Inhibition der Cyclooxygenase bei destruktiven Gelenkerkrankungen

Transcription

Ruhr-Universität Bochum
Prof. Dr. med. Ralf H. Wittenberg
Dienstort: St. Elisabeth-Hospital Herten
Orthopädische Abteilung
Inhibition der Cyclooxygenase bei destruktiven Gelenkerkrankungen
Effekte von Lumiracoxib, Diclofenac, Celecoxib und SC-560 auf die Prostanoidfreisetzung aus entzündeter Synovialis und Bursa subacromialis in vitro
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Ida Sibylle Haußleiter
aus Münster
2004
Dekan:
Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent:
Prof. Dr. med. R. H. Wittenberg
Korreferent:
Prof. Dr. med. J. Krämer
Tag der Mündlichen Prüfung:
25. 01.2005
meiner Familie
Diskobolische Marmorkopie der Bronzestatue
von MYRON (50 v. Chr.); Rom Museo Nazionale
Inhaltsverzeichnis
Theoretischer Teil
1. Grundlagen
1
1.1
Entzündung
2
1.2
Enzyme und Botenstoffe
3
1.2.1 Cyclooxygenase (COX)
3
1.3
1.4
1.2.1.1 Struktur und Isoformen
4
1.2.1.2 Lokalisation und Effekte
8
Inflammatorisch
9
Zentralnervös
10
Kardiovaskulär
11
Gastrointestinal
12
Urogenital
13
1.2.2 Prostaglandine (PG)
15
1.2.3 Cytokine
19
Pharmakologische Intervention
20
1.3.1 Nicht-steroidale Antiphlogistika (NSAID)
22
1.3.2 selektive COX-1-Inhibitoren
23
24
1.3.4 Nebenwirkungen der selektiven COX-2-Inhibitoren
26
Chronisch-entzündliche Gelenkerkrankungen
28
1.4.1 Impingement - Syndrom der Schulter
28
1.4.2 Osteoarthrose des Knies
30
Experimenteller Teil
2. Versuchsdesign
2.1
2.2
33
Methodik
33
2.1.1 Pilotexperiment
33
2.1.2 Kurzeitinkubation
34
2.1.3 Langzeitinkubation
34
Material
35
2.2.1 Gewebe
35
2.2.2 Pharmaka-Lösungen
36
2.3
Procedere
39
2.4
biometrische Verfahren
40
2.4.1 Radioimmunoassay (RIA)
40
2.4.2 Enzymelinked Immuno-sorbent Assay (ELISA)
42
2.5
Statistik
45
2.6
verwendete Substanzen
47
3. Ergebnisse
48
3.1
Pilotexperiment
48
3.2
Endgültige Analyse
56
Auswertung
4. Diskussion
74
5. Zusammenfassung
100
Literaturverzeichnis
Danksagung
Lebenslauf
102
Verzeichnis der Abkürzungen
COX
Cl
-
Cyclooxygenase
Chlorid
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
ELISA
Enzymelinked Immuno Sorbent Assay
FG
Feuchtgewicht
IL1β
Interleukin 1β
IL4
Interleukin 4
6-Keto-PGF1α
6-Keto-Prostaglandin F 1α
kB
Kilo Basenpaar; molekularbiologische Maßeinheit
kD
Kilo Dalton; chemische Masseinheit
mRNA
messenger Ribonukleinsäure
Na+
Natrium
NSAID
Nicht-steroidale Antiphlogistika
PBS
Phosphatsäure-gepufferte Saline
PG
Prostaglandine
RIA
Radioimmunoassay
RT-PCR
Reverse-Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion
TBX
Thromboxan
TNFα
Tumor Nekrose Faktor α
ZNS
Zentrales Nervensystem
Theoretischer Teil
1. Grundlagen
Zur Therapie rheumatischer Schmerzen verwendeten schon die Ägypter vor 3500 Jahren einen Aufguss aus getrockneten Myrte-Blättern. Rund tausend Jahre später empfahl
HIPPOKRATES den Saft der Pappel bei Augenentzündungen und den Einsatz von
Weidenrinde, um Geburtsschmerz und Fieber zu lindern. Alle diese Heilmittel enthalten
Salicylate. CELSIUS beschrieb 30 v.Chr. Rubor (Rötung), Calor (Wärme), Dolor
(Schmerz) und Tumor (Schwellung) als Charakteristika der Entzündung und therapierte
sie mit Extrakten aus Weidenblättern.
Im Römischen Reich - zu Zeiten von PLINIUS dem Älteren, DIOSCORIDES und GALEN - wurde der Einsatz salicylathaltiger Pflanzen weiterentwickelt und die Weidenrinde bei leichten bis mittleren Schmerzen als Therapie der Wahl empfohlen. Auch in
China und anderen Gebieten Asiens wurden salicylathaltige Pflanzen therapeutisch angewandt. Im Mittelalter wurden Salicylate als Wundpflaster oder systemisch bei Dysenterie und menstruellen Schmerzen eingesetzt.
Der erste dokumentierte, klinische Einsatz der Weidenrinde fand 1763 in England statt.
Mit 1.8g getrockneter, zermahlener Weidenrinde therapierte Reverend STONE aus Oxfordshire erfolgreich das Fieber von über 50 Patienten. Er schloss seine Publikation mit
dem Wunsch, dass diese potente Substanz umfassend eingesetzt und getestet würde und
die Welt einen großen Nutzen aus der Wirkung ziehe [STONE 1763]. Die derzeitig
weltweite Produktion von 45000 Tonnen Aspirin im Jahr und ein durchschnittlicher
Verbrauch von 80 Tabletten pro Person übersteigen seine Vorstellungen sicherlich.
1859 wurde erstmals Salicylsäure synthetisch in Deutschland hergestellt. Der Vater von
Felix HOFFMAN, einem jungen Chemiker der Bayer AG, drängte seinen Sohn, eine
schmackhaftere Form des sehr bitteren Salicylates zu entwickeln, um sein Rheuma zu
therapieren. 1899 wurde Aspirin als praktische Möglichkeit präsentiert, den Organismus
mit der aktiven Substanz Salicylat zu versorgen [DRESER 1899].
Beinahe ein Jahrhundert später, am 10. Dezember 1980, erhielt Sir John VANE den
medizinischen Nobelpreis für die Erforschung des Wirkmechanismus von Aspirin auf
das Enzym Cyclooxygenase. Heute nimmt VANE aufgrund einer koronaren Herzerkrankung selbst regelmäßig das Medikament ein, dessen Effekte er vor 23 Jahren erfolgreich beschrieb.
1
1.1 Entzündung
Unsere Umwelt enthält eine Vielzahl mikrobiologischer, chemischer und physikalischer
Faktoren, die eine Gewebeschädigung provozieren können. Ihre Abwehr geschieht über
die angeborene, unspezifische und die erworbene, spezifische Immunität. Dies ist ein
wichtiger Schutzmechanismus unseres Organismus zur Erhaltung der funktionellen und
morphologischen Integrität. Eine Entzündung ist der örtlich begrenzte Abwehrprozess
einer Gewebeschädigung und besteht aus einer komplexen Reaktion des gefäßführenden
Bindegewebes, der Blutzellen und des Blutplasmas. Die schädigende Noxe führt zu
einer Alteration des Gewebes und zur Freisetzung von Substanzen, die die entzündliche
Reaktion auslösen und so zur Kardinalsymtomatik führen: Rötung durch Vasodilatation,
Gewebsschwellung durch entzündliches Exsudat, Erwärmung aufgrund vermehrter Gewebsdurchblutung und letztlich Schmerz durch Nervenreizung [CELSIUS / GALEN].
VIRCHOW (1821-1902) fügte die gestörte lokale Funktionsfähigkeit als fünftes Symptom hinzu.
Bakterien Noxen Ischämie Anaphylaxie
Gewebeschädigung
Entzündungsmediatoren
Akute Entzündung
vaskuläre & zelluläre Reaktion
Ödem
Chronische Entzündung
zelluläre Reaktion
Exsudat
Lyse des Exsudats
Granulationsgewebe & Fibrose
Regeneration des
Parenchyms
Restitutio ad integrum
Narbe
Abb. 1.1 akute und chronische Entzündung [nach BÖCKER et al. 1997]
2
Das Bindeglied zwischen Gewebeschädigung und entzündlicher Reaktion stellt eine
Gruppe von chemischen Substanzen dar, die als Entzündungsmediatoren bezeichnet
werden. Sie regulieren in Abhängigkeit von Art und Intensität der Schädigung alle entzündlichen Reaktionen. Sie steuern zu Beginn der Entzündung die vaskuläre Reaktion
und modifizieren später auch die zelluläre Phase mit der Emigration von Phagozyten.
Viele der Entzündungsmediatoren werden von den am inflammatorischen Geschehen
beteiligten Zellen freigesetzt. Die zellulären Mediatoren liegen entweder präformiert in
zytoplasmatischen Vakuolen vor oder sie werden auf den Entzündungsreiz hin in entsprechenden Enzymkaskaden neu synthetisiert [BÖCKER et al. 1997].
1.2 Enzyme und Botenstoffe
1.2.1 Cyclooxygenase (COX)
Das COX-Enzym katalysiert den ersten Schritt in der Umwandlung von Arachidonsäure
zu Prostaglandinen und Thromboxan [VANE 1971]. Gemeinsam mit der Peroxidase,
die der weiteren Prostanoid-Verarbeitung dient, bildet sie die Prostaglandin-Endoperoxid-Synthase (PGHS) [HEMLER und LANDS 1976].
Lange Zeit nahm man an, es gäbe nur eine Form der COX, deren Produkte sowohl für
die physiologische Homöostase, als auch für die Vermittlung akuter Entzündung verantwortlich seien. Diese heutige COX-1-Form wurde 1976 erstmals isoliert [HEMLER
und LANDS] und zwölf Jahre später erfolgreich geklont [DE WITT und SMITH 1988].
Es wurde angenommen, dass in den einzelnen Geweben eine konstante Menge dieser
COX ausgeschüttet wurde und im Entzündungsfall vermehrt Vorstufen von Prostaglandinen freigesetzt würden. Zwei experimentelle Beobachtungen widerlegten jedoch dieses Konzept: Nicht die Menge an PG-Vorstufen stieg im entzündlichen Geschehen an,
sondern der Gehalt an COX. Zudem ließ sich diese Zunahme durch Kortikosteroide
verhindern [FU et al. 1990 / MASFERRER et al. 1992 / O’BANION et al. 1991].
Den induzierbaren Charakter des Isoenzyms und damit die Existenz einer COX-2 zeigten RAZ et al., als sie durch IL1β-Stimulation in Fibroblasten [1989] und durch Endotoxin in Monozyten eine Aktivitätszunahme der COX hervorriefen [1990]. Im gleichen
Jahr demaskierte MASFERRER durch eine Adrenalektomie die COX-Aktivität in vivo.
XIE und KUJUBU fanden mit einem Molekularprogramm, das induzierbare FrühePhase-Gene identifiziert [1991], ein Gen, dessen Sequenz mit dem bekannten COX-1Enzym im Wesentlichen übereinstimmte und klonten erfolgreich die COX-2-Isoform.
3
1.2.1.1 Struktur und Isoformen
Isoenzyme sind Enzyme unterschiedlicher Aminosäuresequenz, die dieselbe Reaktion
katalysieren. In der Natur sind sie weit verbreitet. Sie setzen die gleichen Substrate um,
jedoch mit unterschiedlicher Aktivität. Unterschiedlich ist auch ihr Verhalten gegenüber
Aktivatoren, Inhibitoren, und Substratanaloga [LÖFFLER 1999]. Die Isoenzyme der
COX weisen ein unterschiedliches genetisches Expressionsprofil auf, deutlich divergierende kinetische Eigenschaften, eine variierende Lokalisation in subzellulären Kompartimenten und abweichende Interaktionen mit anderen Enzymen [SMITH et al. 2000 /
FITZPATRICK und SOBERMAN 2001]:
Tab. 1.1 Struktur, Distribution und Regulation der COX-Isoformen [nach PAIRET und
ENGELHARDT 1996 / O’BANION 1999]
COX-1
COX-2
DNA
Chromosome 9 / 22 kB
Chromosome 1 / 8,3 kB
mRNA
2,8 kB
4,5 kB
Protein
72 kD / 599 Aminosäuren
72 kD / 604 Aminosäuren
Homologie
75% Homologie im Menschen: Konservierung der Hämoglobin-Bindungsstelle, des
aktiven Zentrums und der Glykosylierungsseiten
vorwiegend konstitutiv
vorwiegend induziert, aber auch konstitutiv
2-4facher Anstieg durch Stimuli
10-20facher Anstieg durch Stimuli
subzelluläre
Lumenseite des Endoplasmatischen
Lumenseite der perinukleären Membran
Lokalisation
Retikulums
gewebliche
in den meisten Geweben, vor allem
konstitutiv in ZNS, Nieren, Hoden, Trachea
Lokalisation
in Thrombozyten, Endothelzellen,
inflammatorisch induziert in Makrophagen /
Magen und Niere
Monozyten, Synoviozyten, Chondrozyten,
Regulation
Fibroblasten, Endothelzellen
Unterschiede
Das aktive Zentrum der COX-2 ist größer als das der COX-1.
Glukokortikoide hemmen die Expression von COX-2, nicht aber von COX-1.
Die Gene für COX-1 und COX-2 sind auf den menschlichen Chromosomen 9 bzw. 1
lokalisiert [KRAEMER et al. 1992 / FLETCHER et al. 1992] Die Anordnung von
Introns und Exons ist bei beiden Genen identisch, lediglich die Exons 1 und 2 der COX1, die den Startpunkt für die Translation sowie das Signalpeptid enthalten, sind bei
COX-2 in einem Exon kondensiert. Das COX-2-Gen hat insgesamt kleinere Introns und
ist nur 8kb groß, im Vergleich zu 22kb der COX-1. Das Merkmal der kleineren Introns
4
ist typisch für Akute-Phase-Gene und passt zu einer schnellen Transkription und
mRNA-Verarbeitung [CROFFORD 1997].
Abb. 1.2 Struktur der COX-Gene [nach CROFFORD 1997]
Auch die Promoterregion der beiden Gene unterscheidet sich signifikant und spiegelt
den physiologischen Zustandsbereich der beiden Isoformen auf molekularbiologischer
Ebene wieder: Typisch für ein so genanntes „Housekeeping Enzyme“, enthält der Promoter der COX-1 keine TATA-Box und auch keine nachweisbaren Regionen für induzierbare Transkription [SMITH et al. 1995]. Der COX-2-Promoter hingegen beinhaltet
eine TATA-Box, sowie einige Transkriptions-Elemente, die bei hoch regulierbaren Genen üblich sind. Während Lipopolysaccharide, Wachstumsfaktoren und proinflammatorische Cytokine (IL1β, TNFα) im Akutfall COX-2 induzieren, bremsen Glukokortikoide,
IL4, IL13 und IL10 die Genexpression. [APPLEBY et al. 1994 / LEE et al. 1992 / ONOE
et al. 1996 / NIIRO et al. 1997 / XIE et al. 1991 / KUJUBU et al. 1992]. Die Induktion
durch Tumor-Promoter verdeutlicht die Relevanz der COX-2 in der Kanzerogenese.
[SHENG et al. 2000]
Abb. 1.3 Struktur der COX-Promoter [nach CROFFORD 1997]
Im Unterschied zur mRNA der COX-1 enthält die COX-2-mRNA am 3’ Ende ihrer
Sequenz eine repetitive Region, die in der Translationsphase nicht übersetzt wird. Vermutlich destabilisiert sie die mRNA, inhibiert die Translation und degradiert rapide das
Transkript [RISTIMAKI et al. 1994 / DIXON et al. 2000]. Ein Verlust dieser Region
5
aufgrund von Mutationen oder Konformationsänderungen führt zu einer Überexpression
der COX-2 und wird als maßgeblicher Faktor in der Kanzerogenese von malignen Kolon-Erkrankungen diskutiert [TSUJII et al. 1998].
Obwohl auf DNA- und RNA-Ebene deutliche Unterschiede in Struktur und Regulation
der COX-Gene auffallen, sind Proteinstruktur und enzymatische Funktion der beiden
Formen erstaunlich ähnlich. Das Proteinprodukt zeigt Abweichungen im Bereich des Nterminalen Signalpeptides und eine Insertion von 18 Aminosäuren am C-terminalen
Ende des COX-2-Polypeptides. Die übrige Kernsequenz ist jedoch zu 75% identisch
und alle Anteile, die als essentiell für die katalytische Aktivität angesehen werden, sind
konserviert [SMITH und DEWITT 1995].
Die allgemeine Struktur besteht aus drei großen Domänen, die auch als „folding units“
bezeichnet werden: Am N-terminalen Ende des Enzymes befindet sich die Bindungsstelle für diverse Wachstumsfaktoren, die „epidermal growth factor-like domain“. Anschließend befindet sich das „membrane-binding motif“, ein Membran-BindungsBereich und schließlich am C-terminalen Ende die „enzymatic domain“, die das aktive
Zentrum mit COX- und Peroxidase-Aktivität enthält. [PICOT et al. 1994] Diese beiden
katalytischen Regionen sind im selben dimeren Proteinmolekül vereint [VANE et al.
1998 / SMITH et al. 2000], aber räumlich deutlich voneinander getrennt [EVERTS
2000].
Beide Isoenzyme sind membranassoziiert, so dass aus beschädigten Membranen freigesetzte Arachidonsäure an der membranseitigen Öffnung des größtenteils hydrophoben
Enzymkanals angesaugt und um die Haarnadelkurve gedreht werden kann [HAWKEY
1999]. Generell binden alle Substrate an eine Bindungsstelle im mittleren Teil des langen Kanals zwischen Membran-Verbindung und Protein-Innerem. Hier werden zwei
Sauerstoffmoleküle eingefügt und ein freies Radikal freigesetzt, wodurch der für die PG
charakteristische Ring aus fünf Kohlenstoffatomen entsteht. Dieser chemische Vorgang
hat den Enzymnamen der „Cyclo-oxy-genase“ geprägt. COX-1 und COX-2 haben eine
vergleichbare Umsatzgeschwindigkeit Vmax und Michaelis-Konstante Km für Arachidonsäure (20:4 ω6); die COX-2 ist jedoch durch ihren „flexibleren“ Kanal effizienter
bei alternativen Substraten [SMITH und DEWITT 1995].
Der Einsatz fluoreszierender Arachidonsäure zeigte, dass NSAID die COX-1 etwa in
der Mitte des Kanals blockieren [LANZO et al. 1998]. Die Aminosäuren Arginin (an
Position 120), Tyrosin (355) und Glutamat (524) markieren diese Bindungsstelle, wobei
Tyrosin sterisch den Zugang zum aktiven Zentrum behindert [KURUMBAIL et al. 1996
6
/ LOLL et al. 1996]. Pharmakologisch interessant ist das Arginin, das die einzig positiv
geladene Komponente im Bindungskanal ist. Die Röntgenkristallographie der dreidimensionalen Struktur lässt darauf schließen, dass sowohl Arachidonsäure, als auch Carboxylat-haltige NSAID, über Wasserstoffbrücken an dieses polare Arginin binden und
so eine Blockade bewirken [PICOT et al. 1994 / LUONG et al. 1996].
Abb. 1.4 Schematische Darstellung der hydrophoben Bindungskanäle von COX-1
(links) und COX-2 (rechts) mit den gebundenen Inhibitoren Aspirin bzw. Celecoxib
[LOLL et al. 1995 / KURUMBAIL et al. 1996 / FITZGERALD 2003]
Der COX-Bindungskanal enthält eine so genannte „Seitentasche“, die bei den beiden
Isoformen durch unterschiedliche Aminosäuren begrenzt wird: Bei der COX-2 handelt
es sich um Valin (523), Arginin (513) und Valin (434). Valin (523) bindet an eine
Schwefelgruppe der selektiven COX-2-Inhibitoren und ermöglicht so die spezifische
Inhibition von nur der COX-2. Bei der COX-1 sind an entsprechenden Positionen die
Aminosäuren Isoleucin (523), Histidin (513) und Isoleucin (434) positioniert [WONG et
al. 1997 / GUO et al. 1996 / KURUMBAIL et al. 1996]. Das Isoleucin (523) ist um eine
Methylgruppe größer, als das entsprechende Valin (523) der COX-2, und kann somit
den Zugang zur Seitentasche zu versperren [GARAVITO und DEWITT 1999]. Der gezielte Ersatz einer einzigen Aminosäure bewirkt also den kritischen Unterschied für die
Selektivität pharmakologischer Inhibitoren [LUONG et al. 1996 / GIERSE et al. 1996].
7
1.2.1.2. Lokalisation und Effekte
Arachidonsäure
COX-1
Homöostase:
Schleimhaut-Schutz
Plättchen-Aggregation
Renaler Blutfluss
Cyclooxygenase
Prostaglandin G2
COX-2
Pathophysiologie:
Entzündung, Fieber
Schmerz
Ischämie
M. Alzheimer
Kanzerogenese
Adaptation:
Renale Renin-Sekretion
Wund- & Ulkusheilung
Weibliche Reproduktion
Knochen-Metabolismus
Gefäß-Schutz
Peroxidase
Prostaglandin H2
Prostglandine
Prostacyclin
Thromboxane
Abb. 1.5 Rolle der COX-Enzyme [nach HINZ und BRUNE 2002]
Trotz vieler struktureller Gemeinsamkeiten scheinen COX-1 und COX-2 als zwei separate Enzymsysteme zu funktionieren: Während die COX-1 im endoplasmatischen Retikulum lokalisiert ist, wird die COX-2 sowohl dort, als auch in der Kernmembran exprimiert [MORITA et al. 1995].
Verallgemeinert gesagt, handelt es sich bei der COX-1 um ein konstitutiv vorhandenes
„Housekeeping Enzyme“, das in fast allen Geweben des menschlichen Organismus vorkommt und physiologische Reaktionen vermittelt. Die COX-2-Isoform wird hingegen
von Zellen exprimiert, die am Entzündungsgeschehen beteiligt sind und katalysiert die
Synthese von Prostanoiden bei pathologischen Vorgängen. Heute weiß man jedoch,
dass die These von der „guten“ COX-1 und der „schlechten“ COX-2 die Vorgänge in
vivo nur unzureichend wiedergibt [FITZGERALD und PATRONO 2001].
Während die COX-2 zu Beginn der 90er Jahre ausschließlich als Produzent pathologischer Prostanoide angesehen wurde, belegen neuere Studien, dass die COX-2 auch eine
bedeutende Rolle in diversen physiologischen Prozessen spielt [VANEGAS und
SCHAIBLE 2001 / O’BANION 1999]. Ebenso wurde eine vermehrte COX-1-Expres-
8
sion in nicht physiologischen Situationen, wie z.B. nach Läsion eines Nerven, beobachtet [TO et al. 2001 / HARTNER et al. 2000 / SCHWAB et al. 2000].
Die beiden Isoenzyme greifen auf getrennte Arachidonsäure-Reserven zurück, die in
Antwort auf unterschiedliche zelluläre Stimuli mobilisiert werden [REDDY und
HERSCHMAN 1994 / MURAKAMI et al. 1994]. Die von der COX-2 produzierten
Stoffwechselprodukte regulieren über eine rückkoppelnde Schleife und Interaktion mit
nukleären Rezeptoren die Expression des Enzymes [FORMAN et al. 1995 / DEVCHAND et al. 1996 / HINZ et al. 2000].
Inflammatorisch:
Das Tiermodell der inflammatorischen Arthritis gibt Aufschluss über die Expression
von COX-2 bei akuter und chronischer Entzündung [SANO et al. 1992]. Immunohistochemisch ließen sich Synoviozyten des Gelenkinnenraums, vaskuläre Endothelzellen,
infiltrierende Monozyten, Chondrozyten, subchondrale Osteoblasten und angrenzendes
Knochenmark anfärben. Eine Behandlung des Gewebes mit Dexamethason senkte erwartungsgemäß die COX-Expression. Ein Anstieg der COX-1-mRNA konnte durch
RT-PCR-Analysen nicht festgestellt werden [SANO et al. 1992]. Beide Beobachtungen
belegen, dass die angestiegene Expression in vivo überwiegend auf eine vermehrte
COX-2-Freisetzung zurückzuführen ist. Im Tiermodell der adjuvant induzierten Arthritis stieg die mRNA von COX-2 - nicht aber von COX-1 - zeitgleich mit der klinisch
nachweisbaren Pfotenschwellung an. Ein verabreichter selektiver COX-2-Inhibitor verhinderte das Pfotenödem zu 80-85 % und Dexamethason zu 95-100 % [ANDERSON et
al. 1996].
In explantiertem humanem Synovialisgewebe konnte ebenfalls die Regulation der
COX-Enzyme durch physiologische Faktoren nachgewiesen werden: Grundsätzlich
wurden beide COX-Isoformen exprimiert. Der Zusatz von IL1β oder Phorbolester stimulierte die COX-2-Expression, Dexamethason und IL4 antagonisierten diese Entwicklung
und inhibierten die spontane PGE2-Produktion in den frisch isolierten Synoviozyten.
Dieselbe Behandlung hatte keinerlei Einfluss auf den COX-1-Spiegel im Gewebe [SUGIYAMA et al. 1995 / CROFFORD et al. 1994 / HULKOWER et al. 1994]. Die Wirkung von IL1β und IL4 verdeutlichte die Rolle anti-inflammatorischer Cytokine als regulierende Faktoren der Genexpression [ONOE et al. 1996].
In menschlichem Gewebe war die COX-2 ebenso in verschiedenen Zelltypen des Gelenkbereiches nachweisbar, wie im Tiermodell. Die Expression schien einheitlichen
9
Regulationsmechanismen zu unterliegen [RISTIMAKI et al. 1994 / O’SULLIVAN et
al. 1992 / WILBORN et al. 1995 / GENG et al. 1995 / ONOE et al. 1996].
Bei der Untersuchung von rheumatisch, osteoarthrotisch oder traumatisch verändertem
humanem Synovialisgewebe fand sich ein deutlicher COX-2-Gehalt im rheumatischen
Gewebe. Das Gewebe der Osteoarthrose-Patienten zeigte eine Immunoreaktivität mit
leicht schwächerem Signal; in der traumatischen Kontrollgruppe war die Färbung jedoch nur sehr gering ausgeprägt. Ausmaß und Intensität der Anfärbung korrelierten mit
dem Grad der monozytären Gewebsinfiltration, die als Maß für die synoviale Entzündung galt [SANO et al. 1992].
Zentralnervös:
Eine Entzündung sorgt am Ort ihrer Entstehung für eine gesteigerte Expression von
COX-2 und durch ihre Syntheseprodukte zu einer Stimulierung der peripheren nozizeptiven Nervenenden, sowie zu einer lokalen Schmerz-Hypersensitivität.
Im zentralen Nervensystem sind basal beide Isoformen nachweisbar: COX-1 und COX2 können augenblicklich auf eine Freisetzung von Transmittern reagieren und zentral
Prostanoide synthetisieren [YAKSH et al. 2001 / TEGEDER et al. 2001]. In den vergangenen Jahren wurde immer deutlicher, dass die PG nicht nur periphere Nozizeptoren
erregen, sondern auch im ZNS agieren und eine Hyperalgesie verursachen können. Die
experimentelle zentrale Administration von COX-Inhibitoren zeigte, dass diese Substanzen vor allem im Hinterhorn wirkten und so eine Analgesie hervorriefen [TASSORELLI et al. 2003]. Im Hinterhorn des Rückenmarks werden die nozizeptiven Signale
auf das zweite Neuron übertragen und anschließend an höhere Zentren des ZNS weitergegeben. Die Schmerzempfindung geht dann gesammelt im Kortex ein. COX-2 ist konstitutiv im Hinterhorn vorhanden und wird bei traumatischer oder inflammatorischer
Belastung in den entsprechenden sensorischen Segmenten hoch reguliert. Diese Induktion erleichtert die Übertragung des nozizeptiven Inputs. Auf Rückenmarksebene erzeugtes PGE2 spielte eine wesentliche schmerzvermittelnde Rolle, indem es die spinalen
Neurone direkt depolarisierte und so die Erregung bildete [BABA et al. 2001]. Dass es
sich bei den beschriebenen zentralen Vorgängen um ein COX-2-vermitteltes Geschehen
handelte, wurde 1998 durch eine Studie belegt, in der der selektive COX-2-Inhibitor
Celecoxib den inflammatorisch erhöhten PG-Spiegel in cerebrospinaler Flüssigkeit
deutlich senkte, während der COX-1-selektive Inhibitor SC-560 keine signifikante Wirkung zeigte [SMITH et al.]. Diese Beobachtungen wurden durch SAMAD et al. unter10
mauert, die zeigten, dass nach peripherer Entzündung die COX-2-Expression in Neuronen des Rückenmarks und anderen Teilen des ZNS großflächig induziert wurde [2001].
Als Folge der peripheren Entzündung induzierte vor allem das in diesem Zusammenhang sekretierte IL1β die zentrale COX-2. Entsprechend agierende Hemmstoffe - wie ein
Inhibitor des Interleukin-Converting-Enzyms oder ein selektiver COX-2-Inhibitor verminderten sowohl die zentrale PGE2-Induktion, als auch die mechanische Hyperalgesie [SAMAD et al. 2001].
Kardiovaskulär:
Ebenso wie in der Synovialis entzündlicher Gelenke, werden auch in artherosklerotischen Plaques sowohl COX-1 als auch COX-2 exprimiert [CROFFORD et al. 1994 /
SCHONBECK et al. 1999]. Im Gefäßendothel wirkt die COX durch die Produktion von
Prostacyclin anti-thrombogenetisch und vasodilatatorisch. Prostacyclin hemmt zudem
die Aktivierung und Aggregation von Leukozyten. Als „Gegenspieler“ führt das in den
Thrombozyten produzierte Thromboxan A2 zu einer Thromboaggregation und Vasokonstriktion [FUNK et al. 1991 / WHITTLE et al. 1980 /MONCADA et al. 1976].
Adventitia
Vasodilatation
Muskularis
Vasokonstriktion
Endothel
PKA
cAMP
+
PGI2
AC
G
Ca2+
_
IP3
TXA2
PLC
IP
TP
G
Abb. 1.6 Regulation des peripheren Gefäßtonus durch Prostacyclin PGI2 und Thromboxan TXA2 [nach HINZ und BRUNE 2002]
Die vaskuläre Protektion durch die COX-2 scheint ein adaptiver Prozess zu sein, denn
laminäre Scheerkräfte im Gefäß und Komponenten der artherogenen Lipoproteine führten zu einer Hochregulierung des Isoenzyms [TOPPER et al. 1996 / ZEMBOWICZ et
al. 1995]. Die genaue Rolle der COX-2 in der Artherosklerose ist jedoch immer noch
11
nicht geklärt. PRATICO et al. zeigten im Tiermodell, dass die Inhibition beider Isoenzyme das Auftreten einer Artherosklerose verzögerte [2001]. Auch COX-1-stämmige
PG trugen also offensichtlich zur artherosklerotischen Genese bei.
Konsequenterweise sollte der Einfluss von NSAID auf die Progression von Plaques im
Menschen evaluiert werden. In klinischen Studien an gesunden Probanden führten selektive COX-2-Inhibitoren zu einer verminderten systemischen Produktion von Prostacyclin [CATELLA-LAWSON et al. 1999 / McADAM et al. 1999]. Die COX-1vermittelte Thromboxansynthese wurde dadurch nicht tangiert und es kam zu einem
unvorteilhaften Gleichgewicht der beiden Vasomodulatoren. Publizierte klinische Studien divergieren in diesem Zusammenhang: Während in der CLASS-Studie (Celecoxib
Long-Term Arthritis Safety Study) keine Differenz im Auftreten kardiovaskulärer Ereignisse unter Celecoxib oder NSAID (Ibuprofen und Diclofenac) beobachtet wurde
[SILVERSTEIN et al. 2000], hatten die Patienten in der VIGOR-Studie (Vioxx
Gastrointestinal Outcome Research) unter Rofecoxib ein vierfach erhöhtes Risiko, einen
Myokardinfarkt zu erleiden, als die Kontrollgruppe unter Naproxen [BOMBARDIER et
al. 2000]. Da jedoch beide COX-2-selektiven Komponenten eine vergleichbare Hemmung der Prostacyclin-Synthese bewirken sollen, ohne dabei die Produktion von
Thromboxan zu beeinflussen, basiert die Diskrepanz der kardiovaskulären Endpunkte
vermutlich auf dem Einsatz unterschiedlicher Studienprotokolle und NSAID [FITZGERALD et al. 2000]: VIGOR wurde an Patienten mit rheumatischer Arthritis durchgeführt, die nachgewiesenermaßen ein erhöhtes Risiko für kardiovaskuläre Ereignisse haben, während CLASS ausschließlich Osteoarthrose-Patienten einbezog, deren kardiovaskuläres Risikoprofil sich nicht signifikant von dem der Normalbevölkerung unterscheidet [MUKHERJEE et al. 2001].
Gastrointestinal:
Die Aufgaben der beiden Isoenzyme im Gastrointestinaltrakt lassen sich grob drei Bereichen zuordnen: Physiologischer Normalzustand, Inflammation und Ulkus. Sowohl in
Ruhe, als auch im Entzündungsfall, stimuliert die COX-1 als „Housekeeping Enzyme“
die Sekretion von Schleim und Bikarbonaten [WALLACE et al. 1999]. Prostaglandine,
die von diesem Isoenzym synthetisiert werden, werden als hauptverantwortlich für die
Zytoprotektion im Gastrointestinaltrakt angesehen, obwohl auch die COX-2 physiologisch in Magenmukosa [ZIMMERMANN et al. 1998 / ISEKI 1995]. Die COX-2 ver-
12
mittelt bei Entzündung ebenfalls eine adaptive Zytoprotektion, so dass die betroffenen
Zellen besser topischen Irritationen widerstehen können [WALLACE et al. 1999].
Mit diesem Konzept stimmen die Beobachtungen der CLASS- und VIGORStudiengruppen überein, in denen die beiden selektiven COX-2-Inhibitoren Celecoxib
und Rofecoxib signifikant weniger Nebenwirkungen - wie Perforationen, Ulkus und
Blutungen - im oberen Gastrointestinaltrakt hervorriefen, als konventionelle NSAID
[SILVERSTEIN et al. 2000 / BOMBARDIER et al. 2000]. Die Daten weisen auf ein
deutlich verbessertes Risiko-Nutzen-Profil der selektiven COX-2-Inhibitoren bezüglich
gastrointestinaler Sicherheit hin und machen das Auftreten eines Ulkus oder die daraus
resultierenden Komplikationen weniger wahrscheinlich. Dennoch sind die neuen Substanzen immer noch mit einer möglichen Dyspepsie assoziiert, die zwar seltener auftritt,
als bei den NSAID, aber dennoch signifikant häufiger als unter Placebo [LANGMAN et
al. 1999].
Eine weitere bedeutende Entdeckung der letzten Jahre war die Beobachtung, dass COX2 die Heilung gastrointestinaler Ulzera beeinflusst. Im Falle eines Magengeschwürs
übernahm die COX-2 eine reparierende Funktion und erreichte durch Stimulation von
Angiogenese, Zellproliferation und Granulationsbildung eine schnellere Wundheilung
[WALLACE et al. 1999]. Übereinstimmend damit wurde eine induzierte COX-2Expression am Rand von ulzeriertem Gewebe nachgewiesen [MIZUNO et al. 1997].
Selektive COX-2-Inhibitoren verzögerten im Tiermodell deutlich die Abheilung von
Ulzera [SCHMASSMANN 1998]. Konsequenterweise muss untersucht werden, ob in
Patienten mit einem Ulkus durch NSAID eine effektive Ulkus-Abheilung erfolgt, wenn
sie auf selektive COX-2-Inhibitoren umgestellt werden. JONES et al. zeigten, dass sowohl selektive COX-2-Inhibitoren, als auch non-selektive NSAID die Angiogenese
durch einen direkten Effekt auf die Endothelzellen hemmen [1999]. Auch beim Heliobacter-Pylori-verursachten Ulkus stieg der Gehalt an COX-2 und sank nach erfolgreicher Eradikation wieder ab. Der erhöhte COX-2-Gehalt schien also eine direkte Antwort auf die bakterielle Infektion zu sein [McCARTHY et al. 1999].
Urogenital:
HARRIS et al. belegten die Existenz der COX-Isoformen in den Nieren erwachsener
Ratten [1994]. Generell nahm der COX-2-Gehalt mit zunehmendem Alter ab [NANTEL
et al. 1999].
13
Die COX-2-Form scheint einen Einfluss auf den Salzhaushalt des Organismus zu haben, da sie in Strukturen exprimiert wird, die den renalen Blutfluss und die Freisetzung
von Renin regulieren, wie die Macula densa des juxtaglomerulären Apparates und die
aufsteigende Henle-Schleife [HARRIS et al. 1994]. Das zirkulierende Blutvolumen und
die Gefäßkontraktilität beeinflussten die Expression der COX-2 und nach Salzrestriktion stieg der Gehalt an COX-2-Protein und mRNA in der Macula densa deutlich an
[HARRIS et al. 1994]. Zusätzlich zu den renovaskulären Effekten verminderte das produzierte PGE2 in der aufsteigenden HENLE-Schleife die Rückresorption von Natrium
und Chlorid. Zudem senkte es die osmotische Wirkung von Vasopressin in den Sammelgängen, so dass es zu einem gesteigerten Urinfluss kam [STOKES 1979 / ORLOFF
und ZUSMAN 1978].
Eine pharmakologische Inhibition des Angiotensin Converting Enzymes (durch ACEHemmer), sowie des Angiotensin-II-Rezeptors (durch ATII-Rezeptorblocker) führte
ebenfalls zu einer gesteigerten COX-2-Expression, sowohl in Tieren mit Salzrestriktion,
als auch in der Kontrollgruppe [HARRIS et al. 2000]. Die Einnahme selektiver COX-2Inhibitoren ging mit einer verminderten Sekretion von Renin einher [HARRIS 2003 /
TRAYNOR et al. 1999]. Die Aktivierung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems
schien also die COX-2-Expression in der Nierenrinde zu hemmen. Klinische Studien
zeigten, dass auch selektive COX-2-Inhibitoren durch Hemmung der renalen Wasserund Salzausscheidung periphere Ödeme verursachten und beim Risikopatienten einen
Hypertonus provozierten bzw. verschlechterten [WHELTON et al. 2000 / CATELLALAWSON et al. 1999 / ROSSAT et al.1999].
Da beide Isoformen im renalen Gefäßsystem vorkommen, stellte sich die Frage, welche
für die gesteigerte Produktion gefäßerweiternder PG bei Volumenmangel zuständig ist
und so den renalen Blutfluss gewährleistet [PATRONO und DUNN 1987]. Auch wenn
die Salz-Restriktion selektiver COX-2-Inhibitoren und traditioneller NSAID in gesunden Probanden vergleichbar war, führten in klinischen Studien bisher nur NSAID zu
einer signifikanten Senkung der glomerulären Filtrationsrate [CATELLA-LAWSON et
al. 1999]. Ebenso wie NSAID verursachten allerdings auch die neuen selektiven COX2-Inhibitoren eine signifikante Hyperkaliämie [BRATER et al. 2001 / WHELTON 2000
/ WHELTON 1999] Insgesamt lässt sich sagen, dass auch die neue Generation der
COX-2-Inhibitoren die Niere nicht mit Nebenwirkungen verschont und deshalb bei prädisponierten Patienten vorsichtig eingesetzt werden sollte.
14
1.2.2 Prostaglandine (PG)
PG sind Derivate der Arachidonsäure und äußerst wirksame zelluläre Entzündungsmediatoren. Sie werden bei Schädigung in praktisch allen kernhaltigen Zellen gebildet. Sie
leiten sich aus hoch ungesättigten, langkettigen C20-Fettsäuren ab, die in großen Mengen in den Phospholipiden der Zellmembran vorkommen. Inzwischen ist der Stoffwechselweg, der zur Generation von PG führt, bis ins kleinste Detail beleuchtet worden.
Phospholipid-Membran
Phospholipase A2
COOH
CH3
Arachidonsäure
Cyclooxygenase
PGG2
PGH2
COOH
O
Isomerasen
O
COOH
CH3
O
CH3
HO
PGI2
OH
Niere
Gehirn
Thrombozyten
Endothelium
TXA2
Niere
Thrombozyten
Makrophagen
vaskuläre
Muskulatur
PGD2
Gehirn
Atemwege
Mastzellen
Lymphozyten
Eosinophile
PGF2a
OH
PGE2
Uterus
Gehirn
Atemwege
Niere
vaskuläre
vaskuläre
Muskulatur Muskulatur
Auge
Thrombozyten
Abb. 1.7 Prostanoid-Biosynthese [nach FITZGERALD und PATRONO 2001]
Der initiale Schritt in der Produktion von PG wird von der Phospholipase A2 katalysiert,
die Arachidonsäure aus Membranlipiden freisetzt. Die Phospholipasen A sind eine
Großfamilie diverser Enzyme mit mehr als dreizehn aktiven Isoformen. Sie unterscheiden sich in Substratspezifität, pH-Sensitivität, Expressionsmuster, Regulierung und subzellulärer Lokalisation and werden gemäß ihrer Struktur und ihres Calciumbedarfs klassifiziert [SIX und DENNIS 2000]. Von besonderer Bedeutung sind die sekretorischen
Phospholipasen, die experimentell und bei entzündlichen Erkrankungen rapide freigesetzt werden können [TOUQUI und ALAOUI-EL-AZHER 2001].
15
Im Verlauf der Prostanoid-Synthese wird die freigesetzte Arachidonsäure alternativ
über die Lipoxygenase oder die Cyclooxygenase verstoffwechselt. Hierbei entstehen
Leukotriene bzw. PG, Prostacyclin und Thromboxan. Das erste Reaktionsprodukt der
Cyclooxygenase COX bzw. der Prostaglandin-Endoperoxid-H2-Synthetase (PGHS) ist
das PGH2, das dann von gewebsspezifischen Enzymen in Prostacyclin PGI2, die
Prostaglandine PGE2, PGD2 und PGF2 sowie Thromboxan TXA2 umgewandelt wird
[SMITH et al. 2000 / GARAVITO und DeWITT 1999]. Es entsteht so eine Reihe bioaktiver Komponenten, die dann ihre biologische Wirkung über spezifische Rezeptoren
ausüben. Die Rezeptoren bestehen aus sieben transmembranösen Domänen und werden
- gemäß dem zugehörigen prostanoiden Liganden - als DP-, EP-, FP-, IP- und TPRezeptoren klassifiziert [MINAMI et al. 2001 / NARUMIYA et al. 1999 / SUGIMOTO
2000 / BREYER et al. 2001]. Die Rezeptoren sind über G-Proteine an Effektoren wie
die Adenylatzyklase oder Phospholipase C gekoppelt [GOETZL et al. 1995 / COLEMAN et al. 1994].
Die enzymatische Metabolisierung der Arachidonsäure durch die COX produziert mehrere Komponenten, die in ihrer Gesamtheit als Prostanoide bezeichnet werden. Sie umfassen in ihrer Länge 20 Kohlenstoffatome („Eicosanoide“) und werden bei einer Fünfring-Struktur „Prostaglandine“ und bei einem Sechsring „Thromboxane“ genannt. Die
numerische Ergänzung „2“ bezieht sich auf die beiden Doppelbindungen in den Seitenketten. Eicosanoide haben eine kurze Halbwertzeit und übernehmen als lokale Hormone
oder Mediatoren wichtige Funktionen unter physiologischen, sowie unter pathologischen Bedingungen [McGEER et al. 1996]. Sie vermitteln Schlüsselfunktionen in vielen
Prozessen, inklusive der zellulären Antwort auf Verletzung und entzündungsfördernde
Cytokine, der Fiebergenese, der Modulation der Stressreaktion, des Schlaf-WachRhythmus, der Regulation des zerebralen Blutflusses, sowie der peripheren und zentralen Kontrolle der Schmerzwahrnehmung [O’BANION 1999]. In der Zelle wirken PG
und Leukotriene als „second messenger“ und vermitteln die Aktivierung von KaliumKanälen, Makrophagen oder die Adhäsion. Im Gewebe halten sie homeostatische Funktionen wie die Zytoprotektion der Magenschleimhaut und den renalen Gefäßtonus aufrecht [DI MARZO 1995]. Eine konstante Neusynthese von PG durch die konstitutiv
exprimierte COX ist in vielen Geweben für die Homöostase notwendig. Bei entsprechender inflammatorischer Stimulation kann die PG-Synthese innerhalb von Minuten
hoch reguliert werden [FUNK 2001]. Pro-inflammatorische Signale greifen hierbei
16
transkriptionell und post-translationell in den Metabolismus ein und führen so zu einem
frühen, massiven und anhaltendem Anstieg des Prostanoid-Gehaltes.
Schon bald nach der initialen Isolierung von Prostanoiden wurde gezeigt, dass diese
Substanzen inflammatorische und immunologische Reaktionen des Organismus beeinflussen und dass sich durch ihren künstlichen Zusatz die Kardinalzeichen der Entzündung, sowie ein gesteigertes Schmerzempfinden, reproduzieren lassen. Eine periphere
Inflammation erhöht den lokalen Prostanoid-Spiegel und trägt damit direkt zur Entzündung- und Schmerzentstehung bei [TILLEY 2001]. Es zeigte sich jedoch, dass durch
die periphere Entzündung auch der zentrale Prostanoid-Gehalt erhöht wird und so wesentlich weitreichendere Änderungen in der Schmerzwahrnehmung bewirkt werden
[DIRIG und YAKSH 1999 / VANEGAS und SCHAIBLE 2001]: Durch die periphere
Aktivierung des Rezeptors von PGE2 kommt es zu einer Proteinkinase-A-vermittelten
Phosphorylierung von Natriumkanälen und anderen Rezeptoren in den terminalen Bereichen nozizeptiver Fasern. Die Erregbarkeit der Nozizeptoren steigt, die auslösende
Schmerzschwelle sinkt und die Wirkung schmerzerzeugender Stimuli wird verstärkt
[KHASAR et al. 1998]. Damit spielen die Prostanoide eine wesentliche Rolle in der
Generierung einer peripheren Sensibilisierung. PGE2 verursacht auf Gewebe-Ebene eine
Hyperalgesie und erhöhte Vasopermeabilität und agiert so synergistisch mit anderen
inflammatorischen Mediatoren wie Bradykinin, Histamin und Leukotrien B4. Diese Effekte tragen zur initialen hyperämischen Phase der Entzündung bei. Zentral applizierte
Prostanoide rufen eine deutliche Veränderung im Schmerzverhalten hervor; die Antwort
auf Noxen ist gesteigert und Schmerzreaktionen auf normalerweise nicht-schädliche
Stimuli treten auf [MINAMI et al. 1994]. Auf zellulärer Ebene des Rückenmarks erhöht
PGE2 die Erregbarkeit in schmerzvermittelnden neuronalen Stoffwechselwegen: Es
kommt zu einer gesteigerten Freisetzung von Transmittern aus den Endkolben zentraler
Schmerzfasern [MALMBERG et al. 1995], zu einer direkten Depolarisation der Rückenmarks-Neuronen durch Aktivierung eines nicht-selektiven Kationen-Kanals [BABA et al. 2001] und zu einer Reduktion der zentralen Inhibition durch Glycin [AHMADI et al. 2002]. Die Therapie inflammatorischer Zustände sollte strategisch auf die Linderung von Entzündung und Schmerz und auf das Erreichen allgemeinen Wohlbefindens des Patienten abzielen. Da die Prostanoide in all diese Bereiche verwickelt zu sein
scheinen, stellt sich nun die Aufgabe, die Synthese der Prostanoide effektiv zu blockieren, ohne allzu viele unerwünschte Nebenwirkungen zu verursachen.
17
Tab. 1.2 Profil ausgewählter Prostanoide
Name: PGE2
Strukturformel:
COOH
O
CH3
O
OH
Profil:
- dilatiert die Mikrovaskulatur und erhöht die Permeabilität der Gefäße
- wirkt pyrogen und hyperalgetisch, provoziert das inflammatorische Erythem
- unterdrückt die Freisetzung lysosomaler Enzyme
- unterdrückt die Synthese von Interleukin 2 und Interferon γ durch T-Lymphozyten
- schwächt die Migration von T-Helferzellen und unterstützt die Proliferation von T-Suppressorzellen
- stimuliert die Aktivität von Osteoklasten und Knochenresorption in Synovialis
- inhibiert die Proliferation von Knochenzellen in Synovialis
- diuretisch und natriuretisch; induziert die Freisetzung von Renin
- reduziert die Produktion von Magensäure, fördert die Freisetzung von Magenschleim
- stimuliert die duodenale Sekretion von Bikarbonaten
- fördert die Kontraktion des Uterus
Name: PGI2
Strukturformel:
COOH
O
CH3
HO
OH
Profil:
- 6–Keto–PGF1α ist der stabile - und somit messbare - Metabolit von Prostacyclin
- vasodilatativ
- unterdrückt die Adhärenz und Aggregation von Thrombozyten
- hemmt die Aktivierung und Adhäsion von Leukozyten
- wirkt pyrogen und hyperalgetisch
- induziert die Freisetzung von Renin
- reduziert die Produktion von Magensäure, fördert die Freisetzung von Magenschleim
- stimuliert die duodenale Sekretion von Bikarbonaten
18
1.2.3 Cytokine
Mittlerweile ist eine Vielzahl löslicher Faktoren bekannt, die unter dem Begriff „Cytokine“ zusammengefasst werden und modulierend auf ihre Zielzellen einwirken. Sie
vermitteln in einem komplexen Netzwerk hochspezifisch zwischen den einzelnen Immunzellen einerseits und zwischen Immun- und Gewebezellen andererseits. Zur Gruppe
dieser Mediatoren gehören Lymphokine, Interleukine und Chemokine.
Die Synthese von Cytokinen kann in diversen Leukozyten induziert werden, einige
werden allerdings auch konstitutiv synthetisiert. Hierbei haben endogene Mechanismen,
wie der zirkadiane Rhythmus und das Lebensalter, und pathologische Zustände, wie
Infektionen oder Neoplasien einen Einfluss. Aktivierte Zellen produzieren häufig mehrere Cytokine gleichzeitig [BÖCKER et al. 1997].
Die immunologische Mastzelle exprimiert sowohl multifunktionelle Cytokine, wie
TNFα und IL1β, als auch profibrotische und anti-inflammatorische Cytokine wie IL4.
Zusätzlich ist sie fähig, membranständiges TNFα freizusetzen und gewinnt damit eine
große funktionelle Bedeutung im entzündlichen Geschehen der Gelenkerkrankung
[McNEIL 1996 / GOTIS-GRAHAM et al. 1998].
Inflammatorische Interleukine, wie TNFα und IL1β, verstärken die entzündliche Reaktion, indem sie in vielen humanen Zellen die Expression von COX-2-mRNA und –
Protein stimulieren [STICHTENOTH et al. 2001 / CROFFORD 1997]. IL1β fördert außerdem die Expression verschiedener Prostanoide und induziert gemeinsam mit ihnen
die Angiogenese in entzündlichem Gewebe in vitro und in vivo. Der Zusatz selektiver
COX-2-Inhibitoren unterdrückt diesen Effekt und belegt somit die Schlüsselrolle von
COX-2 und diversen Prostanoiden in der IL1β-induzierten Angiogenese [KUWANO et
al. 2004].
Die klinische Erfahrung zeigt, dass Cytokine eine wesentliche Rolle in der Pathogenese
von Gelenkerkrankungen, einschließlich der Osteoarthrose und der rheumatischen Arthritis, spielen [PELLETIER 1996 / CHU et al. 1992]. Proinflammatorische Cytokine sind
wichtige Mediatoren von Entzündung, Immunität, Proteolyse, Zellrekrutierung und Proliferation. TNFα und IL-1β, die von aktivierten Makrophagen produziert werden, verursachen zudem vermutlich zelluläre Interaktionen, die in einer Ereignisabfolge zur Zerstörung des Gelenkknorpels führen. [MASTBERGEN et al. 2002 / HARDINGHAM et
al. 1992 / DINGLE 1991]
19
1.3 Pharmakologische Inhibition der Prostanoid-Biosynthese
Die Entdeckung von zwei unterschiedlichen COX-Isoenzymen und das darauf folgende
Klonen und Exprimieren dieser Isoformen hat die Entwicklung einer neuen Klasse von
diarylheterozyklischen Inhibitoren ermöglicht, die COX-2-selektiv wirken [GANS et al.
1990 / FUTAKI et al. 1994 / PENNING et al. 1997 / RIENDEAU et al. 1997 / CHAN et
al. 1999].
Die Hemmung der COX-Enzyme durch traditionelle NSAID lässt sich generell einem
der folgenden Mechanismen zuordnen: Einfache reversible Hemmung, wie durch Ibuprofen [ROME und LANDS 1975], zeitabhängige reversible Hemmung wie durch
das schwach bindende Naproxen [GIERSE et al. 1999] oder das fest bindende Indomethacin [ROME und LANDS 1975], und letztendlich irreversible kovalente Inhibition,
wie im Falle des Aspirins [VAN DER OUDERAA et al. 1980].
Fluoreszenz-Untersuchungen
des
Bindungsverhaltens
von
selektiven
COX-2-
Inhibitoren haben für die Assoziation an die COX-2 einen dreischrittigen Kinetikprozess herausgestellt, während die Bindung an COX-1 auf zwei unterschiedlichen Teilschritten basiert, und nicht nur, wie bisher berichtet, auf einer kompetitiven Hemmung
[LANZO et al. 2000]. Die Existenz eines langsamen, irreversiblen Teilschrittes bei der
Hemmung der COX-2, nicht aber der COX-1, ist vermutlich für die Potenz und Selektivität der neuen diarylheterozyklischen selektiven COX-2-Inhibitoren verantwortlich
[WALKER et al. 2001 / RIENDEAU et al. 1997 / GIERSE er at. 1999].
ROME und LANDS erkannten bereits 1975 den bedeutsamen Zusammenhang zwischen
der zeitlichen Komponente der COX-Inhibition und der Potenz der verwendeten pharmakologischen Substanz. Kinetische Modelle zur Analyse der zeitabhängigen Hemmung setzen sich üblicherweise aus einer schnellen, reversiblen Reaktion zweiter Ordnung und einer darauf folgenden langsamen, irreversiblen Reaktion erster Ordnung zusammen:
k1
E+I
↔
kinact
[EI]
→
EI*
k-1
Abb. 1.8 Zweischrittige irreversible Inhibition [nach WALKER et al. 2001]
20
Bei der Analyse der zeitabhängigen Inhibition durch SC-560 beobachteten WALKER et
al. nach der ersten rapiden Gleichgewichtseinstellung einen weiteren, langsamen und
reversiblen Reaktionsschritt [2001]:
k1
E+I
↔
k2
[EI]
k-1
↔
[EI*]
k-2
Abb. 1.9 Zweischrittige reversible Inhibition [nach WALKER et al. 2001]
Während initial binäre Komplexe mit beiden Isoformen gebildet wurden, verhielt sich
SC-560 in dieser zweiten Reaktion rund 20fach selektiver gegenüber COX-1 Offensichtlich ereignen sich in den jeweiligen aktiven Zentren der Enzyme individuelle Interaktionen, die eine Unterscheidung zwischen den beiden Isoformen - unabhängig von
den Vorgängen in der hydrophoben Seitentasche - möglich machen [WALKER et al.
2001].
Auf der Basis kinetischer und struktureller Beobachtungen entwarfen LANZO et al. ein
neues Arbeitsmodell für die Inhibition der Cyclooxygenase [2000], welches das inhibitorische Verhalten der meisten NSAID gegenüber sowohl COX-1, als auch COX-2 befriedigend erklärt. Kinetische Daten der Steady-State- und zeitabhängigen Inhibition
von COX-1 und COX-2 durch eine Serie diarylheterozyklischer Inhibitoren belegen das
dreischrittige, reversible Inhibitionsmodell [WALKER et al. 2001]:
k1
E+I
↔
k-1
k2
[EI]
↔
kinact
[EI*]
→
EX
k-2
Abb. 1.10 Dreischrittige irreversible Inhibition [nach WALKER et al. 2001]
Beim ersten Schritt handelt es sich um eine Reaktion zweiter Ordnung, in der der Inhibitor in der Lobby-Region [MARNETT und KALGUTKAR 1999 / LANZO et al. 2000]
nahe dem Zugang zum hydrophoben Kanal [KURUMBAIL et al. 1996 / PICOT et al.
1994] an das Enzym bindet. Der zweite Reaktionsschritt korrespondiert mit der Verlagerung des Inhibitors entlang dieses Kanals und seiner Bindung im aktiven Zentrum der
COX. Diese beiden ersten Schritte sind vermutlich für beide COX-Isoformen bei der
21
Hemmung durch die meisten NSAID gleich. Abhängig von pharmakologischen Eigenschaften wie Selektivität und Potenz der eingesetzten Substanz können die Schritte jedoch nicht voneinander trennbar erscheinen, wie im Fall von Valdecoxib [WALKER et
al. 2001]. Der dritte, irreversibel erscheinende, kinetische Vorgang wird nur beobachtet,
wenn die COX-2 durch phenylsulphonamid- oder -sulphonhaltige Diarylheterozyklen
inhibiert wird. Dieser Prozess wird interpretiert als die Formation des fest gebundenen
Enzym-Inhibitor-Komplexes; dies beinhaltet die Optimierung der Konformationsänderungen von Inhibitor und Protein im aktiven Zentrum und der Seitentasche des Enzyms
[COPELAND et al. 1994].
1.3.1 Nicht-steroidale Antiphlogistika (NSAID)
Tab. 1.3 Profil von Aspirin und Diclofenac [nach WÖRZ 2001]
Name: Aspirin (2-(Acetyloxy)benzoesäure)
Strukturformel:
Profil:
- Salicylat
- Pharmakokinetik: geringe Potenz, schnelle Eli-
COOH
mination
- Orale Bioverfügbarkeit: dosisabhängig bis 50%
O
C
CH3
- Eliminations-Halbwertszeit t1/2β: 15 min
- Einzeldosis bei Erwachsenen: 0.05-1g
O
(50-100mg hemmen die Thrombozyten-Aggregation, 500-1000mg wirken analgetisch)
- maximale Tagesdosis: ca. 6g
Name: Diclofenac ([2-(2,6-Dichloranilino)phenyl]essigsäure
Strukturformel:
Profil:
- Aryl-Essigsäure
Cl
H
N
CH2
COOH
- Pharmakokinetik: hohe Potenz, schnelle Elimination
- Orale Bioverfügbarkeit: dosisabhängig bis 50 %
- Eliminations-Halbwertszeit t1/2β: 1-2 h
Cl
- Einzeldosis bei Erwachsenen: 25-75 mg
- maximale Tagesdosis: ca. 150 mg
22
Die Entdeckung des Aspirins als analgetische, anti-inflammatorische und antipyretische Substanz vor rund 100 Jahren markierte den Beginn der modernen Arzneimittel-Forschung [HEDNER und EVERTS 1998]. Salicylsäure und Acetylsalicylsäure
wurden die Prototypen der NSAID, die heutzutage eine der klinisch am häufigsten eingesetzten Medikamentenklassen bilden.
Obwohl der klinische Nutzen der NSAID schon früh etabliert wurde [HEDNER und
EVERTS 1998], dauerte es weitere 70 Jahre, bis VANE den Wirkmechanismus von
Aspirin entdeckte und dafür den medizinischen Nobelpreis erhielt [1971].
Heute weiß man, dass sowohl die therapeutischen, als auch die unerwünschten Wirkungen der NSAID auf ihrer Fähigkeit beruhen, die COX-abhängige PG-Synthese reversibel zu hemmen [VANE 1994 / SMITH 1989 / HIGGS 1986/ NEEDLEMAN et al.
1986]. Rund ein Jahrhundert nach der ersten Entdeckung der Salicylsäure, ergeben sich
jedoch noch immer neue therapeutische Nischen für den Einsatz von NSAID, wie kolorektale Tumorerkrankungen [CHAN 2003 / GASPARINI et al. 2003 / HULS et al.
2003] und M. Alzheimer [PASINETTI und POMPL 2002 / GIOVANNINI et al. 2003 /
HOOZEMANS et al. 2003].
Neben den beiden oben dargestellten Vertretern gehören auch Ibuprofen, Indomethacin,
Naproxen, und viele andere pharmakologisch in die Klasse der NSAID.
1.3.2
selektive COX-1-Inhibitoren
Dieser COX-1-selektive Inhibitor unterscheidet sich nur durch den Austausch einer Seitengruppe vom COX-2-selektiven Inhibitor Celecoxib.
Im Tierversuch ist für SC-560 generell eine Bioverfügbarkeit in vivo nachgewiesen
worden, die der von Indomethacin entsprechen soll [MASFERRER et al. 1994]. Die
geringe Wasserlöslichkeit von SC-560 ist für den biochemischen Aktionseintritt und die
Dauer der hervorgerufenen Wirkung von ganz entscheidender Bedeutung [DAVIES et
al. 2000]; aufgrund des lipophilen Charakters wird SC-560 bevorzugt in Fettgewebe
und Gehirn aufgenommen und angereichert.
SC-560 wird vielfach in experimentellen Studien als selektiver COX-1-Inhibitor eingesetzt und mit klinisch relevanten NSAID oder selektiven COX-2-Inhibitoren verglichen
[LOFTIN et al. 2002 / TANAKA et al. 2002 / GRETZER et al. 2001 / WALLACE et al.
2000].
23
Tab. 1.4 Profil von SC-560 [TENG et al. 2003 /SMITH et al. 1998]
Name: SC 560 (5-(4-chlorophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1H-pyrazolon)
Profil:
Strukturformel:
- methoxyl-haltiger Diarylheterozyklus
H3C
- COX-1 IC50 0.009 µM, COX-2 IC50 6.3 µM
O
- Orale Bioverfügbarkeit: 5-15 %
- Eliminations-Halbwertszeit t1/2β: 5 h
N
N
CF3
- Metabolismus: hoher First-Pass-Effekt in der
Leber
- urinäre Exkretion und Hemmung der urinären
Elektrolyt-Ausscheidung
- weder anti-inflammatorische, noch analgetische
Cl
Wirkung
100 Jahre lang hat Aspirin als analgetische, entzündungshemmende und antithrombotische Substanz seine Wirkung bewiesen. Seit 1938 ist jedoch zudem bekannt,
dass Aspirin toxisch auf den Gastrointestinaltrakt wirkt. Die Tatsache, dass die Hemmung der Cylcooxygenase sowohl dem therapeutischen, als auch dem toxischen Effekt
der NSAID zugrunde liegt, scheint das „no gain without pain“ Prinzip zu bestärken.
Nach der genetischen Identifizierung und dem erfolgreichen Klonen der inflammatorisch induzierbaren COX 2 Ende der 90er Jahre wurden bald spezifische Inhibitoren
dieses Enzyms entworfen, die erstmals in der Lage waren, die Prostaglandin-abhängige
Verkettung von Wirksamkeit und Magentoxizität zu sprengen. Die Erkenntnis, dass es
zwei Isoformen der Cyclooxygenase gibt, die einen unterschiedlichen Wirkbereich haben, schuf die Hypothese, dass eine spezifische und selektive Hemmung der COX-2
eine therapeutische Wirkung ähnlich den NSAID habe, ohne jedoch deren unerwünschte Nebenwirkungen hervorzurufen. Die Aussicht auf eine pharmakologische Substanz
mit einem COX-2-selektiven Wirkprofil und verbesserter gastrointestinaler Tolerabilität
regt die Pharmaindustrie bis heute zu einer intensiven Suche nach dem „sicheren Aspirin“ an.
24
Tab. 1.5 Profil von Celecoxib [SMITH et al. 1998 / WÖRZ 2001 / FITZGERALD
2003] und Lumiracoxib [SCOTT et al. 2004 / STICHTENOTH und FROHLICH 2003 ]
Name: Celecoxib (4-[5-(4-Methylphenyl)-3-(trifluormethyl)pyrazol-1-yl]benzolsulfonamid)
Profil:
Strukturformel:
H2N
- sulphonamid-haltiger Diarylheterozyklus
O
- COX1/COX2-Ratio: 30
S
- COX-1 IC50 15 µM, COX-2 IC50 0.04 µM
O
- Orale Bioverfügbarkeit: 22-40 %
N
N
CF3
- Plasmapeak tmax: nach ca. 2 - 4 h
- Eliminations-Halbwertszeit t1/2β: 11 h
- Proteinbindung: 97 %
- Metabolismus: CYP 450 (Oxidation)
- urinäre Exkretion: 29 %
- Einzeldosis bei Erwachsenen: 100 – 200 mg
H3C
- maximale Tagesdosis: 400 mg
Name: Lumiracoxib (2-[(2-chloro-6-fluorophenyl)amino]-5methylphenyl]acetylsäure)
Profil:
Strukturformel:
- Phenylacetylsäure
- COX1/COX2-Ratio: 433
H3C
COOH
- Orale Bioverfügbarkeit: 74 %
- Plasmapeak tmax: nach ca. 2 – 3 h
NH
F
- Eliminations-Halbwertszeit t1/2β: 3 - 6 h
Cl
- Proteinbindung: 98 %
- Metabolismus: CYP 450; (Oxidation)
- urinäre Exkretion: 54 %
- Einzeldosis bei Erwachsenen: 200 – 400 mg
- maximale Tagesdosis: 400 mg
Außer Celecoxib (Celebrex®) gehört auch Rofecoxib (Vioxx®) zu den selektiven COX2-Inhibitoren der ersten Generation, während Valdecoxib (Bextra®), Etoricoxib (Arcoixa®) und Lumiracoxib (Prexige®), die pharmakologische Zweitgeneration bilden.
Seit Dezember 2000 befand sich Lumiracoxib als „COX-189“ in experimenteller klinischer Erprobung [DING und JONES 2001] und steht ab Sommer 2004 weltweit zur
klinischen Verfügung. Es wird als selektiver Cyclooxygenase-Inhibitor der zweiten Generation betrachtet, da es in vitro eine höhere Selektivität für COX-2 aufweist [STICHTENOTH und FROHLICH 2003]. Ursprünglich sind die Inhibitoren weiterentwickelt
25
worden, um das Nebenwirkungsprofil weiter zu schmälern und sie in einem breiteren
Patienten-Kollektiv einsetzen zu können. Bisher verfügbare Daten zeigten diesbezüglich
jedoch keine generelle Überlegenheit von Lumiracoxib über Celecoxib: Zwar wurde
eine größere Effizienz und ein schnelleres Einsetzen der Wirkung deutlich [TACCONELLI et al. 2004 / TANNENBAUM et al. 2004 / WARNER und MITCHELL 2004],
im klinischen Gesamtbild ist dies jedoch nur von untergeordneter Bedeutung. Im Bezug
auf gastrointestinale Nebenwirkungen erbrachte Lumiracoxib keine klaren Vorteile, die
Inzidenz für Magengeschwüre war sogar leicht höher als unter Celecoxib [NITU et al.
2003 / ANON 2003 / KIVITZ et al. 2003]. Im Vergleich zu Placebo war das Auftreten
von mittelgradigen bis schweren Ödemen unter Lumiracoxib deutlich höher, erreichte
jedoch nicht die Werte von Diclofenac [STICHTENOTH und FROHLICH 2003].
Klinisch-therapeutisch war Lumiracoxib in der Behandlung der Osteoarthrose von
Hand, Knie und Hüfte in einer Dosis von 100-400 mg über einen längeren Zeitraum
effektiv und Placebo signifikant überlegen [BENEVOLENS-KAYA et al. 2003 /
GRIFKA et al. 2003 / WITTENBERG et al. 2003]. Es war so wirksam wie Celecoxib,
und in den klinischen Endpunkten „allgemeine Schmerzintensität“ und „funktioneller
Status“ sogar überlegen [TANNENBAUM et al. 2004 / SCHELL et al. 2003 /
FLEISCHMANN et al. 2003].
Die internationale, randomisierte, doppelblinde Multicenter-Studie TARGET (Therapeutic Arthritis Research and Gastrointestinal Event Trial) wird den Einsatz von Lumiracoxib, Ibuprofen und Naproxen in rund 18000 Osteoarthrose-Patienten vergleichen.
Endpunkte von TARGET sind die gastrointestinale bzw. kardiovaskuläre Sicherheit der
eingesetzten Medikamente [HAWKEY et al. 2004 / STICHTENOTH und FROHLICH
2003]. Die Einbeziehung eines selektiven COX-2-Inhibitors der ersten Generation, wie
in der vorliegenden Arbeit, wäre allerdings in dieser großen, klinischen Studie ebenfalls
wünschenswert gewesen.
1.3.4
Nebenwirkungen der selektiven COX-2-Inhibitoren
Im Falle einer akuten Entzündung sind die COX-2 spezifischen Inhibitoren ebenso effektiv; wie die traditionellen NSAID. Handelt es sich jedoch um eine chronische Entzündung, beginnt die COX-2 in der Spätphase, PG mit anti-inflammatorischer Wirkung
zu synthetisieren, die dann einen positiven Einfluss auf den Heilungsprozess haben. Bei
einer selektiven Hemmung der COX-2 ist dieses Synthese nicht möglich und die selek-
26
tiven COX-2-Inhibitoren scheinen so das Entzündungsgeschehen sogar zu verstärken
[FITZGERALD und PATRONO 2001].
1999 fanden zwei große, randomisierte und kontrollierte Studien statt, die die propagierte Überlegenheit dieser Substanzen gegenüber den bewährten unspezifischen NSAID
und ihr angeblich minimiertes Nebenwirkungs-Potential - vor allem auf gastrointestinaler Ebene - untersuchten: Die Vioxx Gastrointestinal Outcome Research (VIGOR) und
die Celecoxib Long-Term Arthritis Safety Study (CLASS). Die durchgeführten Studien
besaßen ein ähnliches Design; ein unselektiver NSAID wurde mit einer Substanz der
Erstgeneration der selektiven COX-2-Inhibitoren verglichen.
Unerwartet waren in den beiden Studien nicht die gastrointestinalen Nebenwirkungen,
sondern die Auswirkungen auf das kardiovaskuläre System. Es ist bekannt, dass durch
eine Inhibiton der COX-2 in vivo die Produktion von Prostacyclin abnimmt und die
urinäre Ausscheidung desselben sinkt. Zudem sorgen laminäre Scheerkräfte in vitro,
wie scheinbar auch in vivo, für eine gesteigerte COX-2-Expression in endothelialen
Zellen [FITZGERALD und PATRONO 2001 / TOPPER et al. 1996].
Als unerwünschte kardiovaskuläre Wirkungen wurden in den obigen Studien myokardialen Infarkte, Schlaganfälle und kardiovaskulär bedingte Todesfälle gewertet. Das Risiko für einen myokardialen Infarkt war in der VIGOR-Studie um das Vierfache erhöht.
[FITZGERALD und PATRONO 2001 / BOMBARDIER et al. 2000] In CLASS gab es
keine signifikanten Unterschiede zwischen der Celecoxib- und der NSAID-Gruppe.
[FITZGERALD und PATRONO 2001 / SILVERSTEIN et al. 2000]
Da Rofecoxib und Celecoxib eine vergleichbare Inhibition der systemischen Produktion
von Prostacyclin hervorrufen ohne jedoch die systemische Produktion des Thromboxans
zu beeinflussen, war die divergierende Inzidenz kardiovaskulärer Ereignisse vermutlich
im unterschiedlichen Studienprotokoll begründet: So unterschieden sich pathologische
Auswahlkriterien, Studienpopulation, Studiendauer und die als Vergleich herangezogene NSAID. [FITZGERALD et al. 2000] Während ein Drittel der CLASS-Population
regelmäßig kardioprotektives Aspirin in niedriger Dosierung einnahm, war dies für VIGOR ein Ausschlusskriterium. Zudem wird vermutet, dass Menschen mit Rheumatischer Arthritis (wie in VIGOR), nicht aber diejenigen mit Osteoarthrose (wie in
CLASS), ein erhöhtes Thrombose-Risiko aufweisen. Die Autoren der CLASS-Studie
veröffentlichten außerdem lediglich ihre Halbjahres-Ergebnisse und rechneten sie auf
Einjahres-Daten hoch. Die Tendenzen wurden dementsprechend verzerrt und die Er-
27
gebnisse deutlich „beschönigt“; Celecoxib erschien im Vergleich zu Rofecoxib verträglicher und nebenwirkungsärmer.
Wenn der Anspruch erhoben wird, ein Medikament biete einen deutlichen Sicherheitsgewinn gegenüber einer vergleichbaren Wirksubstanz, sollte es sich nicht nur um einen
partiellen Vorteil handeln; die Summe aller unerwünschten Nebenwirkungen sollte dann
prozentual niedriger sein. Schon T.H. HUXLEY stellte fest: „The great tragedy of science – the slaying of a beautiful hypothesis by an ugly fact.“
Den obigen Studien zufolge sind die COX-2-selektiven Inhibitoren für Patienten geeignet, die ein erhöhtes Risiko für gastrointestinale Zwischenfälle haben: Zu dieser Gruppe
gehören alle über 60jährigen, Patienten mit einem bekannten Magenulkus, und solche,
die regelmäßig Glukokortikoide oder Antikoagulantien einnehmen. Die Applikation bei
Risikopatienten für renale oder kardiovaskuläre Erkrankungen, insbesondere arterielle
Hypertonie und chronische Herzinsuffizienz, sollte mit großer Vorsicht erfolgen.
1.4 chronisch-entzündliche Gelenkerkrankungen
Um den Effekt von COX-Inhibitoren bei destruktiven Gelenkerkrankungen zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit Gewebe von Patienten mit Osteoarthrose des
Knies oder Impingement-Syndrom der Schulter verwendet. Diese beiden Krankheitsbilder verkörpern einen intra- bzw. extra-artikulären Vorgang und stehen exemplarisch für
chronisch entzündliche Pathologien.
1.4.1 Impingement-Syndrom der Schulter
Biomechanisch kann man sich die Schulter als ein Konstrukt aus mehreren Schichten
vorstellen, die durch ihre Anordnung den großen Bewegungsumfang und die Stabilität
ermöglichen: Die innerste Schicht bilden knöcherne Bestandteile sowie die Gelenke,
überlagert von einer zweiten Schicht aus verschiedenen Ligamenten, die stabilisierend
in die Gelenkkapsel einstrahlen. Als äußere Schutzschicht dient ein zweigeteilter Muskelmantel, im Inneren bestehend aus der Rotatorenmanschette und außen übermantelt
vom M. deltoideus. Wie bei einem Sandwich liegt zwischen den Muskelschichten die
Bursa subacromialis, der größte Schleimbeutel im menschlichen Körper. Sie ist von
einer Synovialmembran ausgekleidet und ermöglicht als flexible Verschiebeschicht die
reibungslose Bewegung im Gelenk [BÖCKER et al. 1997].
28
Das Engpasssyndrom der Rotatorenmanschette wurde erstmals 1972 von NEER als
„rotator cuff impingement“ in der Literatur beschrieben. Er stellte fest, dass die mechanische Einengung der Rotatoren-Sehnen unter dem Schulterdach zu einem gewissen
Symptomen-Komplex führt, v.a. wenn die Schulter in Vorwärts-Flexion oder Innenrotation gebracht wird. NEER prägte drei Krankheitsstadien, denen äthiologisch die Einklemmung der jeweiligen Muskelsehne unter dem Akromion und ein rigider korakoakromialer Bogen zugrunde liegen, die zur Degeneration und Reißen der Weichteilstrukturen führen können:
Tab. 1.6 Klassifikation und Symptomatik des Impingement-Syndroms [LYONS und
ORWIN 1998 / NEER 1983]
Stadium I

bevorzugt Patienten < 25 Jahren

Ödem, Einblutung innerhalb der Rotatorenmanschette

exzessive Aktivität der Schultermuskulatur oberhalb des Kopfes

leichter, aktivitätsabhängiger Schmerz

keine Muskelschwäche oder Bewegungseinschränkung im Schultergelenk

geweblicher Schaden unter konservativer Therapie reversibel
Stadium II

bevorzugt Patienten zwischen 25 und 40 Jahren

betrifft offenbar bevorzugt Athleten

signifikanter Schmerz bei geringer Aktivität, teilweise nächtlicher Ruheschmerz

häufig Bewegungseinschränkung
Stadium III

bevorzugt Patienten > 40 Jahren

partielle oder komplette Ruptur der Rotatorenmanschette

Läsion der Sehne des M. biceps brachii

Knöcherne Veränderungen von Akromion und Tuberositas humeri

bei lang andauerndem Impingement
Stadium IV

Arthropathie durch Defekt der Rotatorenmanschette
29
Das höchste Erkrankungsrisiko für ein Engpass-Syndrom haben schwer körperlich arbeitende Menschen, besonders bei häufigen Über-Kopf-Arbeiten, sowie Sportler, die
ebenfalls häufig Bewegungen über dem Kopf ausführen (Schwimmen, Tennis, Volleyball, Wurfsportarten).
Die Beschwerden können mit zunehmender Bewegung graduell ansteigen und so auf
ein Impingement hinweisen, oder aber schlagartig und stechend einsetzen, was einen
Riss der Manschette vermuten lässt. Chronizität und Lokalisation der Schmerzen sind
ebenso wichtig zu erfragen wie die Entstehungsbedingungen, verstärkende Faktoren,
auslösende Positionen und eventuelle Begleiterscheinungen.
Die physikalische Therapie während der Akutphase sollte den Schmerz und die Entzündung lindern und einer muskulären Atrophie vorbeugen. Die subakromiale Injektion
eines Lokalanästhetikums, in Kombination mit einem entzündungshemmenden Kortikosteroid, lindert die Beschwerden und ermöglicht eine uneingeschränkte Bewegungstherapie.
Sollte die anfängliche Symptomatik persistieren und der Patient nach drei Monaten konservativer Therapie keine deutliche Besserung zeigen, ist eine chirurgische Intervention
indiziert. Die arthroskopische, subakromiale Dekompression (anteriore Acromionplastik) ist hier der Eingriff der Wahl; 85-90% der behandelten Patienten erreichen
wieder eine Funktionsfähigkeit der Schulter wie vor Krankheitsbeginn [CHANG et al.
2004 / FONGEMIE et al. 1998].
In allen Phasen empfiehlt sich als adjuvante medikamentöse Therapie die regelmäßige
Gabe von NSAID für zwei Wochen.
1.4.2 Osteoarthrose des Knies
Lange Zeit wurde die Osteoarthrose als Konsequenz des physiologischen Alterungsprozesses betrachtet. In diesem Zusammenhang entstand der Begriff der degenerativen Gelenkerkrankung. Heutzutage ist jedoch bekannt, dass die Osteoarthrose aus einem komplizierten Zusammenspiel von Gelenkintegrität, Genetik, lokaler Entzündung, mechanischer Kräfte, sowie zellulärer und biochemischer Prozesse resultiert [CREAMER und
HOCHBERG 1997].
Die Kombination von erhöhtem Lebensalter, weiblichem Geschlecht und Übergewicht
gilt, nach heutiger Studienlage, als ausgeprägtes Risikoprofil für die Entstehung einer
Osteoarthrose [LING und BATHON 1998 / FRIED und GURALNIK 1997]. Eine amerikanische Studie ergab, dass übergewichtige Frauen ein vierfach und Männer sogar ein
30
fünffach erhöhtes Risiko haben, an Osteoarthrose zu erkranken [FELSON und CHAISSON 1997 / SCHOUTEN et al. 1992].
Histologisch handelt es sich bei der Osteoarthrose vereinfacht um einen progressiven
Degenerationsprozess mit ineffektiver Reparatur: Im Stadium I kommt es zum Verlust
der Proteoglykane und Fissurenbildung. Diese vertiefen sich im Stadium II und erreichen den radiären Knorpel; Chondrozyten gehen zugrunde oder bilden „Brutkapseln“.
Im Stadium III dringt Synovia in den Gelenkknorpel ein und ausgebrochene Knorpelstücke liegen frei im Gelenkraum. Es kommt zur Entwicklung einer Synovialitis mit
reaktivem Granulationsgewebe. Durch den Schwund des Gelenkknorpels wird in Stadium IV die knöcherne Deckplatte freigelegt und es entstehen subchondrale Pseudozysten
mit synovialer Flüssigkeit im Knochen. Sie werden von reaktiv neu gebildetem Knochen umgeben und später von fibrösem Narbengewebe ausgefüllt [BÖCKER et al.
1997].
Tab. 1.7 Kriterien der Osteoarthrose des Knies [nach ALTMAN et al. 1986]
1. Klinische Charakteristika (95 % Sensitivität und 69% Spezifität für Osteoarthrose)

Knieschmerzen
und mindestens drei der folgenden sechs Kriterien:

50 Jahre oder älter

weniger als 30 Minuten Morgensteifigkeit

Crepitus bei aktiver Bewegung

knöcherne Empfindlichkeit

knöcherne Vergrößerung

keine fühlbare Wärme des Synoviums
2. zusätzliche labortechnische Charakteristika (92 % Sensitivität, 75% Spezifität)

BSG < 40mm/h

Rheuma-Faktor < 1:40

veränderte Synovia (klare Farbe, visköse Flüssigkeit, Leukozyten < 2000/m3)
3. zusätzliche radiographische Charakteristika (91 % Sensitivität, 86 % Spezifität)

Osteophyten

Verengung des Gelenkraumes

subchondrale Sklerose und Zysten
31
Da es derzeit keine Substanzen gibt, die die Osteoarthrose verzögern oder präventiv
verhindern können, konzentrieren sich die Therapiemaßnahmen auf Analgesie, sowie
auf die Bewahrung von Lebensqualität und funktioneller Unabhängigkeit. In diversen
Studien war Acetaminophen zur initialen Schmerztherapie Placebo überlegen und
NSAID gleichgestellt. Vom American College for Rheumatology ACR wird es daher
mit einer Tagesdosis bis 4000mg als Analgetikum der Wahl empfohlen [GRAINGER
und CICUTTINI 2004 / American College of Rheumatology 2000]. In der Langzeittherapie können NSAID oder Opioidanalgetika zur Symptomkontrolle eingesetzt werden.
Im nicht-pharmakologischen Bereich wirkt sich eine Reduktion des Körpergewichtes
positiv auf die Schmerzentwicklung aus, da der biomechanische Stress sinkt [FELSON
und CHAISSON 1997]. Auch regelmäßige Bewegung ist von Vorteil für den Patienten,
denn durch Belastung und Mobilisation wird die Integrität des Gelenkes erhalten [FOLEY et al. 2003 / SUOMI und COLLIER 2003].
Wenn trotz umfassender medikamentöser Therapie Funktion und Mobilität beeinträchtigt bleiben, das Gelenk an sich strukturell instabil ist, oder aber der Schmerz nicht tolerabel ist, sollte eine chirurgische Intervention durchgeführt werden. Arthroskopisch
werden intraartikuläre freie Gelenkkörper entfernt und degenerierte Menisci repariert.
Bei ausreichend stützendem Bandapparat und kleinem Varus-Winkel bietet sich die tibiale Osteotomie an. Bei schwergradigen Deformitäten oder Instabilität ist eine totale Endoprothetik (TEP) des Kniegelenks vorzunehmen.
32
Experimenteller Teil
2. Versuchsdesign
2.1 Methodik
2.1.1 Pilotexperiment: Ermittlung der optimalen Inkubationsdauer
Die Angaben in der Literatur über die Inkubationszeit für inflammatorisches Gewebe
sind nicht eindeutig und variieren in einer Bandbreite von fünf bis 24 Stunden [KODA
et al. 1996].
Die Präparations- und Inkubationstechnik der vorliegenden Arbeit wurde bereits mehrfach angewandt; bisher wurden allerdings immer mehrere Inkubationszeiten gewählt, da
die Gewichtung auf der temporären Komponente der pharmakologischen Hemmung
lag. Der Fokus dieser Arbeit war jedoch auf die Effektivität und die COX-1-/COX-2Ratio der Substanzen in den unterschiedlichen Geweben gerichtet. Daher war es von
Bedeutung, eine Inkubationszeit festzulegen, die die Durchführung des einzelnen Experimentes nicht unnötig verlängert, aber dennoch signifikante Aussagen über die Wirksamkeit der eingesetzten Pharmaka zulässt. Während der Inkubation musste also eine
angemessene Freisetzung an Eicosanoiden stattfinden und gleichzeitig der volle
Wirkumfang der Pharmaka erreicht werden.
Die vergleichenden Pilotexperimente dieser Arbeit dienten daher der Ermittlung eines
solchen ökonomischen, aber dennoch validen Zeitpunktes. Zu diesem Zweck wurden
50mg FG Synovialisgewebe von acht Patienten mit Osteoarthrose nach dem bewährten
[KNORTH et al. 2002 / KNORTH et al. 2001 / WILLBURGER et. al. 1996 / WITTENBERG et al. 1993 / WITTENBERG et al. 1991] und unter 2.3. beschriebenen Protokoll präpariert. Das Gewebe wurde dann in Anwesenheit des unspezifisch hemmenden Diclofenac und des COX-2-selektiven Celecoxib in kontrollierten Doppelproben für
die Dauer von drei, sechs und 20 Stunden inkubiert. Nach Ablauf der jeweiligen Inkubationszeit wurden die einzelnen Überstände komplett entfernt, bei –80°C tief gefroren
und durch eine entsprechende Menge neuer Pharmakonlösung ersetzt. Mittels Radioimmunoassay (RIA) wurde dann exemplarisch die Freisetzung von 6-keto-PGF1α in
den abgehobenen Überständen bestimmt.
6-keto-PGF1α ist der stabile Metabolit des Prostacyclins PGI2. Es entsteht durch nichtenzymatische Hydratisierung des PGI2 mit einer Halbwertzeit von t1/2=2-3 min und
33
diente in diesem Experiment als Indikator für ein florierendes Entzündungsgeschehen
und eine inflammatorisch induzierte Angiogenese [VAPAATALO und PARANTAINEN 1978 / KUEHL et al. 1977].
2.1.2 Kurzzeitinkubation von Bursa- und Synovialisgewebe
Nach Ermittlung des optimalen Inkubationszeitpunktes für die zugrunde liegende Fragestellung wurde nun ein Spektrum an spezifischen und unspezifischen COXInhibitoren gewählt, um das Profil der Entzündungsmediatoren in den beiden inflammatorischen Geweben zu charakterisieren. Das neue, COX-2-selektive Lumiracoxib (in
den Konzentrationen [10-5M] und [10-6M]) wurde dem, ebenfalls COX-2-selektiven,
Celecoxib ([10-6M]), dem unselektiven Diclofenac ([10-6M]) und dem COX-1selektiven, experimentellen, SC-560 ([10-5M] und [10-6M]) gegenübergestellt.
100mg FG Synovialisgewebe von 21 Patienten mit Osteoarthrose des Knies und 100mg
FG Bursagewebe von zehn Patienten mit Impingement-Syndrom der Schulter wurden
intra-operativ gewonnen, präpariert und mit den obigen Substanzen für sechs Stunden in
kontrollierten Doppelproben inkubiert. Mittels Enzymelinked Immuno Sorbent Assay
(ELISA) wurde in sechs der abgehobenen Überstände der Gehalt der Prostaglandine
PGE2 und 6-keto-PGF1α, sowie der Interleukine IL1β und TNFα bestimmt.
Die gemessenen Werte für Prostaglandine zeigten in allen Proben die gleiche Tendenz
und unterschieden sich eindeutig von den Kontrollwerten. Da es sich bei den kommerziell erhältlichen ELISA-Kits um kostspielige Testverfahren handelt und die erhaltenen
Ergebnisse signifikante Aussagen zuließen, wurden am übrigen Gewebe keine weiteren
ELISAs vorgenommen.
2.1.3 Langzeitinkubation von Synovialisgewebe
Sechs Stunden waren bewiesenermaßen ausreichend, um Aussagen über die Hemmungspotenz der eingesetzten Substanzen machen zu können. Die InterleukinFreisetzung nach sechs Stunden war jedoch nicht eindeutig interpretierbar; sodass sich
die Frage stellte, wie sich der Interleukin-Spiegel im Laufe der Entzündung mit und
ohne pharmakologische Hemmung entwickeln würde.
34
Bei sieben der obigen Synovialisproben wurde daher nach der ersten Inkubation von
sechs Stunden der entnommene Überstand durch frische Pharmakonlösung ersetzt und
das Gewebe erneut für 14 Stunden inkubiert. Nach den insgesamt 20 Stunden Inkubationszeit wurden die Überstände erneut abgehoben und der Interleukingehalt mittels ELISA bestimmt.
2.2 Material
2.2.1 Gewebe
Das in dieser Arbeit verwendete Synovialisgewebe wurde bei Patienten mit therapieresistenter, chronischer Osteoarthrose des Knies, im Zuge der operativen totalen Endoprothetik (TEP), vollständig resiziert. Mit einem Gesamtgewicht von 1.5-3g/Patient stellt
die Synovialis ein handliches experimentelles Gewebe dar, das gut zu transportieren
und als überschaubare Einheit zu präparieren ist. Anatomisch gesehen bildet das, von
Synovialis ausgekleidete, Kniegelenk ein abgeschlossenes Kompartiment, in dem die
Mediatoren der Entzündung auf begrenztem Raum freigesetzt werden. Ein Epizentrum
der Entzündung ist daher gut lokalisierbar und Symptome wie Wärme, Rötung und
Schwellung sind makroskopisch sichtbar.
Das zweite, in dieser Arbeit verwendete, Gewebe stammte von Patienten mit therapieresistentem Impingement-Syndrom der Schulter. Bei der operativen offenen SchulterDekompression wurde die Bursa vollständig entfernt. Die Bursa subacromialis der
Schulter ist beim chronisch-destruktiven Impingement-Syndrom in ähnlicher Weise
betroffen, wie die Synovialis des Knies bei der Osteoarthrose. Sie unterliegt einer vergleichbaren sekundären mechanischen Belastung; auch sie ermöglicht einen „reibungslosen“ Ablauf der Bewegung im Gelenk. Im Gegensatz zur Synovialis, die zur Auskleidung der Gelenk-Innenfläche des Knies dient, stammt die Bursa subacromialis jedoch
aus dem extra-artikulären Bereich des Schultergelenkes.
Histologisch und klinisch haben die beiden verwendeten Gewebe jedoch große Ähnlichkeit: Sie sind beide von einer synovialen Membran umgeben, sekretieren synoviale
„Gleitflüssigkeit“, sind häufig Lokalisation entzündlicher Prozesse und produzieren bei
traumatischer Läsion ein vergleichbares leukozytäres Infiltrat. Im Falle einer chronischen Entzündung ähnelt das Geschehen der Bursa ebenfalls dem in der Synovialis.
35
Um eine Beeinflussung des Eicosanoidstoffwechsels durch - im Vorfeld verabreichte anti-inflammatorische Substanzen zu verhindern und somit die Ergebnisse der Untersuchung nicht zu verfälschen, wurden nur solche Patienten ausgewählt, die zum Zeitpunkt
der Operation keinerlei Antiphlogistika oder Analgetika einnahmen und die für diese
Substanzen eine bestimmte „Wash-out“-Periode aufwiesen: Sie sollten seit mindestens
drei Monaten keine intra-artikulären Kortikosteroid-Injektionen erhalten und seit mindestens einem Monat keine Kortikosteroide oral oder systemisch zu sich genommen
haben. Für die Gruppe der NSAID war eine Abstinenzzeit von mindestens zwei Wochen gefordert.
2.2.2 Pharmaka-Lösungen
Selektive COX-2 Inhibitoren zeigen im hochmolaren Konzentrationsbereich eine zunehmend unspezifische Hemmung, sie hemmen vermehrt also auch die COX-1. Um die
bursale und synoviale Synthese von Prostaglandinen jeweils einem COX-Isoenzym spezifisch zuordnen zu können, wurden daher in der vorliegenden Arbeit Konzentrationen
im Bereich von 10-5 - 10-6 Mol/L verwendet.
Das unselektiv hemmende Diclofenac wurde in einer Konzentration von [10-6M] eingesetzt, die nachgewiesenermaßen im Wirkbereich potenter Hemmung liegt [TOMISATO
et al. 2004 / KNORTH et al. 2002 / LAUFER et al. 1999 / WITTENBERG et al. 1993].
Auch für das COX-2-selektive Celecoxib ist die eingesetzte Konzentration [10-6M] als
effektiv nachgewiesen worden [TOMISATO et al. 2004 / GIERSE et al. 1999 / LIPSKY
und ISAKSON 1997]. Für die beiden anderen Pharmaka - das COX-1-selektive SC-560
und das neue, COX-2-selektive, Lumiracoxib - liegen weniger ausführliche Studien
über ideale Wirkkonzentrationen vor. Sie wurden in jeweils zwei Konzentrationen ([105
M] und [10-6M]) eingesetzt, um den Wirkbereich besser charakterisieren zu können,
ohne gleichzeitig schon eine unspezifische Hemmung zu bewirken.
Alle Pharmaka wurden in [1M] Tyrode gelöst.
2.2.2.1 Tyrode Lösung
Als Nährmedium zur Inkubation des Synovialis- und Bursagewebes wurde isoosmolare
Tyrode-Lösung verwendet. Sie basierte auf der ursprünglichen Zusammensetzung von
M.V. Tyrode [1910]:
36
Substanz
MG [g/mol]
[mmol / L]
[g / L]
NaCl
58.443
136.9
8
KCl
74.551
2.7
0.2
MgCL2
95.211
1.08
0.1
NaHCO3
84.007
12
1
NaH2PO4
119.977
40
4.8
CaCl2
110.986
1.77
0.2
C6H12O6
180.157
4.8
0.9
Direkt vor Gebrauch wurde diese [10M] Stammlösung in ddH2O auf [1M] verdünnt und
Glucose und Calciumchlorid zugesetzt. Die Lösung wurde auf 37°C erwärmt und mit
Carbogen begast, um physiologische Konditionen zu erzeugen. Der pH-Wert wurde auf
pH 7.4 adjustiert. Die Tyrode-Lösung wurde halbiert, ein Teil wurde als spätere „SpülLösung“ auf Eis gelagert, die zweite Hälfte für die spätere Inkubation mit Antibiotika
versetzt und weiterhin bei 37°C carbogenisiert:
Penicillin
50 IU / ml
Streptomycin
50 ug / ml
Gentamycin
50 ug / ml
2.2.2.2 Diclofenac (Natrium-[o-[2.6-dichlorphenyl)-amino]-benzeneacetic acid)
Substanz
MG [g/mol]
[mmol / L]
[mg / ml]
Diclofenac
318.14
2.5 x 10-3
0.7954
Diclofenac-Natriumsalz wurde, wie dargestellt, als Stammlösung in Tyrode gelöst und
für die eingesetzte Konzentration [10-6M] entsprechend in Tyrode verdünnt.
37
2.2.2.3 SC-560
Substanz
MG [g/mol]
[mmol / L]
[mg / ml]
SC 560
352.7
2.5 x 10-3
0.8818
SC 560 wurde, wie dargestellt, als Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst
und für die eingesetzten Konzentrationen [10-5M] und [10-6M] entsprechend in Tyrode
verdünnt.
2.2.2.4 Celecoxib (4-[5-(4-methylphenyl)-3- (trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1-yl] benzenesulfonamide)
Substanz
MG [g/mol]
[mmol / L]
[mg / ml]
Celecoxib
381.38
2.5 x 10-3
0.9535
Celecoxib wurde, wie dargestellt, als Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst
und für die eingesetzte Konzentration [10-6M] entsprechend in 4% ethanolhaltiger Tyrode verdünnt.
2.2.2.5 Lumiracoxib (2-[(2-chloro-6-fluorophenyl)amino]-5-methyl-2-[(2-chloro-6fluorophenyl)amino]-5-methylphenyl]acetic acid)
Substanz
MG [g/mol]
[mmol / L]
[mg / ml]
Lumiracoxib
293.72
2.5 x 10-3
0.7343
Lumiracoxib wurde, wie dargestellt, als Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO)
gelöst und für die eingesetzten Konzentrationen [10-5M] und [10-6M] entsprechend in
Tyrode verdünnt.
38
2.3 Procedere
Die frisch hergestellten Pharmakalösungen wurden für die folgenden Inkubationen bei
37°C gehalten. Das komplette, intra-operativ gewonnene Gewebe wurde sofort nach der
Entnahme in ein Gefäß mit 0.9% NaCl-Lösung gefüllt, um ein Austrocknen des Gewebes zu verhindern. Es wurde dann auf Eis gelagert, um die Stoffwechselreaktion zu reduzieren und den Transport ins Labor zu ermöglichen.
Hier wurde unmittelbar die makroskopische Präparation auf einer eisgekühlten Petrischale vorgenommen: Das Synovialis- bzw. Bursagewebe wurde von Fremdgewebe wie
Bindegewebe, Fett und Muskel befreit und in 2-3 mm große Stücke zerteilt. Anschließend wurde das präparierte Gewebe gemischt, um eine möglichst gleiche Zusammensetzung aller Inkubationsproben zu gewährleisten und somit realistischere Aussagen
über die Effekte der Wirksubstanzen im erkrankten Zielgewebe in vivo machen zu können. Das Gewebe wurde auf Filterpapier drainiert, via Analogwaage in 100mg FGPortionen geteilt und diese jeweils in ein auf Eis gelagertes Reagenzglas mit 2ml kalter
Tyrode-Lösung [pH 7.4] gegeben. Um Verunreinigungen durch verbliebene Blutanteile
und Zellpartikel zu entfernen, wurden alle Proben dreimal mit eiskalter Tyrode-Lösung
[pH 7.4] gespült und anschließend die flüssige Phase möglichst vollständig entfernt.
Dem Gewebe wurden jeweils 1ml der entsprechenden, in Tyrode gelösten Substanz
([10-5M] und [10-6M]) bzw. der Kontroll-Lösung (Tyrode oder DMSO) zugesetzt. Die
Pharmakalösungen wurden für weitere Inkubationen bei 37°C gelagert. Die gleichbehandelten Doppelproben wurden bei konstanter Temperatur von 37°C und unter kontinuierlicher 95%iger CO2-Begasung für sechs Stunden im Inkubationsschrank (Inkubator Boy 2000) inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Überstände vollständig abpipettiert und umgehend in -80°C gelagert. Im Falle der Langzeitinkubation
wurde das Volumen mit neuer Pharmakonlösung substituiert und die Proben erneut für
14 Stunden unter gleichen Bedingungen inkubiert.
Mittels RIA und ELISA wurde später in den Überständen der Gehalt an entzündungsspezifischen Prostaglandinen und Interleukinen bestimmt (s. 2.4.1 und 2.4.2). Das Gewebe wurde nach durchgeführter Inkubation zur weiteren histologischen Untersuchung
und Sicherung der Diagnose in Formalinlösung fixiert.
39
2.4 biometrische Verfahren
2.4.1 Bestimmung von 6-Keto-PGF1a mittels Radioimmunoassay (RIA)
bekannte Menge an radioaktivem
6-Keto-PGF1α und spezifischen
Antikörpern
Übernacht-Inkubation
bei 4°C
Aktivkohle
Probe mit
6-Keto-PGF1α-Anteil
Einstellung des Steady-StateGleichgewichts
Radio Immuno Assay
Feste Phase mit AntigenAntikörper-Komplexen
Szintilationsgel
Waschen
Messung des radioaktiven
6-Keto-PGF1α
ungebundener Überstand
Abb. 2.1. schematische Darstellung des Radioimmunoassays
Dieses Assay basiert auf dem konkurrierenden Verhalten von radioaktiv markiertem
und dem nachzuweisenden, unmarkierten 6-keto-PGF1α (in Standard- oder Testprobe)
um eine begrenzte Anzahl an Bindungsstellen des spezifischen anti-6-keto-PGF1αAntikörpers.
Sowohl der spezifische Antikörper Anti-6-keto-PGF1α-Ak 173-5, als auch die markierte
Fettsäure 3H-6-keto-PGF1α (Tracer), werden den Proben in begrenzter Menge zugegeben und provozieren so den Wettbewerb um freie Bindungen und die Einstellung eines
Steady-State-Gleichgewichtes. Nimmt die Konzentration an unmarkierter Fettsäure in
Standard oder Probe zu, so nimmt die Menge des Tracers, der an den Antikörper binden
kann, ab. Die Menge an antikörper-gebundenem, markiertem Tracer ist also umgekehrt
proportional zur Menge der unmarkierten Fettsäure in der Probe.
40
Der Radioimmunoassay in der vorliegenden Arbeit basiert auf dem Protokoll, das
PESKAR 1978 entwickelte. Neben den zu bestimmenden Testproben umfasst dieses
Assay vier Eichungswerte (Total, Nicht-spezifische Bindung NSB, Bindung 1 und Bindung 2) zur Kalibrierung des und acht Standardwerte (500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.6,
7.8, 3.9 pg/ml an unmarkiertem, authentischem 6-keto-PGF1α) zur Erstellung der quantifizierenden Standardkurve.
Die Zubereitung aller RIA-Proben wurde vollständig auf Eis durchgeführt, um die Reaktionsgeschwindigkeit bis zum Inkubationsbeginn zu reduzieren. Als Test-Puffer diente Phosphatsäure-gepufferte Saline (PBS) [0.5M], die direkt vor Gebrauch in Natriumchloridlösung [0.9%] auf [0.01M] verdünnt und nach Adjustierung des pH-Wertes auf
7.4 mit 1% Gelatine versetzt wurde. Eine entsprechende Menge an Test-Buffer (7901400µl) wurde in Assayröhrchen vorgelegt und mit je 10µl Standardlösung oder 500µl
der gesammelten Inkubationsüberstände gemischt.
100µl des spezifischen Antikörpers Anti-6-keto-PGF1α 173-5 wurden dann allen Standard- und Testproben, sowie „Bindung 1“ und „Bindung 2“ zugefügt. Das mit Tritium
markierte 6-keto-PGF1α wurde als kompetitierendes Antigen zugesetzt und alle Proben
für 30sec bei 100rpm zentrifugiert. Die zuzusetzende Menge wurde spektrometrisch
bestimmt und sollte eine maximale Aktivität von 4500 +/- 300cpm in der „Total“-Probe
nicht überschreiten, um eine optimale Auswertbarkeit des RIA zu erzielen. Der „NSB“Probe wurde neben dem markierten Antigen später auch das Adsorptionsmedium Aktivkohle zugesetzt, um das Ausmaß an unspezifischer Bindung des Tracers zu bestimmen. „Bindung 1“ und „Bindung 2“ erhielten zusätzlich den spezifischen Antikörper
und charakterisierten so das spezifische Bindungsverhalten des Tracers. Der RIA ist
aussagekräftig, wenn der Aktivitäts-Mittelwert der beiden Bindungs-Proben 25-40% des
„Total“ beträgt.
Die Assayröhrchen, mit einem Gesamtvolumen von 1.5ml, wurden sorgfältig mit Parafilm verschlossen und über Nacht bei 4°C inkubiert, damit sich das Steady-StateGleichgewicht zwischen gebundenem und freiem Tracer einstellen konnte. Alle Proben
– mit Ausnahme des „Total“ - erhielten am Folgetag 500µl Aktivkohle [2%] als Separationsmedium. Die Antigen-Antikörper-Komplexe wurden so an die feste Phase gebunden und der "überschüssige", ungebundene radioaktive Tracer im Überstand spektrometrisch quantifizierbar.
41
Die Aktivkohle-Gemische wurden per Vortex geschüttelt, zehn Minuten bei 1500rpm
zentrifugiert und die Überstände in 7ml Scintilationsgel (Scintigel) dekantiert. Die Mischung wurde erneut geschüttelt, im Flüssigkeitsscintilationsspektrometer (Packard Minaxi 4000) platziert und für zehn Minuten in der Dunkelheit inkubiert, um den lichtempfindlichen Scintillator zu regenerieren. Anschließend wurde die Tritium-Aktivität in
jeder Probe in Dreifach-Messung von jeweils zwei Minuten gezählt und anschließend
ein Mittelwert bestimmt. Die Nachweisgrenze lag für 6-keto-PGF1α bei 23pg/Röhrchen.
Zur Auswertung wurde der NSB-Wert von allen Werten subtrahiert, mittels der Standardwerte eine semilogarithmische Standardkurve erstellt und die Konzentration der zu
testenden Proben per Interpolation bestimmt. Es wurden nur Proben ausgewertet, die im
Bereich von 10-90% Inhibition der Eichkurve lagen. Proben <10 % wurden in größerem
Volumen, Proben >90 % nach Verdünnung erneut gemessen.
2.4.2 Bestimmung von PGE2, 6-Keto-PGF1a, IL1β und TNFα mittels Enzymelinked
Immuno-sorbent Assay (ELISA)
Standard und Proben
mit PGE2-Anteil
Antigen-Antikörper-Komplexe
mit spezifischen Antikörpern
beschichtetes Testfach
EnzymeLinked Immuno Sorbent Assay
Inkubation und
Säurezugabe
Spektrophotometrie
Farbig markierte Komplexe
Abb. 2.2 schematische Darstellung des Enzymelinked Immuno-Sorbent Assay
42
Der ELISA dient der quantifizierenden Bestimmung eines bestimmten Proteins (Antigens) in einer Testprobe. Das Prinzip des Assays beruht auf der Markierung des antikörper-gebundenen Antigens durch einen weiteren, enzymmarkierten Antikörper, der
nach Substratzusatz eine quantitative Farbreaktion hervorruft. Es handelt sich also um
einen direkten Nachweis-Test, da der Gehalt an gebundener Substanz mittels Farbmarkierung direkt ausgewertet wird, nicht der ungebundene, umgekehrt proportionale Anteil im Überstand wie beim Radioimmunoassay.
Die beiden verwendeten Antikörper umrahmen das gesuchte Antigen von beiden Seiten
und der so gebildete Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex hat dem Verfahren den
Namen "Sandwich-ELISA" eingebracht. Die Bindung der Antikörper erfolgt an zwei
unterschiedliche Epitope des Antigens und macht den ELISA so zu einem sehr sensitiven Verfahren; das Antigen muss erst von zwei unabhängigen Komponenten spezifisch
gebunden werden, bevor es als solches erkannt und der Test positiv wird. Der zweite
Antikörper ist speziell für den Gebrauch im ELISA präpariert: er ist an ein Enzym gebunden, das mit einem zugesetzten, zuerst farblosen Substrat reagiert und einen Farbwechsel in den Testfächern hervorruft. Üblicherweise handelt es sich bei diesem Enzym
um eine Esterase oder Phosphatase. Das Ausmaß des Farbwechsels (im vorliegenden
Fall zu Gelb bzw. Violett) korreliert mit dem Proteingehalt der Probe, die Farbintensität
ist direkt proportional zur Konzentration der gebundenen, zu bestimmenden Substanz.
Die kommerziell erhältlichen ELISA-Kits enthalten Test-Platten mit 96 Fächern, die
bereits mit einem spezifischen, monoklonalen Antikörper beschichtet sind. Das komplette Assay umfasste den Leerwert (Blank), sieben Standardwerte ( PGE2, 6-KetoPGF1a und TNFa: 500, 250, 125, 62.5, 31.3, 15.6, 7.8 pg/ml, IL-1b: 250, 125, 62.5,
31.3, 15.6, 7.8, 3.9 pg/ml) und die Testwerte (Diclofenac und Celecoxib in [10-6], SC560 und Lumiracoxib in [10-5] und [10-6], sowie entsprechende Kontrollen). Alle Proben
wurden als Doppelproben pipettiert.
In alle Fächer wurde ein Puffer vorgelegt, der die Lösung in reaktionsgünstigen Konditionen hielt und eine Bindung an die Antikörperbeschichtung ermöglichte. Je nach Hersteller wurde dann eine bestimmte Menge an Standard- oder Testprobe hinzugefügt,
ebenso wie der zweite, spezifische Antikörper. Die Testproben wurden, je nach Ursprungsgewebe, angemessen verdünnt, so dass die optische Dichte später im linearen
Abschnitt des Auswertungsgraphen liegt. Die Testplatte wurde, nach Zusatz aller Reagenzien, für eine Dauer von 2-18 Stunden auf einem Rotator bei 3000rpm schüttelnd
inkubiert. In dieser Zeit bindet das gesuchte Antigen aus Standard- oder Testprobe spe43
zifisch an den Feste-Phase-Antikörper, der den Boden des Testfaches auskleidet. Der
zugegebene, Freie-Phase-Antikörper bindet dann spezifisch an ein weiteres Epitop des
bereits einfach gebundenen Antigens. Falls dieser zweite Antikörper nicht schon an ein
Enzym gekoppelt war, wurde nach sorgfältigem Waschen (Entfernen des überschüssigen, ungebundenen Antikörpers) ein Enzymkonjugat zugegeben und in einer zweiten
Inkubation (1h) die gebundenen Antikörper markiert. Nach einem weiteren WaschSchritt (Entfernen des überschüssigen Enzym-Markers) wurde nun das - direkt vor
Gebrauch zubereitete - "Entwicklungs"-Substrat zugegeben und die ELISA-Platte auf
einem Rotator bei 3000rpm ohne Lichteinwirkung erneut inkubiert (10 - 90 min). Um
die enzymatische Umwandlung in das quantifizierende Farbprodukt zu beenden, wurde
eine säurehaltige Stopplösung zugegeben und die Platte umgehend in einem
Spektrophotometer bei 450nm Wellenlänge ausgewertet.
Die Mittelwerte der Standardreihe mit bekannten Konzentrationen wurden dann genutzt, um eine doppelt logarrhythmische Standardkurve zu generieren, die eine funktionelle Beziehung zwischen der optischen Dichte und der entsprechenden Konzentration
an Eicosanoiden herstellt. Im zugehörigen Graphen wird ein sichtliches Abflachen der
exponentiellen Kurve an beiden Enden deutlich. Biologischerweise muss sich der Eicosanoidgehalt am unteren Ende der Kurve dem Nullpunkt beständig nähern, da negative
Konzentrationen nicht möglich sind. Die Ausschweifungen im oberen Part der Kurve
basieren auf der mechanischen Begrenztheit des Spektrophotometers: Nach einem bestimmten Sättigungspunkt ist die Farbintensität für die Maschine nicht mehr differenzierbar; alle Proben oberhalb dieses Schwellenwertes erscheinen "richtig gelb". Aufgrund dieser beiden Phänomene ist der lineare Teil der erstellten Kurve nachvollziehbar
der akkurateste und sollte daher zur Auswertung verwendet werden. Nach Umstellung
der Funktionsgleichung wurden alle gemittelten Testwerte durch Interpolation an der
Kurve bestimmt und unter Berücksichtigung der entsprechenden Verdünnungsfaktoren
berechnet.
Die jeweiligen Nachweisgrenzen der Prostaglandine lagen bei 11pg/ml für 6-ketoPGF1α und bei 15pg/ml für PGE2. Die Interleukine waren bis zu einem Wert von
2.5pg/ml im Falle des TNFα und bis zu 1.1pg/ml bei IL1β nachweisbar.
Das Protokoll aller kommerziell erhältlichen ELISA-Kits ähnelt dem beschriebenen
Vorgehen, lediglich Inkubationszeit, Menge der zugesetzten Substanzen und das transformierte Farbprodukt können variieren.
44
2.5 Statistik
Die spezifische Freisetzung von Prostanoiden und Interleukinen aus entzündlichem Synovialis- bzw. Bursagewebe in vitro ist ein guter Indikator für das Entzündungsgeschehen. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit der jeweilige Mediator-Gehalt (in pg pro
mg Feuchtgewicht Inkubationsgewebe) als zu bestimmende Zielgröße in naiven Kontrollproben und in Anwesenheit inhibierender Pharmaka festgelegt.
Bei der Beurteilung medizinischer Behandlungen steht weniger die Messung des absoluten Behandlungseffektes im Vordergrund, als vielmehr der Vergleich mit dem Effekt
anderer, unter denselben Versuchsbedingungen applizierter Behandlungsformen [FISHER et al. 1993]. Dabei kommt der Kontrollgruppe besondere Bedeutung zu; nur ein
simultaner Vergleich ermöglicht eine genaue Quantifizierung des Behandlungseffektes
[TRAMPISCH und WINDELER 2000 / ROSNER 2000]. Alle Proben wurden als
gleichbehandelte Gewebepaare doppelt inkubiert und aus den Einzelwerten der Versuchsreihen wurde der arithmetische Mittelwert bestimmt. Der Mittelwert einer Stichprobe liefert einen Schätzwert für den Erwartungswert der zugrunde liegenden Verteilung; sein Standardfehler gibt Auskunft über die Genauigkeit dieser Schätzung [TRAMPISCH und WINDELER 2000]. Die Varianz gibt an, in welchem Umfang
Schwankungen eines errechneten Wertes in beide Richtungen auftreten. Zur Abschätzung der Streuung der Werte um den rechnerischen Mittelwert wird die mittlere Standardabweichung δ (SEM) berechnet [ROSNER 2000].
Der Mittelwert der absoluten Mediatorenfreisetzung in den Kontrollproben wurde hundert Prozent gleichgesetzt und mit dem Mittelwert der jeweiligen Pharmakongruppe
verglichen. Die Differenz der Freisetzung im Verhältnis zum Kontrollwert quantifiziert
den hemmenden Effekt der Pharmaka [FISHER und VAN BELLE 1993] und wurde als
Prozent Inhibition I% bezeichnet:
I% =
xK − xP
xK
Die gewählte Nullhypothese H0 („die eingesetzten Pharmaka haben keinen Einfluss auf
die Freisetzung der untersuchten Mediatoren“) wurde im einseitigen t-Test nach STUDENT für gepaarte Stichproben überprüft und mit der Fehlerwahrscheinlichkeit α =
0.05 verworfen:
45
t=
xK − xP
δd
für n K + nP − 2 Freiheitsgrade
n K und n P
Umfang der Stichproben (Kontrolle und Pharmaka)
x K und x P
Mittelwerte der Stichproben
δ K2 und δ P2
Varianzen der Stichproben
δd = δd 2 =
δ K2
nK
+
δ P2
nP
Standardabweichung der Differenz der Mittelwerte
Tab. 2.1 Signifikanzniveau des STUDENT-t-Tests:
<
0.1
0.5
0.01
0.001
hoch
sehr hoch
signifikant signifikant
FreiheitsGrad
nicht
signifikant
10
< 1.81
1.81
2.23
3.17
4.59
22
< 1.72
1.72
2.07
2.82
3.79
signifikant
46
2.6 verwendete Substanzen
Celecoxib
Searle, Skokie, IL, USA
Diclofenac
Sigma Chemie, München
Lumiracoxib
Novartis GmbH, Basel, Switzerland
SC 560
Searle, Skokie, IL, USA
DMSO
Ethanol
Alle Substanzen für die Tyrode-Lösung waren von analytischem Reinheitsgrad und
wurden von Sigma Chemie, München bezogen.
Aktivkohle
Riedel de Haen AG, Seelze
Scintilationsgel
K. Roth KG, Karlsruhe
Gelatine
K. Roth KG, Karlsruhe
Na2HPO4 x 2H20
E. Merck, Darmstadt
NaH2PO4
E. Merck, Darmstadt
3
New England Nuclear Co, Dreieich
H-6-keto-PGF1α
Anti-6-keto-PGF1α-Ak 173-5
Institut für Experimentelle Klinische Medizin,
Ruhr-Universität Bochum unter Leitung von
Frau Prof. Dr. med. B.M. Peskar
PGE2 - ELISA
Cayman Chemical Co, Ann Arbor, MI, USA
6-keto-PGF1α - ELISA
Bender Med Systems, Wien, Austria
IL1β - ELISA
IL4 - ELISA
TNFα - ELISA
47
3. Ergebnisse
3.1 Pilotexperiment
3.1.1 6-keto-PGF1α-Synthese in Synovialis nach dreistündiger Inkubation
[ pg / mg ]
1000
Kontrolle
Diclofenac [10-6 M]
750
Celecoxib [10-6 M]
500
** p < 0.01
**
**
**
250
0
KO DI
KO CE
KO CE
Konzentration
Abb. 3.1 50 mg Synovialisgewebe wurde drei Stunden lang in Anwesenheit von COXInhibitoren [10-6M] und [10-5M] inkubiert. Der absolute 6-keto-PGF1α-Gehalt wurde
mittels RIA gemessen und mit der Kontrollgruppe verglichen [n=6].
% Inhibition
100
80
60
40
20
0
DI
CE
CE
Inhibitor
Diclofenac [10-6 M]
Celecoxib [10-6 M]
Celecoxib [10-5 M]
Abb. 3.2 Prozentuale Inhibition der 6-keto-PGF1α-Synthese in Synovialis [n=6]
48
Tab. 3.1 Mittelwert und mittlere Standardabweichung
Substanz
Kontrolle Tyrode
MW [pg / mg FG]
600,5
SEM [pg / mg FG]
71,18
Diclofenac [10-6 M]
Kontrolle DMSO
229
21,01
861
76,05
-6
410,83
31,55
-5
319,58
47,74
t-Wert
2,89
Signifikanz
-6
3,16
**
-5
3,48
**
Celecoxib [10 M]
Celecoxib [10 M]
Tab. 3.2 STUDENT-t-Test
Substanz
-6
Diclofenac [10 M]
Celecoxib [10 M]
Celecoxib [10 M]
**
Nach dreistündiger Inkubation von 50mg FG Synovialisgewebe kam es zur höchsten
Freisetzung von 6-keto-PGF1α in reiner Tyrode und DMSO, jeweils ohne Zusatz von
inhibierenden Substanzen (s. Tab. 3.1). Die Differenz der beiden Kontrollwerte erklärt
sich durch die Verwendung unterschiedlicher Lösungen (Tyrode und DMSO, je nach
Lösbarkeit des eingesetzten Pharmakons). Da die Inhibition durch die diversen pharmakologischen Substanzen letztendlich prozentual angegeben wird, nivellieren sich diese
Unterschiede jedoch.
Unter Zusatz des unselektiv inhibierenden Diclofenac in der Konzentration [10-6M] erreichte die 6-keto-PGF1α-Synthese ihren niedrigsten Wert (s. Tab. 3.1). Verglichen mit
dem obigen Kontrollwert entsprach dies einer signifikanten prozentualen Hemmung von
61.87 %. Der CSI Celecoxib wurde in dieser Versuchsanordnung sowohl in [10-6M], als
auch in [10-5M] verwendet und hemmte erwartungsgemäß in der höheren Konzentration
die 6-keto-PGF1α-Produktion stärker. Es kam zu einer signifikanten prozentualen Hemmung von 52.28 % bzw. 62.88 % (s. Tab. 3.2).
49
3.1.2 6-keto-PGF1α-Synthese in Synovialis nach sechsstündiger Inkubation
[ pg / mg ]
Kontrolle
2000
Diclofenac [10-6 M]
1500
Celecoxib [10-6 M]
1000
** p < 0.01
*** p < 0.001
**
KO
500
***
***
0
KO DI
KO CE
KO CE
Konzentration
Abb. 3.3 50 mg Synovialisgewebe wurde sechs Stunden lang in Anwesenheit von
COX-Inhibitoren [10-6M] und [10-5M] inkubiert. Der absolute 6-keto-PGF1α-Gehalt
wurde mittels RIA gemessen und mit der Kontrollgruppe verglichen [n=6].
% Inhibition
100
80
60
40
20
0
DI
CE
CE
Inhibitor
Diclofenac [10-6 M]
Celecoxib [10-6 M]
Celecoxib [10-5 M]
50
Substanz
Kontrolle Tyrode
MW [pg / mg FG]
2054,33
SEM [pg / mg FG]
159,67
Diclofenac [10-6 M]
Kontrolle DMSO
150,75
19,39
1540,75
146,36
Celecoxib [10-6 M]
574,33
58,54
243,00
22,5
t-Wert
6,83
Signifikanz
Celecoxib [10 M]
3,54
**
Celecoxib [10-5 M]
5,06
***
-5
Celecoxib [10 M]
Substanz
Diclofenac [10-6 M]
-6
***
Verlängerte man die Inkubationszeit auf sechs Stunden, kam es in 50mg FG entzündlichem Synovialisgewebe - ohne Zusatz pharmakologischer Inhibitoren – zu einem weiteren Anstieg des 6-keto-PGF1α um das mehr als Vierfache (s. Tab. 3.3).
Diclofenac in [10-6M] reduzierte den 6-keto-PGF1α-Gehalt signifikant um 92.66 %. Unter Celecoxib in den Konzentrationen [10-6M] und [10-5M] wurde die 6-keto-PGF1αSynthese signifikant zu 62.72 % bzw. 84.23 % gehemmt (s. Tab. 3.4).
51
3.1.3 6-keto-PGF1α-Synthese in Synovialis nach zwanzigstündiger Inkubation
[ pg / mg ]
25000
Kontrolle
Diclofenac [10-6 M]
20000
Celecoxib [10-6 M]
15000
*** p < 0.001
10000
KO
5000
***
KO
0
***
KO DI
KO
KO CE
***
KO CE
Konzentration
Abb. 3.5 50 mg Synovialisgewebe wurde zwanzig Stunden lang in Anwesenheit von
COX-Inhibitoren [10-6M] und [10-5M] inkubiert. Der absolute 6-keto-PGF1α-Gehalt
wurde mittels RIA gemessen und mit der Kontrollgruppe verglichen [n=6].
% Inhibition
100
80
60
40
20
0
DI
CE
CE Inhibitor
Diclofenac [10-6 M]
Celecoxib [10-6 M]
Celecoxib [10-5 M]
52
Substanz
Kontrolle Tyrode
MW [pg / mg FG]
23827,50
SEM [pg / mg FG]
2522,63
Diclofenac [10-6 M]
Kontrolle DMSO
43,58
4,22
22073,33
2246,9
Celecoxib [10-6 M]
2206,00
196,44
230,83
31,11
t-Wert
5,44
Signifikanz
Celecoxib [10 M]
5,09
***
Celecoxib [10-5 M]
5,61
***
-5
Celecoxib [10 M]
Substanz
Diclofenac [10-6 M]
-6
***
Nach der Langzeit-Inkubation von 20 Stunden hatte sich die 6-keto-PGF1α-Synthese
weiter verzehnfacht.
Unter Diclofenac [10-6M] kam es zu einer signifikanten prozentualen Hemmung von
99.82 % (s. Tab: 3.6)
In Anwesenheit des selektiven Celecoxib wurde 6-keto-PGF1α mit 2206 ± 196.44 pg/mg
FG bzw. 230.83 ± 31.11 pg/mg FG bei [10-6M] bzw. [10-5M] gemessen. Die Inhibition
betrug 90.01 % und 98.95 %.
53
3.1.4
zeitliche 6-keto-PGF1α-Synthese in Synovialis
in Anwesenheit eines selektiven und eines non-selektiven COX-Inhibitors
% Inhibition
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
3h
6h
20 h
Zeit
Diclofenac [10-6 M]
Celecoxib [10-6 M]
Abb. 3.7 50 mg Synovialisgewebe wurde sechs Stunden lang in Anwesenheit von Diclofenac und Celecoxib in [10-6 M] inkubiert. Der 6-keto-PGF1α-Gehalt wurde mit der
Kontrollgruppe verglichen und als prozentuale Inhibition ausgedrückt [n=6].
Durch den gewählten Versuchsaufbau bot sich die Möglichkeit, zwei Substanzen mit
unterschiedlich gerichteter Selektivität bezüglich ihrer Potenz im verwendeten Gewebe
im zeitlichen Verlauf zu vergleichen. Durch den Einsatz beider Pharmaka im gleichen
Konzentrationsbereich von [10-6M] war dieser Vergleich möglich und zulässig. Nach
nur drei Stunden hemmte der unspezifische COX-Inhibitor Diclofenac die 6-ketoPGF1α-Freisetzung um 61.87 %, das COX-2-selektive Celecoxib um 52.28 %. Nach der
mittelfristigen Inkubation von sechs Stunden hemmte das traditionelle NSAID um 92.66
%, der neue CSI um 62.72 %. Mit weiter zunehmender Inkubationszeit näherten sich
die Werte der prozentualen Hemmung zunehmend einander an und erreichten nach 20
Stunden eine fast vollständige Blockade der enzymatischen Synthese mit 99.82 % für
Diclofenac und 90.01 % für Celecoxib. Zu allen Zeitpunkten war die Differenz der prozentualen Hemmung unter den einzelnen Pharmaka zueinander signifikant (s. Tab. 3.2,
3.4 und 3.6).
54
3.1.5
zeitliche 6-keto-PGF1α-Synthese in Synovialis
in Anwesenheit eines COX-2-Inhibitors unterschiedlicher Konzentration
% Inhibition
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
3h
6h
20 h
Zeit
Celecoxib [10-6 M]
Celecoxib [10-5 M]
Abb. 3.8 50 mg Synovialisgewebe wurde sechs Stunden lang in Anwesenheit von Celecoxib in [10-6 M] und [10-5 M] inkubiert. Der 6-keto-PGF1α-Gehalt wurde mit der Kontrollgruppe verglichen und als prozentuale Inhibition ausgedrückt [n=6].
Um genaueren Aufschluss über die Bedeutung der Inhibitor-Konzentration für das inhibitorische Geschehen zu erlangen, wurden einige Substanzen in verschiedenen, abgestuften Konzentrationen eingesetzt und ermöglichten so den direkten, intraindividuellen Effektivitätsvergleich. Nach 3 Stunden Inkubation wurde die untersuchte
Prostaglandin-Produktion unter [10-6M] Celecoxib zu 52.28 % und unter [10-5M] Celecoxib zu 62.88 % gehemmt. Nach sechs Stunden betrug die Inhibition 62.72 % bei [106
M] und 84.23 % bei [10-5M]. Zum Ende der Langzeitinkubation wurde die Synthese
unter [10-6M] zu 90.01 % und unter [10-5M] zu 98.95 % inhibiert. Diese Werte unterscheiden sich schon nach drei Stunden deutlich, nach sechs und 20 Stunden ist die Differenz jedoch hochsignifikant (s. Tab. 3.2, 3.4 und 3.6). Beide eingesetzten Konzentrationen liegen innerhalb des therapeutischen Wirkbereiches von Celecoxib und
gewährleisten noch eine eindeutige Selektivität für die COX-2 (s.o.).
55
3.2 Endgültige Analyse
Aufgrund der ausgiebigen Pilotexperimente im Vorfeld dieser Arbeit, wurde im Hauptteil der - als signifikant erwiesene - Inkubationszeitpunkt von sechs Stunden für alle
weiteren Untersuchungen gewählt. Zudem wurde für den weiteren Verlauf das biometrische Auswertungsverfahren vom RIA auf den ELISA umgestellt worden, da sich dieses enzymatische Testsystem durch seine benutzerfreundliche Anwendbarkeit, sowie
eine hohe Sensitivität und Spezifität in Vorgängerstudien bewährt hat. Außerdem war
bei der Vielzahl der durchgeführten Untersuchungen auch der Wegfall der radiologischen Belastung durch den RIA von Bedeutung.
3.2.1 PGE2- Synthese in Synovialis nach sechsstündiger Inkubation
[ pg / mg ]
70000
Kontrolle
Diclofenac [10-6M]
Lumiracoxib [10-6M]
Celecoxib [10-6M]
SC-560 [10-6M]
60000
50000
40000
**
***
30000
** p<0.01
*** p < 0.001
20000
10000
0
***
KO DI
***
KO LU
KO CE
KO SC
Konzentration
Abb. 3.9 100 mg Synovialisgewebe wurde sechs Stunden lang in Anwesenheit von selektiven und non-selektiven COX-Inhibitoren [10-6M] inkubiert. Der absolute PGE2Gehalt wurde mittels ELISA gemessen und mit der Kontrollgruppe verglichen [n=6].
56
Diclofenac [10-6 M]
Lumiracoxib [10-6 M]
Celecoxib [10-6 M]
SC-560 [10-6 M]
% Inhibition
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
DI
LU
CE
SC
Inhibitor
Abb. 3.10 Prozentuale Inhibition der PGE2-Synthese in Synovialis [n=6]
[ pg / mg ]
60000
Lumiracoxib [10-5M]
SC-560 [10-5M]
50000
40000
*
30000
* p<0.05
*** p < 0.001
20000
10000
KO
0
KO
***
LU
KO
KO
SC
Konzentration
Abb. 3.11 100 mg Synovialisgewebe wurde sechs Stunden lang in Anwesenheit eines
COX-1- und eines COX-2-selektiven COX-Inhibitors [10-5M] inkubiert. Der absolute
PGE2-Gehalt wurde mittels ELISA gemessen [n=6].
57
Substanz
Kontrolle Tyrode
MW [pg / mg FG]
57089
SEM [pg / mg FG]
2133,7
Diclofenac [10-6 M]
Kontrolle DMSO
2139,38
333,23
55153,5
1580,78
5901
679,42
Celecoxib [10 M]
26276,83
1502,53
SC 560 [10-6 M]
31989,67
2503,92
3322,28
389,65
27107,67
3677,97
t-Wert
10,39
Signifikanz
11,69
***
5,41
***
3,19
**
13
***
2,86
*
-6
-5
SC 560 [10 M]
Substanz
-6
Diclofenac [10 M]
-6
Lumiracoxib [10 M]
-6
Celecoxib [10 M]
-6
SC 560 [10 M]
-5
Lumiracoxib [10 M]
-5
SC 560 [10 M]
***
Nach sechsstündiger Inkubation von 100mg FG entzündlichem Synovialisgewebe kam
es zu einer basalen PGE2-Synthese von 57089 ± 2133.7 pg/mg FG in Tyrode und
55153.5 ± 1580.78 pg/mg FG in DMSO.
Unter Diclofenac in [10-6M] betrug die Produktion 2139.38 ± 333.23 pg/mg FG, die
Synthese wurde zu 96.25 % gehemmt.
Bei Lumiracoxib in gleicher Konzentration betrug der PGE2-Gehalt 5901 ± 679.42
pg/mg FG, dies entspricht einer prozentualen Hemmung von 89.3 %.
Der zweite CSI Celecoxib in [10-6M] senkte die PGE2-Produktion auf 26276.83 ±
1502.53 pg/mg FG, bei einer Synthese-Hemmung um 52.36 %.
Unter Zusatz von [10-6M] des COX-1-selektiven SC-560 enthielten die Inkubationsproben im Mittel 31989.67 ± 2503.92 pg/mg FG PGE2, gleichbedeutend mit einer prozentualen Inhibition von 42 %.
58
Gemäß der aktuellen Literatur wirken selektive Inhibitoren in Konzentrationen > 10-5M
zunehmend unspezifisch und hemmen vermehrt auch die COX-1-derivierte Prostaglandin-Synthese. Um den optimalen Wirkbereich der verwendeten Pharmaka weiter zu
charakterisieren, wurde das entzündliche Gewebe zusätzlich mit dem neuen CSI Lumiracoxib, sowie dem COX-1-präferentiellen SC-560 in der Konzentration [10-5M] für
sechs Stunden inkubiert. In diesem Konzentrationsbereich wurde unter Lumiracoxib ein
PGE2-Gehalt von 3322.28 ± 389.65 pg/mg FG gemessen, die prozentuale Inhibition
betrug 93.98 %. SC-560 hemmte zu 50.85%, die Proben enthielten 27107.67 ± 3677.97
pg/mg FG PGE2.
59
3.2.2 6-keto-PGF1α-Synthese in Synovialis nach sechsstündiger Inkubation
Kontrolle
Diclofenac [10-6M]
Lumiracoxib [10-6M]
Celecoxib [10-6M]
SC-560 [10-6M]
[ pg / mg ]
30000
20000
* p < 0.05
** p < 0.01
*** p < 0.001
*
**
10000
***
0
KO DI
KO LU
KO CE
KO SC
Konzentration
Abb. 3.12 100 mg Synovialisgewebe wurde sechs Stunden lang in Anwesenheit von
selektiven und non-selektiven COX-Inhibitoren [10-6M] inkubiert. Der absolute 6-ketoPGF1α-Gehalt wurde mittels ELISA gemessen [n=6].
Diclofenac [10-6 M]
Celecoxib [10-6 M]
SC-560 [10-6 M]
% Inhibition
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
DI
LU
CE
SC
Inhibitor
60
[ pg / mg ]
40000
Lumiracoxib [10-5M]
SC-560 [10-5M]
30000
** p < 0.01
20000
10000
**
0
KO
LU
KO
SC
Konzentration
Abb. 3.14 100 mg Synovialisgewebe wurden sechs Stunden lang in Anwesenheit eines
COX-1- und eines COX-2-selektiven COX-Inhibitors [10-5M] inkubiert. Der absolute 6keto-PGF1α-Gehalt wurde mittels ELISA gemessen [n=6].
Substanz
Kontrolle Tyrode
MW [pg / mg FG]
57089
SEM [pg / mg FG]
2133,7
Diclofenac [10-6 M]
Kontrolle DMSO
2139,38
333,23
55153,5
1580,78
5901
679,42
Celecoxib [10 M]
26276,83
1502,53
SC 560 [10-6 M]
31989,67
2503,92
3322,28
389,65
27107,67
3677,97
-6
-5
SC 560 [10 M]
61
Substanz
Signifikanz
Diclofenac [10 M]
t-Wert
5,39
3,71
**
Celecoxib [10 M]
2,32
SC 560 [10-6 M]
1,49
*
n.s.
-6
-6
-5
Lumiracoxib [10 M]
-5
SC 560 [10 M]
4,39
2,04
***
**
n.s.
Der Kontrollwert für die 6-keto-PGF1α-Produktion nach sechs Stunden Inkubation betrug für Tyrode bzw. DMSO 26391.83 ± 1810.97 pg/mg FG bzw. 27057.67 ± 1905.01
pg/mg FG.
[10-6M] Diclofenac verminderte den 6-keto-PGF1α-Anteil auf 2289.08 ± 234.03 pg/mg
FG, also um 91.33 %. In der Gruppe der selektiven COX-2-Inhibitoren betrug die 6keto-PGF1α-Produktion unter [10-6M] Lumiracoxib bzw. Celecoxib 8641 ± 696.91
pg/mg FG bzw. 14660.17 ± 1061.44 pg/mg FG. Dies entsprach einer prozentualen
Hemmung der gemessenen Prostaglandin-Synthese von jeweils 68.06 % bzw. 45.82 %.
Bei vorwiegender COX-1-Inhibiton durch [10-6M] SC-560 betrug der 6-keto-PGF1αGehalt der Proben 16589.17 ± 2153.61 pg/mg FG, was 38.69 % Inhibition entspricht.
In einer Konzentration von [10-5M] kam es unter Lumiracoxib zu einer Produktion von
6-keto-PGF1α von 5772 ± 532.29 pg/mg FG und unter SC-560 von 13292.33 ± 1985.45
pg / mg. Dies entsprach prozentual einer Hemmung von 78.67 % bzw. 50.87 %.
62
3.2.3 PGE2- Synthese in Bursa nach sechsstündiger Inkubation
[ pg / mg ]
30000
Kontrolle
Diclofenac [10-6M]
Lumiracoxib [10-6M]
Celecoxib [10-6M]
SC-560 [10-6M]
20000
* p < 0.05
10000
*
0
KO DI
*
KO LU
KO CE
KO SC
Konzentration
Abb. 3.15 100 mg Bursagewebe wurden sechs Stunden lang in Anwesenheit von selek-
tiven und non-selektiven COX-Inhibitoren [10-6M] inkubiert. Der absolute PGE2-Gehalt
wurde mittels ELISA gemessen und mit der Kontrollgruppe verglichen [n=6].
Diclofenac [10-6 M]
Celecoxib [10-6 M]
SC-560 [10-6 M]
% Inhibition
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
DI
LU
CE
SC
Inhibitor
Abb. 3.16 Prozentuale Inhibition der PGE2-Synthese in Bursa [n=6]
63
[ pg / mg ]
30000
Lumiracoxib [10-5M]
SC-560 [10-5M]
20000
* p<0.05
10000
*
0
KO
LU
KO
SC
Konzentration
Abb. 3.17 100 mg Bursagewebe wurden sechs Stunden lang in Anwesenheit eines
COX-1- und eines COX-2-selektiven COX-Inhibitors [10-5M] inkubiert. Der absolute
PGE2-Gehalt wurde mittels ELISA gemessen [n=6].
Substanz
Kontrolle Tyrode
MW [pg / mg FG]
57089
SEM [pg / mg FG]
2133,7
Diclofenac [10-6 M]
Kontrolle DMSO
2139,38
333,23
55153,5
1580,78
5901
679,42
Celecoxib [10 M]
26276,83
1502,53
SC 560 [10-6 M]
31989,67
2503,92
3322,28
389,65
27107,67
3677,97
-6
-5
SC 560 [10 M]
64
Substanz
Signifikanz
Diclofenac [10 M]
t-Wert
2,93
2,96
-6
*
Celecoxib [10 M]
0,8
*
n.s.
SC 560 [10-6 M]
0,83
n.s.
3,11
*
n.s.
-6
-5
Lumiracoxib [10 M]
-5
SC 560 [10 M]
0,46
In 100mg FG entzündlich verändertem Bursa-subacromialis-Gewebe kam es nach
sechsstündiger Inkubation ohne Pharmakonzusatz zu einer PGE2-Synthese von 25041.5
± 3268.11 pg/mg FG in Tyrode bzw. 21051.17 ± 2687.23 pg/mg FG in DMSO. Unter
Zusatz von [10-6M] Diclofenac belief sich das PGE2 im Bursagewebe auf 482.42 ±
255.94, es handelt sich um eine prozentuale Inhibition von 94.08 %. Lumiracoxib in
[10-6M] senkte den PGE2-Gehalt auf 1539.35 ± 182.42 pg/mg FG, dies entsprach einer
Hemmung von 92.69 %. [10-6M] Celecoxib hemmte die Synthese um 30.92 %, dies
entsprach einem absoluten PGE2-Wert von 14543.17 ± 1938.31 pg/mg FG. Unter SC560 in [10-6M] betrug der PGE2-Gehalt 14694 ± 1601.39 pg/mg FG und die Inhibition
30.2 %.
Im Konzentrationsbereich von [10-5M] belief sich die bursale PGE2-Produktion auf
565.62 ± 51.54 pg/mg FG unter Lumiracoxib bzw. 16571.83 ± 2978.2 pg/mg FG unter
SC-560. Prozentual gesehen bedeutete dies eine Hemmung von 97.31 % bzw. 21.28 %.
65
3.2.4 6-keto-PGF1α-Synthese in Bursa nach sechsstündiger Inkubation
Kontrolle
Diclofenac [10-6M]
[ pg / mg ]
30000
Lumiracoxib [10-6M]
Celecoxib [10-6M]
SC-560 [10-6M]
* p < 0.05
** p < 0.01
20000
10000
*
**
0
KO DI
KO LU
KO SC
KO CE
Konzentration
Abb. 3.18 100 mg Bursagewebe wurden sechs Stunden lang in Anwesenheit von selek-
tiven und non-selektiven COX-Inhibitoren [10-6M] inkubiert. Der absolute 6-ketoPGF1α-Gehalt wurde mittels ELISA gemessen [n=6].
Diclofenac [10-6 M]
Celecoxib [10-6 M]
SC-560 [10-6 M]
% Inhibition
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
DI
LU
CE
SC
Inhibitor
Abb. 3.19 Prozentuale Inhibition der 6-keto-PGF1α-Synthese in Bursa [n=6]
66
[ pg / mg ]
30000
Lumiracoxib [10-5M]
SC-560 [10-5M]
25000
20000
* p < 0.05
15000
10000
*
5000
0
KO
LU
KO
SC
Konzentration
Abb. 3.20 100 mg Bursagewebe wurden sechs Stunden lang in Anwesenheit eines
COX-1- und eines COX-2-selektiven COX-Inhibitors [10-5M] inkubiert. Der absolute 6keto-PGF1α-Gehalt wurde mittels ELISA gemessen [n=6].
Substanz
Kontrolle Tyrode
MW [pg / mg FG]
57089
SEM [pg / mg FG]
2133,7
Diclofenac [10-6 M]
Kontrolle DMSO
2139,38
333,23
55153,5
1580,78
5901
679,42
Celecoxib [10 M]
26276,83
1502,53
SC 560 [10-6 M]
31989,67
2503,92
3322,28
389,65
27107,67
3677,97
-6
-5
SC 560 [10 M]
67
Substanz
Signifikanz
Diclofenac [10 M]
t-Wert
3,37
2,36
-6
**
Celecoxib [10 M]
1,17
*
n.s.
SC 560 [10-6 M]
0,15
n.s.
2,62
*
n.s.
-6
-5
Lumiracoxib [10 M]
-5
SC 560 [10 M]
0,7
Betrachtete man die ungehemmte Prodkution von 6-keto-PGF1α aus Bursagewebe nach
sechs Stunden Inkubationszeit, ergaben sich Kontrollwerte von 21780.83 ± 2372.29
pg/mg FG in Tyrode und 23457.17 ± 2918.12 pg/mg FG in DMSO. Nach Zusatz von
[10-6M] Diclofenac sank der Gehalt auf 2146.5 ± 200.65 pg/mg FG, also um 90.15 %.
In Anwesenheit von Lumiracoxib in [10-6M] betrug der 6-keto-PGF1α-Gehalt 6337.5 ±
516.01 pg/mg FG, entsprechend einer prozentualen Hemmung von 72.98 %. Celecoxib
in gleicher Konzentration hemmte die Synthese zu 39.85 %, dies entsprach 14108.5 ±
1442.45 pg/mg FG. Unter [10-6M] SC-560 sank die 6-keto-PGF1α-Synthese auf
22150.83 ± 2081.29 pg/mg FG, die Inhibition betrug lediglich 5.57 %. Unter der erhöhten Dosis von [10-5M] belief sich der 6-keto-PGF1α-Gehalt in den Inkubationsproben auf
4568.5 ± 407.38 pg/mg FG für Lumiracoxib bzw. 17045.67 ± 2377.09 pg/mg FG bei
vorwiegender Hemmung der COX-1 durch SC-560. Prozentual interpretiert entsprach
dies 80.52 % bzw. 27.33 % Inhibition.
68
3.2.5 PGE2-Synthese in intra- und extra-artikulärem Gewebe
Kontrolle
[ pg / mg ]
Synovialis
Diclofenac
Bursa
Lumiracoxib
60000
Celecoxib
50000
SC-560
40000
*** p < 0.001
** p < 0.01
* p < 0.05
**
***
30000
20000
***
10000
*
***
0
DI
LU
CE
SC
DI
*
LU
CE
SC
Inhibitor
Abb. 3. 21 100 mg Synovialis- und Bursagewebe wurden sechs Stunden lang in Anwe-
senheit von COX-Inhibitoren [10-6M] inkubiert. Der absolute PGE2-Gehalt wurde mittels ELISA gemessen und mit der Kontrollgruppe verglichen [n=6].
Diclofenac [10-6 M]
% Inhibition
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Celecoxib [10-6 M]
SC-560 [10-6 M]
SYNOVIALIS
BURSA
Inhibitor
Abb. 3.22 Prozentuale Inhibition der PGE2-Synthese in Synovialis und Bursa [n=6]
69
3.2.6 6-keto-PGF1α-Synthese in intra- und extra-artikulärem Gewebe
Kontrolle
Diclofenac
Lumiracoxib
Celecoxib
SC-560
** p < 0.01
* p < 0.05
[ pg / mg ]
Bursa
Synovialis
30000
20000
*
**
10000
*
***
0
DI
**
LU
CE
SC
DI
LU
CE
SC
Inhibitor
Abb. 3.23 100 mg Synovialis- und Bursagewebe wurden sechs Stunden lang in Anwe-
senheit von COX-Inhibitoren [10-6M] inkubiert. Der absolute 6-keto-PGF1α-Gehalt
wurde mittels ELISA gemessen und mit der Kontrollgruppe verglichen [n=6].
Diclofenac [10-6 M]
Celecoxib [10-6 M]
SC-560 [10-6 M]
% Inhibition
100
80
60
40
20
0
SYNOVIALIS
BURSA
Inhibitor
Abb. 3.24 Prozentuale Inhibition der 6-keto-PGF1α-Synthese in Synovialis und Bursa
[n=6]
70
3.2.7 PGE2- und 6-Keto-PGF1α-Synthese im geweblichen Vergleich
in Anwesenheit eines COX-2-Inhibitors unterschiedlicher Konzentration
PGE2
[ pg / mg ]
60000
Kontrolle
50000
40000
30000
20000
10000
***
***
*
0
SYNOVIALIS
*
BURSA
[ pg / mg ]
30000
20000
**
10000
*
**
*
0
6-keto-PGF1α
Abb. 3.25 100 mg Synovialis- und Bursagewebe wurden sechs Stunden lang in Anwe-
senheit von Lumiracoxib [10-6M] und [10-5M] inkubiert. Der absolute Gehalt der
Prostanoide wurde mittels ELISA gemessen und mit der Kontrollgruppe verglichen
[n=6].
71
% Inhibition
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
PGE2
SYNOVIALI
S
6-keto-PGFα
BURSA
PGE2
6-keto-PGFα
Abb. 3.26 Prozentuale Inhibition der Prostanoid-Synthese in Synovialis und Bursa
[n=6]
72
Auswertung
4. Diskussion der Ergebnisse
Bisher gibt es keine experimentellen Untersuchungen, in denen die Auswirkungen unterschiedlich selektiver COX-Inhibitoren in mehreren entzündlichen Geweben direkt
miteinander verglichen werden.
Generell ist unklar, ob die eingesetzten Medikamente den tatsächlichen Ort der Entzündung überhaupt erreichen und dort wirken. Darüber hinaus stellt sich die Frage, ob ihre
Anwesenheit „vor Ort“ überhaupt erforderlich ist, um eine angemessene Analgesie zu
erzielen [DUFFY et al. 2003].
Die Osteoarthrose, als ein Vertreter der chronisch destruktiven Gelenkerkrankungen, ist
die häufigste Form der Arthritis [CARMONA et al. 2001 / WATSON 1997]. Nach
Schätzungen der Weltgesundheits-Organisation WHO leiden weltweit rund 25% der
über 65jährigen unter Schmerzen und Einschränkungen aufgrund dieser Erkrankung
[2003]. Der stärkste prädiktive Faktor ist das Lebensalter, so leidet fast jeder über
90jährige an Osteoarthrose [VAN SAASE et al. 1989 / LAWRENCE 1977].
Die Osteoarthrose ist durch Schmerz, Gelenkentzündung und –versteifung gekennzeichnet und resultiert in zunehmendem Ausmaß in physischer Behinderung [BREEDVELD 2004]. In der so genannten FRAMINGHAM-Studie wurde die Osteoarthrose als Ursache für physische Behinderung und Einschränkung der Lebensqualität - gleichgesetzt
mit
kardiovaskulären
Erkrankungen,
Herzinsuffizienz
und
chronisch-
obstruktiven Lungenerkrankungen [GUCCIONE et al. 1994].
Die Häufigkeit der Erkrankung macht einerseits experimentelles Gewebe leicht zugänglich und bietet eine große Stichprobe an vergleichbaren Untersuchungsobjekten, verdeutlicht zugleich aber auch den dringenden Bedarf an potenten pharmakologischen
Therapeutika.
Generell hat sich die Osteoarthrose in klinischer und experimenteller Forschung als ein
Modell zum Studium von chronischen Schmerzen und Entzündung durchgesetzt. Patienten mit entzündlichen Erkrankungen der Gelenke bieten die perfekte Möglichkeit, den
obigen Fragestellungen nachzugehen: Durch die Entzündung wird lokal vermehrt COX-
73
2 induziert, die dann verstärkt PGE2 produziert. Die direkte Bestimmung der Eicosanoid-Synthese bietet sich an, um das Ausmaß des Entzündungsgeschehens zu ermessen
und den Einfluss möglicher Therapeutika zu beobachten [DUFFY et al. 2003 / SEPPALA et al. 1990]. Eine direkte Evaluierung pharmakodynamischer und -kinetischer Parameter am klinisch relevanten Ort wird so möglich.
Die dieser Arbeit zugrunde liegende Hypothese, dass die COX-2 im akut entzündlichen
Gelenk vermehrt induziert wird, ist durchaus berechtigt, wenn man berücksichtigt, dass
sowohl die rheumatische Arthritis, als auch die Osteoarthrose mit einer generell erhöhten PG-Produktion einhergehen und außerdem beide Krankheitsbilder auf eine Therapie
mit NSAID ansprechen [DUFFY et al. 2003].
Die beiden Isoenzyme der Cyclooxygenase sind hauptverantwortlich für die Freisetzung
entzündungsfördernder Eicosanoide in Bursa- und Synovialisgewebe: Der Prostaglandin- und Leukotrien-Gehalt in Gelenkgewebe und -flüssigkeit ist bei entzündlichen Gelenkerkrankungen deutlich erhöht [HE et al. 2002 / PORTANOVA et al. 1996]. Mehrere Arbeitsgruppen zeigten, dass der Gehalt an PGE2 in den Gelenken von Patienten mit
Osteoarthrose signifikant über dem der Normalbevölkerung lag [BERTIN 1994 / SAHAP ATIK 1990]. PGE2 vermittelte in diesem Zusammenhang über eine Aktivierung
der Osteoklasten eine vermehrte Knochenresorption, was langfristig zu den beobachteten Gelenkschäden bei Osteoarthrose führt [RAISZ 1999]. Die gleichzeitig beobachtete
Knorpelschädigung wurde durch die beiden synergistisch arbeitenden Interleukine IL1β
und TNFα vermittelt, da sie die Expression degradierender Enzyme induzierten und die
Reparationsfunktion der Chondrozyten einschränkten [HE et al. 2002 / PAREDES et al.
2002].
Insbesondere der erhöhte Spiegel der Prostanoide PGE2 und PGI2 vermittelte Hyperalgesie, Schmerz und Entzündung im Rahmen der Osteoarthrose
[MARTEL-
PELLETIER et al. 2003 / BERTOLINI et al. 2002 / HINZ und BRUNE 2002 / PARENTE 2001].
Im Tiermodell der Polyarthritis reduzierten monoklonale Antikörper gegen PGE2 sowohl den Spiegel, als auch die Wirkung anderer inflammatorischer Markersubstanzen.
Diese Beobachtung unterstreicht den signifikanten Beitrag von PGE2 zur Pathogenese
der Arthritis [PORTANOVA et al. 1996].
MURATA et al. zeigten anhand von Knockout-Mäusen, die keinen ProstacyclinRezeptor besitzen, dass PGI2 als Mediator, im Rahmen einer Entzündung, Schwellung
74
und Schmerz vermittelte [1997]. Auch das inflammatorische Exsudat fiel ohne den Einfluss des Prostacyclins deutlich geringer aus. Die Verwicklung von PGI2 in die nozizeptive Antwort des Organismus konnte ebenfalls etabliert werden: Die Reaktion auf künstlich erzeugte Schmerzreize war bei den Knockout-Mäusen - im Vergleich zum Wildtyp
- nicht vorhanden. Die nozizeptive Vermittlung durch PGE2 erreichte ebenfalls nicht die
Ausmaße des Wildtyps und legte nahe, dass PGE2 und PGI2 unterschiedliche, kontextabhängige Aufgaben in entzündlichen Prozessen besitzen könnten [MURATA et al.
1997].
In der vorliegenden Arbeit bestätigte die Messung des PGE2 in den ungehemmten Kontrollproben der individuellen Patientengewebe eine hohe zugrunde liegende PGE2Produktion. Die beobachtete biologische Varianz der individuellen Gewebe-Explantate
war vorhersagbar und spiegelte vermutlich das unterschiedliche Ausmaß der klinischen
Entzündung wider [McEVOY et al. 2004].
Trotz der zunehmenden Entwicklung neuer, selektiver und pharmakologisch vorteilhaft
synthetisierter Inhibitoren der Cyclooxygenase, ist ein einheitliches In-Vitro-Testsystem
zur Evaluierung der Wirksamkeit dieser Substanzen nicht etabliert. Je nach Interessensschwerpunkt verwendeten Arbeitsgruppen Zellkulturen [REMMEL et al. 2004 /
CHANG et al. 2003 / HAWKEY 1999], humane Gewebepräparate [FURST 1999], rekombinante Enzymsysteme [PAIRET und VAN RYN 1999] oder menschliches Vollblut [MELLO et al. 2000 / LAUFER et al. 1999 / PAIRET et. al. 1998].
Jede Methode produzierte leicht divergierende Ergebnisse, was die unterschiedliche
Proteinbindung und die Verteilung entlang der Zellmembran widerspiegelt. Keine Methode kann jedoch generelle Gültigkeit beanspruchen. Die angegebene Selektivität kann
- je nach Assay - bis um das Zehnfache variieren. Derzeit gilt die Nicht-Hemmung der
Thrombozyten-Aggregation als Goldstandard, um eine Substanz als COX-2-selektiv zu
deklarieren [HAWKEY 1999]. Da die meisten der getesteten Pharmaka jedoch unter
spezifischen klinischen Bedingunen, bei hauptsächlich lokalem Entzündungsgeschehen,
Einsatz finden sollen, ist es von Vorteil, das entsprechende Zielgewebe in den Versuchsaufbau einzubeziehen und die Eigenschaften der Substanz in diesem Zielgewebe
zu berücksichtigen [DUFFY 2003 / FURST 1999]. Daher wurde in der vorliegenden
Arbeit osteoarthrotisches Synovialisgewebe bzw. Impingement-geschädigtes Bursagewebe inkubiert.
75
Viele Aufschlüsse über funktionelle Zelleigenschaften in pathologischen Prozessen sind
anhand primärer Zellkulturen gewonnen worden [FIRESTEIN 1996]. Unter methodischen Gesichtspunkten sind diese Experimente korrekt, sie limitieren allerdings die
Aussagekraft des Versuchs für den Einsatz in vivo. Kultivierte isolierte Zelltypen geben
die prädominierenden Zell-Zell-Interaktionen des komplexen, vielgestaltigen Bursabzw. Synovialisgewebes nur unzureichend wider [DAYER und BURGER 1999] und
lassen potentielle gewebliche Wechselwirkungen außer Acht, die durch dieses Zusammenspiel entstehen können. Ein weiterer Aspekt der möglichst wirklichen Abbildung
der biochemischen und kinetischen Vorgänge in vivo ist im vorliegenden Modell die
Mobilisierung der Arachidonsäure aus endogenen Speichern und die direkte Umsetzung
im Prostaglandin-Syntheseweg, im Gegensatz zu exogenem, experimentell zugesetztem,
Substrat [LANEUVILLE et al. 1994].
Die Etablierung eines Ex-Vivo-Kultursystems erhält den dynamischen Aktivierungsstatus der einzelnen zellulären Komponenten und ermöglicht es, die direkte Wirkung eingesetzter Substanzen auf das entzündliche Gewebe in totum zu beleuchten [McEVOY et
al. 2004]. Ähnliche ex vivo Gewebe-Explantate wurden bereits von Patienten mit rheumatischer Arthritis verwendet, um die Auswirkungen anderer, inflammatorischer
Schlüsselmediatoren auf den synovialen Zellverband zu untersuchen [TETLOW et al.
1998 / WOODS et al. 1999].
In der jüngsten Vergangenheit haben sich auch andere Arbeitsgruppen in vergleichbarer
Weise des ausführlich beschriebenen Inkubationsverfahrens dieser Arbeit (siehe 2.3)
bedient und die erweiterte Aussagekraft des Modells für den klinischen Einsatz getesteter Pharmaka genutzt [DUFFY et al. 2003 / McEVOY et al. 2004 / TOMISATO et al.
2004].
Die durchgeführte Portionierung und Homogenisierung des Gewebes hat einen unschätzbaren Wert, lassen sich doch so unterschiedliche Zeitpunkte und Medikamente an
ein und demselben Material testen. Jegliche inter-individuellen Schwankungen bei
Tiermodellen oder In-Vivo-Studien werden auf diese Weise auf ein Minimum reduziert.
Auch die Art des geweblichen Inkubates gewährleistet ein Optimum an Interpretierbarkeit, handelt es sich doch um die Aufbereitung von Verbänden intakter humaner Zellen.
Der humane Ursprung ist von Bedeutung und gewährleistet repräsentativere Ergebnisse,
da sich angezüchtete tierische Enzyme im In-Vitro-Verhalten zum Teil deutlich von
76
menschlichem Zellmaterial unterscheiden [PAIRET und VAN RYN 1998 / BERG et al.
1997 / CHULADA und LANGENBACH 1997].
Rein methodisch gesehen wurden Einflüsse von Lagerung, Transport und Präparation
des Gewebes auf die spätere Mediatoren-Freisetzung durch die etablierte Verfahrensweise so weitestgehend ausgeschlossen: Die Lagerung des Operationspräparates in
0.9%iger NaCl-Lösung simulierte ein physiologisches Milieu und die sofortige Überführung in einen Behälter mit Eiswasser hielt alle Stoffwechselprozesse, bis zu Beginn
der Inkubation, auf einem künstlichen Ruheniveau. Es ist bekannt, dass die Zeit von der
Entfernung aus dem lebenden Organismus bis hin zur simulierenden Inkubation und die
osmolare Beschaffenheit des Kulturmediums in bestimmten Geweben einen Einfluss
auf die in vitro gemessene Prostaglandin-Freisetzung haben können [BUSIJA et al.
1996 / ZHANG et al. 1995]. Die equilibrierten Inkubationsmedien und die fortwährende
CO2-Begasung sicherten einen konstanten pH-Wert und dienten so ebenfalls der Aufrechterhaltung einer physiologischen Situation. Das Absinken des pH-Wertes unter
physiologisches Niveau würde ein Absinken des intrazellulären Ca2+-Haushaltes mit
sich bringen, was konsekutiv Turbulenzen für den Prostaglandin-Haushalt bedeutete
[STEINHILBER 1999 / AALKJAER und PENG 1997 / MURAKAMI et al. 1994].
Durch das dreimalige Spülen der Inkubationsproben mit eiskalter Tyrode-Lösung wurden zelluläre Fremdbestandteile entfernt, die sonst für eine ektope ProstaglandinProduktion verantwortlich sein könnten [TOMISATO et al. 2004]. Dieser Spülvorgang
und die detaillierte, präparatorische Aufarbeitung des Gewebes sicherten die Inkubation
homogenen Synovialis- bzw. Bursagewebes und damit eine möglichst gewebsspezifische Freisetzung der Mediatoren.
In der experimentellen Durchführung der vorliegenden Arbeit erscheint sicherlich der
relativ geringe Umfang der einzelnen gezogenen Stichproben als nachteilig. In der Phase der Versuchplanung war dieser Wert ursprünglich nicht mit n<10 kalkuliert worden,
was auch in der wesentlich höheren Zahl an asservierten Inkubationsproben zum Ausdruck kommt (n=21 für Synovialis- bzw. n=10 für Bursagewebe). Der ökonomische
Aspekt der ELISA-Tests (s. 2.1.2) beschränkte letztendlich die Anwendung dieses
Auswertverfahrens auf eine anteilig kleinere Stichprobe. Alle erhaltenen Ergebniswerte
zeigten jedoch eine bemerkenswerte Kongruenz und ermöglichten eindeutige Äußerungen zu den zugrunde liegenden Fragestellungen. Wenn sich auch die ermittelten Abso77
lutwerte durch eine Vergrößerung der Stichprobe den realen Werten weiter annähern
würden, so waren selbst bei kleinerem Umfang die Unterschiede zur Kontrollgruppe
jeweils signifikant und zeigten einen eindeutigen Trend und eine Aufteilung der Pharmaka-Palette nach Wirkkraft.
Bereits mehrfach wurde gezeigt, dass unspezifische NSAID in einer vergleichbaren
klinischen Situation einen hemmenden Effekt auf die lokale Eicosanoid-Freisetzung und
somit auf die Entwicklung der Entzündung haben. Viele Arbeiten untersuchten bisher
die Auswirkungen von jeweils nur COX-1- bzw. COX-2-selektiven Substanzen auf den
Organismus [McEVOY et al. 2004 / BARDEN et al. 2003 / TANAKA et al. 2002 /
HENNAN et al. 2001]. Die vorliegende Arbeit verwendet ein Spektrum unspezifischer,
COX-1-spezifischer und COX-2-spezifischer Wirkstoffe im selben experimentellen
Aufbau und ermöglicht so einen direkten Vergleich der Substanzen unter identischen
Experimentierbedingungen und in gleichen Wirkstoffkonzentrationen. Neben dieser
intra-experimentellen pharmakologischen Vergleichbarkeit bietet sich außerdem die
Möglichkeit, die COX-1/COX-2-Gewichtung im Entzündungsgeschehen für Synovialis
und Bursa anhand des charakteristischen Inhibitionsmuster der verwendeten Pharmaka
gewebespezifisch zu differenzieren.
Die Spezifität mehrerer COX-2-selektiver Komponenten aus verschiedenen Untersuchungen anhand der COX-1/COX-2-ratio direkt miteinander zu vergleichen, ist schwierig. Die beobachtete Spezifität des Enzyms ist beeinflussbar durch die eingesetzte Enzym- bzw. Substratkonzentration: Liegt eine Sättigung mit dem Substrat Arachidonsäure vor, ist keine kompetitive COX-1-Hemmung bemerkbar, aber eine hohe COX-2Selektivität. Bei erniedrigter AA-Konzentration sinkt dementsprechend scheinbar die
Selektivität für COX-2, und COX-1 wird leicht kompetitiv gehemmt. Die verwendete
Enzym-Konzentration in vitro kann ebenfalls die Auswertung komplizieren. Manche
CSI sind so potente Inhibitoren, dass sie das aktive Enzym schon in niedrigster Konzentration vollständig hemmen. Der IC50-Wert hängt dann vom Enzymanteil der Probe
ab. Eine hieraus abgeleitete selektive COX-1/COX-2-Ratio spiegelt also lediglich den
relativen COX-1-/COX-2-Gehalt der Probe wider [MARNETT et al. 1999]. In den
standardmäßig verwendeten In-Vitro-Testverfahren wird bisher die COX-2-/COX-1Ratio der jeweiligen Substanzen herangezogen, um kalkulatorisch die Selektivität zu
bestimmen und so einen gemeinsamen Konsensus für die Bewertung der Effektivität der
COX-Inhibitoren zu erhalten. Je größer der IC50 für die jeweilige COX-Isoform in die78
ser Ratio, desto mehr Substrat muss eingesetzt werden, um das Enzym zu 50 % zu inhibieren. Eine niedrige Ratio entspricht demnach einer hohen COX-2-Selektivität, der
IC50-Wert für COX-2 sehr gering und der IC50-Wert für COX-1 entsprechend groß. Dieses Selektivitätsprofil eines Wirkstoffes, das durch den IC50-Wert ausgedrückt wird,
lässt sich auch graphisch darstellen: Die gewünschte Konzentration eines Medikamentes
wird hierzu für eine jeweils 50prozentige Inhibition der COX-1 (Ordinate) bzw. der
COX-2 (Abszisse) auf einen Graphen aufgetragen. Die jeweilige Lokalisation, im Bezug auf die Ursprungsgerade, verdeutlicht die Ratio - und damit die Selektivität- der
Substanz [FITZGERALD et al. 2000]. Abhängig von der jeweiligen Kurvensteigung ist
die Ratio dann unterschiedlich biologisch interpretierbar; steilere Kurven erlauben generell eine bessere Differenzierung zwischen einer COX-1- und einer COX-2-Selektivität.
Aus anschaulichen Gründen wäre es jedoch einleuchtender und didaktisch sinnvoller,
den reziproken Wert der Ratio zu verwenden: bei einem Medikament, das die COX-2
100mal stärker hemmt, als die COX-1, wäre dann dieser Wert auch 100mal größer
[HAWKEY 1999]. Selbst diese Selektivitätsratio in vitro kann jedoch das Niveau der
Inhibition bei gegebener klinischer Dosis nicht adäquat vorhersagen. [EVERTS et al.
2000] Demnach existiert kein „optimaler“ Wert für die COX-2-Selektivität. Es besteht
keine Korrelation zwischen Selektivitätswerten, die in vitro festgestellt wurden, und
denen, die nach In-Vivo- oder Ex-Vivo-Studien vermutet worden waren [MARNETT et
al. 1999 / EVERTS et al. 2000]. In-Vitro-Studien zum toxischen Einfluss von NSAID
auf die Zellen der Magenschleimhaut stellten zudem heraus, dass kein direkter Zusammenhang besteht zwischen der COX-2-Selektivität einer Substanz und ihrer Cytotoxizität, also der benötigten Dosis, um eine Apoptose oder Nekrose der Zellen herbeizuführen. Des Weiteren war kein Zusammenhang zwischen der Toxizität und der Fähigkeit
zur effektiven Hemmung der Prostanoid-Synthese erkennbar [TOMISATO et al. 2004].
Auch die Kinetik der Interaktionen pharmakologischer Inhibitoren mit dem jeweiligen
Isoenzym ist für die Interpretation der Ergebnisse von Bedeutung. Einige NSAID konkurrieren mit der Arachidonsäure um die Bindung an das aktive Zentrum der COX im
Sinne eines zeitunabhängigen, kompetitiven Antagonismus. Die meisten agieren jedoch
- wie bereits unter 1.3 beschrieben - sowohl mit der COX-1, als auch mit der COX-2 in
einem zweischrittigen Prozess. Die strukturell determinierte Affinität bestimmt dabei
die COX-1-/COX-2-Relation [GIERSE et al. 1995 / QUELLET und PERCIVAL 1995].
Auch die selektiven Coxibe hemmen die COX-2 in diesem zeitabhängig-irreversiblen
79
Modus [RIENDAEU et al. 1997 / WONG et al. 1997 / GIERSE et al. 1996]. Es konnte
gezeigt werden, dass die COX-2-selektiven Inhibitoren primär an das aktive Zentrum
beider Isoenzyme binden und somit im Rahmen der, faktisch sofort eintretenden, Bildung des [E-I]-Komplexes zunächst sowohl die COX-2, als auch die COX-1 in gleichem Maße hemmen. Dieser initiale Effekt auf die Aktivität beider Isoenzyme ist zunächst gleichermaßen schwach ausgeprägt [QUELLET und PERCIVAL 1995 / COPELAND et al. 1994]. Den zweiten Schritt der dargestellten Kinetik, die zeitabhängige
Konversion des Komplexes aus Enzym und Inhibitor mit irreversibler - und deutlich
potenterer - Inhibition der Syntheseaktivität, vollziehen die Coxibe dann allerdings nur
noch mit der COX-2. Eine elementare Voraussetzung für die selektive Hemmung der
COX-2-Aktivität durch die „COX-2-Inhibitoren“ ist also die zeitabhängige Bildung des
[E-I]*Komplexes mit funktionell irreversibler Einbindung der Coxibe [COPELAND et
al. 1994].
Die Enzymkinetik selektiver COX-2-Inhibitoren erlangt im Wirkvergleich pharmakologischer Substanzen große Bedeutung, da die CSI in hohen Konzentrationen zunehmend
unspezifisch werden, vermehrt also auch die Aktivität der COX-1 hemmen. An bestimmten Entzündungsmodellen konnte demonstriert werden, dass die COX-2selektiven Inhibitoren in Dosen, die zum Erreichen signifikant anti-inflammatorischer
Effekte erforderlich waren, größtenteils bereits eine Inhibition der COX-1 bewirkten
[WALLACE et al. 1999 / EUCHENHOFER et al. 1998 / LORA et al. 1998 / SCHULIGOI et al. 1998 / PATRIGNANI et al. 1996 / PANARA et al. 1995]. Eine klare Differenzierung zwischen COX-1- und COX-2-Inhibition ist dann nicht mehr möglich. Bei
der Interpretation des Datenmaterials bisheriger Untersuchungen über die antiinflammatorische Potenz selektiver COX-2-Inhibitoren bedurfte der Konzentrationsbereich kleiner als [10µM] besonderen Augenmerks, da in höheren Konzentrationen nicht
mehr sicher von einer selektiven Hemmung der COX-2-abhängigen ProstaglandinSynthese ausgegangen werden konnte [PANARA et al. 1995].
In der vorliegenden Arbeit wurde ein Konzentrationsbereich von [10-5-10-6M] gewählt.
Celecoxib ist in diesen Konzentrationen schon mehrfach selektiv verwendet worden
TOMISATO et al. 2004 / GIERSE et al. 1999 / LIPSKY und ISAKSON 1997]. Da es
sich bei Lumiracoxib um den derzeit stärksten selektiven COX-2-Hemmer in vitro handelt [WITTENBERG et al. 2003 / TACCONELLI et al. 2004 / CAPONE et al. 2003],
ist auch hier von einem eindeutigen und monodirektionalem Inhibitionsverhalten auszugehen.
80
Nicht nur das eingesetzte „Enzym-Material“ bietet immer wieder Anlass zu wissenschaftlichen Diskussionen, sondern auch die Inkubationszeit, die für eine realistische
Evaluation der pharmakologischen Wirkpotenz aufgebracht werden sollte. Während
sich die Bildung des instabilen [E-I]-Komplexes sowohl unter unspezifischer, als auch
unter COX-2-selektiver Inhibition faktisch sofort einstellt, sind in der Literatur die Angaben uneinheitlich, welche Zeit mindestens benötigt wird, um eine sichere Konversion
des [E-I]-Komplexes in den irreversiblen [E-I]*-Komplex zu ermöglichen. Bei zu kurzer Inkubationszeit könnte nur das erste Stadium des kinetischen Inhibitionsprozesses
mit dann nur reversibler Bindung des Inhibitors an das Enzym und somit geringerem
Effekt auf die Prostaglandin-Synthese erreicht werden [PAIRET und VAN RYN 1998 /
COPELAND et al. 1994 / ROME und LANDS 1975] und so zu einer irrtümlich niedriger beurteilten Effektivität der Pharmaka und Fehlinterpretationen führen [VAGO et al.
1995].
Während HAWKEY ein allgemeines Zeitfenster von 15-30 Minuten postuliert [1999],
konnten LORA et al. 1998 zeigen, dass die In-Vivo-Potenz und COX-1-/COX-2Affinität unselektiver NSAID bzw. eines COX-2-selektiven Agens nach nur
20minütiger Inkubation nicht valide abgebildet werden. Im Rahmen der Kurzzeitinkubation wurde lediglich eine „instantaneous Inhibition“ erreicht, die nicht repräsentativ
für die Eigenschaften der selektiven COX-2 Inhibitoren in vivo sei. Andere Autoren
beschreiben - in Abhängigkeit vom jeweiligen Testmodell - erforderliche Inkubationszeiten von 10 Minuten [CARABAZA et al. 1997] 35 Minuten [LANEUVILLE et al.
1994], 40 Minuten [COPELAND e al. 1994], 60 Minuten [MELLO et al. 2000], 16
Stunden [WILBORN et al. 1995] bis hin zu 24 Stunden [MELLO et al. 2000 /
PATRIGNANI et al. 1994]
Beim gleichen Synovialis- bzw. Bursa-Modell und identischer Gewebeaufbereitung wie
in der vorliegenden Arbeit, setzte WILLBURGER Inkubationszeiten von fünf und 20
Minuten ein [1996], während KNORTH für jeweils 20 Minuten und 16 Stunden inkubierte [2002].
Um die gesamte Zeitspanne, von vorübergehender Hemmung nach Kurzzeitinkubation
bis hin zur irreversiblen Langzeithemmung, abzudecken, wurde zum Auftakt dieser Arbeit in entsprechenden Pilotexperimenten osteoarthrotisches Kniegewebe nach bewährtem Protokoll präpariert und das Eicosanoid 6-Keto-PGF1α in Überständen nach 3, 6
und 20 Stunden Inkubation immunoradiologisch bestimmt. Neben der generellen Me81
thodik der Gewebegewinnung, Präparation und Inkubation sollte so auch die Inkubationszeit standardgemäß etabliert werden und die Auswertung der Ergebnisse vor dem
Hintergrund bisheriger Untersuchungen möglich werden.
Der kürzeste Wert von drei Stunden näherte sich der Dauer der bisher stattgefunden
Kurzzeitinkubationen an, während die 20 Stunden das Intervall nach oben begrenzten.
Es lag bisher keine Untersuchung darüber vor, wie sich die Anwesenheit von COXInhibitoren auf die Prostaglandin-Synthese nach einer mittleren Zeitdauer von sechs
Stunden auswirkt.
Eine erste Auswertung nach dreistündiger Kurzzeit-Inkubation für die pharmakologisch
ungehemmte Prostaglandin-Freisetzung und die Produktion in Anwesenheit von Inhibitoren ergab Werte der gleichen Größenordnung. Die Eicosanoid-Synthese der ungehemmten Kontrollproben betrug mindestens doppelt so viel wie unter stärkster COXInhibition, auch wenn zu diesem Zeitpunkt alle absoluten Zahlenwerte nur im Hunderterbereich lagen. Nach Anwendung des Student-t-Tests unterschied sich der Prostaglandingehalt der entzündlichen Synovialis unter pharmakologischer Hemmung bereits nach
dieser kurzen Inkubationsdauer signifikant vom Kontrollwert.
Nach Verlängerung der Inkubationszeit des identischen Gewebes auf insgesamt sechs
Stunden, wuchs der Prostaglandingehalt in den Kontrollinkubaten exponentiell an. Die
Werte stiegen bis in den Tausenderbereich und betrugen damit das drei- bis dreizehnfache der Pharmakonwerte. Schon Prima Vista ließ sich hier eine Hemmung der COXSyntheseaktivität feststellen; inhibitorisch sank der Gehalt von 6-Keto-PGF1α um eine
Dezimalstelle. Statistisch gesehen erfüllten die Werte der mittelfristigen Inkubation den
Anspruch eines gewählten Konfidenzintervalles von 99% und waren unter einer gegebenen Irrtumswahrscheinlichkeit von α = 0.01 signifikant.
Der gewählte Endpunkt von sechs Stunden für eine aussagekräftige Inkubation von entzündlich verändertem Gewebe mit Cyclooxygenase-Inhibitoren schien auch vor dem
Hintergrund der pharmako-kinetischen Daten der einzelnen verwendeten Inhibitoren
sinnvoll, lag er doch im Bereich der jeweiligen Halbwertszeiten und gewährleistete so
das Eintreten des jeweiligen Wirkungsgipfels. Besonders deutlich wurde dieser Sachverhalt am Einsatz des COX-2-selektiven Celecoxib in der Konzentration von [10-6M],
das in der Langzeitinkubation von 20 Stunden sein Wirkmaximum bereits überschritt
und die Prostaglandin-Synthese insgesamt schwächer beeinflusste. Zwar war die prozentuale Hemmung nach zwanzig wie nach sechs Stunden signifikant gegeben, allerdings stieg der absolute 6-Keto-PGF1α-Gehalt bereits wieder an und erreichte Werte, die
82
größer waren, als nach mittelfristiger Inkubation. Eine weiter zunehmende Annäherung
von Kontroll- und Inhibitionswert im zeitlichen Verlauf, über die 20 Stunden hinaus,
war anzunehmen. Die Tatsache, dass die anteilige Hemmung nach zwanzig Stunden
immer noch jeweils über 90 % betrug, legte nahe, das die pharmakologischen Substanzen trotz Langzeitinkubation strukturell stabil blieben. Dies stimmte mit den Beobachtungen von PANARA et al. (1995) überein und dient der Qualitätssicherung der vorliegenden Methode.
Im Rahmen einer Langzeitinkubation von 20 oder mehr Stunden ist neben der Stabilität
des Pharmakons auch die Integrität des eingesetzten Gewebes zu berücksichtigen. Die
Manipulation des Gewebes bringt unweigerlich eine Steigerung der ProstaglandinSynthese mit sich. Der Effekt ist jedoch, im Vergleich zu einer nicht präparierten Kontrollgruppe, nur gering ausgeprägt [WITTENBERG 1993]. Durch die experimentelle
Prozessierung des Gewebes, das Herauslösen aus dem natürlichen geweblichen Umfeld
und das langfristige Aufrechterhalten eines künstlichen Milieus könnte es in den Inkubationsproben durch zytodestruktive Ereignisse zu einer artifiziellen Induktion des
COX-2-Enzymes kommen [ZAMORA et al. 1998 / HO et al. 1998 / LU et al. 1995]. Im
Zuge der Etablierung des vorliegenden experimentellen Entzündungsmodells wurde
aber bereits mehrfach pathologisch nachgewiesen, dass die - nach der beschriebenen
Methode präparierten und inkubierten - Gewebeproben, auch nach mehrstündiger Inkubationszeit, keine lichtmikroskopischen Anzeichen für Apoptose, Zelldegeneration oder
-untergang aufwiesen [KNORTH 2002 / MÜLLER 1999 / WILLBURGER 1996].
Zur einfachen Schmerzkontrolle bei destruktiven Gelenkerkrankungen sind der direkte
Zugang der Pharmaka zum Entzündungsort und das Eingreifen in lokale Vorgänge nicht
zwingend erforderlich. Auch ohne die, in der vorliegenden Arbeit nachgewiesenen, lokalen Aktionen tritt umgehend ein analgetischer Effekt ein. Betrachtet man den zeitlichen Verlauf der COX-2-Hemmung und der reduzierten PGE2-Produktion im entzündlichen Knie, zeigt sich eine messbare Verzögerung des Wirkeintrittes im Vergleich zum
Blut. Therapeutische Konzentrationen im Synovialisgewebe werden also erst mit einiger Verzögerung erreicht [DUFFY et al. 2003]. Die frühe Analgesie von COX-2Inhibitoren bei Arthritis wird also nicht am aktuellen Ort der Entzündung erreicht, sondern über die ausgeübte Wirkung auf zentrale COX-Enzyme und PG-Spiegel: COX-2
wird konstitutiv auf Rückenmarksebene exprimiert, ihre Aktivität fluktuiert in Abhängigkeit von peripheren Entzündungen [VANEGAS und SCHAIBLE 2001]. Die Hem83
mung der COX-2 auf diesem Niveau führt zu einer geringeren, zentralen PGE2Produktion, sowie zu einer verminderten Allodynie und Hyperalgesie [DUFFY et al.
2003]. Durch die Veränderung dieser Parameter ändert sich die generelle Nozizeption
und es kommt zu einer ersten, erlebbaren Analgesie für den Patienten.
In der Versuchsplanung dieser Arbeit wurde verstärkt auf die Verwendung unterschiedlicher, entzündlicher Gewebe für die Austestung der Pharmaka-Palette Wert gelegt. Das
eingesetzte Synovialis- und Bursa-Gewebe unterschied sich nicht nur in der histologischen Struktur und der entsprechenden Pathophysiologie der beiden Erkrankungen,
sondern auch durch den anatomisch-topischen Bezug zum entzündlich veränderten Gelenk: Während die Synovialis als „Gelenk-Innenhaut“ den Knorpel zur Gelenkhöhle hin
überzieht und daher ein intra-artikulärer Bestandteil ist, „polstert“ die Bursa subacromialis die mechanische Belastung des Schultergelenkes unterhalb des Akromions ab und
ist somit ein wichtiger, extra-artikulärer Bestandteil.
Dieselbe Methodik wurde bereits zuvor in verschiedenen Arbeiten angewandt
[KNORTH et al. 2002 / WILLBURGER et. al. 1996 / WITTENBERG et al. 1991]. Diese Untersuchungen verwendeten jedoch jeweils nur einen Gewebetyp und zogen zur
Einordnung und Interpretation der Ergebnisse andere Arbeiten heran. Bei gleicher Konzentration der eingesetzten Pharmaka und ähnlicher Gewebepräparation ist dieser Vergleich zwar zulässig, es bleibt jedoch immer die Unsicherheit einer Abweichung in der
Verfahrensweise und untersuchungsbedingter Details bestehen.
Streng genommen ist ein quantitativer Vergleich der pharmakologischen Effekte auf die
Prostaglandin-Freisetzung im Synovialis-Modell mit den Ergebnissen des BursaModells nur dann möglich, wenn das Vergleichsgewebe nach einem simultanen Procedere aufbereitet, behandelt und inkubiert wurde [KNORTH 2002 / GILROY und COLVILLE-NASH 2000 / PAIRET und VAN RYN 1998]. Das in dieser Arbeit verwendete
Synovialis- und Bursagewebe ist nicht nur auf identische Weise präpariert, sondern
möglichst auch parallel inkubiert und im selben Immunoassay ausgewertet worden. Zudem sei hierbei auf die Übereinstimmung der Inkubationszeiten hingewiesen, die in
bisherigen Vergleichen deutlich voneinander abwichen. Fälschliche Auswertungen und
Schlussfolgerungen aufgrund unbewusster, veränderter Rahmenbedingungen werden
damit weitestgehend minimiert.
84
Betrachtet man die basale, ungehemmte Freisetzung der untersuchten Prostaglandine, so
kam es - nach sechs Stunden Inkubationszeit - zu einem PGE2-Gehalt von 55153.5 57089 pg/mg FG (abhängig vom Inkubationsmedium) in Synovialis und von 21051.17 25041.5 pg/mg FG in Bursa. Für 6-Keto-PGF1α betrugen die Werte 26391.83 27057.67 pg/mg FG und 21780.83 - 23457.17 pg/mg FG respektive. Übereinstimmend
mit den Arbeiten von KNORTH [2002] und WILLBURGER [1996] unterschied sich
die Freisetzung von PGE2 in den beiden Geweben deutlich, die bursale Synthese betrug
kaum die Hälfte der synovialen Produktion. Auf dieser Grundlage könnte man die bursalen Veränderungen im Rahmen des Impingement-Syndroms als geringgradiger ausgeprägte Entzündung interpretieren, als die Synovitis bei der Osteoarthrose. Im Falle
von 6-Keto-PGF1α, dem stabilen Abbauprodukt des Prostacyclins, war ein ausgeprägter
Unterschied jedoch nicht feststellbar. Während PGE2 einen „klassischen“ Parameter
zahlreicher, inflammatorischer Läsionen darstellt [MARTEL-PELLETIER et al. 2004 /
BERTOLINI et al. 2002 / PORTANOVA et al. 1996], könnte die anteilig höhere 6Keto-PGF1α-Freisetzung in der Bursa auf eine verstärkte Angiogenese innerhalb des
dortigen Entzündungsgeschehens hinweisen. Die Bedeutung von 6-Keto-PGF1α als Parameter für eine inflammatorische Neovaskularisierung wurde mehrfach herausgestellt
[VANE und BOTTING 1995 / HLA et al. 1993 / NORIOKA et al. 1987] und die histologische Untersuchung von entzündlichem Bursagewebe zeigte eine deutliche Injektion
von Blutgefäßen bei gering ausgeprägter leukozytärer Infiltration [KNORTH 2002].
Laut GERRITSEN fördern angiogenetische Wachstumsfaktoren die Endothelmigration
und -proliferation und gelten gleichzeitig als potente COX-2-Induktoren [1996].
Vergleicht man die pharmakologische Beeinflussung der PGE2-Produktion in beiden
Geweben, so sind die Auswirkungen in Synovialis und Bursagewebe gleichsinnig. Auch
wenn sich der basale PGE2-Spiegel in den Kontrollinkubaten um mehr als 50 Prozent
unterschied, so waren sich die prozentualen Inhibitionswerte doch erstaunlich ähnlich
und erreichten beinahe identische Werte. Unter Einfluss von Diclofenac kam es zu einer
signifikanten synovialen bzw. bursalen Synthesehemmung von 96.25 % bzw. 94.08 %.
Für Lumiracoxib ergaben sich 89.3 % bzw. 92.69 % signifikanter Inhibition. Das neue
Coxib schien also in seiner Potenz, die PGE2-Synthese zu hemmen, in der untersuchten
Konstellation dem unspezifisch wirkenden Diclofenac durchaus ebenbürtig. Das bereits
in vivo verwendete, selektive Celecoxib erreichte signifikante Werte von 52.36 % synovial und 30.92 % bursal und das COX-1-präferentielle SC-560 wirkte mit 42 % in der
85
Synovialis und 30.2 % in der Bursa am wenigsten effektiv auf die entzündliche PGE2Freisetzung. Damit grenzten sich diese beiden Substanzen deutlich von der Gruppe der
hoch potenten Synthese-Hemmer ab. Sie zeigten jedoch nicht nur einen insgesamt
schwächeren Wirkungsgrad, sondern präsentierten gleichzeitig auch eine größere intergewebliche Varianz mit Abweichungen von bis zu 20 Prozentpunkten.
Bei der Synthese von 6-Keto-PGF1α splittete sich die Palette der pharmakologischen
Inhibitoren im geweblichen Vergleich noch deutlicher auf und war nach IsoenzymPräferenz differenziert. Wie bereits ausgeführt, entsprach sich in diesem Fall die basale,
ungehemmte Synthese in Synovialis und Bursa und lag insgesamt unter dem Gehalt von
PGE2. Unter Diclofenac kam es hierbei zu einer Hemmung von 91.33 % in Synovialis
und 90.15 % in Bursa, für Lumiracoxib betrugen die Werte 68.06 % bzw. 72.98 %. Celecoxib inhibierte die Freisetzung synovial zu 45.82 % und bursal zu 39.85%. 38.69 %
Hemmung erbrachte SC-560 in Synovialis und nur 5.57 % in der Bursa subacromialis.
Graphisch interpretiert zeigten diese Werte eine deutliche Abstufung in der SyntheseHemmung und ließen für 6-Keto-PGF1α Rückschlüsse auf einen Stoffwechselweg zu,
der sich kinetisch von dem des PGE2 unterscheidet. Beim klassischen inflammatorischen Parameter PGE2 senkte das COX-1-präferentielle SC-560 die Produktion in beiden Gewebetypen im gleichen Größenverhältnis und ließ somit auf eine entsprechende
Beteiligung dieser COX-Isoform an der Inflammationsgenese schließen. Bezogen auf
das angiogenetische 6-Keto-PGF1α, hemmte SC-560 die synoviale Freisetzung vergleichbar, in der Bursa kam es nur zu einer prozentualen Inhibition von weniger als 10
%. Da der Gesamtgehalt an 6-Keto-PGF1α aber dem der Synovialis entsprach, ist von
einer anteilig höheren Produktion durch die COX-2 auszugehen.
Der neue Cox-2-selektive Inhibitor Lumiracoxib, der in der vorliegenden Arbeit erstmals unter solchen Versuchsbedingungen zum Einsatz kam, und ab August 2004 im
deutschen Handel erhältlich sein wird, schnitt deutlich besser ab, als die bereits großzügigst klinisch eingesetzte Alternative Celecoxib. Sowohl bei der Synthese- Hemmung
von PGE2, als auch von 6-Keto-PGF1α war Lumiracoxib signifikant überlegen und näherte sich, im prozentualen Vergleich, sogar dem unselektiven „In-Vitro-Goldstandard“
Diclofenac an. Betrachtete man die prozentuale Inhibition als Richtgröße und als interpretierbares Äquivalent für die Effektivität der eingesetzten Substanzen, lagen Diclofenac und Lumiracoxib - vereinfacht ausgedrückt - weit oberhalb der 50% - Grenze, wäh86
rend SC-560, aber auch Celecoxib, in allen experimentellen Varianten deutlich unter
diesem Wert blieben.
Lumiracoxib und Celecoxib gehören beide in die Substanzklasse der phenylsulphonhaltigen Diarylheterozyklen. Lumiracoxib unterscheidet sich jedoch von der chemischen
Grundstruktur der Coxibe, indem es erstmals nicht trizyklisch aufgebaut ist und eine
Carboxylgruppe besitzt [MANGOLD et al. 2004 / MARSHALL et al. 2002]. Es stellt
das bisher einzige azidische Coxib dar [CAPONE et al. 2003] und ähnelt, trotz seiner
Zugehörigkeit zur Gruppe der Coxibe, in der Grundstruktur eher dem unselektiven Diclofenac [FITZGERALD 2003]. Diese biochemische Ähnlichkeit könnte die in der vorliegenden Arbeit beobachtete, vergleichbare Hemmung von Diclofenac und seinem Analogon, Lumiracoxib, ansatzweise erklären.
Durch sein einzigartiges chemisches Profil als amphiphiles Molekül, seine Persistenz in
der Synovia und eine bevorzugte Distribution in entzündlichem Gewebe, die vermutlich
auf die erhöhte Ionisation bei inflammatorisch erniedrigtem pH-Wert zurückzuführen
ist, könnte Lumiracoxib, im Vergleich zu bisherigen analgetischen Therapeutika, über
eine verlängerte klinische Wirksamkeit verfügen [ATHERTON et al. 2004 / SCOTT et
al. 2004 / CAPONE et al. 2003 / DAY et al. 1999]. Die synoviale Verteilungskinetik
erweitert möglicherweise die therapeutische Aktion von Lumiracoxib über die, aus
Plasmawerten erwartete, Wirkung hinaus [SCOTT et al. 2004].
In der jüngsten Vergangenheit belegten diverse Studien, dass es sich bei Lumiracoxib
um den derzeit potentesten und selektivsten COX-2-Inhibitor in vitro handelt [TACCONELLI et al. 2004 / BENEVOLENSKAYA et al. 2003 / CAPONE et al. 2003].
Neben diesen viel versprechenden inhibitorischen Fähigkeiten in vitro, scheint Lumiracoxib nach ersten klinischen Studien auch in vivo erfolgreich einsetzbar und anderen
selektiven COX-2-Inhibitoren deutlich überlegen zu sein: Nach mehrwöchiger Therapie
hatte Lumiracoxib bei Osteoarthrose-Patienten eine bessere Wirkung auf die Schmerzstärke und das Krankheitserleben, als Celecoxib [TANNENBAUM et al. 2004]. Im Bezug auf die kurzfristige Analgesie war Lumiracoxib - in der Reduktion der summierten
Schmerzintensität - Rofecoxib, Celecoxib und Plazebo signifikant überlegen. Es verfügte über die am schnellsten einsetzende Analgesie und gleichzeitig die längste Zeitspanne
bis zum Einfordern weiterer, unterstützender Analgetika [KELLSTEIN et al. 2004].
Um das pharmakologische Profil von Lumiracoxib weiter heraus zu stellen, und es in
die täglich größer werdende Palette von Cyclooxygenase-Inhibitoren einzuordnen, wur87
de seine inhibitorische Kompetenz in Bezug auf Konzentrations- und Gewebsabhängigkeit geprüft. Wie bereits erwähnt, hemmte dieser selektive Inhibitor in den beiden Konzentrationen [10-5M] und [10-6M] die Prostaglandin-Produktion signifikant in allen
durchgeführten Versuchen. Beide eingesetzten Dosen erreichten eine prozentuale
Hemmung im Bereich von 68 – 97 % und waren damit dem zweiten COX-2-selektiven,
sowie natürlich dem COX-1-selektiven Präparat, weit überlegen. Lediglich das unspezifische Diclofenac, das - bei Patienten mit niedrigen Risikofaktoren - noch immer den
therapeutischen Goldstandard in der Therapie entzündlicher Gelenkerkrankungen darstellt, konnte diese potente Hemmung noch übertreffen.
Im Vergleich der beiden eingesetzten Konzentrationen von Lumiracoxib miteinander,
war eine deutliche Steigerung der Synthesehemmung mit der Erhöhung der Dosis um
eine Zehnerpotenz möglich: Während die synoviale PGE2-Freisetzung durch [10-6M]
Lumiracoxib zu 89.3 % gehemmt wurde, erreichte dieser Wert in einer [10-5M]-Lösung
93.98 %. In der Bursa war die Inhibitionsverteilung mit 92.69 % und 97.31 % gleichsinnig. Auch bei der Synthese von 6-Keto-PGF1α in den beiden Geweben hatte das höher dosierte Lumiracoxib erwartungsgemäß einen stärkeren Einfluss. Die Werte betrugen hier 68.06 % und 78.67 in Synovialis bzw. 72.98 % zu 80.52 % in der Bursa respektive.
Aus der Literatur ist einschlägig bekannt, dass selektive Inhibitoren im Dosisbereich
von [10-3M] bis [10-4M] nur noch eine fragliche Selektivität ausüben und in nichtquantifizierbarem Ausmaße das COX-1-Isoenzym ebenfalls inhibieren [WALLACE et
al. 1998 und 1999 / EUCHENHOFER et al. 1998 / LORA et al. 1998 / PAIRET und
VAN RYN 1998 / / SCHULIGOI et al. 1998 / PATRIGNANI et al. 1996 / PANARA et
al. 1995]. Im Bereich von [10-5M] kann jedoch noch von einer ausschließlichen Inhibition der COX-2 ausgegangen werden [KNORTH 2002 / WILLBURGER 1996].
Über die Entwicklung des Interleukin-Spiegels bei Gelenkerkrankungen unter Pharmakotherapie mit Cyclooxygenase-Inhibitoren ist aus der Literatur wenig bekannt. Der
gewählte Inkubationszeitraum von sechs Stunden ist für die Beurteilbarkeit der Inhibitoren-Wirkung auf den inflammatorischen Prostaglandin-Haushalt ausreichend und lässt
valide Interpretationen zu, für die untersuchten Interleukine ist jedoch kein bestimmtes
Zeitfenster nachgewiesen. Die Messwerte nach sechsstündiger Inkubation gaben tendenziell Aufschluss über die Entwicklung des Interleukin-Spiegels im therapierten Entzündungsgeschehen und ein signifikanter Unterschied zu den Kontrollproben war teil88
weise feststellbar (Ergebnisse nicht abgebildet). Dieser Aspekt ermutigte, die Freisetzung von TNFα und IL1β unter einem zeitlichen Verlaufsaspekt genauer zu betrachten
und die Inkubationszeit, wie in den voran gegangenen Pilotexperimenten, auf 20 Stunden auszudehnen. Auf diese Weise sollte eine möglicherweise später einsetzende Reaktion im Stoffwechselweg der Interleukine auf die pharmakologische Inhibition der inflammatorisch bedeutsamen COX-Isoenzyme erfasst werden. Die ungehemmte Interleukin-Freisetzung in den untersuchten Proben nahm nach der Langzeitinkubation deutlich zu, was – wie bereits erwähnt – für eine immer noch bestehende Vitalität des Gewebes spricht. Gleichzeitig belegt diese Tatsache, dass die gewählten Interleukine sehr
wohl eine Rolle in dem jeweils zugrunde liegenden Entzündungsprozess spielen;
schließlich veränderten sich ihre Werte über die Zeit und in Abhängigkeit vom zugesetzten Pharmakon.
Eine Beeinflussung durch Vorgänge auf Zellebene ist möglich und kann beim derzeitigen Kenntnisstand nicht ausgeschlossen werden. Anhand des vorliegenden Datenmaterials wird eine Interaktion der pharmakologischen COX-Inhibition mit dem IL1βHaushalt auf jeden Fall möglich, und von einer Modulation im Entzündungsfall ist ebenfalls auszugehen. Da die Interleukine als Transkriptionsfaktoren auf genetischer Ebene direkt die COX-Exprimierung mitbestimmen [SOLOFF et al. 2004 / LIU et al.
2003 / MARTEL-PELLETIER ET AL. 2003 / NIE et al. 2003 / MORISSET et al.
1998], ist auch die Hypothese eines Anstiegs dieser Mediatoren durch negative Rückkopplung bei Hemmung der Isoenzyme denkbar. FIORUCCI konnte in diesem Zusammenhang eine Steigerung der TNFα-Synthese am Magen nach Diclofenacgabe nachweisen [2002]. Die im Rahmen dieser Arbeit erhobenen Werte gingen zwar tendenziell in
eine Richtung, im zeitlichen Verlauf war jedoch kein weiterer Aufschluss möglich. Den
Wechselwirkungen und der Interleukin-Kinetik liegt vermutlich ein wesentlich komplexeres Regulationsnetzwerk zugrunde, als dass es mit der COX-Inhibition allein ausreichend erklärt werden könnte.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die PGE2-Synthese in der Bursa generell geringer ausfällt, die 6-Keto-PGFα-Synthese jedoch der in der Synovialis entspricht. Betrachtet man die prozentualen Inhibitionswerte an sich, ist aber von einer äquipotenten Wirkkraft der eingesetzten Pharmaka in beiden Geweben auszugehen. Diese Ergebnisse untermauern die Erfahrungen aus dem klinischen Alltag, dass sowohl traditionelle
NSAID, als auch die neueren Coxibe ein sinnvolles therapeutisches Mittel zur Sym89
ptomkontrolle und Schmerzreduktion im Rahmen der Osteoarthrose und des Impingement-Syndroms darstellen. Bei einer rein biochemischen und pharmakologi-schen Beurteilung der Wirkpotenz, sowie bei Vernachlässigung aller möglicher Nebenwirkungen
und Komplikationen, wäre aufgrund der vorliegenden Ergebnisse Diclofenac weiterhin
in beiden Krankheitsbildern das Therapeutikum der Wahl. Basierend auf dem vorliegenden Zahlenmaterial, könnte es aber - bei Patienten mit entsprechenden Risikofaktoren - durch das vermutlich besser verträgliche, aber auch wesentlich teurere Lumiracoxib ersetzt werden. Bisher waren die Coxibe im selektiven Konzentrationsbereich den
traditionellen NSAID therapeutisch deutlich unterlegen. WALLACE postulierte, dass
COX-2-selektive Substanzen generell nie einen vergleichbaren anti-inflammatorischen
Effekt hervorrufen könnten, wie eine kombinierte COX-1- und COX-2-Inhibition
[1999]. Lumiracoxib hemmt sowohl in [10-5M], als auch in [10-6M] die PG-Synthese
potent und signifikant und bietet daher erstmals - bei vermutlich strukturklassen-bedingt
niedrigerer GI-Toxizität - eine echte Alternative in der Langzeittherapie entzündlicher
Gelenkerkrankungen. Neben den durchgeführten Experimenten zur pharmakologischen
Wirksamkeit sind aber plazebo-kontrollierte, doppel-blinde klinische Studien notwendig, um diesen neuen, selektiven Inhibitor weiter zu charakterisieren und seine klinische
Bedeutsamkeit einzuordnen.
Die Auswahl der Stichprobe in der vorliegenden Studie schränkt ihre allgemeine Aussagekraft deutlich ein. Altersmäßig umfasste die Bursa-Gruppe eine Reichweite von 4671 Jahren mit einem mittleren Durchschnittsalter von 59 Jahren, während die Synovialis-Gruppe Patienten im Alter von 62-74 Jahren einschloss und ein arithmetisches
Durchschnittsalter von 68.5 Jahren aufwies. Die relativ „jüngere“ Bursa-Population
ergab sich aus der Pathogenese des Impingement-Syndroms (siehe 1.4.1), das bevorzugt
bei jüngeren, athletischen Menschen und Berufstätigen mit Überkopf-Beanspruchung
des Schultergelenkes auftritt.
Die untersuchten Patienten waren sicherlich nicht repräsentativ für die Grundgesamt
aller an Osteoarthrose bzw. Impingement-Syndrom erkrankten Menschen der Bevölkerung. Die sich bietende Population, aus der eine entsprechende Untersuchungsgruppe
stichprobenartig gezogen werden konnte, beschränkte sich auf hospitalisierte Patienten,
die – nach Versagen der konservativen Therapie – zur chirurgischen Intervention vorgesehen waren. Hierbei handelte es sich also jeweils um Patienten, bei denen die Krankheit schon maximal progredient war bzw. ein operativer Eingriff als ultima Ratio nach
90
Versagen der konservativen Behandlung notwendig wurde oder die Therapie aus anderen erschwerenden Gründen nicht anschlug. Zudem mussten diese Patienten eine gewisse „Wash-Out-Periode“ sämtlicher anti-inflammatorischer Substanzen - sowohl systemischer als auch lokaler Anwendung - hinter sich haben, um bei der experimentellen
Inkubation über möglichst „saubere“ Gewebe mit einer ähnlichen, zugrunde liegenden
Prostaglandin-Produktion zu verfügen. Diese methodische Kondition entfernte - meiner
Meinung nach - die experimentell betrachtete Einheit wesentlich mehr von der „realen“
Grundgesamtheit, als der fehlende Querschnitt durch alle Stadien der Erkrankungen;
denn die Mehrheit der chronisch erkrankten Patienten nimmt sicherlich auf einer regelmäßigen Basis entzündungshemmende und schmerzlindernde Medikamente zur Symptomkontrolle und Verbesserung der Lebensqualität ein.
Beide Punkte wirken zwar nachteilig auf die Repräsentanz der Studie, tangieren die
praktische therapeutische Relevanz jedoch nur peripher. Wenn die getesteten Medikamente bei therapie-refraktären und analgetika-naiven Patienten Wirkung zeigen und
einen signifikanten Einfluss auf die zugrunde liegenden enzymatischen Vorgänge haben, dann wären sie unter „erleichterten“ Bedingungen wie einer nur leichtgradigen
Erkrankung des Gelenkes oder der Ko-Administration anderer Analgetika bzw. Antiphlogistika im Sinne eines Stufenschemas sogar mit größerer Wahrscheinlichkeit effektiv
und erfolgsversprechend.
Ein Großteil der Patienten mit Osteoarthrose leidet an Komorbiditäten, die sie ebenfalls
medikamentös therapieren. Hierzu zählen die koronare Herzkrankheit, arterielle Hypertension, periphere Gefäßerkrankungen, Herzinsuffizienz, renale Funktionseinschränkungen, Diabetes und Erkrankungen der Atemwege [MARKS und ALLEGRANTE
2002 / GABRIEL et al. 1999].
Vor dem Hintergrund dieser Begleiterkrankungen ist es nicht selten, dass ein Patient
gleichzeitig COX-2-selektive Inhibitoren und kardioprotektives Aspirin in niedriger
Dosierung einnimmt. Statistisch gesehen ist dies besonders häufig bei älteren Patienten
mit Osteoarthrose der Fall [MARKS und ALLEGRANTE 2002 / GABRIEL et al. 1999
/ CLARIA und SERHAN 1995 / PATRONO 1994]. Neuere Studien haben ergeben,
dass unter dieser Koadministration in Patienten mit Rheumatischer Arthritis und Osteoarthrose die Inzidenz gastrointestinaler Ulzera signifikant ansteigt und das präferierte
Sicherheitsprofil der Coxibe damit vermindert wurde [SIKES et al. 2002 / GOLDSTEIN et al. 2001 / Food and Drug Administration 2001 / SILVERSTEIN et al. 2000].
91
FIORUCCI et al. zeigten, dass die orale Einnahme von Coxiben bei chronischen Aspirin-Anwendern das Auftreten gastrischer Läsionen deutlich erhöht [2002].
Gleichzeitig können NSAID und Coxibe mit dem kardioprotektiven, antithrombozytären Effekt des Aspirins interferieren, da sie den Zugang zum aktiven zentrum der COX verhindern und Aspirin dann metabolisiert wird, bevor es seine Wirkung
entfalten kann [WIDLANSKY et al. 2003 / SIKES et al. 2002].
Ähnlich wie bei vielen Ulkus-Patienten bereits vor Einnahme der COX-Inhibitoren eine
erhöhte gastrointestinale Sensibilität vorliegt [NORGARD et al. 2004], weisen auch
Patienten mit erhöhtem Risiko für kardiovaskuläre Nebenwirkungen bereits vor Therapiebeginn zahlreiche Risikofaktoren auf: Atemwegserkrankungen, arterielle Hypertension, hohe Cholesterin-Spiegel, niedrige HDL-Spiegel, renale Einschränkungen und
Diabetes mellitus [SINGH et al. 2002 / SONNENBLICK 2002].
Die selektiven COX-2-Inhibitoren sind jedoch, ebenso wie NSAID, neben ihren möglichen negativen Auswirkungen auf das kardiovaskuläre System, mit renalen Schädigungen assoziiert [CHENG und HARRIS 2003 / BRATER 2002 / MUKHERJEE 2002 /
SIMON et al. 2002 / KOMERS et al. 2001].
COX-2 wird in der menschlichen Niere nach einem bestimmten Verteilungsmuster konstitutiv exprimiert. Die Expression wird in Abhängigkeit von Volumenänderungen und
extrazellulärem Ionengehalt reguliert. Damit kommt ihr möglicherweise eine bedeutende Rolle in der renalen Steuerung der Salz- und Wasserhomöostase, sowie der Hämodynamik zu [CHENG und HARRIS 2004]. Beim gesunden, hydrierten Patienten sind
PGs nur unwesentlich in die renale Hämodynamik involviert. Bei verminderter Nierenfunktion haben sie jedoch eine große kompensatorische Rolle [PARENTE und PERRETTI 2003 / BRATER 2002 / GALLI und PANZETTA 2002 / LeLORIER et al.
2002]. Die COX-Hemmung auf renaler Ebene kann eine bestehende arterielle Hypertension verschlechtern und zu substanzieller Morbidität und Mortalität führen [LAUFER 2004].
Mehrfach wurde beobachtet, dass die traditionellen NSAID im anfälligen Patienten eine
Salzretention und eine verminderte glomeruläre Filatrationsrate provozieren und so den
arteriellen Blutdruck in normo- und hypertensiven Patienten erhöhen können [JOHNSON 1997 / DE LEEUW 1996]. Es handelte sich hierbei lediglich um eine mittlere Erhöhung von 5mmHg, langfristig ist sie jedoch klinisch bedeutsam und erhöht das Herzinfarkt- und Schlaganfallrisiko [BRATER 2002 / SIMON et al. 2002 / DE LEEUW
92
1996]. Da die meisten antihypertensiven Medikamente, außer Calcium-Antagonisten
und AT2-Rezeptorblockern, auf die Synthese vasodilatativer PG angewiesen sind
[WHELTON 2001 / JOHNSON 1997], antagonisieren NSAID teilweise die Effekte
dieser Substanzen und beeinflussen so zusätzlich die Blutdrucklage der Patienten
[MENGLE-GAW und SCHWARTZ 2002]. Auch das COX-2-selektive Rofecoxib interferierte in klinischen Studien mit der Wirkung von ACE-Hemmern und β-Blockern
[WHELTON et al. 2002].
Die Coxibe beeinflussen die renalen Variablen in gleicher Weise wie NSAID
[SCHWARTZ et al. 2002 / WHELTON et al. 2000 / CATELLA-LAWSON et al. 1999],
allerdings sind ihre Auswirkungen weniger schwerwiegend [BRATER 2002 / KOMERS et al. 2001]. Beim gesunden Erwachsenen mit ausgeglichenem Salz-WasserHaushalt haben die Coxibe nur einen minimalen Effekt [CATELLA-LAWSON et al.
1999], bei älteren und salzarmen Patienten nimmt der Einfluss auf die Hämodynamik
jedoch stetig zu [ROSSAT et al. 1999 / WHELTON et al. 2000]. Kommt es zu einem
relativen oder absoluten intra-vaskulären Volumenmangel, können die COX-2selektiven Inhibitoren verheerende Auswirkungen auf die renale Funktion haben
[CHENG und HARRIS 2004]. Unter NSAID-Therapie kann es im prädisponierten Patienten durch eine Erhöhung des peripheren Gefäßwiderstandes und eine Verminderung
der renalen Perfusion außerdem zur Entwicklung oder Verschlechterung einer Herzinsuffizienz kommen [PAGE und HENRY 2000].
Da die arterielle Hypertension eine häufige Komorbidität bei Patienten mit Osteoarthrose ist [KOMERS et al. 2001], scheint bei ihnen der Einsatz COX-2-selektiver Coxibe
nahe zu liegen. Die darauf ausgelegte SUCCESS-Studie (Successive Celecoxib Efficacy
and Safety Studies) untersuchte die renale Sicherheit von Celecoxib in älteren, hypertensiven Osteoarthrose-Patienten und ergab sechs Wochen einen Anstieg des systemischen Blutdrucks. Allerdings bestehen große Bedenken bezüglich des eingesetzten Studienprotokolls, so ist nicht unbedingt von einer optimal eingesetzten HypertensionsTherapie auszugehen [WHELTON et al. 2002 / KOMERS et al. 2001 / WHELTON et
al. 2001].
Bei Patienten mit renalem Risiko sollten dennoch vor Einsatz der Coxibe die gleichen
Vorsichtmaßnahmen gelten, wie bei NSAID. Es empfiehlt sich daher, Patienten für eine
medikamentöse Therapie mit COX-Hemmern sorgfältig auszuwählen, Komorbiditäten
und -medikationen zu berücksichtigen und wichtige Parameter therapiebegleitend zu
überwachen [LAUFER 2004]. Besondere Vorsicht ist bei Patienten geboten, die eine
93
chronische Herzinsuffizienz, Leberzirrhose, chronische Nierenerkrankung, fortgeschrittene Dehydrierung oder ein erhöhtes Lebensalter aufweisen. Alle diese Faktoren begünstigen Volumenmangel und Funktionsreduktion in der Niere [WHELTON 2001].
Viele Studien untersuchen derzeit die Auswirkungen COX-2-selektiver Substanzen auf
das kardiovaskuläre System und bestätigen die Tendenz der Coxibe, den Blutdruck zu
erhöhen oder eine vorbestehende Hypertension zu verschlechtern. Welche Substanz in
welchem Ausmaß für diese Effekte verantwortlich ist und ob unterschiedlich starke
Tendenzen innerhalb dieser Substanzklasse vorliegen, bleibt jedoch abzuwarten.
Sicher ist jedoch, dass die Coxibe ein Ungleichgewicht zwischen anti- und prothrombotischen Eicosanoiden hervorrufen und so das Risiko thrombo-embolischer Ereignisse
erhöhen könnten [FITZGERALD 2002 / MUKHERJEE 2002 / DOWD et al. 2001 /
HENNAN et al. 2001 / KOMERS et al. 2001]. Alle diese Erkenntnisse weisen darauf
hin, dass es sinnvoll ist, nach anderen Wegen der Weiterentwicklung von NSAID zu
suchen, als lediglich die Selektivität für COX-2 zu erhöhen [TOMISATO et al. 2004].
Allgemein häufen sich inzwischen die Untersuchungen bezüglich der generellen Sicherheit von NSAID und COX-2-selektiven Inhibitoren. Nach ausgiebiger Evaluation
nimmt für beide Substanzklassen das Risiko auf gastrointestinaler, kardiovaskulärer und
renaler Ebene zu: Ernsthafte gastrointestinale Komplikationen, wie Perforationen, Ulzerationen und Blutungen können signifikante und sogar fatale Auswirkungen für die Patienten haben [LAUFER 2004]. In epidemiologischen Studien riefen NSAID außerdem
unerwünschte Nebenwirkungen im unteren Gastrointestinaltrakt hervor: Neben den oben genannten Beschwerden zählten hierzu Obstruktion, Divertikulitis und die Exazerbation bestehender entzündlicher Darmerkrankungen [WOLFE et al. 1999 / WILCOX
et al. 1997].
NSAID sind weltweit die am häufigsten verwendete Substanzklasse an Pharmaka
[SEAGER und HAWKEY 2001 / WOLFE et al. 1999] und demnach ist die NSAIDinduzierte Gastropathie eine der häufigsten Arzneimittel-Nebenwirkungen [TRAMER
et al. 2000].
Eine Ulkusanamnese, erhöhtes Lebensalter, die gleichzeitige Therapie mit Antikoagulantien oder Kortikosteroiden, NSAID in sehr hoher Dosis oder die gleichzeitige Einnahme mehrerer NSAID zählen zu den Hauptrisikofaktoren für das Auftreten gastrointestinaler Komplikationen unter NSAID-Therapie [LAINE 2002 / SEAGER und
94
HAWKEY 2001 / HERNANDEZ-DIAZ und RODRIGUEZ 2000]. Die Toxizität der
Antiphlogistika wird durch Infektion mit Heliobacter Pylori, kardiovaskuläre Vorerkrankung, rheumatische Grunderkrankungen und die Langzeit-Anwendung von NSAID
deutlich erhöht [SEAGER und HAWKEY 2001]. Liegen bei einem Patienten mehr als
zwei dieser Risikofaktoren vor, ist eine Therapie mit NSAID kontraindiziert und sollte,
wenn möglich, substituiert werden [LAUFER 2004].
Generell sollten bei Patienten unter NSAID-Therapie alle verfügbaren Strategien ergriffen werden, um potentielle gastrointestinale Nebenwirkungen zu entschärfen. So sollte
das ausgewählte Medikament neben guter Wirksamkeit auch über ein hohes Sicherheitsprofil verfügen, bei geeigneten Patienten könnten in diesem Zusammenhang COX2-selektive Substanzen verwendet werden. Ein bestehender Heliobacter Pylori sollte vor
Therapiebeginn eradiziert werden, und bei Bedarf sollten begleitend ProtonenpumpenHemmer oder substituierende Prostaglandine, wie Misoprostol, verordnet werden
[MAMDANI et al. 2002 / SEAGER und HAWKEY 2001].
Auch Patienten, die selektive COX-2-Inhibitoren einnehmen, können - bei entsprechender Disposition - aufgrund nicht-medikamentöser Risikofaktoren, immer noch Ulzera
und andere gastrointestinale Komplikationen entwickeln [HAWKEY und LANGMAN
2003].
Die selektiven Coxibe werden jedoch - aufgrund der vorausgesetzten besseren gastrointestinalen Toleranz - mit größerer Wahrscheinlichkeit Hochrisiko-Patienten verordnet.
Das assoziierte Blutungsrisiko für den Magendarmtrakt dieser Substanzen könnte also
generell überbewertet werden, da die betroffenen Patienten schon vor Beginn der Medikamenteneinnahme ein höheres Risiko für diese Komplikationen aufweisen [NORGARD et al. 2004]. Zudem limitieren nachvollziehbare Ausschlusskriterien in klinischen Studien die generelle Aussagekraft für die ärztliche Praxis im Bezug auf Patienten mit erhöhter gastrointestinaler Sensibilität. Dennoch waren COX-2-selektive Inhibitoren, insbesondere Celecoxib, in einem Kollektiv gefährdeter Patienten - mit vorangegangenen gastrointestinalen Beschwerden oder prädisponierenden Erkrankungen - mit
einem geringeren Risiko für Blutungen im oberen Gastrointestinal-trakt assoziiert, als
verglichene NSAID [NORGARD et al. 2004].
Betrachtet man hingegen die CLASS-Studie, die gastrointestinal unbelastete Probanden
einschloss, unterschied sich Celecoxib in der Langzeittherapie, bezüglich der Sicherheit
95
im Magen-Darm-Trakt, nicht von anderen NSAID [JUNI et al. 2003 / METCALFE et
al. 2003 / SIMON et al. 2002 / SILVERSTEIN et al. 2000].
Auf der anderen Seite ist das Risiko einer rezidivierenden Magenblutung unter einer
Ko-Medikation von Diclofenac mit Omeprazol ebenso gering, wie unter Celecoxib
[WOLLHEIM 2003]. Diese Beobachtungen machen deutlich, dass die überschwänglich
postulierte, verbesserte gastrointestinale Sicherheit der Coxibe relativ zu bewerten ist
und sich die altbekannten NSAID im geeigneten Kontext durchaus bewähren. Gegebenfalls sollten sie , wie oben beschrieben, durch geeignete protektive Strategien und koadministrierte, supportive Medikamente „aufgewertet“ werden, und so, bei verbessertem Sicherheitsprofil, ihr überlegenes Wirkpotential ausüben.
Das Auftreten gastrointestinaler Komplikationen unter Analgetika-Therapie ausschließlich auf die Inhibition der COX-1 zurückzuführen und daher die Cox-2-selektiven Coxibe bedenkenlos einzusetzen, ist nach einigen Untersuchungen eine zu einfach Sicht
der Dinge: Es konnte gezeigt werden, dass der in dieser Arbeit ebenfalls zum Einsatz
kommende, COX-1-selektive Inhibitor SC-560 auch in sehr hohen Dosen keine Schäden im Magen-Darm-Trakt hervorruft [TANAKA et al. 2002 / GRETZER et al. 2001 /
WALLACE et al. 2000] und auch Knock-out-Mäuse, in denen das COX-1-Isonezym
nicht angelegt ist, entwickelten keinerlei sichtbare Ulzerationen der Magenschleimhaut
[LANGENBACH et al. 1995]. Darüber hinaus ist beim Auftreten von Läsionen die
steigende Inzidenz nicht immer mit einem sinkenden Gehalt an Prostanoiden in Verbindung zu bringen [LIGUMSKI et al. 1990] und zur willentlichen Provokation einer gastrischen Läsion sind größtenteils bedeutend höhere Konzentrationen der NSAID erforderlich, als zur kompletten Hemmung der Cyclooxygenase auf dieser Ebene [LIGUMSKI et al. 1983]. All diese Beobachtungen weisen darauf hin, dass vermutlich die
Hemmung beider Isoenzyme nötig ist, um gastrointestinale Läsionen durch NSAID zu
induzieren [WALLACE et al. 2000]. TOMISATO et al. zeigten außerdem, dass für die
Induktion gastrischer Ulzera durch NSAID eine Hemmung der lokalen PG-Produktion
notwendig ist. Die alleinige orale Zufuhr COX-2-selektiver Substanzen resultierte in
keinerlei Läsionen der Magenschleimhaut [2004].
Zudem sind vermutlich weitere, von der COX-Inhibition unabhängige, Mechanismen
involviert [LICHTENBERGER 2001]: TOMISATO et al. untersuchten unter Inkubationsbedingungen, die denen in der vorliegenden Arbeit verwendeten entsprechen, die
cytotoxischen Auswirkungen von NSAID auf Zellen der Magenschleimhaut in vitro.
96
Nach Meinung der Autoren basiert eine NSAID-induzierte Gastropathie auf dem Ungleichgewicht defensiver und offensiver Faktoren im Gastrointestinum: Durch die
COX-Hemmung kommt es zu einer verminderten PG-Produktion und damit zu einer
Abnahme der mageneigenen Abwehrmechanismen gegen toxische Angriffe; gleichzeitig wird die Magenschleimhaut durch den Einsatz der NSAID direkt einer cytotoxischen
Aggression ausgesetzt [ 2004].
Die Genese gastrointestinaler Komplikationen durch diese Substanzklasse ist also nur
teilweise auf die Inhibition der gastrischen Cyclooxygenase zurückzuführen [LICHTENBERGER 2001]. Darüber hinaus involviert sie Mechanismen wie Reduktion des
lokalen Blutflusses [ASHLEY et al. 1985], generelle Steigerung der Motilität [TAKEUCHI et al. 1986], Aktivierung neutrophiler Granulozyten [ASAKO et al. 1992] und
direkte Cytotoxizität durch die topisch irritierende Qualität der NSAID [LICHTENBERGER et al. 1995].
Diese Aspekte unterstreichen erneut, dass sich Weiterentwicklung der NSAID zur besseren Verträglichkeit und weitläufigerem Einsatz nicht nur auf das Selektivitätsverhalten der Pharmaka konzentrieren sollte [TOMISATO et al. 2004]. Da es sich bei allen
bisher verfügbaren COX-2-selektiven Inhibitoren, außer Lumiracoxib, um nichtazidische Komponenten mit ähnlicher trizyklischer Formel handelt, liegt die bessere
Verträglichkeit und erhöhte Sicherheit vielleicht sogar im chemischen Profil der Substanzen begründet, und nicht in ihrer Selektivität [ATHERTON et al. 2004].
Übergeordnetes Ziel in der Behandlung der entzündlichen Gelenkerkrankungen ist es,
die Symptome zu kontrollieren und die resultierende physische Behinderung zu minimieren [American College of Rheumatology 2000]. Heutzutage sind vielfältige pharmakologische Therapeutika erhältlich, die Schmerzen lindern, Gelenksteifigkeit und schwellung vermindern, die Gelenkfunktion erhalten, Knorpelverlust vermeiden und
generell die Lebensqualität des Patienten sichern [American College of Rheumatology
2000]. Vielfach ist der Schmerz das Symptom, das die Patienten am meisten beeinträchtigt und sie nach Behandlung suchen lässt [BREEDVELD 2004].
Bereits Rofecoxib zeigte gegenüber Celecoxib eine deutliche Überlegenheit in der postoperativen Analgesie [BARDEN et al. 2003]. Für das neue Lumiracoxib stehen vergleichende Untersuchungen bisher noch aus. Seine klare In-Vitro-Überlegenheit lässt aber
gleichsinnige Ergebnisse vermuten. Ebenso wie Rofecoxib, war auch das COX-2selektive Parecoxib in adäquater Dosis den traditionellen NSAID, nach kleinen wie
97
großen chirurgischen Maßnahmen, in der Analgesie ebenbürtig. Bei kleineren, zahnchirurgischen Eingriffen zeichneten sich diese Substanzen sogar durch eine verlängerte
Wirkdauer aus [ROMSING und MOINICHE 2004]. Konventionelle NSAID können,
per se oder in Kombination mit niedrig-molekularem Heparin, das Blutungsrisiko in
prädisponierten Patienten nach einem operativen Eingriff deutlich erhöhen [FORREST
et al. 2002]. Der Vorteil der neuen COX-2-selektiven Inhibitoren liegt daher nicht nur in
der besseren gastrointestinalen Verträglichkeit, sondern in diesem Kontext auch in der
selektivitätsbedingten fehlenden Thrombozyten-Hemmung. Bei gefährdeten Patienten
bilden die Coxibe daher eine wirkliche, attraktive Alternative zu den NSAID in der
postoperativen Schmerztherapie [ROMSING und MOINICHE 2004]. Trotz der allgemein besseren gastrointestinalen Verträglichkeit der Coxibe, limitieren ihre Interferenz
mit der Aspirin-Adaptation, sowie die potentielle kardiovaskuläre und renale Toxizität
aber ihren Einsatz in der Langzeittherapie [BRUNE 2004].
In jüngster Vergangenheit wurden daher zunehmend neue pharmakologische Ziele anvisiert, um eine möglichst optimale Therapie destruktiver, entzündlicher Gelenkerkrankungen zu gewährleisten. Der wissenschaftliche Fokus wandert dabei in der Prostaglandin-Kaskade zunehmend abwärts [LAUFER 2004].
Eine vermutlich besser verträgliche und dennoch wirkstarke Alternative zu den Coxiben
sind die so genannten CINODs, COX-inhibierende NO-Donatoren. Es handelt sich
hierbei um bifunktionelle Moleküle, die NO-spendende Gruppen kovalent in selektive
COX-2-Inhibitoren inkorporieren. Stickstoffmonoxid NO ist ein endogener, gastroprotektiver Mediator mit anti-thrombozytären Eigenschaften [WHITTLE 2003 / BANDARAGE und JANERO 2001]. In Verbindung mit der Inhibition der Cyclooxygenase ergibt sich so ein Präparat mit verbesserter gastrointestinaler Sicherheit und einem vorteilhaften Einfluss auf die Hämodynamik.
Eine weitere Neuentwicklung zur Behandlung von Schmerz und Entzündung sind die
LOX-/COX-Inhibitoren. Sie sind Analoga der Arachidonsäure und hemmen effektiv die
Enzyme im Prostanoid-Stoffwechsel, die Arachidonsäure metabolisieren. Es wird nicht
nur - wie bisher unter NSAID und Coxiben - die Cyclooxygenase an der Produktion
inflammatorischer Prostanoide gehindert, sondern gleichzeitig auch die Aktion der 5Lipoxygenase (LOX) herabgesetzt. Durch die alleinige Inhibition der COX durch Coxibe wurde bisher die dort gehemmte Metabolisierung der Arachidonsäure zusätzlich in
den Stoffwechsel-Zweig der LOX „umgelagert“ und es kam konsekutiv zu einer gestei98
gerten Produktion - ebenfalls entzündungsfördernder - Leukotriene. Hierdurch nahm die
leukozytäre Chemotaxis zu, es kam zur Adhäsion der Leukozyten an mesenterialen Venolen und im weiteren Verlauf entstanden Läsionen der Schleimhaut. Eine komplette
Hemmung sowohl des COX-, als auch des LOX-Weges wurde diesen StoffwechselShift vermeiden [MARTEL-PELLETIER et al. 2003] und die Inhibitoren hätten analgetische und anti-inflammatorische Eigenschaften bei einem gleichzeitig verbesserten Toxizitätsprofil [LAUFER 2001].
Auch wenn es sich bei der kombinierten Inhibition von Enzymen um eine sinnvolle
neue Therapiestrategie handelt, ist dieses Konzept aufgrund der hohen Hepatotoxizität
der Substanzen bisher nicht in vivo anwendbar. Lediglich der synthetisierte LOX/COX-Inhibitor Licofelone hat geringere redox-aktive Eigenschaften und zeigte erste
experimentelle Erfolge: Bei einem verbesserten Sicherheits-Profil soll er ähnlich wirksam sein wie die traditionellen NSAID und Coxibe [BLANCO et al. 2003 / PAVELKA
2003].
Da auch die Leukotriene einen Anteil an der Pathogenese der Osteoarthrose haben
[LAUFER 2001], könnte diese neue Substanz geeignet sein, um die Progression der
Krankheit zu verlangsamen [BRUNE 2004 / JOVANOVIC et al. 2001].
Auch wenn also für den klinischen Einsatz von Pharmaka sicherlich weiterführende,
kontrollierte Studien am Patienten notwendig sind, bietet die in dieser Arbeit verwendete In-Vitro-Verfahrensweise eindeutig Vorteile für einen ersten, aussagekräftigen Gesamtüberblick über die Wirkkraft der Substanzen. Die Verwendung von operativem
entzündlichen Synovialis- und Bursagewebe ex vivo erfüllt HAWKEY’s Forderung, das
spätere Zielgewebe als Grundlage in vitro zu benutzen [1999]. Der Einsatz eines unspezifischen, eines COX-1-präferentiellen und zweier COX-2-selektiver Inhibitoren deckt
das komplette Spektrum an möglicher COX-Enzymhemmung ab. Speziell die Verwendung von Diclofenac entspricht außerdem dem derzeitigen klinisch-therapeutischen
Goldstandard und bietet auch für das In-Vitro-System eine valide Bezugsgröße [PAIRET und VAN RYN 1998].
99
5. Zusammenfassung

Für die In-vitro-Evaluation von COX-2-Inhibitoren haben sich sechs Stunden als
ideale Inkubationsdauer herausgestellt. Nach diesem Zeitraum ist die Wirkung
der zu prüfenden Pharmaka auf die Eicosanoid-Synthese aussagekräftig; die Unterschiede zur Kontrollgruppe sind deutlich signifikant und assay-bedingte Artefakte einer Langzeitinkubation treten noch nicht auf.

Es kam zu einer deutlichen Prostaglandin-Freisetzung in den inkubierten Kontrollproben von inflammatorischer Synovialis und Bursa subacromialis. Der jeweilige Gehalt nahm im zeitlichen Verlauf von drei, über sechs bis hin zu zwanzig Stunden dramatisch zu. Die untersuchten Prostaglandine könnten also am
Entzündungsgeschehen bei der Osteoarthrose des Knies bzw. beim Subacromialsyndrom der Schulter beteiligt sein.

Die ungehemmte Freisetzung von PGE2 war in den Bursa subacromialisInkubaten nur halb so groß wie in den Synovialis-Präparaten. Versteht man
PGE2 als klassischen Entzündungsparameter, so ist die bursale Entzündung geringgradiger ausgeprägt, als die in der Synovialis.

Die 6-Keto-PGF1α-Freisetzung in den Kontrollproben entsprach sich in beiden
Gewebetypen und lässt auf ein vergleichbares Maß an inflammatorisch bedingter Neovaskularisation schließen.

Alle eingesetzten Pharmaka, gleichgültig ob unselektiv oder isoenzympräferentiell, hemmten – prozentual gesehen - die Eicosanoid-Synthese in den
beiden Geweben gleichsinnig. Neben der inhibitorischen Tendenz stimmte auch
das Wirkungsgefälle der Substanzen in beiden Geweben überein. Die vorgestellten Substanzklassen hemmten jeweils signifikant die Prostaglandin-Synthese
und sind daher bei Osteoarthrose, ebenso wie beim Impingement-Syndrom,
gleichwohl einsetzbar.
100

Der neu eingesetzte, COX-2-selektive, Diarylheterozyklus Lumiracoxib war in
seiner allgemeinen inhibitorischen Wirkkraft deutlich potenter als das bisher klinisch favorisierte Celecoxib. Der weitere klinische Einsatz von Lumiracoxib
hängt jedoch entscheidend von der Abklärung des zugehörigen Nebenwirkungsspektrums ab.

Eine Hemmung der Eicosanoid-Synthese durch das COX-1-selektive SC-560
war sowohl in Synovialis, als auch in Bursa subacromialis feststellbar. Somit ist,
trotz eindeutiger COX-2-Dominanz, von einer Beteiligung der COX-1-Isoform
am Entzündungsgeschehen in beiden Geweben auszugehen.

Die Kombination aus COX-1 und COX-2 in der inflammatorischen Prostaglandin-Synthese erklärt die weiterhin bestehende Überlegenheit der unselektiven,
traditionellen NSAID. In allen Inkubationsproben ließ sich die gemessene Freisetzung am potentesten durch das unspezifische Diclofenac inhibieren. Um die
untersuchten Krankheitsbilder am effektivsten zu therapieren, sollten daher im
geeigneten Patienten weiterhin NSAID eingesetzt werden. Bei Begleiterkrankungen oder bei besonderer Neigung zu Nebenwirkungen wären die „verträglicheren“ CSI die Medikation der Wahl.

Die Interleukin-Freisetzung verändert sich in Anwesenheit selektiver und unspezifischer COX-Inhibitoren. Der Cyclooxygenase-Weg ist jedoch sicherlich nicht
der einzige Faktor, den es bei der Beurteilung des regulierten InterleukinHaushaltes zu berücksichtigen gilt. Die erhobenen Ergebnisse lassen zwar vermuten, dass der Gehalt an pro-inflammatorischen Interleukinen unter COXInhibition - im Rahmen einer negativen Rückkopplung - ansteigt, weitere Interpretationen sind bei dem geringen Datenumfang jedoch nicht aussagekräftig.
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Ida Sibylle Haußleiter
Curriculum Vitae
seit Okt. 2003
Praktisches Jahr im Sana-Klinikum Remscheid
Sept. 2002 – Sept. 2003
Forschungsstipendium des Biomedical Science Exchange
Program: Research Fellow der Neural Plasticity Research
Group, Harvard Medical School / Massachusetts General
Hospital, Boston, MA
klinische Tätigkeit im MGH Pain Center, Boston, MA
Aug. 2002
Zweites Medizinisches Staatsexamen, Ruhr-Universität
Bochum
Feb. 2002
Promotionsstipendium der Medizinischen Fakultät der
Ruhr-Universität Bochum
Aug. 2001 – Aug. 2002
Studentische Hilfskraft in der Abteilung für Spezielle
Schmerztherapie, BG Kliniken Bergmannsheil, Bochum
Jan. 2001 – Dez. 2001
Studentische Hilfskraft im Auslandsamt der
Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum
Okt. 2000 – Apr. 2002
experimentelle Forschung für die Promotion,
Labor für experimentelle klinische Medizin und
Orthopädie, Ruhr-Universität Bochum
Sept. 1999 - Aug. 2000
Auslandsstipendium des ERASMUS-Programmes
Erstes Medizinisches Staatsexamen, Université Louis
Pasteur ULP, Strasbourg, Frankreich
Famulaturen in den Universitätskliniken
Aug. 1999
Äzrtliche Vorprüfung, Ruhr-Universität Bochum
seit Okt. 1997
Studium an der Ruhr-Universität Bochum,
Fakultät für Medizin und Fakultät für Publizistik
Aug. 1988 – Jun. 1997
Mallinckrodt-Gymnasium, privates katholisches
Gymnasium in Dortmund, Abitur
Aug. 1984 – Juli 1988
Besuch der Grundschule
26. März 1978
geboren in Münster
Danksagung
Ich danke allen, die Geduld mit mir hatten.
Ich danke Herrn Prof. Dr. med. Ralf H. Wittenberg, der mich seit dem ersten Semester
als Patenprofessor begleitet hat, für die Überlassung des Themas und die intensive
Betreuung meiner Arbeit. Er hatte für mich jederzeit ein offenes Ohr.
Ich danke Frau Prof. Dr. med. Brigitta M. Peskar, Abteilung für Experimentelle Klinische Medizin der Ruhr-Universität Bochum, die mein Interesse an der Forschung geweckt hat und mir viele konstruktive Hinweise gab. Ihren Mitarbeitern danke ich für die
freundliche Aufnahme und Zusammenarbeit im Labor.
Ich danke den Mitarbeitern der Orthopädischen Kliniken des St.-Josef-Hospitals Bochum und des St.-Elisabeth-Hospitals Herten, für ihre Kooperation und die Bereitstellung des Gewebes. Insbesondere danke ich Herrn PD Dr. med. Roland E. Willburger,
der mir als Ansprechpartner in Bochum zur Verfügung stand. Ich danke Herrn Dr. med.
Holger Knorth.
Ich danke Herrn Prof. Dr. med. Christoph Maier, Abteilung für Spezielle Schmerztherapie der BG Kliniken Bergmannsheil Bochum, für seinen Rat und seine Unterstützung.
Ich danke der Neural Plasticity Research Group der Harvard Medical School in Boston,
unter Leitung von Clifford Woolf, M.D., Ph.D., die mir eine neue, faszinierende Forschungswelt eröffnet hat. Mein besonderer Dank gilt Tarek Samad, Ph.D., für die lebhaften Diskussionen und sein Interesse an dieser Arbeit. Außerdem danke ich Max Fun
und Sebastian Shaffer für die tatkräftige Hilfe bei der Literatur-Recherche.
Ich danke Herrn PD Dr. med. Stefan Lange und Frau Dipl. Stat. Anika Hüsing, Abteilung für Medizinische Informatik, Biometrie und Epidemiologie der Ruhr-Universität
Bochum, für die Überprüfung meiner statistischen Methoden.
Ich danke der Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum für die Gewährung
eines Promotionsstipendiums, das die materielle Gestaltung dieser Arbeit erleichtert hat.
Last, not least, danke ich meiner Familie für ihr Verständnis. Insbesondere danke ich
meiner Mutter für psychologische Unterstützung und sorgfältiges Korrekturlesen, meinem Bruder für seinen Beistand in rezidivierenden technischen Herausforderungen und
meinem Vater für seine naturwissenschaftlichen Anregungen.