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REGULATION GLOBALE DE L’EXPRESSION DES GENES
TP4 : Les puces à ADN
-introduction
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-réactifs et matériel
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-protocoles
extraction des ARN totaux de levure
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purification des ARN messagers
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synthèse d’ADNc marqués par reverse transcription
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dénaturation des ARNm
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purification des sondes cDNA
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hybridation
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lavages
traitement des lames spottées
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-annexe
protocole d’extraction et de purification des ARN du kit Microfast
track de Invitrogen
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TP4 – ETUDE GLOBALE DES GENOMES
le puces à ADN
Objectif de la manipulation
Etude de la réponse précoce de la levure S. cerevisiae à la drogue
fluphénazine
La manipulation réalisée en TP consiste à comparer les transcriptomes de cellules ayant été
mises en présence de la drogue fluphénazine pendant 2, 5 et 10 minutes avec les transcriptomes
de cellules non traitées. Chaque binôme de TP étudiera un temps particulier. Les résultats
obtenus seront ensuite mis en commun pour l’étape d’analyse des profils d’expression. Le but
de cette manipulation est de caractériser la réponse précoce des cellules à la fluphénazine. La
fluphénazine est un inhibiteur de la calmoduline et donc de la voie de signalisation calcique. Elle
est utilisée couramment comme neuroleptique. Récemment, on s’est rendu compte que cette
drogue modifiait la capacité à résister aux antifongiques de type azoles de la levure pathogène
Candida albicans. Il apparaît donc intéressant de comprendre l’effet de cette drogue sur
l’expression des gènes de la levure modèle S. cerevisiae.
Matériel de départ
Dans le cadre du TP, nous utiliserons des puces à ADN composées d’oligonucléotides
longs (50 nucléotides) spécifiques de chacun des gènes de la levure (un peu moins de 6000)
déposés en duplicats (deux génomes par puces soit un peu moins de 12000 dépôts) sur des
lames recouvertes de polysilanes (Ultragaps de Corning). Ces puces à ADN ont été fabriquées à
l’Ecole Normale Supérieure de Paris par le service génomique du département de biologie
(SGDB, http://transcriptome.ens.fr). La liste et la position des gènes présents sur la puce seront
explicités lors de la phase d’analyse des résultats.
Chaque binôme préparera des ARN issus respectivement des souches YRR1gof et SEY. A
partir de ces ARN, il s’agira de synthétiser par reverse transcription les ADNc correspondants,
marqués soit avec le fluorophore Cy3, soit avec Cy5. Le mélange de ces deux populations
d’ADNc constituera la sonde qui sera hybridée sur la puce.
Le protocole concernant les étapes préalables de fabrication des puces
à ADN, d’extraction des ARN de levures et de leur purification sont
disponibles sur le site!: http://transcriptome.ens.fr/
REACTIFS ET MATERIEL
Réactifs
Eau Rnase free : Sigma réf W4502
Tampon TES: Tris 10 mM pH 7.5, EDTA 10 mM, SDS 0.5% autoclavé
Phénol:chloroforme 5:1 et chloroforme
Acétate de sodium 3M pH 5,3 autoclavé
Ethanol absolu
Beta-mercaptoethanol
Amorces OligodT!: Invitrogen.
Amorces hexamères aléatoires : Roche Diagnostics réf 1034731
Tampon RT 5X fourni avec l'enzyme
DTT 0,1M
Transcriptase Inverse Superscript II à 200U/ul : Gibco BRL réf 18064014
dNTP Set à 100 mM chaque : Amersham Pharmacia Biotech réf 27203501
dNTP mix: 2.5mM dATP, 2.5mM dCTP, 2.5mM dGTP, 1.25mM dTTP
Cy3-dUTP et Cy5-dUTP à 1mM : Amersham Pharmacia Biotech réf PA53022
et PA55022
Tampon d'hybridation 2X: 50% Formamide, 10X SSC, 0.2% SDS
EDTA 20 mM
NaOH 0,1 M et HCl 0,1 M
Isopropanol
Ethanol 95%
Tampons de lavage: 1X SSC + 0,2% SDS , 0,1X SSC + 0,2% SDS, 0,1X SSC
Matériel
Incubateurs à 42°C, 65°C et 70°C.
Bains-marie à 37°C - 50/60°C – bouillant.
Plaque chauffante à 80°C.
Kit Quiaquick PCR purification de Quiagen
Lamelles souple hydrophobe, Polylabo.
Bacs et supports pour traitement des lames.
Chambres d'hybridation : ArrayIt hybridization cassette Telechem ou
Corning.
Appareil UV : Stratalinker 65mJ, Stratagene.
Centrifugeuse pour microtubes et supports de lames.
PROTOCOLES
Extraction des ARN totaux de levure
http://transcriptome.ens.fr/
«!Nettoyage!» des ARN
http://transcriptome.ens.fr/
Synthèse d’ADNc marqués par reverse transcription
Préparer deux tubes PCR de 0,2ml contenant 15µg de chaque ARN.
Ajouter 5ug d’amorces hexamères aléatoires et 2µg d’amorces OligodT dans chaque tube.
Completer le volume à 23µl total avec de l’eau.
Placer les tubes à 70°C pendant 10 minutes pour dénaturer les
structures secondaires simple brin du mélange amorces-ARNm.
Pendant ce temps, préparer le mélange de réaction!:
16 µl de tampon de RT 5X first strand buffer
8 µl de DTT 0,1M
4 µl de dNTP mix
4 µl d’enzyme Superscript II 200U/µl
Mettre les tubes de PCR dans la glace.
Ajouter 1 µl de Cy3-dUTP 1mM dans l ’ u n des tubes!(selon l e s
instructions de l’encadrant)
Ajouter 1 µl de Cy5-dUTP 1mM l’autre tube.
Mettre 16 µl de mix dans chaque tube.
Laisser les tubes cinq minutes sur la paillasse.
Incuber les tubes à 42°C pendant deux heures.
Dénaturation des ARN
Stopper la réaction de RT en ajoutant 1,5ul d’EDTA 20mM par tube.
Ajouter 15µl de NaOH 0,1M préparée extemporanément.
Incuber 10min à 70°C.
Neutraliser immédiatement le pH avec 15ul de HCl 0,1M.
Purification des sondes cDNA
Pooler les deux tubes de PCR dans un tube eppendorf de 1,5ml.
Ajouter 1/10 volume de Na Acetate et 2,5 volumes d’ethanol 95%.
Laisser précipiter une demi-heure à –80°C.
Centrifuger 30min à 21000g (max) à 4°C.
Eliminer le surnageant.
Eliminer soigneusement toute trace d’alcool (au besoin, centrifuger
brièvement).
Ne pas laisser le culot sécher.
Reprendre le culot dans 40µl d’eau et 4µl de Na Acetate.
Ajouter 200µl de tampon PB de Quiagen.
Mettre sur une colonne Quiaquick et centrifuger à 13500 g pendant 1
minute.
Enlever le liquide, ajouter 600µl de tampon PE sur la colonne et
centrifuger 1 minute.
Enlever le liquide et recentrifuger «!à vide!» pendant 1 minute.
Enlever le liquide. Mettre la colonne dans un tube eppendorf propre,
ajouter 30µl d’eau préchauffée à 37°C et centrifuger 1 minute.
Recommencer avec les mêmes 30µl.
Hybridation
Chauffer la sonde et le tampon d’hybridation à 70°C pendant deux ou
trois minutes.
Ajouter 35 µl de tampon d’hybridation aux 30µl de sonde.
Préparer la chambre d’hybridation: mettre un peu d’eau dans chaque
logette, placer la lame matrice vers le haut (la matrice est du côté
opposé à l’étiquette).
Déposer la sonde sur la matrice (attention aux bulles).
ATTENTION!: à partir de maintenant, il faut éviter au maximum que la
sonde sèche sur la lame, ce qui causerait un bruit de fond irréversible.
Recouvrir l’ensemble avec la lamelle souple hydrophobe.
Refermer la chambre en vissant, sans forcer!! La pression sur le joint
peut s’apprécier à l’œil (“!trait!” noir tout autour de la chambre,
synonyme d’étanchéité).
Placer la chambre dans un bain marie à 42°C en prenant soin qu’elle soit
toujours bien horizontale afin que la lamelle ne glisse pas.
Incuber 12 à 14 heures.
Lavages
Préparer les tampons de lavage!: 150ml de 1X SSC, 0,2% SDS!; 150ml
de 0,1X SSC300ml de 0,1X SSC.
Sortir la chambre du bain marie, toujours bien horizontale, l’essuyer
précautionneusement.
Sortir la lame et la plonger rapidement dans le 0,1X SSC 0,1% SDS. Remuer le portoir de haut
en bas jusqu’à ce que la lamelle se détache.
Rincer deux fois 5 minutes dans du 0,1X SSC en agitant énergiquement
de haut en bas à chaque fois.
Centrifuger les lames une minute à 50g (Sigma 500rpm) sur une nacelle
recouverte d’un papier absorbant.
Les lames sont prêtes à être scannées.
Traitement des lames spottées
Ce traitement a pour but de neutraliser les groupements silanes libres
après le spotting, de façon à limiter au maximum une interaction non
spécifique de la sonde avec le support.
Préparer 50ml de tampon de blocage!dans un falcon: 5X SSC, 0,1% SDS,
1% BSA.
Préchauffer la solution à 42°C.
Mettre la lame dans le falcon et incuber 45 minutes à 42°C.
Rincer la lame cinq fois dans autant de falcon remplis d’eau.
Passer la lame dans un falcon d’isopropanol et laisser sécher sur un
papier.
ANNEXE
Adresses internet de différentes banques de données
Saccharomyces Genome Data Base : genomewww.stanford.edu/Saccharomyces/
Yeast Proteome Data Base : www.proteome.com/databases/index.html
MIPS Yeast Genome project: www.mips.biochem.mpg.de/mips/yeast/index.htmlx
Yeast Protein interactions : depts.washington.edu/sfields/projects/YPLM/Natureplain.html
NCBI: www.ncbi.nlm.nih.gov/
The EMBL Outstation - European Bioinformatics Institute (EBI): www.ebi.ac.uk
Informations diverses
Produits toxiques et biologiques
Le matériel biologique:
- les cônes et tubes eppendorfs sont jetés dans des poubelles de paillasse
Tous les soirs avant de partir vérifier que votre paillasse soit propre et, si vous avez un doute
ou une question demander avant d'agir!