2D Elektrophorese: Analyse komplexer

FORSCHUNGSARBEITEN / RESEARCH ACTIVITIES 2010
2D ELEKTROPHORESE –
ANALYSE KOMPLEXER PROTEINGEMISCHE
2D ELECTROPHORESIS –
ANALYSIS OF COMPLEX PROTEIN MIXTURES
Hintergrund
Anwendung in aktuellen Projekten
Die Proteomforschung befasst sich mit der Identifizierung und
Die 2D DIGE-Technik wird zur Charakterisierung pflanzlicher
Quantifizierung von Proteinen aus komplexen biologischen
und tierischer Zellzustände angewendet. So wird z. B. nach
Systemen unterschiedlicher Größenordnungen. So kann das
Biomarkern für die positive Wirkung von biologisch aktiven
Proteom einer einzelnen Zellorganelle von Interesse sein, ge-
Chemikalien („Bioregulatoren“) auf gestresste Pflanzen
nauso aber das einer ganzen Zelle, das einzelner Pflanzenorga-
gesucht. In Experimenten mit Salz- und Trockenstress konnte
ne oder ganzer Pflanzen. Eine leistungsfähige hochauflösende
nach Behandlung mit einer Kombination aus zwei Bioregulato-
Technik zur Auftrennung und Visualisierung dieser komplexen
ren eine stark erhöhte Überlebensrate der gestressten Pflanzen
Proteingemische ist die zweidimensionale (2D)-Elektrophorese.
beobachtet werden. Auf Proteomebene ließ sich mit Hilfe
Sie besteht aus einer isoelektrischen Fokussierung (IEF), bei
der 2D DIGE-Technik eine signifikante Hochregulation von 25
der die Proteine in der ersten Dimension entsprechend ihres
Proteinen für salzgestresste Pflanzen und von 29 Proteinen
isoelektrischen Punktes aufgetrennt werden und einer SDS-
für trockengestresste Pflanzen detektieren. Ein Großteil der
Elektrophorese, die in der zweiten Dimension eine Trennung
identifizierten Proteine ist an Vorgängen der Photosynthese
nach der Masse der Proteine ermöglicht.
beteiligt.
In der quantitativen Proteomforschung wird nach signifikanten
Parallel wird die Methode für den Vergleich von antikörper-
Unterschieden der Expressionsmuster von Proteinen in Abhän-
produzierenden CHO (Chinese Hamster Ovary)-Zellen mit
gigkeit verschiedener Faktoren, wie z. B. abiotischem Stress
unterschiedlich hoher Produktivität verwendet. Das Ziel ist die
oder Mutationen, gesucht, um dadurch komplexe Vorgänge
Identifizierung molekularer Marker, die charakteristisch sind
besser verstehen zu können. Desweiteren sind Vergleiche zwi-
für hoch produzierende Zellen.
schen zwei Zuständen wie gesundem und krankem Gewebe
hilfreich zur Identifizierung spezifischer Marker, die eine Klassifizierung biologischer Proben erlauben.
Methodik
Am Fraunhofer IME werden Proteom-Analysen mit Hilfe der
„Difference-in-gel-electrophoresis” (DIGE)-Technik durchgeführt. Dabei werden zwei zu vergleichende Proben mit
unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert und auf
Figure 1: 2D DIGE workflow: Samples from two states are labeled
demselben 2D Gel getrennt. Die Fluoreszenzbilder der un-
with different fluorescent dyes and separated in one gel. Protein
terschiedlichen Proben eines Gels werden mit einem Scanner
expression values are calculated and compared to identify upregu-
aufgenommen und mit Hilfe einer Analyse-Software bearbei-
lated and downregulated protein spots.
tet und analysiert. Das Verhältnis der Expression eines jeden
Proteinspots zwischen den beiden Proben wird berechnet –
abgesichert durch statistische Methoden. Zur Identifizierung
der Proteine werden die Proteinspots von Interesse aus dem
Gel ausgeschnitten und per Massenspektrometrie analysiert.
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Background
Application in current projects
One of the major aims of proteomic research is to identify
The 2D DIGE technique is currently being applied in the ana-
and quantify proteins expressed in complex biological
lysis of animal and plant cells in a variety of contexts. For
systems, including organelles, cells, organs and whole plants.
example, we are searching for biomarkers that characterize
Two-dimensional electrophoresis (2DGE) is a powerful, high-
the positive influence of biologically active chemicals (“bio-
resolution separation technique for the visualisation of these
regulators”) on stressed plants. Plants subjected to salt and
complex protein mixtures. The proteins are separated in the
drought stress that were treated with a combination of two
first dimension by isoelectric focusing (IEF) according to their
bioregulators showed a significant increase in fitness. DIGE
isoelectric point, and in the second dimension by SDS gel
revealed the significant upregulation of 25 and 29 protein
electrophoresis according to their molecular weight.
spots for salt-stressed and drought-stressed plants, respec-
In quantitative proteomics, 2DGE patterns are screened for
tively, most of which appear to be involved in photosynthesis.
significant differences (the presence/absence or intensity of
We have also used DIGE to compare antibody-producing CHO
protein spots) in response to conditions such as abiotic stress
(Chinese hamster ovary) cell lines with different antibody
or mutations, in order to understand more about complex
production levels, aiming to identify molecular markers
biological pathways. Furthermore comparisons between two
characteristic for high-performance clones.
states (e. g. healthy and diseased tissues) are important for
the identification of protein biomarkers that help to classify
Sponsor / Aufttraggeber
samples.
German Federal Ministry of Education and Research and
Fraunhofer internal strategic funding
Methodology
Cooperation partners / Kooperationspartner
At the Fraunhofer IME, proteome analysis is performed using
Bayer CropScience, Fraunhofer ITWM, Fraunhofer FIT
the difference-in-gel-electrophoresis (DIGE) technique, in
which different samples are labeled with different fluorescent
Contact / Ansprechpartner
dyes and separated on the same 2D gel. The 2DGE patterns
Dr. Stefan Schillberg
for each sample can be scanned individually and compared
Tel: +49 241 6085 - 11050
using appropriate software, including the calculation of pro-
[email protected]
tein difference ratios supported by statistical methods. Protein
spots of interest are then cut from the gel and analyzed by
Dr. Ruth Horn
mass spectrometry for protein identification.
Tel: +49 241 6085 - 12261
[email protected]
Figure 2: 2D image of the whole leaf proteome of Arabidopsis
thaliana in the pH range 4-7
Figure 3: 2D image of the whole CHO cell proteome in the
pH range 3-10