PROTEIN CRYSTALLIZATION

Berichte aus der Verfahrenstechnik
Bo-Hyun Ryu
Protein Crystallization by
Solvent Freeze-Out Technology
Shaker Verlag
Aachen 2010
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Zugl.: Halle, Univ., Diss., 2009
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Abstract
Crystallization has exhibited great potential in downstream processing of the proteins. In
order to provide the required amounts of crystalline proteins, efficient and reproducible
methods for the crystallization of various kinds of proteins on a large scale are required.
However, due to the complexity of the proteins, such methods are not found yet. Hence,
new strategies have been sought in order to better understand and improve the
crystallization processes in order to avoid large amounts of salts as crystallizing agent.
For those purposes the “solvent freeze out technology” for crystallizing proteins is
introduced here as an advanced crystallization technology which is efficient and
reproducible. This new technique in protein crystallization involves the freeze out (a
layer crystallization for the solvent, known from melt crystallization) of the solvent in
order to enrich and therefore supersaturate the protein solution. The process is thus
primarily a solid-layer melt crystallization technique with a secondary solution
crystallization step generating the protein crystals. Problems and advantages of the
technology are discussed on the basis of experimental results. As such it suffers from a
problem common to solid-layer melt crystallization, namely inclusions of impurities in
the crystalline solid layer. In the specific case presented here, the major impurity found in
the ice layer is the protein. The dependence of the concentration of the protein found in
the ice upon the final temperature of the cold finger as well as on the cooling rate applied
has been investigated and is presented here. The question of the maximum allowable
layer growth rate is discussed on the basis of the known criteria. The major parameters
concerning the inclusion effect of solute in the ice are the ice growth rate (vice), mass
transfer coefficient of the solute (k), the interface temperature (ti) and the interface
concentration (ci) of the solute between the ice and the solution with the boundary layer
conditions. In order to avoid inclusions in the ice, the allowable maximum ice growth rate
(vmax) for the process should be defined depending on the optimum criterion of vice/k. The
empirical evaluation of the estimated criterion of vice/k to the freeze out protein
crystallization process is assessed on the basis of separation efficiency which is
represented as effective distribution coefficient (keff).
Key words: solvent freeze-out, protein crystallization, solid layer melt crystallization,
protein inclusion, the optimum criterion of vice/k, the allowable maximum ice growth rate
(vmax), separation efficiency
Abstract
Der Kristallisation wird insbesondere für Downstream-Prozesse von Proteinen eine sehr
große Bedeutung beigemessen. Um gewünschte Mengen an kristallinem Produkt
(Proteinen)
erhalten
zu
können,
sind
effiziente
und
reproduzierbare
Kristallisationsprozesse für verschiedenste Proteine im großtechnischen Maßstab
unabdingbar. Aufgrund der komplexen Proteinstruktur konnten derartige Verfahren aber
bis heute nicht etabliert werden. Daher wird zurzeit nach neuen Strategien gesucht, um
den Gesamtprozess besser verstehen und letztendlich verbessern zu können und um die
bisher benötigten großen Mengen an Salz als Kristallisationsagenz zu vermeiden.
Aus diesem Grunde wird hier die effiziente und reproduzierbare „solvent freeze out“
Technologie für die Kristallisation von Proteinen vorgestellt. Diese neue Technik der
Proteinkristallisation beinhaltet das Ausfrieren des Lösungsmittels, um die
Proteinkonzentration in der Lösung zu erhöhen und somit eine Übersättigung zu
generieren. Auf den ersten Blick handelt es sich um eine klassische
Schmelzkristallisation an einer festen Oberfläche, die allerdings an eine
Lösungskristallisation der Proteinkristalle in Lösung gekoppelt ist.
Probleme und Vorteile der neuen Technik werden hier auf Grundlage von
experimentellen Daten aufgezeigt und diskutiert. Das größte Problem stellt dabei der
Einschluss von Fremdstoffen in der festen Kristallisationsschicht dar. In diesem
speziellen Fall ist die Hauptverunreinigung gleichzeitig unser Zielprodukt, das Protein
selbst. Die Abhängigkeiten der Proteinkonzentration im Eis von der
Kühlfingertemperatur und der angewendeten Kühlrate wurden untersucht und die
Ergebnisse werden hier dargestellt. Dabei wird die Frage nach der maximalen
Eiswachstumsgeschwindigkeit unter Berücksichtigung bekannter Kriterien diskutiert. Die
wichtigsten Parameter hinsichtlich des Einschlusseffektes von Protein im Eis sind die
Eiswachstumsgeschwindigkeit (vice), die Stofftransportkoeffizienten der gelösten Stoffe
(k), die Grenzflächentemperatur (ti) und die Grenzflächenkonzentration (ci) in der
Grenzschicht Eis/Lösung. Um den Einschluss von Zielprotein im Eis zu vermeiden, darf
eine maximale Eiswachstumsgeschwindigkeit (vmax), die auf Grundlage eines optimalen
Kriterium vice/k definiert wurde, nicht überschritten werden. Die empirische Abschätzung
des Parameters vice/k für das Ausfrieren während eines Proteinkristallisationsprozesses
beruht auf der Trenneffektivität, welche durch den effektiven Verteilungskoeffizienten
(keff) beschrieben wird.
Key words: Ausfrieren von Lösungsmittel, Proteinkristallisation, Schmelzkristallisation
an festen Grenzflächen, Proteineinschlüsse, der Optimierungsparameter vice/k, zulässige
maximale Eiswachstumsgeschwindigkeit (vmax), Trenneffektivität