Radioanalytik in der Bioanalytik

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6. Anwendung in den Biowissenschaften
Radioimmunoassay
DNA-Sequenzierung
Weiterführende Literatur: Lotspeich et al., Bioanalyitk
Radioimmunoassay (RIA)
Basis
Immunochemische Reaktionen
Radionuklide als Tracer zur Isolation
alle RIAs gehören zu den Proteinbindungsmethoden
erstmals 1959 von Yalow und Berson beschrieben
seitdem breit angewendet in klinischer Medizin
jährlich mehr als 10.000.000 allein in den USA
Radioimmunoassay
Messung der Konzentration von
• Serumproteinen
• Hormonen
• Enzymen
• bakterielle Antigene
• Drogen (Rechtsmedizin)
• andere in Blut, Körperflüssigkeiten oder Geweben
Radioimmunoassay
Spezifische Einweiskörper
Art des Radioassays
Antikörper
Radio-Immuno-Assay (RIA)
immunradiometrischer Assay
(IRMA)
Serum
kompetitiver ProteinBindungsassay (CPBA)
Zell- oder Membranproteine
Radio-Rezeptorassay (RRA)
Radioimmunoassay (RIA)
wichtigster Radioassay: RIA
Radioimmunoassay
Vorteile:
Spezifität
Sensitivität
Versatilität
präzise Messgenauigkeit
Radioimmunoassay
Nachteile:
Aufwand beim Umgang mit
radioaktiven Stoffen
fehlende Lagerfähigkeit wegen
radioaktiven Zerfall
Bei kurzlebigen: Aktivität verschwindet
Bei langlebigen: Radiolyse
Radioimmunoassay
Kompetitiver RIA
Antigen-Antikörper-Reaktion in Lösung
Mischung radioaktiv markierten löslichen Antigens
(„heißes“ Antigen)
mit steigenden Mengen nicht markierten („kaltem“)
Antigen.
Radionuklide: meist
125I, 3H
Radioimmunoassay
Kompetitiver RIA
• „heißes“, durch Radioaktivität messbares Antigen
• durch „kaltes“ Antigen ersetzt
• Verdrängung durch bekannte Antigenmengen kalibriert
• an Standardkurve unbekannte Antigenmenge bestimmt
Radioimmunoassay
Pharmakokinetik
kinetischen Grundlagen der Antigen-Antikörper-Reaktion
Massenwirkungsgesetz
[Ag] + [Ak]
k1
k2
[AgAk]
Ag:
Konzentration des freien Antigens
Ak:
Konzentration des freien Antikörpers
AgAk: Konzentration des gebundenen Antigens
(Antigen-Antikörper-Komplex)
Radioimmunoassay
Pharmakokinetik des RIA
Gleichgewichtskonstante: K =
k1
k2
=
[AgAk]
[Ag]·[Ak]
molare Konzentration der gesamten
(freien F und gebundenen G) Antikörperbindungsstellen
[Akges] = [Ak] + [AgAk]
Das Verhältnis von gebundenem zu freiem Antigen
ergibt eine Gerade mit der Steigung K.
Radioimmunoassay
Pharmakokinetik des RIA
G
= K · ([Akges] - G)
F
Das Verhältnis von gebundenem zu freiem Antigen
ergibt eine Gerade mit der Steigung K.
100
gebundenes radiomarkiertes Antigen [%]
gebundenes radiomarkiertes Antigen [%]
RIA
100
100
U.A.
U.A.
50
50
50
0
0
1
1
10
10
100
100
1000
1000
kaltes Antigen [pg]
0
1
10
100
kaltes Antigen [pg]
1000
Radioimmunoassay
Messung der gebundenen Antigenmenge
erfordert die Trennung vom nicht gebundenen Antigen.
z.B. durch Fällung des Antikörpers
Dabei muss das nicht gebundene Antigen in Lösung bleiben
Fällung von Antikörpern geschieht z.B. in
• 35-50% gesättigter Ammoniumsulfatlösung
• Adsorption des Immunkomplexes an Bentonit/Aktivkohle
Entfernung des gebundene Antigens vom nicht-gebundenen
• Kopplung an unlöslichen Träger
• durch Waschen entfernen
Radioimmunoassay
Tests für die verschiedensten Plasmabestandteile
Plasmabestandteile
Proteohormone
ACTH
2
Insulin
5
Testosteron
10
50
Progesteron
20
Calcitonin
Steroidhormone
Nachweisbare Konzentration [pg/mL]
Pharmaka
Digoxin
100
Drogen
Morphin
100
Radioimmunoassay
Ablauf
• Herstellung reiner Antigene zur Markierung
• radioaktive Markierung der Antigene z.B.
125I, 3H
• Herstellung der spezifischen Antikörper
• Trennung der freien von den gebundenen Antigenen
Reaktionsbedingungen sind genau einzuhalten:
Inkubationszeit, Temperatur, pH, Proteinkonzentration,
Molarität und Ionenstärke.
Inkubationszeiten: wenigen Stunden bis mehrere Tage.
Ablauf : DNA-Sequenzierung
Zellwände werden aufgebrochen
doppelsträngige DNA wird denaturiert in Einzelstrangstücke
Konzentration durch Zentrifugation
Durch Anwendung von Enzymen werden die
Nukleotidketten weiter in kleinere Stücke zerteilt.
Zu diesen werden markierte Verbindungen hinzugefügt
die selektiv an die verschiedenen Fragmente binden.
Ablauf : DNA-Sequenzierung
ursprünglicher DNA-Strang kann in einem Klonprozess
direkt markiert werden, z.B. mit 32P
geklonte DNA wird dann aufgeschnitten in Fragmenten
mit verschiedenen Restriktionsenzymen
Eletrophorese in einem Gel z.B. Polyakrylamid
Autoradiographie: Charakteristische Linien
Informationen über das Individuum, von dem die DNA
entnommen wurde
Markierungspositionen
Hauptsächlich: Nucleosidtriphophate
Am häufigsten:
32P
oder
33P-Phosphatmarkierung:
Austauschposition - oder -Position der Phosphatreste
in
2`-Desoxyribo-, 3`-Desoxyribo(Cordycepin)- oder 2`Ribonucleotiden.
Im Fall von 35S erfolgt der Austausch gegen ein
Sauerstoffatom des -Phosphats.
Markierungspositionen
A
O
Purin- oder
Pyrimidinbase
O
│
P
││
O
O
O
│
P
O
││
O
O
│
P
││
O
O
O
CH2
│
│
H
1
2
R = H;
R = OH
R1 = OH; R2 = H
R1 = R2 = OH
H
R2
2`-Desoxyribose
3`-Desoxyribose
Ribose
H
H
R1
Sonden zur Nukleinsäureanalytik
R2
│
C
B
N3
│
C2
R1
4
R3
5
C
Pyrimidin
6
1
C H
N
R2
│
C
N3
│
C2
1
R
4
N
5
C
7
8
6
1
N
C
9
N
CH
Purin
Sonden zur Nukleinsäureanalytik
Isotop
Art der
Strahlung
EMax
[MeV]
HalbwertsZeit
Anwendungen
Eigenschaften
3H
0,0118
12,3 Jahre
in situ
niedrige Sensitivität
hohe Auflösung
35S
0,167
87,4 Tage
Filter-Hybridisierung
mittlere Sensitivität
gute Auflösung
125I
0,035
0,035
60,0 Tage
in situ
mittlere Sensitivität
hohe Auflösung
32P
1,71
14,2 Tage
Filter-Hybridisierung
Sequenzierung
höchste
Strahlungsenergie
höchste Sensitvität
mittlere Auflösung
(Streustrahlung)
DNA-Sequenzierung: Detektion radioaktiver Nucleinsäuren
• Autoradiographie
Strahlende Fläche
Membran,
Gel,
Zellrasen,
Gewebsschnitt
wird direkt mit dem Röntgenfilm in Kontakt gebracht.
• Flourographie
Strahlende Fläche wird mit floureszierenden Chemikalien
überschichtet; die die radioaktive Strahlungsenergie in
Floureszenz umwandelt.
Flourophore: 2,5-Diphenyloxazol (PPO) und Natriumsalicylat.
• Indirekte Autoradiographie mit Verstärkungsfolien
(intensifyer screens):
Hochenergetische -Strahlung wird durch Phosphatreste der
Verstärkungsfolie absorbiert und in blaues Licht umgewandelt.
Cerenkov-Effekt
• Flüssige Emulsionen für cytologische oder cytogenetische
in situ-Anwendungen:
niedrig- bis mittelenergetischen 3H- bzw. 35S-Strahler
verlangen direkten Kontakt des Detektionsmediums
die feste Emulsion wird bei 45°C verflüssigt und der Objektträger
eingetaucht. Nach Trocknen erfolgt die Exposition bei 4 °C unter
Lichtausschluss für Tage bis zu mehreren Monaten.
• Vorexponierte Röntgenfilme für direkte Autoradiographie
und Fluorographie:
nur für Fluorographie oder Verstärkungsfolien (Lichprozesse)
Gelgestützte DNA-Sequenzierungsverfahren
quervernetzte Polyacrylamidgele zwischen planaren Glasplatten
und linear polymerisierte Gele in Glaskapilaren.
beruhen auf der Erzeugung von basenspezifisch endenden
DNA-Populationen, die in einer nachfolgenden denaturierenden
Polyacrylamidgelelektrophorese nach ihrer Größe getrennt
werden.
Gelgestützte DNA-Sequenzierungsverfahren
Die Erzeugung dieser Populationen kann auf zwei
unterschiedlichen Wegen erfolgen:
Die Reaktionsprodukte können durch die Synthese eines DNAStranges erzeugt werden.
Die Gelelektrophorese wird in ultradünnem Gelen (d < 0,35 mm)
oder Kapillaren durchgeführt.
Die Verwendung von Kapillaren ist jedoch mit Problemen bei der
Befüllung der Kapillaren, der Polymerisation der Gelmatrizen und
damit geringeren Leseweiten behaftet.
Sequenzierung nach Sanger: Didesoxy-Verfahren
Kettenbruchverfahren oder Terminatorverfahren
basiert auf der enzymatisch katalysierten Synthese einer
Population von basenspezifisch terminierten DNA-Fragmenten,
die nach ihrer Größe gelelektrophoretisch getrennt werden
können.
Ausgehend von einer bekannten Startsequenz wird durch Zugabe
• eines Sequenzierungsprimers
• eines Nucleotidgemischs und
• einer DNA-Polymerase
die Synthese eines komplementären DNA-Stranges initiiert
Primer: ein kurzes DNA-Oligonucleotid von ca. 20 Bp
Primer ist notwendig, um
• eine definierte Startstelle zu erhalten
•den Synthesebeginn der DNA-Polymerase einzuleiten.
Start:
Reaktion wird in vier parallelen, aliquoten Ansätzen gleichzeitig
gestartet, die sich nur durch die Verwendung eines
unterschiedlichen Nucleotidgemischs unterscheiden.
Die mit A, C, G und T bezeichneten Reaktionen enthalten eine
Mischung aus
• natürlich vorkommenden 2´-Desoxynucleotiden und
• synthetischer 2´, 3´-Didesoxynucleotide als Terminatoren.
Verlauf:
Während der Strangsynthese durch die schrittweise
Kondensation von Nucleosidtriphosphaten in 5´ → 3´-Richtung
kann es nur zu zwei unterschiedlichen Reaktionsereignissen
kommen:
(A) Bei der Kondensation der 5´-Triphosphatgruppe eines 2´Desoxynucleotids (dNTP) mit dem freien 3´-Hydroxyende des
DNA-Strangs entsteht unter Freisetzung von anorganischem
Pyrophosphat ein um eine Base verlängertes DNA-Molekül, das
wiederum die freie 3´-Hydroxygruppe besitzt.
Die Synthese kann also im nächsten Schritt fortgesetzt werden.
Verlauf:
Während der Strangsynthese durch die schrittweise
Kondensation von Nucleosidtriphosphaten in 5´ → 3´-Richtung
kann es nur zu zwei unterschiedlichen Reaktionsereignissen
kommen:
(B) Kommt es hingegen zu einer Kondensationsreaktion zwischen
dem freien 3´-Hydroxyende eines DNA-Strangs der 5´Triphosphatgruppe eines 2´, 3´-Didesoxynucleotids, ist nach
Einbau dieses Nucleotids eine Verlängerung des Strangs nicht
mehr möglich, da keine freie 3´-Hydroxygruppe vorhanden ist.
Der Strang ist terminiert.
Es entstehen Reaktionsprodukte von bis zu 1000 Bp Länge
A
3´
3´
A
C
T
G
T
G
A
C
5´
T
A
OH
A
C
T
G
T
T
G
A
C
A
A
5´
OH
A
PPP
T
PPi
OH
PPP
OH
Desoxynucleotid
B
3´
5´
3´
A
C
T
G
T
G
A
C
T
A
OH
A
C
T
G
T
T
G
A
C
A
A
5´
H
A
PPP
T
H
Didesoxynucleotid
PPi
PPP
OH
Prinzip des Kettenabbruchverfahrens nach Sanger
In einer geprimten, durch eine
Polymerase katalysierten DNA-Synthesereaktion
werden basenspezifisch teminierte DNA-Fragmente
unterschiedlicher Länge syntethisiert.
Diese Fragmente erzeugen in der
Gelelektrophorese ein spezifiches Bandmuster,
das zur Rekonstruktion der Basenfolge dient.
5´
3´
3´
5´
+ dNPTs + Polymerase
+ ddATP
+ ddCTP
+ ddGTP
+ ddTTP
GCTCTCA
GC
GCTC
GCTCTC
G
GCTCTCAG
GCT
GCTCT
C
G
▬▬▬
T
▬▬▬
▬▬▬
▬▬▬
▬▬▬
▬▬▬
▬▬▬
▬▬▬
G 3´
A
C
T
C
T
C
G 5´
Leserichtung
A
Elektrophorese
Primer
Matrize
A
▬▬
C
G
T
A
▬▬
T
▬▬
▬▬
▬▬
▬▬
C
▬▬
G
G
G
▬▬
C
▬▬
▬▬
T
▬▬
C
▬▬
Autoradiogramm eines Sequenzierungslaufes.
Jeweils vier benachbarte Spuren repräsentieren
die Teilreaktionen A, C, G und T eines Klons.
Entsprechend der Laufrichtung des Gels
befinden sich die kleineren Reaktionsprodukte
am unteren Ende der Abbildung.
Jede Bande unterscheidet sich von der
vorhergehenden im Idealfall um eine Base.
G
▬▬
▬▬
T
▬▬
G
▬▬
T
▬▬
G
▬▬
C
▬▬
▬▬
G
▬▬
▬▬
T
T
▬▬
A
▬▬
▬▬
▬▬
C
C
▬▬
T
▬▬
C
▬▬
▬▬
G
▬▬
A
▬▬
C
▬▬
A
▬▬
▬▬
G
▬▬
▬▬
T
T
▬▬
G
▬▬
▬▬
T
▬▬
G
▬▬
T
▬▬
A
▬▬
▬▬
G
▬▬
C
▬▬
▬▬
▬▬
T
G
▬▬
G
▬▬
A
▬▬
C
▬▬
G
▬▬
▬▬
T
Markierungstechniken und Nachweisverfahren (Isotopenmarkierung)
Basis der Verwendung radioaktiver Isotope in der DNA-Sequenzierung:
• Sie diskriminieren nicht zwischen verschiedenen Isotopen
• Der Einbau in DNA-Strang führt zu keinen Mobilitätsänderungen im Gel.
•
32P
und
35S
• Expositionszeiten bei Autoradiographie mit
32P
kürzer
• Ortsauflösung mit 32P ist jedoch aufgrund der energetisch bedingten
größeren Schwärzungsbereiche bedeutend geringer
• für längere DNA- Sequenzierungsläufe 35S bevorzugt
Markierung erfolgt:
durch radioaktiv markierten Primer oder
während der Sequenzierungsreaktion
Die radioaktive Markierung eines DNA-Sequenzierungsprimers erfolgt
durch eine Phosphatierung mit gamma-32P-ATP und Polynucleotid-Kinase.
Die durch chemische Synthese produzierten Primer besitzen freie 5´-OHGruppe, die direkt, d.h. ohne Dephosphorylierung phospohoriliert werden
können.
Die Markierung während der Didesoxy-Sequenzierungsreaktion erfolgt
durch Zugabe von alpha-32P-ATP.
Das Isotop wird in den synthetisierten DNA-Strang eingebaut, der somit
nachweisbar wird.

Radioanalytik in der Bioanalytik

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