1. Dénombrement de levures

1. Dénombrement de levures
Concepts et messages
Les microbes qui nous entourent ne sont pas toujours des pathogènes. Bien au contraire! Les petits pains ou la
tresse du dimanche matin sont des exemples bienfaisants d’utilisation de micro-organismes!
• Les levures peuvent se garder facilement
• Taille des microbes
• Travail dans des conditions stériles
• Nombre de micro-organismes
• Une levure donne lieu à une colonie
Illustration de l’expérience
0.7 g de levure
dans 10 ml
Etalement de 0.1 ml,
facteur de dilution de 10x
10-3
10-5
Les résultats
10-3
10-5
10-6
10-7
A partir de ce résultat, vos élèves peuvent estimer le nombre
de levures vivantes dans un cube de levure
2.9 x 1011 levures !!
10-6
10-7
Matériel fourni:
▪ Pipettes stériles
▪ Propipette
▪ Pipettes automatiques p200 (avec embouts)
▪ Tubes à essai (stériles)
▪ Erlenmeyer stérile
▪ Chambre Thoma ou Kova
▪ Pipettes pasteurs pour étalement
▪ Sacs pour déchets
▪ H2O stérile (pour dilution)
▪ Boîtes de Petri YPD
▪ Ethanol
Matériel non fourni:
▪ Bec bunsen
▪ Balance
▪ Cubes de levure
▪ Cuvettes pour spectrophotomètre (option)
▪ Spectrophotomètre (option)
▪ Béchers pour étalement
2. Les enzymes de restriction
Concepts et messages
Les enzymes de restriction ont comme peu d’autres
découvertes en biologie révolutionné nos approches
expérimentales. La découverte des enzymes de restriction a
permis l’essor du génie génétique et de ses applications qui
influencent notre vie au quotidien. Il n’y a pas si longtemps,
nous avons voté sur le génie génétique, et nous serons
certainement de nouveau amener à réfléchir sur d’autres
questions similaires.
• Enzymes de restriction
• Fréquence de coupure
• Séparation et visualisation des fragments
Illustration de l’expérience
Cartes de restriction des
plasmides utilisés
Le résultat
Matériel fourni:
Dans le gel il est possible de voir que l’enzyme MspI, qui reconnaît une séquence de 4
paires de bases, coupe beaucoup plus souvent que BamHI, qui coupe une séquence de 6
paires de bases.
Dans le plasmide pUC19-TIF1, un fragment d’environ 5000 paires de bases a été cloné dans
le plasmide d’origine, pUC19. Coupé par BamHI, il est possible de voir deux fragments: le
plasmide d’origine et l’insert.
･ Pipettes automatiques (p20) et embouts
･ Pipettes automatiques (p200) et embouts
･ Tubes de réaction, type Eppendorf
･ Appareils d’électrophorèse (source et cuve)
･ Bloc chauffant (37°C)
･ Tampon d’électrophorèse (TBE 1x)
･ Agarose
･ Solution de SYBR-safe
･ Enzyme de restriction BamHI
･ Enzyme de restriction MspI
･ Tampon de restriction
･ Tampon de charge
･ ADN pUC19
･ ADN pUC19-TIF1
･ Marqueur de taille
･ H20 stérile
･ Propipettes
3. Clonage d'un gène dans un plasmide
Concepts et messages
Le fait de cloner un gène consiste à l’insérer dans un vecteur
(plasmide) et de le multiplier de façon identique à volonté.
Cette technique utilise les outils de génie génétique. Elle
permet de transférer des gènes d’autres espèces dans les
bactéries et de les faire produire, par exemple des facteurs
humains à des fins thérapeutiques.
• Clonage moléculaire
• restriction, ligation
• transformation bactérienne
Illustration de l’expérience
Les résultats
Matériel fourni:
▪ P20, P200 et pointes jaunes
▪ Blocs chauffant
▪ Tubes Eppendorf stériles
▪ H2O stérile
▪ Boîtes LA-X-Gal: (ampicilline,
ampicilline+ chloramphénicol, chloramphénicol)
▪ ADN pUC19
▪ ADN pHP45-cmR
▪ Enzyme de restriction BamH
▪ Tampon de digestion (10x)
▪ ADN ligase
▪ Tampon de ligation (10x)
▪ Cellules compétentes Escherichia coli (dh5α)
▪ Bloc réfrigérant pour les enzymes
▪ Ethanol et râteau pour les étalements
4. Transformation de bactéries
Concepts et messages
Illustration de l’expérience
La transformation est un processus naturel qui contribue à
l’évolution des microbes et au transfert de facteurs de
virulences entre bactéries pathogènes
• transformation
• sélection
• bioluminescence
• résistance aux antibiotiques
Cette expérience fait partie de l’expérience 3, mais peut très
bien être utilisée toute seule pour démontrer la puissance de
sélection. Cette expérience est appropriée pour des
discussions autour des antibiotiques et de l’évolution.
Les résultats
Dans cette expérience il y a deux messages importants:
1) la puissance de la sélection
2) l’apport d’un nouveau phénotype.
Ici la sélection est énorme. Il est possible de trouver une bactérie
dans 100 millions. Ceci reflète la sélection dans l’environnement
ou lors d’une infection. Cette sélection peut être la résistance à
une substance toxique, l’utilisation d’une substance nondégradable et nocive pour l’environnement ou, hélas, l’apparition
d’une bactérie résistante à un antibiotique.
Si vous regardez les boîtes dans le
noir, vous verrez de la lumière
Matériel fourni:
Pipettes p20 et embouts stériles
Pipettes p200 et embouts stériles
Pipettes p1000 et embouts stériles
Pipettes pasteur pour étalement
Bechers pour ethanol
Microcentrifugeuse
Bain-Marie 37°C
Bain-Marie 42°C
Tubes à réaction (Eppendorf 1.5ml)
Ethanol pour étalement
H2O stérile
plasmide lux117
2 Boîtes de Petri LA
2 Boîtes de Petri LA+Amp
0.5M CaCl2 (solution 10x, à diluer dans de l'H2O
stérile)
▪ Bec bunsen
▪ Spectrophotomètre (en option)
▪ Cuvettes (en option)
▪
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▪
5. La coloration de Gram
Concepts et messages
Les bactéries peuvent être groupées en 2 catégories selon la méthode de
coloration de Gram. Cette technique a été mise au point en 1884 par Hans
Christian Gram, un bactériologiste danois. Après coloration, les bactéries Gram+
deviennent violettes alors que les bactéries Gram- apparaissent en rose.
La coloration de Gram permet de mettre en évidence les propriétés de la paroi
bactérienne, et d'utiliser ces propriétés pour les distinguer et les classifier. L’
avantage est de donner une information rapide sur les bactéries présentes dans un
produit ou un milieu tant sur le type que sur la forme.
• Coloration de Gram
• Analyses médicales
• Visualisation des bactéries
Illustration de l’expérience
Étaler et fixer le prélèvement à la chaleur
1) Coloration par le violet de gentiane. Laisser agir 1 minute. Rincer
2) Etaler le lugol et laisser agir 1 minute. Rincer
3) Décoloration (rapide) à l'alcool ~ 5 à 10 secondes. Rincer
4) Recoloration à la safranine. Laisser agir 30 secondes. Rincer. Sécher
Observer avec une goutte d'huile à immersion (grossissement x1000)
Les résultats
Matériel fourni:
Boîtes de Petri contenant diverses bactéries
Réactifs pour la coloration de Gram
Frottis de bouche
Matériel non fourni:
▪ Pissette d’H2O pour les rinçages
▪ Bec bunsen
▪ Lames
▪ huile à immersion
▪ microscope (grossissement 40 à 1000 x)
6. La rétroinhibition
Concepts et messages
Chaque cellule essaye d’économiser un maximum ses
ressources. Si un produit synthétisé par la cellule est déjà
présent en abondance sa production sera bloquée. Souvent
ce phénomène est dû à l'interaction du produit final avec un
une molécule servant comme répresseur de l'expression des
gènes de biosynthèse. Ce phénomène est dénommé la
rétroinhibition.
• l’expression des gène est régulée
Dans cette expérience, nous utilisons le fait
qu’une levure, avec une déficience dans la
production de l’adénine, a un phénotype
visible, elle devient rouge.
• phénotype/génotype
Le Résultat
Le résultat se décompose en trois parties:
Au centre autour de la pastille qui contient beaucoup d’adénine, la levure pousse aisément et reste blanche
Dans le cercle suivant, la levure a encore assez d’adénine pour pousser, mais le milieu est limité en adénine et la
levure essaye de produire de l’adénine. Un produit intermédiaire s’accumule et s’oxyde en pigment rouge
Vers l’extérieur, il n’y a plus assez d’adénine pour permettre à la levure de pousser.
Dans l’expérience à droite, une partie des levures ont été recouvertes et mises en anaérobiose. En absence d’oxygène
le pigment rouge n’est pas produit.
Matériel fourni:
･ Souche de levure ade2 (CW04)
･ Boîtes SD sans adénine
･ Solution stock d'adénine (2g/l)
･ Filtre rond
･ P200 et pointes jaunes
Matériel non fourni:
･ Spatule ou scalpel
･ Pincette
･ Etuve 30°C
･ Pipettes pasteur pour étalement
･ Ethanol
･ Béchers pour éthanol
7. Mutagenèse par l’UV
Concepts et messages
L'irradiation par les rayons ultraviolets (UV) provoque la formation de
nombreuses modifications de l'ADN et est responsable de la majorité des
cancers de la peau.
En utilisant le phénomène de la biosynthèse de l’adénine décrit dans
l’expérience 6, cette expérience met en évidence l’effet mutagène des UV. En
allant plus loin, cette expérience permet d’analyser les courbes de survies, de
visualiser le phénomène de photoréversion, de tester l’efficacité des crèmes
solaires et d’aborder les questions de révertants.
• Mutations
• Ultraviolets
• Photoréversion
• Courbes de survie
Illustration de l’expérience
Les levures sont étalées sur une boîte de pétri puis soumises à différentes durées d’irradiation aux UV
Les résultats
Matériel fourni:
• lampe UV (254 nm)
• tubes pour les dilutions
• pipettes en verre 10 ml
• propipettes
• pipettes automatique (P200) et embouts
• pipettes Pasteur pour faire des râteaux d'étalement
• béchers et alcool pour l'étalement
• lunettes de protection
• gants
• souche de levure ade2
• H2O stérile pour les dilutions
• 5 boîtes YPD sans adénine
• Facultatif :
boîtes SD sans adénine
Cure-dents stériles
Matériel non fourni:
• pipettes Pasteur pour faire des râteaux d'étalement
8. Détection de micro-organismes
Concepts et messages
• Microbiologie
Cette expérience simple permet de se rendre compte de la multitude de microorganismes avec lesquels nous vivons et sans lesquels nous ne pourrions pas vivre.
• Environnement
• Culture sur boîtes de Petri
Nous avons environs 1012 bactéries sur notre peau, 1010 dans notre bouche et 1014
dans notre tractus digestif soit 10 fois plus que le nombre de nos cellules !
• Colonies
•Moisissures
Sur notre planète, il y aurait plus de 1 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 (1 quintillion) de bactéries…
…et nous sommes quelques
6 500 000 000 (6.5 milliards) d’êtres humains !!!
Illustration de l’expérience
Il suffit simplement de contaminer (ensemencer) un boîte de Petri contenant un milieu nutritif pour micro-organismes. Pour cela
on touche directement le milieux avec les doigts par exemple, ou avec un coton-tige que l’on a frotté quelque part.
En quelques jours de jolies colonies apparaissent.
Les résultats
Doigts dans le Pétri
coton-tige frotté sur
la peau.
Les élèves d’une classe du Cycle d’orientation ont effectué
l’expérience. Voici les résultats des microbes présents sur leurs
doigts.
coton-tige frotté
dans la terre.
Matériel fourni:
• Boîtes de pétri contenant le milieu de culture
• Cotons-tiges stériles
• Boite de parafilm
• Sac jaune pour les déchets
9. Extraction et visualisation d’ADN
Concepts et messages
L’ADN est une molécule qui fascine. A juste titre d’ailleurs
puisqu’elle porte l’information génétique faisant d’un
organisme (ou d’une cellule) ce qu’il est.
Cette molécule peut-être facilement isolée et visualisée sous
forme de filaments visqueux ou de précipités.
L’ADN en chiffres
Génome humain:
6.4 milliards de paires de nucléotides
23 paires de chromosomes.
Plus de 2 mètres d’ADN par cellule !
Bactérie E. coli:
3'500'000 paires de nucléotides
1 chromosome
1.4 mm d’ADN (E. coli mesure 0.001 mm de long !).
• Extraction d’ADN
• Structure et dimension de l’ADN
Au total, l’information contenue dans le génome humain correspond à 200
annuaires téléphoniques, celle contenue dans le génome d’une bactérie
correspond à un livre de poche !
• Purification d’ADN
Illustration de l’expérience
Il existe de nombreux protocoles pour extraire simplement de l’ADN de différents organismes vivants. Les plus utilisés sont
l’oignon, l’épithélium buccale, la banane, le kiwi…
Détergent
Chaleur
Voici un exemple d’extraction
d’ADN de bactéries.
Ce protocole à l’avantage
d’être très simple et très
rapide.
La lyse des cellules est
visible
par
un
éclaircissement de la
culture.
Des bactéries (quelques milliards)
sont prélevées et transférées dans
un tube.
Les résultats
L’ADN est alors libéré des bactéries
et donne un aspect visqueux et
filamenteux à la solution.
Matériel fourni:
Pour l’extraction à partir de culture de bactéries:
• 1 culture d’E.coli
• P1000 et pointes bleues
• Ethanol
• SDS 2%
• Bloc chauffant
• tubes
De l’alcool est alors ajouté délicatement. L’ADN
étant insoluble dans l’alcool, il va former une
pelote, visible à l’œil nu.
Matériel non fourni:
L’extraction d’ADN sur les tissus peut être effectuée à l’aide
de produits vendus dans le commerce:
• Alcool à bruler
• Liquide vaisselle
• Sel de cuisine
• Filtres à café
10. La PCR
Concepts et messages
La PCR (ou réaction de polymérisation en chaine) est devenu un
outils précieux dans bien des domaines touchant la biologie. Que
ce soit dans la recherche, les analyses médicales, la systématique
ou la criminologie.
Cette technique permet d’amplifier des millions de fois un
unique fragment d’ADN.
• Polymérisation de nucléotides
• Génotypage
• Criminologie
• Electrophorèse
Illustration de l’expérience
Vérifiez que le cheveu
possède bien son bulbe
Les résultats
M : marqueur de taille. Lignes
1 à 5 : génotype de 5 individus.
Noter que l’individu 1 est
homozygote
pour
l’allèle
D1S80.C- : contrôle négatif
(sans ADN), ce contrôle permet
de vérifier l’absence de
contaminations d’ADN. P :
primers.
Matériel fourni:
• Pipettes p20 et embouts stériles
• Pipettes p200 et embouts stériles
• Gants
• Microcentrifugeuse (option)
• Bloc chauffant 95°C
• Tubes à réaction (Eppendorf 1.5ml)
• Tubes PCR (0.2 ml)
• Machine PCR
• H2O stérile
• NaOH (200 mM)
• HCl (200 mM)
• Tris-HCL pH 8.5 (200 mM)
• 2x mix PCR (comprenant la Taq DNA polymérase, les dNTPS et le tampon)
• Primers
• Agarose
• Cuve d'électrophorèse
• Tampon de migration TBE 1x
• SYBR-Safe
• Lampe de détection d'ADN (lumière bleue)
• Marqueur de poids moléculaire