Extraction et dosage par CLHP de la caféine contenue dans le Coca

Extraction et dosage par CLHP de la caféine contenue dans le Coca-Cola
La caféine est le composant du café et du thé qui stimule le cortex
cérébral. On trouve également la caféine dans les graines des plants de
cola d’Afrique occidentale (Cola acuminata et Cola nitida), qui sont
cultivés de façon extensive en Amérique du Sud. Des extraits de ces
plantes sont utilisés pour parfumer et ajouter une action stimulante aux
boissons du type Coca-Cola, au lieu de la cocaïne qu’elles contenaient
autrefois. (Peter Atkins : Molécules au quotidien). La solution à analyser a
été préparée selon le protocole suivant :
O
H3C
O
N
N
N
CH3
N
CH3
Dans un bécher de 600 mL placé sur un agitateur magnétique, introduire 250 mL de Coca-cola et
ajouter une solution saturée de carbonate de sodium jusqu’à pH environ 9. Agiter vigoureusement.
Ajouter 50 mL de dichlorométhane et maintenir l’agitation pendant au moins 5 minutes. Transférer le
contenu du bécher dans une ampoule à décanter. Décanter et recueillir la phase organique dans un
erlenmeyer propre et sec. Réaliser une deuxième extraction avec à nouveau 50 mL de dichlorométhane.
Décanter et recueillir la phase organique dans le même erlenmeyer que précédemment. Sécher sur
sulfate de magnésium anhydre. Filtrer la phase organique sèche et chasser le dichlorométhane à
l’évaporateur rotatif. Dissoudre la totalité de la caféine recueillie dans l’éluant – mélange
acétonitrile/eau : 70/30 (V/V) – et ajuster le volume à 20,0 mL à l’aide d’une fiole jaugée. Cette solution
est appelée solution mère : FM.
Le premier objectif de cette séance est de déterminer la concentration massique en caféine
dans la boisson, par CLHP, et ce par deux techniques de dosage différentes. Pour information, les
fabricants indiquent que la concentration est de l’ordre de 70 à 80 mg.L-1. Le deuxième objectif est
de voir quelles sont les influences de quelques paramètres (débit, température et proportion
d’éluant) sur une analyse par CLHP.
1. Mise en évidence du domaine de linéarité
L’analyse se fait sur une colonne Gemini C18 (150*4,6) 5 µm en mode isocratique avec pour
éluant un mélange acétonitrile – eau, 70/30 (V/V). La boucle d’injection est de 20 µL. La détection
se fait par barrette de diodes à 254 nm. La seringue utilisée a une capacité de 250 µL.
Q1. Se renseigner sur la signification de chacun de ces termes.
Injecter une solution étalon de caféine en CLHP et reporter dans le tableau ci-dessous la
hauteur et la surface du pic chromatographique de la caféine. Effectuer les dilutions au demi (à
50% : pipette jaugée de 10 mL / fiole jaugée de 20 mL) et effectuer les mesures de la hauteur et de
la surface. Renouveler jusqu’à avoir mis en évidence un domaine de linéarité pour un des
paramètres.
Concentration de la solution étalon de caféine (100 mL) FE0 de
concentration exacte connue et proche de 1 g.L-1 dans l’éluant :
Fiole mère
Facteur de dilution
Concentration / µg.mL-1
Hauteur de pic (H)
Surface de pic (A)
Fiole mère
Facteur de dilution
Concentration / µg.mL-1
Hauteur de pic (H)
Surface de pic (A)
4,985 g.L-1
FE0
1
FE1
1/2
FE2
1/4
FE3
1/8
FE4
1/16
FE5
1/32
3487,8
263,33
3388,6
232,75
2502,4
175,25
1738,3
98,24
873,3
50,66
443,3
25,65
FE6
1/64
FE7
1/128
FE8
1/256
FE9
1/512
FE10
1/1024
FE11
1/2048
224,1
12,57
118,7
6,87
59,6
3,46
30,3
1,78
15,2
0,95
8,6
0,63
Q2. Tracer les courbes A = f() et H = f() sur Excel. En déduire le domaine de linéarité (sans
bruit de fond). Proposer un facteur de dilution et en déduire l’ordre de grandeur du volume de solution
mère à diluer dans une fiole de 20 mL pour être dans le domaine de linéarité.
XB - ENCPB
1/6
2. Dosage de la caféine par CLHP par gamme d’étalonnage
Avant de réaliser cette dilution, vous devez faire valider votre « aptitude à la maîtrise d’une pipette
automatique » réalisée sur de l’eau sur un volume de 150 µL.
2.1. Préparation de la gamme étalon et tracé de la courbe d’étalonnage
A partir de la solution étalon de caféine (FE0), à 4,985 g.L-1, préparer une série de cinq
solutions diluées dans cinq fioles jaugées (FG1 à FG5) de 20 mL selon le tableau ci-dessous. Injecter
chacune des solutions préparées en CLHP.
Numéro de la fiole
V(FE0)/ µL
caféine dans FGi/ mg.L-1
Acaféine
hcaféine
FG1
5
FG2
10
FG3
20
FG4
30
FG5
40
0,49
7,78
0,87
14,46
1,52
26,98
2,53
42,45
4,32
72,21
Tracer les courbes d’étalonnages. Déterminer les paramètres des régressions linéaires (a, b,
c, d et coefficient de détermination) : Acaféine = a  caféine + b et hcaféine = c  caféine + d.
2.2. Dosage de la caféine contenue dans le Coca-cola
Dans une fiole jaugée de 20 mL, introduire le volume adapté (de l’ordre de 30 µL, mesuré
exactement) de solution mère (FM) et compléter à 20 mL avec l’éluant. La solution ainsi préparée est
appelée solution fille FF. Injecter en CLHP la solution fille FF.
Q3. A partir des courbes d’étalonnage, déterminer Ccaféine pour la fiole FF. En déduire la
concentration de la caféine dans la fiole mère FM puis dans le Coca-cola.
3. Dosage de la caféine par CLHP par la méthode de l’étalon interne
3.1. Préparation de la fiole étalon et injection du mélange étalon
Préparer la fiole étalon (FEEI) en y introduisant 30 µL de la solution de caféine étalon (FE0) et
150 µL de la solution d’étalon interne de concentration proche de 1 g.L-1 (FEI).
Concentration de l’étalon de
caféine dans FE0 :
Concentration de l’étalon de
caféine dans FEEI :
Concentration de l’étalon
interne dans FEI :
Concentration de l’étalon
interne dans FEEI :
4,985 g.L-1
g.L-1
g.L-1
g.L-1
Injecter en CLHP la solution FEEI. Effectuer un test de répétabilité validé en dessous de 0,5 %
et remplir le tableau ci-dessous.
tR / min
Essais
Etalon interne
Caféine
1
2
Test de répétabilité
O/N
Aiétalon
3
1
2
3
Valeurs gardées :
tR / min
%Aiétalon
h iétalon
ρiétalon / mg.L-1
Etalon interne
Caféine
XB - ENCPB
2/6
3.2. Préparation de la fiole de dosage (FFEI) et injection
Dans une fiole de 20 mL, introduire le volume adapté (de l’ordre de 30 µL, mesuré
exactement) de solution mère (FM) ainsi que 150 µL de la solution de l’étalon interne (FEI). Compléter
à 20 mL avec l’éluant. La solution ainsi préparée est appelée solution fille FFEI.
Etalon
interne utilisé :
Concentration de l’étalon
interne dans (FEI):
g.L-1
Injecter en CLHP la solution fille FFEI. Remplir le tableau ci-dessous.
tR / min
Composé
%Aiétalon
Aiétalon
ρi / mg.L-1
Q4. Montrer que :
ρcaféine = ρétalon
caféine ×
%Aétalon
%Acaféine
étalon interne
×
étalon
%Acaféine
%Aétalon interne
Q5. En déduire la concentration de la caféine dans la fiole mère FM puis dans le Coca-cola. En
déduire la masse de caféine extraite du Coca-cola.
Q6. Comparer les résultats obtenus par les deux méthodes.
4. Influence de paramètres de la chaîne de CLHP
Sur le mélange de votre choix, injecter en changeant :
1. le débit,
2. la température,
3. la proportion d’éluant.
Remplir le tableau suivant.
Mélange choisi :
Essai
Débit
/ mL.min-1
t / °C
% AcCN
tr / min
A
h
Nth
R
As
1
2
3
4
5
Q7. Conclure l’influence de chacun des paramètres.
Q8. Expliquer l’intérêt de s’intéresser à Nth, R et As.
XB - ENCPB
3/6
Feuille de résultats
NOMS :
Q1. Signification de chacun des termes
Gemini
C18
150*4,6
5 µm
mode isocratique
boucle d’injection
acétonitrile – eau,
70/30 (V/V)
Détecteur à
barrette de diodes
1. Mise en évidence du domaine de linéarité
Q2.
Domaine de linéarité
Protocole de dilution
2. Dosage de la caféine par CLHP par gamme d’étalonnage
Validé
Non validé
Aptitude à la maîtrise d’une pipette automatique
2.1. Préparation de la gamme étalon et tracé de la courbe d’étalonnage
Numéro de la fiole
V(FE0)/ µL
FG1
5
FG2
10
FG3
20
FG4
30
FG5
40
FG6
50
caféine / mg.L-1
Courbes d’étalonnages
Acaféine = a  caféine + b
a=
b=
r² =
XB - ENCPB
hcaféine = c  caféine + d
c=
d=
r² =
4/6
2.2. Dosage de la caféine contenue dans le Coca-cola
Q3. caféine (FF) =
caféine (FM) =
mg.L-1
caféine (Coca-cola) =
mg.L-1
mg.L-1
3. Dosage de la caféine par CLHP par la méthode de l’étalon interne
3.1. Préparation de la fiole étalon et injection du mélange étalon
Concentration de l’étalon de
caféine dans FE0 :
Concentration de l’étalon de
caféine dans FEEI :
Concentration de l’étalon
interne dans FEI :
Concentration de l’étalon
interne dans FEEI :
4,985 g.L-1
g.L-1
Essais
Etalon interne
1
2
3
1
2
g.L-1
Test de répétabilité
O/N
Aiétalon
tR / min
g.L-1
3
Caféine
%Aiétalon
tR / min
ρiétalon / mg.L-1
h iétalon
Etalon interne
Caféine
3.2. Préparation de la fiole de dosage (FFEI) et injection
Etalon
interne utilisé :
tR / min
Concentration de l’étalon
interne dans (FEI):
%Aiétalon
Aiétalon
Composé
g.L-1
ρi / mg.L-1
Q4.
Q5.
caféine (FF) =
caféine (Coca-cola) =
XB - ENCPB
caféine (FM) =
mg.L-1
mg.L-1
caféine (Coca-cola) =
mg.L-1
mg.L-1
5/6
Q6.
4. Influence de paramètres de la chaîne de CLHP
Mélange choisi :
Essai
Débit
/ mL.min-1
t / °C
% AcCN
tr / min
A
h
Nth
R
As
1
2
3
4
5
Q5. Conclusion sur l’influence de :
débit :
température :
proportion d’éluant :
Q6.
Nth :
R:
As :
XB - ENCPB
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