Chapitre I - Institut de Chimie des Substances Naturelles

Olivier LAPRÉVOTE
SPECTROMÉTRIE DE MASSE ORGANIQUE ET BIO-ORGANIQUE
- 2001 –
O. Laprévote, Directeur de Recherche, Laboratoire de Spectrométrie de Masse, Institut de Chimie des
Substances Naturelles, UPR CNRS 2301, avenue de la Terrasse, 91 198 Gif-sur-Yvette cedex,
[email protected]
2
INTRODUCTION
Parmi les différentes méthodes d’analyse structurale utilisées en Chimie organique, la
spectrométrie de masse présente l’originalité de s’adresser à des substances analysées en phase
gazeuse et non en phase condensée comme la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) ou la
cristallographie par diffraction des rayons X.
Cette particularité conditionne la plupart des paramètres expérimentaux qui vont être mis en
œuvre lors d’une analyse par Spectrométrie de Masse, notamment ceux qui sont impliqués lors de la
phase d’évaporation de l’échantillon.
Par ailleurs, toutes les techniques de Spectrométrie de Masse font appel non aux espèces
moléculaires en tant que telles mais aux entités ioniques qui en proviennent. Tous les procédés de
Spectrométrie de Masse reposent en effet sur les déplacements de particules chargées dans des champs
électromagnétiques. Cela nécessite donc, pour que l’analyse d’une substance organique soit réalisable
en Spectrométrie de Masse, une étape préalable d’ionisation de l’échantillon.
L’objet analysé en Spectrométrie de Masse correspond par conséquent à un flux gazeux
ionique généré à partir des molécules introduites dans le spectromètre. Il est à noter, comme
conséquence de ce qui précède, que la Spectrométrie de Masse est une méthode d’analyse destructrice,
l’échantillon ne pouvant être recouvré après analyse.
De façon très classique, un spectromètre de masse se compose de trois parties distinctes :
Une source d’ions, enceinte au sein de laquelle les ions sont formés à partir de l’échantillon vaporisé ;
un analyseur dont l’objet consiste à mesurer, pour chacune des espèces ioniques issues de la source
d’ion, le rapport entre sa masse (m) et sa charge (q). De façon conventionnelle, ce n’est pas la valeur
de la charge (q) qui est utilisée mais plutôt la valeur absolue du nombre de charge (z). Les ions se
voient donc attribuer une valeur m/z caractéristique qui s’exprime en «Thomson» (Th) ;
un détecteur qui mesure, en fonction des différentes valeurs de m/z, l’intensité de signal (I) qui leur
correspond.
Le spectre de masse montre donc la variation du courant ionique détecté en fonction de m/z.
Intensité
IA
IB
IC
Dans l’exemple présenté, la valeur de z
correspond à l’unité. Ce n’est pas toujours le
cas. Les valeurs d’intensité sont souvent
indiquées par référence au pic le plus intense
de la gamme de masse présentée (pic «de
base») auquel est attribué l’intensité relative
100 %
De nombreuses techniques d’ionisation,
d’analyse et de détection ont été développées.
mC/z
mA/z
mB/z
Le choix de la méthode à mettre en œuvre est
donc particulièrement important. Plusieurs
paramètres sont à prendre en compte, en particulier les propriétés physico-chimiques du produit à
analyser, la quantité d’échantillon disponible et, surtout, le type d’information que l’on attend du
spectre (poids moléculaire, information de structure, formule brute, etc …).
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CHAPITRE I
L’IONISATION
I . 1 Méthodes d’ionisation conventionnelles « directes »
I . 1 . A Ionisation électronique
I . 1 . B Ionisation chimique
Ces techniques sont chronologiquement les premières à avoir été utilisées à des fins d’analyse
structurale, l’ionisation électronique précédant l’ionisation chimique. Bien qu’anciennes, elles
demeurent encore répandues même si leur part se réduit progressivement.
Elles font toutes deux appel à une évaporation des échantillons par effet thermique associé au
vide imposé à la source d’ions. Le substrat est introduit dans la source après avoir été déposé dans un
creuset, sur une céramique ou un filament (tel quel ou après une solubilisation préalable). La source
d’ion IE/IC peut également être couplée à la sortie d’une colonne de CPG, auquel cas l’échantillon
pénètre dans la source en phase vapeur.
.
M + e- → M+ + 2 e-
I . 1 . A Ionisation électronique (IE)
filament
ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ
70 V
électrons
repousseur
vers
l’analyseur
ions
molécules
V0
cathode (trappe)
Un filament porté à haute température (2000°C) par passage d’un courant émet des électrons
qui peuvent être accélérés par une certaine différence de potentiel. L’énergie cinétique des électrons
est un paramètre important de l’ionisation électronique qui influe aussi bien sur le rendement de
l’ionisation que sur l’énergie d’excitation moyenne des ions formés. On considère ainsi que le
rendement d’ionisation (section efficace) optimal est atteint aux alentours d’une énergie de 70 eV.
Dans le cas où les phénomènes de fragmentation seraient trop nombreux (lorsqu’ils amènent à une
diminution trop importante de l’intensité du pic moléculaire), il est possible de réduire l’énergie des
électrons. Cela conduit souvent à la formation d’espèces moléculaires plus stables qui auront donc
moins tendance à fragmenter.
Les électrons, après avoir traversé le volume de la source sont captés par une cathode (appelée
“trappe”) alors que les ions formés par impact des électrons avec les espèces moléculaires sont
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expulsés de la source par un repousseur porté à un certain potentiel de même signe. Ils sont ensuite
accélérés, à l’interface de la source et de l’analyseur, par une différence de potentiel V0.
Dans la source, l’ion formé possède une certaine énergie (principalement vibrationnelle) due
au processus d’ionisation: c’est l’énergie interne qui peut donner lieu aux diverses réactions de
fragmentation. Celles-ci se produisent en fonction des données thermodynamiques et cinétiques
correspondant aux différents processus envisageables (ruptures simples ou réarrangements). Lorsque
l’énergie interne est assez importante, les ruptures simples peuvent être très abondantes alors qu’à un
niveau plus faible, les ruptures avec réarrangement peuvent dominer le spectre (voir Chapitre III).
L’intérêt de l’IE réside d’une part dans sa sensibilité (on forme 1 ion pour 1000 molécules
présentes) et d’autre part dans l’importance du phénomène de fragmentation qui est une source
d’informations structurales
précieuses. L’absence fréquente du pic moléculaire (c’est à dire le pic
+.
correspondant à l’ion M ) reste malgré tout un inconvénient majeur de cette méthode.
L’ionisation électronique s’adresse à des composés suffisamment volatils, apolaires et stables à la
chaleur pour que l’évaporation puisse avoir lieu sans pyrolyse. Il s’agit encore d’une majorité
des composés issus de la Chimie organique.
I . 1 . B Ionisation Chimique (IC)
La source IC est similaire à la source IE, seules sont modifiées ses conditions d’utilisation (on
commercialise le plus souvent des sources « duales » IE/IC). L’ionisation se produit par interaction
entre des ions réactifs, préparés eux-mêmes par ionisation électronique, et les molécules de
l’échantillon.
Þ introduction d’un gaz réactif (ammoniac, méthane, isobutane, …)
Þ "haute pression" dans la source d’ions (jusqu'à 10-1 à 1 mbar)
Le gaz réactif, sous sa forme protonée GH+, se comporte essentiellement comme un acide de Brönsted
vis à vis de la molécule. Il se produit donc une réaction de protonation de celle ci via un complexe ionmolécule intermédiaire (= solvatation du proton) qui peut apparaître sur les spectres.
Exemple:
Première étape: formation de l'ion réactif (ammonium) par ionisation électronique du gaz (ammoniac)
NH3 + e-
→
.
NH3+ + 2 e.
NH3+ + NH3
.
→ NH4+ + NH2
Deuxième étape: protonation de la molécule M par l'ion ammonium
M + NH4+
Pics observés →
m/z 18
→
(M …..H….. NH3)+
m/z M+18
→
MH+ + NH3
m/z M+1
Lorsque l'on utilise un gaz réactif GH+, la réaction qui se produit avec la molécule M peut s'écrire de la
façon suivante:
M + GH+ → MH+ + G
Cette réaction, correspondant à la différence des deux réactions suivantes, ne se produit que si elle est
exothermique:
∆H°G = APG
GH+ → G + H+
MH+ → M + H+
∆H°M = APM
Les enthalpies de ces deux réactions s'appellent "affinités protoniques" respectivement du gaz et de la
molécule à analyser, elles correspondent au terme enthalpique de la basicité en phase gazeuse.
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La réaction de protonation aura lieu lorsque APG < APM
Concrètement, on choisira un gaz réactif adapté à la molécule étudiée (de plus faible AP), en général
dans le but de limiter les phénomènes de fragmentation.
GAZ REACTIF
H3+
4
CH5+
H3O+
5
6
7
(CH3)3C+
8
NH4+
9
(AP kJ.mol-1)
alcools
éthers
aldéhydes
cétones
acides
esters
amines
L'IC s'adresse à des composés aussi volatils, apolaires et stables à la chaleur que l'IE (évaporation
initiale de l'échantillon). Ces composés doivent être susceptibles de se protoner (présence
d'hétéroatomes). L'IC complète l'IE en cela que les espèces formées sont plus stables. Elle s'applique
donc tout particulièrement aux produits qui fragmentent trop abondamment en IE.
I . 2 Méthodes d’ionisation dites "douces" ou "indirectes": désorption/désolvatation d'ions
I . 2 . A Désorption sous ionisation chimique (DIC; DCI)
I . 2 . B Désorption Laser assistée par matrice (MALDI)
I . 2 . C Bombardement par des atomes ou des ions rapides (FAB; LSIMS)
I . 2 . D Electronébulisation (Electrospray, ESI)
Dans le cas de l'IE et de l'IC, l'ionisation des composés est réalisée en phase gazeuse, c'est à dire après
la volatilisation de l'échantillon sous l'effet conjugué du vide et de la chaleur. Il faut donc disposer de
techniques complémentaires pour parvenir à l'ionisation des composés polaires, peu volatils ou
thermiquement fragiles qui peuvent être dégradés par pyrolyse.
Ce problème est d'autant plus sérieux que les molécules polaires dont il s'agit appartiennent à des
familles structurales dont l'importance est considérable en chimie ou dans les sciences de la vie:
oligosaccharides, peptides et protéines, acides nucléiques, complexes supramoléculaires, etc…
Pour transférer ces substances en phase gazeuse, le moyen envisagé peut consister à fournir beaucoup
d'énergie aux molécules de l'échantillon dans un temps suffisamment bref pour que les dégradations
thermiques n'aient pas le temps de se produire. Cela revient à provoquer une évaporation des
molécules ionisées pendant le processus d'ionisation lui-même. Ce phénomène d'ionisation et
d'évaporation simultanées avec un transfert rapide d'énergie s'appelle la désorption. L'énergie
d'ionisation peut être apportée à l'échantillon par différents vecteurs: un chauffage rapide (DCI), des
photons (MALDI), un bombardement de particules (FAB, LSIMS).
Une autre approche consiste, à partir d'une solution aqueuse, à désolvater progressivement
l'échantillon ionisé en solution. C'est le principe de base de l'électronébulisation.
I . 2 . A Désorption sous ionisation chimique (DIC; desorption/chemical ionisation DCI)
Le procédé est identique à l'IC à cela près que l'échantillon est déposé en solution sur un filament.
Après évaporation du solvant, il est introduit dans la source où règne une certaine pression de gaz
6
réactif. Un chauffage rapide du filament conduit à l'évaporation de l'échantillon et à son ionisation par
le gaz réactif avent que les phénomènes de pyrolyse n'aient eu lieu. Les gaz réactifs utilisés sont les
mêmes qu'en IC conventionnelle.
Cette méthode fournit, en mode positif, des molécules protonées MH+ et des adduits [MGH]+
susceptibles (ou pas) de se fragmenter. De même que l'IC, la DCI peut être utilisée en mode négatif.
I . 2 . B Désorption Laser assistée par matrice (Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionisation
MALDI)1
Cible MALDI permettant le dépôt de 384
échantillons
Cette technique fait appel à une matrice solide
aromatique (ac. Α-cyanocinnamique, sinapinique, 2,5dihydroxybenzoïque, etc…) dans laquelle est dispersé
l'échantillon (104 molécules de matrice pour une
d'échantillon,
l'ensemble
étant
cocristallisé).
L'irradiation laser se traduit par une excitation
électronique et thermique des molécules de matrice qui
peuvent céder des protons à l'échantillon, conduisant
ainsi à son ionisation. La matrice sert donc de vecteur
d'énergie entre le faisceau laser et la molécule
d'échantillon. Couplée à un analyseur à temps de vol, la
désorption laser assistée par matrice est une méthode de
choix pour l'étude de composés de haute masse (voir
chapitre V).
I . 2 . C Bombardement par des atomes ou des ions rapides (Fast-Atom Bombardment FAB; LiquidSecondary Ion Mass Spectrometry LSIMS)
L'échantillon est dissout dans une matrice liquide à faible tension de
vapeur, susceptible de céder des protons (glycérol, thioglycérol, alcool
meta-nitrobenzylique). Dans le cas du FAB, des atomes accélérés à
près de 10 KeV (Xe, Ar, Kr) bombardent la solution d'échantillon. Il
s'agit d'ions Cs+ (20-30 KeV) dans le cas de la LSIMS.
Sonde FAB (JEOL). La
goutte de matrice est
nettement visible.
Les mécanismes initiaux qui conduisent à la protonation de
l'échantillon seraient, au moins pour une part, de nature radicalaire, de
façon analogue aux processus rencontrés en ionisation chimique.
Outre les molécules protonées ([M+H]+), FAB et LSIMS conduisent
aussi, en mode positif, à la formation de molécules cationisées telles que [M+Na]+, ce qui se traduit
par un accroissement de 22 Th par rapport à la valeur de m/z attendue pour l'ion [M+H]+. Ceci peut
constituer une gêne lorsque le composé est inconnu et que l'ion [M+Na]+ est accompagné par un ion
[M+2Na-H]+. En cas de doute sur le poids moléculaire, il peut être utile de passer en mode négatif, de
changer les propriétés de la matrice ou encore de lui additionner un autre cation alcalin (par exemple
Li+).
FAB et LSIMS ont joué un rôle très important en Spectrométrie de Masse. Ces techniques ont en effet
permis d'apporter des solutions à de nombreux problèmes de séquençage de peptides. L'utilisation de
matrices peu volatiles permet la production d'ions pendant plusieurs minutes, ce qui rend possible
l'accumulation de spectres et par voie de conséquence, accroît la sensibilité. Cela, ajouté à la stabilité
des espèces protonées fournies avec un bon rendement, est très utile pour les études en MS/MS.
1
M. Karas et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 28 (6), 760 (1989)
7
Les défauts de ces méthodes sont liés à la présence de pics de matrice qui apparaissent sur les spectres
de masse et augmentent le "bruit chimique". Par ailleurs, l'ionisation se produisant à la surface de la
goutte de matrice, elle est sensible au caractère hydrophile ou lipophile de l'échantillon. Ce problème
est d'autant plus important que l'on étudie des composés en mélange. Certains produits, même
majoritaires, peuvent ne pas apparaître sur les spectres au profit de substances minoritaires ou
d'impuretés dont l'activité de surface serait supérieure (effet de suppression spectrale).
Impureté
Pic de matrice
Spectre LSIMS d'une saponine. Matrice: m-NBA + LiI
I . 2 . D Electronébulisation (Electrospray Ionisation, ESI)
Jusqu'en 1987, la limite de poids moléculaire des composés analysables par spectrométrie de masse ne
dépassait pas 35 000 Daltons dans les cas les plus favorables (252Cf-PDMS). Depuis 1988, date à
laquelle elle est apparue, la technique d'électronébulisation (electrospray) permet l'analyse en routine
de protéines de masse supérieure à 100 000 Da.
L'electrospray repose sur l'introduction d'une solution aqueuse du composé à analyser par un capillaire
très fin porté à haut potentiel. Cette tension crée des charges dans la solution et, au sortir du capillaire,
un nébulisat ("spray") de fines gouttelettes (1 µ) est formé, favorisé par une nébulisation pneumatique.
Dans la source à pression atmosphérique, ces gouttelettes rencontrent un flux d'azote chaud à contrecourant qui conduit à l'évaporation progressive du solvant. Le premier effet en est la diminution de la
taille de la gouttelette ainsi que, corrélativement,
l'augmentation de la densité de charges au sein de
la solution. Lorsque la répulsion coulombienne
excède la tension superficielle de la gouttelette,
celle-ci explose en formant des gouttelettes de
seconde génération, beaucoup plus petites. Après
plusieurs étapes de désintégration, la densité de
charge dans la gouttelette devient telle que le
champ électrique local, très intense, conduit à la
désorption des ions par effet de champ. Cela se
traduit par la production d'ions en phase gazeuse,
physiquement intacts et pouvant porter plusieurs
charges en raison de l'attachement de protons aux
sites basiques des molécules.
L'interface entre source et analyseur de masse est
Source electrospray (Sciex)
réalisée par une série de lentilles (cône
8
d'échantillonnage, "écumoire" ou skimmer) qui réalise, d'une part, la désolvatation complète des ions
et, d'autre part, leur activation par collision, phénomène que l'on peut mettre à profit pour obtenir des
ions-fragments et donc des informations de structure. La région d'activation se situe, sur le schéma de
source ci-dessous, entre le cône d'échantillonnage (Sampling cone) et l'écumoire (Skimmer). Le
potentiel du skimmer étant fixe (dans le cas présent, la valeur de 4000 V est adaptée au couplage avec
un spectromètre magnétique), il suffit d'augmenter le potentiel variable du sampling cone pour
favoriser les fragmentations.
5000 V
4000 V
4000-4240 V
8000 V
N2
Ion intact
Fragment
Capillaire
Sampling
cone
Contre-électrode
Skimmer
P intermédiaire (10-3 mbar)
P atm.
Vide
Schéma général de la source electrospray dite "pepperpot" (Micromass, Manchester, UK).
Dans le cas des séries d'ions multichargés rencontrées avec les protéines, le calcul du poids
moléculaire s'effectue à partir des différentes valeurs de m/z rencontrées sur le spectre de masse,
chaque pic différant de son voisin, à masse m constante, par son nombre de charge z associé au
nombre de protons correspondant. Un calcul simple permet ensuite à l'ordinateur de tracer un spectre
fictif, dit de "déconvolution", montrant le pic qui correspondrait à la molécule M neutre. Le nombre de
charges est parfois tel que, même pour des protéines de grande taille, les valeurs de m/z obtenues
entrent dans le domaine de masse des spectromètres conventionnels tels que les quadripôles.
10+
757
7566
11+
689
9+
842
8+
946
7+
1082
m/z
Spectre de masse electrospray d'une protéine (en rouge: nombre de charge z, en bleu: valeur de m/z, en insert,
déconvolution du spectre).