CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE : vi=f [substrat]

CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE : vi=f [substrat]
La glucose-oxydase (GOD) catalyse l’oxydation du glucose (substrat) en le transformant en gluconolactone (produit) selon la réaction enzymatique ci-dessous :
GOD GLUCONOLACTONE + PEROXYDE D’HYDROGENE (le gluconolactone se transforme spontanément en acide gluconique)
GLUCOSE + O2 + H2O
C6H12O6 + O2 + H2O
GOD
C6H12O7 + H2O2
On suit la cinétique par la mesure du dioxygène. Il s’agit d’un dosage indirect du substrat (glucose) par la mesure de la disparition de l’O2.
PROTOCOLE
PRODUITS ET MATERIEL
PRODUITS :
SUBSTRAT
 A partir d’une solution « mère » de
-1
glucose à 100g.L , préparer 5 dilutions
à:
5/10/20/40/50 g.L-1
ENZYME

Glucose-oxydase : dissoudre une pointe
de spatule de GOD dans 5 ml d’eau
distillée. A préparer au moment du TP.
EAU DISTILLEE
MATERIEL






T.A.E + portoir
Pipette de 5 ml et propipette
Micropipette + cônes ou microseringue
Tube à hémolyse pour l’enzyme
Fioles pour dilution
Matériel expérimental assisté par
ordinateur adapté: Sonde à dioxygène/
bioréacteur/logiciel d’enzymologie
MANIPULATION.
LOGICIEL : ATELIER SCIENTIFIQUE (version 2.3)
SONDE DIOXYGENE
PARAMETRAGE DE L’ORDINATEUR…………………………










Choisir «ENZYMOLOGIE» dans « Atelier scientifique »
Enceinte du bioréacteur
Cliquer sur l’onglet « concentration en O2 »
Choisir le paramètre étudié : « concentration en substrat »
bioréacteur
BIOREACTEUR
Cocher les grandeurs à mesurer
Entrer au clavier la valeur de la concentration de la 1ère dilution et son unité
devient actif
La courbe d’apparition du produit est calculée à partir de la précédente
Ce calcul doit tenir compte des coefficients stœchiométriques de la réaction étudiée
REGULATEUR DE VITESSE
Le rapport Produit/Substrat est ici égal à 1
Le coefficient stœchiométrique est paramétré par défaut à 1. Il n’y a pas de modification à apporter (dans le cas contraire cliquer
sur
pour modifier le coefficient
Consommation : Affiche la disparition du substrat en fonction du temps. Production : Affiche l’apparition du produit de la réaction en fonction du temps.
DEROULEMENT DE LA CINETIQUE…………………………







Introduire 5ml de solution glucosée dans l’enceinte du bioréacteur
Mettre sous agitation
Attendre quelques secondes (homogénéisation du milieu)
Introduire la sonde oxymétrique dans le bioréacteur
Lancer l’acquisition
Après 1 minute, injecter 200µl de GOD avec la microseringue ou micropipette/insérer un repère en cliquant sur
Recommencer de la même façon pour chaque dilution (commencer par la dilution la plus faible, ce qui évite de rincer la pipette
entre chaque manipulation)
 Enregistrer les données acquises (fichier / enregistrer sous)
 A chaque nouvelle acquisition, entrer la nouvelle valeur du paramètre étudié dans le menu « paramètre »
CONSTRUIRE UNE COURBE PARAMETRIQUE
COURBE PARAMETRIQUE : vi = f[S]………………………
vi (vitesse initiale) = pente de la courbe où la pente est maximum
A partir du tableau ci-contre :
 Sélectionner, dans le tableau, la première ligne avec un clic gauche
 La ligne sélectionnée affiche la couleur correspondant à la courbe sur le graphique
 Déplacer la souris dans la fenêtre graphique
 Le curseur de la souris change d’aspect : l’outil « droite » est activé :
 Tout en maintenant le bouton gauche de la souris enfoncé, positionner le curseur sur la portion de la droite où la pente est maximale
 Sans lâcher le clic gauche, valider la droite en appuyant sur entrée.
 La valeur de la vitesse initiale correspondante (pente de la droite) s’affiche à droite dans le tableau
 Recommencer l’opération pour chacune des courbes (commencer par la [S] la plus faible, ce qui évite de rincer la pipette entre chaque manipulation)

devient actif.
 Cliquer sur ce bouton pour obtenir la courbe vi=f[S]
RESULTATS
Résultats obtenus par les élèves
[O2]= f (tps)
NOTES
 La GOD, comme toutes les enzymes, doit être stockée au froid
 Les solutions de glucose peuvent être préparées la veille et conservées au réfrigérateur
 Eviter les artéfacts en injectant le plus lentement possible l’enzyme
Courbe paramétrique