réactions impliquant plusieurs substrats

RÉACTIONS IMPLIQUANT PLUSIEURS SUBSTRATS
Réactions à deux substrats
Réactions catalysées par oxydoréductases, transférases, ligases
● Analyse cinétique basée sur des réactions à un substrat
Il y a deux grandes catégories en ce qui concerne des réactions à deux substrats:
A) Réactions enzymatiques impliquant des complexes ternaires (complexe contenant
l'enzyme et deux substrats)
La réaction E + A + B  E + P + Q procède par la formation des complexes
ternaires de type EAB et EPQ de sorte que :
E + A + B  EAB  EPQ  E + P + Q
● Cette catégorie de réaction se sous-divise en deux classes.
A.1) Réactions dans lesquelles le complexe ternaire se forme d'une façon
ordonnée ou obligatoire.
Le deuxième substrat B se lie après le premier substrat A est lié.
E + A  EA
et
EA + B  EAB (mais pas E + B  EB)
A.2) Réactions dans lesquelles le complexe ternaire se forme de façon
séquentielle au hasard
E + A  EA  EA + B  EAB
ou
E + B  EB  EB + A EAB
B) Réactions impliquant la formation des complexes binaires, mais pas ternaires
● B.1) La catégorie la plus importante comprend le mécanisme « ping pong »
ou enzyme substitué ces réactions connues sous le nom déplacement
double impliquent une modification de l'enzyme et les deux substrats, A et
B, qui ne se rencontrent pas sur la surface de l'enzyme.
Une forme modifiée de l'enzyme est créée pendant son interaction avec le
premier substrat et avant que le deuxième substrat ne soit lié donc :
E + A  E' + P
E' + B  E + Q
● B.2) Une deuxième catégorie d'enzyme opère par un mécanisme de type
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Theorell-Chance (nommée d’après les deux investigateurs) dans lequel un
complexe ternaire se forme, mais sa décomposition afin de libérer le premier
produit est si rapide que la concentration du complexe ternaire est
cinétiquement négligeable.
W W Cleland a proposé des représentations cinétiques schématisées pour décrire
les réactions enzymatiques. Ce type de représentation à la fois simplifie la description
des interactions possibles entre l’enzyme avec le substrat, ainsi qu’avec l’activateur et
l’inhibiteur et en même temps donne une vue globale et compréhensive du
mécanisme réactionnel.
● Le progrès d'une réaction est démontré par une ligne horizontale (bifurquée
si nécessaire) sur laquelle les formes enzymatiques sont démontrées
i) Mécanisme séquentiel au hasard
A
B
P
EA
Q
EQ
EAB ⇌ EPQ
E
E
EB
EP
B
A
Q
P
ii) Mécanisme ordonné ou obligatoire
A
B
E
P
EAB ⇌ EPQ
EA
Q
EQ
E
iii) Mécanisme enzyme substitué (ping pong)
A
E
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P
EA ⇌ E’P
B
E’
Q
E’B ⇌ EQ
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E
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Traitement mathématique des réactions à deux substrats
Il n'y a pas de nouveaux principes à invoquer en ce qui concerne des réactions
à plusieurs substrats par rapport à une réaction de substrat unique.
● Algèbre seulement est plus compliquée.
● But des manipulations mathématiques consiste à déterminer les concentrations
des complexes enzymatiques en fonction de la concentration totale de
l'enzyme et pour une concentration de substrat donnée.
● L'approximation de l'état stationnaire est utilisée sauf pour le mécanisme
séquentiel au hasard où l'équilibre rapide simplifie l’équation cinétique.
● L’approximation d'équilibre rapide est justifiée dans beaucoup de réactions
● La vitesse de la réaction enzymatique est égale à la concentration du complexe
qui précède l'étape de la régénération de l'enzyme libre  la constante de
vitesse décrivant l'étape de régénération
ki
E + A ⇌ EA + B ⇌ EAB ⇌ EPQ  EQ + P  E + Q
Dans ce schéma v = ki [EQ]
● La régénération de l'enzyme fait partie du mécanisme et permet à la
réaction de continuer
Les équations décrivant les vitesses initiales des réactions à plusieurs substrats
ont les formes suivantes :
A) Mécanismes impliquant des complexes ternaires A.1 et A.2
v
VMAX [ A] [ B]
K A' K B  K B [ A]  K A [ B]  [ A] [ B]
● Mécanisme Theorell-Chance donne la même forme
B) Mécanisme enzyme substitué (ping-pong) B.1
v
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VMAX [ A] [ B]
K B [ A]  K A [ B]  [ A] [ B]
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C) Analyse des paramètres dans les équations :
Dans les deux équations, Vmax représente la vitesse maximale à des niveaux
saturants des substrats A et B
Les paramètres KA et KB représentent en effet les constantes Michaelis pour
les substrats A et B respectifs en présence des concentrations saturantes de l’autre
substrat;
● si on divise par B la relation définie pour un mécanisme impliquant la
formation d’un complexe ternaire;
v
VMAX [ A]
K A' K B
[ B]
 KB
[ A]
 K A  [ A]
[ B]
quand [B]  ∞, 1/[B]  0 , le vitesse devient équivalente à celle obtenue
par la relation de Michaelis-Menten
v
VMAX [ A]
K A  [ A]
● Le terme K’A, n’a pas d’interprétation simple
● Les termes K’A, KA et KB représentent des fonctions de constantes de vitesses
qui décrivent les réactions élémentaires des mécanismes enzymatiques.
● Dans le cas des mécanismes séquentiels au hasard, K’A, KA et KB représentent
des constantes de dissociation puisque l'approximation d'équilibre rapide a été
utilisée dans la dérivation de l'équation
K'A
EA
KA
E
EAB
K'B
EB
E + Produits
KB
L’approximation de l’équilibre rapide relie les constantes de dissociation par la
relation KA / K’A = KB / K’B ; donc K’B = K’A KB / KA
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D) Analyse des données
Dans une expérience cinétique, la vitesse est mesurée à partir des
concentrations de [A] différentes et en gardant [B] constante, ce processus est répété
à d'autres valeurs de B afin de balayer une gamme de variation importante en v.
L’estimation des paramètres cinétiques - VMAX, KA, K’A et KB se fait
aujourd’hui à partir de logiciels eg GraFit
● Cependant, les méthodes graphiques permettent une analyse plus claire du
mécanisme de la réaction catalysée
Complexes ternaires
La transformation de l’équation de vitesse en forme réciproque est :
1
K A K B K A' K B
1
 (1 


)
v
[ A] [ B] [ A][ B] VMAX
En traçant 1/v contre 1/[A] à [B] fixe donne une ligne avec pente et avec
l'intercepté (ordonnées à l’origine) sur l'axe 1/v :
1
1
K A' K B 1
1
K

(K A 
)

(1  B )
v VMAX
[ B] [ A] VMAX
[ B]
y =
m
x +
[B] augmentant
1/v
b
Graphique : Traçage des
données cinétiques en forme
double réciproque montrent
variation de 1/v vs 1/[A] à
différentes valeurs de [B]
constant.
1 / [A]
Intercepté
Pente
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1
VMAX
1
VMAX
(1 
KB
1
KB 1
)

[ B]
VMAX VMAX [ B ]
K A' K B
KA
K A' K B 1
(K A 
)

[ B]
VMAX
VMAX [ B ]
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● La pente et l’intercepté sont ensuite retracé en fonction de 1/[B]
(représentations secondaires) pour résoudre les paramètres cinétiques
● quand [B]  ∞, la pente et l'intercepté décroisent pour que la pente 
KA/Vmax et l'intercepté  1/Vmax
Représentations secondaires
la pente vs 1/[B]
l'intercepté vs 1/[B]
« Pente de la pente » = K’AKB/VMAX
Pente
« Pente de l’intercepté » = KB/VMAX
Intercepté
1/ VMAX
KA / VMAX
1 / [B]
1 / [B]
À partir de ces représentations secondaires, il est possible de déterminer les
paramètres cinétiques Vmax, KA, KB et K’A.
Dans le mécanisme séquentiel au hasard si K’A > KA , ceci implique que la
liaison d'un substrat avec l'enzyme favorise la liaison de l'autre substrat  liaison
synergétique.
Complexe binaire
Pour le mécanisme d'enzyme substitué (ping-pong), la représentation
réciproque donne :
1
K
K
1
 (1  A  B )
v
[ A] [ B] VMAX
En traçant 1/v contre 1/[A] à [B] fixe, on obtient une ligne droite avec une
pente KA/Vmax et une intercepté 1/Vmax (1 + KB/ [B])
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[B] augmentant
Graphique : Traçage des
données cinétiques en forme
double réciproque montrent
variation de 1/v vs 1/[A] à
différentes valeurs de [B]
constant
1/v
1 / [A]
Intercepté
1
VMAX
(1 
KB
1
KB 1
)

[ B]
VMAX VMAX [ B ]
● La pente est indépendante de [B] et donc la représentation graphique en [B]
différentes donne des lignes parallèles;
Représentation secondaire de l'intercepté vs 1/[B]
« Pente » = KB/VMAX
Intercepté
1/ VMAX
1 / [B]
● Les paramètres cinétiques, Vmax, KA, KB sont ensuite déterminés pour le
mécanisme « ping pong » à partir de la représentation secondaire.
E) Discrimination entre des mécanismes différents
Il est possible de distinguer entre des mécanismes d'enzymes substitués
(« ping-pong ») et ceux impliquant des complexes ternaires à partir des
représentations graphiques
1) Dans le cas du mécanisme ping-pong, lignes parallèles en représentation double
réciproque
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 Cependant, il faut soigneusement analyser les données afin de s'assurer que les
lignes sont vraiment parallèles
Si un mécanisme enzymatique substitué est suggéré, il est possible de chercher
une confirmation supplémentaire
 Présence des réactions partielles; transformation de A en P en l'absence de B
E + A  E' + P
 Identification de la forme modifiée de l'enzyme E'
Exemple : nucléotide diphosphate kinase
GTP + dGDP  GDP + dGTP
o La séquence de réaction commence par la phosphorylation de la chaîne
latérale d’une histidine par GTP et qui est détectée par le transfert du γ
– P32 GTP sur l'enzyme
d’abord,
E + GTP32  E – P32 + GDP
suivi par
E – P32 + dGDP  E + dGTP32
2) Il n'est pas possible de distinguer entre le mécanisme ternaire ordonné et séquentiel
au hasard seulement à partir d'analyses cinétiques
 Ceci demande les expériences supplémentaires suivantes :
i) Liaison des substrats
Pour le cas du mécanisme séquentiel au hasard, chaque substrat A et B se lie
d'une façon indépendante à l'enzyme tandis que dans le cas du mécanisme ordonné,
le deuxième substrat B ne peut pas se lier en l'absence du premier substrat A
 Le cas de lactate déshydrogénase qui catalyse la réaction
L-lactate + NAD+ ⇌ pyruvate + NADH + H+
o NAD+ se lie à l'enzyme, mais il n'y a pas de liaison du lactate en
l'absence de NAD+
 Mécanisme ordonné
ii) Inhibition par produit
Profil d'inhibition démontré par des produits P et Q envers le substrat A et B
peut indiquer le mécanisme possible, mais les équations sont très complexes.
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iii) Échange des isotopes à l'équilibre
L'échange des isotopes est catalysé par l'enzyme quand les composantes de la
réaction sont à l'équilibre.
Par exemple, dans la réaction catalysée par la malate déshydrogénase
L-malate + NAD+ ⇌ oxaloacétate + NADH + H+
● Les concentrations des composantes sont arrangées pour qu'au pH en question,
le rapport
[𝑜𝑥𝑎𝑙𝑜𝑎𝑐é𝑡𝑎𝑡𝑒][ 𝑁𝐴𝐷𝐻]
= 𝐾𝑒𝑞 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑟é𝑎𝑐𝑡𝑖𝑜𝑛
[𝑚𝑎𝑙𝑎𝑡𝑒][𝑁𝐴𝐷+ ]
● Un des substrats, le NAD+, est étiqueté par l’isotope 14C qui est radioactif et
après l'ajout d'une quantité catalytique de l'enzyme; la vitesse avec laquelle
l'isotope est transformé en NADH est déterminée
o il n'y a pas de transformation nette de NAD+ en NADH puisque la
réaction est déjà à l’équilibre
o cependant, la réaction dans les deux sens permet un échange continu
entre substrat et produit
o donc équilibration de NAD+ étiqueté au 14C avec NADH après suffisant
de temps
Il a été constaté que lorsque les concentrations de malate et d'oxaloacétate sont
augmentées de façon que leur rapport reste constant, ceci afin que l'état d'équilibre de
la réaction ne soit pas perturbé, la vitesse d'échange entre NAD+ et NADH approchait
zéro tandis que la vitesse d'échange entre malate et oxaloacétate aussi étiqueté
atteignait une valeur limite
NAD+
⇌ NADH
Vitesse
échange
L-malate
Vitesse
échange
[malate]
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⇌ oxaloacétate
[malate]
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Ces résultats suggèrent que l'enzyme obéit à un mécanisme ordonné de type
malate
E + NAD+

oxaloacétate

NADH
NAD
E NADH ⇌
⇌ E NAD ⇌ Emalate
⇌ Eoxaloacéta
te ⇌
E + NADH
● au fur et à mesure que les concentrations de malate et d'oxaloacétate
augmentent, la vitesse de transformation des complexes binaires ENAD+ et
ENADH en complexes ternaires augmentent également
● l'enzyme, à ce moment-là, existe presque exclusivement sous forme de
complexe ternaire et NAD+ et NADH ne se dissocient presque jamais de
l'enzyme
● puisque l'enzyme est présent en petites quantités par rapport aux
concentrations de substrats et de produits, ce type de situation n'est cohérent
qu’avec presque aucun échange d'isotopes entre NAD+ libre et NADH libre
Aussi longtemps que la liaison de NAD+ implique un changement
conformationnel pour que l'enzyme puisse lier le malate, ce changement
conformationnel est stabilisé par le malate et assure que le NAD+ reste lié à l'enzyme
avec des concentrations saturantes de malate.
o Le mécanisme séquentiel au hasard n'explique pas les faits
F) Réactions impliquant plus que deux substrats
Réactions impliquant trois réactifs sont :
1. Glyceraldehyde-3-phosphate déshydrogénase avec
D-glyceraldéhyde-3-P + NAD+ + Pi ⇌ 3-phospho-D-glycérol phosphate + NADH
2. Tyrosyl t-RNA synthétase
ATP + C - Tyr + tRNA ⇌ AMP + PPi + L-Tyr - tRNA
Plusieurs types de mécanismes possibles :
● Enzyme substitué ou formation des complexes quaternaires par des
mécanismes ordonnés, au hasard, et ordonnés partiels
Exemple : glutamate déshydrogénase
2-oxoglutarate + NH4+ + NAD(P)H ⇌ L-glutamate + NAD(P)+ + H2O
● Mécanisme où les réactants s'ajoutent au hasard afin de former le complexe
quaternaire
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