FISH-CISH-DES-C Copie-2011

DES Patho moléculaire 2011
Principes et application des techniques
d’Hybridation In Situ Fluorescente
(FISH) en Anatomie-Pathologie
Christiane Copie-Bergman,
Département de Pathologie, CHU Henri Mondor,
UPEC, INSERM U955, Créteil, France
PLAN
I.
IntroductionHistorique-Définitions
II. La technique de FISH
III. Applications
I- Introduction
Rappel historique
• 19th siècle premières images des chromosomes humains
(Hansemann et al)
• 1956
• 1960
1er caryotype: 46 chromosomes (Levan et al)
Chromosome de Philadelphie et Leucémie myéloïde
chronique (Nowell et Hungerford)
• 1960-1970 Chromosomes banding: fluorochromes remplacé par
la suite par le Giemsa (bandes G et R)
• 1969
1ere hybridation in situ ADN-ARN* = cytogénétique
moléculaire (Joe Gall et Mary Lou Pardue)
• 1970-1980 développement des techniques de détection: d’abord
radioactive, fluorescence indirecte (1977), puis
couplage direct ARN/ADN à un fluorochrome (1986)
• 1990
FISH, RT-PCR, CGH, CGH array
• 2000
Puces à ADN « microarrays, transcriptome,
bioinformatique….
Définitions
Sarma & Reinberg Nat Rev Mol Cell Biol 2005
Définitions
• Cytogénétique conventionnelle
Caryotype permettant une vision globale
de l’ensemble des chromosomes
résolution de 107 pb
(culturedivisions cellulaires blocage
en métaphase étalement sur lames
dénaturation coloration bandes
spécifiques de chaque chromosome)
• Cytogénétique moléculaire
techniques d’hybridation in situ en
fluorescence (FISH)
résolution de 50kb-2Mb
métaphase
Noyaux
interphasiques
II-La technique de FISH en Anatomie
Pathologie
•
•
•
•
•
Principe
Échantillons
Sondes
Méthode
Visualisation
Principes de la cytogénétique moléculaire
en Anatomie-Pathologie
o Cytogénétique interphasique: une analyse cytogénétique par
hybridation in situ sur noyaux non mitotiques avec des sondes ADN
spécifiques de chromosomes
o Propriétés
d’hybridation
complémentaires)
de
l’ADN
(séquences
nucléotidiques
o Révélation du complexe sonde-cible, à l’aide de sondes fluorescentes
(FISH), ou chromogéniques (CISH) ou métallographiques (SISH)
PRINCIPE
SONDE
CIBLE
ADN marqué
ADN
Dénaturation Thermique
Noyaux
TAAGG
ATTCC
ADN simple brin
ADN simple brin
Hybridation spécifique
Observation au microscope
Principe de l’hybridation in situ
Speicher et al, Nature review genetics 2005
MATERIEL/ECHANTILLONS TISSULAIRES
• Empreintes tissulaires
tissu frais ou congelé
• Suspensions de noyaux
- tissus frais
- tissus congelés
- tissus fixés et inclus en paraffine
• Coupes tissulaires
- congelées
- tissus fixés et inclus en paraffine
Sondes utilisées pour la technique de
FISH
Sondes commercialisées
Directement couplées à un fluorochrome (CY3,TR,FITC) ou marquées
à la biotine ou digoxygénine (+2ème couche)
1- Sondes satellites: CEPs (« Chromosome enumeration probes »)
Sondes DNA de séquences hautement répétées.
2- Sondes spécifiques d'un locus: LSI (« Locus specific identifier »)
Détection d’anomalies chromosomiques de « nombre » ou de
structure: délétion, inversion, duplication, isochromosome,
translocation chromosomiques
Sondes « maison »
-Sondes cosmidiques ou BAC
Une séquence précise complémentaire d'un gène d’intérêt, est
insérée dans un fragment d'ADN circulaire bactérien ou cosmide.
Réplication en grand nombre dans des bactéries.
Lyse des bactéries
Extraction d’ADN
PCR du fragment d’intérêt
Contrôle de la taille sur gel .
Marquage par « Nick Translation »
Contrôles de la spécificité sur chromosomes métaphasiques
Sonde marquée
Sondes Fusion
Point de cassure
Gène A
Gène B
Point de cassure
Ventura et al,Journal of Molecular Diagnoics 2006
•
Principe
2 sondes marquées de couleurs
différentes qui s’hybrident à leur
locus respectif A et B situés sur 2
chromosomes différents
•
Permet de connaître le gène
partenaire
•
intérêt: détection de translocations
chromosomiques
Sondes “split-signal” ou “break-apart”
Gene A
breakpoint
region
Ventura et al,Journal of Molecular Diagnoics 2006
•
Principe: 2 sondes marquées (couleurs
#) qui flanquent la région des points
de cassure du gène d’intérêt
•
Détection de translocations
•
Indépendant du gène partenaire
•
Interprétation plus facile +++:
- diminue le risque de signaux « fauxpositifs »
- lecture plus facile
Méthode
• J1
- préparation des lames (3µm)
déparaffinage
prétraitement
- digestion pepsine : 10 minutes
- hybridation avec les sondes DNA
dénaturation 5min 82°C,
hybridation 14-20h 45°C
• J2
Lavages stringents, déshydratation, montage
Lecture en double aveugle
Acquisition d’images
J Hematopathol 2008, 1:119-126.
J1
1.
Méthode
Déparaffinage
- 3x5mn dans des bains de Xylène pur
- réhydratation dans une série décroissante d’éthanol
- eau courante et lavage (2SSC ou wash du DAKO)
2. Prétraitement (rompre les liaisons covalentes liées à la fixation)
- Solution de prétraitement (citrate) au Bain-Marie ou au micro-ondes
- lavages 2x3mn à température ambiante
3. Digestion protéolytique (favoriser l'accès de la sonde au noyau)
- Pepsine
- +/-10mn à 37°C puis arrêt par lavages
Conditions à adapter au type d'échantillon
Compromis entre préservation du tissus et pénétration de la sonde
J1
Méthode
Début de la technique pour empreintes et cytospins
4. Déshydratation (éviter une dilution de la sonde)
-
Bains d’alcool croissants
Séchage 20’ à l’air
5. Application de la sonde
-
Décongeler quelques minutes
déposer 10 µl par lame
Poser une lamelle 22X22
Sceller à la colle autour de la lamelle
6. Co-dénaturation et hybridation noyaux cibles et sondes sont dénaturés ensemble
-
Ex : 5 minutes à 82°C (conditions selon sonde)
Hybridation 15 à 20h à 37° ou 45°C sur plaque chauffante ou étuve ou hybridizer.
Méthode
J2
7. Lavages stringents ( Eliminer les hybridations non spécifiques)
Augmenter la température et le % de formamide du bain
ou Diminuer la concentration en sels favorisent la stringence
0,4SSC 72°C 2’
ou
2 SSC/50% formamide 37°C 2X5’
8. Déshydratation
- dans des bains d’alcool croissants
-séchage rapide à l’air
9. Montage en DAPI+ « anti-fading »
-Appliquer10 µl de milieu
-Recouvrir d’une grande lamelle
-Stockage à 4°C à l’abri de la lumière
DETECTION DU COMPLEXE SONDE-GENE CIBLE
Par Immunofluorescence directe ou indirecte
Sonde couplée à un fluorochrome
Sonde-DIG + anti-DIG/FITC
FISH double couleur
Sondes CEN 17 et HER2: amplification de HER2
Certif Patho Mol 2011
FISH Multi-couleurs
Halling et al, Human Path 2007
C.I.S.H.
Chromogenic In Situ Hybridization
Technique indirecte
http.hgv.org.au
C.I.S.H
Sonde HER2 biotinylée
+Streptavidine/Per
+DAB
Pas d'amplification du gène
amplification HER2 >10 spots
amplification HER2 avec des clusters
CISH double couleurs
S.I.S.H
Silver In Situ Hybridization
Technique indirecte
Tissu sain : 2 signaux par noyaux
Tumeur : amplification du gène HER2
Powell et al, Human Path 2007
Double marquage du gène HER2 par S.I.S.H
et de la protéine HER2 par immunohistochimie (IHC)
SISH: Amplification du gène HER2 :
« points noirs » dans les noyaux
IHC: surexpression membranaire de la
protéine HER2: marquage rouge de la
membrane des cellules tumorales
Powell et al, Human Pathol, 2007
FICTION
Fluorescence Immunophenotyping and Interphase
Cytogenetics as a Tool for Investigation of Neoplasms
Sonde fusion t(11;14)
IHC Mib1 (bleu)
Ventura et al, J Mol Diagn 2006
www.tissuemarkers.org.uk/FISH_review
Lecture des lames
Equipement
microscope à fluorescence
équipé d’une caméra et logiciel d’acquisition
et de traitement d’images
Lecture
• étape préanalytique: analyse de la lame HES +++ (qualité de la coupe,
nécrose…. et pourcentage de cellules tumorales (anti-CD20 par
exemple)
• Contrôle qualité de la technique: aspect des noyaux au
dapi)/intensité du signal/ bruit de fond
• lecture « en double aveugle »
Analyse automatisée des signaux FISH sur coupes FFPE
Logiciel Visilog 6.5 NOESIS
Rearrangement du gène c-MYC
APPLICATIONS
Maladies génétiques acquises
Cancérologie
I. Anomalies chromosomiques: de nombre ou
amplification d’un oncogène
Quelques exemples
Cancer du sein+++ recherche d’une amplification de
l’oncogène HER2
Tumeurs de vessie - monosomie du 9p21
(Tr papillaire de bas grade)
- polysomies 3, 7
(Tr de haut grade)
Lymphome de la zone marginale de type MALT
Trisomie 3, 18
Facteurs pronostiques biologiques et
moléculaires des cancers du sein
• STATUT HER2
- Oncogène HER-2 (c-erbB-2) (Human epidermal growth factor
receptor 2)
membre d’une famille de gènes codant pour des récepteurs
transmembranaires de facteurs de croissance (EGFR,
HER2, HER3, HER4)
- code pour une glycoprotéine transmembranaire dont la partie
intra cytoplasmique possède une activité tyrosine kinase rôle
dans la croissance et différenciation cellulaire
- 15-20% des cancers mammaires infiltrants sont HER2+
Récepteurs ERBB et signalisation
Hynes et al, Nature Review Cancer 2005
• La surexpression de la protéine HER2 par les cellules
tumorales
- marqueur d’agressivité: les cancers HER2+ ont un pronostic plus
péjoratif que les cancers du sein HER2- (tumeurs de haut grade,
métastases ganglionnaires, résistance à certains types de
chimiothérapie, récidive….)
- cible thérapeutique: Trastuzumab (Herceptin®)
(anticorps monoclonal humanisé) ciblant spécifiquement les cellules
surexprimant la protéine HER2
Hynes et al, Nature Review
Cancer 2005
Détection de la surexpression du gène HER2
dans les cellules tumorales
FISH/CISH
Immunohistochimie
- l’expression de la protéine HER2 est corrélée à l’amplification du gène HER2
- Détection par immunohistochimie +/- FISH, CISH
Détermination du statut HER2 par immunohistochimie
4 scores semi quantitatifs de marquage selon le nombre de cellules
marquées et le caractère continu ou non du marquage membranaire
HES
Protéine HER2
Sein normal: score 0
Carcinome: score 1
Carcinome: score 2
l’amplification doit être
prouvée par FISH/CISH
Carcinome: score 3
Détermination du statut HER2 par FISH interphasique:
Hybridation In Situ Fluorescente
Le gène HER2 est situé sur le chromosome 17 (17q12)
-Sonde centromérique CEN-17 (FITC): permet de compter le
nombre de chromosome 17 par noyaux
- Sonde HER2 (Texas Red): permet de détecter le nombre de
copies du gène HER2 par cellules tumorales
FISH double couleur
CEN 17 et HER2
Détermination du statut HER2 par CISH:
Hybridation In Situ Chromogénique
3 échantillons
tumoraux
Profil normal
2 copies HER2 (rouge) et 2
centromères CEN17 (bleu) par noyau
1
Profil intermédiaire
2
2 à 6 copies HER2 par noyau
mais rapport HER2/CEN 17<2,2
(comptage sur 40 noyaux)
= pas de véritable amplification
3
Amplification
sous forme de « clusters »
Lame Duo CISH HER2
Wolff, JCO 2007
II. Anomalies chromosomiques de structure
• Délétions (del)
17p13 (locus du gène P53) dans les tumeurs
du sein
délétion
• Inversions (inv)
2 cassures suivies d’un recollement après
inversion du segment chromosomique
• Duplications (dup)
duplication d’un segment au sein d’un même
chromosome
duplication
Anomalies chromosomiques de structure
• Isochromosomes
2 bras identiques aux 2 extrémités
(2 courts ou 2 longs)
isochromosome
• Translocations (t) chromosomiques
définition=cassure et déplacement d’un
fragment de chromosome sur un autre
chromosome
-
« spécifiques » de certaines tumeurs
« marqueur » diagnostique et évolutif
exemples: lymphomes
# méthodes de détection dont la FISH
translocations réciproque
Exemple d’applications en hématologie
Lymphome
12 000 nouveaux cas/an en
France
Atteinte privilégiée des
organes hématopoïétiques
Hétérogénéité histologique
d’importance clinique et
thérapeutique
Tumeurs chimiosensibles
(globalement 50% de guérison)
Classification OMS des hémopathies lymphoïdes
Blood 2008, 112 p4384
environ ~90 entités différentes
parmi les hémopathies matures et
immatures
chaque entité est définie à
partir de ses caractéristiques
cliniques, morphologiques,
moléculaires et cytogénétiques.
Classification OMS des hémopathies
lymphoïdes
•
3 catégories essentielles
– Lymphomes de Hodgkin
– Lymphomes B
– Lymphomes T/NK
•
lymphomes non-Hodgkiniens
Au sein des lymphomes B et T/NK
- lymphomes immatures stades précoces de la différenciation
- lymphomes « périphériques » ou matures stades plus avancés de la
différenciation
•
Pour chaque entité définition de la cellule d’origine ou contrepartie
normale reposant essentiellement sur le stade de différenciation de la
cellule tumorale
Répartition des lymphomes non Hodgkiniens
LNH B zone marginale du
MALT
8%
LNH B folliculaire
22%
LNH B de la zone
marginale
3%
autres 6%
LNH anaplasique T/nul
LNH B type LLC
2%
8%
Lymphomes T périphériques
7%
LNH B à
6%
cellules
du manteau
LNH lymphoblastique 2%
LNH B de Burkitt
Lymphome Diffus à
grandes cellules B
35%
1%
Outils diagnostiques
PRELEVEMENT
• De bonne taille +++
• Fixation au FORMOL
• Frais pour CONGELATION + ETUDE CYTOGENETIQUE
+/- CMF
ANALYSE MORPHOLOGIQUE
• HES, Giemsa
IMMUNOHISTOCHIMIE/CMF
MOLECULAIRES
• PCR, RT-PCR, PCR-Q
• Hybridation in situ
CYTOGENETIQUE
• Conventionnelle et moléculaire
• FISH interphasique
Cyclin D1
Translocations chromosomiques et lymphomes
Lymphome
translocation récurrente
Gènes
Burkitt
t(8;14)(q24;q32)
t(2;8)(p12;q24)
t(8;22)(q24;q11)
MYC/IGH
IGK/MYC
MYC/IGL
Folliculaire
t(14;18)(q32;q21)
t(3;14)(q27;q32)
BCL2/IGH
BCL6/IGH
Manteau
t(11;14)(q13;q32)
CCND1/IGH
Lymphome Diffus à grandes
cellules B (LDGCB)
t(3;14)(q27;q32)
t(14;18)(q32;q21)
t(8;14)(q24;q32)
BCL6/IGH
BCL2/IGH
MYC/IGH
Marginal zone
(MALT type)
t(11;18)(q21;q21)
t(14;18)(q32;q21)
t(1;14)(p22;q32)
API2/MALT1
IGH/MALT1
BCL10/IGH
Anaplasique
t(2;5)(p23;q35)
NPM/ALK
variants
Mise en évidence d’une translocation
• Cytogénétique conventionnelle
et moléculaire (FISH)
• Southern blot
• PCR ADN
• FISH interphasique
• mise en évidence de la conséquence d’une translocation:
- transcrits: RT-PCR (compétitive, ou quantitative)
(ex: transcrit de fusion API2-MLT, Cycline D1)
- protéine: IHC (ex: cycline D1, ALK …)
Etude comparative des différentes techniques de FISH,
IHC, PCR et RT-PCR dans le diagnostic des lymphomes du
manteau
IHC (protéine cyclin D1): 69%
RT-PCR (mRNA): 77%
PCR t(11;14): 37%
FISH t(11;14): 97%
(pourcentage de cas positifs sur les 35
cas de MCL analysés)
Belaud-Rotureau et al, Mod Pathol 2002
Sondes ADN split-signal
• Principe: 2 sondes marquées (couleur #) qui flanquent
la région du (des) points de cassure
• Détection de translocations
• Indépendant du gène partenaire
• Interprétation plus facile +++:
- diminue le risque de signaux « faux-positifs »
- lecture plus facile
Sondes « split »
FISH c-MYC
Objectif x40
Apposition ganglionnaire
Objectif x40 Zoom
Objectif x40
FISH c-MYC
Lymphome de Burkitt
BO-C18481-2
Objectif x40
Objectif x40 Zoom
Objectif x40
myélogramme
FISH c-MYC
Lymphome de Burkitt
Objectif x40
Objectif x40 Zoom
Coupe paraffine
Biopsie gastrique
fixée au formol
Révélation possible par Hybridation In Situ
Chromogénique: CISH
• Masse tumorale intracardiaque chez une
femme de 18 ans
• Histologie: lymphome à grandes cellules
Phénotype: CD20+, CD10+, MIB 100%, BCL2• CISH: réarrangement de cMYC
absence de réarrangement de BCL2
Diagnostic: Lymphome de Burkitt
BCL2
Colocalisation des 2 signaux:
absence de réarrangement
cMYC
1 signal de fusion + 1 signal bleu et un
signal rouge séparés= réarrangement
Observation 1
• Femme de 39 ans
• Douleurs abdominales depuis 3 mois
• Pas d’antécédents d’ulcère gastrique
• Examen clinique négatif
Endoscopie
Janvier 2006
ulcère de l’antre de
5x5cm
Réalisation de biopsies gastriques fixées en formol, inclues en paraffine
et coupe tissulaires de 5µm colorées par l’HES (hématéine éosine safran).
Histologie (1)
HE
Histologie (2)
HE
HE
HE
HE
Caractérisation immunohistochimique de la
tumeur (1)
CD20
BCL2
CD10
CD5
Immunohistochimie (2)
BCL6
Mib1
EBERs -
MUM1
P53
Hypothèse diagnostique
• Lymphome de Burkitt
Nécessité d’une étude cytogénétique
à la recherche d’un réarrangement de
l’oncogène cMYC
Cytogénétique du lymphome de Burkitt
t(8;14)(q24;q32)
Variants : t(2;8)(p11;q24)
Probe IGH / MYC
: 10%
t(8;22)(q24;q11) : 15%
cMYC (8q24) <-> IgH (14q32), IgK (2p11), IgL (22q11)
gain(1q), der13q, 7q
FISH interphasique
Sondes « split »
FISH Interphasique
Sonde DNA
Split-signal c-MYC
Mise en évidence d’un
réarrangement de
cMYC
c-MYC
(www.euro-fish.org)
FISH IGH
Mise en évidence d’un
réarrangement du
gène codant pour la
chaine lourde des
immunoglobulines IGH
IGH
Conclusion
• Confirmation du diagnostic de lymphome de Burkitt
avec mise en évidence dans les cellules tumorales
d’une translocation t(8;14)(CMYC-IGH)
• Prise en charge thérapeutique:
chimiothérapie : cyclophosphamide, vincristin,
prednisone, doxorubicin et methotrexate avec
injections intrathécale de methotrexate .
• Endoscopie de contrôle tous les 6 mois
• Dernier bilan en mars 2008: en rémission complète
Evolution
À 3 mois de traitement
Conclusions: FISH interphasique sur tissus fixés
Avantages
Inconvénients
• Flexibilité
• Coût
• Technique très sensible pour
détecter des translocations
sur tissus fixés d’archive.
• Nécessite un temps non
négligeable au microscope à
fluorescence pour l’analyse
des lames
• Outil très attractif et
efficace en particulier quand
une analyse CGC n’est pas
possible mais peut être
complémentaire de la CGC
• Intérêt de la CISH
• Intérêt de l’analyse
automatisée
Conclusions
• FISH interphasique avec les autres outils
diagnostiques
comme
la
cytogénétique
conventionnelle, la CGH, PCR, … est importante pour le
diagnostic et la prise en charge des patients atteints
de lymphomes
• Permet d’identifier certaines entités comme les LF
3q27/BCL6+ ou des entités provisoires définies dans
la classification OMS 2008 (BCLu) qui nécessitent
d’être mieux caractérisées
• Intérêt pour l’identification de facteurs pronostiques
dans les LDGCB (réarrangement de CMYC….)
Références
•
FISH analysis for the detection of lymphoma-associated chromosomal
abnormalities in routine paraffin-embedded tissue
Ventura et al, J Mol Diagn: (8) 141-151, 2006.
•
In situ techniques in diagnostic pathology.
Human Pathology: (38) 1104-1144, 2007.
•
Detection of three common translocation breakpoints in non-Hodgkin’s
lymphomas by fluorescence in situ hybridization on routine paraffinembedded tissue sections
Haralambieva et al, J Pathol: (198) 163-170, 2002
•
Immuno-Fluorescence in situ hybridization Index predicts survival in
patients with Diffuse Large B-Cell lymphoma treated with R-CHOP: A
GELA study. C Copie-Bergman et al, J Clin Oncol 2009, 27:5573-5579
Fishing is possible!
Remerciements
• Département de Pathologie,
Hôpital Henri Mondor, Créteil
Pr Gaulard
Pr Zafrani
Pr Leroy
Pr Allory
Maryse Baia
Nadine Martin
• Association pour la Recherche Thérapeutique,
Génétique
et
Immunologique
dans
les
Lymphomes (ARTGIL)
• PHRC