Microscopie électronique pour la Biologie 2014_Emile Béré

Microscopie électronique en biologie
Objectif de la microscopie en biologie
Imager des structures,
Co-localiser les protéines ou certaines molécules
Acquisition In vivo
A haute résolution
Microscopie électronique
R
R= 0.61 l /nsinm
R = Limite de
résolution
Avantages et limites de la MO
M Photonique
Signal
Photons
Résolution
0.2 µm
Fixé ou
in vivo
Fixé ou
in vivo
Epaisseur
l’échantillon
1 à 50 µm
Coupe ou culture
Durée de
préparation
Quelques sec à qlq heures
Temps
d’acquisition
Quelques ms
en 2D
Immunomar
quages
Marquage et colocalisation
Milieu
Support
0.2 mm
Cheveu en MO
Air, liquide
Lame, boite de pétri
60 µm
Microsphère en MO
En fluorescence on ne voit
que ce qui est marqué
En Microscopie optique
Muscle cardiaque en coupe longitudinale
Gross . x300
En Microscopie électronique
En Microscopie photonique
X 1000
X 10000
Principe de la ME : Interaction électron-matière
LE Microscope Electronique à Transmission
MET
Microscope Electronique en Transmission JEOL 100 Kv
La Microscopie Electronique en Transmission
MO
Immunofluorescence d’une protéine de
jonction sur culture cellulaire
L’image MET la même culture
Applications du MET
Ultrastructure sur coupe de tissu vivant ou matériaux
Immunomarquage des protéines par billes d’or
Diffraction électronique
Coupe MET dans une feuille d’arabidopsis
Effet de peptides microbienne sur cellules cancéreuse
Phagocytose
Bacteries dans cellules
Coloration négative
•
•
•
Virus, proteines, molecules
Pas de coupes
Résultats rapides
Phages
APT ou AcU à
saturation dans
l’eau ou alcool
100 nm
Immunomarquage, Echantillons
Système révélateur
billes or (1 à 15 nm)
Anticorps primaire
Epitope
Antigène
Echantillon
(tissus, cellules,
virus, bactéries…)‫‏‬
Stage d'immunomarquage en M E, Toulouse le 15 mai 2010
Marquage post synaptique d’une protéine sur coupe de cellules nerveuse
LE Microscope Electronique à Balayage
MEB
Interaction électron-matière
Microscope électronique à Balayage 840A de JEOL
MO
MET
L’image MEB correspondante
Application du MEB
Image de surface cellulaire ou de matériau
Immunomarquage des protéines de surface par billes d’or
Imagerie en mode électrons rétrodiffusés
Spectrométrie X
La différence entre la peau humaine et la peau de souris
La surface d’un cheveu
humain. Notez les
plaques de kératine
qui se chevauchent comme
des écailles
20µm
Poil
Couchedes cellules
desquamentes
Poil
Chez la souris
les plaques
s’emboitent
entre elles.
Epiderme
Derme
20µm
Images de vaisseaux sanguins en
MEB et MET
MEB
MET
Pl
Gr
N
N
Gr
2µm
Culture cellulaire
Fibrocytes
Osteoblastes
Osteocyte
Osteoclaste
200µm
500µm
200µm
Œufs et larves(chenilles) du papillon blanc
500µm
Charançon perçant le grain de blé
Legionella pneumophila
traité aux peptides antimicrobienne
Les différents types de grain de pollen
20µm
20µm
Pomme de terre
Crue
Pomme de terre
cuite
200µm
Un poil de barbe coupé par
la lame d’un rasoir mécanique
Un autre poil qui a été déchiqueté
par un rasoir électrique
50µm
Cardiomyocite sur lame
de culture
Cellule sanguine de Wolbachia
Col de chemise propre
Col de chemise sale
200µm
200µm
Contraintes liées à
l’échantillon
Le plus proche du vivant (Fixé)
Ultrafin Epaisseur de coupe
Déshydraté
Surface conductrice
MET et MEB
comprise entre 60 et 70 nm
MET
MET et MEB
MEB
Etapes de préparations des échantillons pour la MET
3 jours
minimum
Culture
cellulaire
Tissu ou
Suspensions
(virus, bactéries, …)
MET
Fixation des protéines
MEB
1 jour
au mini
Fixation des protéines
Fixation des Lipides
Déshydratation
Acétone ou Ethanol
Déshydratation
Acétone ou Ethanol
Inclusion dans la résine
Appareil par contournement
du pt critique du CO2
Polymérisation
60 à 70° C dans étuve
(obtention de blocs)
CO2 liq par purges à 10°C
CO2 liq /gaz 31°C
(pt critique)
Coupes au microtome
Semi-fines ~ 1 µm Ultrafines
~ 60 à 70 nm
CO2 gaz 40°C
Dessiccation totale
Contraste
Métallisation
Observation
Observation
Prise de contact : 35 36
Compétence et savoir faire : Préparation d’échantillons biologiques
pour l’observation au MET et MEB
 Techniques classiques de fixation, déshydratation, inclusion et de coupes pour l’analyse
ultrastructurale,
 Techniques immunocytochimiques avec immunomarquage à l’or colloïdal en pré ou
post enrobage avec amplification à l’argent si nécessaire.
 Coloration négative de macromolécules et de fractions cellulaires
 Réalisation de coupes fines suivi du contraste
 Métallisation et dessiccation par contournement du point critique.
 Observation aux microscopes MEB et MET.
 Collecte des résultats sous forme fichiers numériques
 Enseignements et formations
Nouvelles techniques microscopie
Electronique
AMW (Automatic Microwave Tissue Processor)
Techniques à froid : cryofixation-cryocoupeCryo-MET –cryo-transfert pour le MEB
Tomographie électronique
MEB 3 view
Microscopie à balayage environnementale