COBAS® TaqMan® HIV-1 Test, version 2.0

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For Use With The High Pure System
IN-VITRO-DIAGNOSTIKUM.
HIVHP2
High Pure System Viral Nucleic Acid Kit
48 Tests
P/N: 05923468 190
48 Tests
P/N: 03502295 001
VERWENDUNGSZWECK
Der COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, Version 2.0 (v2.0) zur Verwendung mit dem High Pure System ist ein
in-vitro-Nukleinsäure-Amplifikationstest zur quantitativen Bestimmung der RNA des Humanen Immundefizienz-Virus vom Typ 1 (HIV-1) in Humanplasma unter Verwendung des High Pure System Viral Nucleic
Acid Kit zur manuellen Probenaufarbeitung und des COBAS® TaqMan® 48 Analyzer zur automatischen
Amplifikation und Detektion. Mit dem Test kann HIV-1-RNA im Bereich von 34 bis 10.000.000 Kopien/ml
(57 bis 1,67 x 107 internationale Einheiten/ml) quantitativ bestimmt werden. Basierend auf dem 1. internationalen Standard der Weltgesundheitsorganisation (WHO) für HIV-1-RNA (NIBSC-Code 97/656)
entspricht eine Kopie HIV-1-RNA 1,67 internationalen Einheiten (IE)1,2.
Der Test kann in Verbindung mit dem klinischen Bild und anderen Labormarkern für den Krankheitsverlauf zur
klinischen Versorgung von mit HIV-1 infizierten Patienten herangezogen werden. Mit dem Test kann durch
Bestimmung des HIV-1-RNA-Ausgangswerts die Prognose eines Patienten beurteilt und anhand der
Veränderung des HIV-1-RNA-Spiegels im EDTA-Plasma im Verlauf einer antiretroviralen Behandlung die
Wirksamkeit dieser Therapie kontrolliert werden.
Der COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System ist nicht als
Screening-Test für das Vorliegen von HIV-1 in Blut oder Blutprodukten oder als diagnostischer
Test zur Bestätigung einer HIV-1-Infektion vorgesehen.
ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLÄRUNG DES TESTS
Das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) ist der Erreger des erworbenen Immundefizienz-Syndroms
(AIDS)3-5. Die HIV-Infektion kann durch sexuellen Kontakt, Kontakt mit infiziertem Blut oder Blutprodukten
oder von einer infizierten Mutter auf das Kind im Mutterleib übertragen werden6. Innerhalb von drei bis
sechs Wochen nach HIV-Exposition entwickelt sich bei den infizierten Personen im Allgemeinen ein
kurzzeitiges akutes Syndrom, das sich durch grippeähnliche Symptome äußert und mit einer hochgradigen
Virämie im peripheren Blut verbunden ist7-10. Bei den meisten infizierten Personen schließt sich innerhalb
von vier bis sechs Wochen nach Auftreten der Symptome eine HIV-spezifische Immunreaktion und ein
Rückgang der Plasmavirämie an11, 12. Nach der Serokonversion treten infizierte Personen typischerweise in
eine klinisch stabile, symptomfreie Phase ein, die über Jahre andauern kann13-15. Die symptomfreie Periode
zeichnet sich durch eine anhaltend niedrige Plasmavirämie16 sowie eine allmähliche Abnahme der
CD4+-T-Lymphozyten aus, was zu schwerer Immundefizienz, multiplen opportunistischen Infektionen,
malignen Erkrankungen und schließlich zum Tod führt17. Zwar sind die Viruskonzentrationen im
peripheren Blut während der symptomfreien Phase der Infektion relativ gering, doch scheint es sich bei
der Vermehrung und Elimination des Virus um dynamische Vorgänge zu handeln, bei denen einer hohen
Rate der Virusproduktion und Infektion von CD4+-Zellen eine ebenso hohe Rate der Viruselimination, des
Absterbens infizierter Zellen sowie der Regeneration von CD4+-Zellen gegenübersteht, wodurch es zu
relativ stabilen Plasmavirämie- und CD4+-Werten kommt18-20.
Quantitative Bestimmungen der HIV-Virämie im peripheren Blut haben gezeigt, dass höhere Viruskonzentrationen eventuell mit einem höheren Risiko eines klinischen Fortschreitens der HIV-Erkrankung
verbunden sind und dass eine Reduzierung der Plasmavirämie möglicherweise ein entsprechend
geringeres Progressionsrisiko mit sich bringt21-23. Der Virustiter im peripheren Blut lässt sich quantitativ
durch Messung des HIV-p24-Antigens im Serum, durch quantitative Kultur von HIV aus Plasmaproben
oder durch direkte Messung der viralen RNA im Plasma mit Hilfe der Nukleinsäure-Amplifikation oder mit
Signal-Amplifikationsverfahren bestimmen24-28.
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Das p24-Antigen ist das Haupt-Core-Protein des HIV; es kommt im Serum entweder frei oder an Anti-p24Antikörper gebunden vor. Freies p24-Antigen kann mit einem handelsüblichen Enzymimmunoassay (EIA)
gemessen werden; der Nutzen des p24-Antigens als Marker der viralen Belastung ist jedoch begrenzt, da
das Antigen nur bei 20 % der symptomfreien Patienten und bei 40-50 % der Patienten mit Symptomen
nachweisbar ist. Verfahren zur Auftrennung von Antigen-Antikörper-Komplexen verbessern zwar die
Sensitivität der p24-Antigen-Tests, das virale Protein ist bei den meisten symptomfreien Patienten jedoch
nicht nachweisbar24.
Infektiöses HIV im Plasma kann durch Inokulation in aktivierte mononukleäre Zellen des peripheren Blutes
(PBMC) von gesunden Spendern gezüchtet werden. Die quantitative Bestimmung erfolgt durch Inokulation
der PBMC mit Reihenverdünnungen der Plasmaprobe. Die quantitative Kultur ist zur Überwachung der
Viruskonzentrationen bei infizierten Personen nur von begrenztem Nutzen, da nur ein kleiner Teil der
Viruspartikel in vitro infektiös ist. Infektiöse Viren sind bei symptomfreien Personen oft nicht nachweisbar24.
Die HIV-RNA im Plasma lässt sich mit Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren, wie z. B. der PolymeraseKettenreaktion (PCR), quantitativ bestimmen29-31. Der COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung
mit dem High Pure System basiert auf der PCR-Technologie und bietet höchstmögliche Sensitivität sowie
den breitestmöglichen dynamischen Bereich für den quantitativen Nachweis von HIV-1-RNA in mit EDTA
als Antikoagulans versetztem Plasma.
TESTPRINZIPIEN
Der COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System ist ein NukleinsäureAmplifikationstest zur quantitativen Bestimmung der RNA des Humanen Immundefizienz-Virus vom Typ 1
(HIV-1) in Humanplasma. Der COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure
System beruht im Wesentlichen auf drei Schritten: (1) manuelle Probenaufarbeitung zur Isolierung der
HIV-1-RNA, (2) reverse Transkription der Ziel-RNA zur Erzeugung komplementärer DNA (cDNA)32 und
(3) gleichzeitige PCR-Amplifikation32 von Ziel-cDNA und Detektion der gespaltenen, zweifach markierten
zielspezifischen Oligonukleotid-Detektionssonde.
Der COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System ermöglicht die
manuelle Probenaufarbeitung mit dem High Pure System und anschließende automatische reverse
Transkription, PCR-Amplifikation und Detektion der HIV-1-Ziel-RNA und der HIV-1-Quantifizierungsstandard (QS)-„Armored“-RNA. Das Master-Mix-Reagenz enthält Primerpaare und Sonden, die sowohl für
die HIV-1-RNA als auch für die HIV-1-QS-RNA spezifisch sind. Der Master-Mix wurde entwickelt, um eine
äquivalente Quantifizierung der verschiedenen HIV-1-Isolate zu gewährleisten. Der Nachweis der
amplifizierten DNA erfolgt anhand zielspezifischer und Quantifizierungsstandard-spezifischer, zweifach
markierter Oligonukleotidsonden, die eine unabhängige Identifizierung des HIV-1-Amplifikats und des
HIV-1-QS-Amplifikats ermöglichen.
Die quantitative Bestimmung der viralen HIV-1-RNA erfolgt mit Hilfe des HIV-1-QS. Dieser dient zur
Kompensation von Hemmeffekten und zur Kontrolle des Aufarbeitungs- und Amplifikationsprozesses;
dadurch wird eine exaktere quantitative Bestimmung der HIV-1-RNA in jeder Probe gewährleistet.
HIV-1-QS ist ein nicht-infektiöses Armored-RNA-Konstrukt, das Primer-Bindungsstellen für HIV-1-Primer
im COBAS® TaqMan® HIV-1-Master-Mix, v2.0 sowie eine eindeutige Sonden-Bindungsregion enthält,
welche die Unterscheidung zwischen dem HIV-1-QS-Amplifikat und dem HIV-1-Ziel-Amplifikat ermöglicht.
Der HIV-1-QS wird mit einer bekannten Anzahl Kopien in jede Probe eingebracht und wird durch die
anschließenden Schritte der Probenaufarbeitung, der reversen Transkription und der gleichzeitigen PCRAmplifikation und Detektion der gespaltenen, zweifach markierten Oligonukleotid-Detektionssonden
mitgeführt. Der COBAS® TaqMan® 48 Analyzer berechnet die HIV-1-RNA-Konzentration in den zu
untersuchenden Proben durch Vergleich des HIV-1-Signals mit dem HIV-1-QS-Signal der jeweiligen Probe
oder Kontrolle.
Wahl der Zielsequenz
Die Wahl der RNA-Zielsequenz für HIV-1 hängt von der Identifizierung von Regionen innerhalb des HIV-1Genoms ab, die die größtmögliche Sequenzkonservierung unter den verschiedenen HIV-1-Isolaten
aufweisen. Aufgrund der hohen genetischen Variabilität des Virus deckt der COBAS® TaqMan® HIV-1-Test,
v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System bei der Amplifikation und Detektion gleichzeitig zwei
Regionen des HIV-1-Genoms ab. Zwei zielspezifische und eine QS-spezifische zweifach markierte
Oligonukleotidsonde ermöglichen die unabhängige Identifizierung des HIV-1-Amplifikats und des HIV-1QS-Amplifikats (v2.0). Dementsprechend ist die Wahl geeigneter Primer und der zweifach markierten
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Oligonukleotidsonden für die Amplifikation und Detektion der verschiedenen HIV-1-Isolate mit diesem Test
entscheidend. Der COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System
verwendet Primer für die reverse Transkription und PCR-Amplifikation, die Sequenzen innerhalb der
hochkonservierten Region des HIV-1-gag-Gens33 und der HIV-1-LTR-Region definieren.
Probenaufarbeitung
Beim COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System werden mittels einer
allgemeinen manuellen Probenaufarbeitung, die auf der Bindung der Nukleinsäure an Glasfasern beruht,
EDTA-Plasmaproben bearbeitet und HIV-1-RNA isoliert. Bei dem Verfahren werden 500 μl Plasma
verarbeitet. Die HIV-1-Viruspartikel werden durch Inkubation bei erhöhter Temperatur mit einer Protease
und einem chaotropen Lyse-/ Bindungspuffer lysiert. Dieser Puffer setzt Nukleinsäuren frei und schützt die
freigesetzte HIV-1-RNA vor RNasen im Plasma. Jeder Probe werden neben dem Lysereagenz Protease und
eine bekannte Anzahl HIV-1-QS-„Armored“-RNA-Moleküle zugesetzt. Anschließend wird Isopropanol der
Lysemischung zugegeben, die dann durch eine Säule mit Glasfasereinsatz zentrifugiert wird. Beim
Zentrifugieren werden HIV-1-RNA und HIV-1-Quantifizierungsstandard-RNA an der Oberfläche des
Glasfaserfilters gebunden. Außerdem werden durch das Zentrifugieren ungebundene Substanzen wie
Salze, Proteine und andere Zellverunreinigungen entfernt. Die adsorbierten Nukleinsäuren werden mit
einer wässrigen Lösung gewaschen und eluiert. Es sind ausreichend Verbrauchsmaterialien zur parallelen
Verarbeitung von 12 Proben oder einem Mehrfachen davon vorhanden. Die bearbeiteten Proben, die
HIV-1-RNA und HIV-1-QS-RNA enthalten, werden dem Amplifikations-/Detektionsgemisch zugefügt und
in den COBAS® TaqMan® 48 Analyzer überführt. Die HIV-1-Ziel-RNA und die HIV-1-QS-RNA werden
dann revers transkribiert, amplifiziert und gleichzeitig durch Spaltung zweier HIV-1-spezifischer und einer
QS-spezifischen zweifach markierten Oligonukleotidsonde detektiert.
Reverse Transkription und PCR-Amplifikation
Reverse Transkription
Die reverse Transkription und PCR-Amplifikation werden mit dem thermostabilen rekombinanten Enzym
Thermus specie Z05-DNA-Polymerase (Z05) durchgeführt. In Gegenwart von Mangan (Mn2+) und unter
geeigneten Pufferbedingungen weist Z05 sowohl Reverse-Transkriptase- als auch DNA-Polymerase-Aktivität
auf32. Dadurch können die reverse Transkription und die PCR-Amplifikation gleichzeitig mit der EchtzeitDetektion des Amplifikats erfolgen.
Die aufgearbeiteten Proben werden dem Amplifikationsgemisch in Amplifikationsröhrchen (K-Tubes) oder
Amplifikationsplatten (K-Trays) zugegeben, in denen sowohl die reverse Transkription als auch die PCRAmplifikation stattfinden. Das Reaktionsgemisch wird erwärmt, damit sich die Downstream-Primer
spezifisch an die HIV-1-Ziel-RNA und die HIV-1-QS-RNA anlagern. In Gegenwart von Mn2+ und überschüssigen Desoxynukleotidtriphosphaten (dNTPs), einschließlich Desoxyadenosin-, Desoxyguanosin-,
Desoxycytidin-, Desoxyuridin- und Desoxythymidintriphosphaten, verlängert Z05-Polymerase die
angelagerten Primer, wobei zur RNA-Zielsequenz komplementäre DNA-Stränge gebildet werden.
Zielamplifikation
Nach der reversen Transkription der HIV-1-Ziel-RNA und der HIV-1-Quantifizierungsstandard-RNA wird
das Reaktionsgemisch erwärmt, um das RNA:cDNA-Hybrid zu denaturieren und die Primer-Zielsequenzen
freizulegen. Beim Abkühlen des Gemischs lagern sich die Upstream-Primer spezifisch an den cDNAStrang an, Z05 verlängert den Primer, und ein zweiter DNA-Strang wird synthetisiert. Mit Abschluss dieses
ersten PCR-Zyklus liegt nun eine doppelsträngige DNA-Kopie der Zielregionen der HIV-1-RNA und der
HIV-1-QS-RNA vor. Das Reaktionsgemisch wird nochmals erwärmt, wodurch die sich ergebende doppelsträngige DNA aufgetrennt wird und die Primer-Zielsequenzen freigelegt werden. Beim Abkühlen des
Gemischs lagern sich die Primer an die Ziel-DNA an. Z05 verlängert in Gegenwart von Mn2+ und überschüssigen dNTPs die angelagerten Primer entlang der Zielmatrizen, was zur Bildung eines doppelsträngigen DNA-Moleküls (des so genannten Amplifikats) führt. Dieser Prozess wird vom COBAS®
TaqMan® 48 Analyzer automatisch bis zur Erreichung einer festgelegten Anzahl von Zyklen wiederholt,
wobei in jedem Zyklus die Menge an DNA-Amplifikat verdoppelt wird. Die erforderliche Anzahl der Zyklen
ist im COBAS® TaqMan® 48 Analyzer vorprogrammiert. Die Amplifikation erfolgt nur in den von den
Primern begrenzten Regionen des HIV-1-Genoms; es wird nicht das gesamte HIV-1-Genom amplifiziert.
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Selektive Amplifikation
Die selektive Amplifikation der Ziel-Nukleinsäure in der Probe wird beim COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0
zur Verwendung mit dem High Pure System durch Verwendung des Enzyms AmpErase (Uracil-N-Glykosylase)
und von Desoxyuridintriphosphat (dUTP) erreicht. Das Enzym AmpErase erkennt desoxyuridinhaltige34 – nicht
aber desoxythymidinhaltige – DNA-Stränge und katalysiert deren Zerstörung. Desoxyuridin ist in natürlich
vorkommender DNA nicht enthalten, jedoch in den Amplifikaten immer vorhanden, da Desoxyuridintriphosphat
als eines der dNTPs im Master-Mix verwendet wird. Deshalb enthalten nur die Amplifikate Desoxyuridin.
Desoxyuridin macht kontaminierende Amplifikate vor der Amplifikation der Ziel-DNA anfällig für die
Zerstörung durch das Enzym AmpErase. Zudem wird jedes nichtspezifische Produkt, das nach der ersten
Aktivierung des Master-Mix durch Mangan gebildet wurde, durch das Enzym AmpErase zerstört. Das im
Master-Mix enthaltene Enzym AmpErase katalysiert die Spaltung desoxyuridinhaltiger DNA an den
Desoxyuridin-Resten durch Öffnen der Desoxyribosekette an der C1-Position. Während der Erwärmung im
ersten thermozyklischen Schritt tritt ein Bruch des DNA-Strangs des Amplifikats an der Desoxyuridin-Position
auf, so dass die DNA nicht weiter amplifiziert werden kann. Das Enzym AmpErase bleibt für einen längeren
Zeitraum inaktiv, sobald es Temperaturen über 55 °C ausgesetzt wird (d. h. während aller thermozyklischen
Schritte), und zerstört daher kein nach der reversen Transkription und Amplifikation gebildetes Zielamplifikat.
Detektion von PCR-Produkten beim COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit
dem High Pure System
Der COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System basiert auf der EchtzeitPCR-Technologie35,36. Die Verwendung von zweifach markierten Fluoreszenzsonden ermöglicht die Echtzeitdetektion der Akkumulation von PCR-Produkten durch Überwachung der Emissionsintensität der fluoreszierenden Reporterfarbstoffe, die während der Amplifikation freigesetzt werden. Die Sonden bestehen aus HIV-1und HIV-1-QS-spezifischen Oligonukleotidsonden mit einem Reporterfarbstoff und einem Quencherfarbstoff.
Beim COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System werden die HIV-1- und
HIV-1-QS-Sonden mit unterschiedlichen fluoreszierenden Reporterfarbstoffen markiert. Bei intakten zweifach
fluoreszenzmarkierten Sonden wird die Reporterfluoreszenz durch die Nähe des Quencherfarbstoffs aufgrund
von Förster-Energietransfer-Effekten unterdrückt. Während der PCR hybridisiert die Sonde mit einer
Zielsequenz und wird von der 5'–3'-Nukleaseaktivität der thermostabilen Z05-DNA-Polymerase gespalten.
Nach Freisetzung und Trennung der Reporter- und Quencherfarbstoffe findet kein Quenching mehr statt und
die Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs nimmt zu. Die Amplifikation der HIV-1-RNA und der HIV-1-QS-RNA
wird unabhängig voneinander bei unterschiedlichen Wellenlängen gemessen. Dieser Vorgang wird für eine
festgelegte Anzahl von Zyklen wiederholt, wobei jeder Zyklus die Emissionsintensität der einzelnen Reporterfarbstoffe effektiv verstärkt, was eine unabhängige Identifizierung der HIV-1- und der HIV-1-QS-RNA
ermöglicht. In welchem PCR-Zyklus eine Wachstumskurve exponentiell zu steigen beginnt, hängt von der
Menge des Ausgangsmaterials zu Beginn der PCR ab.
Grundlagen der quantitativen Bestimmung mit dem COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur
Verwendung mit dem High Pure System
Der COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System liefert in einem sehr
breiten dynamischen Bereich genaue quantitative Ergebnisse, da die Überwachung des Amplifikats
während der exponentiellen Phase der Amplifikation erfolgt. Je höher der HIV-1-Titer einer Probe ist, desto
eher steigt die Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs der HIV-1-Sonde über den Ausgangswert des
Fluoreszenzniveaus (siehe Abbildung 1). Da die Menge der HIV-1-QS-RNA in allen Proben konstant ist,
sollte die Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs der HIV-1-QS-Sonde bei allen Proben im gleichen Zyklus
auftreten (siehe Abbildung 2). Bei Proben, in denen die QS-Fluoreszenz beeinträchtigt ist, wird die
Konzentration entsprechend korrigiert. Das Erscheinen des spezifischen Fluoreszenzsignals wird als
kritischer Schwellenwert (Ct) angegeben. Der Ct-Wert wird als die Zyklusbruchzahl definiert, bei der die
Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs einen vorbestimmten Fluoreszenzschwellenwert (den Fluoreszenzsollwert) überschreitet und eine exponentielle Wachstumsphase dieses Signals beginnt (siehe
Abbildung 3). Ein höherer Ct-Wert deutet auf einen niedrigeren Titer der anfänglichen HIV-1-Ziel-RNA hin.
Ein 2facher Anstieg des Titers korreliert mit einer Abnahme der HIV-1-Ziel-RNA um 1 Ct, während ein
10facher Anstieg des Titers mit einer Abnahme um 3,3 Ct korreliert.
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Abbildung 1 zeigt die Ziel-Wachstumskurven für eine Virus-Verdünnungsreihe über einen Bereich von
5 log10. Mit steigender Viruskonzentration verschieben sich die Wachstumskurven in Richtung früherer
Zyklen. Daher entspricht die Wachstumskurve ganz links dem höchsten Virustiter, während die Kurve ganz
rechts dem niedrigsten Virustiter entspricht.
Normalisierte Fluoreszenz
Abbildung 1
Ziel-Wachstumskurven für eine Virus-Verdünnungsreihe über einen Bereich von 5 log10
10
Höchster Titer
5
Niedrigster Titer
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Zykluszahl
Abbildung 2 zeigt die Quantifizierungsstandard-Wachstumskurven für eine Virus-Verdünnungsreihe über
einen Bereich von 5 log10. Die jeder Probe zugefügte Menge an Quantifizierungsstandard ist bei allen
Reaktionen gleich. Der Ct-Wert des Quantifizierungsstandards ist unabhängig vom Virustiter vergleichbar.
Abbildung 2
Quantifizierungsstandard-Wachstumskurven für eine Virus-Verdünnungsreihe
über einen Bereich von 5 log10
50
40
Niedrigster Titer
30
20
10
0
Höchster Titer
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Zykluszahl
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Doc Rev. 6.0
Abbildung 3 zeigt ein Beispiel für die Normalisierung der Fluoreszenzwerte bei jedem Zyklus für jede
einzelne Wachstumskurve. Die Zyklusbruchzahl (Ct-Wert) wird dort berechnet, wo das Fluoreszenzsignal
den Fluoreszenzsollwert schneidet.
Abbildung 3
Normalisierung der Fluoreszenzwerte bei jedem Zyklus für jede Wachstumskurve
1.0
1,0
0.8
0,8
0.6
0,6
0.4
0,4
Ct-Wert = 28,2
Fluoreszenzsollwert
0.2
0,2
0.0
0,0
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
Zykluszahl
Quantitative Bestimmung der HIV-1-RNA
Zur quantitativen Bestimmung der viralen HIV-1-RNA mit dem COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur
Verwendung mit dem High Pure System wird jeder zu bestimmenden Probe eine zweite Zielsequenz (HIV-1QS) in bekannter Konzentration zugegeben. Der HIV-1-QS ist ein nicht-infektiöses Armored-RNA-Konstrukt,
das Fragmente von HIV-1-Sequenzen mit den gleichen Primer-Bindungsregionen wie die HIV-1-gagZielsequenz enthält. Der HIV-1-QS erzeugt außerdem ein Amplifikationsprodukt derselben Länge und Basenzusammensetzung wie die HIV-1-gag-Ziel-RNA. Die Detektionssonden-Bindungsregion des HIV-1-QS wurde
so modifiziert, dass zwischen einem HIV-1-QS-Amplifikat und einem HIV-1-gag-Zielamplifikat unterschieden
werden kann.
Während der Annealing-Phase der PCR im COBAS® TaqMan® 48 Analyzer werden die Proben mit Licht
einer bestimmten Wellenlänge bestrahlt und angeregt. Für jede Probe werden Daten zur gefilterten
Emissionsfluoreszenz gesammelt. Die für die einzelnen Proben erhaltenen Werte werden dann um die
gerätebedingten Schwankungen korrigiert. Diese Fluoreszenzwerte werden vom Gerät an die AMPLILINK
Software gesendet und in einer Datenbank gespeichert. Mit Hilfe von Vorprüfungen wird festgestellt, ob
die Daten für die HIV-1-RNA und HIV-1-QS-RNA gültige Datensätze darstellen. Liegen die Daten
außerhalb der voreingestellten Grenzwerte, werden Alarmhinweise (Flags) generiert. Nach erfolgreichem
Abschluss aller Vorprüfungen werden die Fluoreszenzwerte bearbeitet, um Ct-Werte für die HIV-1-RNA
und die HIV-1-QS-RNA zu generieren. Mit Hilfe der mit dem COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur
Verwendung mit dem High Pure System mitgelieferten chargenspezifischen Kalibrationskonstanten
werden die Titerwerte für die Proben und Kontrollen anhand der Ct-Werte der HIV-1-RNA und HIV-1-QSRNA berechnet. Der COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System
wurde gegen einen internationalen Standard der Weltgesundheitsorganisation (WHO) für HIV-1-RNA
standardisiert1,2,37. Die Titerergebnisse werden in Kopien/ml (cp/mL) oder in Internationalen Einheiten/ml
(IU/mL) angegeben. Als Konversionsfaktor zwischen in HIV-1-RNA Kopien/ml und HIV-1 internationalen
Einheiten/ml angegebenen Werten wurde von der Firma Roche Molecular Systems, Inc. ein Wert von
0,6 Kopien/IE (1,67 IE/Kopie) ermittelt.
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Doc Rev. 6.0
REAGENZIEN
Virusnukleinsäure-Kit für das High Pure System
(P/N: 03502295 001)
48 Tests
LYS
(Lyse-/Bindungspuffer)
Tris
50 % (Gew.-%) Guanidin-HCl
<1 % Harnstoff
19 % (Gew.-%) Triton X-100
2 x 25 ml
CAR
(RNA, lyophilisiert)
2 x 2 mg
PK
(Proteinase K, lyophilisiert)
≥ 64 % (Gew.-%) Proteinase K, lyophilisiert
2 x 100 mg
IRB
(Inhibitor Removal-Puffer)
Tris
65 % (Gew.-%) Guanidin-HCl
(20 ml Ethanol zugeben)
1 x 33 ml
WASH
(Waschpuffer)
Tris
NaCI
(80 ml Ethanol zugeben)
1 x 20 ml
ELB
(Elutionspuffer)
1 x 30 ml
RS
(Virusnukleinsäure-Rack-Set für das High Pure System)
Lyse-Rack
Filterröhrchen-Rack mit daran befestigtem Abfall-Rack
Elutions-Rack
Verschluss-Rack
je 4
WR
(Virusnukleinsäure-Abfall-Rack für das High Pure System)
je 8
COBAS® TaqMan® HIV-1 Test, Version 2.0
(P/N: 05923468 190)
HIVHP2
48 Tests
Probenaufarbeitungs- und Kontrollreagenzien
2 x 1,0 ml
HIV-1 QS, v2.0
(HIV-1-Quantifizierungsstandard, v2.0)
Tris-HCI-Puffer
EDTA
< 0,001 % Armored-RNA-Konstrukt mit HIV-1-Primer-Bindungssequenzen
und einer eindeutigen Sonden-Bindungsregion (nicht-infektiöse RNA aus MS2-Bakteriophage)
Amaranth-Farbstoff
< 0,005 % Poly rA RNA (synthetisch)
0,05 % Natriumazid
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7
Doc Rev. 6.0
HIV-1 H(+)C, v2.0
[Hoch positive HIV-1-Kontrolle, v2.0]
< 0,001 % Armored RNA-Konstrukt mit HIV-1-Sequenzen
(nicht-infektiöse RNA aus MS2-Bakteriophage)
Negatives Humanplasma, in Tests nicht reaktiv auf HCV-Antikörper,
HIV-1/2-Antikörper, HIV-p24-Antigen und HBsAg; HIV-1-RNA,
HCV-RNA und HBV-DNA durch PCR-Methoden nicht nachweisbar
0,1 % ProClin® 300 als Konservierungsmittel
2 x 1,0 ml
HIV-1 L(+)C, v2.0
[Schwach positive HIV-1-Kontrolle, v2.0]
< 0,001 % Armored RNA-Konstrukt mit HIV-1-Sequenzen
(nicht-infektiöse RNA aus MS2-Bakteriophage)
HCV-RNA und HBV-DNA durch PCR-Methoden
nicht nachweisbar
2 x 1,0 ml
CTM (–) C
[COBAS® TaqMan® Negativkontrolle (Humanplasma)]
HCV-RNA und HBV-DNA durch PCR-Methoden
nicht nachweisbar
4 x 1,0 ml
Reagenzien für die Amplifikation und Detektion
HIV-1 MMX, v2.0
(COBAS® TaqMan® HIV-1-Master-Mix, v2.0)
Tricinpuffer
Kaliumhydroxid
Kaliumacetat
< 20 % Dimethylsulfoxid
Glyzerin
< 0,001 % dATP, dCTP, dGTP, dUTP, dTTP
< 0,001 % HIV-1-Primer
< 0,05 % Z05-DNA-Polymerase (mikrobiell)
< 0,1 % AmpErase-Enzym (Uracil-N-Glykosylase) (mikrobiell)
< 0,001 % fluoreszenzmarkierte, für HIV-1 und den HIV-1-Quantifizierungsstandard
spezifische Oligonukleotidsonden
0,09 % Natriumazid
2 x 24 Tests
2 x 1,4 ml
CTM Mn2+
(COBAS® TaqMan® Manganlösung)
< 1,2 % Manganacetat
Eisessig
0,09 % Natriumazid
2 x 24 Tests
2 x 1,0 ml
05923573001-06DE
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Doc Rev. 6.0
WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN
A.
IN-VITRO-DIAGNOSTIKUM.
B.
Dieser Test darf nur für Humanplasma verwendet werden, das im Antikoagulans EDTA gesammelt
wurde.
C.
Nicht mit dem Mund pipettieren.
D.
In den Arbeitsbereichen des Labors nicht essen, trinken oder rauchen. Beim Umgang mit Proben
und Testreagenzien Einweghandschuhe, Laborkittel und Schutzbrille tragen. Nach dem Umgang
mit Proben und Testreagenzien gründlich die Hände waschen.
E.
Bei der Entnahme von Aliquots aus den Reagenzflaschen Kontamination der Reagenzien
durch Mikroorganismen und Ribonuklease vermeiden.
F.
Es wird empfohlen, sterile Einwegpipetten und RNase-freie Pipettenspitzen zu verwenden.
G.
Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen oder verschiedenen Flaschen derselben Charge nicht
vermischen.
H.
Reagenzien aus verschiedenen Kits nicht vermischen.
I.
Nicht verbrauchte Reagenzien, Abfallmaterial und Proben gemäß den geltenden Vorschriften
entsorgen.
J.
Kit nach dem Verfallsdatum nicht mehr verwenden.
K.
Sicherheitsdatenblätter (Safety Data Sheets, SDS) sind auf Anfrage bei der zuständigen RocheVertretung erhältlich.
L.
Die Proben und Kontrollen sind als potenziell infektiös und gemäß den Vorschriften für sicheres
Arbeiten im Labor, wie in Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories38 und dem CLSIDokument M29-A339 beschrieben, zu behandeln. Alle Arbeitsflächen sind mit einer frisch
zubereiteten Lösung aus 0,5 % Natriumhypochlorit in entionisiertem oder destilliertem Wasser
gründlich zu reinigen und zu desinfizieren.
Hinweis: Handelsübliche flüssige Haushaltsbleiche enthält in der Regel Natriumhypochlorit in einer Konzentration von 5,25 %. Durch Verdünnung im Verhältnis
1:10 erhält man eine 0,5-prozentige Natriumhypochloritlösung.
M.
VORSICHT: CTM (–) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 und HIV-1 H(+)C, v2.0 enthalten aus Humanblut
gewonnenes Humanplasma. Das Ausgangsmaterial wurde getestet und für nicht reaktiv bezüglich
Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg), Antikörper gegen HIV-1/2 und HCV sowie HIV-p24-Antigen
befunden. Bei der Untersuchung von negativem Humanplasma mittels PCR-Methoden konnte weder
HIV-1-RNA, HCV-RNA noch HBV-DNA nachgewiesen werden. Für keine der bekannten Testmethoden
kann mit Sicherheit gewährleistet werden, dass von aus Humanblut gewonnenen Produkten keine
Infektionserreger übertragen werden. Deshalb sind alle Materialien menschlichen Ursprungs als
potenziell infektiös anzusehen. CTM (–) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 und HIV-1 H(+)C, v2.0 sind als
infektiös und unter Verwendung sicherer Laborverfahren gemäß Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories38 und dem CLSI-Dokument M29-A339 zu behandeln. Alle Arbeitsflächen sind
mit einer frisch zubereiteten Lösung aus 0,5 % Natriumhypochlorit in entionisiertem oder destilliertem
Wasser gründlich zu reinigen und zu desinfizieren.
N.
HIV-1 MMX, v2.0, HIV-1 QS, v2.0 und CTM Mn2+ enthalten Natriumazid. Natriumazid kann bei
der Reaktion mit Blei- und Kupferleitungen hochexplosive Metallazide bilden. Beim Ausgießen
natriumazidhaltiger Lösungen in Laborwaschbecken zur Vermeidung einer Azidansammlung mit
reichlich Wasser nachspülen.
O.
Beim Umgang mit Reagenzien Augenschutz, Laborkittel und Einweghandschuhe tragen. Haut,
Augen und Schleimhäute vor Kontakt mit diesen Materialien schützen. Bei Kontakt sofort mit
reichlich Wasser abspülen. Unbehandelt können Verätzungen entstehen. Falls diese Reagenzien
verschüttet werden, vor dem Trockenwischen mit Wasser verdünnen.
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Doc Rev. 6.0
LAGERUNG UND HANDHABUNG
Reagenzien zur Probenaufarbeitung
A.
Die High Pure System Virusnukleinsäure-Reagenzien sofort nach Empfang bei 15-25 °C lagern.
B.
Elutionspuffer (ELB) und Lyse-/Bindungspuffer (LYS) bei 15 bis 25 °C lagern. Nach dem Öffnen
ELB und LYS bei 15 bis -25 °C lagern. Geöffnet müssen ELB und LYS innerhalb von 30 Tagen bzw.
maximal bis zum Verfallsdatum verbraucht werden.
C.
Nach der Zugabe von Elutionspuffer (ELB) zur Rekonstitution der Träger-RNA und Proteinase K nicht
verwendete rekonstituierte Träger-RNA (CAR) sowie nicht verwendete rekonstituierte Proteinase K (PK)
bei -15 bis -25 °C lagern. Nach der Rekonstitution müssen Träger-RNA und Proteinase K innerhalb von
30 Tagen bzw. maximal bis zum Verfallsdatum verbraucht werden.
D.
Nach der Zugabe von Ethanol den Inhibitor Removal-Puffer (IRB) und den Waschpuffer (WASH)
bei 15 bis 25 °C lagern. Diese Gebrauchslösungen sind 30 Tage bzw. maximal bis zum Verfallsdatum stabil.
E.
Die Lyse-/Bindungs-Gebrauchslösung [Lyse-/Bindungspuffer mit Träger-RNA, Proteinase K und
HIV-1 QS, v2.0] muss nach der Zubereitung sofort verwendet werden. Überschüssiges, nicht
verbrauchtes Material muss entsorgt werden.
A.
Reagenzien und Kontrollen nicht einfrieren.
B.
HIV-1 MMX, v2.0, CTM (–) C, HIV-1 L(+)C, v2.0, HIV-1 H(+)C, v2.0, HIV-1 QS, v2.0 und
CTM Mn2+ bei 2-8 °C lagern. Ungeöffnet sind diese Reagenzien bis zum angegebenen Verfallsdatum
stabil. Nach dem Öffnen ein Aliquot für einen Batch von 12 Proben entnehmen. Den Rest an
HIV-1 MMX, v2.0, HIV-1 L(+)C, v2.0, HIV-1 H(+)C, v2.0, HIV-1 QS, v2.0 und CTM Mn2+ bei
2-8 °C lagern. Nach dem Öffnen sind HIV-1 MMX, v2.0, HIV-1 L(+)C, v2.0, HIV-1 H(+)C, v2.0,
HIV-1 QS, v2.0 und CTM Mn2+ bei 2-8 °C 30 Tage lang bzw. maximal bis zum Verfallsdatum stabil.
C.
Nach dem Öffnen nicht verbrauchte Reste von CTM (–) C entsorgen.
D.
Den Gebrauchs-Master-Mix (durch Zugabe von CTM Mn2+ zu HIV-1 MMX, v2.0 zubereitet) bei
2-8 °C im Dunkeln lagern. Die aufgearbeiteten Proben und Kontrollen müssen innerhalb von
2 Stunden nach der Zubereitung des Gebrauchs-Master-Mix zugegeben werden.
E.
Bearbeitete Proben und Kontrollen sind bei 4-30 °C bis zu 2 Stunden stabil.
F.
Mit der Amplifikation muss innerhalb von 1 Stunde nach der Zugabe der bearbeiteten Proben und
Kontrollen zum Gebrauchs-Master-Mix begonnen werden.
MITGELIEFERTE MATERIALIEN
Reagenzien zur Probenaufarbeitung
A.
Virusnukleinsäure-Kit für das High Pure System
(P/N: 03502295 001)
LYS
(Lyse-/Bindungspuffer)
CAR
(Träger-RNA)
PK
(Proteinase K)
IRB
(Inhibitor Removal-Puffer)
WASH
(Waschpuffer)
ELB
(Elutionspuffer)
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Doc Rev. 6.0
RS
(Virusnukleinsäure-Rack-Set für das High Pure System)
WR
(Virusnukleinsäure-Abfall-Rack für das High Pure System)
B.
COBAS® TaqMan® HIV-1 Test, v2.0
(P/N: 05923468 190)
HIVHP2
HIV-1 QS, v2.0
(HIV-1-Quantifizierungsstandard)
HIV-1 H(+)C, v2.0
[Hoch positive HIV-1-Kontrolle]
HIV-1 L(+)C, v2.0
[Schwach positive HIV-1-Kontrolle]
CTM (–) C
[COBAS® TaqMan® Negativkontrolle (Humanplasma)]
HIV-1 MMX, v2.0
(COBAS® TaqMan® HIV-1-Master-Mix, v2.0)
CTM Mn2+
(COBAS® TaqMan® Manganlösung)
ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL
Geräte und Software
•
COBAS® TaqMan® 48 Analyzer
•
AMPLILINK Software, Version 3.3 oder Version 3.4
•
Control Unit für die AMPLILINK Software, mit Drucker
•
Geräte- und Anwendungshandbücher:
- Gerätehandbuch für den COBAS® TaqMan® 48 Analyzer zur Verwendung mit der
AMPLILINK Software, Version 3.3 und 3.4
- Anwendungshandbuch für die AMPLILINK Software, Version 3.3, zur Verwendung mit
dem COBAS® AmpliPrep Instrument, COBAS® TaqMan® Analyzer, COBAS® TaqMan® 48
Analyzer, COBAS® AMPLICOR® Analyzer und dem cobas p 630 instrument
oder
- Anwendungshandbuch für die AMPLILINK Software, Version 3.4
•
Testdefinitionsdatei (TDF). Den Namen und die Version der TDF finden Sie auf der dem Kit
beiliegenden Produktinformationskarte.
•
K-Carrier-Halter (P/N: 03287696001)
•
K-Carrier-Transporter (P/N: 03517519001)
•
K-Tray-Capper (P/N: 03339904001)
•
K-Tray-Carrier (P/N: 03341488001)
•
K-Tube-Capper, motorisiert (P/N: 03516539001)
•
K-Carrier (P/N: 28150397001)
Einwegartikel
•
K-Tray, Packung mit 24 (P/N: 03343146001)
•
K-Tubes, Packung mit 12 x 96 (P/N: 03137082001)
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Doc Rev. 6.0
Zentrifugiermaterial
•
Sigma 4-15C Tischzentrifuge oder gleichwertige Mikrotiterplattenzentrifuge mit einer
Zentrifugalkraft von 4600 x g
•
Sigma Zentrifugen-Ausschwingrotor P/N: 11118 (inkl. 2 Becher P/N: 13218 und
2 Plattenhalter P/N: 17978) oder gleichwertiges Produkt
WEITERES ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL
•
Isopropanol (> 99 %) - mindestens entsprechend ACS-Spezifikationen
•
Ethanol (96-100 %) - mindestens entsprechend ACS-Spezifikationen
•
Verstellbare Pipetten* (Kapazität 250 μl und 1000 μl) mit RNase-freien Aerosolfilter- oder
Kolbenhub-Pipettenspitzen
•
Pipettierhilfe: Drummond (P/N: 4-000-100) oder gleichwertiges Produkt
•
Wasserbad, auf 50 °C eingestellt (± 2 °C)
•
Wärmeblock, auf 70 °C eingestellt (± 2 °C)
•
Einwegpipetten, steril, serologisch: 5, 10 und 25 ml
•
Polypropylenröhrchen, steril, konisch: 15 ml und 50 ml: Corning (P/N: 430052 und
P/N: 430290) oder gleichwertiges Produkt
•
Sterile Mikrozentrifugenröhrchen 2,0 ml: Sarstedt (P/N: 72.693.005) oder gleichwertiges
Produkt
•
Vortexer
•
Tube-Racks
•
Einweghandschuhe, puderfrei
•
Kalibrierte Thermometer für Wasserbad und Wärmeblock
* Die Genauigkeit der Pipetten sollte ± 3 % des Nennvolumens betragen. Wo angegeben, müssen RNase-freie
Aerosolfilter- oder Kolbenhub-Pipettenspitzen verwendet werden, um eine Kreuzkontamination der Proben und
Amplifikate zu verhindern.
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Doc Rev. 6.0
ENTNAHME, TRANSPORT UND LAGERUNG VON PROBEN
Hinweis: Alle Proben und Kontrollen wie potenzielle Überträger von Infektionserregern
behandeln.
Hinweis: Dieser Test wurde nur für die Analyse von Humanplasma, das mit EDTA als
Antikoagulans entnommen wurde, validiert. Wenn andere Arten von Proben getestet
werden, können falsche Ergebnisse erzielt werden.
A.
Probenentnahme
Der COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System ist nur für die Analyse
von EDTA-Plasmaproben vorgesehen. Das Blut ist in sterilen Blutentnahmeröhrchen, die EDTA als
Antikoagulans enthalten, zu entnehmen und gemäß den Anweisungen des Röhrchenherstellers zu
mischen. Es können EDTA-Röhrchen mit lila Deckel oder BD Vacutainer® PPT™ Plasmavorbereitungsröhrchen (BD PPT™ Tube) mit perlmuttfarbenem Deckel verwendet werden. Das BD PPT™-Röhrchen
enthält im Sprühverfahren getrocknetes K2EDTA und ein Trenngel. Abbildung 4 zeigt einen Vergleich des
Virustiters der HIV-1-RNA von Proben, die 39 HIV-1-positiven Spendern in EDTA-Röhrchen mit lila Deckel
und in BD PPT™-Röhrchen entnommen wurden. Die BD PPT™-Röhrchen wurden mit den Proben gefüllt,
zentrifugiert und dekantiert und das Plasma wurde innerhalb von 6 Stunden nach der Probenentnahme
eingefroren.
6
5
Log10 HIV-1-RNA [Kopien/ml]
®
BD Vacutainer PPT™ Plasmavorbereitungsröhrchen
Abbildung 4
Vergleich der HIV-1-RNA-Viruslast in EDTA-Röhrchen mit lila Deckel
®
und in BD Vacutainer PPT™ Plasmavorbereitungsröhrchen
4
3
Regression
standardisierte
Hauptkomponente
Y = 1,006 * X - 0,04
R2 = 0,9871
2
N = 39
1
1
2
3
4
5
6
Röhrchen mit lila Deckel
05923573001-06DE
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Doc Rev. 6.0
EDTA-Röhrchen mit lila Deckel
Die in EDTA-Röhrchen mit lila Deckel entnommenen Vollblutproben dürfen nach dem Mischen gemäß
den Anweisungen des Röhrchenherstellers bei 2-25 °C nicht länger als 24 Stunden gelagert werden.
Innerhalb von 24 Stunden nach der Probenentnahme müssen die Probenröhrchen bei 800-1600 x g und
Raumtemperatur 20 Minuten lang zentrifugiert werden, um das Plasma von den zellulären Bestandteilen zu
trennen. Anschließend muss das Plasma in ein steriles Polypropylenröhrchen gegeben werden.
Abbildung 5 zeigt die Auswirkungen verschiedener Lagerbedingungen für Vollblutproben auf den mit dem
COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System gemessenen HIV-RNATiter. Das Vollblut wurde normalen Spendern in Röhrchen mit lila Deckel entnommen. Dann wurde soviel
HIV-1 zugegeben, dass der HIV-1-RNA-Titer ca. 330 Kopien/ml betrug. Es wurden Aliquote entnommen,
die unter den verschiedenen Lagerbedingungen gelagert, zu Plasma verarbeitet und dann mit dem
COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System getestet wurden.
Abbildung 5
HIV-1-Stabilität vor der Plasmatrennung in Vollblut,
das in EDTA-Röhrchen mit lila Deckel entnommen wurde
3,0
2,5
2,0
< 10 Minuten
1,5
24 Std., 2-8 °C
24 Std., 25 °C
1,0
0,5
0,0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Durchschnitt
Spender
BD Vacutainer® PPT™ Plasmavorbereitungsröhrchen
Die in BD PPT™-Röhrchen entnommenen Vollblutproben dürfen nach dem Mischen gemäß den
Anweisungen des Röhrchenherstellers bei 2-25 °C nicht länger als 24 Stunden und nur aufrecht gelagert
werden. Schütteln oder eine andere, von den Anweisungen abweichende Bearbeitung der BD PPT™Röhrchen kann zu abweichenden Ergebnissen der HIV-1-Viruslast führen. Innerhalb von 24 Stunden nach
der Probenentnahme müssen die Probenröhrchen bei 1100 x g und Raumtemperatur 20 Minuten lang mit
Hilfe eines Ausschwingrotors zentrifugiert werden, um das Plasma von den zellulären Bestandteilen zu
trennen. Anschließend muss das Plasma in ein steriles Polypropylenröhrchen gegeben werden.
Abbildung 6 zeigt die Auswirkungen verschiedener Lagerbedingungen für Vollblutproben auf den mit dem
COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System gemessenen HIV-1-RNATiter. Das Vollblut wurde HIV-1-positiven Spendern in ein Röhrchen mit lila Deckel und in fünf BD PPT™Röhrchen entnommen. Nach dem Mischen wurden die Röhrchen unter den in Abbildung 6 dargestellten
Bedingungen gelagert. Dann wurde das Plasma abgetrennt und bis zur Analyse mit dem COBAS®
TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System eingefroren.
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Doc Rev. 6.0
Abbildung 6
HIV-1-Stabilität vor der Plasmatrennung in Vollblut,
das in BD Vacutainer® PPT™ Plasmavorbereitungsröhrchen entnommen wurde
Lila Deckel < 10 Minuten
PPT 2 Std., 25 °C
PPT < 10 Minuten
PPT 24 Std., 2-8 °C
PPT 2 Std., 2-8 °C
PPT 24 Std., 25 °C
6
5
4
3
2
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Spender
B.
Probentransport
Beim Transport von Vollblut und Plasma sind die geltenden Vorschriften für den Transport von
Krankheitserregern zu beachten40. Vollblutproben müssen bei 2-25 °C transportiert und innerhalb von
24 Stunden nach der Entnahme verarbeitet werden. Plasma kann bei 2-8 °C oder gefroren bei
-20 bis -80 °C transportiert werden.
C.
Probenlagerung
Plasmaproben können bei Raumtemperatur maximal 1 Tag lang, bei 2-8 °C bis zu 6 Tage lang oder
tiefgefroren bei -20 bis -80 °C aufbewahrt werden. Es wird empfohlen, Proben in Aliquots von 800-900 μl
in sterilen 2,0-ml-Polypropylenröhrchen mit Schraubverschluss (z. B. Sarstedt P/N: 72.694.006) zu lagern.
Abbildung 7 zeigt die Ergebnisse einer Stabilitätsstudie mit dem COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur
Verwendung mit dem High Pure System zu Plasma normaler Spender, bei der HIV-1 zu einem HIV-1-RNATiter von ungefähr 124 Kopien/ml zugegeben wurde.
Abbildung 7
Stabilität von HIV-1 in EDTA-Plasma
3,0
2,5
2,0
< 1 Stunde
24 Stunden, 30 °C
6 Tage, 2-8 °C
1,5
6 Wochen, -20 °C
6 Wochen, -80 °C
1,0
0,5
0,0
11
12
13
14
15
16
19
18
19
20
Durchschnitt
Spender
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Doc Rev. 6.0
Die Plasmaproben können bis zu 5-mal ohne wesentlichen Verlust von HIV-1-RNA eingefroren und wieder
aufgetaut werden. Abbildung 8 zeigt die Ergebnisse einer Einfrier-Auftau-Studie mit dem COBAS®
TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System zu Plasma normaler Spender, bei
der HIV-1 zu einem HIV-1-RNA-Titer von ungefähr 124 Kopien/ml zugegeben wurde.
Abbildung 8
Stabilität von HIV-1 in EDTA-Plasma nach dem Einfrieren und Auftauen
3,0
2,5
2,0
0 E/A
1 E/A
1,5
3 E/A
5 E/A
1,0
0,5
0,0
11
12
13
14
15
16
19
18
19
20
Durchschnitt
Spender
GEBRAUCHSANLEITUNG
Hinweis: Ausführliche Informationen zur Bedienung, zum Ausdrucken von Ergebnissen und zur
Interpretation von Flags, Anmerkungen und Fehlermeldungen finden Sie (1) im
Gerätehandbuch für den COBAS® TaqMan® 48 Analyzer zur Verwendung mit der
AMPLILINK Software, Version 3.3 und 3.4; (2) im Anwendungshandbuch für die
AMPLILINK Software, Version 3.3 zur Verwendung mit dem COBAS® AmpliPrep
Instrument, COBAS® TaqMan® Analyzer, COBAS® TaqMan® 48 Analyzer, COBAS®
AMPLICOR® Analyzer und cobas p 630 instrument oder (3) im Anwendungshandbuch
für die AMPLILINK Software, Version 3.4.
Hinweis: Alle Amplifikations- und Detektionsreagenzien müssen vor der Verwendung auf Raumtemperatur gebracht werden. Die Lagerung bei 2-8 °C daher mindestens 30 Minuten
vor der Verwendung beenden.
Hinweis: Plasmaproben und Kontrollen müssen vor der Verwendung 15 bis 30 Minuten bei
Raumtemperatur äquilibriert werden.
Hinweis: Wo angegeben, Pipetten mit Aerosolfilter- oder Kolbenhub-Pipettenspitzen verwenden.
Zur Vermeidung von Kontaminationen ist äußerste Sorgfalt erforderlich.
Umfang eines Laufs
Die Reagenzien eines Testkits reichen für vier Läufe mit je 12 Tests, die einzeln oder gleichzeitig
durchgeführt werden können. Bei jedem Lauf mit bis zu 24 Proben und Kontrollen muss je ein Exemplar
der Kontrollen CTM (–) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 und HIV-1 H(+)C, v2.0 mitgeführt werden (siehe
Abschnitt „Qualitätskontrolle“). Die Reagenzien für die Amplifikation und Detektion sind in
Mehrwegflaschen für jeweils 24 Tests abgepackt. Zum möglichst wirtschaftlichen Einsatz der Reagenzien
sollten Proben und Kontrollen jeweils in Batches von 12 bzw. einem Mehrfachen davon bearbeitet werden.
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Doc Rev. 6.0
Aufarbeitung der Proben und Kontrollen
Hinweis: Bei Verwendung tiefgefrorener Plasmaproben die Proben bei Raumtemperatur vollständig auftauen lassen und vor der Verwendung 5-10 Sekunden im Vortexer mischen.
Hinweis: Reagenzien müssen vor ihrem Gebrauch Raumtemperatur erreichen. Vor Beginn der
Reinigungsreaktionen die Heizblöcke auf 70 °C (± 2 °C) und das Wasserbad auf 50 °C
(± 2 °C) vorwärmen.
A.
Vorbereitung der Reagenzien
Hinweis: Die Lyse-/Bindungs-Gebrauchslösung erst zubereiten, nachdem alle Proben und
Kontrollen 15 bis 30 Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibriert wurden.
1.
Zur Vorbereitung des Inhibitor Removal-Puffers 20 ml 96- bis 100-prozentiges Ethanol in den
Inhibitor Removal-Puffer (IRB) pipettieren. Durch 5- bis 10-maliges Umschwenken mischen. Diese
Menge an rekonstituiertem Inhibitor Removal-Puffer ist ausreichend für 48 Tests.
2.
Zur Vorbereitung des Waschpuffers 80 ml 96- bis 100-prozentiges Ethanol in den Waschpuffer
(WASH) pipettieren. Durch 5- bis 10-maliges Umschwenken mischen. Diese Menge an
rekonstituiertem Waschpuffer ist ausreichend für 48 Tests.
3.
Den Elutionspuffer (ELB) bei 70 °C (± 2 °C) in einem 2,0-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit
Schraubverschluss vorwärmen. Hierbei können mehrere Röhrchen verwendet werden. Das
Volumen an Elutionspuffer beträgt pro Probe 75 μl. Das in der folgenden Tabelle angegebene
Volumen entsprechend der Anzahl an Tests vorwärmen.
Anzahl der Exemplare
4.
Reagenz
12
24
Elutionspuffer (ml)
2,0
4,0
Das in der folgenden Tabelle angegebene Isopropanolvolumen entsprechend der Anzahl an Tests in
ein sauberes, steriles Röhrchen pipettieren.
Reagenz
12
24
Isopropanol (ml)
5,0
10,0
5.
500 μl des Elutionspuffers (ELB) in die Träger-RNA (CAR) pipettieren. Das Röhrchen verschließen,
umschwenken und anschließend im Vortexer mischen, bis die gesamte Träger-RNA gelöst ist.
Diese Menge an rekonstituierter Träger-RNA ist ausreichend für 24 Tests. Nicht verbrauchte
rekonstituierte Träger-RNA kann bei -15 bis -25 °C bis zu 30 Tage lang bzw. maximal bis zum
Verfallsdatum gelagert werden.
6.
5,0 ml des Elutionspuffers (ELB) in die Proteinase K (PK) pipettieren. Das Röhrchen verschließen,
umschwenken und anschließend im Vortexer mischen, bis die gesamte Proteinase K gelöst ist.
Diese Menge an rekonstituierter Proteinase K ist ausreichend für 24 Tests. Nicht verbrauchte
rekonstituierte Proteinase K kann bei -15 bis -25 °C bis zu 30 Tage lang bzw. maximal bis zum
Verfallsdatum gelagert werden.
7.
Zur Zubereitung der Lyse-/Bindungs-Gebrauchslösung die in der folgenden Tabelle angegebenen
Volumina entsprechend der Anzahl der zu verarbeitenden Proben und Kontrollen in ein Röhrchen
pipettieren.
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Doc Rev. 6.0
Reagenzien
12
24
Lyse-/Bindungspuffer (ml)
7,0
14,0
Träger-RNA (μl)
140
280
HIV-1 QS, v2.0 (μl)
84
168
Proteinase K (ml)
1,4
2,8
Hinweis: Das Volumen an HIV-1 QS, v2.0 ist für den COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur
Verwendung mit dem High Pure System spezifisch.
Hinweis: Wenn gefrorene rekonstituierte Träger-RNA oder Proteinase K verwendet werden soll,
diese bei Raumtemperatur auftauen lassen und vor dem Gebrauch mehrmals
umschwenken.
B.
•
Die angegebene Menge Lyse-/Bindungspuffer in ein sauberes, steriles 50-ml-Röhrchen geben.
•
Die angegebene Menge rekonstituierte Träger-RNA in das Röhrchen mit Lyse-/Bindungspuffer geben.
•
HIV-1 QS, v2.0 3 bis 5 Sekunden lang im Vortexer mischen und die angegebene Menge
HIV-1 QS, v2.0 in das Röhrchen mit Lyse-/Bindungspuffer und rekonstituierter Träger-RNA
geben.
•
Das Röhrchen verschließen und durch 10- bis 15-maliges Umschwenken mischen. NICHT im
Vortexer mischen – dadurch würden Luftblasen in der Lösung entstehen.
•
Die angegebene Menge rekonstituierte Proteinase K in das Röhrchen mit Lyse-/Bindungspuffer geben.
•
Das Röhrchen verschließen und durch 10- bis 15-maliges Umschwenken mischen. NICHT im
Vortexer mischen – dadurch würden Luftblasen in der Lösung entstehen. Die Lyse-/BindungsGebrauchslösung sofort nach der Zugabe der Proteinase K und dem Mischen von
Proteinase K und Lyse-/Bindungspuffer abfüllen.
•
Nicht verbrauchter Lyse-/Bindungspuffer (LYS) kann bei 15 bis 25 °C bis zu 30 Tage lang bzw.
maximal bis zum Verfallsdatum gelagert werden. Nicht verbrauchte Lyse-/BindungsGebrauchslösung entsorgen.
Aufarbeitung der Proben und Kontrollen
Hinweis: Für diesen Vorgang werden verstellbare Pipetten mit Aerosol-undurchlässigen Spitzen
empfohlen.
Hinweis: Für die Schritte 1, 14, 16, 19 und 22 kann eine Repetierpipette mit sterilen Kombispitzen in
passenden Größen verwendet werden. Dabei muss allerdings zur Vermeidung von
Reagenzspritzern und Kreuzkontaminationen sehr vorsichtig gearbeitet werden.
Hinweis: Während des gesamten Vorgangs vermeiden, dass Lyse-/Bindungs-Gebrauchslösung,
Proben- bzw. Kontrollmaterial oder Isopropanol auf den Rand der Kavität und somit
beim Verschließen zwischen Kavität und Deckel gelangt.
Hinweis: Gut sitzende Handschuhe in geeigneter Größe tragen. Handschuhe regelmäßig
wechseln, vor allem nach dem Umgang mit positiven Kontrollen und nach dem Öffnen
voller Röhrchen aus dem Lyse-Rack. Auf keinen Fall die Unterseite der Deckel
berühren, auch nicht beim Öffnen oder Schließen.
Hinweis: Beim Umgang mit Kontrollen aus dem Kit und klinischen Proben die Negativkontrolle
stets vor den Positivkontrollen aus dem Kit laden.
1.
625 μl Lyse-/Bindungs-Gebrauchslösung in jede Kavität des Lyse-Racks (I, durchsichtig)
pipettieren. Dabei darauf achten, dass keine Flüssigkeit auf den Rand der Kavität und somit beim
Verschließen zwischen Kavität und Deckel gelangt. Die Deckel vorsichtig in die Abdeckposition
herunterklappen. Den Schnappmechanismus nicht einrasten lassen.
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2.
Die Kavitäten einzeln öffnen und 500 μl der Probe oder Kontrolle vorsichtig in die entsprechende
Kavität pipettieren. Dabei darauf achten, dass keine Flüssigkeit auf den Rand der Kavität und somit
beim Verschließen zwischen Kavität und Deckel gelangt. Nach Zugabe jeder Probe oder Kontrolle
den Deckel vorsichtig am Gelenk beginnend herunterdrücken. Dann leichten Druck auf die Mitte
des Deckels ausüben, bis der Schnappmechanismus einrastet und die Kavität fest verschlossen ist.
3.
Nach Zugabe aller Proben und Kontrollen das gefüllte Lyse-Rack ca. 10 Sekunden lang im
Vortexer mischen. Nicht zu kräftig mischen. Überprüfen, ob alle Kavitäten gründlich gemischt
werden.
4.
Das Lyse-Rack vorsichtig in ein auf 50 °C (± 2 °C) vorgewärmtes Wasserbad stellen. Dabei darauf
achten, dass keine Flüssigkeit verspritzt wird. Das Lyse-Rack 10 Minuten lang inkubieren. Während
der Inkubation sollte das Lyse-Rack zwar im Wasser stehen, es darf aber nicht schwimmen.
Sicherstellen, dass der Bereich auf der Oberseite des Lyse-Racks zwischen den Kavitäten während
der Inkubation trocken bleibt. Ober- und Unterseite des Lyse-Racks nach der Entnahme aus dem
Wasserbad vorsichtig abtrocknen.
5.
Das Lyse-Rack 10-20 Sekunden in der Mikrotiterplattenzentrifuge bei einer Drehzahl von 4600 x g
zentrifugieren. Die Zentrifuge erreicht die eingestellte Drehzahl evtl. nicht. Die Füllstände der
Kavitäten überprüfen, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit ausgelaufen ist. Ist Flüssigkeit
ausgelaufen, den Vorgang hier abbrechen.
6.
Die Kavitäten nacheinander öffnen. Dazu leichten Druck auf das Verschlussteil ausüben, um den
Schnappmechanismus zu lösen und den Deckel der Kavität zu öffnen. Dann 350 μl Isopropanol in
jede Kavität pipettieren. Nach jeder Zugabe den Deckel vorsichtig am Gelenk beginnend
herunterdrücken. Dann leichten Druck auf die Mitte des Deckels ausüben, bis der
Schnappmechanismus einrastet und die Kavität fest verschlossen ist.
Hinweis: Das Isopropanolvolumen ist für jeden COBAS® TaqMan®-Test spezifisch.
7.
Überprüfen, ob alle Kavitäten fest verschlossen sind. Die Proben durch dreimaliges Umschwenken
des Racks mischen und das Rack anschließend etwa 10 Sekunden lang im Vortexer mischen. Nicht
zu kräftig mischen. Überprüfen, ob alle Kavitäten gründlich gemischt werden.
8.
Das Lyse-Rack 10-20 Sekunden in der Mikrotiterplattenzentrifuge bei einer Drehzahl von 4600 x g
zentrifugieren. Die Zentrifuge erreicht die eingestellte Drehzahl evtl. nicht. Die Füllstände der
Kavitäten überprüfen, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit ausgelaufen ist. Ist Flüssigkeit
ausgelaufen, den Vorgang hier abbrechen.
9.
Schnappmechanismus zu lösen und den Deckel der Kavität zu öffnen. Dann 750 μl des Probenoder Kontrollgemischs in die entsprechenden Kavitäten im Filterröhrchen-Rack (II, gelb) mit daran
befestigtem Abfall-Rack (weiß) überführen. Nach Zugabe jedes Proben- oder Kontrollgemischs den
Deckel vorsichtig am Gelenk beginnend herunterdrücken. Dann leichten Druck auf die Mitte des
Deckels ausüben, bis der Schnappmechanismus einrastet und die Kavität fest verschlossen ist.
10.
Nach Zugabe aller Proben und Kontrollen das zusammengesetzte Filterröhrchen-Rack 2 Minuten
lang bei 4600 x g in der Mikrotiterplattenzentrifuge zentrifugieren. Die Füllstände der Kavitäten
überprüfen, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit ausgelaufen ist. Ist Flüssigkeit ausgelaufen,
den Vorgang hier abbrechen.
11.
Schnappmechanismus zu lösen und den Deckel der Kavität zu öffnen. Dann das restliche Probenoder Kontrollgemisch in die entsprechenden Kavitäten im Filterröhrchen-Rack überführen. Nach
Zugabe jedes Proben- oder Kontrollgemischs den Deckel vorsichtig am Gelenk beginnend
herunterdrücken. Dann leichten Druck auf die Mitte des Deckels ausüben, bis der Schnappmechanismus einrastet und die Kavität fest verschlossen ist. Das Lyse-Rack sachgemäß entsorgen.
12.
Das zusammengesetzte Filterröhrchen-Rack 2 Minuten lang bei 4600 x g in der Mikrotiterplattenzentrifuge zentrifugieren. Die Füllstände der Kavitäten überprüfen, um sicherzustellen, dass keine
Flüssigkeit ausgelaufen ist. Ist Flüssigkeit ausgelaufen, den Vorgang hier abbrechen.
13.
Das Filterröhrchen-Rack durch Drücken der beiden Schnappverschlüsse an der Oberseite des
Racks vom Abfall-Rack lösen. Das Abfall-Rack entsorgen. Das Filterröhrchen-Rack auf ein neues
Abfall-Rack aufsetzen.
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14.
Alle Deckel des Filterröhrchen-Racks öffnen und 400 μl Inhibitor Removal-Puffer (IRB) seitlich in
die Kavitäten pipettieren. Die Wände der Kavitäten dabei nicht berühren. Nach Zugabe des
Inhibitor Removal-Puffers in alle Kavitäten die Deckel vorsichtig am Gelenk beginnend herunterdrücken. Dann leichten Druck auf die Mitte der Deckel ausüben, bis die Schnappverschlüsse
einrasten und die Kavitäten fest verschlossen sind.
15.
16.
Alle Deckel des Filterröhrchen-Racks öffnen und 700 μl Waschpuffer (WASH) seitlich in die
Kavitäten pipettieren. Die Wände der Kavitäten dabei nicht berühren. Nach Zugabe des
Waschpuffers in alle Kavitäten die Deckel vorsichtig am Gelenk beginnend herunterdrücken. Dann
leichten Druck auf die Mitte der Deckel ausüben, bis die Schnappverschlüsse einrasten und die
Kavitäten fest verschlossen sind.
17.
18.
Racks vom Abfall-Rack lösen. Das Abfall-Rack entsorgen. Das Filterröhrchen-Rack auf ein neues
Abfall-Rack aufsetzen.
19.
Alle Deckel des Filterröhrchen-Racks öffnen und 700 μl Waschpuffer (WASH) seitlich in die
Kavitäten pipettieren. Die Wände der Kavitäten dabei nicht berühren. Nach Zugabe des
Waschpuffers in alle Kavitäten die Deckel vorsichtig am Gelenk beginnend herunterdrücken. Dann
leichten Druck auf die Mitte der Deckel ausüben, bis die Schnappverschlüsse einrasten und die
Kavitäten fest verschlossen sind.
20.
21.
Racks vom Abfall-Rack lösen. Das Filterröhrchen-Rack auf das Elutions-Rack (IIIA, blau) aufsetzen
und einrasten lassen. Das Abfall-Rack sachgemäß entsorgen.
22.
Alle Deckel des Filterröhrchen-Racks öffnen und 75 μl des vorgewärmten Elutionspuffers (ELB) in
die Mitte jedes Filters pipettieren, ohne den Filter dabei zu berühren.
Hinweis: Elutionspuffer darf nicht seitlich in die Kavitäten pipettiert werden.
Nach Zugabe des Elutionspuffers in alle Kavitäten die Deckel vorsichtig am Gelenk beginnend
herunterdrücken. Dann leichten Druck auf die Mitte der Deckel ausüben, bis die Schnappverschlüsse einrasten und die Kavitäten fest verschlossen sind.
23.
Anschließend das Elutions-Rack mindestens 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
24.
25.
Racks vom Elutions-Rack lösen. Das Filterröhrchen-Rack sachgemäß entsorgen.
26.
Das Verschluss-Rack (IIIB, blau) auf das Elutions-Rack (IIIA, blau) aufsetzen. Fest nach unten
drücken, bis die Schnappverschlüsse im Elutions-Rack einrasten. Jeden Deckel am Gelenk
beginnend vorsichtig herunterdrücken. Dann leichten Druck auf die Mitte der Deckel ausüben, bis
die Schnappverschlüsse einrasten und alle Kavitäten fest verschlossen sind.
27.
Die aufgearbeiteten Proben und Kontrollen werden direkt für die PCR verwendet. 50 μl der
aufgearbeiteten Proben und Kontrollen für die Amplifikation verwenden. Die aufgearbeiteten
Proben und Kontrollen innerhalb von 2 Stunden nach Abschluss der Vorbereitung zum GebrauchsMaster-Mix hinzugeben. Die aufgearbeiteten Proben und Kontrollen innerhalb von 1 Stunde nach
der Zugabe zum Gebrauchs-Master-Mix und innerhalb von 3 Stunden nach Abschluss der
Probenaufarbeitung amplifizieren.
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Doc Rev. 6.0
Hinweis: Aufgearbeitete HIV-1-Proben können vor der Zugabe zum Gebrauchs-Master-Mix bis
zu 2 Stunden bei 4-30 °C aufbewahrt werden und dem Gebrauchs-Master-Mix bis zu
1 Stunde vor der Amplifikation zugegeben werden.
Reverse Transkription, Amplifikation und Detektion
Hinweis: K-Carrier und K-Carrier-Halter müssen mit einem fusselfreien Tuch abgewischt werden,
das mit einer 70-prozentigen Isopropanol-Lösung angefeuchtet wurde.
C.
Vorbereitung der Reagenzien
Hinweis: COBAS® TaqMan® HIV-1-Master-Mix, v2.0 (HIV-1 MMX, v2.0), „Gebrauchs-MasterMix“ (Gebrauchs-MMX) und Gebrauchs-Master-Mix mit aufgearbeiteten Proben und
Kontrollen sind lichtempfindlich. Diese Reagenzien vor Licht schützen.
Hinweis: COBAS® TaqMan® HIV-1-Master-Mix, v2.0 (HIV-1 MMX, v2.0) und COBAS® TaqMan®
Manganlösung (CTM Mn2+) müssen vor der Zubereitung des Gebrauchs-Master-Mix
mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibriert werden.
Hinweis: Den Gebrauchs-MMX erst zubereiten, wenn die Aufarbeitung der Proben und
Kontrollen abgeschlossen ist.
Hinweis: Aufgearbeitete Proben sind vor der Zugabe zum Gebrauchs-MMX bis zu 2 Stunden stabil.
Hinweis: Der Gebrauchs-MMX muss innerhalb von 2 Stunden nach der Zubereitung verwendet
werden.
Hinweis: Nach der Zugabe der aufgearbeiteten Proben und Kontrollen zum Gebrauchs-MMX
muss innerhalb von 1 Stunde mit der Amplifikation begonnen werden.
1.
Ein Fläschchen HIV-1 MMX, v2.0 und ein Fläschchen CTM Mn2+ mindestens 30 Minuten lang bei
Raumtemperatur äquilibrieren.
2.
Einen K-Carrier oder K-Tray-Carrier in einen K-Carrier-Halter setzen.
3.
Neue K-Tubes oder ein neues K-Tray in den K-Carrier oder K-Tray-Carrier setzen, ohne dabei die
Wände der Röhrchen zu berühren.
Hinweis: Werden in einem Lauf weniger als 24 Röhrchen analysiert, müssen die Positionen 1, 2,
5, 20, 23 und 24 belegt sein, um den K-Carrier im Thermozykler auszubalancieren. Bei
Verwendung von K-Trays muss der Thermozykler nicht ausbalanciert werden.
4.
Die Verschlüsse der K-Tubes mit dem K-Tube-Capper entfernen.
5.
Den Gebrauchs-MMX wie folgt herstellen:
Für 24 Tests 170 μl CTM Mn2+ in ein Fläschchen HIV-1 MMX, v2.0 geben. Das Fläschchen
verschließen und durch 10-maliges Umschwenken gründlich mischen. Den Gebrauchs-MMX nicht
im Vortexer mischen. Den Gebrauchs-Master-Mix vor Licht schützen und innerhalb von 2 Stunden
nach der Vorbereitung verwenden.
Für 12 Tests 660 μl HIV-1 MMX, v2.0 in ein 2-ml-Röhrchen geben. 80 μl CTM Mn2+ in das 2-mlRöhrchen mit HIV-1 MMX, v2.0 geben, das Röhrchen verschließen und durch 10-maliges
Umschwenken gründlich mischen. Den Gebrauchs-MMX vor Licht schützen und innerhalb von
2 Stunden verwenden. Nicht verbrauchten HIV-1 MMX, v2.0 und CTM Mn2+ in den Originalfläschchen bei 2-8 °C lagern. Nach dem Öffnen sind HIV-1 MMX, v2.0 und CTM Mn2+ bei 2-8 °C
30 Tage lang bzw. maximal bis zum Verfallsdatum stabil.
Hinweis: Die Menge an CTM Mn2+ ist für den COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur
Verwendung mit dem High Pure System spezifisch.
6.
50 μl Gebrauchs-MMX in jedes K-Tube oder in jede Kavität des K-Trays pipettieren.
7.
Mit einer Mikropipette mit Aerosolfilter- oder Kolbenhub-Pipettenspitze 50 μl jeder aufgearbeiteten
Probe bzw. Kontrolle in das entsprechende K-Tube bzw. in die Kavität des K-Trays mit GebrauchsMMX pipettieren. Jede Probe bzw. Kontrolle vorsichtig durch dreimaliges Auf- und Abpipettieren
mischen, ohne Blasen zu erzeugen.
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Doc Rev. 6.0
8.
Schritt 7 für alle aufgearbeiteten Proben und Kontrollen wiederholen, bis alle in K-Tubes überführt
worden sind. Dabei für jede Probe bzw. Kontrolle eine neue Spitze verwenden. Mittels Sichtprüfung
auf Blasen prüfen und diese ggf. entfernen. Die K-Tubes oder K-Trays mit einem K-Tube-Capper
oder K-Tray-Capper verschließen. Mittels Sichtprüfung sicherstellen, dass die korrekten Volumina
zugegeben wurden.
9.
Mit der Amplifikation muss innerhalb von 1 Stunde ab dem Zeitpunkt begonnen werden, an dem
die aufgearbeiteten Proben und Kontrollen zu den K-Tubes oder K-Trays mit Gebrauchs-MMX
gegeben wurden.
D.
Laden und Bedienung des COBAS® TaqMan® 48 Analyzer
1.
Den Workstation-Computer einschalten und mit der entsprechenden Benutzer-ID und dem
zugehörigen Kennwort unter beim Betriebssystem Microsoft Windows anmelden.
2.
Den COBAS® TaqMan® 48 Analyzer einschalten. Sicherstellen, dass das Gerät initialisiert wird und
betriebsbereit ist. Wenn sich noch K-Carrier oder K-Tray-Carrier aus vorhergehenden Läufen in
einem der Thermozykler befinden, diese mit Hilfe des K-Carrier-Transporters entfernen.
3.
Die AMPLILINK Software auf dem Computer starten. Mit der entsprechenden Benutzer-ID und dem
zugehörigen Kennwort anmelden.
4.
Um K-Carrier- oder K-Tray-Anforderungen für die zu analysierenden Proben zu erstellen, auf das
Symbol Orders klicken. Die Registerkarte Sample auswählen, auf die Schaltfläche New klicken
und die Anforderungsnummer für die einzelnen Proben über das Tastenfeld eingeben oder mit dem
Barcodescanner einlesen. Die entsprechende Testdefinitionsdatei für den COBAS® TaqMan®
HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System auswählen, um die Ergebnisse in
Kopien/ml (cp/mL) oder Internationalen Einheiten/ml (IU/mL) anzuzeigen. Namen und Versionsnummern der Testdefinitionsdateien finden Sie auf der dem Kit beiliegenden Produktinformationskarte. Für alle Proben wiederholen. Auf die Schaltfläche Save klicken.
5.
Auf der Registerkarte Quality Control im Fenster Orders die Daten zur Qualitätskontrolle
eingeben. Auf die Schaltfläche New klicken und über das Tastenfeld oder den Barcodescanner die
Daten von der im Kit mitgelieferten Controls Value Card für den COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0
zur Verwendung mit dem High Pure System eingeben. Die Chargennummer, das Verfallsdatum, die
Bereiche für die schwach positive und die hoch positive Kontrolle sowie die chargenspezifischen
Kalibrationskoeffizienten des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0 zur Verwendung mit dem High
Pure System in die vorgesehenen Felder eingeben. Auf OK klicken.
6.
Auf der Registerkarte K-Carrier im Fenster Orders dem Lauf eine K-Carrier- oder K-Tray-Nummer
zuweisen. Im Fenster K-Carrier auf New klicken. In der Zelle rechts neben K-Carrier ID über das
Tastenfeld die K-Carrier- oder K-Tray-Nummer eingeben oder mit dem Barcodescanner den Barcode
auf dem K-Carrier oder K-Tray einlesen. Die entsprechende Testdefinitionsdatei für den COBAS®
TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System im Testbereich in der unteren
Fensterhälfte auswählen, um die Ergebnisse in Kopien/ml (cp/mL) oder Internationalen Einheiten/ml
(IU/ml) anzuzeigen. Namen und Versionsnummern der Testdefinitionsdateien finden Sie auf der dem
Kit beiliegenden Produktinformationskarte.
Hinweis: Bei Verwendung eines K-Carriers, der in einem vorhergehenden Lauf verwendet wurde,
müssen die Ergebnisse zunächst akzeptiert werden, bevor die gleiche K-CarrierNummer einem anderen Lauf zugewiesen werden kann.
7.
Unter Worklist die erste Zeile der Spalte Type (T) auswählen. Dieses Feld markieren, um das
Listenfeld zu öffnen und dort die gewünschte Art von Kontrolle auszuwählen. Nun auf das Feld mit
der Proben-ID für dieselbe Reihe doppelklicken. Das Fenster LookUp Control wird eingeblendet.
Es zeigt alle verfügbaren Kontrollen an. Nach Auswahl der Kontrolle werden die zugehörigen
Kalibrations- und Kontrollwerte im Informationsbereich unten rechts angezeigt. Diesen Vorgang für
alle benötigten Kontrollen wiederholen.
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8.
Um Proben zur Worklist hinzuzufügen, auf die erste Position (Reihe) für den Probeneintrag
doppelklicken. Hierdurch wird das Fenster Lookup Sample mit den zugewiesenen Probenanforderungen aufgerufen. Mit Umschalttaste + Pfeiltaste können mehrere Anforderungsnummern gleichzeitig markiert werden. Sicherstellen, dass allen Anforderungen die entsprechende
Testdefinitionsdatei für den COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure
System zugewiesen wurde, um die Ergebnisse in Kopien/ml (cp/mL) oder Internationalen
Einheiten/ml (IU/mL) anzuzeigen. Namen und Versionsnummern der Testdefinitionsdateien finden
Sie auf der dem Kit beiliegenden Produktinformationskarte.
9.
Auf Save klicken, um die K-Carrier-Anforderungszuweisung zu speichern.
Hinweis: Werden in einem Lauf weniger als 24 Röhrchen analysiert, müssen die Positionen 1, 2,
5, 20, 23 und 24 belegt sein, um den K-Carrier im Thermozykler auszubalancieren. Bei
Verwendung von K-Trays muss der Thermozykler nicht ausbalanciert werden.
E.
Reverse Transkription, Amplifikation und Detektion
1.
Auf der Registerkarte System auf das Symbol Systems klicken. Anschließend auf Open klicken,
um den Thermozykler zu öffnen. Wenn die Abdeckung des Thermozyklers vollständig geöffnet
wurde und im Fenster Systems die Meldung Ready to Load angezeigt wird, den Deckel über dem
Thermozykler anheben und in der geöffneten Stellung halten. Mit Hilfe des K-Carrier-Transporters
den beladenen K-Carrier oder K-Tray-Carrier mit den verschlossenen K-Tubes oder dem K-Tray mit
Gebrauchs-Master-Mix und Proben bzw. Kontrollen in den Thermozykler laden. Den Deckel des
Thermozyklers schließen.
2.
Im Fenster Systems unter dem Thermozykler-Symbol auf Start klicken, um die Abdeckung des
Thermozyklers zu schließen und den Lauf zu starten.
3.
Reverse Transkription, Amplifikation und Detektion werden vom COBAS® TaqMan® 48 Analyzer
automatisch ausgeführt.
ERGEBNISSE
Berechnung der Ergebnisse
Der COBAS® TaqMan® 48 Analyzer ermittelt automatisch den HIV-1-RNA-Titer jeder Probe und Kontrolle.
Der HIV-1-RNA-Titer wird je nach verwendeter Testdefinitionsdatei (TDF) in Kopien/ml oder in
Internationalen Einheiten/ml angegeben. Der Konversionsfaktor zwischen HIV-1-RNA Kopien/ml und
HIV-1 internationale Einheiten (IE)/ml beträgt unter Verwendung des ersten internationalen WHOStandards für HIV-1-RNA für NAT-Tests (Methoden auf Nukleinsäurebasis) (NIBSC 97/656)
0,6 Kopien/IE1, 2. Dieser Konversionsfaktor wurde mit Hilfe des COBAS® AMPLICOR® HIV-1-MONITORTests, v1.5, des COBAS® AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HIV-1-MONITOR-Tests, v1.5 und des COBAS®
TaqMan® HIV-1-Tests zur Verwendung mit dem High Pure System ermittelt.
AMPLILINK Software
•
Bestimmt den Zyklusschwellenwert (Ct) für die HIV-1-RNA und die HIV-1-Quantifizierungsstandard-RNA.
•
Bestimmt den HIV-1-RNA-Titer anhand des Ct-Wertes für die HIV-1-RNA und HIV-1Quantifizierungsstandard-RNA und der chargenspezifischen Kalibrationskoeffizienten.
•
Bestimmt, ob der berechnete Titer in Kopien/ml für HIV-1 L(+)C, v2.0 und HIV-1 H(+)C,
v2.0 innerhalb der Sollbereiche liegt.
Validierung eines Laufs
Das AMPLILINK-Ergebnisfenster oder der Ergebnisausdruck sind auf Alarmhinweise und Anmerkungen zu
überprüfen, um sicherzustellen, dass der jeweilige Lauf gültig ist. Der Lauf ist gültig, wenn für die COBAS®
TaqMan® HIV-1-Kontrollen, v2.0 keine Alarmhinweise ausgegeben werden. Der Lauf ist ungültig, wenn für die
COBAS® TaqMan® HIV-1-Kontrollen, v2.0 einer der folgenden Alarmhinweise angezeigt wird:
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Negativkontrolle
Alarmhinweis
NC_INVALID
Ergebnis
Invalid
Interpretation
Ungültiges Ergebnis oder anderes gültiges Ergebnis
als „Target Not Detected“
Schwach positive HIV-1-Kontrolle, v2.0
Alarmhinweis
LPCINVALID
Ergebnis
Invalid
Interpretation
Ungültiges Ergebnis oder Kontrolle außerhalb des
Sollbereichs
Hoch positive HIV-1-Kontrolle, v2.0
Alarmhinweis
HPCINVALID
Ergebnis
Invalid
Interpretation
Ungültiges Ergebnis oder Kontrolle außerhalb des
Sollbereichs
Falls der Lauf ungültig ist, das gesamte Testverfahren (Aufarbeitung der Proben und Kontrollen, reverse
Transkription, Amplifikation und Detektion) wiederholen.
Interpretation der Ergebnisse
Bei einem gültigen Lauf ist auf dem Ergebnisausdruck für jede einzelne Probe zu prüfen, ob Alarmhinweise
oder Anmerkungen vorliegen. Die Ergebnisse sind wie folgt zu interpretieren:
•
Ein gültiger Lauf kann sowohl gültige als auch ungültige Probenergebnisse umfassen, je nachdem,
ob für die einzelnen Proben Alarmhinweise und/oder Anmerkungen angezeigt werden.
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Doc Rev. 6.0
Die Probenergebnisse sind wie folgt zu interpretieren:
Titerwert
Internationale Einheiten/ml
Kopien/ml
Target Not Detected
Interpretation
Ergebnisse als „HIV-1-RNA nicht nachgewiesen“ angeben.
< 3.40E+01 C/mL
Die berechneten Kopien/ml-Werte liegen unter der Quantifizierungsgrenze des Tests. Ergebnisse als „HIV-1-RNA nachgewiesen, weniger
als 34 HIV-1 RNA Kopien/ml“ angeben.
≥ 3.4E+01 C/mL und
≤ 1.00E+07 C/mL
Berechnete Ergebnisse, die größer oder gleich 34 Kopien/ml
und kleiner oder gleich 1,00E+07 Kopien/ml sind, liegen
innerhalb des linearen Bereichs des Tests.
> 1.00E+07 C/mL
Die berechneten Kopien/ml-Werte liegen oberhalb des Testbereichs.
Ergebnisse als „größer als 1,00E+07 HIV-1-RNA Kopien/ml“ angeben.
Wenn quantitative Ergebnisse gewünscht werden, die ursprüngliche
Plasmaprobe mit HIV-1-negativem Human-EDTA-Plasma im
Verhältnis 1:100 verdünnen und den Test wiederholen. Das dabei
ermittelte Ergebnis mit dem Verdünnungsfaktor multiplizieren.
< 5,68E+01 IU/mL
Die berechneten IE/ml liegen unter der Quantifizierungsgrenze des
Tests. Ergebnisse als „HIV-1-RNA nachgewiesen, weniger als
56,8 HIV-1-RNA IE/ml“ angeben.
≥ 5,68E+01 IU/mL und
≤ 1,67E+07 IU/mL
Errechnete Ergebnisse, die größer oder gleich 56,8 IE/ml und
kleiner oder gleich 1,67E+07 IE/ml sind, liegen innerhalb des
linearen Bereichs des Tests.
> 1,67E+07 IU/mL
Errechnete IE/ml-Werte liegen oberhalb des Testbereichs. Ergebnisse
als „größer als 1,67E+07 HIV-1-RNA IE/ml“ angeben. Wenn
quantitative Ergebnisse gewünscht werden, die ursprüngliche
Plasmaprobe mit HIV-1-negativem Human-EDTA-Plasma im
Verhältnis 1:100 verdünnen und den Test wiederholen. Das dabei
Hinweis: Proben oberhalb des Testbereichs, die ein ungültiges Ergebnis mit dem Alarmhinweis
„QS_INVALID“ liefern, sollten nicht als > 1,00E+07 K/ml oder 1,67E+07 IE/ml
angegeben werden. Die ursprüngliche Plasmaprobe im Verhältnis 1:100 mit HIV-1negativem Human-EDTA-Plasma verdünnen und den Test wiederholen. Das dabei
Hinweis: Titerwerte „Invalid“ – Interpretation: ungültiges Ergebnis.
QUALITÄTSKONTROLLE
In jedem Lauf mit bis zu 24 Proben und Kontrollen ist je ein Exemplar der COBAS® TaqMan® Negativkontrolle,
der schwach positiven COBAS® TaqMan® HIV-1-Kontrolle, v2.0 und der hoch positiven COBAS® TaqMan®
HIV-1-Kontrolle, v2.0 mitzuführen. Wie bei jedem neuen Laborverfahren sollten neue Bediener bei jedem Test
die Mitführung zusätzlicher interner Kontrollen so lange in Betracht ziehen, bis sie eine große Sicherheit in der
korrekten Durchführung des Tests erreicht haben. Die Kontrollen können an jeder beliebigen Position im
K-Carrier oder K-Tray mitgeführt werden. Der Ergebnisausdruck des Laufs ist auf Alarmhinweise und
Meldungen zu überprüfen, um sicherzustellen, dass der jeweilige Lauf gültig ist.
Negativkontrolle
Für CTM (–) C muss das Ergebnis Target Not Detected lauten, d. h. der Ct-Wert für HIV-1-RNA lag
über dem Grenzwert des Tests oder es wurde kein Ct-Wert für HIV-1-RNA ermittelt, während zugleich ein
gültiger Ct-Wert für die HIV-1-Quantifizierungsstandard-RNA ermittelt wurde. Wenn dieses Kriterium für
CTM (–) C nicht erfüllt ist, ist der gesamte Lauf ungültig. In diesem Fall ist das gesamte Testverfahren
(Aufarbeitung der Proben und Kontrollen, Amplifikation und Detektion) zu wiederholen. Falls CTM (–) C
durchgehend ungültig ist, wenden Sie sich bitte an den technischen Kundendienst der zuständigen
Roche-Vertretung.
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Doc Rev. 6.0
Positivkontrollen
Die Sollbereiche für HIV-1 L(+)C, v2.0 und HIV-1 H(+)C, v2.0 sind auf der im Kit mitgelieferten Controls
Value Card für den COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System
angegeben. Diese Bereiche werden in die Control Unit für die AMPLILINK Software eingegeben.
Die HIV-1-RNA-Werte in Kopien/ml für HIV-1 L(+)C, v2.0 und HIV-1 H(+)C, v2.0 müssen innerhalb des
Bereichs liegen, der auf der im Kit mitgelieferten Controls Value Card für den COBAS® TaqMan® HIV-1-Test,
v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System angegeben ist. Sobald mindestens eine Positivkontrolle
dieses Kriterium nicht erfüllt, ist der gesamte Lauf ungültig. In diesem Fall ist das gesamte Testverfahren
(Aufarbeitung der Proben und Kontrollen, Amplifikation und Detektion) zu wiederholen. Wenn der
berechnete HIV-1-RNA-Titer von mindestens einer Positivkontrolle durchgehend außerhalb des
Sollbereichs liegt, wenden Sie sich bitte an den technischen Kundendienst der zuständigen RocheVertretung.
VORSICHTSMASSNAHMEN
1.
Wie bei allen Testverfahren sind korrekte Labortechniken unerlässliche Voraussetzung für die
ordnungsgemäße Durchführung dieses Tests. Aufgrund der hohen analytischen Sensitivität dieses
Tests ist äußerste Vorsicht geboten, um die Reinheit der Testreagenzien und Amplifikationsansätze
zu erhalten und Kreuzkontaminationen der Proben zu vermeiden. Alle Reagenzien sind strikt auf
Reinheit zu überwachen. Verdächtige Reagenzien sind zu entsorgen. Gut sitzende Handschuhe in
geeigneter Größe tragen. Handschuhe regelmäßig wechseln, vor allem nach dem Umgang mit
positiven Kontrollen und nach dem Öffnen voller Röhrchen aus dem Lyse-Rack. Auf keinen Fall die
Unterseite der Deckel berühren, auch nicht beim Öffnen oder Schließen.
GRENZEN DES VERFAHRENS
1.
Dieser Test wurde nur für die Analyse von Humanplasma validiert, das mit EDTA als Antikoagulans
entnommen wurde. Wenn andere Arten von Proben getestet werden, können falsche Ergebnisse
erzielt werden.
2.
Die in BD Vacutainer® PPT™-Plasmavorbereitungsröhrchen entnommenen Vollblutproben dürfen
vor dem Zentrifugieren bei 2-25 °C maximal 24 Stunden und nur aufrecht gelagert werden. Nach
dem Zentrifugieren muss das Plasma in ein steriles Polypropylenröhrchen gegeben werden. BD
PPT™-Röhrchen nicht einfrieren. Schütteln oder eine andere, von den Anweisungen abweichende
Bearbeitung der BD PPT™-Röhrchen kann zu abweichenden Ergebnissen der HIV-1-Viruslast
führen.
3.
Die Leistung des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System
wurde nicht für Proben mit HIV-1 Gruppe N evaluiert.
4.
Zuverlässige Ergebnisse sind nur bei Anwendung sachgemäßer Verfahren für Entnahme, Transport,
Lagerung und Bearbeitung der Proben gewährleistet.
5.
Die Kontaminationsgefahr durch Amplifikate wird durch den Zusatz des Enzyms AmpErase zum
Master-Mix des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0 verringert. Eine Kontamination durch HIV-1positive Kontrollen und klinische Proben lässt sich jedoch nur durch Gute Laborpraxis (GLP) und
sorgfältige Einhaltung der in dieser Packungsbeilage beschriebenen Vorgehensweisen vermeiden.
6.
Dieses Produkt darf nur von in der PCR-Technik geschultem Personal verwendet werden.
7.
Dieses Produkt darf nur zusammen mit dem COBAS® TaqMan® 48 Analyzer verwendet werden.
8.
Mutationen in den hochkonservierten Regionen des viralen Genoms, die durch die Primer bzw.
Sonden des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System
abgedeckt sind, treten zwar selten auf, können jedoch zu fälschlicherweise niedrigen Werten bei
der quantitativen Bestimmung oder zur Nichterkennung des Virus führen.
9.
Die Detektion von HIV-1-RNA hängt von der Anzahl der in der Probe enthaltenen Virenpartikel ab
und kann durch das Probenentnahmeverfahren sowie durch patientenbezogene Faktoren (Alter,
Vorhandensein von Symptomen und/oder Infektionsstadium) beeinflusst werden.
10.
Bevor Benutzer zwischen verschiedenen Verfahren wechseln, sollten sie aufgrund der inhärenten
Unterschiede zwischen den Verfahren in ihrem Labor Studien zur Korrelation der Methoden
durchführen, um die Unterschiede der Verfahren zu ermitteln.
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11.
Einige Isolate der HIV-1-Gruppe O können um bis zu 2 log zu gering quantifiziert werden. Einige
hochtitrige Isolate der HIV-1-Gruppe M, Subtyp G, können um bis zu 0,6 log zu gering quantifiziert
werden.
STÖRSUBSTANZEN
Erhöhte Triglyzeridwerte (bis zu 3500 mg/dl), Bilirubinwerte (bis zu 18 mg/dl), Albuminwerte (bis zu
6200 mg/dl), Hämoglobinwerte (bis zu 250 mg/dl) und Human-DNA-Werte (bis zu 0,4 mg/dl) in Proben
sowie Autoimmunerkrankungen oder entsprechende Marker wie systemischer Lupus erythematosus (SLE),
rheumatoide Arthritis (RA) und antinukleäre Antikörper (ANA) haben nachweislich keinen störenden
Einfluss auf die quantitative Bestimmung der HIV-1-RNA oder die Spezifität des COBAS® TaqMan® HIV-1Tests, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System. Die Evaluierung wurde gemäß CLSI-Richtlinie
EP7-A2 mit einer Reagenzcharge des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0 zur Verwendung mit dem High
Pure System durchgeführt.
Die in Tabelle 1 aufgeführten Präparate wurden bei einer dem 3fachen Peak-Plasmaspiegel (Cmax)
entsprechenden Konzentration getestet und zeigten keinen störenden Einfluss auf die quantitative Bestimmung
der HIV-1-RNA oder auf die Spezifität des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0 zur Verwendung mit dem High
Pure System.
Tabelle 1
Auf Störeinflüsse untersuchte Präparate
Nukleotid-Reverse-Transkriptase- und
Nukleotid-DNA-Polymerase-Inhibitoren
Tenofovir DF
Adefovir dipivoxil
Nukleosid-Reverse-Transkriptase- und DNAPolymerase-Inhibitoren
Lamivudin, 3TC
Zidovudin
Stavudin, 4dT
Abacavirsulfat
Didanosin, ddI
Telbivudin
Entecavir
Emtricitabin
HIV-Protease-Inhibitoren
Saquinavir
Ritonavir
Lopinavir/Ritonavir
Atazanavir
Nelfinavir-Mesylat
Darunavir
Tipranavir
Fosamprenavir
Nicht-Nukleosid-HIV-Reverse-TranskriptaseInhibitoren
Nevirapin
Efavirenz
HIV-Integrase-Inhibitor
Raltegravir
HIV-Fusionsinhibitor
Enfuvirtid
Immunmodulatoren
Ribavirin
Peginterferon alfa-2a
Peginterferon alfa-2b
HIV-Entry-Inhibitor
Maraviroc
Substanzen zur Behandlung von HerpesViren
Ganciclovir
Valganciclovir HCl
Acyclovir
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Doc Rev. 6.0
NICHT-KLINISCHE LEISTUNGSBEURTEILUNG
A. Nachweisgrenze
Die Nachweisgrenze des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System
wurde mit Hilfe des 2. internationalen WHO-Standards für HIV-1-RNA, NIBSC Code 97/6502,37, HIV-1Subtyp B, verdünnt in HIV-1-negativem Human-EDTA-Plasma bestimmt. Die Nachweisgrenze wurde für
drei Reagenzchargen bestimmt. Für jede Reagenzcharge wurden mindestens fünf Verdünnungsreihen
analysiert. Pro Konzentrationsstufe wurden insgesamt 183 Exemplare getestet. Die Evaluierung wurde
gemäß der CLSI-Richtlinie EP17-A durchgeführt.
Die Konzentration von HIV-1-RNA, die mit einer Positivitätsrate von über 95 % (ermittelt durch PROBITAnalyse) bestimmt werden kann, beträgt 17 Kopien/ml bzw. 29 IE/ml. Für die Chargen 1, 2 und 3 wurden
jeweils die folgenden Ergebnisse in Kopien/ml ermittelt: 15,6 Kopien/ml (95 %-Konfidenzintervall:
13,3-20,3 Kopien/ml), 20,1 Kopien/ml (95 %-Konfidenzintervall: 16,8 – 27,0 Kopien/ml) und 15,8 Kopien/ml
(95 %-Konfidenzintervall: 13,4-20,7 Kopien/ml). Für die Chargen 1, 2 und 3 wurden jeweils die folgenden
Ergebnisse in IE/ml ermittelt: 26,1 IE/ml (95 %-Konfidenzintervall: 22,2-33,9 IE/ml), 33,6 IE/ml (95 %Konfidenzintervall: 28,0-45,1 IE/ml) und 26,4 IE/ml (95 %-Konfidenzintervall: 22,3-34,6 IE/ml). Tabelle 2
enthält eine Übersicht der Ergebnisse für alle drei Reagenzchargen. Der Konversionsfaktor zwischen IE/ml
und Kopien/ml wurde mit Hilfe des COBAS® AMPLICOR® HIV-1-MONITOR-Tests, v1.5, des COBAS®
AmpliPrep/COBAS® AMPLICOR® HIV-1-MONITOR-Tests, v1.5 und des COBAS® TaqMan® HIV-1Tests zur Verwendung mit dem High Pure System ermittelt.
Tabelle 2
Nachweisgrenze des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0
zur Verwendung mit dem High Pure System
mittels internationalem WHO-Standard und PROBIT-Analyse
Eingangskonzentration
(HIV-1-RNA
IE/ml)
(HIV-1-RNA
Kopien/ml)
Anzahl der
Exemplare
Anzahl der
Positiven
Positivitätsrate
83
50
183
183
100,0 %
62
37
182
181
99,5 %
45
27
183
181
98,9 %
33
20
182
174
95,6 %
25
15
183
174
95,1 %
17
10
183
146
79,8 %
PROBIT 95 % Trefferquote
29 IE/ml (95 %-Konfidenzintervall: 26,0-32,9)
17 Kopien/ml (95 %-Konfidenzintervall: 15,6-19,7)
Die Nachweisgrenze wurde anhand von HIV-1-Subtypen der Gruppe M bestätigt. Dazu wurden die
kultivierten Isolate der Subtypen A, B, C, D, CRF01_AE, F, G und H der Gruppe M mit Nennkonzentrationen
von ungefähr 10, 15, 20, 40 und 60 Kopien/ml in HIV-1-negativem Human-EDTA-Plasma mit mindestens
48 Exemplaren pro Konzentration getestet. Die Nennkonzentrationen wurden für die kultivierten Isolate
aus den mittleren HIV-1-RNA-Titern bestimmt, die mit dem COBAS® AMPLICOR® HIV-1-MONITOR-Test,
v1.5 und zwei in-vitro-diagnostischen Vergleichstests für HIV-1-RNA ermittelt wurden. Für alle Subtypen
der Gruppe M mit Konzentrationen zwischen 15 und 40 Kopien/ml und darüber wurden Positivtrefferquoten von mindestens 95 % erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
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Doc Rev. 6.0
Tabelle 3
Validierung der Nachweisgrenze des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0
zur Verwendung mit dem High Pure System anhand
der HIV-1-Subtypen A-H der Gruppe M und einer Analyse mit einer Trefferquote von 95 %
Subtyp
Isolatbezeichnung
Niedrigste Konzentrationsstufe
mit ≥ 95 %-Trefferquote
(Kopien/ml)
A
92UG029
20
B
8E5/LAV
40
C
92BR025
10
D
92UG021
15
CRF01_AE
92TH022
15
F
93BR020
20
G
ARP173/RU570
15
H
HIV V1557
15
B. Präzision
Zur Bestimmung der Präzision des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0 zur Verwendung mit dem High
Pure System wurden Reihenverdünnungen einer Probe HIV-1-Zellkulturüberstand (HIV-1-Subtyp B) in
HIV-1-negativem Human-EDTA-Plasma analysiert. Die Titerbestimmung des Zellkulturüberstands
(Stammkonzentration) erfolgte anhand einer Methode, die die Rückführbarkeit auf den 2. internationalen
HIV-1-RNA-Standard der Weltgesundheitsorganisation (WHO), NIBSC-Code 97/650 gewährleistet2, 37. Es
wurden drei Reagenzchargen analysiert, wobei pro Reagenzcharge 15 Läufe durchgeführt wurden. Jeder
Lauf bestand aus 6 Verdünnungsstufen und 3 Exemplaren für jede Stufe. Alle Proben durchliefen das
gesamte Verfahren des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System
einschließlich Probenaufarbeitung, Amplifikation und Detektion. Die hier angegebene Präzision spiegelt
daher alle Aspekte des Testverfahrens wider. Tabelle 4 enthält eine Übersicht der Ergebnisse für alle drei
Reagenzchargen.
Tabelle 4
Präzision des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System
Alle drei Chargen zusammen
Titer
(Kopien/ml)
Log10-Titer
(Log10
Kopien/ml)
Anzahl
Gesamt-SD
(Log10-Titer)
Gesamt-VK der
Log-Normalverteilung (%)
8,6E+01
1,93
135
0,19
46
8,6E+02
2,93
136
0,09
22
8,6E+03
3,93
136
0,09
22
8,6E+04
4,93
136
0,07
17
8,6E+05
5,93
136
0,07
17
8,6E+06
6,93
136
0,14
33
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C. Linearer Bereich
Zur Bestimmung der Linearität des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0 zur Verwendung mit dem High
Pure System wurden Reihenverdünnungen einer hochtitrigen HIV-1-Zellkulturüberstandprobe (HIV-1Subtyp B) in HIV-1-negativem, normalem Human-EDTA-Plasma analysiert. Die Titerbestimmung des
Zellkulturüberstands (Stammkonzentration) erfolgte anhand einer Methode, die die Rückführbarkeit auf
den 2. internationalen HIV-1-RNA-Standard der Weltgesundheitsorganisation (WHO), NIBSC-Code 97/650
gewährleistet2,37. Für den COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System
ergab sich ein linearer Bereich von 9 (Log10 = 0,93) HIV-1-RNA Kopien/ml bis 1,7E+07 (Log10 = 7,24)
HIV-1-RNA Kopien/ml. Die untere Bestimmungsgrenze lag bei 34 (Log10 = 1,54) HIV-1-RNA Kopien/ml
und die obere Bestimmungsgrenze bei 1,0E+07 (Log10 = 7,00) HIV-1-RNA Kopien/ml. Die Evaluierung
wurde gemäß der CLSI-Richtlinien EP6-A und EP17-A mit zwei Reagenzchargen des COBAS® TaqMan®
HIV-1-Tests, v2.0 durchgeführt. Pro Reagenzcharge wurden 15 Läufe durchgeführt, wobei jeder Lauf aus
14 Verdünnungsstufen und 3 Exemplaren pro Stufe bestand. Abbildung 9 enthält eine Übersicht der
Ergebnisse für beide Reagenzchargen.
Abbildung 9
Linearität des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System
8
®
®
COBAS TaqMan HIV-1-Test, v2.0
y = 1,023x - 0,292
2
R = 0,983
7
6
5
4
3
2
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Nennkonzentration
D. Subtypenerfassung der HIV-1-Gruppe M
Die Leistung des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System bei
HIV-1-Subtypen der Gruppe M wurde durch Analyse von kultivierten HIV-1-Isolaten der Subtypen A, B, C,
D, CRF01_AE, F, G und H der Gruppe M mit den Nennkonzentrationen von ca. 2,0E+02, 2,0E+04 und
2,0E+06 Kopien/ml in EDTA-Plasma evaluiert. Die Nennkonzentrationen wurden aus den mittleren HIV-1RNA-Titern bestimmt, die mit dem COBAS® AMPLICOR® HIV-1-MONITOR-Test, v1.5 und einem in-vitrodiagnostischen Vergleichstest für HIV-1-RNA ermittelt wurden. Mit dem COBAS® TaqMan® HIV-1-Test,
v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System wurden von jeder Probe sieben Exemplare getestet, und
der mittlere log10-Titer wurde mit den Nenntitern verglichen. Mit dem COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0
zur Verwendung mit dem High Pure System wurden Ergebnisse ermittelt, die den Nennkonzentrationen
aller HIV-1-Subtypen der Gruppe M entsprachen (siehe Abbildung 10). Die mittleren log10-Konzentrationsergebnisse lagen für alle Proben innerhalb von ± 0,3 log10 von der Nennkonzentration. Eine
Ausnahme hierzu bildeten die am höchsten konzentrierten Proben von zwei der drei getesteten Subtyp-GIsolate, die 0,51 und 0,56 log10 unter der Nennkonzentration von 6,30 log10 Kopien/ml (2,0E+06 Kopien/ml)
lagen.
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Abbildung 10
COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System
Prüfung der Subtypenerfassung – Zellkulturüberstände der Gruppe M
Mittlerer Log10-Titer HIV-1-RNA [Kopien/ml]
Nominaler Log10-Titer HIV-1-RNA [Kopien/ml]
COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, Version 2.0 [mittlerer Log10-Titer HIV-1-RNA (Kopien/ml)]
7
6
5
4
3
2
1
A
(UG273)
B
(US2)
C
(SM145)
D
CRF01_AE
F
(UG270) (CM240) (BZ162)
G
G
(HH8793) (RU570)
G
H
(RU132) (BCP-KITA)
Subtyp der HIV-1-Gruppe M
Des Weiteren wurde die Leistung des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0 zur Verwendung mit dem High
Pure System bei Subtypen der Gruppe M mit dem COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0
verglichen, indem 308 Proben bekannten Subtyps getestet wurden, einschließlich 141 Proben anderer
Gruppe-M-Subtypen als Subtyp B. Der COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High
Pure System und der COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 lieferten für alle Subtypen
vergleichbare Ergebnisse (siehe Abbildung 12).
E. Detektion der HIV-1-Gruppe O
Die Leistung des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System bei
HIV-1-Proben der Gruppe O wurde durch Analyse von drei kultivierten HIV-1-Isolaten der Gruppe O
evaluiert, die mit Human-EDTA-Plasma auf verschiedene Konzentrationen verdünnt wurden. Die
Nennkonzentrationen wurden den Isolaten mit Hilfe eines in-vitro-diagnostischen Vergleichstests für
HIV-1-RNA zugewiesen, der für HIV-1 der Gruppe O spezifisch ist. Die Nachweisgrenze des COBAS®
TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System bei HIV-1-Proben der Gruppe O
wurde durch Analyse der einzelnen Isolate mit Nennkonzentrationen zwischen 10 und 200 Kopien/ml
bestimmt (siehe Tabelle 5). Dabei wurden für jede Konzentration 48 Exemplare getestet. Bei zwei der drei
Gruppe-O-Isolaten betrug die Positivtrefferquote bei Konzentrationen zwischen 15 und 20 Kopien/ml und
darüber mindestens 94 %. Bei einem der drei Gruppe-O-Isolaten (MVP5180) betrug die Positivtrefferquote
bei Konzentrationen von 100 Kopien/ml und darüber mindestens 92 %, und die 95 %-Nachweisgrenze
mittels Probit-Analyse lag bei 112 Kopien/ml.
Die Linearität des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System bei
HIV-1 Gruppe O wurde durch Testen derselben drei Isolate mit Konzentrationen von 2,0E+2, 2,0E+4 und
2,0E+6 Kopien/ml in Human-EDTA-Plasma bestimmt. Dabei wurden für jede Konzentration 7 Exemplare
getestet (siehe Abbildung 11). Bei zwei der drei Isolate lagen die mittleren log10-Konzentrationsergebnisse
für alle Proben innerhalb von ± 0,3 log10 von der Nennkonzentration. Beim Isolat MVP5180 lagen die
mittleren log10-Ergebnisse ca. 1,3 log unter den Nennkonzentrationen. Das mittlere Ergebnis für die
niedrigkonzentrierte Probe von MVP5180 ist in Abbildung 11 als untere Quantifizierungsgrenze
(34 Kopien/ml) dargestellt. Zwar wurden alle Exemplare nachgewiesen, die Ergebnisse lagen jedoch unter
der unteren Quantifizierungsgrenze.
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Doc Rev. 6.0
Des Weiteren wurde die Leistung des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0 zur Verwendung mit dem High
Pure System bei HIV-1-Proben der Gruppe O bewertet, indem sechs zusätzliche in Human-EDTA-Plasma
verdünnte, kultivierte Gruppe-O-Isolate mit dem COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit
dem High Pure System und einem in-vitro-diagnostischen Vergleichstest für HIV-1-RNA, der für HIV-1
Gruppe O spezifisch ist, getestet wurden (siehe Tabelle 6). Für fünf der sechs Isolate wurden mit dem
COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System und dem Vergleichstest
vergleichbare Ergebnisse erzielt; bei einem Isolat waren die Ergebnisse des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests,
v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System deutlich niedriger.
Tabelle 5
Nachweisgrenze des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0
zur Verwendung mit dem High Pure System bei HIV-1-Isolaten der Gruppe O
Gruppe-OIsolat
(HIV-1-RNA
Kopien/ml)
Anz.
Exemplare
Anz.
Positive
Positivitätsrate
100
48
48
100 %
80
48
48
100 %
60
48
48
100 %
40
20
48
48
48
45
100 %
94 %
100
47
47
100 %
80
60
48
48
48
48
100 %
100 %
40
48
48
100 %
20
48
46
96 %
15
10
48
48
47
44
98 %
92 %
200
47
47
100 %
175
150
100
80
60
48
48
48
47
48
47
48
44
43
38
98 %
100 %
92 %
91 %
79 %
40
48
33
69 %
20
48
25
52 %
BCF01
BCF03
MVP5180
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32
PROBIT 95 %
Trefferquote
20 Kopien/ml
(95 %-Konfidenzintervall
nicht verfügbar)
13 Kopien/ml
0,7 - 24 Kopien/ml)
112 Kopien/ml
90 - 156 Kopien/ml)
Doc Rev. 6.0
Abbildung 11
COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System
Prüfung der Subtypenerfassung – Zellkulturüberstände der Gruppe O
Nominaler Log10-Titer HIV-1-RNA [Kopien/ml]
COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, Version 2.0
[mittlerer Log10-Titer HIV-1-RNA (Kopien/ml)]
7
6
5
4
3
2
1
BCF01
BCF03
MVP5180/91
Isolate der HIV-1-Gruppe O
Tabelle 6
Vergleich des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System
mit dem in-vitro-diagnostischen Vergleichstest bei HIV-1-Isolaten der Gruppe O
Log10 HIV-1-RNA Kopien/ml)
Gruppe-OIsolat
Verdünnung
COBAS
TaqMan®
HIV-1-Test, v2.0
Vergleichstest
Differenz
(COBAS® TaqMan®
HIV-1-Test, v2.0 –
Vergleichstest)
-0,04
®
BCF02
1,0E+4
4,16
4,20
BCR06
1,0E+4
4,43
4,34
0,10
BCF07
1,0E+4
3,98
4,10
-0,12
BCF11
1,0E+4
4,35
4,58
-0,23
BCF13
1,0E+4
2,79
4,69
-1,90
I2478B
100
3,25
3,40
-0,15
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F. Spezifität
Die Spezifität des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System wurde mit
zwei Reagenzchargen durch Analyse von HIV-1-negativen EDTA-Plasmaproben von normalen Blutspendern
ermittelt. Insgesamt wurden 547 einzelne EDTA-Plasma-Proben mit dem COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0
zur Verwendung mit dem High Pure System getestet. Für 543 Proben wurde das Ergebnis „Target Not
Detected“ und für 3 Proben ein Ergebnis < 34 Kopien/ml ermittelt. Eine Probe war ungültig. Somit liegt die
klinische Spezifität des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System bei
99,5 % (einseitige untere 95 %-Bereichsgrenze: 98,45 %).
G. Analytische Spezifität
Zur Evaluierung der analytischen Spezifität des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0 zur Verwendung mit
dem High Pure System wurde HIV-1-negatives und HIV-1-positives (2,4E+02 Kopien/ml HIV-1) HumanEDTA-Plasma mit gezüchteten pathogenen Keimen (Viren, Bakterien, Hefe) oder DNA (HTLV-2) mit 1E+06
Partikeln/ml versetzt (siehe Tabelle 7). Keiner der getesteten Organismen zeigte eine Kreuzreaktivität oder
beeinträchtigte die Leistung des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure
System. Alle getesteten Organismen ergaben in HIV-1-negativen Proben das Ergebnis „Target Not
Detected”. Bei den HIV-1-positiven Proben ergaben alle getesteten Organismen RNA-Titer, die innerhalb
von 0,2 log10 HIV-1-RNA Kopien/ml von den HIV-1-positiven Kontrollproben lagen.
Tabelle 7
Proben für die Ermittlung der analytischen Spezifität
Virus
Adenovirus Typ 5
Cytomegalovirus
Epstein-Barr-Virus
Humanes Herpesvirus Typ 6
Herpes-Simplex-Virus Typ 1
Herpes-Simplex-Virus Typ 2
Humanes T-Zell-lymphotropes Virus Typ 1
Humanes T-Zell-lymphotropes Virus Typ 2
Humanes Immundefizienz-Virus Typ 2
Influenza A
Hepatitis-A-Virus
Hepatitis-B-Virus
Hepatitis-C-Virus
Bakterien
Staphylococcus aureus
Propionibacterium acnes
Hefen
Candida albicans
H. Korrelation der Methoden
Die Leistung des COBAS® TaqMan® HIV-1-Tests, v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System wurde
durch Analyse von 308 klinischen HIV-1-positiven Proben mit dem COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®
HIV-1-Test, v2.0 verglichen. Alle Proben wurden mit HIV-1-negativem EDTA-Plasma im Verhältnis 1:5 verdünnt
und mit dem COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0 und dem COBAS® TaqMan® HIV-1-Test,
v2.0 zur Verwendung mit dem High Pure System in Doppelbestimmung getestet. Bei 290 Proben wurde
mindestens ein gültiges Ergebnis innerhalb des linearen Bereichs beider Systeme erhalten. Bei der DemingRegressionsanalyse der mittleren logarithmischen Virustiterergebnisse wurde eine Steigung von 0,991, ein
Achsenabschnitt von 0,09 und ein R-Quadrat-Wert von 0,983 ermittelt (siehe Abbildung 12). Die mittlere
logarithmische Differenz zwischen den Methoden betrug 0,06 (95 %-Konfidenzintervall: 0,04 bis 0,07).
Der Subtyp aller Proben war bekannt und umfasste 167 Proben vom Subtyp B (54 %) und 141 Proben
anderer Gruppe-M-Subtypen als Subtyp B (46 %). Zu den Proben, die nicht vom Subtyp B waren,
gehörten alle Subtypen der Hauptgruppe M und rekombinanten Formen (siehe Tabelle 8). Die mittlere
logarithmische Differenz zwischen den Methoden betrug 0,09 für die Proben vom Subtyp B und 0,02 für
die Proben anderer Subtypen.
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Doc Rev. 6.0
Tabelle 8
Verteilung der Subtypen klinischer Proben beim Vergleich der klinischen Methoden
Subtyp
Anzahl
Subtyp
Anzahl
Subtyp
Anzahl
A
3
G
B
167
H
8
CRF10_CD
3
3
CRF11_CPX
C
16
4
CRF01_AE
15
CRF13_CPX
12
D
5
CRF02_AG
47
CRF14_BG
6
F
10
CRF09_CPX
3
CX
6
Abbildung 12
Korrelation zwischen dem COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0
und dem COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HIV-1-Test, v2.0
8
A (n = 3)
B (n = 154)
C (n = 16)
D (n = 5)
F (n = 8)
G (n = 7)
H (n = 3)
CRF01_AE (n = 15)
CRF02_AG (n = 45)
CRF09_CPX (n = 3)
CRF11_CPX (n = 4)
CRF13_CPX (n = 12)
CX (n = 6)
CRF10_CD (n = 3)
CRF14_BG (n = 6)
®
®
COBAS TaqMan HIV-1-Test, Version 2.0
7
6
5
4
3
2
Regression
standardisierte
Hauptkomponente
Y = 0,991 * X + 0,09
1
2
R = 0,9831
N = 290
0
0
1
2
3
4
®
®
5
6
7
8
®
COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1-Test, Version 2.0
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Doc Rev. 6.0
LITERATUR
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