Epidémiologie moléculaire des infections bactériennes
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Epidémiologie moléculaire des infections bactériennes
Epidémiologie moléculaire des maladies infectieuses Dominique Blanc, MER PD Service de médecine préventive hospitalière CHUV CHUV/SMPH/DB/CoursModuleMicrobiol/EpidemiologieMoleculaire2007.ppt Introduction Exemple 1: Hémocultures positives à Klebsiella pneumoniae Question: Épidémie? Les méthodes de typage Phénotypique: Le support de la variabilité est le caractère qui peut prendre plusieurs états • Biochimique (biotypage) • Résistance aux antibiotiques (antibiogramme) • Reconnaissance par des anticorps (sérotype) • Résistance aux phages (lysotype) Génotypique: Le support de la variabilité est une ou des séquences nucléotidiques ou au sens large les gènes. Le locus est l’emplacement de cette séquence sur le chromosome et l’allèle est les différents variants d’une séquence à un locus ¾Epidémiologie moléculaire Méthodes phénotypiques: ex. Sérotypage • Basé sur l'observation que les microorganismes de la même espèce ont des déterminants antigéniques exprimés à la surface de la cellule (lipopolysaccharides, polysacchrides capsulaires, protéines membranaires, flagelles, fimbriae) • Exemples de sérotypages encore utilisés: – Salmonella, panel de plus de 2'200 anticorps définissants les "différentes espèces" ou sérovars – Shigella – Pneumocoques (déterminant antigénique = capsule => utilité pour définir la composition des vaccins) Méthodes par restriction de l'ADN Méthodes par PCR RAPD: Random Amplification Polymorphism DNA AP-PCR: Arbritary prime PCR Inter IS: Inter Insertion Sequence AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism MLST: Multilocus Sequence Typing RAPD: Random Amplification Polymorphism DNA AP-PCR: arbitrary Prime PCR RAPD: Petits primers ( habituellement 10 mers) AP-PCR: primers normaux (habituellement 18 to 20 mers) ! Seulement UN primer! AFLP: Arbritary Fragment Lenght Polymorphism Multilocus Variable-Number Tandem Repeat Analysis (VNTR = séquence répétitive trouvée dans une région particulière du génome = un locus) P. Supply et al, JCM 2001, 39:3563 MLST: multilocus seqence typing 2-2-2-2-3-3-3 2-2-2-2-3-3-3 = ST 36 Base de données accessible par internet: www.mlst.net Avantages du MLST • • • • Hautement reproductible Résultats non ambigus (typage défénitif) Echange entre laboratoires Construction de base de données internationales Critères d'évaluation Aisance d'utilisation • Versatilité (capacité de pouvoir utiliser la méthode pour plusieurs espèces avec le minimum de modification) • Rapidité • Accessibilité (disponibilité des réactifs, coûts des réactifs et de l'équipement) • Facilité d'utilisation (techniquement simple, possibilité de tester un grand nombre d'échantillons en même temps, simplicité de la lecture et de l'interprétation des résultats) Critères de performance • Typabilité: nb d'isolats typés/nb isolats testés T= Nt N • Reproductibilité: un certain nombre d'isolats sont testés 2 fois: nb d'isolats avec même résultats /nb d'isolats testés 2x R= Nr N Critères de performance Pouvoir discriminant = capacité à différencier les isolats Comparaison entre différentes méthodes • nb de types / nb d'isolats testés • Indice de discrimination: probabilité que la méthode attribue 2 types différents à 2 isolats indépendants: N 1 D = 1− ∑aj N ( N − 1) j =1 aj = nombre d'isolats qui sont du même type que l'isolat j Indice de diversité de Simpson (écologie des populations) repris par Hunter et Gaston pour la caractérisation des méthodes de typage en épidémiologie. Évaluation des différentes méthodes de typage 4. Typage comparatif et définitif • Reproductible dans un même essai – RAPD – PFGE • Reproductible entre les essais, entre les laboratoires • Nomenclature standardisée des types – – – – MLST Binary typing VNTR PFGE (?) Valeurs continues ou catégorisée des marqueurs • Valeurs continues: – Méthodes basées sur la comparaison de fragments d'ADN de tailles différentes • PFGE, RAPD, AFLP – Permet du typage comparatif (quelques centaines d'isolats peuvent être comparés avec le support d'un programme informatique) • Pas optimum pour du typage définitif: difficile d'établir une nomenclature standardisée des types • Valeurs catégorisées: – Méthodes permettant l’attribution d’un type de façon on ambiguë • MLST, VNTP – Nomenclature standardisée des types – Permet un typage définitif Analyse des bandes: étape 1 Isolat #1 Isolat #2 Tolérance (variation) de la position des bandes Analyse des bandes: étape 2 Isolat #1 Isolat #2 Isolat #100 Tolérance (variation) de la position des bandes Niveaux espace - temps 106 Evolution: Temps (années) millions d'années / mondial 101 Macro-épidémiologie: décennies / national-continent Micro-épidémiologie: jours – mois / régional ⇒ Choix de la méthode de typage en fonction du niveau où se situe le problème à étudier Niveau de résolution des marqueurs • Isoenzymes: trop lent pour micro-épidémiologie, bon pour délimiter les principales subdivisions d'une espèce • PFGE: idéal pour microépidémiologie, probablement pas idéal pour niveau macroépidémiologique et évolutif car trop rapide • RAPD: idéal pour tout les niveaux car possibilité illimitée de primers et très bonne discrimination • MLST: théoriquement idéal pour tous les niveaux (pas démontré pour micro-épidémiologie) Interprétation des résultats de typage • Deux isolats du même type ne sont pas forcément identiques (seulement une fraction du génome est analysée par la méthode de typage), on dit qu'ils sont "indistinguables". • Dans le contexte d'une investigation épidémiologique: deux isolats avec un profil identique dérivent d'un ancêtre commun par une même chaîne de transmission. On suppose qu'ils sont épidémiologiquement apparentés. La force de cette conclusion dépend du pouvoir discriminant de la méthode et de la stabilité des marqueurs. Variabilité des marqueurs Isolats avec un ou quelques caractères de différence parmi une multitude de caractères analysés = isolats similaires * Pt #6 Pt #5 * * Pt #4 Pt #3 * Pt #2 * Pt #1 * 0 1 2 3 Hospitalisation (semaines) Variabilité des marqueurs: exemple du PFGE Représentation schématique de l'influence d'un évènement génétique, apparu sur un fragment de 400kb, sur le profils de restriction PFGE. Interprétation des profils PFGE Uniquement pour les épidémies! Catégorie Nb d'événements génétiques Nb de bandes de Interprétation différence épidémiologique fait partie de l'épidémie Indistinguable 0 0 "Closely related" 1 2-3 Probablement partie de l'épidémie "Possibly related" 2 4-6 Possiblement partie de l'épidémie Différent >2 >6 Pas partie de l'épidémie F. Tennover el al, JCM 1995, 33:2233-9 Problèmes avec ces critères • S’appliquent indifféremment à toutes les espèces de bactéries étudiées par PFGE: – Ne tient pas compte de la diversité de la population ou de l’espèce étudiée – Ne tient pas compte de la vitesse d’évolution des marqueurs Evaluation de la stabilité des profils PFGE des MRSA durant des épidémies Epidémie Durée (mois) Nb personnes Indistinguables Similaires(%) A 1 6 6 0 (0) B 2 7 7 0 (0) C 2.5 19 19 0 (0) D 3 7 6 1 (14) E 4 20 20 0 (0) F 12 30 30 0 (0) G 15 31 30 1 (0) 120 118 2 (1.5) Tous D.S.Blanc et al, JCM 2001, 39:3442 Diversité de la population étudiée et présence de clones prédominants Fréquence des isolats Old Epidemic 1 2 3 4 5 6 Type 7 8 9 10 Génétique des populations du microorganisme: présence de clone prédominant "Aire" de dispersion du clone "Aire" analysée Staphylococcus aureus 1-year study, 1262 adult ICU patients. • 14 different genotypes from 92 primary isolates • Clusters of 2 to 19 isolates: no epidemiological relation for most of them! • The 2 predominant types (38% of all S.aureus) belong to predominant clones in Germany Ö Wide distribution of some S.aureus strains which independently colonize different patients H. Grundmann et al. Clin. Microbiol. Inf., 1999, 5:355-63 Legionella pneumophila Un clone prédominant: • Retrouvé chez beaucoup de patients et de points d'eau dans la région parisienne • Cette souche a également été retrouvée dans d'autres partie de France et d'Europe Lawrence et al JCM 1999 Aurel et al JCM 2003 Utilisation du typage moléculaire en épidémiologie des maladies infectieuses 1) Investigation et contrôle des épidémies 2) Surveillance des agents infectieux (endémie) 3) Étude de l’épidémiologie des agents infectieux Investigation d'épidémies • Raison: Contrôle à court terme de la transmission • But: comparer des isolats provenant d'une épidémie suspectée pour déterminer celles qui sont étroitement apparentées (cas de l'épidémie ou source, ou véhicule) de celles qui ne sont pas apparentées (cas sporadiques) – détection, confirmation et délimitation de son étendue – identification de(s) source(s) de contamination et /ou des vecteurs de transmission (air, eau, personne à personne) – évaluation de l’efficacité des mesures prises pour contenir ou stopper la dissémination • Échelle: jours à mois, quelques à des centaines d'individus infectés • Besoins: typage comparatif M.J. Struelens et al , ICHE 1998 Épidémie Burkholderia cepacia • 14 patients en 17 jours • Seul facteur commun: subits une endoscopie • Présence de ce germe dans un médicament utilisé pour l'anesthésie locale (Novésine) • Un seul lot de Novésine contaminé Estagnon • Prélèvements d'environnement à la pharmacie: un estagnon d'eau distillée contaminé avec ce germe • Conclusion: l'eau de cette estagnon a été utilisée pour la fabrication de ce lot (au lieu d'une eau bactériologiquement maîtrisée) patients Novésine siphon Hémocultures positives à Klebsiella pneumoniae 123456789 Ribotyping Surveillance des agents ou des maladies infectieux(ses) (endémie) suivis de la tendance, de l’évolution de la fréquence de certaine maladies ou de certaines bactéries (MRSA, Salmonelles ...) détection précoce d'une épidémie (ex. Neiseria meninghitidis ou virus de la grippe pour mise à jour des vaccins) analyse d'une situation endémique spécifique Surveillance des agents ou des maladies infectieux(ses) (endémie) • Raison: évaluation à long terme de stratégies de prévention, détection et monitorage des infections émergeantes ou re-émergeantes • But: monitorage de la dissémination géographique, des changements de prévalence des clones épidémiques ou endémiques • suivis de la tendance, de l’évolution de la fréquence de certaine maladies ou de certaines bactéries (MRSA, Salmonelles ...) • détection précoce d'une épidémie (ex. Neiseria meninghitidis ou virus de la grippe pour mise à jour des vaccins) • analyse d'une situation endémique spécifique • Échelle: années à décennies, des centaines à des milliers d'individus infectés • Besoins: typage définitif nomenclature standardisée des types) M.J. Struelens et al , ICHE 1998 Épidémiologie des infections à Staphylococcus aureus • Identification: – – – – – Cocci Gram + Catalase + Coagulase + DNAse + Colonies pigmentées jaune crème - orange S. aureus: hôtes • hôtes naturels: primates • hôtes temporaires: animaux domestiques, volailles, rongeurs • Pathogène pour les mammifères et les oiseaux • Contamination transitoire de l'air, des surfaces, de l'eau, de la poussière, de la nourriture (entérotoxine), etc. (en contact avec l'homme...) Portage à S.aureus S. aureus: pathogène opportuniste Dommages à la peau ou aux barrières naturelles (traumatisme, ponction, implantation matériel médical ): entrée dans les tissus de l'hôte, adhérence aux tissus de l'hôte, déjouer le système immunitaire Relation symbiotique bénigne (commensal ou mutualiste) Infections à S.aureus Pathogène S. aureus: facteurs de virulence Infections versus colonisation à S.aureus Comparaison des isolats du nez à ceux de bactériémies – 219 patients avec bactériémies • 180 (82%) la même souche (profils PFGE identique) a été retrouvée dans les 2 sites – 1278 patients suivis sur une période de 5 ans • 14 ont eu une bactériémie • la même souche (PFGE identique) a été retrouvée dans les 2 sites pour les 14 patients • 1% des porteurs ont eu une bactériémie C.K. von Eiff, N Engl J Med, 2001, 344 :11-16 Souches de S. aureus ayant des caractéristiques spécifiques Grande diversité, mais présence de clones prédominants! Exemple: souches produisant la toxine du TSS (TSST-1) appartiennent toutes au même clone. Musser and Selander, 1990 Résistance aux antibiotiques de S. aureus: 1. Production de bêta-lactamase 2. Gène de résistance à la méticilline: mecA ¾ Meticilin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) ¾ Situé sur une cassette: SCCmec Importance des infections à S. aureus Influence de la résistance aux antibiotiques sur l’épidémiologie de S. aureus "Staphylocoques hospitaliers" VRSA Meticilline Penicilline 1940 1950 1960 MRSA sporadique 1970 lti Mu ré 1980 n ta s is ce 1990 2000 MRSA: enjeux • Même pouvoir pathogènes que MSSA • Résistance à d'autres antibiotiques ⇒ utilisation de la vancomycine pour traiter les infections (coûteux, administration i.v., toxicité auditive et rénale) • 1997: première apparition de souches ayant une résistance intermédiaire à la vancomycine • 2001: première apparition de souches résistantes à la vancomycine • Infections à MRSA ne remplacent pas celles à MSSA, mais se surajoutent! Proportion de MRSA parmi les MSSA isolés dans des prélèvements cliniques EARSS 2002 Clones épidémiques M. Aires de Sousa, H. de Lencastre /FEMS Immunology and Medical Microbiology 40 (2004) 101-111 Épidémiologie des MRSA en Suisse romande 300 250 200 non typés Autres 150 D 100 C B 50 A 0 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 Évolution de l'incidence de nouveaux patients MRSA observés au CHUV. Seuls les génotypes prédominants (>10 patients) sont individualisés, les autres génotypes figurent dans la catégorie "autres types". Dissémination international d’un clone MRSA A. Belgium clone 1 1992 C. Ontario epidemic clone 1995 A B C B. Western-CH clone 1995 Community acquired MRSA