Men1 - Science Calender

Lyon, 26/11/2015
Bases et Applications de la Modélisation de Pathologies
Humaines en Utilisant les Souris Transgéniques
Chang Xian ZHANG
Cancer Research Centre of LYON
[email protected]
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2007
Mario R. Capecchi
University of Utah
Sir Martin J. Evans
Cardiff University
Oliver Smithies
University of North
Carolina at Chapel Hill
"for their discoveries of principles for introducing specific gene
modifications in mice by the use of embryonic stem cells"
The Knockout Mouse Project
The Comprehensive Knockout Mouse Project Consortium
Nature Genetics 36, 921 - 924 (2004)
Mouse knockout technology provides a powerful means of elucidating
gene function in vivo, and a publicly available genome-wide collection
of mouse knockouts would be significantly enabling for biomedical
discovery. To date, published knockouts exist for only about 10% of
mouse genes. Furthermore, many of these are limited in utility
because they have not been made or phenotyped in standardized
ways, and many are not freely available to researchers. It is time to
harness new technologies and efficiencies of production to mount a
high-throughput international effort to produce and phenotype
knockouts for all mouse genes, and place these resources into the
public domain.
The European dimension for
the mouse genome mutagenesis program
The European Mouse Mutagenesis Consortium
Nature Genetics 36, 925 - 927 (2004)
The European Mouse Mutagenesis Consortium is the European
initiative contributing to the international effort on functional
annotation of the mouse genome. Its objectives are to establish and
integrate mutagenesis platforms, gene expression resources,
phenotyping
units,
storage
and
distribution
centers
and
bioinformatics resources. The combined efforts will accelerate our
understanding of gene function and of human health and disease.
The International Knockout Mouse Consortium
Knockout Mouse Project (KOMP) (USA)
European Conditional Mouse Mutagenesis Program (EUCOMM)
(Europe)
North American Conditional Mouse Mutagenesis Project (NorCOMM)
(Canada)
Texas A&M Institute for Genomic Medicine (TIGM) (USA)
the International Mouse Phenotyping Consortium (IMPC)
International Knockout Mouse Consortium
Etat d’avancement
« Top 5000 Knocking out the druggable genome»
by Lexicon Genetics Inc
Plan
Introduction
Partie I.
Souris transgénique
Souris knock-out (conventionnel, conditionnel)
Partie II.
Knock-in, inductible, double knock-out (combiné)
Partie III.
Nos expériences
Définitions, Etapes de génération, Applications
I. INTRODUCTION
modélisation de pathologies humaines chez les souris
Nécessité
• Histoire naturelle de la pathologie
• Disponibilité des matériels
• Etude mécanistique
• Marqueurs de diagnostic
• Essai thérapeutique
I. INTRODUCTION
modélisation de pathologies humaines chez les souris
Qu’est-ce qu’un « bon »modèle ?
un modèle murin « idéal »
Hann and Balmain, Curr. Opin. Cell. Biol. 13 : 778
•
faithfully recapitulates the human disease;
•
high penetrance but low tumor number
•
short latency, allowing for tumor progression and analysis
within the relatively short lifespan of the mouse.
I. INTRODUCTION
modélisation de pathologies humaines chez les souris
Critère
• critère biologique : origine cellulaire, phénotype et progression
• critère génétique : mutation initiale, altération génomique, voie
de transduction
• critère étiologique : sensibilité vis-à-vis de facteurs environnementaux
• critère thérapeutique : accessibilité à l’essai thérapeutique
I. INTRODUCTION
modélisation de pathologies humaines chez les souris
Ethique
Expérimentation animale et éthique
une base éthique aux expériences biomédicales
mettant en jeu des animaux
3R
• Remplacer l’expérimentation animale aussi souvent que possible par les
cultures cellulaires ou les modèles informatiques;
• Réduire le nombre des animaux mis en jeu dans la mesure du possible
• Raffiner les expériences en choisissant des protocoles qui minimisent le
stress et la douleur et en améliorant les conditions d’élevage.
Bornes de l’étude expérimentale sur
les souris transgénique
1950-60: culture d’embryons in vitro,
agrégation des embryons chimères
1970 :
fécondation in vitro
1976 :
injection du virus SV40 dans l’œuf
1980 : micro-injection de l’ADN dans l’œuf
1981 :
établissement des cellules ES (embryonic stem cells)
1984 :
embryons chimères à partir des cellules ES
1987 : inactivation de gène ciblé par recombinaison homologue
(knock-out)
1989 :
knock-out conditionnel
Avantages de modèle murin
• mammifère de petite taille
nombre de chromosome
• résistance physique
38, X, Y
• reproductibilité
et développement rapide
taille du génome
2,5 Gb
durée de la gestation
durée
la vie
gènesdeestimés
âge de la maturité sexuelle
taille d’une portée
nombre
de portées à l’homme
gènes homologues
• base d’études génétiques importantes
19 - 20 jours
2,0
2,5 ans 000
25- 000-30
6(F) – 8(M) semaines
4-8
6 >- 899%
Notions élémentaires (1)
Ovule fécondé
pronucléus mâle
pronucléus
femelle
On pratique la microinjection de DNA
dans le pronucléus mâle
Notions élémentaires (2)
Formation du blastocyste murin
• cellules ES
• embryon chimère
Cellules souches embryonnaires (cellules ES)
• cellules internes issues du blastocyste
• capables de donner à naissance à toutes les cellules
de l’embryon
• peuvent être mises en culture, traitées et incorporer de
nouveaux ADN, et réintroduites dans un autre
jeune embryon de souris
a
b
c
cellules ES en culture
Notions élémentaires (3)
A
100 µM
I. Période du développement
embryonnaire
E4.5
E0.5
Stades
préimplantatoires
E7.5
Implantation
et gastrulation
E8.5
E9.5
500 µM
Organogenèse
II. Période péri-natale
B
III. Vie adulte
E11.5
E12.5
E13.5
E15.5
E18.5
3000 µM
Organogenèse
Développement foetal
Grandes étapes du développement des embryons murins entre E0.5 et E18.5
Souris Transgénique
Génération des Souris Transgéniques
Définitions
souris porteuse d’un transgène dans son génome
Etapes
Construction du transgène
Micro-injection
de transgène
dans l’ovule fécondé
production du
transgène
Introduction des ovules
microinjectés chez
les souris porteuses
Caractérisation de
transgène dans les
cellules
Identification
des « fondeurs »
Génération des Souris Transgéniques
Transgène
Construction de transgènes
Enh
P
cDNA
cDNA
DNA génomique
Enh
P
E1
Intégration de transgènes
E2
E3
E4
E5
Génération des Souris Transgéniques
Applications
Effets biologiques de l’expression transgénique
Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected
with metallothionein-growth hormone fusion genes
(Modèle murin pour l’Acromégalie)
MT-I
gène de l’Hormone de
croissance de rat
Génération des Souris Transgéniques
Applications
expression d’un oncogène pour la modélisation de cancer
Modèle oncogène
H&E
insuline
promoteur de
l’insuline de rat
Antigène-T
SV40
Génération des Souris Transgéniques
Applications
Utilisation de l’expression d’un gène toxique
Cellules A
Cellules B
?
P-X
mRNA-X
période A
promoter
tissus-spécifique
gène de la toxine A
du Diphtérie
période B
Cellules A
Cellules B
Génération des Souris Transgéniques
Applications
Utilisation de l’expression d’un gène toxique
Pedro Herrera et al. 1994,
Ablation of islet endocrine cells by targeted expression
of hormone-promoter-driven toxigenes
cellules progénitrices
endocrines pancréatiques
E10
GLU
DTA
PP
DTA
cellules endocrines
pancréatiques
E14
cellules endocrines
pancréatiques matures
α
α
α
pp
β
β
δ
δ
pp
pp
cellules progénitrices
endocrines pancréatiques
α
cellules endocrines
pancréatiques matures
α
pp
β
δ
pp
Souris Knock-out (KO)
Souris knock-out
Définitions
Invalidation de gènes ciblés par recombinaison homologue
• Ciblage et remplacement des gènes site-spécifiques
• Recombinaison homologue
Etapes:
• Construction du vecteur de ciblage
• Modification génétique de cellules ES
• Formation de souris chimères
• Obtention de souris KO homozygotes
Souris knock-out
Construction du vecteur de ciblage
Séquences à cibler + Gènes de sélection
Gène ciblé
Vecteur
de ciblage
E1
E2
E3
2 kb > bras court> 1 kb
E5
E6
DTA
E2
E4
Modification génétique des cellules ES
E1
E2
E1
E2
Intégration
non-spécifique
E7
bras long = 4-7 kb
Néo
E1
Intégration
spécifique
E4
E5
E6
Recombinaison Homologue
Néo
Néo
E4
E5
E6
E4
E5
E6
E7
DTA
Souris knock-out
Obtention des souris KO homozygotes
DTA
E2
Néo
E1
ES
G418
insertion par RH
insertion au hasard
sans insertion
ES contenant
l’allèle modifié
allèle normal
allèle modifié
Souris chimère
gamètes
embryon chimère
Souris chimère
Souris knock-out
hétérozygotes
Souris knock-out
homozygotes
Souris knock-out PTEN
Le gène PTEN, un suppresseur de tumeur, est responsable
de la maladie Cowden, Lhermitte-Duclos et
le syndrome de Bannayan-Zonana
Patients de Cowden
(mutation germinale)
Mutation somatique de
l’allèle sauvage
(LOH)
Développement des tumeurs
PTEN knockout mouse
Invalidation du gène Pten au niveau germinal chez les souris
La mutation nullizygote du gène Pten (Pten -/-) conduit
à une létalité embryonnaire précoce (7.5 d.p.c.)
PTEN knockout mouse
La différenciation In vitro est altérée dans les corps embryoïdes Pten–/–
a. Forme désorganisée
b, c. haemoglobinisation endommagée
d. expression génique altérée
Anomalies tissulaires développées chez les souris Pten hétérozygotes
a, une lésion dans le colon. b, c, Section de (a)., montrant la mucus
hyperplasique et/ou dysplasique; d, la peau avec une augmentation du
grosseur épidermique; e, la prostate ayant une hypercellularité avec figures
mitotiques f, prostate marquée avec anticorps anti-Ki-67.
Tumeurs observées les souris Pten chimères et hétérozygotes
a. colon.
b. testis
c. testis
d. thyroid
Souris Knock-out Conditionnel
Souris knock-out conditionnel
Invalidation conditionnelle de gène ciblé
par recombinaison homologue
L’invalidation de gène se fait
au niveau
niveau somatique
germinal
•• au
pendant toute la vie sans
variation
•• tampo-spacialement
spécifique
Souris knock-out conditionnel
Système Cre / loxP
- Cre recombinase (causes recombination)
•
•
•
•
famille de l intégrase,
impliquées dans la recombinaison site-spécifique
pas besoin d’autres co-facteurs
séquences codantes 1029 bp, 38 kDa
- Site loxP (locus of crossover (x) in P1)
structure du sites loxP:
ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT
TATTGAAGCATAT-CGTATGTA-ATATGCTTCAATA
Souris knock-out conditionnel
Conséquences
Excision des séquences
80 pb - 10 kb
Cre recombinase
+
Translocation intermoléculaire
+
Cre recombinase
Inversion du fragment d’ADN
A
Cre recombinase
+
A
Souris knock-out conditionnel
Système Flp - FRT
Flp – recombinase
flippase (FLP), une recombinase site-spécifique, dérivée de leuvure
FRT (Flp Recognition Target)
FRT sequence derived from the Saccharomyces cerevisiae
5’-GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC-3’ (34nt)
Principe des souris KO conditionnel
Cre recombinase
Souris « floxed »
Souris KO conditionnel
- Différentes méthodes pour introduire une
Cre recombinase tissus spécifique
• Croisement avec la souris transgénique Cre
• Infection par un virus recombinant exprimant la Cre
Introduction de la Cre recombinase tissus-spécifique (1)
Souris « floxed »
Souris transgénique Cre
+
F
F
Tissus ciblé
promoteur
spécifique
Cre
autres tissus
CRE
∆
∆
F
F
Protéine
d’intérêt
Effets ?
Protéine
d’intérêt
Introduction de la Cre recombinase tissus-spécifique (2)
Le gène APC (adenomatous polyposis coli):
gène de prédisposition aux Polyposes Adénomateuses Familiales
- son inactivation impliquée dans le stage initiale de la
tumorigenèse des pathologies associées
- souris KO classiques sans succès.
Travaux de Noda T. et al, Science 1997 278:120
Utilisation d’un adénovirus recombinant
exprimant la Cre recombinase
Travaux de Noda T. et al, Science 1997 278:120
Le vecteur de ciblage:
adénovirus recombinant exprimant la Cre recombinase
Développement de Technologie
Développement de technologie
Souris transgéniques
• grand fragment/gène de grande taille
• expression inductible
Souris Transgénique Inductible
TET-On and TET-Off
TET-Off
transactivateur
Promotor
tTA
pA
+ Dox
tTA
TET-On
Dox
Dox
tTA
tTA
(Active)
rtTA pA
Promotor
tTA
rtTA
rtTA
(Inactive)
(Inactive)
+ Dox
Dox
transgène
tTA
tetO
tTA
Dox
rtTA
TATA
transgène pA
transgène
rtTA
tetO
TATA
transgene pA
transgene
Estrogène récepteur
Promotor
inactive form
localisation in the cytoplasme
Transgene + ER pA
transgene-ER HSP
+ 4-OHT
active form
translocation in the nuclear
transgene-ER
4-OHT
Expression inductible par le biais du système Cre-loxp
promoteur
ATG
gène 1
gène 2
ARNm gène 1
Stop codon
Cre
ATG
gène 2
ARNm gène 2
Souris transgénique inductible / conditionnelle
cellules issues de
souris descendantes
Souris transgénique conditionnelle « traçage de cellules »
RosaR
GlucagonCre
Stop sequence
cellules progénitrices
endocrines pancréatiques
α
cellules endocrines
pancréatiques matures
α
pp
β
δ
pp
The cellullar origin of Pancreatic Endocrine Tumors
Transdifferentiation of α-cells into insulin-secreting cells
Control
glucagon
α-cell
glucagon
Menin
menin Dapi
x
Menin
Men1F/F-GluCre+
insulin
glu/ins cell (A1)
x
Menin
insulin
menin/Glu/Ins
x
A1
A2
A2
A1
A1
A1
A1
A2
β-cell like (A2)
3 months
5 months
The intermediate cells appeared on the basis of α–cell proliferation
The cellullar origin of Pancreatic Endocrine Tumors
Strategy:
Rosa26R-βGal mice
βGal
Stop sequence
Men1 F/F mice
3
F
F
GluCre mice
glucagon
CRE
+
pancreas
(α-cells)
other tissues
CRE
∆
∆
Menin
3
F
F
βGal
Menin
Physiopathological consequences
+ traçage cellulaire
The cellullar origin of Pancreatic Endocrine Tumors
Cell lineage tracing
Lu J, et al. Gastroenterology. 138(5):1954
glucagon
x
x
Menin insulin
Menin
GluCre+-R26R
α-cell
Men1F/F-GluCre+-R26R
β-cell
Lacz
?
glucagon
insulin
Menin
glu/ins cell
x
Menin
LacZ /Glu/Ins
x
insulin
β-cell like
All the developed lesions came from α–cells by cell-tracing
The cellullar origin of Pancreatic Endocrine Tumors
glucagon
Conclusions
proliferation
insuline
cells in
transdifferentiation
insulinomas
glucagon
glucagon
Men1
inactivation
normal
α-cells
Men1-deficient
α-cells
MafB
MafB
α-cell transdifferentiation contributes
to Men1 insulinoma histogenesis.
glucagonomas
Adult pancreatic a-cells posses the potential to
transdifferentiate into insulin-secreting cells
Lu J, et al. Gastroenterology. 138(5):1954
Développement de technologies
Souris transgéniques
• grand fragment/gène de grande taille
• expression inductible (cre-loxp)
Knock-out & Knock-in
Souris Knock-In (KI)
Souris knock-in
Construction du vecteur de ciblage
Séquences à cibler + Gènes de sélection
Gène ciblé
Vecteur
de ciblage
E1
E2
E3
2 kb > bras court> 1 kb
E5
E6
E2
E2
DTA
E3*
Modification génétique des cellules ES
E1
E7
bras long = 4-7 kb
Néo
E1
Intégration
spécifique
E4
E4
E5
E6
Recombinaison Homologue
Néo
E3*
E4
E5
E6
E7
Développement de technologies
Souris transgéniques
• grand fragment/gène de grande taille
• expression inductible (cre-loxp)
Knock-out & Knock-in
• gènes modifiés
étudier des mutants «naturels»
rôle respectif des membres d’une famille de gène
produire des anticorps «humanisés»
• gènes étiquetés
patterns d’expression
gènes chimères
knock-in
Tumor induction by an endogenous K-ras oncogene
is highly dependent on cellular context
Carmen Guerra, et al., Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Spain
Cancer Cell, 4:111
knock-in
L’effet de l’expression endogène du K-rasv12 est tissus-dépendant
poumon
testicules
cervelet
foie
rein
pancréas
peau
intestin
knock-in
Chester W et al., Nature Genetics 25, 453 - 457
Insertion of Inhbb into the Inhba locus rescues the Inhba-null
phenotype and reveals new activin functions
Activin
ligand de la voie
de transduction
TGFβ
Inhibin-βA
(Inhba)
Inhibin-βB
(Inhbb)
KO
KO
létalité néonatale
viable Inhbb
Développement de technologies
Nouvelle approche pour générer des souris KO: “mariage” entre des “souris
KO” et “souris transgéniques”.
Développement de technologies
Un nouvel outil pour la modification génomique
CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)
Cas9 (the CRISPR-associated RNA-guided endonuclease)
Développement de technologies
Souris transgéniques
• grand fragment/gène de grande taille
• expression inductible (cre-loxp)
Knock-out & Knock-in
• gènes modifiés
étudier des mutants «naturels»
rôle respectif des membres d’une famille de gène
produire des anticorps «humanisés»
• gènes étiquetés
patterns d’expression
gènes chimères
Souris double knock-out
Double knock-out
pancreatic ductal adenocarcinoma
• un des cancers humains les plus mortels: 6 mois de survie en moyenne
• diagnostique tardif sans exception
• résistance profonde aux thérapies existantes
• origine de cellules tumorales: duct pancréatique
• facteurs génétiques impliqués:
Double knock-out
Double knock-out
Depinho et al, Gene & Dev. 17:3112, 2004
Modélisation du développement et la progression
du cancer ductal pancréatique chez les souris
- génération des souris avec l’expression du KrasG12D
et la délétion du Ink4a/Arf pancréas-spécifiques
LSL-KRAS G12D
promoteur
Loxp-stop-Loxp
ATG
Ink4a/Arf
surexpression
Stop codon
pdx1Cre
flox/flox
E1a
KRASG12D
LSL-KRAS G12D
E1b
E2
E3
E3
pancréasspécifique
Ink4a/Arf
inactivation
A
B
E
F
C
G
D
H
L’expression du KrasG12D et la délétion du Ink4a/Arf
pancréas-spécifiques conduit à l’apparition du cancer de
pancréas similaire à celui observé chez l’homme
Les Néoplasies Endocriniennes Multiples de type 1
(NEM1, OMIM 131100)
Syndrome héréditaire, autosomal dominant, forte pénétrance
hypophyse antérieure (45%)
- Prolactinome
- Somatotrophinome
- Corticotrophinome
- Non sécrétant
tumeurs
non-endocrines
La perte d’hétérozygotie est souvent observée
parathyroïdes (95%)dans
pancréas endocrine (75%)
- Gastrinome
- Insulinome
- Glucagonome
- Non sécrétant
Le gène MEN1
surrénales ( 25%)
carcinoïde
thyroïde
les tumeurs de NEM1.
La
- lipome
- angiofibrome,
un suppresseur de
tumeur
- collagenome
- leiyomyome
Approche choisie pour étudier la fonction biologique du gène NEM1
Questions posées:
• Quelle est la réelle importance de l’inactivation du gène NEM1?
• Quelles sont les conséquences physiopathlogiques de cette inactivation?
Approche adoptée:
« invalidation de gène chez les souris (knock-out) »
• récapituler les événements génétiques observés chez les patients des NEM1
• établir les modèles pour étudier l’histoire naturelle de la maladie
• étudier l’ensemble des conséquences physiopathologiques de l’invalidation du gène
Objectifs
Souris knock-out Men1 classique
• rôle du gène dans le développement embryonnaire et tumoral
Souris knock-out Men1 conditionnel
• étude détaillée du processus de la tumorigenèse
Lignées cellulaires Men1 +/+, +/-, et -/- dérivées de souris
• identification des événements moléculaires et cellulaires
induits par l’invalidation du gène
Compréhension des mécanismes de la prédisposition aux NEM1
Stratégie pour générer les allèles mutants du gène Men1
G
1
X
2
3
56
BG
X
: loxP site
B/S
4
2
Neo TK
3
7
B/S
4
G
8
X
10
9
G
8
7
56
allèle
sauvage(+)
X
9
10 DTA
9
X
10
vecteur de
ciblage
recombinaison
homologue
G
1
X
2
BG
Neo TK
B/S
4
3
G
8
7
56
allèle
ciblé (T)
Cre recombinase
X
G
2
1
G
X
1
2
B/S
4
3
B/S
4
56
56
7
7
G
8
G
8
X
10
9
« floxed » allèle
(F)
X
9
10
allèle délété
(∆)
Un modèle murin des NEM1 ?
Processus de l’histoire naturelle des NEM1
Homme
Souris
NEM1 familiales
(mutation germinale)
KO Men1 hétérozygotes
(Men1+/–)
?
mutation somatique
dans les tissus endocrines
(LOH)
Inactivation de l’allèle sauvage
?
Développement de tumeurs endocrines
Développement de tumeurs endocrines?
Les souris KO Men1 hétérozygotes, un modèle pour les MEN1 ?
Développement des tumeurs chez les souris Men1+/3 age groups
Table 1: Tumor development in Men1+/+ and Men1+/T mice
8 to
1212
months
8 to
months
Organ/Tissue
Wild type
Type of pathology
(n=9)
n=9
a
1313toto1818months
months
1919toto2626months
months
Men1+/T
Wild type
Men1+/T
Wild type
Men1+/T
(n=23)
n=23
(n=12)
n=12
(n=36)
n=36
(n=22)
n=22
0/12
0/12
0/12
1/17 (5.9%)
7/17 (41.2%)
0/17
2/20 (10%)
0/20
0/20
120 Men1+/0/33
43 controls
21/33
(63.6%)
1/33 (3%)
0/5
0/5
2/20
1/20
0/6
0/6
3/17 (17.6%)
1/17 (5.9%)
(n=61)
n=61
Parathyroid
Dysplasia
Adenoma
Carcinoma
0/5
0/5
0/5
0/5
1/5
0/5
Extra-pancreactic Gastrinoma
Adenoma
Carcinoma
0/8
0/8
1/12
0/12
Pancreactic islets
Hyper/dysplasia
Adenoma
Carcinoma
0/9
0/9
0/9
15/23 (65.2%)
5/23 (21.7%)
2/23 (8.7%)
2/13 (15.4%)
0/13
0/13
13/34 (38.2%)
4/34 (11.7%)
13/34 (38.2%)
0/21
0/21
0/21
7/61 (11.5%)
12/61 (19.7%)
37/61 (60.6%)
Pituitary
Adenoma
Carcinoma
0/7
0/7
1/23 (4.3%)
1/23 (4.3%)
0/8
0/8
2/31 (6.4%)
4/31 (12.9%)
0/20
0/20
10/60 (16.6%)
12/60 (20%)
0/21
0/21
17/61 (27.8%)
11/61 (18%)
(20%)
(8.3%)
lésions hyperplasiques
(10%)
(5%)
lésions tumorales
Adrenal glands
Nodular regeneration
Adenoma
Carcinoma
0/9
0/9
0/9
2/23 (8.7%)
3/23 (13%)
0/23
0/11
0/11
Testis Leydig cells
Hyper/dysplasia
Tumour
0/5
0/5
9/12 (75%)
3/12 (25%)
1/7
0/7
Sex-cord stromal cells
Tumor
0/4
0/9
Thyroid glands
Hyper/dysplasia
Adenoma
0/9
0/9
Mammary glands
Carcinoma
N.D.
7/31 (22.6%)
4/31 (12.9%)
0/31
(14.3%)
tumeurs
endocrines
multiples
0/21
5/61
(8.2%)
5/17 (29.4%)
10/17 (58.8%)
0/9
1/9
0/5
5/16 (31.2%)
0/13
14/28 (50%)
0/23
0/23
0/12
0/12
0/36
0/36
0/22
0/22
4/61 (6.5%)
4/61 (6.5%)
N.D.
N.D.
N.D.
0/13
3/36 (8.3%)
(11.1%)
2/25 (8%)
22/25 (88%)
Les souris Men1+/T développent les tumeurs endocrines
vues chez les patients NEM1
Parathyroid
Endocrine pancreas
Adrenal gland
Pituitary
Men1+/+
nev
dis
co
int
th
me
pth
Men1+/T
th
pth
dis
1250
1250
PTH level (pg/µL)
co
1000
1000
750
750
500
500
250
250
00
Men1+/+
(n=22)
Men1+/T
(n=48)
Les souris Men1+/T développent des tumeurs folliculaires thyroïdiennes
thyroïde
Men1+/T
H&E
Men1+/+
H&E
+
T
La perte d’hétérozygotie dans ces tumeurs suggère un rôle directe de l’inactivation
du gène Men1 dans la tumorigenèse des cellules folliculaires de la thyroïde.
Génération et caractérisation des
lignées tumorales Nem1-déficientes
souris
Nem1+/-
tumeurs de
cellules de Leydig
LCT10
lignées tumorales
Nem1-déficientes
Expression reconstituée de la menin dans les lignées
Nem1 déficientes inhibe la prolifération des cellules
Invalidation conditionnelle du gène Men1 dans les cellules β
Stratégie
RipCRE
F
∆
Menin
F
îlots pancréatiques
∆
cellules β
6 months
2 months
Men1F/F-RipCre+
Men1F/F-RipCre-
Men1F/F-RipCre+
Men1F/F-RipCre+
Perte d’expression de la menin révélée par immuno-marquage
4 months
6 months
Men1F/F - RipCre-
Men1F/F-RipCre+
A.
2 months
6 months
10 months
15 months
15 months
Men1F/F- RipCre-
Men1F/F-RipCre+
Glucagon
Insulin
H&E
B.
5 months
2 months
4 months
6 months
8 months
10 months
15 months 15 months
Tumor progression is accompanied by
angiogenesis and loss of adhesion molecules
Hétérogénéité des tumeurs d’îlot
Observations
The majority of islet tumours is non funtional PanNET
PanNET display different degrees of cell differentiation
30 – 50 % of islet tumours are multi-hormonal
Some islet tumours express non pancreatic hormones
D’où vient l’hétérogénéité des tumeurs d’îlot ?
Hétérogénéité des tumeurs d’îlot
Hypothesis
PanNET heterogeneity
Cellular Origin
Tumor progression
non-endocrine,
but ductal features
Vortmeyer et al.
JCME, 2004
The cellular origin of islet-tumours
Two hypotheses
I.
glucagonome
Normal islet
menin-deficient
α-cells
II.
mixed islet tumours
Normal duct
menin-deficient
ductal progenitors
Zhuang et al., 2004
Perren et al. JCME, 2007
insulinome
α-Cell transdifferentiation ?
The cellullar origin of Pancreatic Endocrine Tumors
glucagon
Conclusions
proliferation
insuline
cells in
transdifferentiation
insulinomas
glucagon
glucagon
Men1
inactivation
normal
α-cells
Men1-deficient
α-cells
MafB
MafB
α-cell transdifferentiation contributes
to Men1 insulinoma histogenesis.
glucagonomas
Adult pancreatic a-cells posses the potential to
transdifferentiate into insulin-secreting cells
Lu J, et al. Gastroenterology. 138(5):1954
Rôle des progéniteurs pancréatiques ?
Importance of pancreatic progenitors
Men1-disruption
E12.5
E15
naissance
adulte
Timing
Development cohort
Postnatal cohort
developmental
defects
Adult cohort
Tumors
I. Importance of Men1-inactivation timing
Ongoing projet: inducible Men1-disruption in Ngn3-expressing cells
TET-O-Cre
Ngn3-KI-tTA
Ngn3 gene Promotor
- Dox
tetO
tTA
+ Dox
tTA
TATA
Cre
tTA
(active)
Dox
Dox
tTA
tTA
(inactive)
Cre
?
inducible Men1 deletion
E12.5
E15
naissance
adulte
Timing
II. Importance of Men1-inactivation timing
Ongoing projet:
Men1-disruption
E12.5
E15
naissance
adulte
Timing
Development cohort
Postnatal cohort
developmental
defects
Adult cohort
Tumors
Importance of pancreatic progenitors
The Men1 gene can be disrupted in all the islet-cell lineages
Lack of growth advantage in Men1-deficient islet cells
during developmental stages
Importance of pancreatic progenitors
Importance of pancreatic progenitors
Mutant mice develop islet tumors with special features ?
Cellules d’origine
du gastrinome pancréatique ?
Cells of origin of pancreatic gastrinoma
pancreas
Defining gastrin+ cell population in the pancreas
• Pancreatic Gastrin+ cells can be found in E12,5 mouse embryonic pancrease
• They can no longer be detected at P7
Defining gastrin+ cell population in the pancreas
4,5 % Ins+
88 % Glu+
Pancreatic Gastrin+ cells are temporary subpopulations of both α- and β-cells
Defining gastrin+ cell population in the pancreas
Men1-disruption in pancreatic gastrin+ cells
Strategy:
Men1-disruption
Glu+/Gastrin+
Ngn3+
Ins+/Gastrin+
β-cell
Pancreatic Gastrin+ lesions ?
Men1-disruption in pancreatic gastrin+ cells
Men1-disruption in Ngn3+cells
The Men1 gene can be
disrupted
in pancreatic Gastrin+ cells
Where come pancreatic gastrinomas ?
Men1-disruption in either pancreatic progenitors or insulin/glucagon-expressing cells
led to gastrinoma development
Dissection moléculaire des mécanismes
impliqués dans la tumorigénèse liée à
l’inactivation du gène MEN1
Caractérisation moléculaire des tumeurs
Modèle d’insulinome (souris conditionnelles)
Nem1F/F-RipCre+
5 mois
approche “genome-wide”
6 mois
10 mois
approche “gène candidat”
Plusieurs voies cellulaires sont dérégulées
dans les insulinomes
Insulinomes
6m
10 m
C1
Insulinomes
6m
10 m
C1
C2
I1
I2
I3
C2
I1
I2
I3
Cacybp
Unknown
Ccnt1
Ccnd3
Ccnl
Unknown
Ccnd1
Cdkn2c
Ccnf
Cdk5r
Cdk7
Ccna1
Pcee
Cdk5
Cdk5r2
Ccna2
Ccnb2
Cdkn1a
Ccnb1-rs1
Cnnm1
Unknown
Ccnc
Ccni
Cdkl2
Hmox1
Ccnd2
Ccne1
Ccnk
Cdk6
Ccnh
Cdkn2a
Cnnm3
Ccng2
Ccne2
Ccng
Cnnm4
Cdkn2d
Ptgir
Cdk2
Cdkn1c
Cnnm2
Ptgis
S100a6
Cdk4
Hmox2
Procr
I4
Tcfe2a
Esm1
Insm1
Insrr
Igfbp3
Ide
Igfbp7
Stxbp4
Igf2
Slc2a8
Irs3
Prss11
Insl6
Igfbp6
Nov
Cyr61
Ctgf
Igfbp4
Dok2
Igfals
Igfbp1
Dok1
Igf2r
Insr
Igf1
Eif4ebp1
Insl5
Igf1r
Igfbp5
Aps
Eif4ebp2
Facteur de croissance
de l’insuline
I4
Cyclines
Confirmation par RT-qPCR des gènes d'intérêt
Igf2
IGF2
Igfbp6
IGFbp6
**
IGFbp3
Igfbp3
*
Facteur de
croissance de
l'insuline (IGF)
Ccna2
**
**
cyclines
**
Ccnb2
**
Ccnd2
Molecular basis of islet-tumour development
Molecular characterisation of mouse Men1 tumours
Cdk2/4, Ccna2, Ccnb2, Ccnd2
p27/p18, ECad/Iqgap/β-Cat
normal endocrine cells
Menin Inactivation
Menin
?
Igf2, Igfbp2/3, AKT/Foxo1
endocrine-specific
factors?
tumorales
LA et al. (2004)
Fontanière et al. (2006)
Cao et al. (2008)
Yan et al. (2009)
Wang et al. (2010)
Molecular basis of PET development
proliferation
Cdk42
Ccna2
Ccnb2 Igf2
Ccnd2
p27
p18
normal endocrine cells
Menin Inactivation
Menin
MafB
MafA
βCat
Foxa2
Ins
Glut2
Dedifferentiation
Oncogene, 31:3647; ERC, 20:833; tumorales
Mol Cell Biol. 29:5477; J Pathology, Revisi
Molecular basis of islet-tumour development
MafB ectopic expression is an early event
Men1F/F-RipCre+
MafB/Glu/Dapi
Men1+/+-RipCre+
MafB/Glu/Ins/Dapi
MafB+Ins+cell (%)
100
80
60
40
20
0
2 months
4 months
2 months
4 months
4 months
Rôle du gène MEN1 dans le
développement embryonnaire ?
Rôle de la menin dans l’embryogenèse
Le gène Men1 est essentiel au développement embryonnaire chez les souris .
(létalité entre E11.5 – E13.5)
fermeture du neurotube
Les embryons Men1 nullizygotes manifestent
de nombreux défauts développementaux
coeur
foie
létalité
Men1T/T
Men1+/+
dg
rv
nt
absence de
fermeture du
tube neural
nt
dg
ivs
lv
rv
ivs
lv
hypotrophie
du coeur
diminution de la
cellularité du foie
Menin et le développement du pancréas
Bourgeon pancréatique
E12.5
Analyses histologiques
Culture de bourgeons pancréatiques
Souris Men1 +/-
Cellules ES Men1 -/-
Analyses de chimérisme
Gène NEM1 et le développement du pancréas endocrine
HE
GLUCAGON
Nem1+/+
Nem1T/T
Gène NEM1 et le développement du pancréas endocrine
Ensemble des conséquences physiopathologiques
de l’invalidation du gène ?
(Out of MEN1)
MEN1, having multi-faceted biological functions
Haematopoiesis: menin is required for both normal haematpoiesis and
oncogenic growth of MLL-transformed haematopoietic cells;
Cell 123:207; PNAS 103:1018; Mech Dev 126:517.
Adipogenesis: menin is required for PPARg expression and adipogenesis.
MCB 29:5060; FEBS L 585:3403;
Osteogenesis: menin is required for osteogenesis.
JBC 279:40267; JBC 280:4785; Dev Biol 311:524.
Myogenesis: menin inhibites myogenesis from messenchymal stem cells.
Dev Biol 332 :116
Fibrogenesis: menin is overexpressed in human liver cirrhosis
J Hepathology 44:1296
MEN1, having multi-faceted biological functions
Haematopoitic cells
Mesoderm
other stromal cells
menin
s
osteocyte
muscle cells
fibroblast
adipocyte
- interplay with
endocrine cells
- MEN1 non-endocrine
tumours
MEN1’s involvement in mouse prostate and breast cancer
Menin physically and functionnally interacts with ER.
Dreijerink et al Cancer Res, 66:4929
Prostate and breast cancer cases were found in heterozygous Men1
mice with low but substantial frequency (10%), with menin
inactivation.
Bertolino et al., Mol Endo, 17:1880;
Seigne et al., BMC Cancer, 10:395.
Men1-disruption in mouse mammary luminal cells using WapCre mice
Basal cells
menin+
Luminal cells
menin-
IHC menin
Men1F/FWapCre (3 gestations, 12 months)
Comparaison de différents types de modèle
souris
RH
expression
application
transgénique
non
surexpression
activation d’un
gène
à étudier
Knock-out
oui
inactivation
invalidation d’un
gène ciblé
Knock-in
oui
endogène et/ou
variable
variable
Problèmes existants
complexité (validation chez l’HOMME)
méconnaissances
Lâchez moi
un peu, non?!