3. dénombrement en milieu solide (masse, surface)

Chapitre
3
COURS
Dénombrement d’une flore
d’un produit microbien
1. Dénombrement après filtration sur membrane
56
2. Dénombrement en milieu liquide
58
3. Dénombrement en milieu solide (masse, surface) 60
FICHE
TECHNIQUE
ACTIVITÉS
4. Dénombrement par observation directe
65
N°1 Diagnostic d’une infection urinaire 68
N°2 D
énombrement des E. coli dans une préparation
à base de viande71
N°3 Dénombrement des entérocoques dans une eau
73
N°1 La filtration d’un liquide
76
Les objectifs du
programme
Pour approfondir les méthodes
de dénombrement vues en classe
de première, l’étude visera les
caractéristiques essentielles
des différentes méthodes de
dénombrement et les paramètres
qui les différencient.
Chapitre 3
Dénombrement d'une flore d'un produit microbien
Le terme « dénombrement d’une flore » signifie que
l’analyse microbiologique doit permettre de quantifier dans l’échantillon une flore particulière. Le résultat
d’une telle analyse quantitative est rendu sous forme
d’une concentration en micro-organismes (appartenant
à une flore particulière) par unité de masse ou de volume
d’échantillon.
Les échantillons peuvent correspondre :
-- à des bioproduits, à de l’eau, pour un dénombrement
de :
·· flore test d’hygiène générale (Flore Mésophile Aérobie Totale),
·· flore témoin de contamination fécale (coliformes
totaux, coliformes thermotolérants, E. coli, Entérocoques, spores de bactéries anaérobies sulfito-réductrices,…),
·· flore pathogène (Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Candida albicans, Legionella pneumophilia,
Listeria monocytogenes…) ;
-- à des prélèvements issus de l’environnement (air, sol)
pour un dénombrement des micro-organismes saprophytes (bactéries, levures, moisissures) ;
-- à des ferments contenant des micro-organismes utiles,
permettant la transformation d’une matière première
en produit alimentaire fini :
·· Saccharomyces cerevisiae (levure de bière) et fabrication
de la bière à partir d’un moût obtenu principalement
à partir d’orge germé,
·· Streptococcus salivarus subsp. thermophilus, Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus et fabrication du yaourt à
partir du lait.
Il existe de nombreuses méthodes de dénombrement.
Les méthodes directes
Certaines nécessitent une culture réalisée dans des
conditions d’incubation adaptées aux exigences de la
flore dénombrée (temps, température, atmosphère) et à
l’aide d’������������������������������������������������
un milieu adapté �������������������������������
à ses �������������������������
exigences nutritives (milieu pouvant en plus être sélectif et discriminatif ). La
culture peut se faire sur différents types de milieux :
-- sur milieu solide (milieu gélosé) :
·· dénombrement dans la masse (avec ou sans double
couche),
·· dénombrement en surface (boîte de Petri classique ou
boîte contact). Cette technique a été automatisée par
la société Intersciences qui a développé un ensemenceur en surface Spiral® (cf.
p. 64),
·· dénombrement après culture sur un filtre ayant
permis une concentration des micro-organismes
(échantillons peu concentrés en micro-organismes)
puis déposé sur un milieu gélosé.
Il existe des supports alternatifs aux supports traditionnels comme le PetrifilmTM ou les lames gélosées ;
-- en milieu liquide (notamment méthode du Nombre le
Plus Probable-NPP). La méthode traditionnelle avec
culture en tubes à essais peut être miniaturisée (culture
en microplaques, cf.
p. 63).
D’autres méthodes directes ne nécessitent pas de mise
en culture :
-- estimation de la biomasse ou du nombre de cellules par
unité de volume par mesure du trouble d’une culture
(ou d’une suspension) en milieu liquide (opacimétrie,
turbidimétrie) (cf.
p. 57) ;
-- cytométrie :
·· manuelle : dénombrement en hématimètre, associé
ou non à une estimation de la viabilité des microorganismes,
·· automatisée : cytométrie de flux (cf.
p. 67).
Les méthodes indirectes
Elles associent le résultat de la mesure d’une activité biochimique à un nombre de micro-organismes :
dénombrement par ATP-métrie (cf.
p. 57).
1. DÉNOMBREMENT APRÈS FILTRATION SUR MEMBRANE
Dans certains produits liquides (eau, solutés pharmaceutiques buvables ou injectables...), les micro-organismes
sont à une concentration très faible (voire nulle si le produit est stérile). Leur dénombrement (rendu en UFC
par unité de volume) impose donc de « concentrer les
micro-organismes » pour pouvoir compter des colonies.
Cette « concentration » se fait grâce à la filtration d’un
grand volume de produit sur une membrane retenant les
micro-organismes.
1.1. Matériel nécessaire
Les différentes étapes d’un dénombrement par une technique de filtration nécessitent l’utilisation d’un matériel
spécifique.
56
1.1.1. Une membrane filtrante
La membrane filtrante (document 1 ) a des pores d’un
diamètre de 0,45� µm���������������������������������
�����������������������������������
dont la disposition selon un réseau en trois dimensions permet de retenir à sa surface
les bactéries. En effet le diamètre des pores du filtre est
inférieur à celui des bactéries classiquement rencontrées.
Il existe aussi des membranes de porosité de 0,22 µm
pour retenir les bactéries les plus petites, des bacilles
très fins qui pourraient se faufiler dans le maillage de la
membrane de 0,45 µm (cas de Pseudomonas aeruginosa)
ou encore des spores.
1 Membrane filtrante et aspect microscopique du réseau tridimensionnel d’une membrane de cellulose
Mesure du trouble et estimation de la biomasse ou du
nombre de cellules par unité de volume
Le trouble d’une suspension microbienne (bactéries, levures) est proportionnel à la biomasse présente
dans la suspension. Cette technique ne distingue pas la biomasse morte de la vivante, mais son intérêt
principal est sa rapidité et sa facilité d’application. La mesure peut se faire à l’aide d’un spectrophotomètre en assimilant l’absorbance mesurée entre 600 et 650 nm à celle du trouble.
Ce principe est également celui de la méthode des étalons de MacFarland (solutions troubles obtenues
traditionnellement par précipitation de sulfate de baryum).
On peut comparer visuellement le trouble d’une suspension microbienne à celui d’un étalon artificiel
pour en estimer sa concentration. En effet, le trouble développé par chaque étalon est assimilable à une
concentration bactérienne selon le tableau de correspondance suivant :
Étalon McFarland Numéro
0,5
1
2
3
4
Chlorure de Baryum à 1 % (mL)
0,05
0,1
0,2
0,3
0,4
Acide sulfurique à 1 % (mL)
9,95
9,9
9,8
9,7
9,6
1,5
3,0
6,0
9,0
12,0
0,132
0,257
0,451
0,582
0,669
Concentration cellulaire approximative
(x108 UFC.ml-1)
Absorbance à 600 nm
L’ATPmétrie
L’ATPmétrie est une technique de dosage instantané de l’ATP (Adénosine triphosphate), molécule de
stockage d’énergie présente dans les organismes vivants.
La technique, basée sur le principe de bioluminescence, est une réaction enzymatique traduisant une
quantité d’ATP dans un échantillon en une quantité de lumière émise et mesurée par un luminomètre
(valeur obtenue en Unité Relative de Lumière (URL) :
luciférase Mg2+
ATP + luciférine + O2
AMP + PPi + oxyluciférine + lumière
On distingue trois sources d’ATP au niveau des prélèvements à analyser :
-- ATP d’origine microbienne, provenant des bactéries, des levures ou des moisissures ;
-- ATP dit « somatique », provenant de cellules d’êtres vivants (lait, sang, muscle, végétaux,…) ;
-- ATP extracellulaire, provenant de débris de micro-organismes ou de cellules somatiques. Cet ATP
est rapidement dégradé dans le milieu extérieur.
Le problème des opérations de nettoyage et de désinfection dans les bio-industries est celui de l’hygiène. Le nettoyage et la désinfection sont donc des étapes primordiales de la fabrication. Appliqué
ainsi au nettoyage-désinfection, le dosage de l’ATP sur les surfaces ou les eaux de rinçage permet la
détection de résidus organiques vivants (résidus alimentaires) et de développement microbien :
-- si de l’ATP est détecté sur une surface ou dans un liquide, c’est qu’il y a présence de cellules
vivantes ;
-- dans le cas d’ATP microbien, la présence de micro-organismes représente un risque direct
puisqu’il peut y avoir contamination des produits ;
-- en revanche, si l’ATP est d’origine somatique, c’est qu’il reste des débris organiques sur la
surface ; ceux-ci peuvent servir de support de croissance pour des micro-organismes, ce qui
constitue un risque indirect pour les produits.
57
Chapitre 3
Dénombrement d'une flore d'un produit microbien
1.1.2. Un système de filtration
L’unité ou rampe de filtration (document 2 ) comporte
un socle grillagé stérilisable sur lequel on dépose dans
un premier temps la membrane filtrante, puis dans un
second temps un godet (entonnoir) stérilisable dans lequel on verse le volume de produit à analyser. Le tout
est relié à une pompe à vide qui permet de faire passer
rapidement le volume de produit à analyser à travers la
membrane. Le liquide filtré, débarrassé des bactéries, est
collecté dans un récipient « poubelle » pour être éliminé.
1.1.3. Des milieux de culture
La membrane est ensuite déposée sur une gélose nutritive adaptée au type de flore recherchée et l’ensemble est
mis à incuber (document 3 ). Les milieux utilisés sont
le plus souvent sélectifs : ils permettent le développement de la flore recherchée en inhibant (au mieux) les
autres flores (dites flores contaminantes). Ils sont aussi
souvent discriminatifs (différentiels) : ils permettent de
mettre en évidence un (des) caractère(s) biochimique(s)
caractéristique(s) de la flore recherchée.
Les nutriments diffusent au travers de la membrane et
les colonies se développent directement à sa surface. La
taille des colonies observées après 24 à 48 heures d’incubation reste inférieure à celle de colonies qui se développeraient directement sur le milieu gélosé.
1.2. Exploitation des résultats
Le nombre de colonies suspectes sur la membrane (colonies présentant les caractères biochimiques caractéristiques de la flore recherchée en fonction du milieu utilisé) permet de calculer la concentration bactérienne N
en nombre d’Unité Formant Colonies (UFC) par mL
selon la formule :
n
V
N UFC/mL = n
v
nombre d’UFC sur la membrane
volume de produit filtré (en mL)
Dans l’analyse microbiologique des eaux, les normes imposent de filtrer 100 mL d’eau à analyser et le résultat est
rendu en UFC pour 100 mL. Il n’y a donc pas de calcul
à faire : le résultat correspond directement au nombre de
colonies sur la membrane.
2. DÉNOMBREMENT EN MILIEU LIQUIDE
2.1. Principe
Si les conditions optimales de croissance sont réunies,
un seul micro-organisme présent dans l’inoculum introduit dans un milieu liquide se développe en y créant un
trouble (et une modification visible du milieu si celuici est discriminatif ). La lecture des tubes contenant le
milieu liquide et ensemencés avec l’inoculum est donc
de type binaire :
-- résultat négatif si absence de trouble et de modification du milieu : il y avait moins de un microorganisme présent dans l’inoculum introduit dans le
milieu liquide ;
-- résultat positif si présence de trouble (et de modification du milieu si celui-ci est discriminant) : il y avait
au moins un micro-organisme présent dans l’inoculum
introduit dans le milieu liquide.
Le résultat sera positif, que l’inoculum introduit dans
le tube de milieu liquide contienne 1, 10, 100, 1 000…
micro-organismes.
La méthode repose sur la répartition aléatoire des microorganismes dans le prélèvement (méthode statistique
reposant sur l’utilisation de la loi de Poisson). On ensemence donc une série de tubes avec un volume donné du
produit à analyser ou ses dilutions, à raison de 1, 2, 3, 5
voire même 10 tubes par dilution testée.
Connaissant le nombre de résultats positifs obtenus dans
la série de tubes, on peut déterminer la concentration en
micro-organismes présents dans une unité de volume ou
de masse du produit analysé.
58
2.2. Mode opératoire
La méthode décrite ci-dessous (NF ISO 7218, mai
1996) est techniquement lourde, mais utilisée lorsque
les bactéries cultivent difficilement en milieu gélosé ou
lorsque le nombre de bactéries présentes dans l’échantillon est relativement faible (document 4 ) :
- volume de l’inoculum : le plus souvent V inoculum = 1 mL
(parfois 10 mL) ;
- choix du milieu à ensemencer :
. milieu de croissance sans indicateur : la présence de
micro-organismes se traduit par un trouble,
. milieu sélectif et discriminatif du micro-organisme à
quantifier : sa présence se manifeste par un trouble et
le virage d’un indicateur de pH par exemple ;
- choix des dilutions à tester : dépend de la population
estimée, le but étant d’obtenir, pour une analyse statistique optimale des résultats :
. une dilution contenant moins d’un micro-organisme
dans l’inoculum utilisé,
. une dilution contenant plus d’un micro-organisme
dans l’inoculum utilisé ;
- choix du nombre d’essais par dilution (dépend de la
précision souhaitée pour les résultats en fonction de
leur analyse statistique) :
. en général trois tubes sont ensemencés par dilution,
. un ou deux tubes sont ensemencés si une précision
moins importante est suffisante,
. cinq ou même dix����������������������������������
���������������������������������
tubes sont ensemencés si une précision plus importante est demandée.
2 Unité et rampe de filtration pour analyse microbiologique
Couvercle de l’entonnoir
Entonnoir de 250 ml
Joint torique en sillicone
(à l’intérieur)
Membrane filtrante
Grille support du filtre
godets
Branchement du tuyau
valve
Flacon récepteur «poubelle»
rampe de filtration
poubelle
pompe à vide
3 Exemples de milieux utilisés dans les techniques de filtration sur membrane
Gélose lactosée au TTC et Tergitol 7
Ce milieu est utilisé pour le dénombrement des coliformes qui sont des bacilles Gram négatif de la
famille des Entérobactéries, capables de dégrader le lactose. Ils sont recherchés comme témoin
de contamination fécale récente.
Le Tergitol 7 inhibe la croissance des micro-organismes à Gram positif, limite l’envahissement
par les Proteus et favorise la récupération des coliformes. Ceux-ci présentent des colonies de
coloration jaune ou orangée, à l’intérieur d’un halo jaune visible sous la membrane. Ce halo est
provoqué par l’acidification liée à la dégradation du lactose en présence de l’indicateur coloré de
pH, le bleu de bromothymol (teinte jaune à pH acide).
Les autres micro-organismes présentent des colonies dont la coloration rouge à marron est due à
la réduction du TTC en formazan insoluble.
Sont considérées comme caractéristiques toutes les colonies « lactose-positif », quelle que soit
leur taille, si le milieu sous la membrane présente une coloration jaune.
Gélose de Slanetz et Bartley
Ce milieu est utilisé pour le dénombrement des entérocoques. Les entérocoques sont des coques
Gram positif recherchés comme témoin de contamination fécale plutôt ancienne.
L’azide de sodium permet d’inhiber la croissance de la majorité des micro-organismes utilisant
une chaine respiratoire aérobie.
Le TTC est un indicateur de la croissance bactérienne. Il est réduit en formazan insoluble à l’intérieur de la cellule. Cette réaction se manifeste par l’apparition de colonies de couleur rouge à
marron. Les entérocoques ont un fort potentiel réducteur et leurs colonies présentent donc cette
coloration.
4 Organigramme d’un dénombrement en milieu liquide
59
Chapitre 3
Dénombrement d'une flore d'un produit microbien
2.3. Exploitation des résultats
2.3.1. Dénombrement à un seul essai
Ce dénombrement s’effectue sans recourir aux tables
de Mac Grady. On ensemence 1 tube par dilution avec
1 mL d’inoculum.
Exemple de résultats :
Dilution
Résultats
100
+
10-1
+
10-2
+
10-3
-
10-4
-
-- il y a au moins un micro-organisme dans l’inoculum
(1 mL) de la plus grande dilution (10-2) présentant encore un trouble : la concentration est donc d’au moins
102 micro-organismes par mL de produit ou de « suspension mère » non dilués ;
-- il y a moins de un micro-organisme dans l’inoculum
(1 mL) de la première dilution (10-3) ne présentant
plus de trouble : la concentration est donc strictement
inférieure à 103 micro-organismes par mL de produit
ou de « suspension mère » non dilués.
On peut exprimer le résultat selon l’intervalle :
102 ≤ Nmicro-organismes/mL < 103
La concentration du produit analysé est comprise entre
102 et 103 micro-organismes dans 1 mL.
2.3.2. Dénombrement à essais multiples
Ce dénombrement s’effectue en utilisant les tables de
Mac Grady (document 6 ).
Exemple : cinq dilutions ont été ensemencées à raison
de trois essais par dilution ; trois combinaisons (de
trois��������������������������������������������������
chiffres)
�������������������������������������������������
sont possibles avec les résultats obtenus (tableau 5 ). Parmi les trois combinaisons de trois
chiffres possibles (332 ; 321 ; 210), laquelle choisir ? Le
nombre le plus élevé et inférieur à 330 est sélectionné ;
dans cet exemple, il s’agit de 321. Si les dilutions sont
insuffisantes, on peut être amené à utiliser des nombres
caractéristiques comme 333, 332 ou 331.
Lecture du NPP (Nombre le Plus Probable)
dans la table statistique de Mac Grady
On reporte le nombre caractéristique de la série dans une
table statistique de Mac Grady.
On y lit le Nombre le Plus Probable (NPP) de microorganismes présents dans l’inoculum de la dilution correspondant au chiffre des centaines du nombre caractéristique.
Exemple : 321 correspond au NPP de 15. Cela signifie
qu’il y a statistiquement quinze������������������������
�����������������������
bactéries dans l’inoculum de la dilution 10-(n+1). D’après les limites de confiance
données par certaines tables, cette valeur numérique de
15 est en fait considérée comme comprise entre 3 et 38
avec une probabilité de 95�������������������������������
%, entre
���������������������������
2 et 52 avec une probabilité de 99 %.
Expression du résultat
Mise en place du nombre caractéristique
Le nombre caractéristique de la série réalisée est une
combinaison de trois chiffres :
-- chaque chiffre correspond au nombre de tubes « positifs » pour une dilution donnée ;
-- les trois chiffres correspondent à trois dilutions successives ;
-- le chiffre des centaines correspond à la plus faible dilution (donc à la plus forte concentration en micro-organismes), celui des dizaines à la dilution intermédiaire
et celui des unités à la plus grande dilution.
Parmi les différentes combinaisons, on choisit celle correspondant au nombre le plus grand et, si possible, inférieur à 330 (correspond à une meilleure répartition des
micro-organismes dans les dilutions).
N
NPP
k
V
nombre de micro-organismes par mL de produit
NPP x k analysé ou de « suspension mère »
nombre lu dans la table
facteur de la dilution correspondant au chiffre des centaines du nombre caractéristique (combinaison retenue)
volume de l’inoculum (1 mL en général)
Si le produit analysé est solide, on prépare une ���������
« �������
suspension mère » de produit en introduisant « �������������
���������������
x������������
» ���������
g de produit dans « 9 x » mL de diluant. Cela correspond à une
dilution au 1/10e du produit. Le nombre de micro-organismes par g de produit analysé est donc N x 10.
3. DÉNOMBREMENT EN MILIEU SOLIDE (MASSE, SURFACE)
Le principe de ces méthodes s’appuie sur le fait qu’un
micro-organisme présent dans un produit ou dans une
suspension de ce produit, mis en culture dans des conditions optimales, en milieu solide convenable, s’y développe en formant une colonie.
Il s’agit de faire correspondre un micro-organisme à une
UFC (Unité Formant Colonie) puisque, dans certains
cas, le développement de plusieurs micro-organismes
1. Biotechnologies 1re STL, SCEREN, 2012
60
groupés peut conduire à une unique colonie.
Ces techniques ayant déjà été décrites dans l’ouvrage de
Première1, voici les principales informations à retenir
(document 7 ).
• Dilution préalable : le plus souvent, le nombre d’UFC
par unité de masse ou de volume du bioproduit à analyser est important ; une étape préalable de dilution
(série de dilutions de raison 1/10e) est nécessaire.
5 Mise en place du nombre caractéristique
Résultats (trois essais par dilution)
10-n
Dilutions et aspect des tubes
après incubation (lecture d’un
trouble associé à la production
de gaz collecté dans une
cloche).
Résultats
+
+
10-(n+1)
+
+
+
10-(n+3)
10-(n+2)
+
+
+
-
+
-
Nombre de tubes +
3
3
2
Combinaison possible
3
3
2
3
2
1
2
1
Combinaison possible
Combinaison possible
10-(n+4)
-
-
1
-
-
0
0
6 Tables de Mac Grady
Deux tubes par dilution
Trois tubes par dilution
Nombre
caractéristique
NPP
Nombre
caractéristique
NPP
Nombre
caractéristique
NPP
Nombre
caractéristique
NPP
000
001
010
011
020
100
101
110
111
120
121
200
201
210
211
212
220
221
222
0,0
0,5
0,5
0,9
0,9
0,6
1,2
1,3
2,0
2,0
3,0
2,5
5,0
6,0
13,0
20,0
25,0
70,0
110,0
000
001
010
011
020
100
101
102
110
111
120
121
130
200
0,0
0,3
0,3
0,6
0,6
0,4
0,7
1,1
0,7
1,1
1,1
1,5
1,6
0,9
201
202
210
211
212
220
221
222
223
230
231
232
300
301
1,4
2,0
1,5
2,0
3,0
2,0
3,0
3,5
4,0
3,0
3,5
4,0
2,5
4,0
302
310
311
312
313
320
321
322
323
330
331
332
333
6,5
4,5
7,5
11,5
16,0
9,5
15,0
20,0
30,0
25,0
45,0
110,0
140,0
61
Chapitre 3
Dénombrement d'une flore d'un produit microbien
• Inoculation du milieu gélosé :
-- dans la masse : V inoculum = 1 mL. Cet inoculum est
introduit dans une boîte de Petri vide et stérile, recouvert du milieu gélosé en surfusion que l’on laisse
durcir après parfaite homogénéisation. On peut ensuite recouvrir le milieu d’une couche de milieu stérile (double couche) pour limiter l’envahissement des
colonies en surface et avoir des colonies présentant
toutes le même aspect ;
-- en surface : Vinoculum = 0,1 mL, à étaler à la surface d’un
milieu gélosé préalablement coulé en boite de Petri.
• I�����������������������������������������������������
ncubation à la température adaptée à la flore recherchée pendant 18 à 72 heures.
• Dénombrement des colonies :
-- en surface : elles ont un aspect macroscopique classique et caractéristique ;
-- en profondeur : elles ont un aspect lenticulaire.
• Exploitation des résultats
Elle peut être effectuée selon la norme ISO 7218
(manipulation réalisée en ensemençant deux boites
par dilution) : voir Biotechnologies 1re STL, pp. 69-70.
Elle peut être effectuée selon la norme ISO 7218
modifiée en octobre 2007, qui officialise l’utilisation
d’une seule boite par dilution :
-choix des essais : choisir deux dilutions successives
dont :
. l’une au moins présente un minimum de dix colonies,
. le « nombre maximal de colonies en totalité est de
trois cents par boite ». En présence d’un agent de
différenciation, le « nombre maximal de colonies
caractéristiques ou présumées est de cent cinquante
par boite »,
. pour les levures et les moisissures, on retient pour le
calcul les dilutions présentant entre dix et cent cinquante colonies par boite ;
-calcul de la concentration bactérienne N en UFC par
mL ou par g de produit :
Arrondir le résultat calculé à deux chiffres significatifs
et l’exprimer en nombre compris entre 1,0 et 9,9.10n
UFC par mL ou par g.
62
Dénombrement en microméthode des entérocoques
Pour l’analyse des eaux, il existe des microplaques de 96 puits permettant de dénombrer les Enterococcus selon le principe du NPP
(d’autres microplaques permettent de dénombrer E. coli). La microplaque MUD/SF permet de réaliser le dénombrement des entérocoques dans les eaux, suivant la méthode NF EN ISO 7899-1Les entérocoques (E. faecium, E. faecalis, E. durans, E. hirae), représentant 70 à 100 % des « streptocoques fécaux », sont de bons
indicateurs de contamination fécale ancienne.
Le principe de ce dénombrement repose sur la mise en évidence des entérocoques par la détection d’une de leur enzyme spécifique, la
β-glucosidase, dont le substrat (4-méthylumbelliféryl-β-D-glucopyranoside ou MUD) est déshydraté dans les cupules de la microplaque.
En présence de l’enzyme le substrat libère un composé fluorescent révélé dans l’UV. Le milieu de culture est déshydraté et fixé au fond
des puits de la microplaque.
La réhydratation du milieu se réalise lorsque l’eau à analyser est introduite dans les puits. Les entérocoques (éventuellement présents
dans l’inoculum) hydrolysent le MUD en 4-méthylumbelliférone et en glucose. La production de 4-méthylumbelliférone, composé à fluorescence bleue, est observée à l’aide d’une lampe UV proche du visible, à 366 nm.
De plus, la composition du milieu, à teneur élevée en peptone et en galactose, permet une excellente récupération des entérocoques.
Le milieu contient aussi de l’acide nalidixique et de l’acétate de thallium qui assurent l’inhibition de la presque totalité de la microflore
contaminante. L’incubation à 44 °C permet aussi d’inhiber la croissance de la majorité des micro-organismes de la microflore secondaire. Ainsi, toutes ces conditions sélectives de culture ne permettent que la croissance des entérocoques.
Une analyse statistique fondée sur la loi de Poisson permet, une fois la lecture faite, de dénombrer les entérocoques présents dans
l’échantillon en fonction du nombre de puits fluorescents obtenus par dilution testée.
Exemple de résultats pour une eau de surface.
On ensemence 24 puits (3 colonnes de 8 puits)
avec 200 µL de chaque dilution :
-- dilution au 1/2 de l’eau à analyser ; on
obtient 10 puits positifs sur les 24 ensemencés ;
-- dilution au 1/20e, on obtient 3 puits
positifs sur 2 ;
-- dilution au 1/200e, on obtient 1 puits
positif sur 24 ;
-- dilution au 1/2 000e, on obtient 0 puits
positif sur 24.
Le nombre caractéristique de la série est de
3/24, 1/24 et 0/24 soit 3/1/0 (si possible ce
nombre doit se terminer par 0).
On reporte ce nombre caractéristique dans une
table statistique et on obtient le NPP puis on
calcule la concentration en entérocoques de
l’eau analysée.
Dilution
1/2
Dilution
1/200e
Dilution
1/20e
Dilution
1/2000e
7 Dénombrement en milieu solide (masse, surface) (ISO 7218 modifiée)
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
Échantillon à
analyser
Dilutions de
raison 1/10
réalisées dans
des tubes
contenant 9 mL
de diluant stérile
1/10
1 mL
1/100
1 mL
1/1000
1 mL
1/10 000
1 mL
1/100 000
1 mL
Culture
Dilutions non exploitables : nombre de colonies supérieur à 300
Dilutions exploitables :
deux dilutions successives
dont une contient entre 10
et 300 UFC.
63
Chapitre 3
Dénombrement d'une flore d'un produit microbien
Dénombrement grâce à un ensemenceur Spiral ®
La méthode d’ensemencement Spiral ® permet l’ensemencement automatique et
standardisé à partir d’un échantillon contenant de 30 à 10.106 UFC/mL, sur une
seule boîte de Petri et sans dilution préalable, selon la norme AFNOR V08-100.
Un volume fixe de l’échantillon (50, 100 ou 200 µL) est ensemencé en suivant la
forme d’une spirale d’Archimède décroissante (du centre vers la périphérie). Le
volume est donc calibré et connu en tout point de la boîte.
Aspect de la spirale mise en évidence
par un colorant bleu
La densité des colonies est décroissante du centre vers la périphérie
Paires de secteurs
opposés
µL déposés
(volume cumulé)
1
1,00
2
2,58
3
5,07
4
9,00
5
15,21
6
25,00
Boîte entière
50,00
Exemple : ensemencement en mode spiral de
50 µL d’échantillon sur
une boite de Petri de
90 mm de diamètre
Après incubation, la lecture s’effectue en
rapportant le nombre de colonies au volume
déposé sur un secteur donné. Seuls servent au
dénombrement les secteurs où les colonies sont
correctement espacées.
Le comptage est réalisé manuellement à l’aide
de la grille qui divise la boîte en secteurs correspondant à un volume précis d’échantillon
déposé.
6
B
1
A
2
3
4
A
6
6
5
2
3
4
1
21 colonies comptées sur les secteurs 1 à 4 du
quadrant B en haut à gauche.
B
5
1
B
2
3
4
A
6
A
5
B
5
6
2
3
4
5
6
1
5
1
6
2
3
4
2
3
4
5
1
2
3
4
5
2
3
4
1
6
1
Dans un quadrant choisi (A ou B) on dénombre les colonies de la périphérie vers le centre et sur un nombre de secteurs suffisants pour
compter au moins 20 colonies. On répète ce comptage sur le même nombre de secteurs dans le quadrant opposé.
On calcule ensuite la concentration en micro-organismes de l’échantillon :
-- en additionnant les deux comptages ;
-- en ramenant ce nombre d’UFC au volume déposé dans les secteurs dénombrés ;
-- en prenant en considération une dilution préalable du produit analysé.
--
15 colonies sur le nombre de secteurs équivalent dans le quadrant B en bas à droite.
Dans notre exemple, le volume correspondant aux secteurs 1 à 4 des deux quadrants B opposés est de 9 µL (mode spiral exponentiel
de 50 µL) et le produit à analyser a été préalablement dilué au 1/10e avant ensemencement.
C=
64
nombre total de colonies x k = (21+15) x 10
= 4,00.104 UFC.mL-1
Vsecteur 900.10-3
4. DÉNOMBREMENT PAR
OBSERVATION DIRECTE
La numération cellulaire peut être réalisée par comptage
au microscope, à l’aide d’une lame de comptage spéciale
ou cellule de numération ou hématimètre. Cette technique ayant déjà été décrite dans l’ouvrage de Première2,
voici les principales informations à retenir.
• Lorsque la suspension cellulaire est trop concentrée,
il est nécessaire de réaliser une dilution préalable de
façon à permettre le comptage des cellules au microscope.
• Le comptage se fait grâce à un hématimètre, épaisse
lame en verre dont le plateau central comporte un quadrillage spécifique gravé (document 8 ).
• Le volume de comptage est déterminé par :
-- la surface du quadrillage gravé sur la lame ;
-- la profondeur de la chambre : hauteur entre le plancher de la plate-forme centrale et la face inférieure de
la lamelle optiquement plane.
• Remplissage de l’hématimètre :
-- faire adhérer parfaitement la lamelle optiquement
plane aux plateaux latéraux ;
-- remplir complètement la chambre de comptage avec
la suspension cellulaire préalablement homogénéisée.
Le remplissage doit être fait en une seule fois, sans
bulles d’air et sans faire déborder le liquide dans les
rigoles. L’hématimètre doit toujours rester « à plat »
pour éviter une mauvaise répartition des cellules sur
le quadrillage ;
-- laisser sédimenter les cellules sur le quadrillage
quelques minutes.
• Numération au microscope (objectif X 40 en général) :
-- vérifier l’homogénéité de la répartition des cellules à
compter (si la répartition est mauvaise, recommencer) ;
-- compter les cellules contenues sur une surface donnée
donc un volume donné ; le nombre de cellules comptées doit être compris entre 200 et 500 cellules pour
être statistiquement correct.
• Prévoir une décontamination et un rinçage de l’hématimètre après comptage.
• Calcul de la concentration cellulaire :
N=
nombre de cellules comptées
k
facteur de dilution
N
9 Quadrillage d'un hématimètre de Malassez
n×k
V
n
V
8 Un hématimètre de Malassez
volume de comptage (L ou mL)
nombre de cellules par litre (ou
mL)
L’hématimètre de Malassez possède un quadrillage
spécifique de 2,5 mm de longueur, 2 mm de largeur et
une hauteur sous lamelle de 0,2 mm (document 9 ). Le
volume correspondant au quadrillage total est égal à 1
mm3. Ce quadrillage comporte 100 rectangles ; chaque
rectangle correspond à un volume de 0,01 mm3.
2. Biotechnologies 1re STL, SCEREN, 2012
65
Chapitre 3
Dénombrement d'une flore d'un produit microbien
Comptage cellulaire et viabilité cellulaire des micro-organismes
eucayotes (levures)
L’industrie agro-alimentaire utilise de nombreuses levures sélectionnées, conditionnées sous forme de levain (ou de ferment). Ces levures,
ajoutées à une matière première, assurent des étapes de la transformation de cette matière première en produit fini.
L’inoculation de la matière première doit se faire avec un nombre connu de micro-organismes (on veut y obtenir une concentration
initiale optimale) et ceux-ci doivent être vivants, pour être capables d’exprimer leurs activités enzymatiques et de se multiplier pendant le
processus de transformation.
La viabilité cellulaire des levures peut être analysée lors du comptage en hématimètre grâce à l’utilisation de colorants qui, en fonction
de leurs caractéristiques, pénètrent soit dans les cellules vivantes soit dans les cellules mortes. La proportion relative des cellules colorées
ou non est un reflet exact du nombre de cellules vivantes ou mortes et donc de la viabilité de l’ensemble de la population cellulaire.
On peut alors calculer le % de viabilité d’une suspension cellulaire :
Il existe deux types de colorants utilisables lors d’une recherche de viabilité réalisée en hématimètre.
• Les colorants vitaux ou d’inclusion, qui colorent les cellules vivantes. Un colorant vital est une substance qui met en évidence une
structure cellulaire sans provoquer la mort immédiate de la cellule. Pour cela, il faut que le colorant soit utilisé à concentration
relativement faible et qu’un élément cellulaire soit capable de l’accumuler. Le rouge neutre, par exemple, est un colorant cationique
qui diffuse rapidement à travers la membrane plasmique et se concentre dans les vacuoles (cellules végétales) et les lysosomes. Sa
concentration intracellulaire peut être 100 à 1 000 fois plus importante que la concentration extracellulaire. Les cellules vivantes
sont donc rouges et les cellules mortes sont incolores.
• Les colorants supravitaux ou d’exclusion, qui colorent les cellules mortes. Il existe deux explications concernant la coloration différentielle des cellules mortes et vivantes à l’aide de ce type de colorant :
–– ces colorants ne se fixent que sur les cellules mortes car la membrane plasmique des cellules vivantes leur est imperméable.
Toute perturbation de l’intégrité membranaire provoquera une modification de la pénétration de ces colorants. Les cellules
vivantes n’incorporent pas ces colorants au contraire des cellules mortes (non viables) qui les incorporent et qui apparaissent
alors colorées ;
–– ces colorants ont tendance à entrer dans les cellules qu’ils rencontrent. Une fois dans la cellule, le colorant entraîne un mécanisme d’exclusion qui va éjecter cette molécule dans le milieu extérieur. Ce mécanisme nécessitant de l’énergie, seules les cellules possédant une source d’ATP peuvent le mettre en place. Ainsi, une cellule vivante expulsera la molécule et restera blanche
au microscope, au contraire une cellule morte n’aura pas les moyens de la rejeter et deviendra colorée.
Exemples de colorants d’exclusion : le bleu trypan (cancérigène), l’érythrosine B, le bleu de Funk, des colorants fluorescents comme
l’iodure de propidium ou le bromure d’éthidium. Avec le bleu trypan ou le bleu de Funk, les cellules vivantes sont incolores et les cellules
mortes sont donc bleues.
Observation de Saccharomyces cerevisiae coloré au bleu de
Funk (cellules vivantes blanches, cellules mortes bleues)
66
Le cytomètre de flux Bactiflow ALS ®
But recherché : passage d’une méthode traditionnelle lente à une méthode alternative rapide (24 h) pour réduire le temps de stockage
du produit fini en industrie agro-alimentaire (mise plus rapide sur le marché de produit à DLC courte, augmentation de la production en
flux tendu).
La technique est basée sur :
–– le marquage fluorescent des organismes viables présents
dans le produit ;
–– la cytométrie en flux, adaptée à la microbiologie industrielle. L’échantillon à analyser est envoyé dans une veine
liquide. Un rayon laser permet d’activer la fluorescence des
bactéries vivantes. Un système optique permet de détecter
et de mesurer l’émission de fluorescence.
Un signal fluorescent détecté est dû à la présence d’une
bactérie vivante. La comptabilisation des signaux détectés pour
un volume d’échantillon donné permet de connaître le nombre
de bactéries vivantes par unité de masse ou de volume de
l’échantillon à analyser.
La méthode alternative doit donner des résultats équivalents à
la méthode de référence.
Flux liquidien contenant les bactéries vivantes
(fluorescentes) ou mortes (non fluorescentes)
Rayon laser activant la
fluorescence
Système optique
détectant
l’émission de
fluorescence
Dans le cadre d’un test qualitatif, la validation de la méthode
alternative consiste à réaliser le test de présence/absence comparativement avec la méthode traditionnelle, avec des charges
en micro-organismes de plus en plus faibles et en dessous de
1 UFC.g-1 et une pré-incubation en bouillon de 24 heures.
L’ensemble des résultats obtenus permet de valider (pour
chaque souche testée) que la limite de détection de la méthode
alternative est inférieure à1 UFC/g, ce qui permet de la valider
pour un test qualitatif en présence /absence dans 1 g et garantir l’absence des germes spécifiés.
67
Chapitre 3
Dénombrement d'une flore d'un produit microbien
ACTIVITÉ 1
DIAGNOSTIC D’UNE INFECTION URINAIRE
PRÉSENTATION
Le diagnostic et le traitement des infections des voies
urinaires reposent sur le dénombrement des bactéries
(bactériurie), leur identification et la détermination
de leur sensibilité à différents antibiotiques (antibiogramme).
Au cours des dernières années de nombreuses techniques
simplifiées ont été développées pour le comptage
des bactéries urinaires, comme les cultures sur lames
gélosées de type « Uricult ». L’ensemencement se fait
immédiatement après la miction (au maximum après
20 min pour éviter tout développement des bactéries) en
plongeant directement la lame gélosée dans l’urine. La
lame gélosée introduite dans un flacon est mise à incuber
18 à 24 h à 37 °C.
En général les lames ont deux faces gélosées différentes
(document 1 ) :
-- une face avec le milieu CLED (Cystine, Lactose, Electrolyte Déficient, cette dernière caractéristique évite
l’envahissement par certaines bactéries très mobiles
comme Proteus), milieu non sélectif permettant de
mettre en évidence le caractère lactose + grâce à la présence de lactose et de BBT (jaune à pH < 6 ; vert entre pH
6 et 7,6 ; bleu au-delà) ;
-- une face avec un milieu sélectif pour les bactéries Gram -,
le milieu de Mac Conkey qui permet lui aussi de mettre
en évidence le caractère lactose + grâce à la présence de
lactose et de rouge neutre (rouge à pH < 6,8 ; orange entre
pH 6,8 et 8 ; jaune-orangé au-delà).
Après incubation, on estime le nombre des bactéries
(en UFC.mL-1) en comparant la croissance sur la lame
gélosée à la tabelle du fournisseur (document 2 ).
Critères diagnostiques dans l’urine :
-- UFC ≥ 105/mL :������������������������������������
bactériurie significative. Une analyse bactériologique (culture, identification et antibiogramme) est indiquée ;
-- UFC compris entre 104 et 105/mL : valeur limite. S’il
s’agit d’une culture pure (un seul type de colonie), une
analyse bactériologique (culture, identification et antibiogramme) est également indiquée. S’il s’agit d’une
culture mixte (plusieurs colonies d’aspect différent),
répéter l’analyse ;
-- UFC < 104/mL : bactériurie non significative.
QUESTIONS
1. Le document 3 présente le résultat obtenu avec la
lame immergée d’un patient :
1.1. Conclure sur la bactériurie d’après la densité des
colonies obtenues sur la face CLED.
68
1.2. Les colonies observées sont-elles lactose + ou - ?
1.3. La bactérie responsable de l’infection urinaire
est-elle probablement Gram + ou Gram - ?
1.4. À l’aide de l’annexe 1 , proposer, en les justifiant,
les tests nécessaires pour réaliser une orientation
de famille ou de genre ?
2. Le technicien a ensemencé une galerie API 20E à
l’aide des colonies obtenues après repiquage. Le document 4 montre le résultat obtenu après culture et
révélation des tests dans les différentes cupules. On a
identifié ainsi E. coli comme bactérie responsable de
cette infection urinaire.
À l’aide de l’annexe 2 , répondre aux questions
suivantes :
2.1. Pourquoi certaines cupules ont-elles leur titre
souligné ? Encadré ?
2.2. Q uel réactif a été ajouté à la cupule IND ? Ce
réactif révèle la présence d’indole, produit par
l’action d’une tryptophanase sur le tryptophane.
En déduire :
-- la composition minimale du milieu présent dans
la cupule ;
-- le nom de l’enzyme présente chez la bactérie en
cas de réaction positive.
2.3. Le perchlorure de fer ajouté à la cupule TDA met
en évidence la présence d’acide indolpyruvique
produit par l’action d’une tryptophane désaminase
sur le tryptophane. Écrire la réaction catalysée par
la TDA.
2.4. Donner le résultat + ou - pour les cupules suivantes
MAN et SAC. Le mannitol et le saccharose sont
des glucides dont l’utilisation est visualisée grâce
à la présence de BBT dans le milieu déshydraté.
2.5. Faire un logigramme permettant d’expliquer les
différents résultats possibles du test de la réduction
des nitrates en nitrites, puis éventuellement des
nitrites en azote.
2.6. L’identification proposée est-elle en adéquation
avec l’aspect des colonies obtenues sur les deux
faces de la lame immergée ?
3. Le traitement de cette infection urinaire nécessite
une antibiothérapie. Le technicien entreprend donc
la réalisation d’un antibiogramme dont le résultat est
fourni par le document 5 . Répondre aux questions
suivantes à l’aide des fiches techniques de la partie 2
de cet ouvrage (Réalisation d’un antibiogramme et
Lecture d’un antibiogramme :
3.1. Faire un organigramme des différentes étapes de
la réalisation d’un antibiogramme.
3.2. Donner le nom du milieu utilisé.
3.3. Indiquer, en le justifiant, le nom donné à la
concentration en antibiotique obtenue dans la gélose
à la limite entre croissance et absence de croissance.
3.4. Pourquoi le technicien mesure-t-il les diamètres
d’inhibition de la croissance autour des disques
d’antibiotique ?
3.5. Construire l’abaque de lecture pour la ticarcilline
(TIC), puis :
-- estimer la CMI de la ticarcilline pour la souche
E. coli ;
-- dire si le médecin peut prescrire la ticarcilline
pour soigner cette infection urinaire.
Données
Diamètre d’inhibition mesuré pour la ticarcilline : 26 mm.
Diamètre correspondant à la concentration critique inférieure : 22 mm.
Diamètre correspondant à la concentration critique supérieure : 18 mm.
Concentration critique supérieure (concentration plasmatique maximale) : 64 mg.L-1.
Concentration critique inférieure (concentration plasmatique minimale) : 16 mg.L-1.
1 Lame gélosée
2 Comptage des bactéries sur lame gélosée :
tabelle du fournisseur
4 Résultat galerie API 20E
3 Bactériurie sur lame gélosée
Face CLED
5 Résultat de l'antibiogramme
Face Mac Conkey
ANNEXE 1 Principales espèces bactériennes retrouvées dans les infections urinaires • Bacilles Gram - de la famille des entérobactéries (oxydase -) : Escherichia coli (lactose +), Proteus mirabilis (lactose -),
Klebsiella spp. (lactose +).
• Bacilles Gram -, oxydase + : Pseudomonas spp.(lactose -).
• Coques Gram + : entérocoques (catalase -) et Staphylococcus saprophyticus (catalase +).
69
Chapitre 3
Dénombrement d'une flore d'un produit microbien
ANNEXE 2
Extrait de la notice de la galerie API 20E
1. Principe
La galerie API 20E comporte vingt microtubes
contenant des substrats déshydratés. Les microtubes
sont inoculés avec une suspension bactérienne qui
reconstitue les tests. Les réactions produites pendant
la période d’incubation se traduisent par des virages
colorés spontanés ou révélés par l’addition de réactifs.
La lecture de ces réactions se fait à l’aide du tableau
de lecture et l’identification est obtenue à l’aide du
Catalogue Analytique (vendu par le fournisseur) ou
d’un logiciel d’identification.
microcupule
microtube contenant le
milieu déshydraté
2. Échantillons (prélèvement et préparation)
La galerie API 20E ne doit pas être utilisée directement à partir des prélèvements d’origine clinique ou autres.
Les micro-organismes à identifier doivent, dans un premier temps, être isolés sur un milieu de culture adapté à
la culture des Enterobacteriaceae et/ou des bacilles à Gram négatif non exigeants selon les techniques usuelles de
bactériologie.
3. Mode opératoire
•
•
•
Test oxydase
Le test oxydase doit être réalisé selon les instructions du fabricant, il constitue le 21e test d’identification à
noter sur la fiche de résultats.
Préparation de l’inoculum
-- Ouvrir une ampoule d’API NaCl 0,85 % Medium (5 mL) ou utiliser un tube contenant 5 mL d’eau physiologique stérile ou d’eau distillée stérile, sans additif.
-- À l’aide d’une pipette, prélever une seule colonie bien isolée sur milieu gélosé. Réaliser une suspension
bactérienne en homogénéisant soigneusement cette colonie dans le milieu. Cette suspension doit être
utilisée extemporanément.
Inoculation de la galerie
-- Introduire la suspension bactérienne dans les tubes de la galerie à l’aide de la même pipette :
·· pour les tests CIT, VP et GEL, remplir microtube et microcupule ;
·· pour les autres tests, remplir uniquement les microtubes (et non les cupules) ;
·· pour les tests : ADH, LDC, ODC, H2S et URE, créer une anaérobiose en remplissant leur microcupule
d’huile de paraffine.
-- Refermer la boîte d’incubation. Incuber à 36 °C ± 2 °C pendant 18-24 h.
4. Lecture et interprétation
ecture de la galerie
L
Noter sur la fiche de résultats toutes les réactions spontanées puis révéler les tests nécessitant l’addition de
réactifs, soient les tests :
TDA :
Réduction des nitrates en nitrites (NO2)
Ajouter une goutte de réactif TDA (perchlorure de
et en azote (N2) et cupule GLU : après
fer). Une couleur marron rougeâtre indique une
avoir lu le caractère glucose, ajouter 1
réaction positive (présence d’acide indol pyruvique)
goutte des réactifs NR1 (acide sulfanilique)
à noter sur la fiche de résultats.
et NR2 (α-naphtylamine). Attendre 2 à
5 minutes. Une coloration rouge indique
IND :
une réaction positive (présence de NO2
Ajouter une goutte de réactif JAMES (ou de
issu de la réduction des nitrates par une
KOVACS). Une couleur rose diffusant dans toute
nitrate réductase bactérienne). Une réaction
la microcupule indique une réaction positive
négative (coloration jaune) peut être due à la
(présence d’indole) à noter sur la fiche de résultats.
production d’azote (N2) à partir des nitrites :
ajouter 2 à 3 mg de réactif Zn (poudre de
VP :
zinc) dans la cupule GLU. Après 5 minutes,
Ajouter une goutte des réactifs VP1 (KOH) et VP2
un tube resté jaune indique une réaction
(α-naphtol). Attendre au minimum 10 min.
positive (présence de N2) à noter sur la fiche
Une couleur rose ou rouge indique une réaction
de résultats. Si la cupule est orange-rouge,
positive (présence d’acétoïne) à noter sur la fiche
la réaction est négative, les nitrates encore
de résultats. Une faible coloration rose apparaissant
présents dans le tube ont été réduits en
après 10 min doit être considérée négative.
nitrites par le Zinc.
70
ACTIVITÉ 2
DÉNOMBREMENT DES E. COLI DANS UNE PRÉPARATION À BASE DE VIANDE
3. Combien attend-on au maximum de colonies sur les
boîtes de la dilution 10-2 si l’unité d’échantillon de
l’aliment analysé est « acceptable » (classe 2) ?
4. Les résultats du dénombrement réalisé sont présentés
dans le tableau 2 .
4.1. À l’aide de la formule de calcul normalisée, calculer
le nombre d’UFC :
- par mL de suspension mère ;
- par gramme de préparation à base de viande.
Donnée : formule de calcul normalisée :
PRÉSENTATION
Le tableau 1 présente un extrait du règlement (CE)
n° 2073/2005 de la commission européenne du 15 novembre
2005 concernant les critères microbiologiques applicables
aux denrées alimentaires.
La norme NF ISO 16649-2 d’août 2001 (annexe 1 )
est une méthode pour le dénombrement des E. coli
β-glucuronidase positive par la technique de comptage des
colonies à 44 °C au moyen d’un milieu contenant du
5-bromo-4-chloro-indolyl-b-Dglucuronate, substrat
chromogénique permettant la détection de l’enzyme
β-glucuronidase.
4.2. Analyser les résultats obtenus pour cette unité
d’échantillon. Conclure.
4.3. Les analyses des autres unités d’échantillon ont
donné les résultats suivants :
n2 = 9.102 UFC.g-1 ; n3 = 1.103 UFC.g-1 ;
n4 = 4.103 UFC.g-1 ; n5 = 6.102 UFC.g-1.
QUESTIONS
1. Q ue traduit la présence de E. coli en quantité importante
dans une préparation à base de viande ?
2. La présence du sérotype E. coli O157:H7 ne peut pas
être détectée avec la gélose TBX (annexe 2 ). À l’aide du
Zoom p. 23 (Les cas groupés de syndrome hémolytique
et urémique), indiquer si cela peut engendrer un
problème de santé publique.
Conclure.
1 Recherche et dénombrement d’E. coli dans une préparation à base de viande
Plan d’échantillonnage
n
5
Limites en UFC/g
C
2
m
500
M
5000
Méthode
d’analyse de
référence
Stade d’application
du critère
Action en cas de résultat
insatisfaisant
ISO16649-1ou 2
Fin du procédé de
fabrication
Amélioration de l’hygiène de
production et amélioration de la
sélection et/ou de l’origine des
matières premières
2 Résultats du dénombrement
Suspension mère
10-1
10-2
Nombre de colonies
totales
Boîte 1
450
45
8
Boîte 2
380
56
9
Nombre de colonies
caractéristiques
Boîte 1
142
15
2
Boîte 2
138
17
3
71
Chapitre 3
L’eau,
un composant
essentiel
des produit
organismes
vivants
Dénombrement
d'une
flore d'un
microbien
ANNEXE 1
Recherche et dénombrement des E. coli selon la norme NF EN ISO 16649-2
Introduire 10 g de préparation à base de viande dans 90 mL de tryptone-sel.
Homogénéiser après broyage. On obtient la « suspension mère ».
-1
J0
-2
Réaliser les dilutions 10 et 10 de la « suspension mère » en tryptone-sel.
Introduire 1 mL de la « suspension mère » et de chacune des dilutions dans
deux boîtes de Petri stériles. Ajouter 15 mL de milieu TBX en surfusion à 4550 °C. Bien homogénéiser. Laisser durcir. Recouvrir de milieu stérile.
Laisser durcir. Incuber 18 à 24 h à 44 °C.
J1
Après la période d’incubation spécifiée, compter les UFC caractéristiques
de E. coli β-glucuronidase positive dans chaque boîte contenant moins de
150 UFC caractéristiques et moins de 300 UFC au total (UFC
caractéristiques et non caractéristiques).
Pour que le résultat soit valide, il est en général estimé nécessaire de
compter les UFC caractéristiques sur au moins une boîte contenant un
minimum de 15 UFC caractéristiques. Dans la formule de calcul normalisée,
∑C est alors la somme des UFC comptées sur toutes lesboîtes de deux
dilutions successives dont au moins une contient un minimum de 15 UFC
caractéristiques.
ANNEXE 2
Le milieu TBX
Les sels biliaires inhibent la croissance de la majorité des microorganismes à Gram positif et favorisent la récupération des
Escherichia coli.
Le BCIG (acide 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronique)
est un substrat chromogène. La plupart des souches d’Escherichia
coli possédant une β-glucuronidase agissent par clivage du BCIG,
entraînant la coloration des colonies en bleu.
Il est important de noter que toutes les bactéries de l’espèce
Escherichia coli ne possèdent pas de β-glucuronidase. C’est le cas
notamment du sérotype O157:H7 qui présente donc des colonies
blanches.
L’incubation réalisée à 44 °C et impérativement limitée à 24 h
permet d’inhiber la croissance de la majorité des micro-organismes
contaminants.
72
ACTIVITÉ 3
DÉNOMBREMENT DES ENTÉROCOQUES DANS UNE EAU
PRÉSENTATION
Les entérocoques possèdent les propriétés suivantes :
-- ce sont des coques Gram +, catalase -, ne formant pas
d’endospore ;
-- ils appartiennent aux streptocoques du groupe D (selon
Lancefield), groupe divisé en deux sous-groupes : les
entérocoques et les non-entérocoques ;
-- ils sont, entre autre, capables de cultiver à 45 °C et en
bouillon 6,5 % de NaCl à 35 °C ;
-- ils résistent à de nombreux inhibiteurs et notamment à la
bile et à l’azide de sodium ;
-- ils sont, entre autres caractères biochimiques, TTC+ et
esculine +.
Leur présence dans une eau traduit une contamination
fécale relativement ancienne si elle est associée à celle des
coliformes fécaux. Il existe également des entérocoques
d’origine non fécale provenant de matières végétales, du
sol et des insectes. Ces espèces ne sont pas associées à la
présence de coliformes fécaux.
Étant donné qu’il est difficile de discriminer les
entérocoques d’origine fécale et les entérocoques d’origine
non fécale, les entérocoques doivent être plutôt perçus
comme un indicateur général de pollution d’origine
organique.
Le dénombrement des entérocoques dans une eau peut se
faire par filtration ou par une méthode de dénombrement
en milieu liquide (selon le NPP).
QUESTIONS
1. Dénombrement des entérocoques par la technique de
filtration (norme NF EN ISO 7899-2)
Selon cette norme (annexe 1 ) :
-- les entérocoques présumés sont les bactéries se développant en 44 ± 4 h à 36 °C, sur milieu sélectif
à l’azoture de sodium (gélose de Slanetz et Bartley,
document 1 ) en donnant des colonies typiques
réduisant le chlorure de triphényl-2,3,5 tétrazolium
(colonies TTC+) ;
-- les entérocoques sont les bactéries se développant en
44 ± 4 h à 36 °C, sur milieu sélectif à l’azoture de
sodium en donnant des colonies typiques réduisant le
chlorure de triphényl-2,3,5 tétrazolium qui, de plus
donnent une réaction positive sur une gélose biliée à
l’esculine (colonies esculine +) (document 2 ) et une
réponse négative au test catalase.
Le document 5 montre le résultat de la membrane
déposée sur gélose de Slanetz et Bartley après incubation,
pour une eau analysée selon cette norme.
1.1. Commenter le choix de la porosité de la membrane
filtrante ; en déduire le diamètre minimal des
entérocoques.
1.2. Commenter l’aspect macroscopique des colonies
observées sur la gélose de Slanetz et Bartley.
Conclure.
1.3. Après transfert de la membrane sur gélose BEA,
on observe sous 2/3 des colonies l’apparition d’un
halo noirâtre. Conclure.
1.4. Rendre le nombre d’entérocoques pour 100 mL
d’eau analysée.
2. Dénombrement des entérocoques par la méthode du
NPP (norme NF EN ISO 9308-3)
Dans cette norme (annexe 2 ) sont considérés comme
entérocoques les micro-organismes donnant une réaction positive en 48 h à 37 °C dans un milieu de Rothe
(document 3 ) et une réaction positive en 24 h à 37 °C
sur un milieu de Litsky (document 4 ). Le tableau 6 donne les résultats obtenus pour une eau analysée selon
cette norme.
2.1. Le choix des dilutions testées est-il satisfaisant ?
2.2. Pourquoi certains résultats dans la série de Litsky
sont « non effectués » ?
2.3. Déterminer NPP, le nombre le plus probable
d’entérocoques par mL d’eau analysée (cf. table de
Mc Grady p. 61).
2.4. Une eau analysée précédemment a donné comme
résultat : 2 000 entérocoques par mL. Quelles
dilutions doivent être réalisées pour avoir une
série de résultats exploitables de façon optimale
par cette méthode ?
3. Comparaison des deux méthodes
3.1. Dresser un tableau de comparaison entre la
technique par filtration et la technique par
dénombrement en milieu liquide (NPP) en
comparant les points suivants :
-- temps de manipulation (court, long) ;
-- temps nécessaire à l’obtention du résultat de
l’analyse (en heures) ;
-- matériel nécessaire.
3.2. À partir des critères microbiologiques suivants
établis pour différentes catégories d’eau, quelle
méthode peut-on choisir pour leur analyse ?
-- eau de consommation : 0 entérocoques pour
100 mL ;
-- eau de baignade (eau de qualité correcte) :
100 entérocoques pour 100 mL ;
-- eau destinée à la production d’eau potable nécessitant un traitement classique : 1������������
000 �������
entérocoques pour 100 mL.
73
Chapitre 3
Dénombrement d'une flore d'un produit microbien
2 Milieu confirmatif : gélose biliée à l’esculine et à
l’azoture (BEA)
1 Milieu présomptif de Slanetz et Bartley
La présence d’azide de sodium limite la croissance de toutes
les bactéries pourvues d’une chaîne respiratoire (flore
secondaire inhibée). Les entérocoques, bactéries anaérobies
aérotolérantes donc dépourvues de chaîne respiratoire, ne
sont pas inhibés. De plus ils réduisent le TTC en formazan qui
colore leurs colonies en rouge.
3 Milieu présomptif : bouillon glucosé à l’azoture (milieu
Alors que la prolifération des entérocoques tolérant la bile
n’est pas ralentie, la croissance des bactéries secondaires
d’origine non intestinale est largement inhibée par les sels
biliaires. Les entérocoques hydrolysent l’esculine (glucoside)
en glucose et en esculine. L’esculine forme avec les ions
Fer(III), un complexe noir qui diffuse dans le milieu.
4 Milieu confirmatif : milieu de Litsky
de Rothe)
Le milieu de Rothe contient du glucose, indispensable à
la croissance des entérocoques (micro-organismes pour
lesquels la présence de peptones ne suffit pas à la production
d’énergie), et un inhibiteur, l’azide de sodium ou azoture
de sodium, qui rend le milieu sélectif pour les bactéries
dépourvues de chaîne respiratoire dont les entérocoques.
Le milieu de Litsky est plus sélectif que le milieu de Rothe car
il contient, en plus de l’azide de sodium, un second inhibiteur,
l’éthyl violet ou cristal violet. Les quelques souches de bacilles
sporulés et coques à Gram positif autres que les entérocoques
donnant des résultats positifs en milieu de Rothe, sont inhibés
en présence d’éthyl-violet.
Le développement des entérocoques se traduit par un trouble
associé à la formation (ou non) d’une pastille violette au fond
du tube.
5 Résultat de la culture sur gélose Slanetz et Bartley (44 h à 36 °C)
6 Dénombrement des entérocoques en milieu liquide par la méthode du NPP
100
10-1
10-2
Bouillon de Rothe
- trouble
+ + +
+ + +
+ + -
+ -
Bouillon de Litsky
- trouble
- pastille violette
+ + +
+ + +
+ + +
+ - +
- - - - -
- ne ne1
- ne ne
ne : test non effectué
1
74
10-3
10-4
-
-
-
-
ne ne ne
ne ne ne
ANNEXE 1
Recherche et dénombrement des entérocoques selon la norme NF EN ISO 7899-2
J0
Filtrer 100 mL d’eau à analyser sur une membrane filtrante de 0,45 µm de
porosité.
Placer la membrane sur une gélose de Slanetz et Bartley avec TTC.
Incuber 44 h à 36 °C.
J1
Dénombrer les colonies caractéristiques d’entérocoques présumées
présentant une coloration rouge, marron ou rose, pouvant être limitée au
centre ou à la périphérie.
En cas de présence de colonies d’entérocoques présumées transférer la
membrane sans la retourner sur une boîte de milieu confirmatif gélose Bile
Esculine Azide (BEA). Placer 2 h à 44 °C.
Compter les colonies d’entérocoques confirmées entraînant l’apparition
d’un halo noir dans le milieu. En cas de doute, une réaction négative au test
de la catalase confirmera la présence d’entérocoques.
ANNEXE 2
Dénombrement des entérocoques selon la norme NF EN ISO 9308-3
Méthode par ensemencement en milieu liquide et détermination du NPP
J0
J1
J2
Réaliser une série de dilutions de l’eau à analyser en eau physiologique
stérile de raison 1/10. Ensemencer trois bouillons présomptifs glucosés à
l’azoture (bouillon de Rothe) avec 1 mL d’eau analysée et de chaque dilution
réalisée. Incuber 24 h à 37 °C.
Lecture des bouillons de Rothe : considérer comme positifs les tubes pour
lesquels on observe un trouble.
À partir de chaque bouillon de Rothe positif, ensemencer à l’aide d’une anse
calibrée, un bouillon confirmatif de Litsky. Incuber 24 h à 37 °C.
Lecture des bouillons de Litsky : la présence d’entérocoques se caractérise
par l’apparition d’un trouble dû au développement bactérien, avec ou sans
dépôt violet au fond du tube.
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Chapitre 3
Dénombrement d'une flore d'un produit microbien
FICHE TECHNIQUE 1
LA FILTRATION D’UN LIQUIDE
1
Stériliser, avant usage, l’unité de filtration par autoclavage.
2
Installer la trompe à vide et placer l’ensemble de l’appareil entre deux becs Bunsen de manière à
ménager une zone de travail stérile.
3
Séparer le godet de la base de l’unité de filtration, en déposant le godet, couvercle à l’envers, derrière
la zone de travail. Ne jamais passer les mains au-dessus des structures ouvertes.
4
Déposer stérilement sur le support, une membrane filtrante neuve et stérile (quadrillage vers le haut).
5
Replacer le godet et l’ouvrir. Déposer son couvercle à l’envers sur la paillasse, toujours derrière la
zone de travail pour éviter de passer les mains par-dessus.
6
Après avoir bien agité le liquide à analyser, le verser doucement jusqu’à la graduation adéquate.
Refermer le couvercle du godet.
7
Faire le vide sans brutalité pour ne pas briser la membrane filtrante et filtrer la totalité
. du liquide
8
Arrêter la filtration.
9
Ouvrir l’unité et rincer (trois fois) avec de l’eau stérile les parois internes du godet pour récupérer les
micro-organismes qui s’y seraient déposés. Filtrer après chaque rinçage.
9
Sécher la membrane filtrante en effectuant plusieurs
. petits vides.
10
Arrêter la filtration.
11
Ouvrir l’unité en déposant toujours le godet, couvercle à l’envers, derrière la zone de travail.
12
Prélever stérilement la membrane filtrante et la déposer sans la retourner sur une gélose nutritive.
Il ne doit pas y avoir de bulles d’air sous la membrane sous peine d’avoir des zones ne permettant
pas la diffusion des nutriments.
Membrane filtrante
sur un support
76
Échantillon d’H2O
filtré au travers
de la membrane
(0,45 µm)
Dépôt de la
membrane
sur une boite
contenant
le milieu.
Incubation
pendant 24 h