termination de la kappa-caséine B dans le lait de citerne

Analyse et interprétation des résultats de la détermination de la kappa-caséine B dans le lait de
citerne
Dr. Daniel Glauser, Suisselab SA, Zollikofen
Dr. Ernst Jakob, Institut des sciences en denrées alimentaires IDA, Agroscope, Liebefeld
Résumé
La variante B de la kappa-caséine (κ-Cn B) présente des caractéristiques plus avantageuses pour la fabrication de fromage que les variantes A et E, puisqu’elle améliore le
caillage de la présure du lait. Depuis octobre 2015, Suisselab offre la détermination du
taux de κ-caséine B dans le lait de citerne dans le cadre d’un programme comportant
trois analyses par an. Le taux de κ-Cn B est déterminé à l’aide d’un test immunoenzymatique, la méthode ELISA. Le test se base sur la détection spécifique de κ-Cn B au
moyen d’un anticorps, qui entraîne un changement de couleur sur une plaque d’essai. La
quantification se fait par l’addition d’une série de dilutions d’un standard de κ-Cn B avec
une concentration connue sur chaque plaque d’essai. Les critères de performance du test
et les exigences requises concernant le maniement des échantillons sont connus de par
les essais de validation du fabricant du test. Le test est exécuté par Suisselab SA dans
une procédure automatisée, qui a été validée par Suisselab SA préalablement au lancement du test. Tous les échantillons sont analysés en double et les résultats sont seulement validéssi les exigences du fabricant du test quant à la répétabilité sont remplies. Le
taux de κ-Cn B dans le lait est indiqué par Suisselab SA sous forme de valeur absolue en
unités mg/l. En raison d’oscillations saisonnières de la teneur en protéine du lait, les taux
de κ-Cn B mesurés devraient toutefois toujours être interprétés en rapport avec le taux
de caséine total mesuré. C’est la raison pour laquelle Suisselab SA fournit non seulement
le taux de κ-Cn B déterminé, mais également le taux de caséine ainsi que celui de κ-Cn B
par kg de caséine. Cela permet d’interpréter les valeurs mesurées judicieusement.
Principe de l’analyse sur la κ-Cn B
Le taux de κ-Cn B est déterminé à l’aide d’un test immuno-enzymatique compétitif indirect, la méthode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Cette méthode a été
développée dans le cadre d’une collaboration entre l’université de Parme et l’entreprise
Bender MedSystems. Elle est aujourd’hui commercialisée par l’entreprise eBioscience/Affymetrix. La méthode se base sur la détection spécifique de κ-Cn B moyennant
un anticorps monoclonal (1). Cet anticorps adhère à la région de la protéine dans laquelle
se trouvent les deux substitutions d’acides aminés qui distinguent la κ-Cn B de la κ-Cn A
(Ile136 et Ala148). En une première étape du test ELISA, des plaques de microtitrage
sont recouvertes de κ-Cn nettoyée et la protéine non-liée est enlevée (ill. 1, étape 1).
Ensuite, les échantillons sont placés dans les creux des plaques de microtitrage et sont
incubés avec une concentration définie d’anticorps anti-κ-Cn B (ill. 1, étape 2). La κ-Cn B
qui se trouve dans le lait entre en compétition avec la κ-Cn B liée à la plaque de microtitrage autour des sites de liaison de l’anticorps. Plus il y a de κ-Cn B dans le lait, plus le
lait absorbe d’anticorps et moins il y a d’anticorps qui adhèrent à la plaque de microtitrage. En lavant soigneusement les creux, on enlève la κ-Cn B libre avec les anticorps
adhérés. Les anticorps liés à la κ-Cn B de la plaque de microtitrage sont ensuite détectés
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moyennant l’addition d’un anticorps marqué par une enzyme (ce qu’on appelle le conjugué HRP), qui adhère à l’anticorps spécifique de la κ-Cn B (ill. 1, étape 3). Après avoir à
nouveau lavé soigneusement les creux, on ajoute un substrat coloré qui est converti par
l’activité enzymatique du conjugué et vire au bleu (ill. 1, étapes 4 et 5). Pour terminer,
on stoppe la réaction enzymatique par l’addition d’une solution d’acide sulfurique, qui
entraîne en même temps un changement de couleur du substrat du bleu au jaune. S’il y
a peu de κ-Cn B dans le lait, la couleur du creux est jaune. Si le lait contient beaucoup de
κ-Cn B, le creux reste incolore. L’intensité de la couleur est relevée avec précision par
une mesure photométrique de l’absorption, les longueurs d’onde étant définies. Pour
pouvoir maintenant déterminer exactement la concentration de la κ-Cn B dans les échantillons analysés, on ajoute une série de dilutions d’une solution κ-Cn B standard avec une
concentration connue sur chaque plaque de microtitrage. A l’aide d’une formule mathématique, on peut maintenant calculer les concentrations de κ-Cn B dans les échantillons
de lait sur la base des valeurs d’absorption des échantillons et de la courbe standard.
Ill. 1 : Déroulement du test κ-Cn B ELISA. Etape 1 : Les plaques de microtitrage sont
recouvertes de κ-Cn B. Etape 2 : Addition de l’échantillon de lait et de l’anticorps spécifique κ-Cn B. Etape 3 : Détection des anticorps liés au moyen de l’anticorps marqué avec
une enzyme (conjugué HRP). Etape 4 : Addition du substrat coloré. Etape 5 : Conversion
du substrat coloré par l’activité enzymatique du conjugué HRP, qui entraîne un changement de couleur d’incolore au bleu.
Assurance de la qualité
Le test κ-Cn B ELISA a été complètement validé par le fabricant du test, qui indique les
critères sensibilité de l’analyse, répétabilité et spécificité (tableau 1). De plus, le fabricant
fournit des informations sur la durée de conservation et la stabilité à la congélationdécongélation des échantillons. Si l’on respecte ces indications, il est assuré que le résultat de mesure ne soit pas influencé par le maniement des échantillons. Suisselab SA exécute le test ELISA sur la base des échantillons de lait du contrôle du lait dans une procédure de test entièrement automatisée. Le maniement uniforme des échantillons est assuré par les prescriptions du contrôle du lait ainsi que par les processus standardisés au
laboratoire de Suisselab SA. Basé sur le test conventionnel manuel, le test automatisé
ELISA a été validé par Suisselab SA préalablement au lancement du test. Le haut degré
d’automatisation permet d’assurer l’exécution standardisée ainsi que le flux des données
impeccable. Pour des fins d’assurance de la qualité, Suisselab SA analyse tous les échantillons ainsi que la courbe standard en double. Pour garantir la répétabilité, les valeurs
mesurées des deux analyses individuelles ne doivent pas diverger de plus de 20 % de la
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moyenne des deux analyses. Si ces exigences ne sont pas remplies, le résultat d’analyse
ne peut pas être validé. Grâce à la courbe standard sur chaque plaque de microtitrage et
à l’analyse en double de chaque échantillon, l’exactitude et la répétabilité de l’analyse
sont garanties.
Critère de performance
Indication du fabricant
Sensibilité de l’analyse
30 mg/l dans le lait non dilué
Répétabilité « Intra-Assay »
Coefficient de variation de 4.0 %
Répétabilité « Inter-Assay »
Coefficient de variation de 5.5 %
Spécificité
Pas de réactions croisées mesurables avec α-Cn, β-Cn et κCn A
Tableau 1 : Critères de performance de κ-Cn B ELISA
Interprétation des résultats
Plus il y a de vaches en lactation avec le génotype AB ou BB dans un troupeau, plus le
taux de κ-Cn B dans le lait est élevé. Le taux de κ-Cn B dépend toutefois aussi de la teneur en caséine du lait, raison pour laquelle on attend des concentrations nettement plus
élevées en fin d’automne qu’au printemps. Pour cette raison, le résultat du test ELISA
n’est pas seulement indiqué en mg de κ-Cn B par litre de lait, la teneur en caséine du lait
est également indiquée, ainsi que le taux de κ-Cn B par kg de caséine. Les deux sont des
facteurs importants pour la fabrication de fromage. La teneur en caséine du lait est directement décisive pour le rendement en fromage, alors que le taux de κ-Cn B dans la caséine influence le caillage de la présure du lait et les pertes de matière grasse dans le
petit-lait et exerce ainsi une influence indirecte sur le rendement en fromage.
Références
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Summer A, Santus E, Casanova L, Joerg H, Rossoni A, Nicoletti C, Donofrio G,
Mariani P, Malacarne M. 2010. Short communication: Characterization of a monoclonal antibody for κ-casein B of cow's milk. Journal of Dairy Science 93 (2) 796800.
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