Cellules souches et vieillissemen

04/02/2014
Capacité régénératrice et vieillissement musculaire
chez l’homme
Le muscle squelettique adulte est formé de :
- Cellules différenciées plurinucléées dont les noyaux sont
post-mitotiques : les fibres musculaires
- Cellules mononucléées déterminées dont les noyaux sont
quiescents : les cellules satellites.
-Les cellules satellites sont situées sous la lame basale
Elles sont responsables de la croissance musculaire
et chez l’adulte de la régénération après lésion
(traumatisme, opération, maladie dégénérative)
Vincent Mouly
Institut de Myologie, Paris
[email protected]
Myonucleus
Evolution
en fonction
de l’âge
Cellule
satellite
From T.A. Partridge
Vieillissement Humain
SARCOPENIE
2002 : 21% de la population a 60 ans ou plus
2050 : plus d’un tiers de la population aura 60 ans ou plus
Nombreux changements de l’organisme avec l’âge:
•
masse grasse
•
masse musculaire et masse osseuse
•
système immunitaire, mémoire et métabolisme
•
prévalence de nombreuses maladies
•
Nombreuses hormones circulantes
•
Facteurs locaux
Impossible d’afficher l’image.
Débute à 30 ans
S ’accélère après 65 ans
masse musculaire
force
endurance
activité enzymatique
(d’après Janssen, 2000)
1
04/02/2014
Au niveau cellulaire, la sarcopénie est caractérisée par :
Atrophie musculaire liée au vieillissement :
Un processus multifactoriel
Force musculaire
Masse musculaire
20-40% entre 20 et 70-80 ans,≥50% dans la neuvième décade
≥ 50% dans la neuvième décade
Surface de section
Nombre de fibres
10% à 50 ans,40% à 80 ans (Lexell et al.,
1988)
Taille des fibres
Modification de l’innervation
unités motrices
(mort des motoneurones)
Masse grasse
Fibrose
(
Synthèse,
rigidité musculaire, fragilité musculaire)
dégradation des protéines
Modifications mitochondriales
Une baisse
du nombre de fibres
Une baisse
De la taille des fibres
synthèse des protéines mitochondriales
activités enzymatiques mitochondriales
accumulation de mutations de l’ADN mitochondrial
Régénération musculaire et cellules satellites
Remplacement cellulaire important
Potentiel régénératif fort
Cellule satellite quiescente
lésion
Fibre musculaire
Cellule satellite activée
Remplacement cellulaire faible
Potentiel régénératif fort
Activation
Remplacement cellulaire faible
Potentiel régénératif faible
Prolifération
Contribution des progéniteurs
à l’homéostase et à la réparation
Division
asymétrique
Différenciation
Maturation
Cellules sanguines
foie
Epithelium mammaire
Petits vaisseaux
Epithelium intestinal
Muscle squelettique
Endothelium vasculaire
Pancreas
Epiderme
Cortico-surrénales
Parenchyme pulmonaire
cerveau rein
Rétine
coeur
Moelle épinière
- Nombre de cellules satellites
Capacité
Régénératrice
- Capacité des cellules satellites a être activées
Aproliférer
A se différencier
Hétérogénéité tissulaire et fonction des progéniteurs
pour l’homéostase et la réparation
From Rando 2006 Nature
In vivo
Baisse du nombre de cellules satellites avec l’âge
Determination du nombre de cellules
satellites par immunofluorescence :
Sélection au hasard des zones de comptage
Leu-19 / Laminin
au moins200 fibres comptées
Leu-19, Lam
Leu-19, Lam, DAPI
6.8 - 0.8% entre 20 et 83 ans (1 exception : CPM)
Age moyen
:
68-71 ans
n = 4-6
2
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In vivo
Nombre de cellules satellites chez les athlètes
Prolifération
Progéniteur
quiescent
Différenciation
Myoblaste
mononucléé
Maturation
Myotube
plurinucléé
Fibre régénérée
In vitro
Modèles in vitro
Capacité proliférative des progéniteurs musculaires
Prolifération
Progéniteur
quiescent
Rappel :
Différenciation
Myoblaste
mononucléé
Maturation
-Toutes les cellules somatiques humaines présentent une limite de prolifération
(Travaux de Hayflick 1960-1965)
-La sénescence proliférative est définie comme l’absence totale de divisions
cellulaires pendant 3 semaines en milieu de croissance.
Myotube
plurinucléé
Fibre régénérée
Fusion
Cellules somatiques
Divisions
« Les tissus ou organes blessés ne
peuvent se réparer d’eux-mêmes
indéfiniment car la capacité proliférative
des cellules qui les composent est
limitée »
Sénescence
(Weismann,1889)
Isolation
(explant, enzymes)
Prolifération
(GF, cytokines)
Differenciation
(cytokines)
jours
In vitro
Approche in vitro :
LA CAPACITE PROLIFERATIVE IN VITRO
DES CELLULES SATELLITES HUMAINES
EST LIMITEE ET VARIE AVEC L ’AGE
-Etablissement de cultures primaires à partir de biopsies
n div
-Mesure du nombre de divisions moyen réalisé à chaque « passage »
selon la formule log (N/n)/log2 ou N est le nombre compté
et n le nombre ensemencé initialement.
70
Age (Q) Divisions
60
5j
5m
9 ans
15 ans
26 ans
28 ans
31 ans
81 ans
86 ans
50
-Détermination du nombre maximal de divisions que les cultures
font in vitro avant d’atteindre la sénescence proliférative.
40
30
5 jours
5 mois
26 ans
81 ans
86 ans
20
10
0
Isolement
(explants ou enzymes))
20
40
60
80
100
55-65
46
30
28
19
21
17
15
15
120
jours
Prolifération
(GF, cytokines)
Le nombre de divisions mesuré n’est pas absolu, mais peut être comparatif
3
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In vitro
Potentiel myogénique des myoblastes sénescents
LA CAPACITE PROLIFERATIVE IN VITRO
DES CELLULES SATELLITES HUMAINES
EST LIMITEE ET VARIE AVEC L ’AGE
Desmine
Hoescht
Desmine & Hoescht
n div
70
Age (Q) Divisions
60
5j
5m
9 ans
15 ans
26 ans
28 ans
31 ans
81 ans
86 ans
50
40
30
5 jours
5 mois
26 ans
81 ans
86 ans
20
10
0
20
40
60
80
Et en situation pathologique
100
jeunes
55-65
46
30
28
19
21
17
15
15
sénescentes
120
jours
DMD :
7 ans (Q) 19
11 ans(Q) 14
PV
5
-Les myoblastes sénescents ne peuvent pas initier de cycle cellulaire mais
peuvent toujours se différencier
- Les myotubes formés par les myoblastes sénescents sont plus petits
(93.2 % des myotubes jeunes, mais aucun des myotubes sénescents,
contiennent plus de 50 noyaux)
Modification du programme myogénique
dans les myoblastes sénescents
Régénération & Cellule Satellite
Cellule Satellite
Myoblaste
Myofibre
Sénescent
Jeune
MyoD
MyoD
DO 450 nm
1.5
Y
S
1.0
Myogénine
Quiescente
Activée
Proliferative
0.5
Differentiée
0.0
0
8
16
48
hours
p57
Pax7
Myf5
DO 450 nm
3
Myf5
Emerine
Y
S
2
1
MyoD
0 15 30 45 60 15 30 45 60
0
Différenciation(heures)
Myogenin
0
8
16
48
hours
Western blot
(D’après P.S. Zammit)
Délai et diminution del’expression
de MyoD, Myogénine et p57
Théorie de l’horloge mitotique
Diminution de l’activité de
liaison àl’AND
de MyoDet Myf5
Télomères
La durée de la vie d’une cellule est déterminée par le nombre de divisions cellulaires
qui a été effectué et non par le temps chronologique passé en culture
Composition
DNA : séquences répétées TTAGGG - non codantes
Double brin + 3’ simple brin à l’extrémité
+ protéines
Participe à la structure des chromosomes et à leur stabilité
(d’après de Lange et al., 2005)
Protection de l’extrémité 3’ simple brin contre les fusions chromosomiques
(structure T-loop)
Télomères
(from Ramirez et al., 2003)
4
04/02/2014
Sénescence réplicative: Théorie de l’horloge mitotique
Sénescence réplicative: Théorie de l’horloge mitotique
Divisions
Taille critique
Sénescence
Réplication
incomplète
Raccourcissement des
télomères
jours
Perte télomérique / division cellulaire
Cellules somatiques
Réplication
incomplète
Southern blot
Taille des télomères Kb
(d’après Campisi et al., 2001)
Réplication de l’ADN = bidirectionnelle
&
ADN polymérase = unidirectionnelle
synthétise de 5’
3’
50 à 200 bp de chaque chromosome
non répliquées / division
6 Kb
Taille critique
Sénescence
(fibroblastes)
Nombre de divisions
In vivo
Athletes:
Longueurs télomériques et nombre de cellules satellites
LES TELOMERES
RACCOURCISSENT REGULIEREMENT
AU COURS DES DIVISIONS CELLULAIRES
TRF
m oyens
(Kb )
20
15
10
5 j
5 m.
2 6 ans
2 8 ans
8 1 ans
5
0
0
10
20
30
40
50
60
Exercise intensif:
- TRFmin plus courts
- Nombre plus élevé de cellules satellites
70
n
divisions
In vivo
Les télomères mesurés in vivo
sont dramatiquement plus courts dans les dystrophies
TELOMERES ET TELOMERASE
Il existe un mécanisme pour remettre
l’horloge mitotique à zéro,
par exemple à chaque génération :
C’est la télomerase qui allonge les télomères
Min TRF
length
8
:
Au cours du développement
7
- Les télomères sont longs
- La télomèrase est active dans les cellules précoces
6
:
Après la naissance
et chez l'adulte
5
- Les télomères raccourcissent
- La télomérase est inactive sauf :
4
dans certains tissus prolifératifs
Control
Muscular dystrophies
3
(couche basale de la peau, crypte intestinale, etc...)
dans la lignée germinale
2
0
5
10
15
(n = 21), r = 0.64, m = -13 bp/ y.
20
25
30
Age
- La télomèrase est active dans la grande majorité des tumeurs invasives
( n = 11) , r = 0.76, m = -164 bp/ y.
5
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La sénescence cellulaire peut être induite
par des voies multiples
Peut-on manipuler la capacité proliférative ?
La télomérase exogène
peut augmenter la capacité proliferative,
mais n’est pas suffisante pour immortaliser les myoblastes humains
Impossible d’afficher l’image.
instabilité
de la
chromatine
Signaux de
stress
Arrêt irréversible
du cycle
cellulaire
Oncogènes,
mutations
oncogéniques
Cassures d’ADN
non télomérique
Télomères
courts/dysfonctionnels
(Sénescence réplicative)
Il existe un mécanisme supplémentaire qui provoque
un arret prolifératif dominant sur l’horloge mitotique
Cycle Cellulaire
Voies impliquées dans l’arrêt
l’arrêt prolifératif des myoblastes humains
Telomerase
pas d’immortalisation
X
Longueur
télomérique critique
=
=
p53
p21
p16INK4a
Cycline D
M
CdK4/6
E2F Rb
Cycline
CDK
X
P P
E2F
Stress
p16
+
INK4
p18INK4c
Sortie du
cycle en G1
P
p15INK4b
G2
R
G1
p19INK4d
p21CIP1
S
p27KIP1
Rb
CIP-KIP
p57KIP2
p16 se lie à cdk4 pour inhiber la progression du cycle cellulaire
Implication de la voie p16?
Implication de la voie p16 dans l’arrêt
l’arrêt prolifératif?
Inhibition de la voie p16 par surexpression de Cdk4
clonage
+ hTERT
HSK
LHCN
LHCNM2
(donneur adulte)+ p16
population
Clone myogénique
Cdk-4
PDL
TRF (Kb)
100
10.0
Control-CdK4
75
7.5
Control
50
Les myoblastes immortalisés ont dépassé les 200 divisions
Pas de tumeurs observées in vivo. Telomeres = 18-20 kb
5.0
2.5
25
00
**
Taille critique
0.0
100
200
300
400 jours en culture
Délai de l’arrêt prolifératif
Contrôle Contrôle-CdK4
Les télomères atteignent la valeur critique
L’arrêt prolifératif est déclenché par p16 avant que les télomères
n’atteignent la taille critique
LHCNM2 : myoblastes
(TRFs 18-20 kb)
LHCNM2 : myotubes (D33)
Collaboration avec Woody Wright
6
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Implication de la voie p16 en pathologie
Autres populations immortalisées :
Dystrophie myotonique DM1 :
Expansion de triplets CTG dans la région non codante du gène DMPK
TRF moyens (kb)
N div max
60
Ratio p16 / Emerin
10.0
**
ns
2.0
50
7.5
40
OPMD
contrôle nouveau-né
1.5
**
30
5.0
1.0
2.5
0.5
20
10
0
Contrôle
Contrôle
DM1
33% capacité proliférative
FSH
DMD (eligible pour le saut d’exon)
Codon stop bientôt disponible
0.0
0.0
Cont-S
DM1
DM1-S
Même niveau de p16
Télomères plus longs
à l’arrêt prolifératif
à l’arrêt prolifératif
Les myoblastes DM1 s’arrètent avant les contrôles
Arrêt précoce
Ils s’arrètent avec des télomères « long »
Arrêt p16 ?
Collaborations : F. Muntoni, J. Morgan, L. SweeneyJ. Lacau St Guily, S. Périé, S. Blumen
Implication de la voie p16 en pathologie
Conclusions 1
TRF moyens (kb)
n div
10.0
60
Contrôle
DM1-CdK4
50
DM1
30
-Le vieillissement est caracterisé par une baisse du nombre de cellules satellites
7.5
Taille
critique
40
-Et par une baisse de leur capacité proliferative
5.0
2.5
20
-La sénescence (en fait l’arrêtproliferatif) perturbe le programme myogénique
10
0
100
200
300
0.0
400 jours
DM1
DM1-Cdk4
L’inhibition de p16 supprime l’arrêt précoce : Les télomères atteignent la taille critique
-
n div
DM1-hT∆
∆
175
S
MAIS
p16
150
125
GAPDH
100
- La prolifération des cellules humaines est contrôlée par l’érosion télomérique
∆ ∆5aza
La voie de stress interfère avec la prolifération et peut déclencher, au moins
in vitro, un arrêt précoce.
75
∆ : clone defectif pour p16
50
DM1
DM1-hTERT
25
0
0
100
200
300
400
jours
La voie p16 peut être activée précocemment en pathologie
hTERT seule ne peut immortaliser les cellules DM1
Le seul clone immortalisé est défectif pour p16
Les répétitions CTG pourraient générer un signal de type stress qui
déclencherait la voie p16.
Q : Quelle est l’implication de la voie p16 in vivo ?
Diminution de l’efficacité de régénération avec l’âge
Capacité proliférative
1. Facteurs environnementaux
Rongeurs
Jeune
Agé sédentaire
Agé Actif
- Greffe d’un muscle de rat âgé dans un rat jeune
- Parabiose hétérochronique souris jeune - âgée
(Carlson and Faulkner, 1989)
(Conboy et al., 2005)
l’efficacité de
régénération du
muscle âgé
P16ARNm
Dérégulation de facteurs systémiques avec l’âge:
Nombre max de divisions
Hormones, Facteurs de croissance
1. Les cellules des rongeurs sont plus sensibles au stress
2. Expression de la télomérase constitutive chez la souris
Sensibilité à l'environnement
Pas de vieillissement réplicatif
-Pas de différences dans la capacité proliférative in vitro
-Augmentation du niveau d’expression dep16
dans les cultures de sujets âgés sédentaires.
7
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Facteurs secrétés et vieillissement musculaire
Sarcopenie
•
Caractérisation du secrétome des myoblastesHumains
en différenciationin vitro
Modification du comportement avec l’age
Perte de masse musculaire (atrophie)
force
Contractions plus lente
Réponse hypertrophique à la surcharge
Jeune
Les cultures de myotubes humains
secrètent des molécules spécifiques
Injury
Soluble factors
Myoblastse
mononucléés
Cellules Satellites
Myotubes
Descendance cellulaire
°
Vieux
Fusion
Différenciation
Vieillissement
local
Viellissement de
l’environnement
Paracrine &
Autocrine
Regeneration perturbée
Maintien de la niche perturbée
•
Analyse du milieu conditionné de myoblastesdifférenciés
Pucesàanticorps, LC-MS/MS et gels 2D
couplésà la Mass spec (2DE/MS)
Dérégulation de facteurs secrétés avec l’âge?
IRM de sujets jeunes et agés
Le “secretome” des myotubes humains
Caractérisation du secrétome des myoblasteshumains
en différenciationin vitro
Les myotubes secrètent des vésicules :
exosomes et microparticules
Analyse du milieu de cellules en cours de différenciation (sans sérum)
Exosomes
4%
Microparticules
MPs
Secretées classiquement
42
666
Non classées
MPs
Exosomes
Potentiellementsecrétées
257
24
3
Soluble
Secreted
14
Secrétées sans signal
Sécretion d’exosomes et de microparticules
Qui contiennent des protéines,
Mais aussi des mRNAs et des miRNAs
NB : Ces vésicules contiennent aussi des mRNAs et des miRNAs
Modification du programme myogénique
dans les myoblastes sénescents
72H en milieu de différenciation
Expression de Myosine à 72H de Differenciation
37produitsd’expressionde gènesdétectés
Diminution de la taille des myotubes
Jeunes
Dramatique
“secretion”
16secrétésdifferentiellement ensenescence
de la
4
réprimées en Sen (comparéesàJeunes)
Impossible d’afficher l’image.
12
35
surexprimées en Senescence
**
30
25
Jeunes
Protein Secreted
D
**
20
Senescentes
15
Sen
**
10
5
Low Value
High
0
COL4
ECM
Marqueurs CTGF
de fibrose GAPDH
0
24
48
72
Time in Differentiation Conditions (H)
Surexpression dans lesfibroblastes
senescents :
The senescent secretory phenotype (Campisi, J.)
8
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Exemples de modifications de la secrétion en vieillissementprolifératif
IGFs Systems
In Vitro Analysis
Les myoblastes sénescents inhibent la différenciation in vitro & favorisent la
prolifération via des facteurs secrétés
98facteurssecrétésdifférentiellement en (pré)sénescence
Up-regulés
• Transwell co-culture
Down-regulés
S
S
Parmi les voiesmodifiées, on trouve:
Cytokines inflammatoires, ECM, IGF, protéases et
leursinhibiteurs,épuration des radicauxlibres
S
J
J
J
Differenciation
Proliferation
S
S
J
S
S
J
J
J
J
S
J
J
S
J
Les myoblastes ne sont pas tout seuls !
Stress
p16
VIEILLISSEMENT
Stress oxidatif
Capacité régénératrice
Renouvellement nucléaire ?
Sénescencecellulaire
Horlogemitotique
Modifications du secrétome
Inflamm-aging
Baisse du nombre de progéniteurs
Capacitéproliférative avec arrêtprématurépotentiel
Retard et baisse de la capacitéà se différencier
Altération du protéasome et du renouvellementprotéique (coll B. Friguet)
Augmentation du stress oxidatif et de l’oxydation des protéines (coll B. Friguet)
Modification du secrétome:Baisse du niveau de signalisation
Augmentation de remodelage de l’ECM et des cytokines inflammatoires
Comportement in vivo ?
Co-injections avec des macrophages :
Differenciationin vivo
5j in vivo
Analyses post-injection
Cryodommage
Sur le TA
+ myoblastes humains
P=0,055
précoce : 24hrs-5jours
**
tardive :1-2 mois
γc /
Alymphoide, pas de NK
RAG -/
Expression de MHC néonatale
Lamine A/C humaine (noyaux)
-
C5-
*
Detection de fibres humaines (spectrine)
Et de noyauxhumains (lamins A/C)
à l’aided’anticorps ne reconnaissant
quelesprotéineshumaines
Les macrophages pro-inflammatoires retardent la differenciation,
Les anti-inflammatoires favorisent la differenciation
9
04/02/2014
Régénération musculaire
Cellule satellite quiescente
lésion
Conclusions 2
Inflammation
Interactions cellulaires :
secretome
Cytokines, chemokines
-Les cellules musculaires en différenciation secrètent des cytokines (myokines)
-Le secretome varie en fonction de l’âge prolifératif
-Les cellules sénescentes favorisent la prolifération et inhibent la différenciation
Cellule satellite activée
Autres types cellulaires
Fibroblastes, etc
Macrophages
Facteurs secretés,
vesicules
Angiogénèse
Facteurs circulants
Innervation
Facteurs trophiques
-Les macrophages pro-inflammatoires favorisent la prolifération (cytokines)
-Les macrophages anti-inflammatoires favorisent la différenciation (cytokines)
Il existe un dialogue entre les acteurs cellulaires de la réparation,
entre autre via des molécules secrétées ou des vésicules dédiées,
qui participe à la régulation de la régénération musculaire.
10