le tissu adipeux

UNIVERSITE TOULOUSE III – PAUL SABATIER
U.F.R sciences de la vie et de la terre
THESE
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE TOULOUSE III
Discipline : Innovation pharmacologique
Présentée et soutenue par
Sandra DE BARROS
Le 29 octobre 2007
Les métalloprotéases matricielles 2 et 9 et la différenciation des
cellules progénitrices du tissu adipeux humain
JURY
Professeur Marie-Christine RIO
Rapporteur
Docteur Jean-Philippe BASTARD
Rapporteur
Docteur Annie QUIGNARD-BOULANGE
Examinateur
Professeur Philippe VALET
Président
Docteur Jean GALITZKY
Directeur de thèse
1
A mes parents
A Christophe, Carole et Adrien,
A Laurent.
2
Remerciements
En préambule à ce travail, je tiens à exprimer toute ma reconnaissance et mes sincères
remerciements à tous ceux qui ont participé de près ou de loin à ce travail.
Je tiens à remercier le Professeur Marie-Christine RIO et le Docteur Jean-Philippe
BASTARD d’avoir spontanément accepté d’évaluer ce travail en tant que rapporteur.
J’exprime également ma gratitude au Professeur Philippe VALET et au Docteur Annie
QUIGNARD-BOULANGE pour avoir si gentiment acceptés de participer à ce jury de thèse.
Les recherches qui ont fait l’objet de cette thèse ont été effectuées dans l’unité
INSERM U858 équipe 1, encadrées par les Docteurs Jean GALITZKY, Virginie
BOURLIER, Coralie SENGENES et Anne BOULOUMIE. Je leur suis très profondément
reconnaissante de m’avoir apporté leur soutien, leur confiance et leur disponibilité au cours
de ces trois années de thèse.
Je tiens tout particulièrement à remercier Max LAFONTAN pour ses précieux
conseils.
Je dis un grand merci à tous les membres (ou ex-membres) de l’équipe des allées et
particulièrement à Karine, Alec et Marie-Adeline pour toute l’aide qu’elles ont pu
m’apporter.
J’adresse mes remerciements à l’ensemble du personnel de l’unité INSERM U858 et
plus particulièrement à l’ex-unité INSERM U586 dirigé par le professeur Dominique
LANGIN, pour les nombreux services rendus. Une petite attention particulière pour Danièle,
Carine et Corinne régulièrement « nounous » des plaques taqman, ainsi que Pascale et Lydia
pour toutes les questions administratives que j’ai pu rencontrer… Je tiens également à
remercier les personnes du Laboratoire de Pharmacologie Médicale et Clinique, ainsi que
celle du Centre de Pharmacovigilance, deux services dirigés par le Professeur Jean-Louis
MONTASTRUC que je remercie.
Enfin, je ne saurai clore cette partie sans adresser mes sincères remerciements à ma
famille. J’adresse un grand merci à mes parents, à mon frère, à Carole et à Adrien. Je
remercie également Laurent pour sa présence, sa patience et son soutien quotidien.
3
Table des matières
Table des matières
4
Liste des figures
7
Liste des tableaux
9
Principales abréviations utilisées
10
Avant propos
12
Introduction
14
I- Le tissu adipeux
14
A) Les fonctions du tissu adipeux
14
A.1) Les fonctions métaboliques du tissu adipeux
15
A.1.1) Le stockage des lipides : la lipogenèse et la synthèse des
triglycérides
15
A.1.2) La mobilisation des lipides : la lipolyse
16
A.2) Les fonctions sécrétoires du tissu adipeux
B) Le développement normal du tissu adipeux
17
18
B.1) Le processus de détermination adipocytaire
19
B.2) Le processus de différenciation adipocytaire
22
B.2.1) Les étapes du processus de différenciation adipocytaire
22
B.2.2) Contrôle transcriptionnel de la différenciation adipocytaire
23
B.2.2.1) Les PPARs
23
B.2.2.2) Les C/EBPs
24
B.2.2.3) Le facteur SREBP-1
24
B.2.2.4) Les autres facteurs de transcription
25
B.2.3) Régulation hormonale et intracellulaire de la
différenciation adipocytaire
25
B.3) La vascularisation du tissu adipeux
26
C) Le développement excessif du tissu adipeux : l’obésité
C.1) Les modifications cellulaires du tissu adipeux
28
29
C.1.1) Les adipocytes et les cellules progénitrices/souches
29
C.1.2) Les cellules endothéliales
29
C.1.3) Les macrophages
30
4
C.2) Les modifications des fonctions métaboliques du tissu adipeux
31
C.3) Les modifications des fonctions sécrétoires du tissu adipeux
32
D) La régression du tissu adipeux : la lipoatrophie
D.1) Les modifications cellulaires du tissu adipeux
34
35
D.1.1) Les adipocytes
35
D.1.2) Les cellules progénitrices/souches
37
D.1.3) Les cellules endothéliales
39
D.1.4) Les macrophages
40
D.2) Les modifications des fonctions métaboliques du tissu adipeux
40
D.3) Les modifications des fonctions sécrétoires du tissu adipeux
41
II- Les métalloprotéases matricielles
43
A) Classification et structure
43
B) Les régulations des MMPs
45
B.1) Les Régulations transcriptionnelles et post-transcriptionnelles
45
B.2) Les régulations de la sécrétion
46
B.3) Les processus de maturation des MMPs
46
B.4) Les processus d’inhibition des MMPs
48
C) Mode d’action des MMPs
49
D) Les fonctions biologiques et pathologiques des MMPs
50
III- Les métalloprotéases matricielles dans le tissu adipeux
54
A) La régulation de l’adipogenèse
54
B) La régulation de l’angiogenèse
55
C) La régulation de l’infiltration macrophagique
55
D) Les régulateurs des MMPs dans le tissu adipeux
56
Objectifs
58
Résultats
59
I- Implication des MMPs dans la différenciation adipocytaire des
cellules de la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux humain
59
A) Influence d’un inhibiteur des MMPs et des inhibiteurs de la protéase du VIH sur
5
la différenciation adipocytaire
59
B) Influence d’un anticorps neutralisant dirigé contre MMP-9 sur la
différenciation adipocytaire
61
C) Détermination des mécanismes impliqués dans la chute de l’expression de
MMP-9 par les inhibiteurs de la protéase du VIH
62
D) Études préliminaires et perspectives sur l’étude des cibles moléculaires de
MMP- 9
65
II- Implication des MMPs dans la différenciation des cellules CD34+/CD31isolées de la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux humain
68
A) Influence d’un inhibiteur des MMPs sur la différenciation adipocytaire
des cellules CD34+/CD31-
69
B) Mise au point d’une condition de culture permettant simultanément les
capacités adipogéniques et angiogéniques des cellules CD34+/CD31-
70
B.1) Etude de l’accumulation intracellulaire des triglycérides et de la
formation d’un réseau cellulaire positif pour le CD31 par les cellules
CD34+/CD31- cultivées dans un milieu mixte
70
B.2) Etude de l’expression en ARNm des marqueurs adipocytaires et
endothéliaux par les cellules CD34+/CD31- cultivées dans un milieu
mixte
72
B.3) Etude cinétique sur l’évolution des cellules CD34+/CD31- au cours de la
culture en milieu mixte.
73
C) Implication des contacts cellule-cellule dans les capacités adipogéniques et
angiogéniques des cellules CD34+/CD31-
76
C.1) Influence de la densité cellulaire sur les cellules CD34+/CD31- cultivées
en milieu mixte
76
C.2) Influence de la communication cellulaire via les jonctions gaps sur les
cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte
77
Conclusions et perspectives
80
Références bibliographiques
83
Annexes
103
6
Liste des figures
Figure 1 : Le tissu adipeux
Figure 2 : Lipogenèse et synthèse des triglycérides dans l’adipocyte
Figure 3 : Contrôle de la lipolyse dans l’adipocyte humain
Figure 4 : Les sécrétions du tissu adipeux
Figure 5 : Détermination et différenciation adipocytaires
Figure 6: Evolution de la matrice extracellulaire et de la forme cellulaire au cours de la
différenciation adipocytaire
Figure 7 : Progression des facteurs de transcription au cours de l’adipogènese dans les
préadipocytes de la lignée 3T3-L1
Figure 8 : Balance entre les facteurs de transcription pro- et anti-adipogéniques
Figure 9 : Comparaison entre les modifications du tissu adipeux lors d’une obésité ou d’une
lipoatrophie
Figure 10 : Les métalloprotéases matricielles
Figure 11 : Régulation de l’activité des métalloprotéases matricielles
Figure 12 : Eléments de liaison aux facteurs de transcription sur les promoteurs des
métalloprotéases matricielles
Figure 13 : Mode d’action des métalloprotéases matricielles
Figure 14 : Effet d’un anticorps neutralisant pour la MMP-9 sur la différenciation
adipocytaire des cellules de la FSV du tissu adipeux humain
Figure 15 : Hypothèse du mode d’action des IPs-VIH sur l’expression génique de MMP-9
Figure 16 : Influence d’un substrat matriciel sur la différenciation adipocytaire des cellules
de la FSV du TA humain
Figure 17 : Technique d’isolement des différentes populations de la FSV du tissu adipeux
humain
Figure 18 : Sécrétion des MMP-2 et -9 au cours de la différenciation adipocytaire des
cellules progénitrices CD34+/CD31- isolées
Figure 19 : Influence du batimastat sur la différenciation adipocytaire des cellules
progénitrices CD34+/CD31Figure 20 : Détermination de l’accumulation des TGs et de la formation d’un réseau
cellulaire positif pour le CD31 des cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu adipogénique,
endothélial ou mixte
7
Figure 21 : Détermination de l’expression en ARNm des marqueurs adipocytaires et
endothéliaux des cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu adipogénique, endothélial ou
mixte
Figure 22 : Evolution du contenu en ADN, TGs et du réseau cellulaire positif pour le CD31
des cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte
Figure 23 : Evolution de l’expression en ARNm des marqueurs adipocytaires et endothéliaux
des cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte
Figure 24 : Influence de la présence de cellules endothéliales matures sur la formation du
réseau cellulaire positif pour le CD31 des cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte
Figure 25 : Influence de la densité cellulaire sur les capacités adipogéniques et
angiogéniques des cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte
Figure 26 : Evolution de l’expression en ARNm des connexines 43 et 45 des cellules
CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte
Figure 27 : Effet d’un inhibiteur des jonctions gaps sur les capacités adipogéniques et
angiogéniques des cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte
8
Liste des tableaux
Tableau 1: Les différents modèles de culture cellulaire utilisés pour l’étude de l’adipogenèse
Tableau 2: Facteurs extracellulaires et molécules de signalisation régulant l’adipogenèse
Tableau 3 : Classification des adultes maigres, normaux, en surpoids et obèses selon l’IMC
Tableau 4: Sécrétions du tissu adipeux modulées ou non au cours de l’obésité
Tableau 5: Classification des différentes lipoatrophies humaines
Tableau 6: Impact des IPs-VIH et des INRTs sur les sécrétions adipocytaires in vitro et in
vivo
Tableau 7: Classification des métalloprotéases matricielles
Tableau 8 : Les activateurs des MMPs
Tableau 9: Phénotypes des souris déficientes pour les MMPs
Tableau 10: Les inhibiteurs des MMPs dans le cancer
Tableau 11: Composition des milieux adipogénique, endothélial et mixte utilisés
Tableau 12: Détermination de l’expression en ARNm des marqueurs adipocytaires et
endothéliaux par des adipocytes matures, des cellules progénitrices CD34+/CD31- et des
cellules endothéliales capillaires CD34+/CD31+
Tableau 13: Expression en ARNm des connexines 43, 45, 40 et 37 dans des adipocytes
matures, des cellules progénitrices CD34+/CD31- et des cellules endothéliales capillaires
CD34+/CD31+
9
Principales abréviations utilisées
ACC : Acetyl Co-A carboxylase
ADAM: A Disintegrine And Metalloprotease domain
AGA: 18α-glycyrrhetinic acid
AGNE: acide gras non estérifié
AP-1: Activator protein-1
aP2 : fatty acid binding protein
ATGL : adipocyte triacylglycerol lipase
bFGF : basic fibroblast growth factor
bHLH : basic helix-loop helix
BMP : Bone morphogenetic protein
CD : Cluster de différenciation
C/EBP : CCAAT/enhancer binding protein
CHOP-10 : C/EBP homologous protein 10
CRABP-1 : Cytoplasmic retinoic acid binding protein-1
ECBM : Endothelial cell basal medium
ECGM : Endothelial cell growth medium
FAS : Fatty acid synthase
FSV: Fraction stroma-vasculaire
GLUT : Glucose transporteur
GZA : glycyrrhizic acid
IDV : Indinavir
IGF : Insulin growth factor
IκB: Inhibitor NF-κB
IL : Interleukine
IMC : Indice de masse corporelle
INRT : Inhibiteur nucléosidique de la réverse transcriptase
INNRT: Inhibiteur non nucléosidique de la réverse transcriptase
IPs-VIH : Inhibiteur de la protéase du VIH
LHS : Lipase hormono-sensible
LPL : Lipoprotéine lipase
MCP-1 : Monocyte chemoattractant proteine 1
10
MEC : Matrice extracellulaire
MMP : Métalloprotéase matricielle
MT-MMP : Métalloprotéase matricielle de type membranaire
NF-κB : Nuclear factor kappa B
NFV : Nelfinavir
PAI-1 : Plasminogen activator inhibitor 1
PDGF : Platelet-derived growth factor
PKA : Protein kinase A
RT-PCR :Real-time polymerase chain reaction
RTV : Ritonavir
RXR : Récepteur de l’acide 9-cis-rétinoique
SDF-1 : Stromal cell-derived factor-1
SQV : Saquinavir
SREBP: Sterol regulatory element binding protein
TA : Tissu Adipeux
TCF/LEF : T-cell factor/lymphoid enhancer factor
TIMP : Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases
TGs : Triglycérides
TNF-α : Tumor necrosis factor α
VEGF : Vascular endothelial growth factor
VIH : Virus de l’immunodéficience humaine
VLDL : Very low density lipoprotein
vWF : von Willebrand Factor
11
Avant-propos
Le tissu adipeux (TA) adulte peut subir des processus de développement excessif
(surpoids, obésité) mais aussi des processus de régression (lipoatrophie). Ces deux
phénomènes entraînent des altérations de la composition cellulaire et des fonctions du TA. Il
est désormais reconnu qu’un excès ou une perte de masse grasse constitue un facteur
aggravant de nombreuses pathologies telles que le diabète de type 2 et les désordres
cardiovasculaires.
Le surpoids touche, aujourd’hui, près d’un milliard de personnes à l’échelle de la
planète, soit un sixième de la population mondiale. Parmi elles, 300 millions sont obèses et
l’obésité infantile est en plein essor. Les causes de l’obésité sont multiples et dépendent aussi
bien de facteurs génétiques qu’environnementaux. A l’heure actuelle, quelques médicaments
avec une indication pour l’obésité (orlistat, sibutramine) ont été développés mais leur
efficacité reste insuffisante.
Les syndromes de lipodystrophies étaient des événements rares (moins de 1 cas sur
100000) et de causes principalement génétiques. Ces dix dernières années sont apparues des
formes de lipodystrophies liées aux traitements antirétroviraux de l’infection par le virus de
l’immunodéficience humaine (VIH). En effet, si l’utilisation des inhibiteurs de la protéase du
VIH (IPs-VIH) et des inhibiteurs nucléosidiques de la reverse transcriptase (INRTs) ont
permis de diminuer significativement la morbidité et la mortalité des patients infectés par le
VIH, plus de 50% des patients traités ont développé un syndrome lipodystrophique se
caractérisant par une redistribution des dépôts adipeux et des complications métaboliques. Le
signe clinique majeur du syndrome lipodystrophique est une lipoatrophie au niveau de la face
et des membres associée ou non à une accumulation du TA au niveau des régions dorsocervicales et abdominales. Quelques approches thérapeutiques pour le traitement des
lipoatrophies ont été développées (thiazolidinedione, metformine) mais elles agissent plus sur
les complications métaboliques associées que sur l’altération du TA elle-même.
Ainsi, une meilleure connaissance des mécanismes impliqués dans l’extension et la
régression de la masse grasse est maintenant nécessaire afin d’identifier de nouvelles cibles
thérapeutiques. Dans ce chapitre d’introduction, nous allons dans une première partie nous
intéresser au TA, à ses fonctions et à son développement normal. Nous aborderons aussi les
modifications tant cellulaires que fonctionnelles que le TA subit lors d’une obésité ou d’une
lipoatrophie. Puis dans une deuxième partie, nous nous intéresserons aux principaux acteurs
12
impliqués dans la régulation des phénomènes de remodelage tissulaire, les métalloprotéases
matricielles ou MMPs. Leur classification, leur structure ainsi que la régulation de leur
activité seront présentées. Enfin, leur mode d’action et les fonctions biologiques auxquelles
ces protéases sont associées seront décrits. Enfin nous aborderons le rôle potentiel de ces
enzymes dans la plasticité du TA.
Nos travaux de recherche portant sur la caractérisation (i) du rôle de la MMP-9 dans
les processus de différenciation adipocytaire et (ii) des interactions entre les inhibiteurs de
protéases utilisées lors de la thérapie du VIH avec les voies dépendantes de MMP-9, seront
ensuite exposés. Enfin, une dernière partie de notre travail portant sur la caractérisation des
cellules progénitrices du TA humain en condition de culture permettant d’exprimer leurs
capacités angiogéniques et adipogéniques sera décrite.
13
Introduction
I.
Le tissu adipeux
Le tissu adipeux (TA) est doué d’une importante plasticité. Il est en effet capable de
croître ou d’involuer de manière spectaculaire. Avant de nous intéresser au développement
excessif du TA ainsi qu’à sa capacité de régression, un aperçu de la fonction propre du TA
nous semble nécessaire.
A) Les fonctions du tissu adipeux
Deux grands types de TA sont présents chez les mammifères : le TA blanc et le TA
brun. Ces deux tissus ont des propriétés biochimiques et fonctionnelles distinctes. Le TA
brun se retrouve surtout chez les rongeurs et, chez l’homme, il est initialement présent chez le
nouveau-né et joue un rôle clé dans la gestion de la thermogenèse (libération d’énergie sous
forme de chaleur). Le TA blanc, dont nous parlerons exclusivement dans la suite de ce
travail, constitue la principale réserve d’énergie de l’organisme. Il comprend différents dépôts
anatomiques localisés dans les territoires sous-cutanés et viscéraux. Cette notion de
localisation du TA est essentielle puisque selon que le TA soit sous-cutané ou viscéral, son
organisation cellulaire va varier ainsi que son activité métabolique et sécrétoire (81, 136,
270).
Au cours de ces dernières années, les recherches sur le TA ont permis de faire
émerger les concepts et rôles clés du TA dans le contrôle des flux métaboliques ainsi que la
notion de TA endocrine. Ainsi, le TA n’est plus décrit comme un simple tissu de soutien et de
protection. Les adipocytes sont le type cellulaire majeur du TA. Ils assurent la fonction
métabolique du tissu (stockage et dégradation des triglycérides (TGs)) mais sont également
considérés comme une source cellulaire des sécrétions du TA. L’adipocyte est caractérisé par
une morphologie polygonale et une grande taille avec un diamètre moyen de 70µm chez le
sujet normo-pondéré. La quasi-totalité de la cellule est occupée par une unique vacuole
lipidique et le cytoplasme et les organites constituent un fin liseré périphérique (figure 1A).
Ces caractéristiques ainsi que sa flottaison in vitro permettent de le distinguer et de l’isoler
facilement de la fraction non adipocytaire du TA, la fraction stroma-vasculaire (FSV),
14
A
Noyau de l’adipocyte
Membrane cytoplasmique
de l’adipocyte
Vacuole lipidique
B
Adipocyte
Macrophage
Préadipocyte
Cellule souche/
progénitrice
Figure 1 : Le tissu adipeux
(A) Morphologie des adipocytes
(B) Composition cellulaire
Microcirculation
contenant principalement des cellules progénitrices/souches, des cellules vasculaires et des
cellules immuno-inflammatoires (figure 1B).
A.1) Les fonctions métaboliques du tissu adipeux
Brièvement, nous aborderons dans les paragraphes suivants les mécanismes et les
voies de régulation des principales fonctions métaboliques adipocytaires : le stockage des
lipides (lipogenèse et synthèse de TGs) et leur dégradation (la lipolyse).
A.1.1) Le stockage des lipides : la lipogenèse et la synthèse des triglycérides
Le stockage des lipides dans l’adipocyte se fait par 2 voies (figure 2). La première
voie correspond à la capture directe des TGs associés aux chylomicrons et aux lipoprotéines
de très faible densité (ou VLDL pour « very low density lipoprotein ») circulants, provenant
de l’alimentation ou de la lipogenèse hépatique. La LPL (lipoprotéine lipase), produite et
sécrétée par les adipocytes, est ancrée par des protéoglycanes à héparane sulfate à la surface
endothéliale (87). En coopération avec GPIHBP1 (glycosylphosphatidylinositol-anchored
high density lipoprotein-binding protein 1) récemment décrite comme étant exprimée à la
surface endothéliale et comme jouant le rôle de récepteur potentiel aux chylomicrons et
VLDL, la LPL hydrolyse les lipoprotéines (11, 297). Les acides gras non estérifiés issus de
ce clivage sont ensuite recaptés par l’adipocyte, qui les transforme alors en acyl-Co enzyme
A (Acyl-CoA). Ils seront ré-estérifiés en TGs en présence de glycérol. La deuxième voie
correspond à la lipogenèse de novo. Le terme de lipogenèse proprement dit désigne la
néosynthèse d’acides gras à partir du glucose. Après l’entrée du glucose dans l’adipocyte,
grâce à des transporteurs spécifiques (GLUT-1 et 4), le glucose est dégradé en pyruvate par le
processus de la glycolyse. A partir du pyruvate, l’acétyl-CoA carboxylase (ACC) et la
synthase des acides gras (FAS, « fatty acid synthase ») interviennent de façon successive
pour catalyser la formation des acides gras à longue chaîne saturée. L’action des différentes
désaturases permet de synthétiser des acides gras plus ou moins saturés. Comme
précédemment, ces acides gras sont ensuite ré-estérifiés pour donner les TGs. Il est nécessaire
de préciser que chez les rongeurs, la lipogenèse est réalisée dans le foie et le TA. Par contre,
chez l’homme, la lipogenèse est majoritairement hépatique et elle n’est qu’accessoire dans le
TA (145), excepté suite à un régime alimentaire riche en glucides (105). De nombreux
facteurs endocrines et paracrines tels que les catécholamines, l’hormone de croissance et la
15
Glycéro
l-3-P
DHAP
Glucose-6-P
Pyruvate
Acétyl-CoA
Estérification
ACC
Malonyl-CoA
TG
Glucose
GLUT
FAS
Palmitate
Acyl-CoA
Glucose
AGNE
LPL
Transporteur
TG:
Chylomicrons
VLDL
AGNE
LPL
Glycolyse
Lipogenèse de novo
Origine alimentaire
des acides gras
Vaisseau
capillaire
Figure 2 : Lipogenèse et synthèse des triglycérides dans l’adipocyte
GLUT: glucose transporter; DHAP: dihydroxyacétone phosphate; TG: triglycérides; ACC:
acétyl Coenzyme A (CoA) carboxylase; FAS: fatty acid synthase; AGNE: acide gras non
estérifié; LPL: lipoprotéine lipase; VLDL: very low density lipoprotein
D’après Fève B., Médecine clinique, 2003
leptine sont capables de contrôler le stockage des TGs mais le facteur majeur est l’insuline
qui stimule cette voie en augmentant le captage du glucose via le recrutement du transporteur
GLUT-4 à la membrane, et en activant les enzymes glycolytiques et lipogéniques (120). De
façon intéressante, les effets inhibiteurs de la leptine et de l’hormone de croissance sur le
stockage des TGs passent par l’inhibition des effets stimulateurs de l’insuline.
A.1.2) La mobilisation des lipides : la lipolyse
La lipolyse assure la dégradation des TGs contenus dans les vacuoles lipidiques de
l’adipocyte, en glycérol et acides gras non estérifiés. Plusieurs lipases interviennent de façon
séquentielle dans cette hydrolyse des réserves lipidiques (figure 3). La lipase hormonosensible (LHS) clive les TGs en diglycérides puis les diglycérides en monoglycérides, et
constitue l’enzyme limitante du processus lipolytique. La lipase des monoglycérides (LMG)
dégrade ensuite les monoglycérides en glycérol et acides gras non estérifiés. Cependant, la
mise en évidence d’une activité lipolytique diminuée mais toujours présente chez des souris
invalidées pour le gène de la LHS a laissé supposer l’existence d’au moins une autre lipase
capable d’hydrolyser les TGs dans les adipocytes (196). Trois laboratoires différents ont
identifié une nouvelle lipase dénommée « adipocyte triacyglycerol lipase » (ATGL),
isoforme ζ d’une phospholipase indépendante du calcium (iPLA 2 ζ) ou desnutrine (113, 277,
303). L’ATGL jouerait un rôle clé dans la lipolyse basale, mais l’hydrolyse des TGs et des
diglycérides par la LHS demeurerait l’étape limitante dans la lipolyse stimulée par les
principaux agents lipolytiques chez l’homme, les catécholamines et le peptide atrial
natriuretique (142). Les mécanismes susceptibles de réguler l’activité de la LHS sont bien
connus et sont présentés dans la figure 3 (135). L’activité de cette lipase dépend
spécifiquement de sa phosphorylation réversible par une kinase dépendante de l’AMPc
(PKA) (100) ou du GMPc (PKG) (240). La phosphorylation de la LHS active l’enzyme, en
démasquant le site catalytique. Par ailleurs, cette phosphorylation permet une redistribution
de la lipase du cytoplasme vers la vacuole lipidique. Les périlipines, protéines abondamment
exprimées à la surface des gouttelettes lipidiques, interviennent dans la localisation et la
stabilisation de la LHS à la surface des vacuoles. La phosphorylation des périlipines par la
PKA et la PKG réduit leur ancrage à la gouttelette lipidique et favorise ainsi l’accès de la
LHS à ses substrats lipidiques.
16
Activation
Noradrénaline
Adrénaline (β1- β2-AR)
Parathormone (PTH-R)
Gs
Membrane
Plasmique
KHD
αs
GC
GTP
GMPc
γ
β
+
R C
R C
PKG
PKA
γ
α
β i
PI3K
PKB
Akt
P-Tyr-P
+
+
-
5’-AMP
R C
R C
Gi
ATP
AMPc
+
Inhibition
Inhibition
Adrénaline (α2A-AR)
Insuline (I-R)
Adénosine (A1-R)
Prostaglandines (EP3-R)
Neuropeptide Y/peptide YY (NPY1-R)
Acide nicotinique (HM74A)
Adenylyl cyclase
Activation
Atrial Natriuretic Peptide
Brain Natriuretic Peptide
(NPR-A)
PDE-3B
PDE-3B
Ser-P
TG
ATGL
AGNE
Diacylglycérol
Ser-P
+
LHS
AGNE
Monoglycéride
LMG
AGNE
Glycérol
Figure 3 : Contrôle de la lipolyse dans l’adipocyte humain
Les catécholamines activent les récepteurs α2-adrénergiques (α2–AR) et β1/2/3-adrénergiques (β1/2/3–
AR) modulant négativement et positivement l’activité de l’adénylyl-cyclase (AC) respectivement.
Outre le récepteur α2–AR, de nombreux autres récepteurs sont couplés négativement à l’AC. C’est
notamment le cas des récepteurs à l’adénosine (A1-R), aux prostaglandines (EP3-R), au neuropeptide
Y (NPY-Y1-R) et à l’acide nicotinique (HM74A). L’AC produit de l’AMPc qui va activer une
protéine kinase dépendante de l’AMPc (PKA). L’insuline possède une action antilipolytique. Son
mécanisme d’action implique la phosphatidyl-inositol 3 kinase (PI3-K), la protéine kinase B
(PKB/Akt) et la phosphodiestérase-3B (PDE-3B) qui diminue les taux intracellulaires d’AMPc
transformé en 5’-AMP. L’ANP et le BNP stimulent le NPR-A dont l’activité guanylyl-cyclase (GC)
génère du GMPc. Le GMPc stimule une protéine kinase dépendante du GMPc (PKG ou cGK-I). La
PKA et la PKG activent par phosphorylation les périlipines et la lipase hormono-sensible (LHS) qui
va transloquer à la vacuole lipidique et participer, avec l’adipocyte triacylglycérol lipase (ATGL) et la
monoglycéride lipase (LMG), à l’hydrolyse des triglycérides (TGs) en glycérol et acides gras non
estérifiés (AGNE).
A.2) Les fonctions sécrétoires du tissu adipeux
D’un point de vue quantitatif, les acides gras libres, issus de la lipolyse et libérés dans
la circulation sanguine, représentent le principal produit de sécrétion du TA (265). Cependant
le TA est également capable de synthétiser et de sécréter une multitude de facteurs qui
agissent soit localement de façon autocrine et/ou paracrine, soit parfois de façon endocrine.
On désigne sous le terme « adipokines », l’ensemble des facteurs bioactifs produits et
sécrétés par le TA. Historiquement, la LPL est la première adipokine découverte (49).
Toutefois, c’est la découverte de la leptine, hormone synthétisée par le TA et intervenant
dans le contrôle de la prise alimentaire, qui a permis au TA d’acquérir le statut d’organe
endocrine (302). Suite à cette découverte, d’autres facteurs produits et sécrétés par le TA ont
été décrits, on en compte actuellement plus d’une cinquantaine qui diffèrent tant au niveau de
leur structure que de leur fonction : des hormones (stéroïdes et glucocorticoïdes), des
cytokines (TNFα, IL-6, IL-8), des facteurs de croissance (TGF-β), des protéases (MMP-2 et
9) et des anti-protéases (TIMP, PAI-1) (81). Plusieurs fonctions physiologiques leur sont
associées, du contrôle du métabolisme lipidique, à l’angiogenèse et l’inflammation (figure 4).
Excepté la leptine et l’adiponectine considérées comme spécifiques des adipocytes, les
adipokines apparaissent comme étant également exprimées et produites par les cellules de la
fraction non adipocytaire du TA, i.e la FSV (72). Des différences dans l’activité de sécrétion
mais également dans le type d’adipokines ont été décrites dans les TA humains sous-cutanés
et viscéraux (72, 136).
En résumé, l’adipocyte présente deux fonctions principales, le stockage des
lipides selon le processus de lipogenèse ainsi que celui de la synthèse des TGs, et la
mobilisation des lipides via le processus de lipolyse. Ces activités métaboliques sont
étroitement régulées par des signaux neuro-humoraux. De plus, grâce à une capacité
sécrétoire aussi multiple que variée, le TA joue un rôle endocrine permettant d’assurer
une communication avec de nombreux organes et tissus mais aussi un rôle paracrine et
autocrine permettant une communication locale entre les différents types cellulaires qui
le composent.
Voyons à présent les mécanismes impliqués dans le développement normal de la masse
grasse. Nous nous intéresserons ensuite aux modifications cellulaires du TA et de ses
principales fonctions au cours d’un développement excessif ou d’une régression.
17
Métabolisme lipidique et
des lipoprotéines
Tonus vasculaire et angiogenèse
Lipoprotéine lipase
Acylation stimulating protein (ASP)
Prostaglandines
Acide lysophosphatidique (LPA)
Retinol binding protein (RBP)
Cholesteryl ester transferase protein (CETP)
Autotaxine (phospholipase D)
Vascular endothelial growth factor (VEGF)
Monobutyrine
Leptine
FIAF (PGAR ou angiopoietin like 4)
Angiopoietin 2
Angiotensinogène et Angiotensine II
Metalloprotéases de type 2 et 9 (MMP-2 et -9)
Apeline
Adipocytes
Réponse immunitaire et
inflammatoire
Tumor necrosis factor α (TNF-α)
Interleukines 6 et 8 (IL-6 et IL-8)
Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1)
Haptoglobine
Serum amyloïd A (SAA)
Monocyte chemoattractant protein (MCP-1)
Métallothionéïne
Métabolisme et homéostasie
énergétique
Leptine
Adiponectine
Résistine
Interleukine 6 (IL-6)
Apeline
Figure 4 : Les sécrétions du tissu adipeux
B) Le développement normal du tissu adipeux
Le développement de lignées cellulaires fibroblastiques pluripotentes ou unipotentes a
largement contribué à l’identification et à la compréhension des événements cellulaires et
moléculaires impliqués dans la formation des adipocytes, i.e. la différenciation adipocytaire
ou adipogenèse. Le tableau 1 présente les principaux modèles de préadipocytes utilisés in
vitro pour l’analyse de l’adipogenèse ainsi que leur origine tissulaire (d’après (91)). Notons
que la majorité de ces modèles cellulaires sont d’origine embryonnaire et murine.
Tableau 1: Les différents modèles de culture cellulaire utilisés pour l’étude de
l’adipogenèse
Nature de la culture
Phénotype
pluripotentes
Lignées unipotentes
Origine tissulaire
Cellules ES
Blastocystes murins
Muscle,
10T1/2
Embryons de souris C3H
adipocyte blanc
hMADS
TA humain
Lignées totipotentes
Lignées
Nom
Adipocyte blanc 3T3-L1,
Embryon de souris Swiss
3T3-F442A
Ob17
TA épididymaire de souris ob/ob adulte
Clone TA1
Clone dérivé des 10T1/2 traités par 5azacytidine
Adipocyte brun
Cultures Primaires
Adipocytes
Clone A31T
Lignée murine Balb/c3T3
Clone 1246
Carcinome embryonnaire de souris C3H
PAZ6
Fœtus humain
HIB 1B
TA brun de souris
FSV du TA
TA blanc ou brun (rongeurs, lapins,
blanc ou bruns
porcs, hommes…)
Voyons à présent les voies de régulation des processus de détermination et de
différenciation adipocytaires.
18
B.1) Le processus de détermination adipocytaire
Comme l’indique la figure 5, la détermination adipocytaire correspond à l’orientation
d’une cellule précurseur, supposée d’origine mésenchymateuse, vers la lignée adipocytaire.
Bien que les mécanismes impliqués dans ce processus soient encore peu connus, certains
facteurs susceptibles d’orienter le précurseur mésenchymateux vers le lignage adipeux ont été
identifiés (pour revue (79, 226)). C’est notamment le cas des voies de signalisation de delta
fos B et de l’acide rétinoïque mais aussi de Wnt, une glycoprotéine sécrétée impliquée dans
la croissance et le devenir cellulaire et des BMPs (bone morphogenic protein) appartenant à
la superfamille du TGF-β et impliqués dans le devenir des cellules mésenchymateuses. Le
facteur delta fos B inhibe l’adipogenèse en favorisant la différenciation ostéogénique (234).
L’activation de la voie Wnt inhibe également la différenciation adipocytaire en favorisant
l’orientation myogénique (230). Enfin, une exposition des cellules mésenchymateuses
multipotentes CH310T1/2 à du BMP-4 engage les cellules vers un lignage adipogénique
(261). L’influence du BMP-2 sur ces cellules CH310T1/2 semble en revanche plus complexe
puisqu’à faibles concentrations il stimule l’engagement vers le lignage adipogénique alors
qu’à de fortes concentrations il stimule l’engagement vers le lignage ostéogénique (283).
Il est à noter que l’origine des précurseurs des adipocytes n’est pas claire. Chez
l’embryon, l’apparition d’adipocytes est concomitante à l’apparition du système vasculaire
(52) et la culture de cellules souches embryonnaires murines en présence d’acide rétinoïque
promeut
la
différenciation
adipocytaire
(58,
207).
Chez
l’adulte,
des
cellules
mésenchymateuses de la moelle osseuse caractérisées par leur capacité d’adhésion sur
plastique, leur capacité de prolifération et leur expression de différents marqueurs de surface
tels que le CD105 et l’absence du marqueur des cellules souches hématopoïétiques CD34,
sont capables in vitro de s’orienter vers des voies adipogéniques, chondrogéniques et
ostéogéniques (210). De plus, des analyses clonales ont permis de montrer qu’une même
cellule conservait ces capacités multiples de détermination (210). Récemment, une étude
réalisée chez des souris soumises à un régime gras a permis de montrer par l’utilisation
d’approches de repopulation des cellules de la moelle osseuse par des cellules souches qui
expriment une protéine fluorescente verte (GFP) que certains adipocytes des dépôts profonds
pourraient être originaires de cellules de la moelle osseuse (54). De plus, des cellules
sanguines circulantes ont été montrées comme pouvant exprimer une capacité de
différenciation adipocytaire, suggérant que des cellules de la moelle osseuse peuvent, sous
des stimuli à préciser, être mobilisées dans la circulation sanguine et être recrutées dans les
19
Type cellulaire
Précurseur
multipotent
Chondrobastes
Ostéoblastes
Myoblastes
Evènements moléculaires
•Voie Wnt
•Delta Fos B
•Acide
rétinoïque
Etapes
Détermination
Adipoblaste
Phase
exponentielle
de croissance
Pref 1
Arrêt de croissance
(confluence)
Préadipocyte
C/EBP β et δ
PPAR γ
Expansion clonale
(mitoses post-confluence)
C/EBP α
Engagement
(commitment)
Différenciation
Remodelage de
la MEC et du
•Gènes
adipocytaires cytosquelette
•Enzymes
lipogéniques
et synthèse de
TG
Maturation
terminale
•Lipolyse
•Activités
sécrétoires
Adipocyte
mature
Figure 5 : Détermination et différenciation adipocytaires
D’après Gregoire F. M., Physiol. Rev., 1998.
dépôts adipeux (101). Le TA adulte contient également au sein de la FSV des cellules
résidentes capables d’exprimer des capacités multiples de différenciation (304). De plus,
diverses approches in vivo ont montré la capacité réparatrice de ces cellules dans des modèles
animaux d’ischémie vasculaire et cardiaque ou de dommages osseux et musculaires. La revue
qui suit : « le TA un donneur de cellules souches » présente ces données.
20
biologie générale
biologie générale
LE TISSU ADIPEUX :
UN DONNEUR DE CELLULES SOUCHES ?*
Anne BOULOUMIÉ, Sandra DE BARROS, Marie MAUMUS, Jean GALITZKY, Coralie SENGENES
Les cellules souches sont caractérisées par leur capacité d’autorenouvellement et leur capacité à produire des cellules différenciées fonctionnelles.
Différents types de cellules souches sont définis en fonction de leur origine et de leur devenir : (1) les cellules souches embryonnaires totipotentes capables de former toutes les couches embryonnaires ainsi que les
annexes extra-embryonnaires qui supportent la croissance de l’embryon,
(2) les cellules souches embryonnaires pluripotentes qui donnent naissance au mésoderme, endoderme et ectoderme, (3) les cellules souches
multipotentes, capables de générer plusieurs types cellulaires, (4) les
cellules progénitrices ou précurseurs qui présentent une capacité limitée
d’autorenouvellement et qui se différencient en un type cellulaire défini
[1].
Des progrès récents dans l’isolement et la caractérisation des cellules souches/progénitrices ont conduit à la
mise en évidence de cellules présentant certaines propriétés de cellules souches/progénitrices dans divers tissus
adultes, tels que le cœur, le rein, le cerveau, le muscle
et également le tissu adipeux. Ces cellules constitueraient un réservoir de cellules réparatrices prêtes à être
mobilisées et à se différencier en réponse à une ischémie et/ou à un dommage. Ces cellules présentent un
intérêt croissant en médecine réparative et régénérative
avec un rôle thérapeutique potentiel dans une grande
variété d’applications cliniques. Cependant, la présence
de cellules souches/progénitrices dans les tissus adultes
a conduit à de nombreuses questions et controverses
quant à leurs identités et potentialités réelles de différenciation [2].
Inserm, Équipe Avenir, INSERM U858, Institut de médecine moléculaire de Rangueil,
Toulouse ; Université Paul Sabatier, Institut Louis Bugnard IFR31, Toulouse.
Correspondance : Anne Bouloumié, INSERM équipe AVENIR, Faculté de médecine, 37, allées Jules Guesde, 31000 Toulouse.
Email : [email protected]
* Conférence donnée dans le cadre de la 47e Journée Annuelle de Nutrition et de
Diététique, le vendredi 26 janvier 2007.
Cah. Nutr. Diét., 42, 2, 2007
Chez l’adulte, la moelle osseuse est considérée comme le
tissu réservoir de cellules souches [3]. Deux familles au moins
de cellules souches/progénitrices qui représentent une fraction mineure de la population totale de la moelle (0,001 à
0,01 % des cellules nuclées), ont été identifiées : les cellules
souches hématopoiétiques qui comprennent des cellules
multipotentes capables de reconstituer l’ensemble des
lignées hématopoiétiques, des cellules progénitrices monopotentes donnant naissance à un lignage, et les cellules souches mésenchymateuses qui présentent la capacité de se
différencier en cellules des tissus connectifs, dont les os, le
tissu adipeux et le cartilage. Une population de cellules
immatures capables de prolifération sans sénescence et
capables de s’orienter vers des lignages distincts, i.e. endothélial, endodermal et neural in vitro et in vivo, a été également décrite dans la moelle adulte et définie comme « cellules
souches adultes multipotentes » [4]. Cependant, leur existence est soumise à de fortes controverses. Finalement, des
cellules endothéliales progénitrices sont également présentes
dans la moelle osseuse. Ces cellules contribueraient à la néovascularisation de tissus ischémiques après leur mobilisation
et leur recrutement vers les sites ischémiques [5].
En plus de la moelle osseuse, d’autres sources de cellules
souches/progénitrices ont été décrites chez l’adulte, tels
que la peau [6], le muscle [7], le cerveau [8] et le tissu
adipeux humain [9].
73
biologie générale
Caractéristiques in vitro
des cellules souches/progénitrices
du tissu adipeux humain
La présence de cellules progénitrices dans le tissu adipeux
humain est reconnue depuis les travaux de Bjorntorp sur
l’évolution de la cellularité de la masse adipeuse avec le
développement de l’obésité.
Les préadipocytes
En effet, ses travaux ont montré clairement que l’obésité
chez l’homme se caractérise par une phase d’hypertrophie adipocytaire suivie d’une phase d’hyperplasie adipocytaire [10, 11]. Les adipocytes étant des cellules
matures différenciées, incapables de proliférer. L’augmentation du nombre d’adipocytes dans le tissu adipeux
(TA) de patients obèses est expliquée par la différenciation de cellules progénitrices présentes dans la fraction
stroma-vasculaire (FSV), i.e. la fraction non-adipocytaire,
du TA [12]. En effet, l’isolement de la FSV de TA humain
et sa mise en culture in vitro en condition adipogénique
[13, 14], i.e. en présence de facteurs favorisant la différenciation adipocytaire tels que l’insuline, la triodothryronine et le cortisol, conduit à la formation de cellules in
vitro qui expriment des transcripts spécifiques des adipocytes. De plus, ces cellules différenciées présentent des
activités fonctionnelles métaboliques, i.e. lipolyse et lipogénèse, et sécrétoires (production de leptine) des adipocytes matures. Des expériences chez les rongeurs ont
permis de plus de montrer que ces cellules forment in
vitro des adipocytes matures fonctionnels au site de leur
injection [15, 16]. Ces résultats démontrent la présence,
au sein du TA, de cellules immatures capables de se différencier in vitro et in vivo en adipocytes fonctionnels.
Différenciation in vitro des cellules de la FSV
du TA humain
Outre leur capacité de différenciation en adipocyte in
vitro, de nombreux laboratoires ont, par la suite, montré
que les cellules de la FSV humaine pouvaient acquérir
selon les conditions de culture in vitro des marqueurs
biochimiques caractéristiques de lignages cellulaires variés
[17] : lignage ostéogénique [18], chondrogénique [19,
20] et myogénique [21, 22] mais également l’expression
de marqueurs du lignage neuronal [21, 23], endothélial
[24-26], épithélial [27-29] et même cardiaque [30]. De
plus, des approches « clonales », c’est-à-dire d’analyse
des capacités de différenciation des cellules dérivant
d’une cellule unique après multiples passages, ont montré
que plusieurs clones cellulaires pouvaient se différencier
en plusieurs lignages [22, 23], suggérant la présence de
cellules de type « cellules souches adultes multipotentes »
et non pas seulement un mélange de population de cellules progénitrices unipotentes. Ces résultats sont en
accord avec les résultats obtenus par le groupe de Christian Dani [31] montrant dans la FSV isolée à partir de
TA de jeunes donneurs, la présence de cellules plus
immatures et multipotentes (hMADS ou Human Multipotent Adipose Derived Stem Cell). Des expériences parallèles chez les rongeurs mettaient également en évidence
une plasticité importante des cellules de la FSV des TAs
murins [32-34].
74
Limites des approches in vitro sur les cellules
de la FSV du TA humain
La majorité des approches réalisées in vitro utilisent
des phases d’expansion cellulaire en présence de fortes
concentrations de sérum, conditions associées à des altérations phénotypiques des cellules [35]. En effet, alors que
les cellules natives, i.e. directement isolées, de la FSV
humaine expriment des marqueurs membranaires de type
CD34, marqueur des cellules souches hématopoiétiques,
et sont dépourvues des marqueurs des cellules souches
mésenchymateuses Stro-1 et CD105, les cellules placées
en culture expriment un profil inverse, i.e. perte du CD34
et gain de CD105 et Stro-1 [25, 36-38]. De plus, peu ou
pas d’analyses fonctionnelles ont été associées aux études
relatives aux potentialités de différenciation des cellules.
Ces analyses sont cependant nécessaires pour statuer
clairement quant à la capacité réelle de différenciation en
cellules fonctionnelles. De plus, certains résultats obtenus
chez les rongeurs n’ont pas été confirmés chez l’homme
suggérant que les capacités de différenciation des cellules
de la FSV humaine sont plus restreintes que chez le rongeur.
Enfin, la FSV du TA n’est pas constituée d’une population
de cellules homogènes mais contient, comme son nom l’indique, des populations cellulaires de la composante vasculaire [25] et de la composante stromale, i.e. macrophages
et lymphocytes infiltrés [39].
Isolement des cellules progénitrices/souches natives
de la FSV du TA humain
Afin d’isoler et de caractériser la population de cellules
progénitrices présentes dans la FSV du TA humain, notre
groupe a développé une approche d’immunosélection/
déplétion permettant d’isoler les différentes populations
cellulaires. Nous avons ainsi démontré que les cellules
« natives » positives pour le CD34 et négatives pour le
marqueur endothélial CD31 sont la seule population cellulaire parmi les cellules endothéliales capillaires (CD34+/
CD31+), les macrophages (CD34–/CD14+) et les cellules
CD34–/CD31–/CD14–, à présenter la capacité de se différencier en adipocytes in vitro [38]. De plus, une partie
de cette même population cellulaire possède, en milieu de
culture endothélial, la capacité d’exprimer des marqueurs
endothéliaux et de s’organiser en structures semblables à
des capillaires [25]. Ces résultats montrent que la fraction
cellulaire CD34+/CD31– native, i.e. n’ayant subi aucune
étape d’expansion in vitro, de la FSV du TA humain présente des propriétés de cellules progénitrices capables de
donner naissance à des cellules qui expriment des marqueurs phénotypiques des adipocytes et des cellules endothéliales. Il reste à déterminer si cette population cellulaire
native est constituée d’un mélange de cellules progénitrices
unipotentes ou de cellules souches multipotentes.
Caractéristiques in vivo
des cellules souches/progénitrices
du TA humain
Les approches in vitro ont donc apporté des observations
intéressantes sur la plasticité potentielle des cellules dérivées
de la FSV du TA humain, justifiant la mise en place d’approches in vivo d’injection de cellules humaines dans des
modèles animaux présentant des ischémies/dommages
Cah. Nutr. Diét., 42, 2, 2007
biologie générale
tissulaires afin de suivre la potentialité réparatrice de ces
cellules. Les mécanismes responsables des interactions
entre cellules implantées et cellules hôtes restent à être
caractérisés. Cependant, des travaux récents apportent des
données intéressantes concernant la réponse de l’hôte
ainsi que le comportement des cellules injectées en fonction
des environnements locaux distincts.
Réponse immune de l’hôte
Les cellules dérivées de la FSV des TAs humains semblent
présenter une nature non-immunogénique [40]. En effet,
in vitro les cellules ne provoquent pas d’alloréactivité de
lymphocytes incompatibles mais apparaissent de plus
exercer des propriétés immunosuppréssives [40, 41]. De
plus, in vivo, l’implantation des cellules humaines chez
des souris immunocompétentes n’induit pas d’accumulation
de lymphocytes au site d’implantation [31]. Les processus
exacts impliqués nécessitent une caractérisation plus approfondie. Cependant, ces observations pourraient avoir un
impact important en termes de thérapie allogénique ou pour
le transfert de cellules dans un organisme hôte dérivées
d’un autre donneur [42].
Mécanismes d’adressage des cellules
Plusieurs types de modes d’administration des cellules ont
été utilisés de l’injection intraveineuse à l’application directe
au site endommagé. Quand les cellules sont injectées par
voie systémique chez la souris, les cellules s’infiltrent en
conditions basales dans différents tissus [43] dont les
poumons, le foie, le cœur, le thymus et le cerveau [44].
Toutefois, en présence de dommages tissulaires, une infiltration plus élevée est observée au niveau du site endommagé. Par exemple, une hépatectomie partielle chez la
souris conduit à l’augmentation de l’infiltration des cellules
dérivées de la FSV dans le foie [44]. Les mécanismes qui
guident les cellules aux sites endommagés ne sont pas
connus. Nous avons initié des expériences sur la capacité
de migration des cellules CD34+/CD31–. Nos résultats
montrent que les cellules migrent fortement en réponse
à un gradient de facteurs produits par les cellules endothéliales. Des recherches complémentaires sont nécessaires
pour déterminer quels facteurs, tels que des chimiokines
ou des signaux relatifs à l’état hypoxique, sont responsables
de l’attraction des cellules souches/progénitrices de la
FSV des TAs humains.
Devenir in vivo
Le principe de la thérapie cellulaire est que les cellules souches/progénitrices vont au niveau du site endommagé se
différencier sous l’influence de facteurs locaux en cellules
d’un phénotype approprié. Cependant la différenciation
« réelle » des cellules souches/progénitrices in vivo est
soumise à controverse et plusieurs processus alternes ont
été suggérés comme participant aux activités réparatrices
des cellules telles que la fusion cellulaire aboutissant à la
reprogrammation nucléaire et la production par les cellules
souches/progénitrices de facteurs trophiques et « réparateurs » agissant de manière paracrine sur les cellules hôtes.
La capacité réparatrice des cellules souches/progénitrices
de la FSV du TA humain a été clairement mise en évidence
dans différents modèles chez la souris. Dans un modèle de
souris immunotolérante avec une ischémie de la patte arrière
provoquée par ligature de l’artère fémorale, l’injection de
cellules de la FSV brute [24, 45, 46] ou des cellules
Cah. Nutr. Diét., 42, 2, 2007
CD34+/CD31– [25] conduit à une amélioration de la
néovasularisation du membre ischémique. Toutefois, il reste
à déterminer si cette néovascularisation est due à une
incorportion des cellules injectées dans la vasculature de
la souris et à leur différenciation en cellules endothéliales
ou à la production locale par les cellules injectées de facteurs proangiogéniques [46, 47]. Des activités réparatrices
de dommages osseux ont été également rapportées dans
différents modèles murins [48, 49]. Enfin, l’injection des
cellules souches multipotentes chez des souris « mdx »,
modèle de myopathie de Duchenne, est associée à une
expression importante et prolongée de la dystrophine
humaine, protéine nécessaire à l’intégrité de la fibre musculaire [31]. Des expériences en parallèle sur les cellules de
la FSV murine montrent également des capacités réparatrices
multiples [50-52].
Limites et questions
Un nombre important d’observations suggère que le processus néoplastique impliquerait des cellules souches [53].
Une étude récente montre le risque de transformation des
cellules de la FSV. En effet, la culture à long terme des
cellules de la FSV du TA humain adulte a été associée à
l’immortalisation et la transformation spontanée des cellules,
conduisant in vivo à la formation de tumeur après injection des cellules chez la souris athymique [54]. Des études
complètes sont donc nécessaires pour établir clairement le
risque associé à l’expansion in vitro des cellules de la FSV
humaine.
Le déclin du potentiel régénératif est une signature du
vieillissement et pourrait être dû à des changements relatifs
à l’âge des cellules souches spécifiques des tissus. Des études
récentes chez la souris montrent que le déclin de l’activité
des cellules progénitrices lié au vieillissement peut être
réversible suite à une exposition à un environnement
« jeune » alors qu’à l’inverse l’environnement d’un animal
âgé empêche la régénération tissulaire stimulée par des
cellules progénitrices issues d’animaux « jeunes » [55]. Les
études de l’équipe de C. Dani montrant la présence de
cellules souches multipotentes dans la FSV ont été réalisées chez des patients jeunes [31]. Il serait maintenant
intéressant de déterminer l’impact de l’âge sur les cellules
souches/progénitrices du tissu adipeux tant au niveau de leur
potentialité intrinsèque que sur leur interaction avec l’environnement.
Finalement, la présence de ces cellules dans la FSV pose
la question de leur origine et de leur spécificité. Récemment, Hong et al. [56] a décrit que les fibrocytes circulant
CD45+ étaient capables en culture d’accumuler des triglycérides. Les études de Crossno et al. [57] réalisées chez
la souris en transplantant des cellules de la moelle osseuse
de souris transgéniques qui expriment la protéine fluorescente verte (GFP) à des souris sauvages soumises à un
régime riche en graisse, montrent l’apparition d’adipocytes
GFP positifs dans les tissus adipeux. Ces deux études suggèrent que certaines cellules progénitrices du tissu adipeux
pourraient avoir une origine sanguine/moelle osseuse.
Nos expériences montrent que les cellules CD34+/CD31–
circulantes sanguines ne présentent cependant pas les
mêmes potentialités que les cellules CD34+/CD31– du
tissu adipeux humain, i.e. production de colonies de cellules
sanguines mais absence de différenciation adipocytaire
[38], ce qui suggère que si ces cellules ont la même ori75
biologie générale
gine, le micro-environnement dans lequel elles résident
définit leur potentialité et leur spécificité. Des études
complémentaires sont donc nécessaires pour mieux définir
l’influence du micro-environnement sur la potentialité des
cellules souches/progénitrices.
Conclusion
De nombreuses données obtenues in vitro et in vivo
montrent la présence au sein des TAs humains de populations cellulaires présentant des capacités similaires aux
cellules progénitrices/souches. La capacité multiple de différenciation reste soumise à controverse et nécessite des
recherches supplémentaires pour statuer clairement. Entre
autres, des méthodes standardisées et validées d’isolement,
de caractérisation, de sélection, de purification, de culture,
de stockage et d’injection des cellules à partir du TA humain
doivent être développées. Les cellules souches/progénitrices
du TA humain pourraient, de part leur accessibilité et leur
nombre au sein de la FSV, devenir un modèle cellulaire
intéressant pour des approches de thérapie cellulaire pour
la régénération et la réparation tissulaire [58, 59]. Toutefois, de nombreux challenges scientifiques restent encore
à être réalisés avant d’envisager de telles approches. Les
mécanismes d’infiltration et d’adressage des cellules doivent
être mieux caractérisés ainsi que le rôle relatif de la différenciation, fusion et production de facteurs paracrines dans
les effets réparateurs de ces cellules.
Résumé
De nombreux laboratoires ont montré que les cellules issues
de la fraction stroma-vasculaire des tissus adipeux humains
pouvaient exprimer in vitro selon les conditions de culture
des marqueurs biochimiques de lignages cellulaires variés :
adipogénique, ostéogénique, chondrogénique, myogénique,
endothélial, neuronal et épithélial. De plus, diverses approches in vivo ont montré la capacité réparatrice des cellules
de la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux humain
dans des modèles animaux d’ischémie vasculaire et cardiaque
ou de dommages osseux et musculaires. Ces résultats suggèrent fortement que le tissu adipeux humain contient des
cellules qui présentent des propriétés similaires à celles
des cellules souches ou progénitrices. Toutefois, la nature
exacte de ces cellules, leur potentialité réelle de différenciation in vivo ainsi que les mécanismes impliqués dans
leur capacité de réparation et de régénération restent à être
caractérisés pour envisager leur utilisation dans des approches de régénération et réparation tissulaire.
Mots-clés : Cellule progénitrice – Préadipocyte – Cellules
endothéliales – Réparation – Régénération.
Abstract
Several laboratories have shown that the cells from the
stroma-vascular fraction of the human adipose tissue
express, depending on cell culture conditions, biochemical markers of multiple cell lineages including adipogenic, osteogenic, chondrogenic, myogenic, endothelial,
neuronal and epithelial cell lineage. Furthermore, various
76
in vivo approaches revealed the ability of the cells derived from the stroma-vacsular fraction of adipose tissue
to repair ischemic or damaged tissues. Altogether these
data strongly suggest that the stroma-vascular fraction
of the human adipose tissue contains cells that exhibit
properties like stem/progenitor cells. However, the exact
nature of the cells, their potentiality to lead to differentiated cells in vivo as well as the mechanisms involved
in their repair capability remain to be characterized to
consider their use in regenerative and reparative medicine.
Key-words: Progenitor – Preadipocyte – Endothelial cell
– Repair – Regeneration.
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Afin d’isoler et de caractériser la population de cellules progénitrices présentes dans
la FSV, notre groupe a développé une technique d’isolement des différentes populations
cellulaires de la FSV qui se fonde sur l’utilisation de nanoparticules magnétiques couplées à
des anticorps dirigés spécifiquement contre les marqueurs de surface CD34 (marqueur des
cellules souches hématopoïétiques et des cellules endothéliales capillaires), CD31 (marqueur
des cellules endothéliales et de la lignée hématopoïétique) et CD14 (marqueur des
monocytes/macrophages). Nous avons ainsi démontré que les cellules positives pour le CD34
et négatives pour le CD31 (CD34+/CD31-) sont la seule population cellulaire présente dans
la FSV capable de présenter la capacité de différenciation adipocytaire en condition
adipogénique (241). De plus, notre groupe a récemment mis en évidence que cette population
cellulaire CD34+/CD31- possède, en milieu endothélial, la capacité d’exprimer des
marqueurs endothéliaux et de s’organiser en structures semblables à des capillaires (173). Ces
résultats indiquent que la fraction cellulaire CD34+/CD31- de la FSV du TA humain, n’ayant
subi aucune étape d’extension in vitro, présente des propriétés de cellules progénitrices
capables de donner naissance à des cellules qui expriment des marqueurs phénotypiques des
adipocytes et des cellules endothéliales. Il reste cependant à déterminer si cette population
cellulaire est constituée d’un mélange de cellules progénitrices unipotentes ou de cellules
souches multipotentes. D’autre part et de façon inattendue, les cellules CD34+/CD31présentent des caractéristiques différentes des cellules souches mésenchymateuses et
hématopoïétiques puisqu’elles ne sont capables ni d’exprimer le marqueur CD105, propre
aux cellules souches mésenchymateuses, ni douées d’activité hématopoïétique, en conditions
de culture adaptées (241). Ainsi, l’origine mésenchymateuse des précurseurs adipocytaires
communément admise jusqu’ici est remise en question. Toutefois, il est important de noter
que la quantité de cellules souches mésenchymateuses dans la moelle osseuse est très faible
et que leur isolement requiert des phases d’expansion in vitro (210). Ainsi, aucune étude n’a
pu pour l’instant être réalisée sur des cellules souches mésenchymateuses fraîchement
isolées. L’expression de nombreux marqueurs de surface est modulée par la culture et l’état
de prolifération des cellules (112). Ainsi, l’expression du marqueur CD34 est connue pour
être diminuée alors que celle de CD105 est augmentée par l’état de prolifération cellulaire
(170, 173, 174, 241). On peut donc penser que l’expression du CD34 des cellules
progénitrices CD34+/CD31- du TA et l’absence du marqueur CD105 est relative au fait que
ces cellules n’ont pas subi de phases d’expansion. Il est à noter que certaines équipes
suggèrent
que
les
précurseurs
adipocytaires
pourraient
être
originaires
d’une
dédifférenciation des adipocytes matures (5, 186, 211). Cependant, peu de données sont en
21
accord avec cette hypothèse et l’on peut supposer que cette dédifférenciation apparente des
adipocytes pourrait être due à une contamination des adipocytes matures par des cellules
progénitrices. En effet, les études de Miyazaki et al. montrent qu’en condition de culture
flottantes (c’est-à-dire quand la surface cellulaire adhérente se trouve au-dessus des cellules),
des progéniteurs adipocytaires, fixés sur les adipocytes, sont capables de migrer sur la surface
de culture et de se différencier en adipocytes (175).
B.2) Le processus de différentiation adipocytaire
B.2.1) Les étapes du processus de différenciation adipocytaire
La différenciation adipocytaire proprement dite ou adipogenèse représente le passage
du préadipocyte à l’adipocyte mature. Après une phase de croissance exponentielle, le
précurseur déterminé vers la lignée adipocytaire ou adipoblaste marque un arrêt de croissance
à confluence (figure 5). Ces cellules deviennent alors des préadipocytes et s’engagent dans
l’adipogenèse proprement dite. Tout au long du processus d’adipogenèse vont se succéder
différents événements morphologiques, biochimiques et moléculaires, que l’on regroupe en
deux catégories, les événements précoces et tardifs.
Les événements précoces concernent en particulier le remodelage de la matrice
extracellulaire (MEC) et du cytosquelette (figure 6). Au cours de la différenciation
adipocytaire, la composition de la MEC est fortement modifiée. D’une structure riche en
fibronectine, sa composition va évoluer vers une structure de type lame basale, composée
essentiellement de laminine, collagène IV et d’entactine (151). En effet, une diminution de la
production du collagène fibrillaire de type I et III et de la fibronectine et une augmentation de
la production de la laminine, des protéoglycans, de l’entactine et du collagène de type IV ont
été observés au cours de la différenciation des préadipocytes d’origine murine et bovine (132,
133, 184). Des cultures de préadipocytes murins, porcins et humains réalisées sur différents
supports matriciels ont souligné la variation d’adipogenèse selon le type de matrice utilisé
suggérant le rôle essentiel de la composition et de l’organisation de la MEC dans la
différenciation adipocytaire (95, 98, 133). Ainsi, l’ensemble de ces données suggère
l’importance du remodelage de la MEC durant le processus adipogénique. Grâce à un
remodelage matriciel, les tensions avec le cytosquelette sont modifiées. Des changements
dans la forme de la cellule sont possibles par une réorganisation du réseau intracellulaire
d’actine (252). L’ensemble de ces remodelages matriciels, du cytosquelette et de la forme de
22
Collagène I, III
Fibronectine
Structure fibroblastique
des préadipocytes
Confluence et engagement
des préadipocytes
C/EBP
PPARγ
Remodelage du cytosquelette
et transcription de gènes
adipogéniques (C/EBP et PPARγ)
Remodelage matriciel
via des protéases
Synthèse d’aP2,
LPL, FAS …
Synthèse de la MEC par
les préadipocytes au cours
de la différenciation
Collagène IV et Entactine
Adipocytes matures
Figure 6 : Evolution de la matrice extracellulaire et de la forme cellulaire au
cours de la différenciation adipocytaire
D’après Lilla J, Am J Path, 2002
la cellule permet alors aux préadipocytes de subir une étape d’expansion clonale liée à une
série de réplications de l’ADN ou mitoses dites post-confluentes.
A la suite de ces événements précoces, les préadipocytes sont dits « engagés dans la
différenciation adipocytaire ». En anglais, on parle encore de « commitment » des
préadipocytes. Enfin, une étape de maturation terminale permet d’obtenir les adipocytes
matures. Cette maturation terminale est marquée par l’acquisition des propriétés
métaboliques et sécrétoires des adipocytes matures (91).
B.2.2) Contrôle transcriptionnel de la différenciation adipocytaire
Les changements morphologiques majeurs qui accompagnent la différenciation
adipocytaire, tels que l’arrondissement des cellules et l’accumulation progressive de vacuoles
lipidiques dans le cytoplasme, sont la conséquence de variation d’expression d’un très grand
nombre de gènes. Cette reprogrammation génétique profonde est sous le contrôle de facteurs
de transcription pro- ou anti-adipogéniques dont les principaux sont les facteurs PPARs
(Peroxisome proliferator-activated receptors), les C/EBPs (CCAAT/enhancer binding
proteins) et le facteur ADD1/SREBP-1c (Adipocyte determination and differentiation factor
1/sterol regulatory element binding protein-1c) (pour revue (74, 226).
B.2.2.1) Les PPARs
Les facteurs de transcription PPARs appartiennent à la superfamille des récepteurs
nucléaires. Une fois activés par la liaison à leur ligand, ils forment des hétérodimères avec les
récepteurs de l’acide 9-cis-rétinoïque (RXR) qui reconnaissent spécifiquement des éléments
de réponse PPRE (« PPAR Responsive Element ») situés dans les régions promotrices de
gènes cibles. Chez les mammifères, trois isoformes de PPARs α, β (ou δ ou NUC-1 (nuclease
abnormal-1)), et γ ont été décrites, chacun codé par un gène différent et caractérisés par une
distribution tissulaire, des ligands, des co-facteurs et des fonctions qui leur sont propres. De
multiples études démontrent que PPARγ, et plus particulièrement PPARγ2, est
préférentiellement exprimée dans les adipocytes et joue un rôle majeur dans le contrôle
transcriptionnel de la maturation terminale de l’adipocyte. En effet, il transactive de
nombreux gènes marqueurs de la différenciation adipocytaire, tels que celui de la LPL ou
celui codant pour la protéine de transport aux acides gras (aP2) (228). Plusieurs ligands
capables d’activer le PPARγ majorent le taux de conversion adipocytaire et l’amplitude de la
23
différenciation. C’est notamment le cas des thiazolidinediones qui sont utilisées dans le
traitement du diabète et de l’insulino-résistance. De plus, la 15-déoxy-δ prostanglandine et
l’acide lysophosphatidique (LPA) sont décrits comme des activateurs du facteur de
transcription (23, 171). Toutefois leur affinité pour le PPARγ est beaucoup plus faible que
celle habituellement décrite pour les récepteurs nucléaires avec leurs ligands physiologiques.
B.2.2.2) Les C/EBPs
Les facteurs C/EBPs appartiennent à la famille des facteurs de transcription à motifs
basiques et glissières de leucines (bHLH, « basic Helix Loop Helix »). Le domaine basique
permet à ces facteurs de se lier à l’ADN alors que le motif en glissières de leucines leur
permet de s’homo- ou de s’hétéro-dimériser. Trois isoformes de C/EBPs, α, β et γ, possèdent
un rôle inducteur dans l’adipogenèse (227, 228). Les C/EBPs β et γ sont induits de façon très
précoce et transitoire au cours de l’adipogenèse, et jouent un rôle clé dans l’enclenchement de
la maturation terminale. L’induction de C/EBPα se fait plus tardivement et permet de
transactiver différents gènes marqueurs de la différenciation adipocytaire tels qu’aP2, PPARγ
et la leptine mais également d’induire sa propre expression (227, 228). Récemment, des
travaux ont montré que des souris déficientes pour CHOP-10 (CCAAT/enhancer binding
protein (C/EBP) homologous protein), un facteur de transcription anti-adipogénique
appartenant à la famille des C/EBPs présentent une adiposité importante mais aucun désordre
métabolique associé (6). Cet effet semble impliquer les facteurs C/EBPs.
Les nombreuses données expérimentales obtenues depuis ces dernières années et sur
les lignées murines principalement, ont permis de proposer un modèle de progression des ces
facteurs de transcription au cours de l’adipogenèse (figure 7) (7).
B.2.2.3) Le facteur SREBP-1
Le facteur ADD1/SREBP-1 fait partie de la famille des facteurs à motifs héliceboucle-hélice (bHLH-LZ pour basic helix-loop-helix-leucine zipper). Le domaine HLH
permet à ces facteurs de former des homo- ou hétero-dimères avec des protéines de la même
famille. Après dimérisation, le complexe se lie par le domaine basique à des séquences
spécifiques dites E-box, situées au niveau des promoteurs de gènes cibles. De nombreuses
études ont montré l’implication de SREBP-1 au niveau hépatique et adipocytaire dans la
24
Figure 7 : Progression des facteurs de transcription au cours de l’adipogènese dans
les préadipocytes de la lignée 3T3-L1
D’après Avram MM., J. Am. Acad. Dermatol., 2007
régulation de nombreux gènes impliqués dans le métabolisme du cholestérol, des TG et des
acides gras (65, 103). Au niveau du TA, il favorise l’adipogenèse en induisant l’expression de
PPARγ (73, 122).
B.2.2.4) Les autres facteurs de transcription
En dehors de ces intervenants essentiels dans l’adipogenèse, d’autres facteurs
transcriptionnels aux fonctions pro- ou anti-adipogéniques constituent potentiellement des
régulateurs importants de la différenciation adipocytaire. Ces différents facteurs sont
identifiés et présentés dans la figure 8 (d’après revue (78)). Notons que les facteurs de
transcription Kruppel-like factor 15 et 5 (KLF15 et 5), appartenant à la famille des facteurs à
doigts de zinc, sont décrits comme étant pro-adipogéniques alors que KLF2 est antiadipogénique (177, 194, 292). Le facteur Krox 20 apparaît comme le facteur le plus précoce
induit directement par les signaux hormonaux (39). De manière intéressante, le facteur de
transcription CREB (cAMP-response-element binding protein) a été impliqué dans
l’accumulation des TGs dans des préadipocytes murins soumis à une dysfonction
mitochondriale par un traitement avec l’antimycin A (272).
B.2.3) Régulation hormonale et intracellulaire de la différenciation adipocytaire
Le processus d’adipogenèse que nous venons d’aborder est hautement contrôlé par de
nombreux facteurs de nature très variée: hormones, cytokines, nutriments et molécules de
signalisation cellulaire. Les principaux facteurs connus sont présentés dans le tableau 2 et
classés selon leur effet pro- ou anti-adipogénique.
25
CHOP
CUP
Ids δ-IP
δ-FosB
GATA-2 et -3
RARα
SMADs
TCF/LEF
KLF2
PPARγ et δ
C/EBP α, β et γ
SREBP-1
CREBs STATs NFATs
FOXC2
Foxa-2
HMGs
LXR
KLF5 et 15 Krox20
Rev-erb- α Notch
Facteurs de transcription
anti-adipogéniques
Facteurs de transcription
pro-adipogéniques
Figure 8 : Balance entre les facteurs de transcription pro- et anti-adipogéniques
(CHOP: C/EBP homologous protein; CUP: C/EBP unidentified protein; Ids: inhibitor of
DNA binding; RARα: retinoic acid receptor α;TCF/LEF: T-cell factor/Lymphoid enhancer
factor; KLF: Kruppel like factor; CREBs: cAMP responsive element binding protein;
STATs: signal transducers and activators of transcription; NFATs: nuclera factor of
activated T cells; FOXC2: Forkhead box C2; HMGs: high mobility group proteins; LXR:
liver X receptor)
D’après Fève B. , Best. Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab., 2005
Tableau 2: Facteurs extracellulaires et molécules de signalisation régulant la
différenciation adipocytaire
Facteurs pro-adipogénique
Hormone
Facteurs anti-adipogéniques
Hormone de croissance, Prolactine
Déhydroépiandrostérone
Insuline, T3
Vitamine D (selon les modèles)
Glucocorticoïdes
Endothéline
Vitamine D (selon les modèles)
Résistine
Prostaglandines I 2 et J 2
Prostaglandines F 2α
Angiotensinogène (via la synthèse de
prostaglandines)
IGF1 (insulin-like growth factor 1)
EGF (epidermal growth factor)
facteurs de
LIF (leukaemia inhibitory factor)
PDGF (plateled-derived growth factor)
croissance
FGF10 (fibroblast growth factor 10)
TGF-α et β (transforming growth factor)
BMPs (Bone morphogenetic proteins)
bFGF (basic fibroblast growth factor)
MCSF (macrophage colony stimulating
TNF-α (tumor necrosis factor α)
factor)
Interleukine 1, 6 et 8, Interféron γ
Cytokines et
Adiponectine
Nutriments
Acides gras, glucose, acides aminés
Molécules de
AMPc, H 2 0 2 (à faibles doses)
Protéine kinase C
signalisation
Ras et Erk1 et 2 (à un stade précoce et MAP kinase Erk1 et 2 (à un stade tardif)
transitoire)
Kinase AMP-dépendante (AMPK)
MAP Kinase p38
c-Jun amino-terminal kinases (JNK)
Phosphatidy-inositol 3-kinase
Protéine kinase B
Autres
Voie NF-κB
Pref 1, Wnt10b,
B.3) La vascularisation du tissu adipeux
Au cours du développement embryonnaire du TA, l’angiogenèse est étroitement liée à
l’adipogenèse (52, 285). Des études d’implantation sous-cutanée de préadipocytes de la
lignée 3T3F442A chez des souris athymiques, ont clairement associé l’apparition de
marqueurs adipocytaires aux marqueurs endothéliaux au site d’injection (90, 185). Ces
résultats sont confirmés par les travaux de Fukumura et al. montrant que des préadipocytes
26
transfectés par un dominant négatif de PPARγ empêchant l’adipogenèse, inhibe
l’angiogenèse au site d’implantation. En parallèle, l’inhibition de l’angiogenèse par un
traitement avec un anticorps neutralisant anti-VEGF-R2, inhibe l’adipogenèse (83). Ainsi,
adipogenèse et angiogenèse sont donc deux phénomènes étroitement liés.
Le rôle de l’endothélium dans le développement du TA est reconnu depuis longtemps
(285). Cependant, il a été négligé par le fait que le TA était généralement considéré comme
peu vascularisé. Cette observation est essentiellement liée à la difficulté d’accès aux
capillaires du TA, du fait de la grande taille des adipocytes matures et de leur organisation en
couches multiples. En effet, l’analyse du TA après une période de jeûne chez l’animal qui
s’accompagne d’une diminution du diamètre des adipocytes a permis de mettre en évidence
l’ensemble du réseau vasculaire de ce tissu (225). Ainsi, en évaluant la densité capillaire du
TA ou en marquant les érythrocytes au chrome 51, des études ont montré que le réseau
vasculaire du TA est aussi important que celui du muscle squelettique et que chaque
adipocyte présente des contacts étroits avec au moins un capillaire sanguin (94, 107).
L’importance de l’endothélium pourrait en partie s’expliquer par le rôle clé de la surface
endothéliale dans le contrôle de la lipogenèse adipocytaire via la LPL, enzyme sécrétée par
les adipocytes et active à la surface des cellules endothéliales. En effet, les cellules
endothéliales semblent jouer un rôle direct dans les phénomènes de trafic intercellulaire de la
LPL par la sécrétion d’un facteur qui, sous stimulation de l’insuline, libèrerait la LPL des
protéoglycans à héparane sulfate adipocytaires (126).
En résumé, les lignées cellulaires murines ont permis une étude approfondie des
processus de détermination et de différenciation adipocytaires. Le processus de
détermination adipocytaire est cependant peu connu contrairement à la différenciation
adipocytaire qui a suscité de nombreuses études. Par ailleurs, la mise en évidence
récente de cellules souches multipotentes au sein de la FSV permet au TA d’acquérir un
nouveau statut de « source d’approvisionnement de cellules souches/progénitrices »
pour d’éventuelles thérapies cellulaires. Cependant, de nombreux points restent encore
à élucider, notamment déterminer si la FSV du TA renferme un pool de cellules souches
aux potentialités variées ou bien une seule et unique cellule multipotente. De même,
malgré
des
similitudes,
il
est
nécessaire
de
déterminer
si
les
cellules
souches/progénitrices issues du TA adulte sont identiques aux préadipocytes d’origine
embryonnaire et si des différences inter-espèces sont observées (hommes vs rongeurs).
27
C) Le développement excessif du tissu adipeux : l’obésité
L’indice de masse corporelle (IMC), rapport du poids sur la taille au carré, permet
d’évaluer la corpulence d’un individu adulte. Le tableau 3 présente la classification des
adultes de poids normal, en surpoids, obèse ou maigre (sous-poids).
Tableau 3: Classification des adultes maigres, normaux, en surpoids et obèses selon
l’IMC
IMC (kg/m2)
Classification
Sous-poids
< 18,50
Maigreur sévère
< 16,00
Maigreur modérée
16,00 - 16,99
Maigreur légère
17,00 - 18,49
Poids normal
18,50 - 24,99
Surpoids
≥ 25,00
Pré-obèse
25,00 - 29,99
Obésité
≥ 30,00
Obésité de classe I
30,00 - 34,99
Obésité de classe II
35,00 - 39,99
Obésité de classe III
≥ 40,00
Classification définie par l’organisation mondiale de la Santé
D’après WHO expert consultation, The Lancet, 2004,.(48)
L’obésité correspond à une surcharge pondérale résultant d’un développement
excessif du TA. Les potentialités d’extension du TA sont uniques. En effet, la masse grasse
peut-être multipliée par quatre chez un individu obèse et peut représenter jusqu'à 60 à 70% de
sa masse corporelle.
De nombreux événements cellulaires et biochimiques sont responsables de la
croissance excessive du TA adulte. Dans les paragraphes suivants, nous allons voir les
modifications du TA lors de l’obésité, aussi bien dans sa composition cellulaire que dans ses
fonctions métaboliques et sécrétoires.
28
C.1) Les modifications cellulaires du tissu adipeux
C.1.1) Les adipocytes et les cellules souches/progénitrices
Les changements dans la masse du TA sont associés à des modifications de la taille et
du nombre des adipocytes (214). L’augmentation du volume des adipocytes correspond à une
hypertrophie adipocytaire. Le diamètre moyen d’un adipocyte peut aller jusqu’à 120µm chez
le sujet obèse. Selon l’hypothèse dite de la « taille critique », la cellule adipeuse se chargerait
en TGs jusqu'à atteindre une taille critique au-delà de laquelle une phase d’hyperplasie
apparente apparaîtrait au sein du tissu. Ces nouveaux adipocytes proviendraient de la
prolifération et/ou du recrutement de cellules progénitrices associés à leur différenciation. Les
études de Crossno et al montrent que des souris soumises à un régime gras sont capables de
recruter des cellules souches de la moelle osseuse dans le TA afin de former de nouveaux
adipocytes (54), cependant les mécanismes impliqués ne sont pas caractérisés. Ainsi deux
phases adipocytaires auraient lieu dans le TA une phase d’hypertrophie cellulaire suivie dans
les cas d’obésité sévère d’une hyperplasie adipocytaire (15, 249). Les mécanismes
responsables de l’hypertrophie adipocytaire s’expliquent par des altérations des activités
métaboliques (lipogenèse et lipolyse) des adipocytes. Nous le verrons dans le chapitre
suivant. L’augmentation du nombre d’adipocytes est moins bien définie. Récemment, les
travaux de Tchoukalova et al. indiquent que la proportion des préadipocytes de la FSV,
positifs pour le marqueur aP2 et négatifs pour le CD68 (un marqueur des macrophages), est
diminuée avec l’obésité (262). Ces travaux peuvent être associés à ceux de van Harmelen
indiquant que la capacité de différenciation adipocytaire des cellules de la FSV est
négativement corrélée avec l’IMC (271).
C.1.2) Les cellules endothéliales
Des travaux de notre groupe indiquent que l’évolution du réseau vasculaire est
parallèle à celui de la masse adipeuse suggérant que le développement du TA est associé à
une néovascularisation. En effet, le pourcentage de cellules endothéliales des capillaires
sanguins, caractérisées par la double expression CD34 et CD31, au sein de la FSV, reste
constant avec l’augmentation de l’IMC (173). La dépendance du TA vis-à-vis de son réseau
vasculaire au cours de l’obésité a été mise en évidence grâce à de récents travaux montrant
que des facteurs anti-angiogéniques limitent le développement de la masse grasse dans
29
différents modèles de souris obèses (19, 233). De plus, l’apoptose sélective des cellules
endothéliales, in vivo par l’utilisation d’un phage contenant un peptide pro-apoptotique
associé à la prohibitine, une protéine membranaire de surface, entraîne une réversion de
l’obésité chez la souris (129). Ainsi, le réseau vasculaire joue un rôle déterminant dans la
croissance mais également dans le maintien de la masse grasse. Les mécanismes impliqués
dans l’extension du réseau vasculaire lors du développement du TA ne sont pas connus.
Cependant, de nombreuses évidences montrent que les adipocytes sécrètent de nombreux
facteurs angiogéniques (16, 17, 154, 301) et que cette production est augmentée avec l’état
d’obésité (247). De plus, on peut supposer que les cellules CD34+/CD31- pourraient
également via des processus de vasculogenèse, i.e. différenciation en cellules endothéliales,
participer à l’augmentation du résseau vasculaire du TA. Récemment, une étude réalisée sur
un modèle de souris obèse db/db a évalué simultanément l’angiogenèse et l’adipogenèse et a
montré une étroite relation spatiale et temporelle entre la formation de nouveaux vaisseaux
sanguins à partir de vaisseaux préexistants et le processus de différenciation adipocytaire
(189).
C.1.3) Les macrophages
La présence de macrophages au sein du tissu adipeux a été mise en évidence depuis
longtemps par les histologistes (263) mais n’a suscité que très peu d’intérêt jusqu'à ces
dernières années. Des observations récentes suggèrent l’implication de cette population
cellulaire dans l’installation d’un état pro-inflammatoire, au sein du TA, lors de son
développement excessif. En effet dans différents modèles animaux d’obésités, une
accumulation de macrophages a été observée lors du développement de la masse grasse (286,
293). De plus, notre groupe a montré que le pourcentage de macrophages au sein de la SVF
est corrélé de façon positive avec l’IMC dans les tissus adipeux sous-cutanés (55) et
viscéraux (56) humains. Inversement, l’équipe de K. Clément a montré que la quantité de
macrophages infiltrés dans le TA est diminuée après une perte de poids chez des sujets
obèses (24, 46).
L’origine de cette augmentation de la population macrophagique au sein du TA des
sujets obèses n’est pas bien comprise. De par les similitudes d’expression génique entre
adipocytes et macrophages et l’observation des capacités de phagocytose décrites dans le
préadipocyte humain, il a été suggéré que les macrophages puissent provenir de la
différenciation des préadipocytes (235). Cependant notre équipe n’a pu mettre en évidence
30
d’activité hématopoïétique à partir de précurseurs adipocytaires humains (241). Des
expériences de transplantation de moelle osseuse chez la souris démontrent que 80% des
macrophages du TA sont d’origine médullaire, suggérant ainsi que les macrophages du TA
sont issus de l’infiltration de monocytes sanguins circulants (286). De plus, notre groupe a
montré que les sécrétions adipocytaires stimulent l’activation endothéliale conduisant à une
augmentation de l’adhérence et de la transmigration des monocytes sanguins à travers
l’endothélium du TA humain (55). En conditions normales, la fonction majeure des
macrophages résidents au sein d’un tissu est d’éliminer le matériel étranger et les cellules
apoptotiques, processus essentiel dans le maintien de l’homéostasie tissulaire. Le rôle des
macrophages au niveau du TA lui-même reste à être clairement défini. Toutefois, des travaux
récents chez la souris indiquent que l’infiltration des macrophages due à une obésité induite
par un régime hypercalorique semble être plus liée à l’insulino-résistance associée à l’obésité
qu’à l’augmentation de la masse grasse (155, 192, 286).
C.2) Les modifications des fonctions métaboliques du tissu adipeux
Au cours de l’obésité, une augmentation de la lipogenèse semble évidente. Quelques
études ont rapporté que l’activité de la LPL était associée à la taille des adipocytes (66, 75).
Un excès de masse grasse s’accompagne également d’une altération de la fonction lipolytique
du TA au repos et au cours de l’exercice physique (102). Plusieurs travaux in vitro menés au
laboratoire ont évalué l’effet de l’obésité et du surpoids sur la régulation adrénergique de la
lipolyse. Le nombre de récepteurs
α2A -adrénergiques
des adipocytes. Ainsi, les récepteurs
a été corrélé positivement avec la taille
α2A -adrénergiques
sont fortement exprimés dans le TA
sous-cutané où les adipocytes sont hypertrophiés, et bien plus dans le tissu fémoral
qu’abdominal suggérant une faible activité lipolytique de l’adrénaline dans le TA abdominal
voire antilipolytique dans le TA fémoral chez la femme (13, 166). Chez le sujet obèse, les
réponses lipolytiques mesurées in situ dans le TA sous-cutané, sont très diminuées par
rapport à des sujets de poids normal au cours d’un exercice physique. Ceci s’explique par une
activation soutenue des récepteurs
α2A -adrénergiques,
surnuméraires dans les adipocytes
hypertrophiés de l’obèse (255). Par ailleurs, de nombreux travaux mentionnent une perte de
sensibilité du TA sous-cutané aux catécholamines au repos, ce qui entraîne une diminution
des réponses β -adrénergiques. Cette résistance aux catécholamines dans l’adipocyte d’obèse
pourrait provenir d’une diminution de la fonction
β2 -adrénergique
(70), d’une diminution de
l’activité et de l’expression de la LHS (143), ou encore de l’expression majoritaire d’une
31
isoforme catalytiquement inactive (219). Notons que des différences dans la lipolyse et la
lipogenèse ont été décrites dans les TA humains sous-cutanés et viscéraux de patients obèses
(72, 136).
C.3) Les modifications des fonctions sécrétoires du tissu adipeux
Comme nous l’avons précédemment évoqué, le TA se comporte comme un organe
endocrine. Ainsi, de nombreuses études se sont focalisées sur les modifications des sécrétions
de ce tissu au cours de l’obésité (72). Dans le tableau 4 sont présentés les principaux facteurs
connus pour être modulés lors du développement excessif de la masse grasse.
Tableau 4: Sécrétions du tissu adipeux modulées au cours de l’obésité
Augmentation
Hormone
Leptine
Facteurs de croissance
TNF-α
et cytokines
IL-1, 6, 8 et 10
Diminution
Adiponectine
Résistine
Apeline
iNOS
TGF-β
MCP-1
HGF
Protéases et inhibiteurs
PAI-1
de protéases
Cathepsine K et S
MMP-9
Autres
Angiotensine
Tissue factor
Facteur VII
C-reactive protein
(TNF-α: tumor necrosis factor- α, IL: interleukine, iNOS: inducible nitric oxide synthase, TGF-β: transforming
growth factor-β, MCP-1: monocyte chemoattractant protein-1, HGF: hepatocyte growth factor, PAI1:plasminogen activator inhibitor 1, MMP-9 : matrix metalloprotease 9)
32
En résume, l’obésité chez l’homme s’accompagne d’un remodelage important de la
masse grasse associé à des modulations des fonctions métaboliques et sécrétoires du TA.
Les mécanismes responsables de ces changements ne sont pas totalement définis mais
ces altérations semblent être impliquées directement dans la genèse des pathologies
associées à l’obèsité. Ainsi l’augmentation de la population macrophagique
inflammatoire et les changements dans la production d’adipokines dont principalement
la leptine et l’adiponectine sont deux éléments clés dans le développement de l’insulinorésistance et de la dysfonction endothéliale, évènements précoces impliqués dans le
diabète de type II et les pathologies cardiovasculaires.
33
D) La régression du tissu adipeux : la lipoatrophie
En plus de ces capacités de croissance, le TA est également capable de régression. On
parle de lipoatrophie ou lipodystrophie. La classification des syndromes de lipoatrophies est
indiquée dans le tableau ci-dessous.
Tableau 5: Classification des différentes lipoatrophies humaines
Classification des lipoatrophies humaines
1) Génétiques
- Lipodystrophie congénitale généralisée (Syndrome de Berardinelli-Seip)
Type 1 : mutations d’une acyltransférase codée par AGPAT2
Type 2 : mutations de la séipine
- Lipodystrophie familiale partielle
Type Dunnigan : mutations de la lamine A/C
Associée à PPARγ : mutations de PPARγ
Associée à Akt2/PKB : mutations de Akt/PKB
- Dysplasie mandibuloacrale
Type A, partielle, mutations de la lamine A/C
Type B, généralisée, mutations de ZMPSTE24 (une métalloprotéase à zinc)
- Syndromes progéroïdes (Syndrome de Werner, syndrome Cockayne)
- Syndrome de déficience en carbohydrate glycoprotéine
- Syndrome SHORT (Short stature, Hyperextensibility, Hernia, Ocular depression, Rieger
anormaly and Teething delay)
2) Présumées inflammatoires ou autoimmunes
- Lipoatrophie acquise généralisée (Syndrome de Lawrence)
- Lipoatrophie acquise partielle (Syndrome de Barraquer-Simons)
- Lipoatrophie acquise associée à des dermatomyosites
- Lipodystrophie associée à une hypocomplémentémie
3) Acquises, de causes inconnues
- Lipodystrophie associée aux traitements anti-VIH
D’après Reitman et al, TEM, 2000 et Garg et al, Clinical Cornestone, 2006
34
Dans certains syndromes de lipoatrophie, l’absence localisée au niveau de la face et
des membres ou généralisée de TA est associée à une accumulation du TA au niveau des
régions abdominales, dorso-cervicales et mammaires. On parle dans ce cas de
lipodystrophies. Ces syndromes peuvent avoir des causes génétiques, immunes ou associées
aux traitements thérapeutiques lors d’infection en particulier pour le VIH (pour revue (25,
222). Paradoxalement elles sont, comme l’obésité, associées à des complications
métaboliques telles que l’hypertriglycéridémie, l’insulino-résistance, la stéatose hépatique et
les pathologies cardio-vasculaires.
Les syndromes lipoatrophiques étaient très rares (moins de 1 cas pour 100 000)
jusqu’à ces dix dernières années où sont apparues les formes liées aux traitements
antirétroviraux de l’infection par le VIH. Ce sont les inhibiteurs de la protéase du VIH (IPsVIH) qui ont été initalement associés à l’émergence de ce syndrome (31, 33, 34). Cependant,
des travaux démontrent que des patients séropositifs recevant des inhibiteurs nucléosidiques
de la reverse transcriptase du VIH en particulier la stavudine et la zidovudine (INRTs) et
naïfs pour les IPs-VIH développent également une lipoatrophie périphérique (20, 32, 157).
Par ailleurs, il a été rapporté que ces traitements pourraient agir en synergie entraînant une
atrophie profonde du TA (158, 269).
Au cours de ce paragraphe, nous allons faire le point sur les modifications cellulaires,
métaboliques et sécrétoires du TA lors d’une régression importante. Nous nous appuierons
essentiellement sur les données des lipoatrophies associées aux traitements anti-VIH qui sont
actuellement les lipoatrophies les plus fréquentes et les plus étudiées (276).
D.1) Les modifications cellulaires du tissu adipeux
Les études réalisées sur le TA sous-cutané des patients traités par les IPs-VIH et les
INRTs montrent une atteinte profonde de la morphologie du TA (62, 110, 152). Les effets
décrits des IP-VIH et des INRTs sur les différents types cellulaires qui composent le TA vont
être abordé dans les paragraphes suivants.
D.1.1) Les adipocytes
Une perte de poids est forcément associée à une diminution de la taille et/ou du
nombre des adipocytes. Si l’existence d’une différenciation adipocytaire après les phases de
développement normal est maintenant connue, la possibilité d’une perte des adipocytes est
35
moins bien documentée. Les études sur l’apoptose dans le TA sont peu abondantes (250).
Cependant, il est admis que l’apoptose peut se produire dans le TA et notamment dans les
adipocytes matures. Un certain nombre de facteurs ont été rapportés pour entraîner l’apoptose
des adipocytes in vitro, notamment des cytokines inflammatoires telles que le TNFα (213),
des flavonoïdes et des acides gras polyinsaturés (121, 188).
Une augmentation de l’apoptose des adipocytes a été décrite chez des patients infectés
par le VIH et ayant développé une lipoatrophie du TA suite aux traitements antirétroviraux
(62, 63, 110). Il est admis que les traitements antirétroviraux influent sur ce processus
apoptotique. En effet, il a été rapporté que le nelfinavir (NFV), un IP-VIH, favorise
l’apoptose des préadipocytes différenciés murins des lignées 3T3-L1 et 3T3F442A (12, 64).
Notons que les mécanismes directement mis en jeu ne sont pas encore définis. Par ailleurs,
ces effets apoptotiques ne sont pas retrouvés dans les préadipocytes murins non différenciés
(64). Le NFV a également été rapporté pour induire la nécrose des préadipocytes différenciés
de la lignée 3T3F442A via une augmentation des espèces réactives de l’oxygène (278)
associée à un stress du réticulum endoplasmique (264).
Concernant les INRTs, une étude indique que la stavudine (un INRT) entraîne une
apoptose des préadipocytes différenciés murins de la lignée 3T3F442A (28). De plus, des
patients traités avec la stavudine ont une augmentation de l’apoptose dans le TA mise en
évidence par la technique TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP digoxigenin
nick-end labeling) (168). Il semblerait que l’apoptose adipocytaire induite par les INRTs soit
due à la genèse d’une toxicité mitochondriale. En effet, le TA des patients infectés par le VIH
et traités avec les INRTs, dont principalement la stavudine, présente des dysfonctionnements
mitochondriaux tels qu’une baisse des taux d’ADN mitochondrial (ADNmt) et des anomalies
de structure des mitochondries (169, 281). De plus, le remplacement de la stavudine par
d’autres INRTs tels que l’abacavir ou la zidovudine améliore les taux d’ADNmt et prévient
l’apoptose (168). Ces phénomènes peuvent s’expliquer par le fait que les INRTs pourraient
inhiber, outre la réverse transcriptase du VIH, d’autres ADN polymérases et notamment,
l’ADN polymérase mitochondriale γ. Cette polymérase est impliquée dans la réplication de
l’ADNmt et son inhibition conduit à une déplétion des taux d’ADNmt et/ou à des altérations
de la structure génomique de l’ADNmt (245) provoquant ainsi une augmentation des espéces
réactives de l’oxygène et l’apoptose cellulaire. L’apoptose des adipocytes joue donc un rôle
important dans l’apparition du syndrome de lipoatrophie associée aux traitements
antirétroviraux. Les travaux de Pajvani et al. ont permis de montrer par l’utilisation de souris
transgéniques surexprimant de manière conditionnelle la caspase 8, une enzyme pro36
apoptotique, spécifiquement dans les adipocytes, l’expression du transgène étant sous le
contrôle du promoteur d’aP2, que le déclenchement de l’apotose adipocytaire par activation
de la caspase 8 s’accompagnait d’un phénotype lipoatrophique. Ces travaux démontrent ainsi
que l’induction et le maintien d’une apoptose adipocytaire pourraient contribuer à la genèse
des lipoatrophies (201, 266)
D.1.2) Les cellules progénitrices/ souches
Outre les effets des composés antirétroviraux sur l’apoptose adipocytaire, de
nombreux travaux montrent que ces composés altèrent également le processus de
différenciation adipocytaire. De nombreuses études ont évalué l’effet des IPs-VIH tels que le
saquinavir (SQV), le nelfinavir (NFV) et l’indinavir (IDV) sur la différenciation des
préadipocytes murins des lignées 3T3-L1 et 3T3F442A et ont montré que ces inhibiteurs de
protéases limitent leur différenciation adipocytaire (64, 144, 176, 300). Chez l’homme, il
existe peu de données concernant les effets des IPs-VIH sur la différenciation adipocytaire.
Deux études réalisées sur des cellules de la FSV du TA humain d’origine mammaire et des
cellules souches mésenchymateuses humaines confirment les effets anti-adipogéniques de
l’IDV et du SQV (109, 288). A l’inverse, les effets des INRTs sur la différenciation des
préadipocytes murins ne sont pas clairs. Certaines études rapportent que ces inhibiteurs
entraînent une diminution de l’adipogenèse (224) et d’autres n’observent aucun effet (28,
198). Récemment un inhibiteur non nucléosidique de la reverse transcriptase du VIH
(INNRT), l’efavirenz, a également fait l’objet d’une étude in vitro. Il a été observé que cet
INNRT inhibe la différenciation des préadipocytes murins de la lignée 3T3-L1 et humains
(68) suggérant que la troisième classe de médicaments utilisée pour le traitement du VIH
contribue à l’altération de la masse grasse. In vivo, sur des biopsies de TA sous-cutané
provenant de patients infectés par le VIH et ayant développé une atrophie adipocytaire, suite
au traitement antirétroviral, des altérations des taux de CEBP/α, de PPARγ et de SREBP-1
ont également été décrites (10). Ces résultats suggèrent que les IPs-VIH altèrent les processus
de différenciation adipocytaire dans les étapes précoces. Cependant, les cibles exactes de ces
composés ne sont pas encore totalement définies.
L’effet anti-adipogénique des IPs-VIH pourrait tout d’abord s’expliquer par des
interactions avec la voie de signalisation de l’acide rétinoïque. En effet, la région catalytique
de la protéase du VIH qui lie les IPs-VIH a environ 60% d’homologie avec CRABP-1
(cytoplasmic retinoic acid binding protein-1), un régulateur intracellulaire des taux d’acide
37
rétinoïque. Ainsi, les IPs-VIH peuvent inhiber la fonction de CRABP-1 et limiter le processus
d’adipogenèse qui nécessite l’expression des gènes dépendants de l’acide rétinoïque (34). De
plus, les IPs-VIH ont été également décrits pour être des inhibiteurs du cytochrome P450 3A,
l’unique enzyme connue pour convertir l’acide rétinoïque en acide cis-9-rétinoïque, le ligand
du RXR (Retinoïd X Receptor) qui par la suite s’hétérodimérise avec PPARγ (34).
Cependant, il faut rester prudent quant à ces données puisque des études ont rapporté que des
altérations du facteur de transcription PPARγ n’expliquent pas la diminution, induite par les
IPs-VIH, de la différenciation des préadipocytes murins et humains (144, 288, 300).
Des interactions entre SREBP-1 et les IPs-VIH ont également été décrites. Ainsi, le
traitement des préadipocytes de la lignée 3T3F442A par l’IDV et le NFV s’accompagne
d’une séquestration du facteur de transcription SREBP-1 au niveau de l’enveloppe nucléaire
des préadipocytes contrairement aux préadipocytes contrôles qui accumulent SREBP-1 au
niveau nucléaire (30). Le mécanisme responsable de cette séquestration de SREBP-1
consécutive à un traitement par les IPs-VIH n’est pas totalement élucidé. Cependant, certains
travaux suggèrent un rôle clé de la lamine A, protéine majeure de l’enveloppe nucléaire. Le
facteur SREBP-1 est synthétisé sous forme d’un précurseur inactif ancré au niveau du
réticulum endoplasmique ou de l’enveloppe nucléaire puis maturé par clivage protéolytique.
La forme mature active de SREBP-1 peut ensuite être transférée dans le noyau et activer
directement la transcription génique (21, 22, 284). Une interaction entre SREBP-1 et la
lamine A/C a déjà été décrite (153). La lamine A est synthétisée sous forme de prélamine A
et sa maturation est assurée par clivage à l’aide d’une métalloprotéinase, FACE chez
l’homme et Zmpste24 chez la souris. Les souris déficientes pour Zmpste24 présentent une
lipoatrophie associée à une accumulation de prélamine A au niveau de l’enveloppe nucléaire
(206). Le rôle clé de la lamine A et de la régulation de l’interaction lamineA/SREBP-1 dans
le contrôle de la différenciation adipocytaire est de plus souligné par les syndromes majeurs
de lipoatrophies génétiques qui sont dus à des mutations de la lamine A. Enfin, récemment il
a été montré que les IPs-VIH provoquaient une accumulation de prélamine A dans des
fibroblastes humains, suggérant que les IPs-VIH pourraient interagir avec FACE pour inhiber
la maturation de la lamine et empêcher l’accès du noyau au facteur adipogénique SREBP-1
(27, 47).
Enfin, une interaction des IPs-VIH avec le protéasome qui constitue la principale
machinerie de dégradation protéique chez les eucaryotes (51) a été envisagée. Des études ont
rapporté que les IPs-VIH sont des inhibiteurs de l’activité protéasomique de certaines cellules
cancéreuses (239) mais aussi de préadipocytes murins de la lignée 3T3-L1 (202). Or, les
38
inhibiteurs spécifiques du protéasome tels que la lactacystine inhibent la différenciation des
myoblastes (124), des ostéoclastes (299) mais aussi la différenciation des préadipocytes de la
lignée 3T3-L1 (212). Nous verrons dans le chapitre Résultats les données que nous avons
obtenues sur les interactions entre les IPs-VIH et le protéasome dans les préadipocytes
humains.
A ce jour, les mécanismes moléculaires des INRTs responsables de la baisse de
l’adipogenèse observée dans les travaux de Roche et al. sont inconnus. Etant donné l’action
des INRTs sur la fonction mitochondriale, il est tentant de spéculer que les INRTs peuvent
diminuer l’adipogenèse via une augmentation des espèces réactives de l’oxygène. En effet,
les espèces réactives de l’oxygène diminuent la prolifération et la différenciation adipocytaire
des lignées murines (35, 36).
Ainsi, l’ensemble de ces données suggère que la lipoatrophie associée au traitement
antirétroviral semble également être due à un défaut du processus de différenciation
adipocytaire. D’ailleurs, une étude récente implique majoritairement une altération de
l’adipogenèse plutôt qu’une induction de l’apoptose des adipocytes dans la lipoatrophie de
patients infectés par le VIH et sous tri-thérapie (181).
D.1.3) Les cellules endothéliales
Chez les patients infectés par le VIH et sous traitement antirétroviral, peu de données
concernent les cellules endothéliales. On peut noter que l’infection au VIH est associée à
l’activation de cellules endothéliales, observée par une augmentation plasmatique des
marqueurs cellulaires de surface tels que VCAM (Vascular Cell Adhesion Molecule), Eselectin et ICAM1 (Intercellular Adhesion Molecule) chez des patients séropositifs (40). Par
ailleurs, les traitements antirétroviraux entraînent des altérations de la fonction endothéliale
chez des patients sains (244) et des dommages de l’ADNmt dans les cellules endothéliales
humaines (114). Enfin, il a été observé, comme pour les adipocytes, une apoptose des cellules
endothéliales chez des patients infectés par le VIH et sous traitement antirétroviral (62).
Cependant, une augmentation de la densité des vaisseaux du TA atrophié de patients infectés
par le VIH et traités a également été observée (110) et on peut se demander si cette
augmentation apparente n’est pas relative en fait à la diminution du nombre et du volume
adipocytaire. Toutefois, il récemment a été observé que les INRTs favorisent l’angiogenèse
des cellules endothéliales humaines in vitro (61). A ce jour, il est difficile de conclure sur
39
l’effet de la régression du TA au niveau des cellules endothéliales. D’autres investigations
sont nécessaires.
D.1.4) Les macrophages
Dans le TA sous-cutané de patients infectés par le VIH et sous tri-thérapie est
observée une infiltration macrophagique (10, 62, 110, 190) similaire à celle observée dans le
TA de patients obèses (24, 286). Cette accumulation de macrophages pourrait être due à
l’apoptose des adipocytes. En effet, les travaux de Cinti et al. indiquent la présence de
macrophages dans les TA de souris et d’humains obèses au niveau des adipocytes nécrosés
(45). De manière identique, dans le modèle de souris lipoatrophiques surexprimant la caspase
8 dans le TA, il a été rapporté une augmentation du nombre de macrophages à proximité des
adipocytes en cours d’apoptose (201).
D.2) Les modifications des fonctions métaboliques du tissu adipeux
Les traitements antirétroviraux affectent également les deux grandes fonctions
métaboliques du TA. Ainsi, des études ont mis en évidence que les IPs-VIH diminuent la
lipogenèse des préadipocytes murins différenciés (64, 137, 144). Ces effets semblent être dus
à une diminution de l’activité de la LPL et de la synthèse de novo de lipides (218). Etant
donné que les IPs-VIH ont la capacité d’interagir avec le transporteur du glucose GLUT-4, il
a été suggéré que les effets des IPs-VIH sur la synthèse de novo de lipides passe par une
inhibition de l’activité de GLUT-4 et du captage du glucose (99, 179, 180). Récemment, une
inhibition de la lipogenèse a également été observée sur des préadipocytes murins
différenciés et traités avec des INRTs mais aussi avec l’efavirenz, un INNRT (68, 137).
La lipolyse est également touchée par les traitements antirétroviraux puisqu’ils sont
associés à une augmentation des taux circulants d’AGNE (93). L’activation de la lipolyse
semble être due à une combinaison complexe entre l’infection au VIH et les traitements
associés. En effet, une augmentation de la lipolyse a été rapportée chez des patients infectés
par le VIH et ce indépendamment du type de thérapie (268). In vitro, de nombreuses études
ont mis en évidence que les IPs-VIH stimulent la lipolyse des préadipocytes différenciés
murins (111, 144, 218, 231). De plus, une interruption de la prise de ces inhibiteurs diminue
l’activation de la lipolyse et les taux d’AGNE chez les patients (268). Récemment, une étude
40
indique que l’effet stimulateur des IPs-VIH sur la lipolyse semble être du à une baisse des
taux de périlipine par une augmentation de leur protéolyse lysosomale (130).
L’ensemble de ces phénomènes pourraient donc expliquer la diminution de la taille
des adipocytes chez des patients infectés par le VIH sous traitement antirétroviral (10, 152).
D.3) Les modifications des fonctions sécrétoires du tissu adipeux
Comme nous l’avons vu précédemment, le profil sécrétoire du TA varie au cours de
l’obésité. Aussi, il n’est pas surprenant que lors d’une perte importante de TA, ce profil soit
également modifié. Quelques études se sont intéressées aux modifications des sécrétions
adipocytaires dues aux IPs-HIV et aux INRTs in vitro sur des préadipocytes différenciés
murins et humains (118, 137, 139, 274) et in vivo dans le plasma et le TA de patients
séropositifs sous traitement antirétroviral (43, 110, 115, 182, 259, 275). Les principaux
facteurs connus pour être modulés par les traitements antirétroviraux in vitro et in vivo sont
présentés dans le tableau 6. Notons que l’effet des traitements antirétroviraux sur la leptine
n’est pas clair puisque deux études réalisées sur des préadipocytes différenciés humains
diffèrent (138, 274). Par ailleurs, la diminution de la sécrétion de leptine observée in vivo est
directement corrélée à la diminution de la quantité de TA des patients (275).
Tableau 6: Impact des IPs-VIH et des INRTs sur les sécrétions adipocytaires in vitro et
in vivo
Augmentation
Diminution
Pas de modification
IL-6 (137, 138, 274)
TNF-α (137, 138, 274)
Adiponectine
IL-1β (137, 138)
(137, 138, 274)
Leptine (274)
Leptine (138)
IL-6 (137, 138)
Adiponectine
TNF-α (137, 138)
(137, 138)
IL-1β (137, 138)
Leptine (138)
Patients sous
IL-6 (43, 115)
Adiponectine (259)
IPs-VIH et INRTs
TNF-α (43, 115)
Leptine (115)
IPs-VIH
INRTs
41
IL-1β (43)
Les modifications importantes des sécrétions adipocytaires dues aux traitements
antirétroviraux in vitro et in vivo pourraient contribuer à l’atrophie du TA et aux
complications métaboliques qui lui sont associées. En effet, ces sécrétions peuvent altérer les
principales fonctions métaboliques des adipocytes ainsi que leur survie cellulaire. De plus,
certaines d’entre elles peuvent également moduler l’adipogenèse telles que le TNF-α et l’IL-6
(pour revue (89)).
Pour conclure, les lipoatrophies résultent donc d’une profonde altération de la
composition cellulaire et des grandes fonctions métaboliques et sécrétoires du TA. Suite
à un défaut du maintien de l’homéostasie énergétique lors d’une perte de TA, ces
phénomènes sont associés à des complications métaboliques similaires à celles
rapportées lors d’un excès de TA. A l’heure actuelle, quelques approches
thérapeutiques
pour
le
traitement
des
lipoatrophies
ont
été
développées
(thiazolidinedione, metformine) mais elles agissent plus sur les complications
métaboliques associées que sur l’altération du TA elle-même. Ainsi, une meilleure
connaissance des mécanismes impliqués dans la régression de la masse grasse est
nécessaire afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
En conclusion de cette première partie, le TA subit donc un remodelage important
lors d’un développement excessif (obésité) ou d’une régression (lipoatrophie) (pour
illustration figure 9). Ainsi, la modification de la composition cellulaire du TA et les
altérations des fonctions métaboliques et sécrétoires de ce tissu pourraient jouer un rôle clé
dans les pathologies associées à l’obésité et aux lipoatrophies telles que le diabète de type II
et les pathologies cardiovasculaires. Une meilleure compréhension des mécanismes
impliqués dans la perte et le gain de poids ainsi que la découverte de nouvelles cibles
thérapeutiques sont donc nécessaires.
Il est évident que la plasticité du TA est possible grâce à fort remodelage tissulaire, au
niveau cellulaire mais aussi au niveau matriciel. De nombreuses protéases ont été décrites
pour être impliquées dans la régulation du remodelage tissulaire. Toutefois, les MMPs sont
les acteurs majeurs du remodelage matriciel. Dans le chapitre suivant, nous aborderons la
classification, la structure ainsi que la régulation de l’activité des MMPs. Puis, les modes
d’action et les fonctions biologiques auxquels les MMPs sont associées seront présentés.
Enfin nous aborderons le rôle potentiel de ces enzymes dans la plasticité du TA.
42
OBESITE
LIPOATROPHIE
Monocyte/
macrophage
Monocyte/
macrophage
Cellules
endothéliales
Cellules
endothéliales
Cytokines
pro-inflammatoires
Adipocyte
nécrosé
Acides gras libres
Adipocyte
nécrosé
Adiponectine
Insulino-résistance
Macrophage
Adipocyte
Adipocyte
Macrophage
Dyslipidémie
Syndrome métabolique
Figure 9 : Comparaison entre les modifications du tissu adipeux lors d’une
obésité ou d’une lipoatrophie
D’après Villaroya F., Int J Obes (Lond), 2007
II. Les métalloprotéases matricielles
Les MMPs font partie de la grande famille des metzincines. Elles sont impliquées
dans tous les processus nécessaires au développement et jouent un rôle majeur dans le
remodelage tissulaire via la dégradation de la MEC. Ainsi, elles sont associées à différentes
pathologies telles que l’arthrite rhumatoïde, les maladies cardiovasculaires et le
développement tumoral. Au cours de ce chapitre, nous allons nous intéresser aux MMPs en
général, à leur régulation, leur mode d’action et aux principales fonctions biologiques qui
leurs sont associées. Enfin, nous aborderons leur rôle dans le TA.
A) Classification et structure
Les MMPs constituent une famille d’endopeptidases à doigt de zinc comprenant, à ce
jour, au moins 24 membres dénommés soit par un nom descriptif, soit par un numéro. En
accord avec la spécificité de leur substrat et de leur structure, les membres de la famille des
MMPs ont été classés en au moins 5 familles distinctes: les collagénases, les gélatinases, les
stromélysines, les matrilysines et les MMPs de type membranaires (MT-MMPs) (Tableau 7).
Malgré une certaine spécificité de substrats, les spectres protéolytiques des différentes MMPs
sont assez larges et se recouvrent permettant ainsi la dégradation de l’ensemble des
composants de la MEC. Dans le tableau 7 se trouvent les différents substrats matriciels des
MMPs répertoriés grâce à des études in vitro (37, 254). Il est important de préciser qu’à ce
jour, tous les substrats des différentes MMPs ne sont pas encore connus et restent à être
déterminés. C’est notamment le cas des MMP-11 et -18.
La structure primaire des MMPs contient au minimum trois domaines: un prédomaine, un pro-domaine et un domaine catalytique proprement dit. Le pré-domaine, au
niveau N-terminal, correspond à un peptide signal. Il est nécessaire à la sécrétion des MMPs
puis est rapidement dégradé. Le pro-domaine maintient l’activité enzymatique sous forme
latente et est classiquement constitué d’une séquence peptidique comprenant un résidu
cystéine qui interagit avec l’atome de zinc au niveau du domaine catalytique (figure 10). Les
MMPs sont donc sécrétées sous forme latente ou zymogène. Pour être actives, le prodomaine doit être éliminé ou modifié par clivage protéolytique, libérant ainsi l’atome de zinc
du résidu cystéine et entraînant l’activation du domaine catalytique qui peut alors se lier à son
substrat. La plupart des MMPs possèdent en plus un domaine charnière riche en proline et un
domaine C-terminal contenant une séquence homologue à de l’hemopexine ou de la
43
vitronectine. Ce dernier domaine intervient dans la reconnaissance du substrat des MMPs.
Des particularités de structure sont observées pour certaines MMPs. Les MMP-2 et -9
possèdent, à l’intérieur de leur domaine catalytique, un domaine homologue à la fibronectine
qui est responsable de la forte affinité de ces enzymes pour la gélatine et le collagène. Les
MT-MMPs possèdent un domaine additionnel qui leur permet l’ancrage à la membrane
plasmique (254).
Tableau 7: Classification des métalloprotéases matricielles
Collagénases
Nom MMPs
1
1
2
8
3
13
4
A
18
2
B
9
1
3
2
10
Matrilysines
3
1
11
7
MT-MMPs
2
1
26
14
2
3
4
5
6
15
16
17
24
25
12
Gélatinases
Stromélysines
Autres
19
20
21
22
23
28
Substrats matriciels
Collagènes (I, II, III, VII, VIII et X), gélatine, PG
Collagènes (I, II, III, V, VII, VIII et X), gélatine et PG
Collagènes (I, II, III, IV, IX, X et XIV), gélatine, PG, FN,
laminine, tenascine, ostéonectine, fibrilline
?
Gélatine, collagènes (I, IV, V, VII, X, XI, et XIV), élastine,
tenascine, fibrilline, laminine, FN, ostéonectine et PG
Gélatine, collagènes (IV, V, VII, X, XI et XIV), élastine,
fibrilline, FN, laminine, entactine, ostéonectine et PG
Collagènes (II, III, IV, V, IX et X), FN, élastine, gélatine,
laminine, fibrilline, FN, tenacsine, entactine, ostéonectine et
PG
Collagènes (II, III, IV, V, IX et X), FN, élastine, gélatine,
laminine, caséine et PG
?
Collagènes (IV et X), élastine, FN, laminine, tenascine,
entactine, ostéonectine, gélatine, caséine et PG
Collagène IV, gélatine et FN
Collagènes (I, II, III et IV), gélatine, élastine, FN, laminine,
vitronectine, perlecan, fibrilline, tenascine, entactine et PG
FN, laminine, tenascine, perlecan, entactine et PG
Collagène III, FN, gélatine, PG, laminine, caséine
Fibrine, fibrinogène
PG
Collagène IV, FN, fibrine, gélatine
Collagène IV, gélatine, FN, laminine, vitronectine, élastine,
fibrilline, caséine et PG
Gélatine
?
?
?
?
??
(FN: fibronectine ; PG: protéoglycanes)
44
A
Structure de base des MMPs
MMP-1
MMP-3
MMP-8
MMP-10
MMP-11
MMP-12
MMP-13
MMP-19
MMP-20
MMP-21
MMP-27
MMP-28
MMPs avec un domaine fibronectine
MMP-2
MMP-9
MMP liées à la membrane
Transmembranaire:
MMP-14
MMP-15
MMP-16
MMP-24
Domaine minimum des MMPs
MMP-7
MMP-26
Pro-domaine
Protéase
Ancré au GPI
MMP-17
MMP-25
MMP-13
Domaine
fibronectine
de type II
Domaine
catalytique
Domaine
charnière
Domaine
hémopoxine
B
Domaine
membranaire
Figure 10 : Les métalloprotéases matricielles
(A) Structure
(B) Activation par clivage du pro-domaine
D’après Page-McCaw A., Nat Rev Mol Cell Biol, 2007
B) Les régulations des MMPs
Pour éviter une protéolyse excessive et des dommages tissulaires, l’activité des MMPs
est régulée par de multiples contrôles aussi bien au niveau de leur transcription, traduction et
sécrétion que de leur localisation, activation et inhibition (figure 11 et pour revue (254)).
Nous aborderons dans ce paragraphe les principales régulations des MMPs.
B.1) Les régulations transcriptionnelles et post-transcriptionnelles
L’expression des MMPs est normalement faible dans les tissus et est induite lorsqu’un
remodelage tissulaire est requis. Une large variété de facteurs solubles incluant des facteurs
de croissance et des cytokines tels que les interleukines 1α et β, les interférons α, β, et γ,
l’EGF, le FGF, le PDGF, le TGF-β et le TNF-α influent sur l’expression des MMPs. Il en est
de même pour les protéines de la MEC notamment les collagènes (290). De plus, des facteurs
non solubles tels que les contacts cellule-cellule et cellule-MEC ainsi que la forme de la
cellule modulent l’expression des MMPs (183, 254, 290). En effet, il a été observé que des
altérations morphologiques de divers types cellulaires entraînent une augmentation de
l’expression des collagénases (2) ainsi que l’activation de certaines intégrines (106).
L’étude des promoteurs des différentes MMPs a mis en évidence la présence de
plusieurs éléments de liaison pour divers facteurs de transcription tels qu’AP1 (activator
protein-1), PEA3 (polyoma enhancer A binding protein-3), NF-κB (nuclear factor-κB) et la
β-catenin (figure 12) (289, 295). Il est connu qu’AP1 lie les facteurs de transcription c-fos et
c-jun et que les sites PEA3 lient ceux de la famille ETS (E26 transformation specific). Le
facteur de transcription NF-κB est connu pour être impliqué dans les processus
d’inflammation et la β-caténine répond à la voie de signalisation de Wnt (187, 294). Comme
on peut l’observer dans la figure 12, plusieurs promoteurs des MMPs sont similaires en terme
de composition en éléments de liaison aux facteurs de transcription suggérant que plusieurs
MMPs sont co-régulées dans leur expression. Cependant et de manière surprenante, les
promoteurs des MMPs appartenant à la même famille telles que les MMP-2/MMP-9
(gélatinases) et les MMP-1/MMP-8 (collagénases) n’ont aucune similitude. Des groupes de
promoteurs de MMPs ont pu ainsi être formés en fonction de leur composition en élément de
liaison (figure 12 et pour revue (37). Il a ainsi été observé que l’expression des MMP-2, 14 et
28 est majoritairement « constitutive » avec tout de même une induction possible par certains
facteurs de croissance ou cytokines (37).
45
2) Traduction
1) mRNA transcription
3) Sécrétion
Sécrétion
régulée
Noyau
Sécrétion
constitutive
Domaine
catalytique
Prodomaine
4) Localisation
Transmembranaire
ou GPI liée
Associée à
la membrane
Liaison à la MEC
Protéase
5) Activation
7) Dégradation
6) Inhibition
α2-macroglobuline
TIMP
Figure 11 : Régulation de l’activité des métalloprotéases matricielles
D’après Page-McCaw A., Nat Rev Mol Cell Biol, 2007
Groupe 1
Groupe 2
MMP-1
MMP-8
MMP-3
MMP-11
MMP-7
MMP-21
MMP-9
Groupe 3
MMP-10
MMP-2
MMP-12
MMP-14
MMP-13
MMP-28
MMP-19
MMP-26
Figure 12 : Eléments de liaison aux facteurs de transcription sur les promoteurs des
métalloprotéases matricielles
(AP-1: activator protein-1; AP-2 : activator protein-2; C/EBP-β : CCAAT/enhancer binding protein-β ;
GC : Sp-1 binding site ; HBS : HIF-binding site ; KRE-M9 : keratinocyte differentiation factor1responsive element-4 ; LBP-1 : leader-binding protein ; NF-1 : nuclear factor-1 ; NF-κB : nuclear factorκB ; OSE-2 : osteoblast-specific element-2 ; p53/AP-2 : p53/AP-2 composite binding site ; PA :
polyadenylation signal ; PEA3 : polyoma enhancer A binding protein-3 ; RARE : retinoic acid responsive
element ; SBE : STAT-binding element ; Si : silencer sequence ; SPRE : stromelysin-1 PDGF-responsive
element ; TATA : TATA box ; Tcf-4 : T-cell factor-4/β-catenin-binding site ; TIE : TGF-β inhibitory
element ; TRF : octamer binding protein ; SAF-1 : serum amyloid A activating factor-1.
D’après Yan C., J. Cell. Physiol., 2007
Il est important de signaler que la régulation transcriptionnelle des MMPs ne dépend
pas uniquement de la présence de site de liaison au niveau de leur promoteur. En effet, des
polymorphismes du promoteur et des régulations épigénétiques (i.e, la méthylation de l’ADN
ou des altérations de la structure de la chromatine) jouent également un rôle dans l’expression
des MMPs. Enfin des régulations post-transcriptionnelles des MMPs sont possibles et
correspondent le plus souvent à des processus de stabilisation ou de dégradation des transcrits
(pour revue (295)).
B.2) Les régulations de la sécrétion
Les MMPs sont sécrétées par de nombreux types cellulaires notamment les
fibroblastes, neutrophiles, macrophages, cellules épithéliales et endothéliales (290). Certains
types cellulaires tels que les macrophages et les neutrophiles, qui ont la capacité de stocker
les MMPs dans des granules intracytoplasmiques, régulent la sécrétion des MMPs par les
actions de la plasmine ou de la thrombine sur le processus de libération des granules (220).
B.3) Les processus de maturation des MMPs
Comme il a été précisé un peu plus tôt, l’activation des MMPs dépend de
l’élimination ou de la modification de leur pro-domaine par clivage protéolytique. Différents
types d’activation des MMPs ont été décrits.
En général, l’activation des MMPs se produit à l’extérieur de la cellule. Le tableau 8
présente les principaux activateurs des MMPs (pour revue (37)). La plasmine issue de la
dégradation du plasminogène est l’un des activateurs physiologiques majeur des MMPs et de
ce fait les activateurs de sa production tels que les activateurs du plasminogène de type
urokinase (uPA) ou de type tissulaire (tPA) le sont également (26). Les MMPs elles-mêmes
sont capables d’activer d’autres MMPs. De plus, il a été rapporté que d’autres protéases telles
que les kallikréines, les cathepsines et les chymases permettaient la maturation des MMPs
(67). Les espèces réactives de l’oxygène ont aussi été impliquées dans l’activation des MMPs
(217, 287).
Les travaux de Pei et Weiss ont démontré pour la première fois que la pro-MMP11
(ou pro-stromélysine 3) était activée à l’intérieur de la cellule avant sa sécrétion. Cette
activation se fait par les furines, une famille de sérine protéases (204). Plus tard, il a été
montré que cette activation par les furines concerne les MMPs contenant une séquence
46
spécifique (RRKR) dans leur pro-domaine. C’est également le cas pour la MMP-14 (ou
MT1-MMP) (37).
Tableau 8 : Les activateurs des MMPs
Collagénases
Gélatinases
Stromélysines
Matrilysines
MT- MMPs
Autres
MMP
Activée par
Activateur de
1
MMP-3 et 10, plasmine, kallikréine et
chymase
MMP-3 et 10 et plasmine
MMP-2, 3, 10, 14 et 15 et plasmine
?
MMP-1, 7, 13, 14, 15, 16, 17 24 et 25
MMP-2, 3 et 13 et plasmine
Plasmine, kallikréine, chymase et tryptase
Elastase et cathepsine G
Furine
MMP-3 et 10 et plasmine
?
Plasmine et furine
?
?
?
?
?
?
Trypsine
?
?
?
?
?
MMP-2
8
13
18
2
9
3
10
11
7
26
14
15
16
17
24
25
12
19
20
21
22
23
28
?
MMP-2 et 9
?
MMP-9 et 13
?
MMP-1, 7, 8, 9 et 13
MMP-1, 7, 8, 9 et 13
?
MMP-2
?
MMP-2 et 13
MMP-2 et 13
MMP-2
MMP-2
MMP-2
MMP-2
?
?
?
?
?
?
?
Un troisième mécanisme d’activation a été décrit au niveau de la surface de la cellule.
Il s’agit d’un mécanisme unique de régulation de la gélatinase-A (MMP-2). La forme inactive
de cette MMP peut se lier à une MMP transmembranaire, la MT1-MMP, ainsi qu’à une
protéine nommée TIMP-2 (tissue inhibitor of matrix metalloproteinases 2) qui agit ici comme
une molécule adaptatrice (nous aborderons les TIMPs dans le paragraphe suivant). La
formation de ce complexe à trois partenaires au niveau de la surface cellulaire permet à une
seconde molécule de MT1-MMP de couper le peptide N-terminal de la pro-MMP-2 et
d’activer ainsi la protéase (258). Ici, MT1-MMP joue un double rôle de molécule réceptrice
et activatrice. Il faut préciser que les autres MT-MMPs sont également capables d’activer
47
MMP-2 même si la protéolyse par la MT1-MMP reste prédominante (37). En revanche, les
activateurs physiologiques de nombreuses MMPs sont encore inconnus (tableau 8).
Une fois leur pro-domaine clivé, les MMPs sont protéolytiquement actives mais très
rapidement elles peuvent être inactivées par liaison à des protéines inhibitrices. Ces protéines
vont se fixer directement au niveau du domaine catalytique empêchant l’accès au substrat.
Dans le paragraphe qui suit nous nous intéresserons aux différents inhibiteurs endogènes des
MMPs.
B.4) Les processus d’inhibition des MMPs
In vivo, l’activité des MMPs est contrôlée par les TIMPs (tissue inhibitors of matrix
metalloproteinases). A ce jour, quatre TIMPs différents ont été identifiés (TIMP-1 à -4). Ce
sont des protéines de petites tailles (20 à 29 kDa), sécrétées mais qui peuvent être retrouvées
à la surface cellulaire associées à des protéines liées à la membrane plasmique ou séquestrées
au niveau de la MEC. C’est le cas de TIMP-3 qui peut interagir avec des protéoglycanes
(298). Les TIMPs sont exprimés par de nombreux types cellulaires incluant les fibroblastes,
les cellules épithéliales et endothéliales, les ostéoblastes, les chondroblastes, les cellules du
muscle squelettiques ainsi que des cellules cancéreuses. Tandis que l’expression de TIMP-2
est constitutive, celle des TIMP-1, 3 et 4 est inductible. Avec un certain degré de spécificité,
les TIMPs sont capables d’inhiber l’activité des MMPs. Ils forment un complexe
équimoléculaire avec les formes actives des MMPs où le domaine amino-terminal des TIMPs
se lie au domaine catalytique des MMPs et, de ce fait, bloque l’accès à la poche contenant
l’atome de zinc. Cette inhibition est réversible. Les TIMPs ont aussi la capacité d’inhiber
d’autres protéases telles que les ADAMs (A Disintegrine And Metalloprotease domain)
(141). La régulation des MMPs par les TIMPs est un facteur majeur dans le contrôle de la
dégradation de la MEC. Elles jouent également un rôle dans le contrôle de nombreux
processus cellulaires tels que la prolifération mais aussi l’apoptose et des événements
physiologiques tels que l’angiogenèse et pathophysiologiques tels que le développement
tumoral (41). Toutefois, de plus en plus d’évidences indiquent que certaines de ces fonctions
semblent être complètement indépendantes des MMPs. Par exemple, récemment, il a été
rapporté que TIMP-2 et 3 pouvaient lier l’intégrine α3 β1 et entraîner une cascade de
signalisation négative conduisant à un arrêt du cycle cellulaire des cellules endothéliales
(243). De la même manière, TIMP-3 est capable d’interagir avec le récepteur 2 du VEGF
empêchant ainsi l’accès à son substrat et entraînant une inhibition de l’angiogenèse (216).
48
Ces effets étant retrouvés quand les TIMPs sont mutés au niveau de leur domaine nécessaire
pour l’inhibition des MMPs, il est donc fortement suggéré que les TIMPs pourraient exercer
des fonctions indépendamment de leurs effets sur les MMPs.
L’α2-macroglobuline, une protéine de 722 KDa, peut également inhiber l’activité des
MMPs (251). Trouvée en abondance dans le plasma, elle serait, de ce fait, l’inhibiteur
endogène majeur des MMPs dans les liquides physiologiques alors que les TIMPs agiraient
plus localement dans l’espace extra- et péri-cellulaire.
D’autres protéines ont été rapportées pour inhiber certaines MMPs. C’est le cas de la
protéine RECK (Reversion-inducing cysteine-rich protein with kazal motifs), une
glycoprotéine GPI-ancrée qui inhibe les MMP-2, -9 et -14, et bloque l’angiogenèse (193).
Une déficience de cette protéine chez des souris est létale suggérant des fonctions
importantes de RECK dans le développement. Enfin, un certain nombre de protéines
contenant des séquences similaires au TIMPs peuvent inhiber les MMPs. Ce sont les « TIMPlike molecules » qui incluent notamment les neltrines, les protéines frizzled, la PCPE (type 1
collagen C-proteinase enhancer protein) et le TFPI-2 (tissue factor pathway inhibitor 2) (pour
revue (8)).
Ainsi, l’activité des MMPs dans l’espace extracellulaire dépend de l’équilibre entre
leur inhibition et leur activation. C’est cet équilibre qui régule le renouvellement de la MEC
et le remodelage tissulaire durant les processus de développement normal ou pathologique.
Voyons à présent les différents modes d’action des MMPs.
C) Mode d’action des MMPs
La MEC est un réseau dynamique de protéines incluant du collagène, de la
fibronectine, de la laminine et des protéoglycanes qui forme une barrière structurale. La
dégradation de la MEC a été longtemps considérée comme un simple remodelage de cette
barrière structurale. Depuis, des études ont montré que la MEC n’était pas juste une structure
passive. Elle peut influencer le comportement des cellules et notamment leur détermination et
leur différenciation (257). Jusqu'à récemment, on pensait que les MMPs participaient à ces
processus via leurs effets sur la MEC mais il est maintenant clair que les MMPs ont d’autres
mécanismes d’action (figure 13 et pour revue (178)). Il a ainsi été rapporté que la dégradation
des composants de la MEC par les MMPs peut générer des fragments matriciels
49
Interactions
cellule-cellule
Interactions
cellule-matrice
Récepteurs et autres
protéines de surface
Facteurs de croissance,
facteurs angiogéniques,
chémoattractants et inhibiteurs
Fragments
matriciels
actifs
Protéines de liaison et
autres protéines solubles
Figure 13 : Mode d’action des métalloprotéases matricielles
D’après Sternlicht and Werb, Annu Rev Cell Dev Bio, 2001
biologiquement actifs tels que l’endostatine (fragment du collagène XVIII) (77),
l’angiostatine (fragment du plasminogène) (195), des fragments de laminine et certains
peptides dérivés de la fibronectine (178). La MEC est également un réservoir de facteurs de
croissance et de cytokines qui sont libérés lors de la dégradation matricielle. C’est notamment
le cas du TGF-β lors de la dégradation de la décorine par les MMP-2, -3 ou -7 (108). En plus
de leur capacité à dégrader l’ensemble des composants de la MEC, les MMPs peuvent
également cliver de nombreuses protéines cellulaires de surface, péri-cellulaires ou
circulantes. Ainsi, les MMPs peuvent activer la forme pro-TGF-β et pro-TNF-α ou cliver les
IGFBPs (insulin-like growth factor binding protein) et par conséquent augmenter la
biodisponibilité de l’IGF (80). De plus, le changement de l’environnement cellulaire peut
indirectement moduler des voies dépendantes des protéines d’ancrages telles que celles des
intégrines. Enfin des études récentes suggèrent que certaines MMPs (MMP-2, -3, -11 et -14)
pourraient avoir également des cibles intracellulaires telles que PARP (poly ADP-ribose
polymérase, une enzyme de réparation à l’ADN (88, 134, 156, 248). Ces nouvelles données
rendent le champ d’action des MMPs encore plus large qu’il ne l’était.
D) Les fonctions biologiques et pathologiques des MMPs
Comme nous l’avons déjà évoqué, la MEC joue un rôle prépondérant dans le
comportement cellulaire (257). Il n’est donc pas surprenant que les principaux acteurs de son
remodelage aient un rôle tout aussi important.
Au niveau cellulaire, ces enzymes jouent un rôle majeur dans la migration cellulaire,
la prolifération, l’apoptose et la différenciation de nombreux types cellulaires notamment les
neurones, les chondrocytes, les ostéoblastes et les adipocytes (dont nous parlerons un peu
plus tard) (pour revue (162)). Récemment, des études ont également suggéré un rôle des
MMPs dans le devenir des cellules souches mésenchymateuses (159). En effet des travaux
indiquent que la composition et la rigidité de la MEC modulent l’orientation des cellules
souches mésenchymateuses vers différents lignages (69) par des modifications des adhésions
focales. De par leurs fonctions au niveau cellulaire, les MMPs régulent plusieurs processus
du développement incluant la morphogenèse, l’angiogenèse, la cicatrisation, la menstruation
et le développement mammaire et osseux (pour revue (280). Des approches de transgenèse
ont permis d’étudier les fonctions biologiques des MMPs dans le développement. A ce jour,
16 modèles de souris déficientes pour les MMPs ont été développés. Toutes les souris
déficientes pour les MMPs sont viables avec cependant des différences notoires sur les
50
phénotypes des animaux qui sont présentés dans le tableau 9 (199). Le fait que ces souris
soient viables, malgré l’importance des MMPs dans le développement, suggère de forts
mécanismes de compensation vis-à-vis d’autres MMPs.
Tableau 9: Phénotypes des souris déficientes pour les MMPs
Géne
invalidé
MMP-2
MMP-3
MMP-7
MMP-8
MMP-9
MMP-10
MMP-11
MMP-12
MMP-13
MMP-14
MMP-19
MMP-20
MMP-23
MMP-24
MMP-28
Phénotype des animaux
Diminution de la taille corporelle, réduction de la néovascularisation, diminution
de l’invasion primaire du conduit de la glande mammaire ; réduction du
développement pulmonaire
Altération de la structure des jonctions neuromusculaires, altération de la
morphogenèse de la glande mammaire
Défaut de l’immunité innée, diminution de la re-épithélialisation après une
blessure du poumon
Augmentation des tumeurs de la peau, résistance aux hépatites létales induites
par le TNFα
Défauts du développement osseux, défaut de la re-myélinisation neuronale après
une blessure nerveuse, retard de la cicatrisation des fractures osseuses, altération
du remodelage vasculaire, altération de l’angiogenèse
Augmentation de l’inflammation et de la mortalité en réponse à une infection ou
une blessure
Retard de la tumorigenèse mammaire
Diminution de la récupération d’une compression de la moelle épinière,
augmentation de l’angiogenèse due à une diminution de l’angiostatine
Défaut du remodelage osseux, réduction des fibroses hépatiques, augmentation
de l’accumulation du collagène dans les plaques d’athérosclérose
Défaut du remodelage squelettique, défaut de l’angiogenèse, inhibition de
l’éruption dentaire et de l’élongation des racines, défauts au niveau des poumons
et des glandes submandibullaires
Obésité
Défaut de l’émail dentaire
Pas de phénotype rapporté
Réponse anormale à une blessure du nerf sciatique
Augmentation de la réponse inflammatoire
D’après Page-McCaw A., Nat Rev Mol Cell Biol, 2007
En plus de ces données sur les principales fonctions des MMPs, il est important de
préciser la complexité des MMPs, en terme d’activité biologique. En effet, certaines d’entre
elles sont paradoxales, puisqu’une MMP peut avoir des effets diamétralement opposés. Par
exemple, il est connu que les MMP-2 et -9 favorisent l’angiogenèse mais des effets antiangiogéniques leurs sont également attribués (pour revue (232)). Il en est de même pour les
51
processus apoptotiques puisque les MMP-2, -3, -7 et -9 peuvent être pro- et anti-apoptotiques
(pour revue (160)).
Du fait de leurs fonctions biologiques, les MMPs ont été associées à diverses
pathologies. Ce sont des modulateurs importants de l’inflammation (pour revue (203)) et elles
sont fortement augmentées dans toutes les pathologies associées à une inflammation
notamment l’arthrite rhumatoïde. A ce jour, un inhibiteur des MMPs, le périostat, est utilisé
pour le traitement de la parodontite, une inflammation des tissus de soutien qui relient la dent
au maxillaire.
Des dérégulations des MMPs ont également été impliquées dans diverses pathologies
cardiovasculaires telles que l’athérosclérose et l’infarctus du myocarde (85, 253).
Enfin, l’importance des MMPs dans la progression du cancer n’est plus à démontrer
(60). Leur expression est fortement augmentée dans de nombreux cancers. Elles interviennent
dans toutes les phases du cancer c’est-à-dire de la croissance tumorale, l’invasion,
l’extravasation dans des sites plus éloignés ainsi que dans l’effet angiogénique requis pour
nourrir la formation de la nouvelle tumeur. Ainsi, les MMPs sont devenues la première cible
pour les programmes de découverte de nouveaux médicaments à but anti-cancéreux. De
nombreux inhibiteurs des MMPs ont été développés (tableau 10). Malgré un début très
prometteur, la survenue d’effets indésirables au cours des phases de développement clinique
et le peu de bénéfice par rapport aux effets indésirables a conduit à l’arrêt de nombreux
d’entre eux. A l’heure actuelle, d’autres inhibiteurs plus spécifiques sont en cours de
développement (pour revue (161).
52
Tableau 10: Les inhibiteurs des MMPs dans le cancer
Inhibiteurs
Spécificité
MMPs
Collagènes synthétiques peptidomimétiques
Batimastat
Large spectre des
(BB-94)
MMPs et ADAM-17
Solimastat
Large spectre
(BB-3643)
Marimastat
MMP-1, -2, -3, -7, -9
(BB-2516)
et -12
Collagènes synthétiques non peptidiques
Prinomastat
(AG3340)
MMP-1, -2, -3, -7, -9
et -14
Tanomastat
(BAY 12-9566)
MMP-2, -3, -9 et -13
D2163
MMP-1, -2 et -9
Effets indésirables
Péritonite
Courbatures musculosquelettiques
Douleur musculaire et articulaire
(Légère à sévère)
Arthralgie et affection associée
aux articulations
Légère douleur articulaire,
élévation des enzymes hépatiques,
nausée et thrombocytopénie
?
Phase
clinique
Arrêt en
phase II
Arrêt en
phase II
Arrêt en
phase III
Arrêt en
phase II
Arrêt en
phase III
En phase II
et III
Tétracycline modifiée
Métastat
(Col-3)
MMP-1, -2, -8, -9 et
-13
Toxicité systémique limitée, légère Utilisé dans
phototoxicité, anémie
le sarcome
sidéroblastique réversible
de Kaposi
Biphosphonate synthétique
Alendronate
MMP-2
?
En Phase I
Néovastat
(AE-941)
MMP-2, -9, -12 et
-13
En Phase
III
Catéchines
MMP-2 et -9
Douleur musculosquelettiques et
raideur articulaire
Toxicité légère à modérée, effets
neurologiques et gastrointestinaux
Acide
acétylsalicylique
MMP-2
Composés naturels
?
D’après Mannello F., Curr. Cancer Drug Targets, 2005
53
En Phase I
En cours
d’étude
III. Les métalloporotéases matricielles dans le tissu adipeux
L’intérêt des MMPs dans le remodelage du TA est très récent et la majorité des études
ont été effectuées chez le rongeur. In vivo, dans des modèles de souris génétiquement obèses
(ob/ob et db/db) ou rendues obèses à l’aide d’un régime hyperlipidique, des variations
d’expression de différentes MMPs dans le TA ont été observées. On peut noter une
augmentation des MMP-2, -3, -11, -12, -13, -14, -19 et une diminution des MMP-7, -9, -16 et
-24 (38, 149, 164). De plus, un traitement au galardin, un inhibiteur des MMPs à large
spectre, limite le développement du TA de ces animaux (148). Ces premières données
suggèrent un rôle primordial du remodelage matriciel dans le développement de la masse
grasse.
A) La régulation de l’adipogenèse
In vitro, des travaux menés par notre équipe et celle de Croissandeau, indiquent que
des préadipocytes murins des lignées 3T3F442A (17) et 3T3L1 (53) produisent au cours de
leur différenciation adipocytaire deux MMPs appartenant à la famille des gélatinases : MMP2 et -9. Par ailleurs, l’inhibition de la différenciation adipocytaire est également observée
dans ces préadipocytes murins traités par des inhibiteurs des MMPs à large spectre
(batimastat et illomastat) ou des anticorps neutralisants dirigés contre les MMP-2 ou -9
suggérant un rôle majeur de ces deux MMPs dans l’adipogenèse chez les rongeurs (17, 53).
Récemment, la MT1-MMP a été identifiée comme importante dans le développement
de la masse grasse. En effet, les travaux de Chun et al. montrent que des souris déficientes
pour la MT1-MMP présentent un phénotype lipodystrophique (44). In vitro et de manière
surprenante, les préadipocytes issus de ces souris sont doués d’une adipogenèse normale dans
un modèle de culture classique en 2 dimensions. Cependant, lorsque ces préadipocytes sont
cultivés sur un support en 3 dimensions, leur adipogenèse est inhibée. Les auteurs démontrent
qu’in vivo les précurseurs adipocytaires sont entourés d’un riche réseau de fibres de collagène
de type 1. Ce réseau est profondément modifié notamment par la MT1-MMP en début de
différenciation. Ce remodelage modifie les contraintes physiques que fait subir la matrice de
collagène au cytosquelette des préadipocytes et induit des cascades de signalisation pour la
poursuite de la différenciation adipocytaire. En l’absence de MT1-MMP, le réseau de
collagène reste très dense, les contraintes du cytosquelette ne sont pas modifiées et le
54
programme de différenciation ne peut pas continuer. La MT1-MMP serait un facteur
adipogénique qui permet la croissance de l’organe adipeux en 3 dimensions.
De façon intéressante, trois autres MMPs, MMP-3 et -11 appartenant à la famille des
stromélysines (Stro1 et Stro-3 respectivement) et MMP-19, ont été décrites comme ayant des
effets inhibiteurs sur le développement du TA et sur l’adipogenèse. In vivo, des souris
transgéniques mutées pour la MMP-3 ont une adipogenèse au niveau de la glande mammaire
accélérée et une hypertrophie adipocytaire (3) et des souris déficientes pour les MMP-3, -11
et -19 soumises à un régime gras développent plus de TA que des souris contrôles (150, 163,
205). In vitro, Alexander et al. rapportent que la MMP-3 augmente au cours de la
différenciation des préadipocytes murins de la lignée 3T3 L1 et qu’un traitement avec des
inhibiteurs des MMPs (GM6001 et TIMP-1) accélère l’accumulation des lipides (3). Ces
données sont à l’opposé de celles obtenues par l’équipe de Croissandeau sur le même type
cellulaire. La spécificité et la sélectivité des inhibiteurs des MMPs utilisés pourraient
expliquer ces différences.
Enfin, en plus de leur rôle majeur dans la différenciation adipocytaire, il a récemment
été suggéré une implication des MMPs dans la détermination des cellules précurseurs vers le
lignage adipocytaire. En effet, les travaux d’Otto et al, indiquent qu’un traitement au BMP-4
entraîne une diminution des MMP-3 et -13 associée à l’engagement des cellules C3H10T1/2
vers le lignage adipogénique (197).
B) La régulation de l’angiogenèse
A ce jour, il existe peu de données concernant les MMPs et la régulation de
l’angiogenèse dans le TA. Toutefois, il a récemment été rapporté in vivo chez des rongeurs
que des macrophages positifs pour LYVE-1 (lymphatic vessel endothelial hyaluronan
receptor 1) et originaire de la moelle osseuse, induisent une angiogenèse notamment à travers
la sécrétion des MMP-9, -12 et -7 (42).
C) La régulation de l’infiltration macrophagique
La MMP-12 est requise pour la dégradation de la MEC par les macrophages et
l’invasion tissulaire (246). De plus, cette MMP est fortement augmentée chez des souris
obèses (38, 164). Les travaux de Huber et al. montrent que la MMP-12 est exprimée et
produite par les macrophages et les adipocytes matures suggérant que ces deux types
55
cellulaires contribuent à la production de MMP-12 dans le TA de sujets obèses. Ainsi, les
auteurs suggèrent que la production de MMP-12 pourrait favoriser l’infiltration
macrophagique mais aussi faciliter la croissance des adipocytes durant le développement de
la masse grasse (104). Toutefois cette hypothèse reste encore à démontrer. Récemment, les
travaux de Cho et al. montrent qu’un traitement avec un inhibiteur de l’activité des MMPs,
l’acide zoledronique, diminue le recrutement et l’infiltration des macrophages positifs pour
LYVE-1. Ces macrophages exprimant principalement les MMP-7, -9 et -12, l’implication de
l’activité de ces MMPs dans l’infiltration macrophagique est suggérée (42).
Chez l’homme, les études concernant les MMPs dans le TA sont peu nombreuses.
Notre équipe a rapporté que des préadipocytes humains en culture primaire produisent et
sécrètent les MMP-2 et -9 au cours de leur différenciation. Sachant qu’il existe de grandes
différences entre les modèles humains et murins, la confirmation de l’implication des MMPs
dans l’adipogenèse chez l’homme est nécessaire et a fait l’objet d’une partie de notre étude.
De plus, de manière intéressante, une augmentation de la MMP-9 plasmatique a été associée
à l’obésité (86) et sa diminution à une perte de poids (140) suggérant un rôle clé de cette
protéase dans le remodelage du TA humain.
D) Les régulateurs des MMPs dans le tissu adipeux
Des travaux ont impliqués TIMP-1 et -3 dans le développement de la masse grasse
chez la souris. Les travaux de Fata et al. sur l’involution de la glande mammaire dans des
souris déficientes pour TIMP-3 montrent une reconstitution adipocytaire accélérée durant le
remplacement des cellules épithéliales de la glande mammaire par la formation du TA (76).
Toutefois, un effet de TIMP-3 sur les autres dépôts de TA de ces souris n’est pas décrit. Les
travaux de Lijnen et al. indiquent que des souris déficientes pour TIMP-1 sont protégées
d’une obésité induite par un régime gras (147). De plus, une augmentation de l’adipogenèse
du TA mammaire est observée in vivo chez des souris surexprimant TIMP-1 et l’addition
d’une protéine recombinante TIMP-1 accélère la différenciation des préadipocytes de la
lignée 3T3L1 in vitro (3). Toutefois, les travaux de Demeulemeester et al. ne sont pas en
accord avec ces résultats et indiquent qu’une surexpression de TIMP-1 par un adénovirus
n’affecte pas le développement du TA des souris, in vivo et in vitro, et n’affecte pas
l’adipogenèse des préadipocytes de la lignée 3T3F442A (59). Concernant l’expression et la
sécrétion de TIMP-1, une augmentation de l’expression de TIMP-1 chez des souris
56
génétiquement obèses ou soumises à un régime gras a été décrite (38, 164) et au cours de
l’adipogenèse in vitro les résultats ne sont pas très clairs puisque des études indiquent qu’au
cours de la différenciation des préadipocytes de la lignée 3T3F442A, l’expression de TIMP-1
augmente (164), et d’autres, notamment notre groupe, que son expression et sa sécrétion
diminuent (17, 116). Chez l’homme, les taux plasmatiques de TIMP-1 sont corrélés avec le
pourcentage de la masse grasse mais pas à l’IMC ni au tour de taille (131). Des travaux
complémentaires seraient nécessaires pour mieux comprendre le rôle précis des TIMPs dans
le TA, notamment chez l’homme, et si leurs effets sont directement liés aux MMPs ou
indépendants.
En plus des TIMPs, d’autres régulateurs des MMPs tels que le système
plasminogène/plasmine jouent un rôle majeur dans le remodelage du TA. Toutefois, ce
dernier a déjà fait l’objet de nombreuses études et ne sera pas abordé ici.
Pour conclure, les MMPs sont nécessaires à tous les processus du développement
de l’organisme. Elles constituent une grande famille de protéases dont l’activité est
régulée à de multiples niveaux. Il est clairement admis que les substrats des MMPs
peuvent être des composants matriciels ou des facteurs solubles cellulaires rendant ainsi
le champ d’action des MMPs très vaste. Elles sont considérées comme des protéases
majeures dans le remodelage tissulaire. Cependant, quelques études seulement se sont
intéressées à l’implication des MMPs dans le remodelage du TA et aucune étude n’a
encore démontré un rôle de ces protéases dans le TA humain.
57
Objectifs
Comme nous l’avons déjà évoqué, le TA est soumis à des processus de
développement excessif (obésité) mais aussi de régression (lipoatrophie). Il est admis que
cette plasticité du TA n’est possible que grâce à un remodelage cellulaire et matriciel. Les
MMPs, comme nous venons de le voir, sont des acteurs majeurs du remodelage tissulaire.
Quelques études ont montré l’importance des MMPs dans la différenciation adipocytaire des
préadipocytes de lignées murines. De plus, les inhibiteurs de la protéase du VIH, décrits
comme associés à l’émergence du syndrome de lipodystrophie, sont également associés à une
inhibition de l’adipogenèse chez les rongeurs. Les effets anti-adipogéniques observés avec les
inhibiteurs de protéases matricielles et de protéases du VIH nous ont conduit à émettre
l’hypothèse d’un lien entre les IPs-VIH et les MMPs. L’influence de ces protéases dans
l’adipogenèse chez l’homme reste cependant à être déterminée.
Dans la première partie de ce travail de thèse, nous nous sommes intéressés à
l’implication des MMPs dans la différenciation des cellules issues de la fraction stromavasculaire (FSV) du TA humain en culture primaire. L’effet des IPs-VIH sur la
différenciation de ces cellules en culture primaire a également été étudié ainsi qu’un lien
potentiel entre les IPs-VIH et les MMPs. Nous avons ainsi observé que les IPs-VIH affectent
l’expression génique de la MMP-9. Peu de données étant connues quant à la régulation
génique de la MMP-9 et aux cibles potentielles des IPs-VIH, les mécanismes moléculaires
responsables de la diminution de l’expression de MMP-9 par les IPs-VIH ont été déterminés.
Dans une deuxième partie de ce travail, sachant que la FSV est formée de plusieurs
populations cellulaires telles que les cellules progénitrices aux capacités adipogéniques et
angiogéniques (241), les cellules endothéliales capillaires et les cellules immunoinflammatoires, nous avons voulu confirmer l’influence de MMP-9 sur l’adipogénèse des
cellules progénitrices isolées. Puis, afin de déterminer les mécanismes qui contrôlent le
devenir des cellules progénitrices, une condition de culture permettant l’étude simultanée de
leurs capacités adipogéniques et angiogéniques a été mise au point.
58
Résultats
I) Implication des MMPs dans la différentiation adipocytaire des cellules de la
fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux humain
Un rôle primordial des MMPs et du remodelage matriciel dans le développement du
TA est maintenant suggéré (38, 148, 149, 164). En effet, des travaux menés par notre équipe et
celle de Croissandeau, indiquent que des préadipocytes murins produisent les MMP-2 et -9
(17, 53). De plus, un traitement par des inhibiteurs des MMPs à large spectre (batimastat et
illomastat) ou des anticorps neutralisants dirigés contre les MMP-2 ou -9 limitent
l’adipogenèse suggérant un rôle majeur de ces 2 MMPs dans l’adipogenèse des préadipocytes
murins (17, 53). Toutefois, chez l’humain, les données concernant les MMPs dans le TA sont
peu nombreuses. Des travaux menés par notre équipe ont mis en évidence que des cellules
issues de la FSV du TA humain en culture primaire sécrètent les MMP-2 et -9 au cours de leur
différenciation adipocytaire.
Dans la publication 1, nous avons donc cherché à déterminer l’implication de ces
MMPs dans l’adipogenèse chez l’homme. En parallèle, nous avons également voulu confirmer
l’effet anti-adipogénique des IPs-VIH chez l’homme. En effet, si de nombreuses études ont
mis en évidence un effet inhibiteur des IP-VIHs sur la différenciation de préadipocytes murins
(64, 144, 176, 300), deux études seulement ont été réalisées sur des cellules souches
mésenchymateuses humaines et sur des préadipocytes humains d’origine mammaire (109,
288). Enfin, un lien potentiel entre les MMPs et les IPs-VIH a été recherché.
A) Influence d’un inhibiteur des MMPs et des inhibiteurs de la protéase du VIH
sur la différenciation adipocytaire
Publication 1 : Protease inhibitor treatments reveal specific involvement of matrix
metalloproteinase-9 in human preadipocyte differentiation.
V. Bourlier, A. Zakaroff-Girard, S. De Barros, C. Pizzacalla, V. Durand de Saint Front, M.
Lafontan, A. Bouloumié and J. Galitzky. J Pharmacol Exp Ther, 312:1272-1279, 2005
59
0022-3565/05/3123-1272–1279$20.00
THE JOURNAL OF PHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS
Copyright © 2005 by The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics
JPET 312:1272–1279, 2005
Vol. 312, No. 3
77263/1194036
Printed in U.S.A.
Protease Inhibitor Treatments Reveal Specific Involvement of
Matrix Metalloproteinase-9 in Human Adipocyte Differentiation
Virginie Bourlier, Alexia Zakaroff-Girard, Sandra De Barros, Christophe Pizzacalla,
Véronique Durand de Saint Front, Max Lafontan, Anne Bouloumié, and Jean Galitzky
Unité de Recherche sur les Obésités, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Institut Louis Bugnard, Hôpital
Rangueil, Université Paul Sabatier, Toulouse, France (V.B., A.Z.-G., S.D.B., C.P., V.D.d.S.F., M.L., J.G.); and Institut für
Kardiovaskuläre Physiologie, Frankfurt/Main, Germany (A.B.)
Received September 6, 2004; accepted November 9, 2004
ABSTRACT
We previously showed that human and murine 3T3-F442A
preadipocytes produced and released matrix metalloproteinases (MMPs) 2 and 9 and that a treatment by MMP inhibitors
resulted in the blockade of murine fat cell adipose conversion.
In parallel, investigators reported that other protease inhibitors,
the human immunodeficiency virus (HIV) protease inhibitors
(PIs) involved in lipodystrophy in humans, also reduced the
adipocyte differentiation process of several murine cell lines.
The present work was performed to define the effects of MMP
inhibitors and HIV-PIs on the human adipocyte differentiation
process, to clarify the involvement of MMPs in the control of
human adipogenesis, and to determine whether HIV-PIs interact with MMPs in the control of this process. The effect of two
MMP inhibitor and four HIV-PI treatments on the differentiation
The mechanisms responsible for the growth of adipose
tissue (AT) are still not well defined. Adipocyte hypertrophy
and hyperplasia, due to the recruitment and differentiation
of adipocyte precursor cells, or preadipocytes, into adipocytes
are major cellular events in the development of the fat mass.
Together with the hypertrophy and the hyperplasia events,
recent investigations have clearly demonstrated that angiogenesis and extracellular matrix (ECM) remodeling are required for coordinated growth of the fat depot (Lijnen et al.,
2002; Rupnick et al., 2002). Among the enzymes involved in
the degradation of the ECM components, the matrix metalloproteinase (MMP) family is considered to play a major role
(Sternlicht and Werb, 2001). In a previous report, we demonstrated that mature human adipocytes and preadipocytes
This work was supported by Grants 01 128 and 02 197 from the Agence
Nationale de Recherche sur le SIDA.
Article, publication date, and citation information can be found at
http://jpet.aspetjournals.org.
doi:10.1124/jpet.104.077263.
of primary culture human preadipocytes, as well as the putative
relationships between HIV-PIs and MMP-2 and -9 expression,
release, or activity were investigated. We showed that MMP
inhibitors and HIV-PIs reduced the human adipocyte differentiation process as assessed by the decrease of cell protein
and/or triglyceride contents and expression of fatty acid binding protein and hormone-sensitive lipase, two adipocyte markers. Unlike MMP inhibitors, HIV-PIs were devoid of any effect
per se on recombinant MMP-2 and 9 activities but reduced the
expression and release of MMP-9 by human preadipocytes.
Thus, the present study indicates that the modulation of the
extracellular matrix components through the production and/or
activity of MMPs, and, more precisely, MMP-9 might be a key
factor in the regulation of human adipose tissue development.
produce and release two members of the MMP family,
MMP-2 and -9, the expression and activity of which were
shown to be dependent on the adipocyte differentiation process (Bouloumié et al., 2001). Interestingly, we also reported
that treatment of the murine 3T3-F442A preadipocytes,
which also produced MMP-2 and -9 during adipose conversion, with MMP inhibitors decreased the rate of adipocyte
differentiation, suggesting that MMP activities are required
for adipogenesis in rodents. However, no data are available
concerning the potential role of MMPs in the regulation of AT
development in humans.
A lipodystrophy syndrome, characterized by body fat redistribution, hyperlipidemia, and insulin resistance, has been
associated with the recent use of protease inhibitors (PIs) in
the therapy of AIDS as consequence of human immunodeficiency virus (HIV) infection (Carr et al., 1998). The most
prominent clinical sign of HIV-PI-associated lipodystrophy is
a loss of subcutaneous fat (lipoatrophy) in the face and the
extremities that can be accompanied, in some cases, by fat
ABBREVIATIONS: AT, adipose tissue; ECM, extracellular matrix; MMP, matrix metalloproteinase; PI, protease inhibitor; HIV, human immunodeficiency virus; IDV, indinavir; RTV, ritonavir; SQV, saquinavir; NFV, nelfinavir; RT-PCR, reverse transcriptase-polymerase chain reaction; HSL,
hormone-sensitive lipase; aP2, fatty acid binding protein; NF-␬B, nuclear factor-␬B; IL, interleukin.
1272
MMP-9 Involvement in Human Adipocyte Differentiation
accumulation in the neck, back, and visceral depots, suggesting that it most likely involves HIV-PI-mediated dysregulation of the balance between the development and the regression of the AT depending on the anatomical location of the fat
deposits. Numerous studies have examined the effect of HIVPIs on adipocyte differentiation of murine cell lines and evidenced that they are potent inhibitors of adipogenesis in vitro
(Zhang et al., 1999; Vernochet et al., 2003). Further analysis
of the putative targets of HIV-PIs has focused on the transcription factors that regulate the expression of adipocytespecific markers (Dowell et al., 2000; Caron et al., 2001).
The present work was performed to define the effects of
MMP inhibitors and HIV-PIs on the differentiation of preadipocytes isolated from the stroma vascular fraction of human AT. It was also expected to clarify the involvement of
MMPs in the control of the adipocyte differentiation process
in human AT and to determine whether HIV-PIs interact
with MMPs in the control of this process. We evidenced that
the broad-spectrum MMP inhibitor batimastat strongly inhibited human adipocyte differentiation. Moreover, HIV-PIs
such as indinavir (IDV), ritonavir (RTV), saquinavir (SQV),
and nelfinavir (NFV) also lead to a strong reduction of the
human adipocyte differentiation process by a mechanism
that may involve their inhibitory effect on MMP-9 expression
and release by treated preadipocytes. Finally, we showed
that MMP-9 inhibitor also reduced the differentiation of human preadipocytes, suggesting that MMP-9 is specifically
involved in the batimastat-mediated inhibition of human
adipogenesis. These data suggest that the modulation of the
ECM components through the production and/or activity of
MMPs and, more precisely, MMP-9 might be a key regulator
of human AT development.
Materials and Methods
Cell Culture and Treatment. Chemicals were from Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, France), and cell culture reagents
were from Invitrogen (Cergy Pontoise, France), Roche Diagnostics
(Meylan, France), or Cambrex Bio Science (Verviers, Belgium).
Human subcutaneous abdominal white AT was obtained from
moderately overweight women undergoing plastic surgery (mean age
39 ⫾ 2 years, mean body mass index 26.5 ⫾ 0.8 kg/m2). The isolation
of human AT-derived stromal cells and the culture of stromal preadipocytes (i.e., fat cell precursors) differentiated into adipocytes were
performed as previously described (10). Briefly, sterile AT was cut
into small pieces and digested under agitation with collagenase (300
U/ml) for 1 h 30 min at 37°C. After centrifugation, washing, and
filtration steps, the stromal cells were suspended in Dulbecco’s Modified Eagle’s medium F-12 supplemented with 10% fetal calf serum
and plated at 60,000 cells/cm2. After 24 h, the medium was changed
for medium consisting of Dulbecco’s Modified Eagle’s medium F-12
supplemented with 33 ␮M biotin, 17 ␮M pantothenate, and 50 ␮g/ml
gentamycin (basal medium) in the presence of 66 nM insulin, 1 nM
triiodothyronine, 100 nM cortisol, 10 ␮g/ml human transferrin (adipogenic medium), and, for the first 3 days, 1 ␮g/ml ciglitazone. After
the 3-day priming period, the cells were cultured in the adipogenic
medium supplemented with 1) the MMP inhibitor batimastat [BB94
or [4-(N-hydroxyamino)-2R-isobutyl-3S-(thienylthiomethyl)-succinyl]-L-phenylalanine-N-methylamide, kindly provided by British
Biotech, Oxford, UK] or MMP-9 inhibitor [MMP-9/MMP-13 inhibitor
II or N-hydroxy-1-(4-methoxyphenyl)sulfonyl-4-benzyloxycarbonylpiperazine-2-carboxamide from Calbiochem, VWR International,
Strasbourg, France]; or 2) HIV-PIs IDV (kindly provided by Merck,
Whitehouse Station, NJ), SQV (kindly provided by Roche, Welwyn
Garden City, UK), RTV (kindly provided by Abbott Diagnostics,
1273
Abbott Park, IL), or NFV (kindly provided by Roche Diagnostics) for
10 days. Batimastat was dissolved in ethanol, whereas HIV-PIs and
MMP-9 inhibitor were dissolved in pure dimethylsulfoxide. Control
cells were treated using an appropriate concentration of each vehicle.
Medium was replaced every 2 days. Before the experiments, the cells
were placed in basal medium with or without 0.1% bovine serum
albumin (MMP inhibitors versus HIV-PIs, respectively) overnight,
supplemented with the various treatments.
The medium was then collected and used in zymography analysis.
Cell triglyceride and total protein contents were determined using
kits from Sigma-Aldrich and Bio-Rad S.A (Marnes-la-Coquette,
France), respectively.
Gelatin Zymography. Proteins with gelatinolytic activity were
identified by electrophoresis in the presence of SDS in 8% polyacrylamide gels containing 1 mg/ml gelatin. Briefly, culture medium
batches (20 ␮l) were directly loaded onto gels; after electrophoresis,
proteins were renatured by exchanging SDS with 2.5% Triton X-100
(20-min incubation repeated twice). The gels were then incubated for
16 h at 37°C in 50 mM Tris-HCl, pH 8.8, 5 mM CaCl2, and 0.02%
NaN3 and stained with Coomassie Blue. The presence of gelatinolytic activity in the culture medium batches was visualized as uncolored areas on an otherwise blue gel. Migration of proteins was
compared with that of prestained molecular weight markers. The
gels were scanned by an imaging densitometer and quantified using
the NIH image program (developed at the U.S. National Institutes of
Health).
Fluorometric Activity Assay on Recombinant MMP-2 and
-9. In vitro assays were performed on 96-well plates. Human recombinant activated MMP-2 (2 nM) or MMP-9 (4 nM) (Calbiochem) were
preincubated in the presence or absence of increasing concentrations
of batimastat (from 0.01 nM to 0.01 ␮M) or HIV-PIs (from 1 nM to
100 ␮M) for 30 min at 37°C. Twenty micromolar of the fluorogenic
substrate Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dnp-Ala-Arg (Bachem, Bubendorf,
Switzerland) were then added to each well, and fluorescence (excitation, 325 nm; emission, 390 nm) was recorded every 2 min for 60
min. MMP activity was evaluated by the maximum rate per minute
on five separate measurements in each well.
Real-Time Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Changes in mRNA levels from specific genes were
quantified by real-time RT-PCR. Total RNAs were extracted using
Qiagen Rneasy Mini Kit according to the manufacturer’s instructions, and RNA concentrations were determined using a fluorometric
assay (Ribogreen; Molecular Probes, Eugene, OR). RNA (0.5 ␮g) was
reverse-transcribed using the ThermoScript RT system (Invitrogen)
according to the manufacturer’s instructions. Reverse transcription
was also performed without Thermoscript enzyme on RNA samples
to check for any genomic DNA contamination. PCR primers were
designed using Primer Express software according to the recommendations of Applied Biosystems (Foster City, CA). The forward and
reverse primer sequences for fatty acid binding protein (aP2), hormone-sensitive lipase (HSL), and MMP-9, respectively, were as follows: aP2, GCATGGCCAAACCTAACATGA (forward) and CCTGGCCCAGTATGAAGGAAA (reverse); HSL, GTGCAAAGACGGAGGACCACTCCA (forward) and GACGTCTGGAGTTTCCCCTCAG (reverse); and MMP-9, CCCTGGAGACCTGAGAACCA (forward) and
CCACCCGAGTGTAACCATAGC (reverse).
Each amplification reaction was performed with 15 ng of cDNA
sample in duplicate in 96-well optical reaction plates with a GeneAmp 5700 sequence detection system. The PCR mixture contained
forward and reverse primer mix (final concentration, 900 nM for
HSL or MMP-9 and 300 nM for aP2) and SYBR Green PCR Master
Mix. For ribosomal RNA control (18S rRNA), a mixture containing
primers and fluorogenic probe mix, TaqMan Universal PCR Master
Mix (Applied Biosystems) was used. All reactions were performed
under the same conditions: 50°C for 2 min and 95°C for 10 min,
followed by 40 cycles of 95°C for 15 s and 60°C for 1 min. Results
were analyzed with the GeneAmp 5700 software, and all values were
normalized to the levels of 18S rRNA.
1274
Bourlier et al.
Statistical Analysis. Values are expressed as means ⫾ S.E.M.
Data were analyzed with one-way analysis of variance coupled with
post hoc Dunnett’s multiple comparison test. Statistical significance
was set at p ⬍ 0.05.
Results
MMP Inhibitor Batimastat Treatment Decreases the
Differentiation of Human Preadipocytes. To determine
whether the broad spectrum MMP inhibitor batimastat could
affect the human adipocyte differentiation process, primary
cultures of human preadipocytes were treated with 1 or 5 ␮M
batimastat for 10 days. Total protein and cell triglyceride
contents were quantified, and the expression of two adipocyte
differentiation markers, aP2 and HSL, was analyzed by realtime RT-PCR.
As is clearly shown in Fig. 1A, 5 ␮M batimastat led to a
strong inhibition of the adipocyte differentiation process
since treated cells exhibited no changes in shape and less
cytoplasmic accumulation of lipid droplets. Quantification of
total protein and triglyceride contents, used as lipogenic indices, demonstrated that batimastat treatment statistically
decreased adipogenesis (23 and 44% decrease in protein and
triglyceride concentrations, respectively) (Fig. 1B). Moreover,
the analysis of aP2 and HSL mRNA levels showed that
batimastat led to a reduction of the expression of both adipocyte differentiation markers (29 and 33% decrease in aP2
and HSL mRNA expression, respectively) (Fig. 1B). Batimastat at 1 ␮M had no effect on the differentiation process (data
not shown).
HIV-PI Treatments Decrease the Differentiation of
Human Preadipocytes. We then investigated the effect of
four HIV-PIs on the human adipocyte differentiation process.
Thus, primary cultures of human preadipocytes were treated
for 10 days with increasing concentrations of HIV-PIs: 5, 10,
25, or 50 ␮M for SQV and IDV; 1, 5, and 10 ␮M for NFV; and
5, 10, and 25 ␮M for RTV. These concentrations were chosen
according to those usually found in the plasma of treated
patients and proved to be effective on murine adipocyte differentiation (Lenhard et al., 2000; Roche et al., 2002). Total
protein and cell triglyceride contents were quantified, and
the expression of aP2 and HSL was analyzed by real-time
RT-PCR. Only the concentrations for which a maximal effect
on the differentiation process was observed, without detected
toxicity (measured by the Toxilight kit, Cambrex Bio Sciences; data not shown), are presented.
As shown in Fig. 2, A and B, the protein and/or triglyceride
contents of the cells were decreased under HIV-PIs: 25%
decrease in triglyceride concentration for IDV (50 ␮M), 28%
decrease in triglyceride concentration for RTV (10 ␮M), and
27 and 46% decrease in protein and triglyceride concentrations, respectively, with SQV (10 ␮M); and 34 and 56% decrease in protein and triglyceride concentrations, respectively, with NFV (5 ␮M). The expressions of aP2 and HSL
mRNAs were also decreased, respectively, by: 28 and 42%
with IDV (50 ␮M), 38 and 47% with RTV (10 ␮M), 72 and 82%
with SQV (10 ␮M), and 76 and 87% with NFV (5 ␮M) (Fig. 2,
C and D). These results indicate an alteration of the differentiation process with the four HIV-PIs used. However, it is
noticeable, as shown for the protein and triglyceride contents, that SQV and NFV exhibited stronger effects on aP2
and HSL expression than IDV or RTV. It should be noted
that higher concentrations of SQV (25 and 50 ␮M), RTV (25
␮M), and NFV (10 ␮M) lead to cell death within a few days in
our model.
HIV-PIs Do Not Modify the Activity of Human Recombinant MMP-9 or MMP-2. To establish whether HIVPIs could affect the human adipocyte differentiation process
by interacting with the MMP-dependent pathways, we first
analyzed the capacity of HIV-PIs to inhibit MMP activities.
The MMP inhibitor batimastat was used as control. MMP-2
and -9 activities were determined by in vitro fluorescence
assays using human recombinant activated MMP-2 and -9
Fig. 1. Effect of the MMP inhibitor batimastat on the
differentiation of human preadipocytes. Stromal preadipocytes from human subcutaneous AT were cultured in an
adipogenic medium in the presence of 5 ␮M batimastat or
its vehicle (control). A, light microscopy analysis performed
after 10 days of treatment. Photomicrographs (⫻100) are
representative of eight independent experiments. B, total
protein and cell triglyceride contents, as well as aP2 and
HSL mRNA expression, determined in cells maintained
overnight in basal medium with treatments. For aP2 and
HSL expression, total RNAs were extracted from cells, and
real-time RT-PCR analysis was performed using specific
cDNA primers. The results obtained were normalized to the
levels of 18S rRNA. Data are means ⫾ S.E.M. expressed as
a percentage of the control for eight independent experiments. ⴱ, p ⬍ 0.05 versus control; ⴱⴱ, p ⬍ 0.01 versus
control.
MMP-9 Involvement in Human Adipocyte Differentiation
1275
Fig. 2. Effect of HIV-PIs on the differentiation of human preadipocytes. Stromal
preadipocytes from human subcutaneous
AT were cultured for 10 days in an adipogenic medium with vehicle (control) or in
the presence of HIV-PIs IDV, RTV, SQV,
or NFV at various concentrations. The
cells were maintained overnight in basal
medium with treatments before use. Total protein and cell triglyceride contents
were then determined (A and B). For aP2
and HSL mRNA expression, total RNAs
were extracted from cells, and real-time
RT-PCR analysis was performed using
specific cDNA primers. The results obtained were normalized to the levels of
18S rRNA (C and D). Only the concentrations for which a maximal effect on the
differentiation process was observed,
without detected toxicity, are presented.
Data are means ⫾ S.E.M. expressed as a
percentage of the control for four to seven
independent experiments. ⴱ, p ⬍ 0.05 versus control; ⴱⴱ, p ⬍ 0.01 versus control.
together with a fluorogenic MMP substrate, in the presence
of increasing concentrations of HIV-PIs (from 1 nM to 100
␮M) or batimastat (from 0.01 nM to 0.01 ␮M). As expected,
batimastat reduced, in a concentration-dependent manner,
the fluorescence emission induced by the cleavage of the
MMP substrate. However, none of the four HIV-PIs tested
had an effect per se on the basal fluorescence detected in the
MMP-9 or -2 activity assays (Fig. 3).
HIV-PI Treatments Reduce MMP-9 Gelatinase Activity Released by Human Preadipocytes. To determine
whether HIV-PIs could affect the gelatinase activities released by 10-day-differentiated human preadipocytes, medium conditioned overnight by preadipocytes treated with
IDV (50 ␮M), RTV (5 ␮M), SQV (10 ␮M), or NFV (5 ␮M) was
collected and analyzed by gelatin zymography.
As observed in Fig. 4, MMP-9 (92 kDa) and MMP-2 (72
kDa) proforms (artificially activated by the gelatin zymography technique) were the major forms detectable in preadipocyte-conditioned media. An active form was visible for
MMP-2 (62 kDa) but not for MMP-9 (82 kDa). Densitometric
analysis of the lytic areas showed that HIV-PI treatments
reduced the MMP-9 gelatinase activity (proform) released by
treated preadipocytes (53, 40, 74, and 91% decrease with
IDV, RTV, SQV, and NFV, respectively). Interestingly, this
decrease of MMP-9 gelatinase activity in the medium, corresponding to the proform, was not accompanied by an increase
of the active MMP-9 form (still not detectable), suggesting
that this reduction was due to a decrease in the secretion of
the enzyme rather than to an increase in the maturation.
Unlike for MMP-9, the MMP-2 gelatinase activity (pro ⫹
active forms) released into the medium by treated preadipocytes did not present a common pattern for the four HIV-PIs
used. Indeed, IDV treatment enhanced the MMP-2 activity
released into the medium (27% increase), RTV and SQV were
devoid of effect, and NFV reduced it (20% decrease) (Fig. 4).
HIV-PI Treatments Reduce MMP-9 Expression by
Human Preadipocytes. Considering the results obtained
with the gelatin zymography technique, real-time RT-PCR
analysis was performed on mRNAs extracted from the same
10-day-treated preadipocytes to investigate any effect of
HIV-PIs on MMP-9 expression.
As depicted in Fig. 5, all HIV-PI treatments led to a sta-
1276
Bourlier et al.
Total protein and cell triglyceride contents were assayed, and
the expression of aP2 and HSL was analyzed by real-time
RT-PCR.
As observed in Table 1, protein and triglyceride contents
were significantly decreased (44 and 52% decrease in protein
and triglyceride concentrations, respectively) as well as
mRNA expression of aP2 and HSL (67 and 73% decrease in
aP2 and HSL, respectively) in cultures receiving 5 ␮M
MMP-9 inhibitor, indicating an alteration of the differentiation process of treated preadipocytes. As for batimastat,
MMP-9 inhibitor at 1 ␮M had no effect on human adipocyte
differentiation (data not shown).
MMP-9 Inhibitor Treatment but Not Batimastat
Treatment Decreases MMP-9 Gelatinase Activity Released by Human Preadipocytes. To determine whether
the two MMP inhibitors could modify the release of the
native preadipocyte-derived MMP-9 and -2, we performed
gelatin zymography on medium conditioned overnight by
preadipocytes treated for 10 days with 5 ␮M batimastat or
MMP-9 inhibitor.
As previously reported (Fig. 4), MMP-9 (92 kDa) and
MMP-2 (72 kDa) proforms (artificially activated by the gelatin zymography technique) were the major forms detectable
in preadipocyte-conditioned media. Surprisingly, densitometric analysis of the lytic areas showed that a 10-day treatment with MMP-9 inhibitor reduced MMP-9 gelatinase activity released into the medium by preadipocytes (84%
decrease), without affecting that of MMP-2 (pro ⫹ active
forms) (Fig. 6). This decrease of MMP-9 gelatinase activity in
the medium, corresponding to the proform, was not accompanied by an increase of the active-MMP-9 form (still not
detectable), suggesting that this reduction was due to a decrease in the secretion of the enzyme rather than an increase
in the maturation. Real-time RT-PCR analysis performed on
mRNAs extracted from the same 10-day-treated preadipocytes revealed a decrease of MMP-9 expression (data not
shown), confirming the results obtained with gelatin zymography. Batimastat treatment had no effect on MMP-9 or
MMP-2 gelatinase activities released into the medium by
treated human preadipocytes (Fig. 6).
Fig. 3. Effect of the MMP inhibitor batimastat or HIV-PIs on the activity
of human recombinant activated MMP-2 and -9. Human recombinant
activated MMP-2 (2 nM) or MMP-9 (4 nM) was preincubated with or
without increasing concentrations of batimastat (from 0.01 nM to 0.01
␮M) or HIV-PIs (from 1 nM to 100 ␮M). The MMP fluorogenic substrate
Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dnp-Ala-Arg was then added, and fluorescence
(excitation, 325 nm; emission, 390 nm) was recorded. Data are means ⫾
S.E.M. of maximum rate/minute for five separate measurements, expressed as a percentage of the control for three independent experiments.
tistically significant reduction of MMP-9 expression: 64%
decrease with IDV (50 ␮M), 75% decrease with RTV (10 ␮M),
82% decrease with SQV (10 ␮M), and 96% decrease with NFV
(5 ␮M). These data are in accordance with those obtained by
gelatin zymography, suggesting that the observed decrease of
MMP-9 gelatinase activity released into the medium under
HIV-PI treatments is probably due to a reduction of MMP-9
expression.
MMP-9 Inhibitor Treatment Decreases the Differentiation of Human Preadipocytes. Following the previous
results with batimastat and HIV-PI treatments, suggesting a
particular involvement of MMP-9 subtype in human adipogenesis, primary cultures of human preadipocytes were
treated or not with 1 or 5 ␮M MMP-9 inhibitor for 10 days.
Discussion
We previously reported that human mature adipocytes and
preadipocytes as well as murine preadipocytes produced and
released two key enzymes of ECM remodeling, the matrix
metalloproteinases MMP-2 and -9 (Bouloumié et al., 2001).
Moreover, we showed that treatment of murine 3T3-F442A
preadipocytes with MMP inhibitors decreased the rate of
adipocyte differentiation. These data were recently confirmed by others, suggesting that MMP activities were required for adipogenesis in rodents (Croissandeau et al., 2002;
Chavey et al., 2003). In the present work, we found that
batimastat, a broad-spectrum MMP inhibitor, also reduced
the differentiation of human preadipocytes in primary cultures, demonstrating for the first time that MMP activities
are required for adipogenesis in humans too. This effect was
strictly mediated by its action per se on MMP activities since
batimastat strongly inhibited the activity of human recombinant MMP-2 and -9 without affecting their secretion by
treated preadipocytes.
Other protease inhibitors, i.e., HIV-PIs, involved in lipo-
MMP-9 Involvement in Human Adipocyte Differentiation
1277
Fig. 4. Effect of HIV-PIs on MMP-2 or MMP-9 gelatinase
activities released into culture medium by human preadipocytes. Stromal preadipocytes from human subcutaneous
AT were cultured in an adipogenic medium with vehicle
(control) or in the presence of 50 ␮M IDV, 10 ␮M RTV, 10
␮M SQV, or 5 ␮M NFV. After 10 days of culture, the cells
were washed and maintained overnight in basal medium
with treatments. Media were then collected and analyzed
by gelatin zymography. Densitometric analysis of the lytic
areas was performed, and results are expressed as a percentage of the control. Data are means ⫾ S.E.M. for four to
seven independent experiments. ⴱ, p ⬍ 0.05 versus control;
ⴱⴱ, p ⬍ 0.01 versus control.
dystrophy seen in HIV-patients receiving PI therapy (Carr et
al., 1998), have been recently linked to alterations of adipocyte differentiation in murine cell lines in vitro (Zhang et al.,
1999; Lenhard et al., 2000; Mondal et al., 2001). We reported
here that treatments with HIV-PIs IDV, RTV, SQV, and NFV
reduced the differentiation of human preadipocytes in primary cultures. The effectiveness of these products on the
TABLE 1
Effect of MMP-9 inhibitor on the differentiation of human
preadipocytes
Stromal preadipocytes from human subcutaneous AT were cultured for 10 days in an
adipogenic medium in the presence of 5 ␮M MMP-9 inhibitor or its vehicle (control).
Total protein and cell triglyceride contents, as well as aP2 and HSL mRNA expression, were determined in cells maintained overnight in basal medium with treatments. For aP2 and HSL expression, total RNAs were extracted from cells, and
real-time RT-PCR analysis was performed using specific cDNA primers. The results
obtained were normalized to the levels of 18S rRNA. Data are means ⫾ S.E.M.
expressed as a percentage of the control for five independent experiments.
MMP-9 Inhibitor
(5 ␮M)
% of Control
Proteins
Triglycerides normalized with proteins
aP2 mRNA expression
HSL mRNA expression
56.24 ⫾ 8.47**
48.25 ⫾ 13.89**
32.77 ⫾ 2.71**
26.64 ⫾ 6.35**
** p ⬍ 0.01 vs. control.
Fig. 5. Effect of HIV-PIs on MMP-9 expression by human preadipocytes.
Stromal preadipocytes from human subcutaneous AT were cultured in an
adipogenic medium with vehicle (control) or in the presence of 50 ␮M
IDV, 10 ␮M RTV, 10 ␮M SQV, or 5 ␮M NFV. After 10 days of culture, the
cells were washed and maintained overnight in basal medium with treatments. Total RNAs were extracted from cells, and real-time RT-PCR
analysis was performed using specific primers for MMP-9 cDNAs. The
results were normalized to the levels of 18S rRNA and expressed as a
percentage of the control. Data are means ⫾ S.E.M. for four to six
independent experiments. ⴱⴱ, p ⬍ 0.01 versus control.
human differentiation process, NFV, SQV⬎RTV, and IDV,
was comparable with that described in other in vitro studies
(Lenhard et al., 2000; Jain and Lenhard, 2002).
According to the inhibitory action of both batimastat and
HIV-PIs on the human differentiation process, we then investigated the potential relationships between MMPs and,
more particularly, MMP-2 and -9 and HIV-PIs. We did not
find any direct effect of HIV-PIs on human recombinant
MMP-2 and -9 activities. However, we found that all HIV-PI
treatments reduced the release of MMP-9 by treated preadipocytes. This effect was specific to the MMP-9 gelatinase
subtype since MMP-2 release did not present the same profile
of changes as MMP-9 but depended on which HIV-PI was
used as treatment. The decrease of MMP-9 secretion might
be due to the reduction of MMP-9 mRNA expression observed
with preadipocytes under HIV-PI treatments. Interestingly,
the effectiveness of HIV-PIs (NFV and SQV versus RTV and
1278
Bourlier et al.
Fig. 6. Effect of batimastat and MMP-9 inhibitor on MMP-2 or MMP-9
gelatinase activities released into culture medium by human preadipocytes. Stromal preadipocytes from human subcutaneous AT were cultured in an adipogenic medium in the presence of 5 ␮M batimastat, 5 ␮M
MMP-9 inhibitor (MMP-9 Inh), or its vehicle (control). After 10 days of
culture, the cells were washed and maintained overnight in basal medium with treatments. Media were then collected and analyzed by gelatin
zymography. Densitometric analysis of the lytic area was performed, and
results are expressed as a percentage of the control. Data are means ⫾
S.E.M. for five to seven independent experiments. ⴱⴱ, p ⬍ 0.01 versus
control.
IDV) on MMP-9 secretion and/or expression was similar to
that observed on the differentiation process.
Although few data are available in the literature concerning the potential relationships between MMPs and HIV-PIs,
Mondal et al. (2001) have recently reported a strong increase
in the release of active MMP-2 and a slight increase in the
release of pro and active MMP-9 by differentiating 3T3-L1
cells under IDV and RTV treatment. Paradoxically, the same
authors described inhibition of 3T3-L1 adipocyte differentiation with both HIV-PIs. These results are unexpected since
other studies have reported an increase of secreted MMP-2
and/or -9 in murine preadipocyte models in vitro, including
the 3T3-L1 cell type, during adipose conversion (Bouloumié
et al., 2001; Croissandeau et al., 2002; Chavey et al., 2003).
Furthermore, the use of MMP inhibitors in this model had
led to a decrease of the differentiation process (Croissandeau
et al., 2002). Culture conditions and experimental protocols
may explain these discrepancies. Regarding our results, the
differences may also be explained by the in vitro model used,
i.e., murine preadipocytes versus human preadipocytes.
According to the effect of HIV-PIs on the release and expression of MMP-9, an involvement of this MMP subtype in
the batimastat-mediated effect was suspected. Thus, we in-
vestigated the effect of MMP-9 inhibitor treatment on human
preadipocytes and observed a decrease in the differentiation
process. However, unlike batimastat, MMP-9 inhibitor not
only decreased the activity of human recombinant MMP-9
(data not shown) but also strongly reduced MMP-9 release by
treated preadipocytes. These results associated with those
obtained with HIV-PI treatments strongly suggest a particular role of MMP-9 subtype in human adipogenesis.
The way in which HIV-PIs affect MMP-9 expression in
human preadipocytes may reside in a specificity of the
MMP-9 gene, i.e., the presence of a nuclear factor-␬B (NF-␬B)
binding site in its promoter region. Indeed, recent publications have reported an inhibition of the 20S and/or 26S proteasome in various cellular types using HIV-PIs (Gaedicke et
al., 2002; Pajonk et al., 2002; Piccinini et al., 2002). These
proteasomes are involved in the degradation of the I␬B family inhibitory molecules that sequester NF-␬B transcription
factors in the cytosol in resting conditions, masking their
nuclear location necessary for gene transcription (Palombella
et al., 1994). It can be speculated, according to some recent
works (Gaedicke et al., 2002; Pati et al., 2002), that HIV-PIs
reduced proteasome activities in our model, decreasing
NF-␬B translocation and MMP-9 gene transcription. This
hypothesis is currently being investigated by our group.
Thus, by reducing MMP-9 secretion, HIV-PIs may alter not
only its direct influence on the degradation of structural
matrix molecules but also the cleavage of several circulating,
cell surface, and pericellular proteins which regulate cell
behavior in numerous ways (Sternlicht and Werb, 2001).
Adipocytokines (IL-8, IL-1␤, IL-6, or tumor necrosis factor-␣)
and transforming growth factor-␤, whose extracellular level
and/or activity can be regulated by MMPs, may be involved in
the MMP-9-dependent pathway leading to inhibition of human adipocyte differentiation.
In conclusion, our data reveal the specificity of impact of
MMP inhibitors and HIV-PIs on the human fat cell precursors, the preadipocytes. They show that the modulation of the
extracellular matrix components through the production of
MMPs and, more precisely, MMP-9 might be a key factor in
the regulation of human adipose tissue development. They
also suggest that, by affecting the production of MMP-9,
HIV-PIs promote human adipose tissue atrophy by preventing replacement of lost adipocytes.
Acknowledgments
We thank Marie-Thérèse Canal for technical assistance.
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Address correspondence to: Dr. Virginie Bourlier, Institut National de la
Santé et de la Recherche Médicale U586, 37 Allées Jules Guesde, 31073
Toulouse, France. E-mail: [email protected]
Discussion de la publication 1
Nous avons travaillé sur des cultures primaires de cellules de la FSV du TA humain,
issues de dermolipectomies abdominales. Nos résultats montrent que les cellules de la FSV
cultivées dans un milieu adipogénique et traitées pendant 10 jours avec un inhibiteur des
MMPs à large spectre, le batimastat, ont une adipogenèse altérée. En effet, il a été constaté
que les cellules traitées ont un contenu intracellulaire en TGs diminué par rapport aux cellules
contrôles. Il en est de même pour l’expression en ARNm de deux marqueurs adipocytaires,
aP2 et la LHS. Ces données indiquent que le batimastat limite la différenciation adipocytaire
des cellules de la FSV du TA humain suggérant un rôle majeur des MMPs dans l’adipogenèse
chez l’homme.
En parallèle, nous avons déterminé l’effet de quatre inhibiteurs de la protéase du VIH:
l’indinavir (IDV), le ritonavir (RTV), le saquinavir (SQV) et le nelfinavir (NFV) sur la
différenciation des cellules de la FSV du TA humain. Nous avons observé que les quatre IPsVIH utilisés limitent la différenciation adipocytaire des cellules de la FSV en culture
primaire. En accord avec nos résultats, une étude récente indiquent que le RTV bloque
l’adipogenèse des préadipocytes humains de type SGBS (Syndrome de Simpson-GolabiBehmel) (92, 123). Il faut préciser que dans notre étude en accord avec des résultats décrits
dans d’autres études in vitro sur des préadipocytes murins que le SQV et le NFV montrent
des effets plus marqués sur la différenciation adipocytaire que l’IDV et le RTV (109, 144).
Ainsi, le syndrome de lipoatrophie associé aux IPs-VIH pourrait donc être relatif aux effets
apoptotiques observés sur les adipocytes matures (12, 64) mais également aux effets négatifs
sur l’adipogenèse.
Les effets anti-différenciant obtenus avec les inhibiteurs de protéases matricielles tels
que le batimastat et les inhibiteurs de la protéase du VIH, nous ont conduit à émettre
l’hypothèse d’un lien entre les MMPs et les IPs-VIH. Afin de déterminer si les IPs-VIH
affectent la différenciation adipocytaire via une voie dépendante des MMPs, nous avons
étudié leur capacité à inhiber directement l’activité des MMP-2 et -9 par une approche in
vitro en utilisant un substrat synthétique des MMPs qui libère un peptide fluorescent après
l’action des MMP-2 et -9 recombinantes en présence des IPs-VIH ou d’inhibiteurs des
MMPs. Aucun effet direct des IPs-VIH sur l’activité des protéines humaines recombinantes
MMP-2 et -9 n’a été observé contrairement au batimastat. Cependant et de manière
surprenante, nous avons observé que les quatre IPs-VIH diminuent spécifiquement l’activité
gélatinase de MMP-9 relarguée dans le milieu de culture alors que l’activité de MMP-2 reste
60
maintenue. Cette diminution de la sécrétion de MMP-9 par les IPs-VIH est associée à une
diminution des taux de transcrits pour MMP-9 suggérant que l’effet anti-adipogénique des
IPs-VIH est associé à l’inhibition spécifique de MMP-9 via un effet transcriptionnel sur son
expression. Le rôle spécifique de MMP-9 dans l’adipogenèse a été confirmé par un inhibiteur
dirigé contre MMP-9 (MMP-9/MMP-13 inhibitor II). Cet inhibiteur diminue la
différenciation des cellules de la FSV du TA humain et réduit l’activité mais également
l’expression de MMP-9. De plus, l’effet d’un anticorps neutralisant dirigé contre la MMP-9
dans la différenciation adipocytaire des cellules de la FSV du TA humain a fait l’objet d’une
étude complémentaire.
B) Influence d’un anticorps neutralisant dirigé contre la MMP-9 sur la
différenciation adipocytaire
Comme pour les précédents traitements décrits dans la publication 1, les cellules de la
FSV ont été cultivées en milieu adipogénique et traitées avec un anticorps neutralisant dirigé
spécifiquement contre la MMP-9 (Chemicon). Comme le montre la figure 14, après 10 jours
de traitement, le contenu intracellulaire en TGs est fortement diminué ainsi que l’expression
en ARNm des marqueurs adipocytaire aP2 et LHS. Ces résultats indiquent donc que l’activité
de MMP-9 est spécifiquement requise pour le bon déroulement de la différenciation
adipocytaire chez l’homme et suggèrent que les effets anti-adipogéniques des IPs-VIH
pourraient être médiés par la chute de l’expression de MMP-9.
Comme nous l’avons évoqué dans le chapitre d’introduction, les mécanismes
d’actions des IPs-VIH sur l’adipogenèse sont encore peu connus. Des travaux ont rapporté
que les IPs-VIH peuvent altérer la maturation et la stabilité de la lamine A/C, perturbant ainsi
la localisation cellulaire de SREBP-1 et l’adipogenèse de préadipocytes murins (29). Il a
également été décrit que les IPs-VIH pouvaient inhiber l’activité du protéasome de certaines
cellules cancéreuses (4, 239) et plus récemment celle des préadipocytes murins de la lignée
3T3-L1 (202). En revanche, l’effet des IPs-VIH sur l’activité du protéasome des
préadipocytes humains reste à déterminer et a fait l’objet de la suite de ce travail. L’activité
du protéasome a de plus été associée à de nombreuses fonctions cellulaires telles que la
progression dans le cycle cellulaire, l’apoptose et la régulation de l’expression de nombreux
gènes notamment en modulant l’activité du facteur de transcription NF-κB (1, 125). Quelques
données parcellaires montrent que l’expression génique de MMP-9, contrairement à celle de
61
B
Contrôle
Ac neutralisant MMP-9
(0.5 µg/ml)
Marqueurs de la différenciation
adipocytaire (en % du contrôle)
A
100
75
50
*
**
25
0
**
TGs
aP2
LHS
ARNm
Figure 14 : Effet d’un anticorps neutralisant pour la MMP-9 sur la différenciation
adipocytaire des cellules de la FSV du tissu adipeux humain
Les cellules de la FSV sont cultivées en conditions adipogéniques et traitées avec un anticorps
neutralisant MMP-9 ou un IgG contrôle pendant 10 jours. (A) Une photographie représentative
de 3 expériences indépendantes est présentée. (B) Le contenu intracellulaire en TGs normalisé à
la quantité d’ADN ainsi l’expression en ARNm d’aP2 et de la LHS ont été évalués. Les résultats
sont exprimés en % du contrôle. * P<0.01, **P< 0.001 vs contrôle
MMP-2, peut-être régulée par NF-κB. En effet, au niveau du promoteur de MMP-9, un site de
liaison pour ce facteur de transcription a été décrit (236, 256). Ainsi, en regroupant
l’ensemble de ces données, nous avons émis l’hypothèse que les IPs-VIH diminuent l’activité
protéasomique des préadipocytes humains empêchant ainsi la dégradation d’IκB, l’inhibiteur
de NF-κB, qui interagit avec NF-κB et le séquestre dans le cytoplasme. Par conséquent, NFκB ne peut pas être transféré dans le noyau et entraîner la transcription de gènes notamment
celui de MMP-9. Pour plus de clarté, cette hypothèse est schématisée dans la figure 15.
C) Détermination des mécanismes impliqués dans la chute de l’expression de
MMP-9 par les inhibiteurs de la protéase du VIH
Publication 2 : Inhibition of human preadipocyte proteosomal activity, by HIV protease
inhibitor or specific inhibitor lacatacystin, leads to a defect in adipogenesis which involves
matrix metalloproteinase-9. S. De Barros, A. Zakaroff-Girard, M. Lafontan, J. Galitzky and
V. Bourlier J Pharmacol Exp Ther, 320:291-299, 2007
62
IPs-VIH
NF-κB
IκB
PROTEASOME
Cytoplasme
NF-κB
MMP-9
Noyau
Figure 15 : Hypothèse du mode d’action des IPs-VIH sur l’expression génique de MMP-9
A l’étal basal, NF-κB est séquestré dans le cytoplasme par son inhibiteur IκB. La translocation
nucléaire de Nf-kB permettant l’activation des gènes cibles de ce facteur, dépend de la
dégradation de son inhibiteur IκB par le protéasome. Les IPs-VIH ont été décrits comme des
inhibiteurs de l’activité du protéasome de certaines cellules cancéreuses et préadipocytes murins.
Ainsi, une inhibition de l’activité du protéasome par les IPs-VIH pourrait empêcher la
dégradation d’IκB et la translocation nucléaire de NF-κB diminuant ainsi la transcription de ces
gènes cibles et notamment MMP-9.
0022-3565/07/3201-291–299$20.00
THE JOURNAL OF PHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS
Copyright © 2007 by The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics
JPET 320:291–299, 2007
Vol. 320, No. 1
111849/3162833
Printed in U.S.A.
Inhibition of Human Preadipocyte Proteasomal Activity by
HIV Protease Inhibitors or Specific Inhibitor Lactacystin
Leads to a Defect in Adipogenesis, Which Involves Matrix
Metalloproteinase-9
Sandra De Barros, Alexia Zakaroff-Girard, Max Lafontan, Jean Galitzky,
and Virginie Bourlier
Unité de Recherche sur les Obésites, Institut National de la Santé et de la Recherche Médical Unité 586, Institut Louis
Bugnard, Hopital Rangueil, Université Paul Sabatier, Toulouse, France
Received August 2, 2006; accepted October 10, 2006
ABSTRACT
In a previous publication, we reported that human immunodeficiency virus (HIV) protease inhibitors (PIs) inhibited the differentiation of human preadipocytes in primary culture, reducing
the expression and secretion of matrix metalloproteinase 9
(MMP-9). The present work was performed to clarify this mechanism. Interestingly, HIV-PIs have been reported to be inhibitors of the proteasome complex, which is known to regulate
nuclear factor (NF)-␬B activation and transcription of its target
genes, among them MMP-9. We thus investigated the potential
involvement of the proteasome in the antiadipogenic effects of
HIV-PIs. The effect of four HIV-PIs was tested on preadipocyte
proteasomal activity, and chronic treatment with the specific
proteasome inhibitor lactacystin was performed to evaluate
alterations of adipogenesis and MMP-9 expression/secretion.
Finally, modifications of the NF-␬B pathway induced by either
HIV-PIs or lactacystin were studied. We demonstrated that
Proteasomes are highly conserved multimeric peptidases
present in all eukaryotic cells. Whereas various forms of
proteasomes exist, the 20S proteasome (multicatalytic core of
all proteasomes) and the 26S proteasome (20S core capped
with two 19S regulatory units) are major proteasomes. Proteasomes were initially thought to be just recyclers of damaged or misfolded proteins, but over the last decade the
activity of this enzymatic complex has been found to be of
This work was supported by Grants 01 128 and 02 197 from the Agence
Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales.
Article, publication date, and citation information can be found at
http://jpet.aspetjournals.org.
doi:10.1124/jpet.106.111849.
preadipocyte proteasomal activity was decreased by several
HIV-PIs and that chronic treatment with lactacystin mimicked
the effects of HIV-PIs by reducing adipogenesis and MMP-9
expression/secretion. Furthermore, we observed an intracellular accumulation of the NF-␬B inhibitor, I␬B␤, with chronic
treatment with HIV-PIs or lactacystin as well as a decrease in
MMP-9 expression induced by acute tumor necrosis factor-␣
stimulation. These results indicate that inhibition of the proteasome by specific (lactacystin) or nonspecific (HIV-PIs) inhibitors
leads to a reduction of human adipogenesis, and they therefore
implicate deregulation of the NF-␬B pathway and the related
decrease of the key adipogenic factor, MMP-9. This study adds
significantly to recent reports that have linked HIV-PI-related
lipodystrophic syndrome with altered proteasome function, endoplasmic reticulum stress, and metabolic disorders.
critical importance for many cellular functions. Cell-cycle
progression, oncogenesis, apoptosis, regulation of gene expression, and inflammation or immune surveillance are all
physiological functions regulated by the proteasome pathway
(Kisselev and Goldberg, 2001). Among the substrates of the
proteasome, cyclins (e.g., cyclin B1), cyclin-dependent kinase
inhibitors (e.g., p21 and p27), tumor suppressors (e.g., p53),
and inhibitors (I␬B) or precursors (e.g., p105) of the transcription factor NF-␬B are well established (Kisselev and
Goldberg, 2001; Adams, 2004). Accordingly, the proteasome
complex has emerged as an attractive target for cancer therapy, and numerous proteasome inhibitors have been developed (Adams, 2004; Voorhees and Orlowski, 2006).
ABBREVIATIONS: I␬B, inhibitor of nuclear factor-␬B; NF-␬B, nuclear factor-␬B; HIV, human immunodeficiency virus; PI, protease inhibitor; AT,
adipose tissue; MMP, matrix metalloproteinase; SQV, saquinavir; NFV, nelfinavir; TNF, tumor necrosis factor; Bay 11-7802, (E)-3-[(4-methylphenyl)-sulfonyl]-2-propenenitrile; IDV, indinavir; RTV, ritonavir; RFU, relative fluorescence units; TBST, Tris-buffered saline/Tween 20; RT, reverse
transcriptase; PCR, polymerase chain reaction; aP2, fatty acid binding protein; HSL, hormone-sensitive lipase; ANOVA, analysis of variance.
MG-132, carbobenzoxy-L-leucyl-L-leucyl-L-leucinal; TG, triglyceride.
291
292
De Barros et al.
Recently, human immunodeficiency virus (HIV) protease
inhibitors (PIs), central components of highly active antiretroviral therapy, have been reported by some authors to directly inhibit the activities of murine and human 20S and/or
26S proteasomes in purified fractions or cellular extracts
(André et al., 1998; Gaedicke et al., 2002; Pajonk et al., 2002;
Piccinini et al., 2002). Indeed, several cleavage sites used by
the HIV protease, which were once thought to be unique and
distinct from those of mammalian proteases (predicting inhibitor selectivity), were found to be similar to those recognized by the 20S proteasome (Schmidtke et al., 1999). Although HIV-PIs have been successfully used in clinical
therapy of HIV infection, they were also rapidly associated
with the emergence of a lipodystrophic syndrome observed in
patients treated with highly active antiretroviral therapy,
which includes dyslipidemia, insulin resistance, central adiposity, and peripheral lipoatrophy. It is now clear that the
mechanism associated with PI-induced metabolic abnormalities is multifactorial (for reviews, see Hui, 2003; Rudich et
al., 2005) but whether the action of HIV-PIs on proteasomal
activity is related to their side effects has been poorly investigated to date.
We previously reported, in accordance with in vivo studies
performed on adipose tissue biopsies from HIV-infected lipodystrophic patients (Bastard et al., 2002; Lloreta et al., 2002),
that PIs reduced the differentiation of human preadipocytes
(i.e., adipocyte precursors) in primary culture isolated from
subcutaneous abdominal adipose tissue (AT) (Bourlier et al.,
2005). This effect was attributed to an indirect action of
HIV-PIs on the expression and secretion of the matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), an enzyme implicated in extracellular matrix remodeling and significantly involved in the
human adipogenic process in vitro (Bourlier et al., 2005).
Because the MMP-9 promoter contains an NF-␬B site (Sato
and Seiki, 1993; St-Pierre et al., 2004) and because proteasomal activity is involved in the activation of NF-␬B pathway, we investigated the potential role of the proteasome in
the antiadipogenic effect of HIV-PIs. We demonstrate here
that HIV-PIs, particularly saquinavir (SQV) and nelfinavir
(NFV), were direct inhibitors of the human preadipocyte 20S
and 26S proteasomes. We found that chronic lactacystin (a
specific proteasome inhibitor) treatment mimicked the effects of HIV-PIs by decreasing the differentiation process and
the expression and secretion of MMP-9. Chronic treatment
with either HIV-PIs (SQV or NFV) or lactacystin led to the
accumulation of the I␬B␤ protein, the inhibitor of the transcription factor NF-␬B and a substrate of the proteasome.
Finally, acute treatment with TNF-␣ (activator of NF-␬B)
induced a potent increase in MMP-9 expression, which was
significantly reduced by SQV, lactacystin, or (E)-3-[(4-methylphenyl)-sulfonyl]-2-propenenitrile (Bay 11-7082) (inhibitor
of NF-␬B activation) cotreatments. Overall, our data indicate
that HIV-PIs, by affecting proteasomal activity, alter the
NF-␬B pathway and implicate the reduction of MMP-9 activity in their antiadipogenic effect.
Materials and Methods
Cell Culture and Treatment. Chemicals were from SigmaAldrich (Saint-Quentin Fallavier, France). Cell culture reagents
were either from Life Technologies (Cergy Pontoise, France), Roche
Diagnostics (Meylan, France), or Cambrex Biosciences (Verviers,
Belgium).
Human subcutaneous abdominal white AT was obtained from
moderately overweight women undergoing plastic surgery (mean age
46 ⫾ 2 years and mean body mass index 27.5 ⫾ 0.7 kg/m2). The
isolation of human AT-derived stromal cells and the culture of stromal preadipocytes differentiated into adipocytes were performed as
described previously (Bouloumié et al., 2001). In brief, sterile AT was
cut into small pieces and digested under agitation with collagenase
(2 mg/ml) (Serva; Coger, Paris, France) for ⬃1 h at 37°C. After
centrifugation, washing, and filtration steps, the stromal cells were
suspended in Dulbecco’s modified Eagle’s medium F-12 supplemented with 10% fetal bovine serum and plated at 60,000 cells/cm2.
After 24 h, the medium was replaced by a medium consisting of
Dulbecco’s modified Eagle’s medium F-12 supplemented with 33 ␮M
biotin, 17 ␮M pantothenate, and 50 ␮g/ml gentamicin (basal medium) in the presence of 66 nM insulin, 1 nM triiodothyronine, 100
nM cortisol, and 10 ␮g/ml human transferrin (adipogenic medium)
and 1 ␮g/ml ciglitazone for the first 3 days. After the 3-day priming
period, the cells were used for experiments or cultured in the adipogenic medium supplemented with 1) the proteasome inhibitor lactacystin or 2) HIV-PIs IDV (kindly provided by Merck Laboratories,
Rahway, NJ) or SQV (kindly provided by Roche, Welwyn Garden
City, UK), RTV (kindly provided by Abbott Laboratories, Chicago,
IL), or NFV (kindly provided by Roche Diagnostics, Mannheim,
France) for 10 days. Lactacystin and HIV-PIs were dissolved in pure
dimethyl sulfoxide. Control cells were treated using an appropriate
concentration of vehicle (⬍0.25%) after verification that dimethyl
sulfoxide was without effect on the various parameters analyzed (i.e.,
lipogenic index, adipogenic gene, or MMP secretion). Medium was
replaced every 2 days. Before some experiments, cells were placed
overnight in basal medium supplemented with the various treatments.
The medium was then collected and used in zymography analysis.
Cellular triglyceride and DNA contents were determined using kits
from Sigma-Aldrich and Molecular Probes (PicoGreen; Interchim,
Montluçon, France), respectively, according to the manufacturer’s
instructions. DNA content was used to normalize data (triglyceride
content and MMP secretion) and to evaluate any cytotoxic effect of
treatments.
Gelatin Zymography. Proteins with gelatinolytic activity (including the gelatinase A “MMP-2” and the gelatinase B “MMP-9”)
were identified by electrophoresis in the presence of SDS in 8%
polyacrylamide gels containing 1 mg/ml gelatin. In brief, culture
medium aliquots (20 ␮l) were directly loaded onto gels, and, after
electrophoresis, proteins were renatured by exchanging SDS with
2.5% Triton X-100 (20-min incubation repeated twice). The gels were
then incubated for 16 h at 37°C in 50 mM Tris-HCl (pH 8.8), 5 mM
CaCl2, and 0.02% NaN3 and stained with Coomassie Blue. The
presence of gelatinolytic activity in the culture medium aliquots was
visualized as clear areas on an otherwise blue gel. Migration of
proteins was compared with that of prestained molecular weight
markers. The gels were scanned by an imaging densitometer and
quantified using the NIH Image program (developed at the National
Institutes of Health, Bethesda, MD).
Fluorimetric Proteasome Activity Assay. Chymotrypsin-like
proteasome activity was performed on 96-well plates using the specific fluorogenic substrate N-succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr7-amido-4methylcoumarin (Sigma). In brief, cells contained in one well were
scraped in 35 ␮l of lysis buffer containing 25 mM Tris-HCl (pH 7.5),
0.1% Nonidet P-40, 10% glycerol, 5 mM MgCl2, 1 mM ATP, and 10
mM KCl. Protein concentration was determined using a Bio-Rad kit
(Bio-Rad, Marnes-la Coquette, France), and 10 ␮g were incubated
alone or with increasing concentrations of lactacystin (0.01–10 ␮M)
or HIV-PIs (1, 10, and 50 ␮M) for 30 min at 37°C in 20 mM Tris-HCl
(pH 8), 0.5 mM EDTA, and 0.035% SDS to assess 20S proteasome
activity or in 20 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM ATP, and 2 mM MgCl2
to assess 26S proteasome activity, according to the method of Rock et
al. (1994). Then, fluorogenic substrate was added to a final concentration of 50 ␮M, and fluorescence was monitored at ␭excitation 360
Proteasome Inhibition Reduces Human Adipogenesis
nm/␭emission 460 nm every 5 min over a 2-h period using a Fluoroscan
Ascent FL (Labsystems, Cergy Pontoise, France). Chymotrypsin-like
proteasome activities of 20S and 26S were evaluated by the maximal
rate (relative fluorescence units per minute) on seven separate measurements in each well.
Western Blot. For Western blot analysis of I␬B␣ and I␬B␤, cells
contained in two wells were scraped in 70 ␮l of lysis buffer containing
20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2,
1 mM Na3VO4, 1% Nonidet P-40, 10% glycerol, and a mix of protease
inhibitors (Complete; Roche Diagnostics). The protein concentration
was determined, and 35 to 50 ␮g of protein were loaded and separated by electrophoresis on a 12% SDS-polyacrylamide gel under
denaturing conditions. After transfer to polyvinylidene difluoride
membranes (Immobilon; Millipore, Bedford, MA) and Ponceau staining to verify equal loading of the lanes, membranes were blocked for
1 h with TBST [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% Tween
20] containing 5% nonfat milk, following by incubation overnight at
4°C with primary antibody against I␬B␣ (ab7545) or I␬B␤ (ab7547)
(Abcam, Cambridge, UK) at a dilution of 1:1000 in TBST containing
1% nonfat milk. Then, membranes were washed with TBST and
incubated for 1 h with a peroxidase-conjugated secondary antibody
(Pierce Chemical, Brebières, France) at a dilution of 1:50,000 in
TBST containing 1% nonfat milk and washed again. The immunocomplexes were detected using a chemiluminescence reagent kit
(SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate; Pierce
Chemical, Rockford, IL). Human Daudi cell lysate (Imgenex, San
Diego, CA) was used as positive control.
For Western blot analysis of NF-␬B p65, cells contained in 12 wells
were washed twice with cold phosphate-buffered saline and prepared
using NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents kit
(Pierce) according to the manufacturer’s instructions. Protein concentrations in nuclear and cytoplasmic extracts were determined as
described above: 20 to 45 ␮g of proteins were loaded and separated by
electrophoresis on a 12% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
under denaturing conditions. After transfer to polyvinylidene difluoride membranes and Ponceau staining to verify equal loading of the
lanes, a WesternBreeze Chemiluminescent Western Blot Immunodetection Kit (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) was used for signal detection. Briefly and according to the manufacturer’s instructions, membranes were blocked, washed, and then incubated with a
primary antibody against NF-␬B p65 N-terminal (Santa Cruz Biotechnology, Le Perray-en-Yvelines, France) at a dilution of 1:1000.
After washing, membranes were incubated with an alkaline phosphatase-conjugated secondary antibody provided with the kit, and
immunocomplexes were detected after the addition of chemiluminescent substrate. Human nuclear extract from A-431 cells (Santa Cruz
Biotechnology) was used as positive control.
The autoradiographs were scanned by an imaging densitometer
and quantified using the NIH Image program. To normalize results,
the densitometric value of each band of interest (i.e., I␬B␣, I␬B␤, and
NF-␬B p65) was reported to the densitometric value of total loaded
proteins in the corresponding lane, obtained after scanning and
quantification of the Ponceau staining (NIH Image program).
Real-Time RT-PCR. Changes in mRNA levels from specific
genes were quantified by real-time RT-PCR. Total RNAs were extracted using a QIAGEN RNeasy Mini Kit according to the manufacturer’s instructions, and RNA concentrations were determined
using a Molecular Probes fluorimetric assay (RiboGreen; Interchim).
RNA (0.5 ␮g) was reverse-transcribed using the Superscript II system (Invitrogen) according to the manufacturer’s instructions. Reverse transcription was also performed without Thermoscript enzyme on RNA samples to check for any genomic DNA contamination.
PCR primers were designed using Primer Express software according to the recommendations of Applied Biosystems (Courtaboeuf,
France). The forward and reverse primer sequences for fatty acid
binding protein (aP2), hormone-sensitive lipase (HSL), MMP-9,
MMP-2, and I␬B␤ were as follows (5⬘–3⬘): aP2, GCATGGCCAAACCTAACATGA (forward) and CCTGGCCCAGTATGAAGGAAA (re-
293
verse); HSL, GTGCAAAGACGGAGGACCACTCCA (forward) and
GACGTCTCGGAGTTTCCCCTCAG; MMP-9, CCCTGGAGACCTGAGAACCA (forward) and CCACCCGAGTGTAACCATAGC (reverse); MMP-2 CACCCATTTACACCTACACCAAGA (forward) and
AGAGCTCCTGAATGCCCTTGA (reverse), and I␬B␤ TACGACGACATTGTGGTTCACA (forward) and GGGTCGTCAGGAAGAGGTTTT
(reverse).
Each amplification reaction was performed with 15 ng of cDNA
sample in duplicate in 96-well optical reaction plates with a GeneAmp 7500 sequence detection system. The PCR mixture contained
forward and reverse primer mix (final concentration: 900 nM for
HSL, MMP-9, or MMP-2 and 300 nM for aP2 or I␬B␤) and SYBR
Green PCR Master Mix. For ribosomal RNA control (18S rRNA), a
mixture containing primers and fluorogenic probe mix, TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) was used. All reactions
were performed under the same conditions: 50°C for 2 min and 95°C
for 10 min, followed by 40 cycles of 95°C for 15 s and 60°C for 1 min.
Results were analyzed with the GeneAmp 7500 software, and all
values were normalized to the levels of 18S rRNA. An interindividual
variability of 10.46% within the control values was observed for all
PCR data (aP2, HSL, MMP-2, MMP-9, and I␬B␤).
Statistical Analysis. Values are expressed as means ⫾ S.E.M.
from n independent experiments. Statistical analysis was performed
using Student’s t test for paired data or one-way analysis of variance
(ANOVA) coupled with post hoc Dunnett’s multiple-comparison test
(GraphPad Prism 4; GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Values of p ⬍ 0.05 were considered statistically significant.
Results
HIV-PIs or Lactacystin Reduced Proteasome Activity from Human Preadipocyte Homogenates. To validate our hypothesis, we first investigated the effect of HIVPIs on proteasome activity of human preadipocytes. After the
3-day priming period, undifferentiated preadipocytes were
scraped into specific lysis buffer, and cellular homogenates
were obtained. Then, homogenates were pretreated (30 min,
37°C) with increasing concentrations of the proteasome inhibitor lactacystin (from 0.01 to 10 ␮M) or HIV-PIs (1, 10,
and 50 ␮M), and 20S and 26S chymotrypsin-like proteasome
activities from these lysates were determined by in vitro
fluorescence assays with the specific fluorogenic substrate
N-succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr7-amido-4-methylcoumarin.
As expected, lactacystin reduced, in a concentration-dependent manner, the fluorescence emission induced by the cleavage of the substrate by the 20S and 26S proteasome (control
maximal rate: 1.62 ⫾ 0.84 and 1.13 ⫾ 0.21 RFU/min, respectively) (Fig. 1, top and bottom). Similar results were obtained
with another known proteasome inhibitor, carbobenzoxy-Lleucyl-L-leucyl-L-leucinal (MG-132) (data not shown). As
shown on the top of Fig. 1, HIV-PIs, except IDV, decreased
chymotrypsin-like activity of the 20S proteasome in a concentration-dependent manner with the following rank of efficiency: SQV ⱖ NFV ⬎ RTV. Higher concentrations of HIVPIs were necessary to reduce the 26S chymotrypsin-like
proteasome activity in the cellular extracts (Fig. 1, bottom).
Chronic Lactacystin Treatment Decreased the Differentiation of Human Preadipocytes. To determine
whether the inhibition of the proteasome per se could affect
the human adipocyte differentiation process, primary cultures of human preadipocytes were placed in an adipogenic
medium in the presence of 0.1 or 0.5 ␮M lactacystin for 10
days. Cellular triglyceride was quantified, and the expression of two adipocyte differentiation markers, aP2 and HSL,
was analyzed by real-time RT-PCR.
294
De Barros et al.
Fig. 1. Effect of HIV-PIs on chymotrypsin-like proteasome activity in
human preadipocyte homogenates. Stromal preadipocytes were isolated
from human subcutaneous AT. After the 3-day priming period, cells were
washed and maintained overnight in basal medium before being scrapped
in specific lysis buffer. Ten micrograms of protein obtained from cellular
homogenates were then preincubated (30 min, 37°C) with or without
increasing concentrations of lactacystin (0.01 and 10 ␮M) or HIV-PIs (1,
10, and 50 ␮M). The proteasome fluorogenic substrate N-succinyl-LeuLeu-Val-Tyr7-amido-4-methylcoumarin was added and fluorescence
(␭excitation 360 nm/␭emission 460 nm) was recorded every 5 min over a 2-h
period. Data are means ⫾ S.E.M. of maximal rate (relative fluorescence
units per minute) for seven separate measurements, expressed as a
percentage of the control for four to five independent experiments. ⴱ, p ⬍
0.05 versus control; ⴱⴱ, p ⬍ 0.01 versus control.
As clearly shown in Fig. 2A, 0.5 ␮M lactacystin led to a
strong inhibition of the adipocyte differentiation process because treated cells exhibited less cytoplasmic accumulation
of lipid droplets. Quantification of cellular triglyceride (TG)
content, used as a lipogenic index, demonstrated that lactacystin treatment significantly decreased adipogenesis (36%
decrease in triglyceride concentration, i.e., 26.58 ⫾ 8.28 mg of
TGs/mg of DNA for controls to 13.68 ⫾ 3.12 mg of TGs/mg of
DNA for lactacystin) (Fig. 2B). Moreover, the analysis of aP2
and HSL mRNA levels showed that lactacystin led to a reduction of the expression of both adipocyte differentiation
markers (41 and 60% decreases in aP2 and HSL mRNA
expression, respectively) (Fig. 2B). It has to be noticed that
lactacystin at 0.1 ␮M had no effect on the differentiation
process and that both 0.1 and 0.5 ␮M lactacystin were free of
any cytotoxic effects (data not shown). However, the use of
concentrations higher than 1 ␮M was associated with cell
death within several days (data not shown).
Chronic Lactacystin Treatment of Human Preadipocytes Reduced MMP-9 Expression and MMP-9 Gelatinase Activity Released into the Medium. MMP-9 activity
has been shown 1) to be involved in the human adipocyte
differentiation process (Bouloumié et al., 2001; Bourlier et
al., 2005) and 2) to be reduced in human preadipocytes
treated by HIV-PIs (Bourlier et al., 2005). To evaluate
whether the inhibition of the proteasome per se could affect
MMP-9 secretion and expression, overnight-conditioned medium from preadipocytes treated with 0.5 ␮M lactacystin for
10 days was collected to be analyzed by gelatin zymography,
and real-time RT-PCR analysis was performed on mRNAs.
As observed in Fig. 3A, MMP-9 (92 kDa) and MMP-2 (72
kDa) proforms (artificially activated by the gelatin zymography technique) were the major forms detectable in preadipocyte-conditioned media. The active form was visible for
MMP-2 (62 kDa) but not for MMP-9 (82 kDa). Densitometric
analysis of the lytic areas showed that lactacystin treatment
reduced the MMP-9 gelatinase activity (proform) released by
treated preadipocytes (53.2 ⫾ 2.7% of the control value, n ⫽
4, p ⬍ 0.001). Interestingly, this decrease of MMP-9 gelatinase activity in the medium, corresponding to the proform,
was not accompanied by an increase of the active-MMP-9
form (still not detectable), suggesting that this reduction was
due to a decrease in the secretion of the enzyme rather than
to an increase in the maturation. In contrast to MMP-9, the
MMP-2 gelatinase activity (proform ⫹ active forms) was not
affected by lactacystin treatment (112.2 ⫾ 11.8% of the control value, n ⫽ 4).
The analysis of MMP mRNA expression (Fig. 3B) was
consistent with the data obtained by gelatin zymography
because lactacystin treatment led to a statistically significant reduction of MMP-9 expression (45% decrease), whereas
no change was observed for MMP-2 expression. Thus, the
observed decrease of MMP-9 gelatinase activity released into
the medium under lactacystin treatment was probably due to
a reduction of MMP-9 expression.
Chronic Treatment with HIV-PIs or Lactacystin Had
No Effect on I␬B␣ but Increased I␬B␤ Protein Level in
Human Preadipocytes. To identify the link between the
inhibition of the proteasome activity and the decrease in
MMP-9 expression, we studied the effect of chronic lactacystin or HIV-PI treatment on I␬B␣ and I␬B␤ proteins, known
substrates of the proteasome. The degradation of these two
well-known I␬B family members leads to NF-␬B translocation to the nucleus (Whiteside and Israël, 1997) and transcription of NF-␬B target genes, among them MMP-9 (StPierre et al., 2004). Human preadipocytes were placed in an
adipogenic medium and treated for 10 days with lactacystin
or various HIV-PIs at concentrations for which no cytotoxic
effect was detected and the inhibition of the differentiation
was maximal according to our previous publication (Bourlier
et al., 2005). Cellular extracts were obtained and analyzed by
the Western blot technique.
As shown in Fig. 4A, none of the treatments led to the
accumulation of I␬B␣ in human preadipocytes. In contrast,
the quantification of the I␬B␤ band clearly indicated that
SQV, NFV, and lactacystin treatment increased the total
cellular level of I␬B␤ protein (83, 36, and 75% increases,
respectively) in human preadipocytes (Fig. 4B). This effect
was not observed with the two other HIV-PIs, IDV and RTV.
Proteasome Inhibition Reduces Human Adipogenesis
295
Fig. 2. Effect of chronic lactacystin treatment on the
differentiation of human preadipocytes. Stromal preadipocytes from human subcutaneous AT were cultured
in an adipogenic medium in the presence of 0.5 ␮M
lactacystin or its vehicle (control). A, light microscopy
analysis was performed after 10 days of treatment.
Photomicrographs (100⫻) are representative of five independent experiments. B, cellular TGs, as well as aP2
and HSL mRNA expression, were determined in cells
maintained overnight in basal medium with treatment.
Cellular triglycerides were normalized to DNA content.
For aP2 and HSL expression, total RNAs were extracted from cells and reverse-transcribed, and realtime RT-PCR analysis was performed using specific
cDNA primers. The results obtained were normalized to
the levels of 18S rRNA. The presented data are
means ⫾ S.E.M. expressed as a percentage of the control for five independent experiments. ⴱ, p ⬍ 0.05 versus control; §, p ⬍ 0.001 versus control.
Fig. 3. Effect of chronic lactacystin treatment on MMP-9 and -2 gelatinase activities released into the medium and on their expression by
human preadipocytes. Stromal preadipocytes from human subcutaneous
AT were cultured in an adipogenic medium with 0.5 ␮M lactacystin or its
vehicle (control). After 10 days of culture, the cells were washed and
maintained overnight in basal medium with or without treatment. A,
culture media were then collected and analyzed by gelatin zymography.
The presented gel is representative of four independent experiments.
Quantification of the lytic areas was performed with the NIH Image
program. B, total RNAs were extracted from cells and real-time RT-PCR
analysis was performed using specific primers for MMP-9 and MMP-2
cDNAs. The results were normalized to the levels of 18S rRNA. The
presented data are means ⫾ S.E.M. expressed as a percentage of the
control for five independent experiments. ⴱⴱ, p ⬍ 0.01 versus control.
It has to be noticed that homogeneity of the controls (i.e.,
IDV, RTV, NFV, SQV, and lactacystin controls) was checked
using one-way ANOVA (not significant, p ⫽ 0.83). The control raw value obtained for the densitometric analysis of I␬B␤
band normalized to total loaded proteins per lane was
0.095 ⫾ 0.019 (arbitrary units).
To verify that the increase in I␬B␤ protein level was not
due to an effect of treatments on I␬B␤ expression, RT-PCR
analysis was performed on mRNAs of preadipocytes treated
for 10 days with NFV (5 ␮M), SQV (10 ␮M), or lactacystin
(0.5 ␮M), when accumulation of the protein was observed. As
shown in Fig. 4C, none of the treatments significantly affected I␬B␤ expression, suggesting that the accumulation of
the protein in the cytosol was due mainly to a decrease of its
degradation, i.e., a decrease in proteasomal activity. However, a contribution of I␬B␤ mRNA expression with NFV can
not be excluded, whereas no statistical significance was
found compared with control values (p ⫽ 0.07, n ⫽ 6), according to the particular variability of the data in this condition.
As for the Western blot experiment, homogeneity of the controls (i.e., NFV, SQV, and lactacystin controls) was checked
using one-way ANOVA (not significant, p ⫽ 0.90). The control raw value obtained for the relative amount of I␬B␤
mRNA normalized to 18S rRNA (i.e., 2⌬Ct ⫻ 104) was 1.42 ⫾
0.25 (arbitrary units).
Chronic Treatment with SQV or Lactacystin Did Not
Lead to NF-␬B p65 Accumulation in the Cytoplasm of
Human Preadipocytes. According to the very similar profile in I␬B␤ protein increase between SQV and lactacystin
chronic treatment, we measured the NF-␬B p65 activity in
10-day-treated preadipocytes because this subunit contains
the transactivation domain necessary for gene transcription
(Hayden and Ghosh, 2004) and has been recently implicated
296
De Barros et al.
Fig. 4. Effect of chronic HIV-PIs or lactacystin treatment on I␬B␣ and I␬B␤ protein level in human preadipocytes. Stromal preadipocytes from human subcutaneous AT were cultured in an adipogenic medium with
vehicle (control) or in the presence of lactacystin
(Lacta.; 0.5 ␮M) or HIV-PIs: IDV (50 ␮M), RTV (10 ␮M),
SQV (10 ␮M), or NFV (5 ␮M). After 10 days of culture,
the cells were washed and maintained overnight in
basal medium with treatment before being scrapped in
a specific lysis buffer. Thirty-five to 50 ␮g of total proteins obtained after lysis were then analyzed by Western blot using a specific antibody. A, representative
autoradiographs of the I␬B␣ and the I␬B␤ blots from
four to seven independent experiments are shown. Statistically significant results are expressed as ratio of
the control values. NS, nonsignificant. ⴱ, p ⬍ 0.05 versus control. B, quantification of the corresponding
bands was performed with the NIH Image program and
normalized to the density of the total loaded proteins
per lane, obtained from the analysis of the Ponceau
staining. The control value of the densitometric ratio
was 0.095 ⫾ 0.019. The presented data are means ⫾
S.E.M. expressed as a percentage of the control. ⴱ, p ⬍
0.05 versus control. C, total RNAs were extracted from
cells and reverse-transcribed, and real-time RT-PCR
analysis was performed using specific primers for I␬B␤
cDNAs. The results were normalized to the levels of 18S
rRNA. Control value of the 2⌬Ct ⫻ 104 was 1.42 ⫾ 0.25.
The presented data are means ⫾ S.E.M. expressed as a
percentage of the control for five to six independent
experiments.
in adipocyte differentiation of the 3T3-L1 cell line (Berg et
al., 2004). Unfortunately, we were unable to detect NF-␬B
p65 activity in any of our conditions (control or treated preadipocytes) using the TransAM NF-␬B chemiluminescent
transcription factor assay kit (Active Motif Europe, Rixensart, Belgium), following the manufacturer’s instructions.
Assays were performed with either cellular or nuclear preadipocyte extracts, but signal corresponding to free active
NF-␬B p65 was always at the blank level (even with the
highest protein concentration required), whereas signal from
the positive control (Jurkat nuclear extract) of the kit was
detected. One possible explanation was a very low presence of
active NF-␬B p65 under basal conditions.
We decided to also perform NF-␬B p65 Western blot analysis of cytoplasmic and nuclear extracts from 10-day-treated
preadipocytes to investigate whether NF-␬B p65 translocation was affected by I␬B␤ protein accumulation induced by
SQV or lactacystin. As observed in Fig. 5A (left panel), NF-␬B
p65 subunit was undetectable (n ⫽ 3) or not analyzable (n ⫽
2) in nuclear extracts from control or treated human preadipocytes. This observation was in agreement with the negative results obtained with the TransAM assay kit. However,
NF-␬B p65 was clearly present in the cytoplasmic extracts,
but quantification of the corresponding bands did not reveal
any significant difference in protein level between control
versus treated preadipocytes (Fig. 5B). To validate the cytoplasmic to nuclear translocation of the NF-␬B p65 assay,
control experiments were performed using human preadipocytes stimulated with TNF-␣ (25 ng/ml) for 1 h. Indeed,
TNF-␣ is a standard activator of the NF-␬B pathway in a
variety of cells (Viatour et al., 2005). As observed in Fig. 5A
(right panel), cytoplasmic NF-␬B p65 was decreased with
TNF-␣ compared with controls (55% decrease, n ⫽ 3, p ⬍
0.05). Furthermore and although no NF-␬B p65 was detectable in the nucleus, a new band of ⬃35 kDa was clearly
visible under TNF-␣ stimulation. This band has already been
identified as a product of nuclear proteolysis of NF-␬B p65
(N-terminal fragment), termed NF-␬B p35, and observed in
the physiological turnover of the transcription factor (Cressman and Taub, 1994). This result indicates that NF-␬B p65
has been translocated to the nucleus, validating our technique.
Acute Treatment with SQV, Lactacystin, or BAY 117082 Reduced TNF-␣-Induced MMP-9 Expression in
Human Preadipocytes. Because one of the possible limitations of our experiments to clearly identify NF-␬B was that
cells were under basal conditions, we decided to investigate
the acute effect of SQV and lactacystin on MMP-9 expression
induced by TNF-␣. After the 3-day priming period, human
preadipocytes were placed in an adipogenic medium and
Proteasome Inhibition Reduces Human Adipogenesis
Fig. 5. Effect of chronic SQV or lactacystin (Lacta.) treatment on cytoplasmic and nuclear NF-␬B p65 protein level in human preadipocytes.
Stromal preadipocytes from human subcutaneous AT were cultured in an
adipogenic medium with vehicle (control) or in the presence of lactacystin
(0.5 ␮M) or SQV (10 ␮M). After 10 days of culture, the cells were washed
and maintained overnight in basal medium with treatment before being
scrapped and prepared using NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction reagents kit. Twenty to 45 ␮g of proteins from cytoplasmic (Cyto.) or
nuclear (Nucl.) extracts were then analyzed by Western blot using a
specific anti-NF-␬B p65 subunit antibody. A representative autoradiograph of five independent experiments is shown (A, left panel). Quantification of the corresponding bands in the cytoplasmic extracts was performed with the NIH Image program and normalized to the density of the
total loaded proteins per lane, obtained from analysis of Ponceau staining
(B).The data presented are means ⫾ S.E.M. expressed as a percentage of
the control. N/A, not analyzable. To validate the technique, human preadipocytes were acutely stimulated with TNF-␣ (25 ng/ml, 1 h), and Western blot analysis was performed. A representative autoradiograph of 3
independent experiments is shown (A, right).
treated for 24 h with TNF-␣ (25 ng/ml) alone or in cotreatment with SQV (10 ␮M), lactacystin (0.5 ␮M), or BAY 117082 (1 ␮M), an inhibitor of I␬B phosphorylation, which is
involved in the NF-␬B activation (Pierce et al., 1997). MMP-9
expression was analyzed by real-time RT-PCR.
As shown in Fig. 6, TNF-␣ treatment strongly enhanced
MMP-9 expression (10 times) in human preadipocytes. As
expected, cotreatment with BAY 11-7082, the inhibitor of the
NF-␬B pathway, reduced the MMP-9 expression induced by
TNF-␣ (27% decrease). Similar results were obtained with
SQV or lactacystin cotreatment, because MMP-9 expression
was decreased by 48 and 22%, respectively, implicating
NF-␬B as the link between proteasome activity and MMP-9
expression in our experiments. It should be noted that similar data were obtained when SQV was replaced by NFV (5
␮M) or when stimulation was performed with interleukin-1␤
(20 ng/ml) in place of TNF-␣ (data not shown). Compared
with TNF-␣, which has been shown to involve preferentially
I␬B␣, interleukin-1␤ is known to induce both I␬B␣ and I␬B␤
degradation when activating the NF-␬B pathway (Thompson
et al., 1995).
297
Fig. 6. Effect of acute SQV or lactacystin treatment on TNF-␣-induced
MMP-9 expression in human preadipocytes. Stromal preadipocytes were
isolated from human subcutaneous AT. After the 3-day priming period,
cells were placed in an adipogenic medium for 24 h, with or without
TNF-␣ (25 ng/ml) alone or in cotreatment with lactacystin (0.5 ␮M), SQV
(10 ␮M), or BAY 11-7082 (1 ␮M), an inhibitor of NF-␬B activation. Total
RNAs were then extracted from cells and reverse-transcribed, and realtime RT-PCR analysis was performed using specific primers for MMP-9
cDNAs. The results were normalized to the levels of 18S rRNA. The
presented data are means ⫾ S.E.M. expressed as a percentage of the
TNF-␣ effect alone for three to four independent experiments. ⴱ, p ⬍ 0.05
versus TNF-␣ alone; ⴱⴱ, p ⬍ 0.01 versus TNF-␣ alone.
Discussion
We previously reported that HIV-PIs reduced the differentiation of human preadipocytes in primary culture. This effect was attributed to the HIV-PI-induced decrease of MMP-9
expression and secretion since we showed that blocking of
MMP-9 activity by pharmacological agents led to the inhibition of human adipogenesis (Bourlier et al., 2005). In the
present work, we report that HIV-PIs decreased the activity
of the two major proteasome complexes, the 20S and the 26S
proteasomes, in human preadipocytes. Interestingly, we
showed that lactacystin, a proteasome inhibitor, mimicked
the effects of HIV-PIs in reducing both human adipogenesis
and MMP-9 expression and secretion. Finally, some of our
results suggested that perturbations of the NF-␬B pathway
are the link between the inhibition of proteasomal activity
and the decrease in MMP-9 expression. Indeed, even if we
were unable to detect NF-␬B p65 signal changes under basal
conditions, we did observe that chronic treatments (10 days)
with HIV-PIs (SQV and NFV) or lactacystin induced cellular
I␬B␤ accumulation. Furthermore, SQV or lactacystin reduced the expression of MMP-9 induced by acute treatment
(24 h) with TNF-␣, a classic activator of NF-␬B.
The inhibition of proteasomal activity and, more precisely,
proteasome chymotrypsin-like activity by HIV-PIs was initially reported few years ago by André et al., (1998) and
linked to a decrease of antigen presentation and T-cell response in infected mice. Here we show, for the first time, that
proteasomes from human adipocyte precursors, which are
major cell targets of HIV-PIs involved in the lipodystrophic
syndrome, are also directly inhibited by several HIV-PIs at
therapeutic concentrations. These data agree with recent
observations made with the murine the 3T3-L1 cell line
model of preadipocytes (Parker et al., 2005). As have other
investigators, we found that the 20S proteasome was more
298
De Barros et al.
sensitive to HIV-PIs than the 26S proteasome (Gaedicke et
al., 2002; Pajonk et al., 2002). One reason may be the different tertiary structure between the 20S and 26S proteasomes,
leading to better accessibility of the inhibitors to the proteolytic sites of the 20S proteasome (Piccinini et al., 2005,
Voorhees and Orlowski, 2006). We found that all HIV-PIs did
not have the same potency in inhibiting the chymotrypsinlike proteasome activity in our model. Indeed SQV and NFV
were the most effective, followed by RTV, whereas IDV was
without effect. Similar observations were made in the rare
publications comparing the effect of HIV-PIs on human proteasomal activity measured on purified proteasome from
erythrocytes (Piccinini et al., 2002, 2005; Parker et al., 2005).
It has to be noted that even if all HIV-PIs were weaker
inhibitors of proteasomal activity than the specific lactacystin inhibitors in our in vitro assay, SQV and NFV (not RTV
nor IDV), can accumulate greatly into cells (20 to ⬎80 times)
(Jones et al., 2001; Janneh et al., 2003). Thus, it can be
expected that intracellular concentrations of these HIV-PIs
are much higher that the ones tested here.
Interestingly, SQV and NFV were the HIV-PIs with the
major effect on the differentiation of human preadipocytes in
our previous work (Bourlier et al., 2005). We thus investigated whether a blockade of proteasomal activity can affect
human adipogenesis. We showed that chronic lactacystin
treatment of preadipocytes in an adipogenic medium led to a
decrease of the various differentiation markers studied (triglyceride content and aP2 and HSL expression). Although
some authors have already implicated the proteasome in
adipogenesis, their observations were on a different model,
the murine 3T3-L1 cell line, using more or less specific proteasome inhibitors (calpain/proteasome), and contradictory
results were obtained (Patel and Lane, 1999; Nguyen et al.,
2000; Prince et al., 2002). As expected and in association with
the reduction of adipogenesis, we found that lactacystin
treatment, as that with HIV-PIs, selectively decreased
MMP-9 expression and activity released into the culture
medium by preadipocytes. The reduction of MMP-9 activity
per se may be responsible for the antiadipogenic effect of
lactacystin since we have previously demonstrated that
treatment of human preadipocytes with pharmacological inhibitors of MMP-9 activity decreased their differentiation
(Bourlier et al., 2005). However we cannot exclude any other
additional phenomenon implicated in adipogenesis that
might be disturbed by proteasome inhibitor treatment.
Reduction of MMP-9 secretion with proteasome inhibitors
has previously been reported for distinct cellular types in
vitro involving NF-␬B pathway perturbations (Ikebe et al.,
1998; Kolev et al., 2003; Lu and Wahl, 2005). We were not
able to find any modification in the activity and repartition of
NF-␬B p65 within the cytosol and the nucleus in association
with chronic SQV or lactacystin treatment in our model,
using two different techniques (enzyme-linked immunosorbent assay-based TransAM NF-␬B assay kit and Western
blot). This may be partly explained by the fact that in the
resting conditions that we studied, the part of active NF-␬B
p65 was too weak to be detected. This hypothesis is in agreement with one of the rare published reports on the subject
showing that NF-␬B p65 is mostly cytosolic in unstimulated
human preadipocytes (Chung et al., 2005). Nevertheless, we
showed that the same chronic treatment with NFV, SQV, or
lactacystin (but not with IDV nor RTV) led to intracellular
accumulation of I␬B␤ protein. In contrast, none of the HIVPIs or lactacystin was effective in modifying the I␬B␣ protein
level. These results agree with the presumed roles of these
two members of the same family because 1) I␬B␣ has been
correlated to transient activation of NF-␬B and I␬B␤ to persistent activation that yields a more permanent change
(Thompson et al., 1995) and 2) I␬B␤, but not I␬B␣, has been
shown to function as a classic cytoplasmic inhibitor of NF-␬B
dimers in resting cells (Malek et al., 2001). Because both
NF-␬B inhibitors have been shown to be substrates of the
proteasome (Weil et al., 1997) and because no parallel increase in I␬B␤ mRNA expression was observed under our
conditions, the increase in I␬B␤ protein most probably reflects the reduction of its degradation resulting from proteasomal activity inhibition induced by the treatments. Furthermore, a different set of experiments conducted with the
classic NF-␬B pathway activator TNF-␣ (Viatour et al., 2005)
showed that MMP-9 expression was up-regulated within 24 h
of treatment in our model, but also that this up-regulation
could be reduced either by SQV, lactacystin, or the NF-␬B
inhibitor, Bay 11-7082. Overall, according to these data on
resting and TNF-␣-stimulated human preadipocytes, we can
easily imagine that the decrease in MMP-9 expression observed with lactacystin and some HIV-PIs (SQV and NFV)
arose in part from perturbations in the NF-␬B pathway.
To our knowledge, this is the first investigation showing
that HIV-PIs are potent inhibitors of human preadipocyte
proteasomal activity and that chronic low-level proteasome
inhibition reduces human adipogenesis. Disorders of the
NF-␬B pathway, resulting from proteasome inhibition may
partly explain the decrease in MMP-9 expression and secretion potentially responsible for adipogenesis reduction (Bourlier et al., 2005) and observed with both lactacystin and
HIV-PI treatment. Our in vitro results suggest that HIV-PIinduced perturbation of preadipocyte to adipocyte balance
noted in clinical studies (Bastard et al., 2002; Lloreta et al.,
2002) may also target preadipocyte proteasome function. Interestingly, a role for the proteasome in more metabolic aspects of the HIV-related lipodystrophic syndrome has previously been reported. Indeed, apolipoprotein B and sterol
regulatory element binding protein degradation have been
shown to be altered by HIV-PI-related proteasome inhibition
and involved in lipid metabolism disorders (Liang et al.,
2001; Hui, 2003). More recently, Parker et al. (2005) has
linked the reduction of proteasomal activity induced by HIVPIs and the dyslipidemia to endoplasmic reticulum stress.
Finally, attention is now being focused on HIV-PI-induced
proteasomal alterations and disturbances of glucose metabolism because proteasome dysfunction and/or endoplasmic
reticulum stress has been closely related to insulin resistance
(Ozcan et al., 2004; Rome et al., 2004). All of this information
will help to better understand the etiology of the lipodystrophic syndrome but may also be of great interest for the recent
clinical use of proteasome inhibitors in cancer therapy (i.e.,
bortezomib treatment for multiple myeloma) and possible
effects on adipose tissue development.
Acknowledgments
We thank Drs. Bénarous, Belhaouri, and Jougla for help in obtaining the adipose tissue samples. We also thank Dr. Sorisky for
critical review of this article.
Proteasome Inhibition Reduces Human Adipogenesis
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Address correspondence to: Dr. Virginie Bourlier, INSERM U586, 37
Allées Jules Guesde, 31000 Toulouse, France. E-mail: [email protected]
Discussion de la publication 2
Dans cette étude, nous avons voulu déterminer les mécanismes impliqués dans la
diminution de l’expression de MMP-9 par les IPs-VIH. Nous avons tout d’abord évalué
l’effet des IPs-VIH sur l’activité du protéasome des cellules de la FSV du TA humain.
L’activité chymotrypsine des deux formes majeures du protéasome, le protéasome 20S qui
constitue la partie multicatalytique de tous les protéasomes et le protéasome 26S constitué du
protéasome 20S coiffé par deux sous-unités régulatrices 19S a été déterminée sur des extraits
protéiques de cellules de la FSV non différenciées. Nous avons observé que le SQV, le NFV
et le RTV diminuent l’activité du protéasome 20S et dans une moindre mesure celle du
protéasome 26S. Cette différence de sensibilité entre les activités des protéasomes 20S et le
26S a déjà été rapportée (84, 200) et pourrait s’expliquer par un problème d’accessibilité des
IPs-VIH aux sites catalytiques situés sur le protéasome 20S quand celui-ci est coiffé par les
sous-unités 19S c’est-à-dire sous une forme 26S (208, 279). Il est important de préciser que
l’inhibition de l’activité protéasomique observée par les IPs-VIH est très inférieure à celle
observée avec un inhibiteur spécifique du protéasome, la lactacystine. De plus, les
concentrations des IPs-VIH effectives sur l’inhibition du protéasome d’extraits protéiques des
cellules de la FSV sont plus élevées que celles requises pour l’inhibition de la différenciation
adipocytaire in vitro. Toutefois, les IPs-VIH tels que le SQV et le NFV ont été décrits comme
s’accumulant dans le cytoplasme cellulaire conduisant à une augmentation de la
concentration intracellulaire de 20 à 80 fois (111, 117, 273, 274).
Afin de déterminer si l’inhibition du protéasome affecte le processus de
différenciation adipocytaire, les cellules de la FSV du TA humain ont été traitées avec la
lactacystine. Après 10 jours de traitement, nous avons observé une diminution de
l’adipogenèse associée à une baisse de la sécrétion et de l’expression de MMP-9, sans atteinte
de MMP-2. Récemment, en accord avec nos résultats, les travaux de Li et al. ont montré que
la lactacystine inhibe également la différenciation des préadipocytes murins de la lignée 3T3L1 (146). L’ensemble de ces données suggère que le protéasome joue un rôle majeur dans
l’adipogenèse des cellules de la FSV ainsi que dans le contrôle de l’expression génique de
MMP-9. Il est tentant de spéculer que l’un des mécanismes impliqués dans l’effet antiadipogénique de la lactacystine est lié à une inhibition de l’activité de MMP-9. Toutefois,
d’autres voies peuvent être impliquées. Ainsi, il a été décrit que l’inhibition du protéasome
des préadipocytes murins entraîne une augmentation de CHOP-10, un facteur de transcription
anti-adipogénique (146). Les mécanismes impliqués dans cet effet sont encore inconnus.
63
Nous avons ensuite recherché des éventuelles perturbations de la voie NF-κB. Dans
un premier temps, nous nous sommes intéressés à IκB et avons observé, par des analyses de
western blot, une augmentation de la protéine IκBβ dans les préadipocytes humains traités
avec le SQV et le NFV pendant 10 jours suggérant une diminution de sa dégradation via le
protéasome. Dans un second temps, nous avons souhaité mettre en évidence un effet direct
des IPs-VIH sur le facteur de transcription NF-κB. Cependant, malgré plusieurs tentatives,
aucun effet direct des IPs-VIH et de la lactacystine sur l’activité et la localisation cellulaire
(cytoplasmique ou nucléaire) de NF-κB n’a pu être mis en évidence. Ces résultats pourraient
s’expliquer par le fait que nous avons travaillé dans des conditions basales c’est-à-dire non
stimulées. Nous avons donc stimulé les cellules de la FSV avec un activateur connu de la voie
NF-κB, le TNF-α. Comme attendu, suite à un traitement aigu avec le TNF- α, l’expression de
MMP-9 est fortement augmentée et lors d’un co-traitement avec la lactacystine et les IPs-VIH
tels que le SQV et le NFV, cette réponse est diminuée. Si l’on considère ces différents
résultats sur les préadipocytes humains en conditions basales et stimulées, on peut penser que
la chute de l’expression de MMP-9 induite par les IPs-VIH et la lactacystine est en partie due
à des perturbations de la voie NF-κB.
Nos résultats obtenus in vitro suggèrent donc que les IPs-VIH participent à l’atrophie
du TA en inhibant l’activité du protéasome des cellules de la FSV du TA humain. De manière
intéressante, l’inhibition du protéasome par les IPs-VIH a également été associée aux
complications métaboliques décrites dans les lipoatrophies induites par les IPs-VIH telles que
l’insulino-résistance et les désordres dans le métabolisme lipidique. Ainsi, compte tenu de
l’ensemble de ces données, il est nécessaire de rester vigilant quant aux effets indésirables
potentiels des inhibiteurs du protéasome dont l’un d’entre eux, le bortezomib est à ce jour
utilisé pour le traitement du cancer.
En résumé de cette première partie, nos résultats montrent que les MMPs et
particulièrement la MMP-9 est un acteur majeur dans la différenciation adipocytaire des
cellules de la FSV du TA humain. De plus, MMP-9 semble être une cible potentielle des IPsVIH. En effet, l’expression génique et la sécrétion de cette MMP est diminuée par les IPsVIH. Les mécanismes impliqués dans cet effet ont été déterminés et passent en partie par une
inhibition de l’activité protéasomique des cellules de la FSV par les IPs-VIH, entraînant des
perturbations de la voie NF-κB, facteur de transcription impliqué dans l’expression génique
de MMP-9. La MMP-9 joue donc un rôle majeur dans le processus de différenciation
adipocytaire chez l’homme.
64
En perspective à ce travail, les cibles moléculaires de MMP-9 responsables de l’effet
modulateur de la différenciation adipocytaire restent à définir. Nos études préliminaires ainsi
que les perspectives envisagées dans cet axe vont être brièvement présentées dans le
paragraphe qui suit.
D) Etudes préliminaires et perspectives sur l’étude des cibles moléculaires de
MMP-9
Comme nous l’avons évoqué l’effet des MMPs s’exerce via leurs actions sur les
composants de la MEC mais aussi via leurs actions sur des facteurs solubles activables par
ces MMPs et/ou des facteurs piégés dans la MEC.
Afin de déterminer si l’action de MMP-9 passe par la dégradation des composants
matriciels, nous avons d’abord évalué l’influence de différents supports matriciels tels que
des supports de collagène, fibronectine et gélatine, connus pour être des substrats de la MMP9 (57, 254), sur l’adipogenèse des cellules de la FSV du TA humain. Pour cela, des cellules
de la FSV du TA ont été ensemencées (60 000 cellules/cm2) sur ces différents supports et
mises en conditions adipogéniques. Après 10 jours de culture, le contenu intracellulaire en
TGs a été quantifié. Comme on peut l’observer dans la figure 16, aucun des supports
matriciels testés n’affecte l’accumulation lipidique des préadipocytes humains, un résultat ne
suggérant aucune altération de leur adipogenèse.
Ces données sont en accord avec d’autres travaux soulignant l’absence d’effet d’un
support de collagène (191) et de fibronectine (95) sur l’adipogenèse des cellules de la FSV de
TA humains et porcins, respectivement. A l’inverse, d’autres travaux ont rapporté un effet
anti-différenciant d’un support de fibronectine sur des préadipocytes d’origine murine et
humaine (98, 191, 260). Les différences observées dans ces études sont surprenantes et
pourraient s’expliquer par le modèle cellulaire et/ou les conditions de culture utilisées. On
note qu’un support de laminine décrit pour activer l’adipogenèse des préadipocytes porcins
(95) a également été testé mais ce support n’a pas permis l’adhérence des cellules de la FSV
du TA humain. Ainsi, ces résultats ne révélant aucun effet du support matriciel sur
l’adipogenèse, il est tentant de suggérer que l’activité de MMP-9 n’est pas due à la
dégradation de la MEC. Il faut cependant rester prudent car il est fort possible que l’action de
MMP-9 passe par la dégradation d’une MEC sécrétée par la cellule, elle-même, et non pas par
celle déposée au préalable sur un support. De plus, il est possible que le modèle de culture en
2 dimensions utilisé pour nos cellules ne permette pas d’observer un effet du support
65
Contenu en triglycéride
(mg/mg d'ADN)
125
100
75
50
25
G
él
at
in
e
tin
e
on
ec
Fi
br
gè
ne
lla
Co
Pl
as
tiq
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0
Figure 16 : Influence d’un substrat matriciel sur la différenciation adipocytaire des
cellules de la FSV du tissu adipeux humain
Les cellules de la FSV sont cultivées sur un support plastique ou coaté avec du collagène
de type IV, de la fibronectine, ou de la gélatine en conditions adipogéniques. A 10 jours
de différenciation, le contenu intracellulaire en TGs normalisé à la quantité d’ADN a été
évalué pour 4 expériences indépendantes. Les résultats sont exprimés en % du contrôle sur
support plastique.
matriciel. L’influence de différents supports matriciels dans un modèle de culture en 3
dimensions est à envisager. En effet, une étude récente montre que des effets de la MT1MMP ne sont révélés que sur un modèle de culture en 3 dimensions (44).
En parallèle, il serait très intéressant de caractériser les principaux composants
matriciels sécrétés par les cellules de la FSV du TA humain en cours de différenciation
traitées ou non avec un inhibiteur de MMP-9. Une telle étude permettrait non seulement de
déterminer l’évolution de la MEC au cours de l’adipogenèse chez l’homme mais aussi de
définir les effets de cette métalloprotéase sur les composants matriciels. De plus, MMP-9
étant connu pour générer des fragments matriciels biologiquement actifs tels que
l’endostatine (77) et certains peptides dérivés de la fibronectine (82), un traitement des
cellules de la FSV du TA humain par des fragments matriciels pourraient être envisagé. En
effet, les travaux de Kamiya et al. montrent qu’un fragment issu de la dégradation de la
fibronectine stimule la différenciation des préadipocytes de la lignée ST-13 (119).
Enfin, la recherche des cibles non matricielles susceptibles de moduler et réguler le
comportement cellulaire pourrait également être envisagée. De nombreuses protéines
cellulaires de surface, péri-cellulaires ou circulantes peuvent être clivées par les MMPs
régulant ainsi leur biodisponibilité. Cependant, peu de données existent chez l’homme. Il
nous semblerait donc intéressant de caractériser notamment la production des facteurs de
croissance et/ou cytokines par les cellules de la FSV du TA humain au cours de la
différenciation. Cette approche pourrait être réalisée grâce à l'utilisation de la technique des
immunoarrays dédiés aux « cytokines » qui permet d’identifier et de quantifier, dans un
milieu de culture ou dans un lysat cellulaire, des protéines différentes décrites comme étant
des cibles de MMP-9 dans d’autres modèles cellulaires et dont les effets sur la différenciation
cellulaire ont été également mis en évidence telles que les TGFs, TNFs, ILs, IGF-I, IGFBPs.
En parallèle, l’influence d’un traitement avec un inhibiteur de MMP-9 pourra être évaluée et
ce, afin de mettre en évidence les facteurs de croissance et/ou cytokines dont le taux
extracellulaire est modifié par la présence de MMP-9 soit par leur clivage direct soit par leur
libération de la MEC.
Pour conclure, l’étude des cibles moléculaires de MMP-9 constitue donc un axe de
recherche dont le développement pourrait permettre de mieux comprendre les effets de la
MMP-9. Cependant, les cellules de la FSV étant une population cellulaire hétérogène, on peut
se demander quels types cellulaires sont les cibles de MMP-9. Récemment, des travaux de
notre groupe ont permis d’isoler et de caractériser la population cellulaire contenant les
66
précurseurs adipocytaires (241). Dans la suite de ce travail, nous avons déterminé si l’effet de
la MMP-9 est retrouvé dans ces précurseurs adipocytaires spécifiquement isolés.
67
II- Implication des MMPs dans la différenciation des cellules progénitrices
CD34+/CD31- isolées de la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux humain
La caractérisation et l’isolement de la population cellulaire contenant les précurseurs
adipocytaires a été possible grâce au développement d’une technique d’isolement des
différentes populations cellulaires de la FSV qui se fonde sur l’utilisation de nanoparticules
magnétiques couplées à des anticorps dirigés spécifiquement contre les marqueurs de surface
CD34 (marqueur des cellules souches hématopoïétiques et des cellules endothéliales
capillaires), CD31 (marqueur des cellules endothéliales et de la lignée hématopoïétique) et
CD14 (marqueur des monocytes/macrophages) (figure 17). La fraction cellulaire
CD34+/CD31- est la seule à exprimer les marqueurs de différenciation spécifiques des
adipocytes et à acquérir les activités métaboliques adipocytaires, en réponse aux conditions
adipogéniques (241).
Notre groupe a également mis en évidence que ces cellules CD34+/CD31-, cultivées
en condition de culture endothéliales, changent de morphologie et d’organisation et
expriment des marqueurs spécifiques des cellules endothéliales tels que le CD31 et le facteur
de Von Willebrand (vWF). De plus, leur injection dans la patte ischémiée d’une souris
athymique entraîne une augmentation du flux sanguin et de la densité capillaire au niveau du
membre ischémié (173). D’autres laboratoires ont rapporté des capacités pro-angiogéniques
similaires des cellules issues de la FSV du TA (211, 221, 291). Par conséquent, la fraction
cellulaire CD34+/CD31- pourrait constituer un pool local de cellules progénitrices/souches
qui serait impliqué dans la formation non seulement des nouveaux adipocytes mais aussi des
capillaires accompagnant le développement de la masse grasse.
Les mécanismes impliqués dans le contrôle du devenir des cellules progénitrices
CD34+/CD31- restent à déterminer. Il a été rapporté que le microenvironnement pouvait
réguler le devenir des cellules souches hématopoïétiques et mésenchymateuses (127, 229). En
effet, de nombreux facteurs solubles (cytokines et facteurs de croissance) ainsi que la
composition et l’élasticité de la MEC contrôlent le devenir des cellules souches (14, 69, 71,
172). De plus, une récente publication indique que l’engagement des cellules souches
mésenchymateuses vers le lignage adipogénique et ostéogénique est régulé par la densité
cellulaire d’ensemencement qui altère la forme de la cellule et module les interactions
cellulaires (167).
Dans la deuxième partie de ce travail de thèse, nous avons d’abord vérifié et confirmé
l’implication des MMPs dans la différenciation adipocytaire des cellules CD34+/CD3168
Tissu adipeux
humain
Digestion à la
collagénase
Adipocytes
matures
Fraction stroma-vasculaire
(FSV)
Billes
anti-CD34
CD34+
CD34Billes
anti-CD14
Billes
anti-CD31
Cellules endothéliales Cellules progénitices
CD34+/CD31+
CD34+/CD31-
Macrophages
CD34-/CD14+
CD34-/CD14-
Figure 17 : Technique d’isolement des différentes populations de la
FSV du tissu adipeux humain
spécifiquement isolées. Suite à cet ensemble de résultats sur les cellules CD34+/CD31-, nous
nous sommes ensuite demandés si l’effet anti-adipogénique observé avec des inhibiteurs de
l’activité et/ou de l’expression des MMPs, particulièrement MMP-9, modulait également les
autres capacités de ces cellules dont la capacité angiogénique. Ainsi, afin d’étudier les
mécanismes qui contrôlent le devenir des cellules CD34+/CD31- nous avons mis au point
une condition de culture permettant l’étude simultanée de l’adipogenèse et de l’angiogenèse.
A) Influence d’un inhibiteur des MMPs sur la différenciation adipocytaire des
cellules CD34+/CD31Nous avons isolé puis cultivé les cellules CD34+/CD31- dans des conditions
adipogéniques similaires à celles décrites dans la première partie de ce travail. L’activité
gélatinase des MMP-2 et -9 relarguée dans le milieu de culture au cours de la différenciation
a tout d’abord été évaluée par la technique de zymographie à la gélatine comme décrite dans
les précédentes publications. Comme le montre la figure 18, la sécrétion des MMP-2 et -9 par
les cellules CD34+/CD31- augmente au cours de la différenciation adipocytaire des cellules
CD34+/CD31- isolées. Ces données indiquent que la production de MMP-2 et -9 est
strictement modulée par la différenciation adipocytaire et ne peut être attribuée à la
modulation de la présence ou de l’état d’activation des autres types cellulaires (macrophages,
cellules endothéliales) de la FSV.
L’implication des MMPs dans la différenciation adipocytaire des cellules
CD34+/CD31- a ensuite été déterminée. Pour cela et de manière similaire à la FSV, les
cellules CD34+/CD31- ont été traitées avec un inhibiteur des MMPs à large spectre, le
batimastat. Après 10 jours de traitement, une diminution de l’accumulation des gouttelettes
lipidiques a été observée et confirmée par le dosage du contenu intracellulaire en TGs (figure
19). Ces données sont en accord avec celles obtenues sur les cellules de la FSV. Elles
suggèrent un rôle majeur des MMPs dans le processus de différenciation adipocytaire des
cellules progénitrices CD34+/CD31- isolées. Cependant, une étude complète serait nécessaire
afin de préciser les effets du batimastat sur l’expression de gènes marqueurs de la
différenciation adipocytaire (gènes précoces tels qu’aP2 et PPARγ et gènes tardifs tels que la
LHS et FAS).
69
J0
J10
Standard
MMP-9
MMP-2
Figure 18 : Sécrétion des MMP-2 et -9 au cours de la différenciation adipocytaire des
cellules progénitrices CD34+/CD31- isolées
Après avoir été isolées de la FSV, les cellules CD34+/CD31- sont cultivées en conditions
adipogéniques. L’activité gélatinase des MMP-2 et -9 relarguée dans le milieu de culture à
0 (J0) et 10 (J10) jours de différenciation est évaluée par zymographie à la gélatine.
L’utilisation d’un standard MMPs nous a permis de détecter les bandes spécifiques de
MMP-2 et -9 actives. Le gel présenté est représentatif de 2 expériences indépendantes.
B
A
Contrôle
Contenu en triglycéride
(en % du controle)
100
75
*
50
25
0
Contrôle
Batimastat
(5 µM)
Batimastat
(5 µM)
Figure 19 : Influence du batimastat sur la différenciation adipocytaire des cellules
progénitrices CD34+/CD31Après avoir été isolées de la FSV, les cellules CD34+/CD31- sont cultivées en conditions
adipogéniques traitées ou non avec le batimastat pendant 10 jours. Une photographie
représentative de 4 expériences indépendantes est présentée ainsi que la quantification du
contenu intracellulaire en TGs normalisé à la quantité d’ADN. Les résultats sont exprimés en
% du contrôle. * P<0.05 vs contrôle
Des travaux de notre groupe ayant démontré que les cellules progénitrices
CD34+/CD31- sont également capables d’angiogenèse dans des conditions de culture
endothéliales (173), il nous a semblé intéressant de déterminer si l’effet anti-adipogénique
observé avec le batimastat pouvait correspondre à une réorientation des cellules
CD34+/CD31- vers le lignage endothélial et/ou à une simple inhibition de la différenciation
adipocytaire. Ainsi, afin de déterminer les mécanismes impliqués dans le devenir des cellules
progénitrices CD34+/CD31-, nous avons mis au point une condition de culture permettant
l’étude simultanée des capacités adipogéniques et angiogéniques.
B) Mise au point d’une condition de culture permettant simultanément les
capacités adipogéniques et angiogéniques des cellules CD34+/CD31-
B.1) Etude de l’accumulation intracellulaire des triglycérides et de la formation d’un réseau
cellulaire positif pour le CD31 par les cellules CD34+/CD31- cultivées dans un milieu mixte
Des cellules progénitrices CD34+/CD31- ont été ensemencées (120 000 cellules/cm2)
dans un milieu de type ECBM (endothelial cell basal medium) supplémenté avec 10% de
sérum de veau foetal et dans des puits coatés avec de la fibronectine (5 µg/cm2) afin de
favoriser l’angiogenèse. Après 24 heures, les cellules ont été mises en présence d’un milieu
adipogénique, endothélial ou d’un milieu mixte correspondant à une combinaison des milieux
adipogéniques et endothéliaux. La composition de ces trois milieux est présentée dans le
tableau 11. Notons que dans cette étude, étant donné les effets apoptotiques de la ciglitazone
sur les cellules endothéliales (165), cet agoniste PPARγ a été remplacé par la rosiglitazone
décrite à l’inverse comme pro-angiogénique (209, 282).
Après 10 jours de culture, les cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu
adipogénique et mixte montrent un phénotype adipocytaire caractérisé par l’accumulation de
gouttelettes lipidiques (figure 20A). Comme on peut le voir sur la figure 20B, une forte
augmentation du contenu intracellulaire en TG est observée au cours de la différenciation des
cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu adipogénique et mixte. Cependant, aucune
différence dans le contenu intracellulaire en TG n’est observée si l’on compare le milieu
adipogénique versus le milieu mixte. En effet, le pourcentage de cellules différenciées en
adipocytes est similaire dans les milieux adipogénique et mixte (66.4 ± 4.4 % et 70.1 ± 1.5 %,
respectivement). En revanche, après 10 jours de culture en milieu endothélial, les cellules
CD34+/CD31- ne stockent pas de lipides.
70
A
J0
C
50
**
40
30
*
20
10
0
Endothéliale
J0
Adipo
Endo
J10
Mixte
Longueur du réseau positif
pour le CD31 (U.A.)
Contenu en triglycérides
(mg/mg d'ADN)
B
Adipogénique
Mixte
150
**
125
100
£
**
75
50
25
0
J0
Adipo
Endo
Mixte
J10
Figure 20 : Détermination de l’accumulation des TGs et de la formation d’un réseau cellulaire
positif pour le CD31 des cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu adipogénique, endothélial ou
mixte
Les cellules CD34+/CD31- sont ensemencées à 120 000 cellules/cm2 et cultivées en milieu
adipogénique (Adipo), endothélial (Endo) ou mixte. Après 10 jours, les cellules sont fixées et
marquées au Red Oil, au Hoechst (un colorant nucléaire) et avec un anticorps dirigé contre le CD31.
Des photographies représentatives de 4 à 11 expériences indépendantes sont présentées. (A). Le
contenu intracellulaire en TGs (B) ainsi que la longueur du réseau cellulaire pour le CD31 (C) ont été
évalués. Les valeurs sont exprimées en mg/mg d’ADN pour le contenu en TGs et la longueur du
réseau cellulaire pour le CD31 en unité arbitraires normalisées à la quantité d’ADN. ** P<0.001 et *
P<0.01 vs J0 et £ P<0.001 vs Endo
Tableau 11: Composition des milieux adipogénique, endothélial et mixte utilisés
Milieu adipogénique
Milieu endothélial
Milieu mixte
ECBM
ECGM
ECGM
Insuline (66 nmol/L)
VEGF (0.5 ng/mL)
Insuline (66 nmol/L)
T3 (1 nmol/L)
IGF-1 (20 ng/mL)
T3 (1 nmol/L)
Cortisol (100 nmol/L)
Transferrine (10 µg/mL)
Transferrine (10 µg/mL)
Rosiglitazone (3 µmol/L)
Rosiglitazone (3 µmol/L)
VEGF (0.5 ng/mL)
IGF-1 (20 ng/mL)
(ECBM: endothelial cell basal medium, ECGM: endothelial cell growth medium constitué d’un milieu de type
ECBM supplémenté avec des facteurs de croissance tels que l’EGF (0.1 ng/ml), le bFGF (1 ng/ml) et
l’hydrocortisone (1 µg/ml)) et 2 % de sérum de veau foetal)
En parallèle, des analyses d’immnunohistochimie ont permis d’évaluer l’apparition
d’un marquage spécifique pour le CD31, un marqueur des cellules endothéliales (pour les
méthodes voir (173)). Comme on peut l’observer dans les figures 20A et C, la culture des
cellules CD34+/CD31- en milieu endothélial et mixte entraîne la formation d’un réseau
cellulaire positif pour le CD31. Cependant, en milieu mixte, la longueur du réseau cellulaire
positif pour le CD31 est plus faible qu’en milieu endothélial suggérant une perte du potentiel
angiogénique en milieu mixte. En effet, le pourcentage de cellules positives pour le CD31 est
plus faible en milieu mixte comparé au milieu endothélial (14.4 ± 1.1 % et 19.1 ± 2.4 % en
milieu mixte et endothélial, respectivement, P<0.05, milieu endothélial vs mixte). En
revanche, la culture des cellules CD34+/CD31- en milieu adipogénique n’entraîne pas la
formation d’un réseau positif pour le CD31. Il est important de préciser que le milieu mixte
comme le milieu endothélial est constitué d’un milieu de base de type ECGM qui contient
des facteurs de croissance et 2% de sérum de veau foetal. Ainsi, les cellules CD34+/CD31montrent une prolifération en milieu mixte et endothélial mais pas en milieu adipogénique.
Cette donnée est mise en évidence dans les photographies présentées dans la figure 20A
grâce au marquage des noyaux par le Hoechst, un colorant nucléaire, et confirmée par la
quantification du contenu cellulaire en ADN. En effet, au cours de la culture, une forte
augmentation (3,5 fois) du contenu en ADN dans les milieux endothélial (données
personnelles) et mixte (figure 22A) est observée. Toutefois, notons qu’aucune différence dans
le contenu en TGs, lorsqu’il est normalisé à la quantité d’ADN, n’a été observé lors de la
culture des cellules CD34+/CD31- dans un milieu adipogénique constitué d’une base ECBM
71
ou d’une base ECGM, suggérant que la prolifération de ces cellules dans le milieu ECGM ne
modifie pas le niveau de différenciation adipocytaire.
L’ensemble de ces résultats montre que les cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu
mixte peuvent à la fois accumuler des lipides et former un réseau cellulaire positif pour le
CD31.
B.2) Etude de l’expression en ARNm des marqueurs adipocytaires et endothéliaux par les
cellules CD34+/CD31- cultivées dans un milieu mixte
Afin de confirmer les capacités adipogéniques et angiogéniques des cellules
CD34+/CD31- en milieu mixte, nous avons voulu évaluer l’expression en ARNm des
marqueurs adipocytaires et endothéliaux par des analyses de RT-PCR. L’expression de ces
marqueurs a été tout d’abord déterminée dans des cellules CD34+/CD31-, des adipocytes
matures et des cellules endothéliales capillaires CD34+/CD31+ fraîchement isolées. Les
résultats présentés dans le tableau 12, montrent comme attendu que les transcrits pour les
marqueurs adipocytaires sont détectés majoritairement dans les adipocytes matures et les
transcrits pour les marqueurs endothéliaux sont détectés majoritairement dans les cellules
endothéliales CD34+/CD31+. On peut cependant noter l’expression non négligeable d’aP2 et
de PPARγ dans les cellules endothéliales capillaires CD34+/CD31+. Concernant PPARγ, ces
résultats sont en accord avec d’autres observations (18). En revanche, aucune autre étude ne
s’est intéressée à l’expression d’aP2 dans les cellules endothéliales. L’ensemble de ces
résultats suggèrent donc que les cellules CD34+/CD31- fraîchement isolées expriment peu les
marqueurs adipocytaires et endothéliaux comparés aux adipocytes matures et aux cellules
endothéliales CD34+/CD31+, respectivement.
L’expression de ces différents marqueurs adipocytaires et endothéliaux dans les
cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu adipogénique, endothélial et mixte pendant 10
jours a ensuite été déterminée. Comme le montre la figure 21A, en milieu mixte, une
augmentation significative des taux de transcrits codant pour les marqueurs adipocytaires,
excepté PPARγ, est observée par rapport au milieu endothélial. De plus, une augmentation en
ARNm de tous les marqueurs endothéliaux est observée dans les cellules CD34+/CD31- en
milieu mixte par rapport au milieu adipogénique (figure 21B). L’ensemble de ces résultats
montre que la culture des cellules CD34+/CD31- en milieu mixte pendant 10 jours induit
l’expression des ARNm codants pour des marqueurs adipocytaires d’une part et des
marqueurs endothéliaux d’autre part.
72
A
B
300
Adipo
Mixte
***
200
***
*
100
0
aP2
PPARγ
LHS
FAS
Marqueurs endothéliaux
(en % du milieu endothélial)
Marqueurs adipocytaires
(en % du milieu adipogénique)
Endo
Mixte
100
***
75
50
*
***
*
25
0
CD31
vWF VE-cadherin VEGF-R1
Figure 21 : Détermination de l’expression en ARNm des marqueurs adipocytaires et
endothéliaux des cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu adipogénique, endothélial ou mixte
Les cellules CD34+/CD31- sont ensemencées à 120 000 cellules/cm2 et cultivées en milieu
adipogénique (Adipo), endothélial (Endo) ou mixte (mixte). Après 10 jours, l’expression en ARNm
des marqueurs adipocytaires (aP2, PPARγ, LHS et FAS) (A) et des marqueurs endothéliaux (CD31,
vWF, VE-cadherin et VEGF-R1) (B) a été déterminée par des analyses de RT-PCR. Les résultats
sont exprimés en pourcentage du milieu adipogénique et endothélial pour les marqueurs
adipocytaires et endothéliaux respectivement pour 3 à 6 expériences indépendantes. *** P<0.001, **
P<0.01 et P<0,05 vs milieu adipogénique ou endothélial
Tableau 12: Détermination de l’expression en ARNm des marqueurs adipocytaires et
endothéliaux par des adipocytes matures, des cellules progénitrices CD34+/CD31- et des
cellules endothéliales capillaires CD34+/CD31+
Adipocytes
matures
Cellules progénitrices Cellules endothéliales
CD34+/CD31CD34+/CD31+
Marqueurs adipocytaires
aP2
PPARγ
LHS
FAS
42.67 ± 3.98
5.34 ± 0.77
21.89 ± 1.85
2.23 ± 0.55
5.67 ± 1.47 ***
1.22 ± 0.17 ***
0.14 ± 0.04 ***
<0.02 ***
12.19 ± 3.43 ***
2.84 ± 0.62 *
0.55 ± 0.14 ***
<0.02 ***
0.23 ± 0.03 *
0.52 ± 0.08 *
0.41 ± 0.05 *
0.07 ± 0.01 *
0.17 ± 0.04 **
0.36 ± 0.06 **
0.22 ± 0.05 *
0.03 ± 0.01**
0.40 ± 0.05
1.00 ± 0.17
1.21 ± 0.32
0.17 ± 0.04
Marqueurs endothéliaux
CD31
vWF
VE-cadherin
VEGF-R1
L’expression en ARNm des marqueurs adipocytaires (aP2, PPARγ, LHS et FAS) et des marqueurs endothéliaux
(CD31, vWF, VE-cadherin et VEGF-R1) a été déterminée par des analyses de RT-PCR dans des adipocytes
matures, des cellules CD34+/CD31- et des cellules endothéliales capillaires CD34+/CD31+ fraîchement isolées.
Les résultats sont exprimés en unités arbitraires pour 3 à 4 expériences indépendantes. *** P<0.001, **
P<0.01,* P<0.05 vs les adipocytes matures pour les marqueurs adipogéniques et vs les cellules endothéliales
CD34+/CD31+ pour les marqueurs endothéliaux
B.3) Etude cinétique sur l’évolution des cellules CD34+/CD31- au cours de la culture en
milieu mixte
Dans le développement du TA, angiogenèse et adipogenèse sont étroitement liées.
Toutefois, il est décrit que l’angiogenèse précède l’adipogenèse (52). Afin de déterminer si
un tel effet est observé dans nos conditions de culture. Nous avons réalisé une étude cinétique
sur l’évolution des cellules CD34+/CD31- à différents jours de culture (2, 4, 6, 8 et 10) en
milieu mixte. Dans un premier temps, la quantification intracellulaire en TGs ainsi que la
formation du réseau cellulaire positif pour le CD31 ont été réalisées. Dans un second temps,
nous avons quantifié l’expression en ARNm des marqueurs adipocytaires et endothéliaux des
cellules CD34+/CD31-.
Comme on peut l’observer dans la figure 22, l’augmentation du contenu en ADN
devient significative à partir du 6ème jour de culture. De manière intéressante, la longueur du
réseau cellulaire positif pour le CD31 apparaît et atteint son niveau maximal au 6ème jour de
culture tandis que le contenu intracellulaire en TGs n’augmente significativement qu’à partir
du 8ème jour de culture. Ces résultats laissent penser que la formation du réseau cellulaire
73
A
Contenu en ADN
(mg/ml)
0.05
*** ***
0.04
0.03
**
0.02
0.01
0.00
0 2 4 6 8 10
Jours de différenciation
B
Contenu en triglycérides
(mg/mg d'ADN)
40
Longueur du réseau positif
pour le CD31 (U.A.)
**
20
10
0
C
***
30
0 2 4 6 8 10
Jours de différenciation
100
75
50
**
***
*
25
0
0 2 4 6 8 10
Jours de différenciation
Figure 22 : Evolution du contenu en ADN, TGs et du réseau cellulaire positif pour le CD31 des
cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte
Les cellules CD34+/CD31- sont ensemencées à 120 000 cellules/cm2 et cultivées en milieu mixte.
Après 10 jours, le contenu intracellulaire en ADN (A) et TGs (B) ainsi que la longueur du réseau
cellulaire positif pour le CD31 (C) ont été évalués. Les valeurs sont exprimées en mg/mg d’ADN
pour le contenu en TGs et la longueur du réseau cellulaire pour le CD31 en unité arbitraires
normalisées à la quantité d’ADN pour 5 à 6 expériences indépendantes. *** P<0.001, ** P<0.01,
*P<0,05 vs J0
positif pour le CD31 précède l’accumulation des TGs. Cependant, il est difficile de comparer
l’apparition d’un marqueur avec la mise en place d’une activité métabolique.
L’étude de l’expression en ARNm des marqueurs adipocytaires et endothéliaux, au
cours de la culture des cellules CD34+/CD31- en milieu mixte nous a permis de compléter
ces résultats. En effet, on note que l’expression d’aP2 et PPARγ, des marqueurs précoces du
processus adipogénique, apparaît et atteint son maximum dès le 4ème jour tandis que
l’expression de FAS, connu pour être un marqueur de l’activité métabolique, apparaît dès le
4ème jour mais atteint son maximum au 8ème jour de culture (figure 23). Concernant les
marqueurs endothéliaux, nous avons constaté que l’expression du CD31 augmente
significativement dès le 4ème jour de culture et une tendance similaire pour le facteur vWF
semble être observée même si aucune différence significative n’a pu être mise en évidence du
fait d’une forte variabilité interindividuelle. Ces résultats semblent indiquer qu’au cours de la
culture l’expression des marqueurs endothéliaux étudiés atteint un niveau maximal plus
rapidement que l’expression de FAS suggérant que les capacités angiogéniques apparaissent
plus précocement que les capacités adipogéniques. Toutefois, il n’est pas exclu que
l’accumulation des TGs nécessite plus de temps que l’organisation d’un réseau cellulaire
positif pour le CD31. Il est important de préciser que les marqueurs endothéliaux utilisés pour
ce travail sont décrits dans la littérature comme des marqueurs détectés spécifiquement dans
les cellules endothéliales matures (223). Leur expression en fonction de la différenciation
endothéliale n’est pas connue et à ce jour il n’est pas décrit de marqueurs géniques
spécifiques de la différenciation des cellules endothéliales. Par ailleurs, il faut également
rester prudent quant à la spécificité des marqueurs de la différenciation adipocytaire. En effet,
certains sont également détectés dans les cellules endothéliales matures notamment PPARγ et
aP2.
Pour conclure, l’ensemble de ces résultats indique que les cellules CD34+/CD31cultivées en milieu mixte pendant 10 jours expriment à la fois des marqueurs adipocytaires et
endothéliaux. Cette condition de culture constitue donc un nouvel outil pour l’étude des
mécanismes contrôlant le devenir des cellules progénitrices CD34+/CD31-.
74
B
70
**
60
50
40
30
*
20
10
0
2
4
6
8
10
Jours de différenciation
2.0
*
1.5
*
1.0
0.5
0.0
2
4
6
8
10
Jours de différenciation
D
Expression en ARNm du CD31
(U.A.)
Expression en ARNm de FAS
(U.A.)
**
C
3
**
*
2
1
0
2
4
6
8
10
Jours de différenciation
E
0.4
0.3
*
0.2
0.1
0.0
2
4
6
8
10
Jours de différenciation
Expresion en ARNm du vWF
(U.A.)
80
Expression en ARNm de PPARγ
(U.A.)
Expression en ARNm d'aP2
(U.A.)
A
0.3
0.2
0.1
0.0
2
4
6
8
10
Jours de différenciation
Figure 23 : Evolution de l’expression en ARNm des marqueurs adipocytaires et endothéliaux
des cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte
Les cellules CD34+/CD31- sont ensemencées à 120 000 cellules/cm2 et cultivées en milieu mixte.
Après 10 jours, l’expression en ARNm des marqueurs adipocytaires aP2 (A), PPARγ (B) et FAS (C)
et des marqueurs endothéliaux CD31 (D) et vWF (E) a été déterminée par des analyses de RT-PCR.
Les résultats sont exprimés en unités arbitraires pour 4 expériences indépendantes. ** P<0.01 et
P<0,05 vs J2
Toutefois, nous nous sommes demandés si l’effet angiogénique observé par les
cellules CD34+/CD31- n’est pas du à une contamination par des cellules endothéliales
matures CD34+/CD31+. Des analyses de cytométrie de flux ont été effectuées pour
déterminer la pureté de la fraction CD34+/CD31-. Il a été observé que 92.9 ± 0.8 % des
cellules retrouvées dans cette fraction sont CD34+/CD31- (données personnelles). Ainsi, la
possibilité d’une contamination par des cellules endothéliales est faible. Cependant, afin de
déterminer l’influence de la présence des cellules endothéliales capillaires matures sur les
cellules CD34+/CD31- en milieu mixte, des expériences de coculture (CD34+/CD31- et
CD34+/CD31+) ont été réalisées. Les cellules CD34+/CD31- ont été ensemencées dans un
milieu ECBM/10% sérum de veau fœtal à 120000 cellules/puits en présence ou non de
cellules endothéliales capillaires CD34+/CD31+ (5000 cellules/puits). Après 24 heures (J0) et
10 jours de culture en milieu mixte (J10), le marquage positif pour le CD31 a été quantifié.
Les résultats présentés à la figure 24, montrent qu’après 24 heures, le nombre de cellules
positives pour le CD31 lors de la coculture est augmenté (P<0,05 contrôle vs coculture) du à
la présence de cellules endothéliales capillaires matures CD34+/CD31+. Cependant, après 10
jours de culture, aucune différence dans la longueur du réseau cellulaire pour le CD31 n’est
observée entre les cellules CD34+/CD31- seules ou en coculture. Ce résultat indiquent que
les cellules endothéliales matures quiescentes CD34+/CD31+ cultivées en milieu mixte ne
s’organisent pas en réseau à la différence des cellules CD34+/CD31-. L’ensemble de ces
données suggère donc que l’effet angiogénique observé est du à un potentiel angiogénique
des cellules CD34+/CD31- plutôt qu’à une contamination par des cellules endothéliales
CD34+/CD31+.
La mise au point de cette condition de culture permettant de révéler simultanément les
capacités adipogéniques et angiogéniques des cellules CD34+/CD31- nous a permis d’initier
des études sur les mécanismes potentiels impliqués dans la régulation de l’expression de cette
double fonctionnalité des cellules CD34+/CD31-. Trois axes ont été envisagés : l’influence
des contacts cellule-cellule, l’influence de la MEC et de son remodelage notamment via les
MMPs et l’influence des facteurs paracrines. Les résultats préliminaires que nous avons
obtenus sont présentés dans le paragraphe suivant.
75
Marquage positif pour le CD31
(en % CD34+/CD31- seules)
J0
Cellules
CD34+/CD31-
Cellules
CD34+/CD31+ CECs
B
Cellules
CD34+/CD31-
Cellules
CD34+/CD31+ CECs
*
600
400
200
0
CD34+/31-
+ CECs
J0
J10
Longueur du réseau positif pour le CD31
(en % CD34+31- seules)
A
120
100
80
60
40
20
0
CD34+/31-
+ CECs
J10
Figure 24 : Influence de la présence de cellules endothéliales matures sur la formation du
réseau cellulaire positif pour le CD31 des cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte
Les cellules CD34+/CD31- sont ensemencées à 120 000 cellules/cm2 seules ou en présence de
cellules endothéliales matures CD34+/CD31+ (CECs) (5 000 cellules/cm2) puis cultivées en
milieu mixte. Après 0 (A) et 10 (C) jours, les cellules sont fixées et marquées au Red Oil, au
Hoechst (un colorant nucléaire) et avec un anticorps dirigé contre le CD31. Des photographies
représentatives de 4 expériences indépendantes sont présentées. Le marquage positif pour le
CD31 a ensuite été évalué. Les valeurs sont exprimées en unité arbitraires normalisées à la
quantité d’ADN.*P<0,05 vs CD34+/CD31- seules.
C) Implication des contacts cellule-cellule dans les capacités adipogéniques et
angiogéniques des cellules CD34+/CD31-
C.1) Influence de la densité cellulaire sur les cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte
Etant donné que les cellules CD34+/CD31- ont une capacité de prolifération
importante en milieu mixte, la densité cellulaire augmente avec le temps. L’influence des
contacts cellule-cellule sur le devenir des cellules progénitrices CD34+/CD31- a donc été
déterminée en modulant la densité cellulaire d’ensemencement. Pour cela, les cellules ont été
ensemencées à trois densités différentes (2 000, 20 000 ou 120 000 cellules/cm2) et cultivées
pendant 10 jours en milieu mixte. Comme on peut le voir dans la figure 25A, quelle que soit
la densité cellulaire d’ensemencement, la quantité cellulaire d’ADN augmente au cours de la
culture et à 10 jours de culture cette quantité d’ADN est identique pour les trois densités. Une
augmentation du contenu intracellulaire en TGs est également observée quelque soit la
densité cellulaire (figure 25B). Cependant, le contenu intracellulaire en TGs est plus faible si
l’on compare la densité d’ensemencement la plus basse (2000 cellules/cm2) et la plus élevée
(120000 cellules/cm2) suggérant un retard de l’adipogenèse lorsque les cellules sont
ensemencées à faible densité. Concernant, la formation du réseau cellulaire positif pour le
CD31, il n’est observé qu’à la plus forte densité (figure 25C) suggérant que les contacts
cellule-cellule initiaux sont nécessaires à l’expression des capacités angiogéniques des
cellules CD34+/CD31-. L’ensemble de ces données suggère donc que la densité cellulaire
d’ensemencement peut moduler le devenir des cellules CD34+/CD31-.
L’influence de la densité cellulaire sur le devenir cellulaire est connue puisque des
travaux ont déjà suggéré que la densité cellulaire influence la différenciation des cellules
souches mésenchymateuses (210). Cependant, ce sont les travaux de Mc Beath et al. qui ont
clairement montré que la densité cellulaire d’ensemencement module l’engagement des
cellules souches mésenchymateuses vers le lignage adipogénique et ostéogénique (167). Ces
effets relatifs à la densité cellulaire peuvent être dus à des modulations de la forme de la
cellule et des tensions du cytosquelette comme il a déjà été suggéré (167) mais également à la
modulation des contacts et des communications entre les cellules.
De nombreuses études ont montré l’importance des jonctions gaps dans le contrôle
des processus de myogenèse (9, 215), d’ostéogenèse (237) mais aussi d’adipogenèse (238).
Récemment, une étude indique que la communication par les jonctions gaps est nécessaire à
l’expansion clonale durant la différenciation des préadipocytes de la lignée 3T3-L1 (296).
76
Contenu en ADN
(mg/ml)
A
0.05
***
0.04
***
***
0.03
0.02
0.01
0.00
0
10
0
2 000
Contenu en triglycérides
(mg/mg d'ADN)
B
10
20 000
0
10
120 000
jours
cellules/cm2
*
30
***
**
20
**
10
0
0
10
0
2 000
10
20 000
0
10
120 000
jours
cellules/cm2
C
Longueur du réseau positif
pour le CD31 (U.A.)
80
***
60
40
20
0
0
10
2 000
0
10
20 000
0
10
120 000
jours
cellules/cm2
Figure 25 : Influence de la densité cellulaire sur les capacités adipogéniques et angiogéniques
des cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte
Les cellules CD34+/CD31- sont ensemencées à 120 000, 20 000 ou 2 000 cellules/cm2 et cultivées en
milieu mixte. Après 10 jours, le contenu intracellulaire en ADN (A) et TGs (B) ainsi que la longueur
du réseau cellulaire pour le CD31 (C) ont été évalués. Les valeurs sont exprimées en mg/mg d’ADN
pour le contenu en TGs et la longueur du réseau cellulaire pour le CD31 en unité arbitraires
normalisées à la quantité d’ADN pour 4 à 10 expériences indépendantes. *** P<0.001, ** P<0.01,
*P<0,05 vs J0
Dans la suite de ce travail, l’implication de la communication par les jonctions gaps dans les
capacités angiogéniques et adipogéniques des cellules CD34+/CD31- a été évaluée.
C.2) Influence de la communication cellulaire via les jonctions gaps sur les cellules
CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte
Les jonctions gaps forment un canal intercellulaire essentiellement constitué d’un
assemblage de connexines. Nous avons tout d’abord évalué l’expression en ARNm des
connexines 43, 45, 40 et 37 dans des adipocytes matures, des cellules progénitrices
CD34+/CD31- et des cellules endothéliales capillaires CD34+/CD31+ fraîchement isolées.
Comme on peut le voir dans le tableau 13, toutes les connexines, excepté la connexine 37,
sont détectées dans les trois types cellulaires testés. Le niveau d’ARNm de la connexin 40 est
cependant très faible et on note que les cellules endothéliales capillaires expriment des
niveaux plus élevés de connexine 43 que les adipocytes matures.
L’expression en ARNm des connexines 43 et 45 a ensuite été évaluée au cours de la
culture des cellules progénitrices CD34+/CD31- en milieu mixte. Les résultats sont présentés
dans la figure 26 et indiquent clairement que l’expression en ARNm de ces connexines
diminue au cours de la culture. Ces résultats sont en accord avec les travaux d’Umezawa et
al. montrant que l’expression de la connexine 43 est diminué au cours de la différenciation
adipocytaire des cellules stromales de la moelle osseuse H-1/A d’origine murine (267).
Tableau 13: Expression en ARNm des connexines 43, 45, 40 et 37 dans des adipocytes
matures, des cellules progénitrices CD34+/CD31- et des cellules endothéliales capillaires
CD34+/CD31+
Types de
connexines
Connexine 43
Adipocytes
matures
0.20 ± 0.06
Cellules progénitrices
CD34+/CD310.51 ± 0.06
Cellules endothéliales
CD34+/CD31+
0.85 ± 0.21 *
Connexine 45
0.05 ± 0.01
0.14 ± 0.06
0.18 ± 0.08
Connexine 40
<0.02
<0.02
0.04 ± 0.01
Connexine 37
Non détectable
Non détectable
Non détectable
L’expression en ARNm des connexines 43, 45, 40 et 37 a été déterminée par des analyses de RT-PCR dans des
adipocytes matures, des cellules CD34+/CD31- et des cellules endothéliales CD34+/CD31+ fraîchement isolées.
Les résultats sont exprimés en unités arbitraires pour 3 expériences indépendantes. * P<0.05 vs les adipocytes
matures
77
A
B
Expression en ARNm de
la connexin 43 (U.A.)
1.0
0.8
0.6
0.4
**
***
0.2
0.0
2
4
6
8
10
Jours de différenciation
Expression en ARNm de
la connexin 45 (U.A.)
0.12
1.2
0.10
0.08
0.06
0.04
***
***
0.02
0.00
2
4
6
8
10
Jours de différenciation
Figure 26 : Evolution de l’expression en ARNm des connexines 43 et 45 des cellules
CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte
Les cellules CD34+/CD31- sont ensemencées à 120 000 cellules/cm2 et cultivées en milieu
mixte. Après 10 jours, l’expression en ARNm des connexines 43 (A) et 45 (B) a été déterminée
par des analyses de RT-PCR. Les résultats sont exprimés en unités arbitraires pour 4
expériences indépendantes. ** P<0.01 et ***P<0,001 vs J2
Le rôle direct de la communication par les jonctions gaps sur les capacités
adipogéniques et angiogéniques des cellules CD34+/CD31- a été déterminé grâce à
l’utilisation d’un inhibiteur des jonctions gaps, le 18α-glycyrrhetinic acide (AGA). Les
cellules ont été traitées pendant 10 jours avec 5 et 10 µM d’AGA ou de GZA (glycyrrhizic
acide) un analogue peptidique de l’AGA sans effet sur les jonctions gaps. Comme on peut le
voir dans la figure 27, le GZA n’a aucun effet significatif ni sur le contenu intracellulaire en
TGs ni sur l’apparition du réseau cellulaire positif pour le CD31. En revanche, l’AGA à 10
µM diminue de façon significative le contenu intracellulaire en TGs mais n’affecte pas
significativement le réseau CD31 même si une tendance à l’augmentation du réseau est
observée. Il est important de noter qu’à une concentration de 10 µM, l’AGA n’a pas effet sur
le contenu cellulaire en ADN (données personnelles). Cependant, l’utilisation de cet
inhibiteur à des concentrations supérieures à 30 µM est associée à une mort cellulaire au bout
de quelques jours de culture.
Ces résultats indiquent que la communication cellulaire via les jonctions gaps est
requise pour l’adipogenèse des cellules CD34+/CD31- en accord avec les travaux de
Yanagiya et al. sur les préadipocytes murins (296). Toutefois, l’effet observé sur les cellules
CD34+/CD31- ne semble pas être du à une altération de l’expansion clonale comme c’est le
cas pour les préadipocytes murins décrit par les résultats de Yanigaya et al. car aucune
différence du contenu cellulaire en ADN dans les cellules contrôles et traitées n’a été
observée (données personnelles). Une étude plus complète est toutefois nécessaire afin de
préciser les effets d’un inhibiteur des jonctions gaps sur l’expression en ARNm des
marqueurs de la différenciation adipocytaire et de déterminer à quel stade de l’adipogenèse
les jonctions gaps sont requises.
En résumé de cette deuxième partie, nous avons mis au point une condition de
culture permettant simultanément l’étude des capacités angiogéniques et adipogéniques des
cellules CD34+/CD31-. Ce nouvel outil va permettre l’étude des mécanismes qui contrôlent
le devenir des cellules CD34+/CD31- et notamment l’influence du microenvironnement. Des
premiers résultats indiquent que les contacts cellule-cellule ainsi que la communication via
les jonctions gaps peuvent moduler le devenir des cellules CD34+/CD31-.
78
B
Contenu en triglycérides
(en % contrôle)
150
100
*
50
0
5
10
GZA
5
10
AGA
µM
Longueur du réseau positif pour
le CD31 (en % du contrôle)
A
300
200
100
0
5
10
GZA
5
10
µM
AGA
Figure 27 : Effet d’un inhibiteur des jonctions gaps sur les capacités adipogéniques et
angiogéniques des cellules CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte
Les cellules CD34+/CD31- sont ensemencées à 120 000 cellules/cm2, cultivées en milieu
mixte et traitées avec un inhibiteur des jonctions gaps, l’AGA, ou son analogue peptidique
GZA. Après 10 jours, le contenu intracellulaire en TGs (A) ainsi que la longueur du réseau
cellulaire positif pour le CD31 (B) ont été évalués. Les valeurs sont exprimées en pourcentage
du contrôle après avoir été normalisées à la quantité d’ADN pour 3 à 4 expériences
indépendantes. *P<0,05 vs GZA 10 µM
En perspective à ce travail, l’influence des MMPs sur le devenir des cellules
CD34+/CD31- cultivées en milieu mixte est envisagé. En effet, nos résultats indiquent que
les cellules CD34+/CD31- isolées et cultivées en milieu adipogénique sécrètent les MMP-2 et
-9 et une inhibition de leur activité par le batimastat limite l’adipogenèse de ces cellules. Il
serait maintenant indispensable d’étudier les effets d’une inhibition des MMPs sur les
capacités adipogéniques et angiogéniques des cellules CD34+/CD31-. L’influence directe de
la MEC et notamment de ses composants matriciels tels que la fibronectine, le collagène, la
gélatine sur les capacités adipogéniques et angiogéniques des cellules CD34+/CD31cultivées en milieu mixte pourrait ensuite être déterminée. Ces études permettraient de définir
le rôle de la matrice et de sa dégradation dans le devenir des cellules progénitrices du TA
humain. Enfin, un troisième axe serait également intéressant et concerne l’influence de
facteurs paracrines sur le devenir de ces cellules. En effet, ces cellules contribuent
certainement à la croissance du TA en fournissant adipocytes et cellules endothéliales
nécessaires à son développement. Comme nous l’avons décrit dans l’introduction, le TA est
une source de nombreux facteurs ou adipokines, elles-mêmes originaires des différentes
populations cellulaires qui composent le TA. Ces sécrétions sont modulées au cours des
phases de croissance des dépôts adipeux. On peut donc se demander si ces adipokines
exercent un rôle dans le contrôle de la différenciation des cellules progénitrices. Ainsi,
l’influence des sécrétions par les autres types cellulaires du TA environnant les cellules
CD34+/CD31- tels que les macrophages, les cellules endothéliales, et les adipocytes matures
doit être envisagée par l’utilisation de milieu conditionnés en base ECBM (condition de
culture que nous avons vérifié comme étant favorable à la survie des cellules endothéliales,
macrophages et adipocytes matures isolés du TA humain) sur les cellules CD34+/CD31- en
milieu mixte.
79
Conclusions et perspectives
Ce travail de thèse a eu pour objectif de déterminer l’implication des MMPs dans la
différenciation des précurseurs adipocytaires humains. Nous avons démontré un rôle majeur
de l’activité des MMPs et plus particulièrement MMP-9 dans la différenciation adipocytaire
des cellules de la FSV du TA humain. De plus, MMP-9 pourrait être une cible de l’effet
inhibiteur des IPs-VIH sur la différenciation adipocytaire des cellules de la FSV du TA
humain. En effet, nous avons mis en évidence que les IPs-VIH diminuent l’expression et la
sécrétion de MMP-9. Les mécanismes impliqués dans cet effet passent en partie par une
inhibition de l’activité protéasomique des cellules de la FSV par les IPs-VIH, entraînant des
perturbations de la voie NF-κB, facteur de transcription impliqué dans l’expression génique
de MMP-9. L’étude des cibles moléculaires de MMP-9 impliquées dans les effets de cette
protéase sur la différenciation adipocytaire, telles que la dégradation des composants de la
MEC puisque celle-ci évolue au cours de la différenciation adipocytaire et/ou la
biodisponibilité de facteurs solubles qui modulent l’adipogenèse doit maintenant être
envisagé. De même les cibles cellulaires de MMP-9 au sein du TA doivent être mieux
définies.
L’ensemble de nos travaux a montré que la fraction cellulaire CD34+/CD31- contient
un pool de cellules progénitrices présentant une potentialité adipocytaire et endothéliale. A
présent, une nouvelle condition de culture permet simultanément l’étude des capacités
adipogéniques et angiogéniques de ces cellules. Cependant, il reste à déterminer si cette
population cellulaire CD34+/CD31- est constituée d’un mélange de cellules progénitrices
unipotentes ou de cellules bi ou multipotentes. Notons que, la différenciation in vitro en
adipocyte n’atteint jamais le pourcentage total de cellules, même si elle est nettement
supérieure aux cellules exprimant des marqueurs endothéliaux tels que le CD31. Cette
observation semble suggérer que les cellules CD34+/CD31- constituent une population
cellulaire hétérogène. Une expérience d’analyse clonale pourrait permettre de déterminer
l’homogénéité ou l’hétérogénéité de cette fraction cellulaire. Cependant ce type d’analyse est
basé sur l’évaluation des capacités angiogéniques et adipogéniques de cellules dérivées après
prolifération d’une cellule initiale. Or, l’effet de la prolifération sur le devenir cellulaire est à
définir étant donné que jusqu'à présent nos études ont été réalisées sur des cellules en culture
primaire non passagées. Nos résultats préliminaires sur les cellules CD34+/CD31- passagées
80
montrent une diminution des capacités angiogéniques alors que leur capacité adipogénique
est maintenue (données personnelles).
La présence de cette population cellulaire CD34+/CD31- au sein du TA humain pose
la question de leur provenance et de leur mobilisation potentielle. En effet, ces cellules
peuvent être résidentes et capable d’autorenouvellement, et/ou elles peuvent être recrutées à
partir des cellules progénitrices circulantes issues de la moelle osseuse comme l’ont suggéré
les travaux de Hong et al. (101). Différents types de signaux tels que le SDF-1 (stromal
derived factor-1) mais également MMP-9 ont été montrés comme participant au recrutement
des progéniteurs CD34+ avec un potentiel hématopoïétique et/ou hépatique dans le foie des
souris NOD/SCID après un dommage hépatique (128). On peut donc poser l’hypothèse d’un
rôle potentiel de MMP-9 sur le recrutement de cellules progénitrices circulantes au sein du
TA.
Une mobilisation potentielle des cellules CD34+/CD31- du TA est-elle possible ? Ces
cellules sont-elles capables de migrer et de quitter le TA ? Le phénomène de mobilisation a
été très étudié pour les cellules souches hématopoïétiques et consiste en leur libération depuis
la moelle osseuse jusqu'à la circulation sanguine. Cette mobilisation est stimulée par de
nombreux facteurs tels que le SDF-1 et le G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor). De
manière intéressante, ces facteurs entraînent la production de MMPs et notamment MMP-9
dans les cellules hématopoïétiques (50, 128). De plus, l’administration de ces composés à des
souris déficientes pour MMP-9 ne permet pas la mobilisation cellulaire (96). Les mécanismes
impliqués dans la migration des cellules souches vers la circulation sanguine passe par
l’augmentation des quantités solubles de kit ligand, une glycoprotéine transmembranaire,
induite par MMP-9 (96) qui permet non seulement la mobilisation des cellules progénitrices
dans la circulation mais aussi la prolifération et la migration des mastocytes dans le tissu
(97). Récemment notre groupe a montré que les cellules CD34+/CD31- migrent en réponse à
des milieux conditionnés par des cellules endothéliales capillaires CD34+/CD31+ du TA
humain. Cet effet est inhibé par la toxine pertussique (un inhibiteur de la protéine Gi) et par
un anticorps dirigé contre le CXCR4, le récepteur du SDF-1. De plus, nous avons mis en
évidence que les cellules endothéliales CD34+/CD31+ produisent et sécrètent du SDF-1 et
que les sécrétions des cellules endothéliales CD34+/CD31+ permettent l’expression des
capacités angiogéniques des cellules CD34+/CD31- (242). L’ensemble de ces résultats est
présenté en annexe dans la publication 3. Le rôle de MMP-9 dans la migration des cellules
CD34+/CD31- est à envisager d’autant plus que les expériences de migration des cellules
81
CD34+/CD31- présentés dans ce travail ont été réalisés sur un support de gélatine (données
personnelles).
Enfin, l’implication de MMP-9 in vivo reste à être définie. Afin de déterminer si les
effets de MMP-9 observés in vitro ont une signification physiologique ou physiopathologique
lors d’un développement ou d’une régression de TA, la caractérisation du TA et de ses
capacités d’extension dans un modèle original de souris invalidées pour le gène de MMP-9
(souris KO MMP-9) sont à envisager. Nos premiers résultats, obtenus sur les souris KO
MMP-9, sous tendent l’implication de cette métalloprotéase dans le développement du TA.
En effet, en conditions nutritionnelles standard, l’absence de MMP-9 est associée à une
diminution de 37% du TA sous cutané et de 27% du TA intra-abdominal (n=6), sans
variation de la masse corporelle totale par rapport aux souris contrôles. De plus, la quantité de
triglycérides stockés dans ces tissus est deux fois plus faible chez les souris KO MMP-9.
Suite à ces résultats, il nous apparaît nécessaire de mieux caractériser ce modèle. Pour cela,
dans un premier temps nous envisageons l’analyse du TA des souris KO MMP-9 aussi bien
dans sa structure que dans sa composition cellulaire et matricielle. En effet, il est important
de définir si la différence de masse adipeuse entre les souris KO MMP-9 et les souris
contrôles est due à une diminution du nombre et/ou de la taille des adipocytes matures. Des
éventuelles modifications de la vasculature, de la présence de macrophages et de la MEC
dans les TA des souris KO MMP-9 et contrôles seront recherchées. De la même manière, il
serait intéressant de définir la composition cellulaire de la FSV isolée des souris KO MMP-9
et contrôles. Enfin, l’isolement des différentes populations cellulaires de la FSV issues des
souris KO MMP-9 et contrôles, par l’utilisation de nanoparticules magnétiques couplées à
des anticorps d’intérêt ainsi que l’évaluation des capacités adipogéniques et angiogéniques in
vitro sur les cellules progénitrices ainsi obtenues pourraient être envisagé. Dans un second
temps, une cinétique de développement et/ou de régression du TA des souris KO MMP-9
pourrait être envisagée. L’étude des différents types cellulaires des TA et des composants
matriciels de ces souris devenues obèses ou maigres pourra être réalisée, comme
précédemment décrit .
Pour conclure, ce travail démontre l’importance des MMPs dans le processus de
différenciation adipocytaire des cellules progénitrices du TA humain. Les MMPs pourraient
ainsi contribuer au développement de la masse grasse. Bien que leur rôle exact reste à
déterminer les MMPs pourraient devenir de nouvelles cibles d’intérêt dans le développement
de traitements efficaces pour l’obésité et la lipoatrophie.
82
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102
Annexes
Publication 3 :
Chemotaxis and Differentiation of Human Adipose Tissue CD34+/CD31- Progenitor
Cells: Role of SDF-1 Released by Adipose Tissue Capillary Endothelial Cells
Coralie Sengenès, Alexandra Miranville, Marie Maumus, Sandra de Barros, Rudi Busse and
Anne Bouloumié. Stem Cells, 2007
103
TISSUE-SPECIFIC STEM CELLS
Chemotaxis and Differentiation of Human Adipose Tissue CD34ⴙ/
CD31ⴚ Progenitor Cells: Role of Stromal Derived Factor-1 Released
by Adipose Tissue Capillary Endothelial Cells
CORALIE SENGENÈS,a ALEXANDRA MIRANVILLE,b MARIE MAUMUS,a SANDRA
ANNE BOULOUMIÉa
DE
BARROS,a RUDI BUSSE,b
a
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, U858, AVENIR Team, I2MR, Paul Sabatier University,
IFR31, Toulouse, France; bInstitute of Cardiovascular Physiology, Johann Wolfgang Goethe University,
Frankfurt am Main, Germany
ABSTRACT
The native CD34ⴙ/CD31ⴚ cell population present in the
stroma-vascular fraction of human adipose tissue (hAT)
displays progenitor cell properties since they exhibit adipocyte- and endothelial cell-like phenotypes under appropriate
stimuli. To analyze the signals within hAT regulating their
phenotypes, the influence of hAT-derived capillary endothelial cells (CECs) was studied on the chemotaxis and differentiation of the hAT-CD34ⴙ/CD31ⴚ cells. Conditioned medium from hAT-CECs led to a strong chemotaxis of the
hAT-CD34ⴙ/CD31ⴚ cells that was inhibited with pretreatments with pertussis toxin, CXCR-4 antagonist, or neutralizing antibodies. Furthermore, hAT-CECs produced and
secreted the CXCR-4 ligand, that is, the stromal derived
factor-1 (SDF-1). Finally, hAT-CECs induced the differen-
tiation of hAT-CD34ⴙ/CD31ⴚ cells toward an endothelial
cell (EC) phenotype. Indeed, hAT-CECs and -CD34ⴙ/
CD31ⴚ cell coculture stimulated in a two-dimensional system the expression of the EC CD31 marker by the hATprogenitor cells and, in a three-dimensional approach, the
formation of capillary-like structures via a SDF-1/CXCR-4
dependent pathway. Thus, the migration and differentiation
of hAT progenitor cells are modulated by hAT-CEC-derived
factors. SDF-1, which is secreted by hAT-derived CECs, and
its receptor CXCR-4, expressed by hAT-derived progenitor
cells, may promote chemotaxis and differentiation of hATderived progenitor cells and thus contribute to the formation of the vascular network during the development of hAT.
STEM CELLS 2007;25:2269 –2276
Disclosure of potential conflicts of interest is found at the end of this article.
INTRODUCTION
The excessive human adipose tissue (hAT) development is
associated with adipocyte hypertrophy and hyperplasia [1, 2] as
well as an extension of the capillary network [3–5]. The processes involved in the increased number of mature adipocytes as
well as the neovascularization within the fat mass are still to be
clearly defined. We have described a cell population, present in
the native stroma-vascular fraction (SVF) of hAT, characterized
as positive for the hematopoietic stem cell marker CD34 and
negative for the endothelial cell marker CD31. The CD34⫹/
CD31⫺ cell population was the only cell population of the SVF
under adipogenic culture conditions among the capillary endothelial cells (CECs), the macrophages, and the cells negative for
the CD34, CD31, and CD14 markers able to express adipocytespecific markers and metabolic lipolytic and lipogenic activities.
Furthermore, under endothelial cell culture conditions, the
CD34⫹/CD31⫺ cells changed their morphology and organization and expressed endothelial cell (EC)-specific markers such
as CD31 and von Willebrand factor [5]. In vivo, their injection
led to an increase in blood flow and capillary density within the
ischemic muscle in the athymic mouse model of hindlimb
ischemia, whereas injection with native hAT-derived CD34⫺
cells exerted no effects [5]. Other laboratories have reported
similar proangiogenic abilities of the whole adipose tissue (AT)
adherent SVF cells [6, 7]. The further characterization of the
native CD34⫹/CD31⫺ cells has shown that they did not express
the classic mesenchymal stem cell markers (CD105 and Stro-1)
and displayed different features from the adult hematopoietic
stem cells since they did not form blood colony in hematopoietic
assays [8]. Thus, the native CD34⫹/CD31⫺ cell population of
hAT can be considered a local pool of adipocyte as well as
endothelial progenitor cells that might play a role in the formation of adipocytes but also of capillaries accompanying the
development of the fat mass. Since the microenvironment, that
is, soluble factors such as the stromal derived factor-1 (SDF-1)
[9 –11], cellular, and extracellular matrix components have been
shown to regulate the biology of hematopoietic and mesenchymal stem cells [12–14], the present study was undertaken to
characterize the effects of signals arising from hAT microenvironment on the chemotaxis and differentiation of the hAT
progenitor cells. Our data delineate the concept that hAT-derived CECs induce the chemotaxis and support the endothelial
Correspondence: Coralie Sengenès, Ph.D., Team 1, “Vascular network, progenitor cells and immune cells from adipose tissue,” Institut
National de la Santé et de la Recherche Médicale U858/I2MR, BP84225, 31432 Toulouse Cedex 4, France. Telephone: ⫹33 5 6114 5975;
Fax: ⫹33 5 6125 5116; e-mail: [email protected] Received March 14, 2007; accepted for publication May 17,
2007; first published online in STEM CELLS EXPRESS May 24, 2007. ©AlphaMed Press 1066-5099/2007/$30.00/0 doi: 10.1634/
stemcells.2007-0180
STEM CELLS 2007;25:2269 –2276 www.StemCells.com
Downloaded from www.StemCells.com at Inserm Disc Doc on September 7, 2007
Key Words. Human CD34⫹ cells • Stromal derived factor-1 • Endothelial differentiation • Chemotaxis • CXCR-4 • Matrigel
Microvasculature • Progenitor cells
Adipose Tissue Stem and Endothelial Cell Crosstalk
2270
differentiation potential of the hAT-derived progenitor cells via
the SDF-1/CXCR-4 axis within hAT.
human AT-derived CECs and no statistical significant differences
were found (not shown).
Transmigration Assay
MATERIALS
AND
METHODS
Isolation of the SVF from hAT
Isolation of the CD34ⴙ/CD31ⴚ Progenitor Cells and
the CD34ⴙ/CD31ⴙ CECs from the SVF of hAT
CD34⫹ cells were isolated from the SVF using CD34-coupled
magnetic microbeads as previously described [5]. Briefly, the SVF
was incubated (room temperature, 15 minutes) with the StemCell
Technologies (St. Katharinen, Germany, http://www.stemcell.com)
positive selection cocktail. Following the addition of magnetic
nanoparticles, cells were recovered by successive magnetic sorting
steps. The CD34⫹ cells were suspended in PBS/0.1% BSA. The
CD34⫹ population was depleted from the CD31⫹ cells using Dynal
Biotech (Hamburg, Germany, http://www.dynalbiotech.com) CD31coupled magnetic microbeads (50 ␮l/ml). After incubation (4°C, 20
minutes), the cell suspension containing the beads, suspended in 10
ml of PBS/0.1% BSA, was exposed to the magnet for 1 minute. The
magnetic bead-free fraction, the CD34⫹/CD31⫺ cells (hAT-derived
progenitor cells), was collected, centrifuged (250g, 10 minutes), and
suspended in the culture medium and the CD34⫹/CD31⫹ cell
fraction (hAT-derived CECs) was removed from the magnet and
suspended in endothelial cell culture medium. The CD34⫹/CD31⫺
cell content of the selected fraction was 92.2% ⫾ 1.2%.
Cell Culture
The hAT-derived CECs were cultured in Endothelial Cell Growth
Medium MV (ECGM-MV) (PromoCell, Heidelberg, Germany,
http://www.promocell.com) on human fibronectin coated culture
dishes. Human AT-derived CECs were used until passage 2 [5, 15].
The human AT-derived progenitor cells were cultured in Endothelial Cell Basal Medium (ECBM, which contains no growth factors)
(PromoCell) supplemented with 10% FCS. Progenitor cells were
used until passage 1 [5]. Human umbilical vein endothelial cells
(HUVECs) were isolated [16] and cultured until passage 8.
Preparation of Conditioned Media and EnzymeLinked Immunosorbent Assay
Human AT-derived CECs, hAT-derived progenitor cells, hAT-resident macrophages (CD14⫹/CD31⫹) that were isolated as previously described [15], and HUVECs were incubated with an equal
amount of basal ECBM supplemented with 0.1% BSA for 24 hours.
Mature adipocytes (400,000 cells) were included in fibrin gels (1.5
mg fibrinogen/ml ECBM supplemented with 25 units/ml ␣-thrombin) and cultured in ECBM supplemented with 0.1% BSA for 24
hours. Control gels were prepared without adipocytes. The conditioned media were collected, centrifuged (1,000g, 10 minutes, 4°C),
and stored at ⫺70°C until use. Release of SDF-1 was measured in
conditioned media by enzyme-linked immunosorbent assay according to the instructions of the manufacturer (RayBiotech Inc.,
Norcross, GA, http://www.raybiotech.com). Note that the SDF-1
levels were measured in conditioned media from P0, P1, and P2
RNA Extraction and Real-Time Quantitative
Polymerase Chain Reaction Assay
Total RNAs were extracted from human mature adipocytes, hATCD34⫹/CD31⫺ cells, hAT-macrophages, and hAT-CD34⫹/CD31⫹
CECs using the RNeasy kit (Qiagen, Hilden, Germany, http://
www1.qiagen.com). RNA concentrations were determined using a
fluorometric assay (RiboGreen). RNA (0.5 ␮g) was reverse-transcribed using the SuperScript III RNase H RT system (Invitrogen,
Carlsbad, CA, http://www.invitrogen.com) according to the manufacturer’s instructions (random hexamers and deoxynucleoside-5⬘triphosphates were from Life Technologies, Rockville, MD, http://
www.lifetech.com). Reverse transcription was also performed
without superscript enzyme on RNA samples to ensure the absence
of contaminating genomic DNA. Primers for human SDF-1
(CXCL12), hypoxia inducible factor-1␣ (HIF-1␣), and CXCR-4
were provided by Applied Biosystems (Assay-On-Demand:
Hs00171022_m1, Hs00153153_m1, and Hs00607978_m1, respectively; Foster City, CA, http://www.appliedbiosystems.com). All
amplification reactions were performed in duplicate from 20 ng
cDNA using the Mx4000 Multiplex Quantitative PCR System
(Stratagene, La Jolla, CA, http://www.stratagene.com) using the
following conditions: 50°C for 2 minutes and 95°C for 10 minutes
followed by 40 cycles at 95°C for 15 seconds and 60°C for 1
minute. Results were analyzed with Stratagene MX4000 software,
and all values were normalized to the levels of the ribosomal RNAs.
Coculture Between hAT-Derived CECs and
hAT-Derived CD34ⴙ/CD31ⴚ Progenitor Cells
Human AT-derived CECs plated at 60,000 cells per cm2 were
cultured in ECGM-MV on human fibronectin-coated 48-well cell
culture plates until confluence. Then, hAT-derived progenitor cells
were labeled with PHK26 according to the instructions of the
manufacturer (Sigma-Aldrich) and 2,000 –3,000 cells per well were
placed in each well in ECBM/2% SVF. After 10 days of coculture,
the cocultured cells were fixed and stained with the indicated
antibodies.
Three-Dimensional Coculture Model
Human AT-derived CECs plated at 60,000 cells per cm2 were
cultured in ECGM-MV on human fibronectin-coated 48-well cell
culture plates. Once confluent, the hAT-CECs were covered with
200 ␮l of unpolymerized BD Matrigel Matrix Growth Factor Reduced (BD Biosciences) and incubated at 37°C for 30 – 45 minutes.
Human AT-derived progenitor cells were harvested with trypsin and
labeled with PHK26 according to the instructions of the manufacturer. The progenitor cells were resuspended in ECBM/0.1% BSA
and 2,000 –3,000 cells per well were loaded onto the matrigelcoated wells (200 ␮l of cell suspension per well). After 24 hours of
“coculture,” progenitor cell tube formation (red fluorescent net-
Downloaded from www.StemCells.com at Inserm Disc Doc on September 7, 2007
Human AT was obtained from individuals undergoing plastic surgery by lipoaspiration. The study was approved by the ethical
committees of Toulouse and Frankfurt am Main hospital universities. Subcutaneous AT was obtained from a total of 38 individuals
(mean body mass index: 26.07 ⫾ 1.01 kg/m2). The AT was digested
using collagenase (300 U/ml in phosphate-buffered saline [PBS],
2% bovine serum albumin [BSA], pH 7.4) for 30 minutes under
constant shaking. Following removal of the floating mature adipocytes, the lower layer containing the SVF was centrifuged (300g, 10
minutes) and the pellet resuspended in erythrocyte lysis buffer (155
mmol/l NH4Cl; 5.7 mmol/l K2HPO4; 0.1 mmol/l EDTA, pH 7.3) for
10 minutes. After successive filtrations through 100-, 70-, and
40-␮m sieves, the cells were resuspended in PBS/2% fetal calf
serum (FCS).
Transmigration assays of hAT-derived progenitor cells were performed using 8-␮m pore HTS FluoroBlock inserts (Falcon; BD
Biosciences, San Diego, http://www.bdbiosciences.com) coated
with bovine gelatin (0.15 mg/cm2). The progenitor cells were
loaded at 50,000 cells per insert (upper chamber) and conditioned
media, SDF-1 in the presence or not of AMD3100 (Sigma-Aldrich,
St. Louis, http://www.sigmaaldrich.com) or CXCR-4 neutralizing
antibody (clone 12G5; R&D Systems Inc., Minneapolis, http://
www.rndsystems.com), were added to the lower chamber. The cells
were allowed to migrate into the lower chamber for 20 –24 hours.
After the assays, the inserts were fixed (4% paraformaldehyde) and
the nuclei were stained with 4,6-diamidino-2-phenylindole. For
blocking experiments, the progenitor cells were preincubated with
the indicated inhibitors at 37°C for 1 hour. The cell transmigration
was quantified by counting the number of nuclei using a computerassisted microscope (Nikon, Düsseldorf, Germany, http://www.
nikon.com) at three distinct positions.
Sengenès, Miranville, Maumus et al.
2271
RESULTS
Figure 1. Human adipose tissue (AT)-derived CECs induce the chemotaxis of hAT-derived CD34⫹/CD31⫺ progenitor cells. (A): Transwell migration of human AT-derived progenitor cells in the presence of
control medium (Control) or conditioned media from adipocytes (n ⫽
14), hAT-CECs (n ⫽ 21), and HUVECs (n ⫽ 3). ⴱ p ⬍ .001 when
compared with control migration. (B): Transwell migration of hATderived progenitor cells in response to hAT-CEC conditioned medium
in the lower chamber (hAT-CEC conditioned medium), in the upper
chamber (upper chamber hAT-CECs) (n ⫽ 3), after 1-hour preincubation with increasing concentrations of pertussis toxin (n ⫽ 4) or after
protein denaturated hAT-CEC-conditioned medium (heated AT-CECs)
(n ⫽ 4). ⴱ p ⬍ .01, ⴱⴱ p ⬍ .001 when compared with migration induced
by hAT-CEC-conditioned medium. Abbreviations: CECs, capillary endothelial cells; hAT, human adipose tissue; HUVECS, human umbilical
vein endothelial cells; PTX, pertussis toxin.
work) was assessed with a computer-assisted microscope (Nikon).
Microphotographs of the center of each well were taken, and tube
formation was quantified by measuring the total tube length using
Lucia image software (Nikon, Tokyo, http://www.nikon.com). Tube
formation of progenitor cells alone was used as a control. For
blocking experiments, the progenitor cells were preincubated with
the indicated inhibitors at 37°C for 1 hour.
Immunocytochemistry
Cells were fixed with 4% paraformaldehyde and immunostained
with anti-human CXCR-4 monoclonal antibody (Abcam, Cambridge, U.K., http://www.abcam.com) (1:50) or platelet endothelial
cell adhesion molecule-1 (CD31) monoclonal antibody (Dako,
Glostrup, Denmark, http://www.dako.com) (1:10) followed by
staining with fluorescently labeled secondary antibody (1:200) (Invitrogen).
AT-Derived CECs Induce the Chemotaxis of the
CD34ⴙ/CD31ⴚ Cells
The effect of hAT-CECs on the migration of hAT-derived CD34⫹/
CD31⫺ cells was assessed in modified Boyden chamber assays
consisting of two cell chambers separated by a polycarbonate filter
(8-␮m pores). The lower chamber was filled up with control media
or 24 hour-conditioned media from confluent hAT-CECs, mature
adipocytes, or confluent HUVECs, and the cell suspension of
hAT-derived CD34⫹/CD31⫺ cells was placed in the upper chamber. Cells that migrated across the filter and attached to the under
part of the filter after 24 hours were counted after nuclei staining.
As depicted in Figure 1A, conditioned media from mature adipocytes or from HUVECs did not induce any cell migration. Conversely, conditioned media from hAT-CECs led to the robust
migration of the CD34⫹/CD31⫺ cells (5.7 ⫾ 0.7-fold increase, n ⫽
21, p ⬍ .001). Human AT-CEC conditioned media failed to induce
the migration of hAT-derived CD34⫹/CD31⫺ cells after protein
denaturation of the conditioned media (Fig. 1B). Moreover, the
stimulatory effect of conditioned media derived from hAT-CECs
was lost when the conditioned media were applied in the upper
chamber together with the CD34⫹/CD31⫺ cells. Taken together,
the results showed that secreted proteins from hAT-CECs stimulated the directed chemotactic migration of the hAT-derived
CD34⫹/CD31⫺ (Fig. 1B). In addition, preincubation of hAT-derived progenitor cells with increasing concentrations of pertussis
toxin (PTX) (200 and 400 ng/ml) led to a concentration-dependent
inhibition of the hAT-CEC-mediated migration (76% ⫾ 9% of
inhibition for 400 ng/ml of PTX, p ⬍ .001, n ⫽ 4) (Fig. 1B).
Statistical Analysis
The CXCR-4/SDF-1 Axis Is Involved in the
Chemotaxis of the CD34ⴙ/CD31ⴚ Cells Mediated by
AT-Derived CECs
Data are expressed as mean ⫾ SEM from at least three independent
experiments. Statistical analysis was performed by Student’s t test
or one-way analysis of variance followed by a Bonferroni post hoc
test when appropriate. Differences were considered significant
when p ⬍ .05.
To further identify the nature of the factor(s) involved in such
an effect, the CD34⫹/CD31⫺ cells were preincubated with a
CXCR-4 antagonist (AMD3100, 10 ␮g/ml) or with neutralizing
anti-CXCR-4 antibody (10 ␮g/ml), and the effect of hAT-CEC
conditioned media was then assessed. As shown in Figure 2, the
www.StemCells.com
Downloaded from www.StemCells.com at Inserm Disc Doc on September 7, 2007
Figure 2. The stromal derived factor-1/CXCR-4 axis is involved in the
hAT-derived progenitor cell chemotaxis toward hAT-CEC conditioned
media. Transwell migration of hAT-derived progenitor cells in the
presence of hAT-derived CEC-conditioned media after 1 hour of preincubation with 10 ␮g/ml of the CXCR-4 antagonist AMD3100
(⫹AMD3100) (n ⫽ 6) or with 10 ␮g/ml of an anti-CXCR-4 neutralizing
antibody (⫹Anti-CXCR-4) (n ⫽ 6). ⴱ p ⬍ .01 when compared with
migration induced by hAT-CEC-conditioned media. Abbreviations:
CECs, capillary endothelial cells; hAT, human adipose tissue.
2272
Adipose Tissue Stem and Endothelial Cell Crosstalk
CXCR-4 neutralizing antibody (77% ⫾ 11% and 96% ⫾ 4% of
inhibition, respectively, p ⬍ .01, n ⫽ 6). Moreover, as depicted
in Figure 3A, increasing concentrations of recombinant SDF-1␣
or -1␤, ligands for the CXCR-4, induced a concentration-dependent chemotaxis of hAT-derived progenitor cells that was significantly inhibited when the progenitor cells were preincubated
with AMD3100 (58% ⫾ 7% of inhibition, p ⬍ .01, n ⫽ 3) or
neutralizing anti-CXCR-4 antibody (72% ⫾ 3% of inhibition,
p ⬍ .01, n ⫽ 3) (Fig. 3B). Of note, the chemotaxis of the
CD34⫹/CD31⫺ cells toward granulocyte monocyte colony
stimulating factor (20 –100 ng/ml), stem cell factor (20 –100
ng/ml), monocyte chemoattractant protein 1 (1–20 ng/ml), and
interleukin 8 (20 ng/ml) was also evaluated, and none of the
chemokines induced a statistically significant migration (data
not shown).
Figure 3. Functionality of the CXCR-4/SDF-1 axis in human adipose
tissue. (A): Human adipose tissue (AT)-derived progenitor cells were
exposed to increasing concentrations of SDF-1␣ or SDF-1␤ (10 –100
ng/ml), and transwell migration was evaluated after 24 hours (n ⫽ 3– 8);
ⴱ p ⬍ .01 and ⴱⴱ p ⬍ .001 compared with control. (B): Human
AT-derived progenitor cells were preincubated (1 hour) with 10 ␮g/ml
CXCR-4 antagonist AMD3100 (n ⫽ 3) or with 10 ␮g/ml anti-CXCR-4
neutralizing antibody (n ⫽ 3). Transwell migration toward 100 ng/ml
SDF-1␣ was then evaluated after 24 hours. $ p ⬍ .001 compared with
control, ⴱ p ⬍ .01 and ⴱⴱ p ⬍ .001 compared with SDF-1␣ induced
migration. Abbreviation: SDF-1, stromal derived factor-1.
hAT-CEC-mediated chemotaxis was suppressed when the progenitor cells were incubated with AMD3100 or with anti-
The expression of CXCR-4 in hAT-derived CD34⫹/CD31⫺
cells was then investigated by real-time polymerase chain reaction (PCR) analysis. The results showed that transcripts for
CXCR-4 were present in hAT-derived CD34⫹/CD31⫺ cells
(Fig. 4B). Moreover, as presented in Figure 4A, the CXCR-4
protein expression was detected by immunocytochemistry on
hAT-CD34⫹/CD31⫺ cells. Additionally, there was a positive
correlation between the level of transcripts encoding for
CXCR-4 in hAT progenitor cells and the one of HIF-1␣ in the
corresponding hAT-CECs (Fig. 4B, p ⫽ .04, n ⫽ 14). In
parallel, SDF-1 mRNA expression was assessed in hAT-derived
CECs and compared with the one of HUVECs and other cells
from the SVF such as hAT-macrophages. As depicted in Figure
4C, the SDF-1 mRNA was mainly expressed by hAT-derived
CECs and was below Ct values of 40 in HUVECs. Consistent
with the mRNA expression, SDF-1 release was significantly
higher in hAT-derived CECs as compared with other cell fractions present in AT-derived SVF such as macrophages (412.2 ⫾
92.9 pg/ml vs. 34.4 ⫾ 18.1 pg/ml, respectively, p ⬍ .001, n ⫽
3–9) (Fig. 4D). The production of SDF-1 by HUVECs was 42
Figure 4. Expression of SDF-1 and
CXCR-4 in hAT. (A): Upper panel: hATderived CD34⫹/CD31⫺ progenitor cells
were fixed and stained with antibodies directed against CXCR-4 receptor followed
by fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated secondary antibodies. Lower panel:
hAT-CD34⫹/CD31⫺ cells were stained
with FITC-conjugated secondary antibodies.
Representative fluorescence microscopy
analysis is shown from n ⫽ 3. (B): Correlation between mRNA levels of CXCR-4 in
hAT-progenitor cells and HIF-1 levels in
hAT-CECs quantified by real-time polymerase chain reaction (PCR) experiments (p ⫽
.04, n ⫽ 14). (C): SDF-1 mRNA expression
in hAT-macrophages (n ⫽ 3), HUVECs
(n ⫽ 4), and hAT-CECs (n ⫽ 6) quantified
by real-time PCR experiments. (D): Enzyme-linked immunosorbent assay of 24hour conditioned media from hAT-macrophages (n ⫽ 3), HUVECs (n ⫽ 4), and
hAT-CECs (n ⫽ 9). ⴱ p ⬍ .05 versus macrophage SDF-1 secretion. Abbreviations:
A.U., arbitrary units; CECs, capillary endothelial cells; hAT, human adipose tissue;
HIF-1, hypoxia inducible factor-1; HUVECS,
human umbilical vein endothelial cells;
SDF-1, stromal derived factor-1.
Downloaded from www.StemCells.com at Inserm Disc Doc on September 7, 2007
CXCR-4 Is Expressed on CD34ⴙ/CD31ⴚ Cells and
SDF-1 Is Produced by hAT-Derived CECs
Sengenès, Miranville, Maumus et al.
2273
DISCUSSION
Figure 5. Human AT-derived progenitor cells incorporate into the
network formed by hAT-CECs and express platelet endothelial cell
adhesion molecule-1 (PECAM-1). (A): Confluent hAT-CECs were
fixed and stained with antibodies directed against PECAM-1 followed
by fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated secondary antibodies.
(B): Confluent PKH26 hAT-CD34⫹/CD31⫺ progenitor cells were
fixed and stained with antibodies against PECAM-1 followed by FITCconjugated secondary antibodies. (C): Confluent hAT-CECs were cultured in the presence of PKH26-labeled hAT-derived progenitor cells
for 10 days of coculture in endothelial basal medium/2% fetal calf
serum. Cells were fixed and stained with antibodies directed against
PECAM-1 followed by FITC-conjugated secondary antibodies. Representative fluorescence microscopy analysis is shown from n ⫽ 3 independent experiments. Abbreviations: CECs, capillary endothelial cells;
DAPI, 4,6-diamidino-2-phenylindole; hAT, human adipose tissue.
times lower than the one of hAT-CECs (9.84 ⫾ 3.81 pg/ml,
n ⫽ 4).
AT-Derived CECs Support the Differentiation of
AT-Derived Progenitor Cells Toward an Endothelial
Cell Phenotype
Coculture experiments of hAT-derived CECs and CD34⫹/
CD31⫺ cells were performed. Human AT-derived CD34⫹/
CD31⫺ cells were labeled with PKH26 and seeded onto confluent hAT-derived CECs (Fig. 5A). After 10 days of coculture,
CD31 expression in the formal CD31 negative AT-derived
progenitor cells (Fig. 5B) was analyzed. hAT-derived CECs
formed a dense CD31 positive network into which PKH26
positive AT-derived progenitor cells incorporated and expressed
the CD31 marker (Fig. 5C). To further analyze the effect of the
hAT-derived CECs on the differentiation of the CD34⫹/CD31⫺
cells, a three-dimensional coculture model was developed.
PKH26 labeled CD34⫹/CD31⫺ cells were seeded on the top of
www.StemCells.com
Although reports show that adipogenesis and angiogenesis are
tightly correlated during the growth of fat mass [3, 17–20], little
is known about the mechanisms that regulate the extension of its
vasculature. In the present study we report that hAT-derived
CECs induce the chemotaxis of hAT-derived progenitor cells.
Moreover, we demonstrate that the presence of hAT-derived
CECs promotes the differentiation and organization of hATderived hAT-CD34⫹/CD31⫺ progenitor cells into capillary-like
structures via a SDF-1/CXCR-4-dependent pathway.
In the last years, several reports have contributed to the
evidence that the SVF cells are phenotypically heterogeneous
and can express under specific culture conditions adipogenic,
osteogenic, chondrogenic, and myogenic lineage markers but
also endothelial, epithelial, and neural markers [5, 8, 21–23].
We have previously shown that native immunoselected CD34⫹/
CD31⫺ cells present in the hAT-derived SVF display angiogenic and adipogenic potentials. Indeed, this cell population is
able to differentiate into adipocyte-like cells [8] and into endothelial-like cells in vitro and in vivo to promote the neovascularization of ischemic muscle in mice [5]. Similar results were
also described using adherent hAT-SVF [6, 7]. The mechanisms
underlying such proangiogenic effects are still to be defined.
Although the hAT-derived progenitor cells were shown to integrate into vessels in vivo [5, 6], they could also contribute to
neovascularization through the production of proangiogenic factors [7, 24]. Nevertheless, such a population of progenitor cells
may participate locally to the extension of the blood capillary
network known to be associated with fat mass development. The
present study was undertaken to analyze the potential crosstalk
within the hAT between hAT-CD34⫹/CD31⫺ progenitor cells
and CECs. Indeed, the EC barrier has already been shown to
interact with progenitor/stem cells [25–27]. Human AT-derived
CECs specifically stimulated the migration of hAT-derived
CD34⫹/CD31⫺ progenitor cells through the release of soluble
proteins. Human AT-derived CECs induced a chemotactic response since no random motility was observed when the cells
were incubated in the same compartment with endothelial cellderived conditioned media. Moreover, since hAT-derived
CD34⫹/CD31⫺ progenitor cell chemotaxis was inhibited in the
presence of pertussis toxin, which specifically prevents activation of Gi proteins coupled to chemokine receptors, the involvement of a chemokine ligand/receptor interaction was strongly
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a growth factor-reduced matrigel under which confluent hATderived CECs were present or not. As shown in Figure 6A,
CD34⫹/CD31⫺ cells alone did neither migrate nor form capillary-like structures. Interestingly, the presence of hAT-derived
ECs under the matrigel dramatically promoted the organization
of hAT-CD34⫹/CD31⫺ cells into branched structures and
pseudotubes (360% ⫾ 48% of the total length obtained with
hAT-CD34⫹/CD31⫺ cells alone, p ⬍ .01, n ⫽ 7) (Fig. 6B).
Given the chemotactic effect mediated by the CXCR-4/SDF-1
axis, we studied the involvement of this system in the hATCEC-dependent tube formation by using a neutralizing antiCXCR-4 antibody, the CXCR-4 antagonist AMD3100, or pertussis toxin (not shown). As depicted in Figure 6C and 6D, the
tube formation induced by hAT-derived CECs was significantly
inhibited in a concentration-dependent manner by the inhibitors
(24% ⫾ 12% and 67% ⫾ 5% of inhibition with 10 ␮g/ml and
100 ␮g/ml AMD3100, respectively; 41% ⫾ 15% and 93% ⫾
2% of inhibition for 10 ␮g/ml and 20 ␮g/ml neutralizing antiCXCR-4 antibody, respectively; 85% ⫾ 0.5% of inhibition for
200 ng/ml pertussis toxin, n ⫽ 4 –7).
2274
Adipose Tissue Stem and Endothelial Cell Crosstalk
suggested. Finally, when CXCR-4 from hAT-CD34⫹/CD31⫺
progenitor cells was neutralized by antibodies [28] or by the
CXCR-4 antagonist (AMD3100) [29], hAT-derived CD34⫹/
CD31⫺ progenitor cells failed to migrate in response to hATderived CEC conditioned medium. Since real-time PCR and
immunocytochemistry analyses showed the expression of
CXCR-4 in native hAT-derived CD34⫹/CD31⫺ progenitor
cells, the present results demonstrate that activation of CXCR-4
of the hAT-derived CD34⫹/CD31⫺ progenitor cells is involved
in the hAT-derived CEC-dependent chemotaxis. In agreement,
earlier work reported immunoreactivity to CXCR-4 in hAT [30],
and a recent publication showed that CXCR-4 overexpression in
hAT-stromal cells regulated cell motility [31]. The sole ligand
of CXCR-4, described so far, is the CXCL12 chemokine also
known as SDF-1 [32–34]. SDF-1, initially described as a product of bone marrow stromal cells [35], is expressed by several
tissues including dendritic cells, endothelial cells and pericytes
from normal skin [36], osteoblasts, and ECs from the bone
marrow [37–39] and astrocytes and neurons from the brain [40].
SDF-1 exists as two isoforms, ␣ and ␤, originating from alternative splicing of the CXCL12 gene [41– 43]. Human AT-CECs
expressed and released more SDF-1 than the other cell types
present in hAT. Moreover, SDF-1 was detected in very low
amounts in conditioned media from HUVECs that did not
stimulate the CD34⫹/CD31⫺ progenitor cell chemotaxis. Human AT-progenitor cells exhibited a concentration-dependent
chemotaxis toward SDF-1␣ and SDF-1␤ that was inhibited in
the presence of CXCR-4 antagonist or neutralizing antibodies.
Taken together, the present findings suggest that SDF-1 released
by hAT-CECs plays a major role in the CXCR-4-mediated
chemotaxis of hAT-progenitor cells, although further experiments are needed to clearly rule out the involvement of other
endothelial-derived factors. The couple SDF-1/CXCR-4 plays a
pivotal role in multiple checkpoints of stem/progenitor cell
biology in the bone marrow compartment including survival,
proliferation, mobilization, and homing [10, 44, 45]. In a twodimensional coculture system, hAT-derived progenitor cells
were shown to incorporate into the network formed by hATCECs and to express the EC marker CD31, suggesting that
hAT-CECs may, in addition to their effect on the migration,
regulate the differentiation of hAT-CD34⫹/CD31⫺. To better
define the role of paracrine factors, three-dimensional coculture
Downloaded from www.StemCells.com at Inserm Disc Doc on September 7, 2007
Figure 6. hAT-CECs induce the formation of capillary-like structures by hATderived progenitor cells via the stromal
derived factor-1/CXCR-4 axis. hAT-CECs
were cultured until confluence. Once confluent, hAT-CECs were covered with matrigel and PKH26 labeled hAT-derived
progenitor cells were seeded onto the matrigel. After 24 hours, tube length was
measured. (A): Representative pictures of
hAT-derived progenitor cells alone (phase
microscopy and fluorescent microscopy
analyses, inset picture). (B): Representative picture of hAT-derived progenitor
cells cocultured with hAT-CECs (phase
microscopy and fluorescent microscopy
analyses, inset picture). (C, D): Representative picture of 1-hour pretreated hATprogenitor cells with AMD3100 (100 ␮g/
ml) (C) or neutralizing anti-CXCR-4 (20
␮g/ml) antibody (D) that were cocultured
with hAT-CECs (phase microscopy and
fluorescent microscopy analyses, inset picture). (E): Total length of the network
formed by PKH26 labeled hAT-derived
progenitor cells pretreated or not with increasing concentrations of AMD3100 or a
neutralizing CXCR-4 antibody. ⴱ p ⬍ .05,
ⴱⴱ p ⬍ .01, ⴱⴱⴱ p ⬍ .001 when compared
with the network formed by adipose tissue
(AT)-derived progenitor cells in the presence of AT-CECs (n ⫽ 4 –7). Abbreviations: 3D, three-dimensional; CECs, capillary endothelial cells; hAT, human adipose
tissue.
Sengenès, Miranville, Maumus et al.
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All together, the present results show that the migration and
differentiation of hAT-derived progenitor cells are modulated
by factors originating from hAT-derived CECs. The SDF-1/
CXCR-4 axis appears to play a key role. Such an effect may be
involved in the recruitment of hAT-derived progenitor cells to
foci where SDF-1 is highly expressed such as neovascularization sites to promote the extension of the capillary network that
occurs during the growth of the fat mass.
ACKNOWLEDGMENTS
We are grateful to Valérie Wegner and Pauline Decaunes for
their excellent technical assistance. We also thank Dr. Marie
Sanson for her special help with HUVECs. This work was
supported by grants from AVENIR INSERM, Alexander von
Humboldt Foundation, and Sofja Kovalevskaja Price (Humboldt
Foundation and the German Federal Ministry of Education and
Research).
DISCLOSURE
OF POTENTIAL
OF INTEREST
CONFLICTS
The authors indicate no potential conflicts of interest.
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experiments were performed. The results clearly showed that
hAT-derived progenitor cells migrate and assemble into capillary-like structures only in the presence of hAT-CECs. Moreover, when CXCR-4 either was antagonized or neutralized,
hAT-progenitor cells failed to appropriately migrate and assemble into tubular structures on matrigel substrate.
Taken together, the present results show that hAT-derived
CECs, through their production of paracrine factors such as
SDF-1, modulate the migration but also the differentiation and
organization of the hAT-derived CD34⫹/CD31⫺ progenitor
cells through the activation of CXCR-4. CXCR-4 mRNA levels
are known to be upregulated by hypoxia through HIF-1 activation via the hypoxia responsive element in the 5⬘ region of the
CXCR4 gene [46, 47]. In the murine AT, hypoxic areas have
been shown to be associated with obesity [48]. Interestingly, the
mRNA levels of CXCR-4 from the CD34⫹/CD31⫺ were found
to be positively correlated to HIF-1␣ transcripts of the CECs. A
recent publication has reported that the recruitment of CXCR-4
positive progenitor cells to regenerating foci or tissues was
mediated by hypoxic gradients via HIF-1 induced expression of
CXCR-4/SDF-1 axis [28]. Moreover, SDF-1 expression in ischemic tissue has been shown to primarily localize in ECs [36]. It
is thus tempting to speculate that hypoxia within the hAT may
promote the migration of resident hAT-derived CD34⫹/CD31⫺
progenitor cells at active sites of neovascularization in the fat
mass.
2275
Adipose Tissue Stem and Endothelial Cell Crosstalk
2276
42
43
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Titre et résumé en anglais
Matrix metalloproteases 2 and 9 and the differentiation of human adipose
tissue progenitor cells
Human adipose tissue (AT) has long attracted attention because of its capacity for
excessive development and regression. Cellular and matrix remodelling can explain human
AT plasticity. The matrix metalloproteinase (MMP) family is considered to play a major role
in tissue remodelling. In a previous report, we demonstrated that the stroma-vascular fraction
(SVF) of human AT produce and release MMP-2 and -9 during adipocyte differentiation in
vitro. In this work, we evidenced that decrease of MMP-9 activity by batimastat and
expression by HIV protease inhibitors decrease adipocyte differentiation of SVF cells. We
showed that the way in which HIV protease inhibitor affect MMP-9 expression involve
perturbations of proteasome and transcription factor NF-κB activities. Since the SVF of
human AT represents a heterogeneous cell population containing capillary endothelial cells,
inflammatory cells and progenitor cells that are able, under appropriate culture conditions, to
express adipogenic and angiogenic abilities, we would like to determine MMP-9 involvement
in the fate of progenitor cells. We defined a new culture condition in which progenitor cells
express simultaneously adipogenic and angiogenic abilities. These data strongly suggests that
MMP-9 modulate the differentiation of human progenitor cells and contribute to human AT
remodelling and thus in this excessive development and/or regression.
104
Auteur : Sandra DE BARROS
Titre : Les métalloprotéases matricielles 2 et 9 et la différenciation des cellules progénitrices
du tissu adipeux humain
Directeur de thèse : Dr Jean GALITZKY
Lieu et date de soutenance : Toulouse, le 29 octobre 2007
Résumé : Le tissu adipeux (TA) peut se développer de manière excessive (obésité) mais
aussi régresser (lipoatrophie). Cette plasticité peut s’expliquer par un remodelage cellulaire et
matriciel. Les métalloprotéases matricielles (MMPs) sont des acteurs majeurs du remodelage
tissulaire. Des travaux précédents menés au sein de l’équipe ont montré que les cellules de la
fraction stroma vasculaire (FSV) du TA humain sécrètent les MMP-2 et -9 au cours de la
différenciation adipocytaire in vitro. Durant ce travail, nous avons observé que l’inhibition de
l’activité de MMP-9 par le batimastat et de son expression par les inhibiteurs de la protéase
du VIH limite la différenciation adipocytaire des cellules de la FSV. L’étude des mécanismes
moléculaires responsables de la diminution de l’expression de MMP-9 par les inhibiteurs de
la protéase du VIH a montré que l’expression de MMP-9 est régulée par une voie impliquant
l’activité du protéasome et le facteur de transcription NF-κB. Sachant que la FSV est une
population cellulaire hétérogène contenant des cellules endothéliales, des cellules immunoinflammatoires et des cellules progénitrices aux capacités adipogéniques et angiogéniques,
nous avons souhaité déterminer l’implication de MMP-9 dans le devenir des cellules
progénitrices. Pour cela, une condition de culture permettant simultanément l’expression des
capacités adipogéniques et angiogéniques des cellules progénitrices a été mise au point.
L’ensemble de ce travail indique que MMP-9 influence la différenciation des cellules
progénitrices du TA humain et contribuent au remodelage du TA lors de son développement
et/ou de sa régression.
Mots clés : tissu adipeux, MMP, adipogenèse, cellules progénitrices
Discipline : Innovation pharmacologique
Intitulé et adresse du laboratoire :
Equipe 1/Avenir - Réseau vasculaire, cellules progénitrices et cellules immnunitaires du tissu
adipeux- INSERM U858/I2MR, 37 Allées Jules Guesde, 31000 Toulouse
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