AT - Analyses et contrôles du lait cru

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AT de biotechnologies
Analyses et contrôles sur le lait cru
Contexte :
Le lait cru, ou lait de ferme, est un lait
animal (le plus souvent de vache) non
transformé qui conserve donc toutes ses
qualités nutritionnelles. Il est embouteillé
directement à la ferme et est conservé par
simple réfrigération. Les consommateurs
montrent un regain d’intérêt pour le lait
cru qui est même vendu dans des
distributeurs automatiques en libre service.
Or le lait peut subir différentes contaminations d’ordre microbiologique :
-transmission de germes dans le lait directement par des vaches malades (atteintes
de mammite par exemple),
-contamination du lait par manque d’hygiène lors de la traite du lait.
Ces contaminants entrainent des risques pour le consommateur, mais entraînent
également des modifications des caractéristiques physico-chimiques du lait, qui peut donc
être déstabilisé et ainsi nuire à ses qualités organoleptiques et nutritionnelles.
L’absence de traitement, notamment de traitements de conservation, fait du lait cru un
produit sensible soumis à des contrôles stricts pour vérifier l’absence de fraudes chez les
producteurs et ainsi garantir une qualité optimale pour le consommateur.
Le tableau ci-dessous résume les principaux critères admissibles pour un lait cru :
Lait cru
(au stade conditionnement)
Flore totale à 30°C
E.coli
S.aureus
90.000 / mL
Pas de critère
100 / mL
Lait cru
(à la DLC : Date Limite de
Consommation)
300.000 / mL
Pas de critère
500 / mL
L’objectif de la séance est de réaliser sur un lot de lait cru :
-des contrôles microbiologiques (flore totale, E.coli, S.aureus) pour vérifier l’hygiène du
produit (J1),
-des contrôles biochimiques pour vérifier que la présence de flores microbiennes n’entraine
pas d’impact sur les qualités physico-chimiques du produit (J2).
Liste des documents ressources :
-Fiche fournisseur du milieu ColiID ou TBX,
-Fiche technique d’utilisation d’un Pétrifilm.
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Jour 1 : Contrôles microbiologiques sur le lait cru
I-Dénombrement de la flore aérobie totale à 30°C
• Le dénombrement de la flore aérobie totale est un indicateur de la qualité sanitaire globale
d’un lait. Il est réalisé par dénombrement en masse en milieu PCA (Plat Count Agar) à 30°C.
Le lait cru testé étant au stade conditionnement, et en supposant qu’il soit juste à la limite
d’acceptabilité, prévoir la dilution décimale à réaliser pour avoir entre 15 et 300 UFC
comptables. Prévoir un encadrement à ± 1 dilution.
• Réaliser les dilutions décimales en eau peptonée ordinaire de 9 mL, puis ensemencer en
masse, en double essai, les milieux PCA. Incuber 48 H à 30°C.
Exploitation :
Rendre un tableau de résultats, puis exprimer les résultats du dénombrement en UFC / mL.
Conclure à l’aide du document 1.
II-Dénombrement de la flore totale du lait cru par cytométrie directe (technique
de Breed)
Cette technique est utilisée pour un dénombrement approximatif de la flore du lait cru et des
yaourts.
1-Principe
Un volume déterminé d’échantillon de 0,01 mL est étalé sur 1 cm2 à la surface d’une lame.
Le frottis est coloré puis est ensuite observé au microscope : les micro-organismes sont
comptés sur plusieurs champs de surface connue. Il est possible alors de calculer le nombre
de micro-organismes par mL.
2-Technique
-Délimiter un carré de 1 cm de coté au marqueur indélébile sur une lame.
-Stériliser la lame à la flamme.
-Homogénéiser le lait et prélever exactement 0,01 mL avec une pipette automatique.
-Déposer ce volume sur la face non marquée, au centre du carré observé par transparence.
-Etaler le volume déposé avec la pointe du cône sur toute la surface du carré sans déborder.
-Sécher le frottis ainsi réalisé à l’étuve à 55°C pendant 5 min environ. Il est très important
qu’il soit bien sec pour que la coloration adhère bien.
-Laisser refroidir, puis recouvrir le frottis de bleu de méthylène pendant 30 secondes
-Egoutter la lame jusqu’à ce qu’elle soit complètement sèche.
-Laver sous un très léger filet d’eau.
-Sécher et examiner à l’immersion.
-Compter les micro-organismes présents dans une vingtaine de champs microscopiques (une
chainette ou un amas = 1 micro-organisme). Faire la moyenne des résultats sur les champs
comptés.
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3-Exploitation
-Sachant que le diamètre d’un champ microscopique à l’objectif x1000 est de 180 µm,
déterminer la surface d’un champ microscopique (surface cercle = 3,14 x r2)
-A l’aide de la moyenne des micro-organismes comptés par champ, calculer le nombre total
de micro-organismes déposés sur 1 cm2, puis exprimer la concentration en micro-organismes
/ mL de lait cru.
-Comparer ce résultat avec les résultats du dénombrement de flore totale sur milieu PCA en
J2.
III-Recherche et dénombrement des coliformes et E.coli
1-Intérêt de la recherche des coliformes et d’E.coli en microbiologie alimentaire
Les coliformes sont des entérobactéries appartenant à différents genres : Citrobacter,
Enterobacter, Escherichia… que l’on retrouve fréquemment dans l’environnement, ainsi que
dans l’intestin des mammifères, dont l’homme.
Cf supports théoriques « Les flores de contamination »
Parmi ces différentes bactéries, E.coli est très intéressante car elle est le seul coliforme
totalement spécifique de l’intestin : c’est donc un témoin de contamination fécale. De plus,
E.coli est un germe relativement fragile, qui ne peut survivre longtemps dans
l’environnement.
La recherche d’E.coli est donc très intéressante : si la bactérie est présente dans un aliment,
cela signifie que celui-ci a été récemment contaminé par des matières fécales et que d’autres
pathogènes peuvent être présents : on parle de contamination fécale récente. Il faudra
donc ensuite rechercher la source de la contamination et corriger la situation.
la recherche d’E.coli dans un lait cru est donc un critère important permettant
de vérifier que celui-ci a été prélevé et stocké dans de bonnes conditions
d’hygiène.
2-Méthodes d’étude des coliformes et d’E.coli
Il existe de nombreuses méthodes d’étude des coliformes et d’E.coli utilisant des milieux
variés. Les normes récentes permettent d’utiliser de nouveaux milieux de culture dits
chromogéniques, qui permettent de différencier directement E.coli des coliformes (exemple
du milieu de culture ColiID de Bio-Mérieux ou du milieu TBX).
3-Dénombrement sur milieu ColiID ou TBX
On réalisera le dénombrement en surface, en simple essai, à partir des dilutions 10-1, 10-2 et
10-3. Incuber selon les recommandations proposées dans la fiche fournisseur.
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Exploitation :
-A l’aide de la fiche fournisseur, identifier les colonies caractéristiques de E.coli sur TBX ou
ColiID.
-Rendre un tableau de résultats, puis exprimer les résultats du dénombrement en UFC / mL
par calcul classique, puis à l’aide de la formule AFNOR ci-dessous. Comparer les résultats
obtenus.
-Le tableau en introduction ne mentionne aucun critère pour E.coli. Quel est donc l’intérêt de
ce dénombrement ?
Formule AFNOR
N = concentration en UFC /mL
Σc : somme des colonies comptées sur les boites choisies
Σc
N=
n1 = nombre de boites comptées à la première dilution
n2 = nombre de boites comptées à la deuxième dilution
(n1 + 0,1 n2) x V x d
V = volume d’inoculum par boite
d = première dilution
IV-Recherche et dénombrement de Staphylococcus aureus
1-Intérêt de la recherche de Staphylococcus aureus en microbiologie alimentaire
S.aureus est une bactérie commensale de l’homme : on la retrouve dans les cavités ORL à
partir desquelles elle est disséminée en aérosols sur la peau, y compris les mains. Elle peut
être pathogène dans certaines circonstances et au niveau de certains tissus (pathogène
opportuniste).
Dans l’industrie alimentaire, pour se préserver de S.aureus, l’hygiène des opérateurs doit
donc être irréprochable : lavage des mains, lavage des bottes, désinfection des matériels,
port d’équipement spéciaux (masques, charlottes, etc.).
Dans le cadre d’un dénombrement sur du lait cru, cette recherche permet donc de vérifier
les bonnes conditions d’hygiène du personnel dans le local de traite.
2-Dénombrement sur Pétrifilm Staph express
A l’aide de la fiche technique fournie, proposer le protocole à mettre en œuvre pour
dénombrer S.aureus sur Pétrifilm Staph express. On testera la dilution 100 en simple essai.
Exploitation :
-A l’aide de la fiche fournisseur, identifier les colonies caractéristiques de S.aureus sur
Petrifilm Staph express.
-Rendre un tableau de résultats, puis exprimer les résultats du dénombrement en UFC / mL,
à l’aide de la formule AFNOR. Conclure.
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Jour 2 : Contrôles biochimiques portant sur le lactose
La concentration massique normale en lactose du lait représente environ 50 g/L. Ce glucide
est un diholoside, de formule développée suivante (représentation de Haworth) :
Lorsque le lait cru subit une contamination importante, les micro-organismes à l’aide de leur
β galactosidase peuvent dégrader le lactose en libérant ses oses constitutifs. Ces oses sont
ensuite consommés par les germes pour former de l’acide lactique, ce qui acidifie le lait et
peut à terme le faire cailler.
Deux contrôles biochimiques seront réalisés pour vérifier que le lait cru n’a pas subit
d’altérations (par binôme) :
-une caractérisation du lactose par chromatographie sur couche mince (élève 1),
-un dosage du lactose par méthode spectrophotométrique (élève 2).
I-Défécation préliminaire
La couleur blanche opaque du lait empêche d’y mesurer une absorbance. Cette opacité
provient des grosses protéines lactiques (caséines) et d’émulsions de matières grasses : on
élimine donc au préalable ces composés parasites par précipitation + centrifugation (=
défécation)
Protocole
Introduire dans un tube centrifugeable,
-5 mL de lait cru (préalablement stérilisé pour éliminer les micro-organismes),
-5 mL de solution défécante (solution de sulfate de cuivre et de zinc)
Laisser agir au moins 5 minutes pour précipiter les protéines et les matières grasses, puis
centrifuger à 4500 rpm pendant 5 min.
Récupérer le filtrat.
La préparation de ce tube a été réalisée à partir du lait cru du J1 : le filtrat est fourni prêt à
l’emploi.
II-Caractérisation du lactose du lait par chromatographie sur couche mince
Réactifs
Pictogrammes de sécurité
Molish
Solvant de migration
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1-Système chromatographique utilisé
- Une phase fixe (= phase stationnaire), constituée par un adsorbant, le gel de silice,
qui est solide et polaire. Le gel de silice est étalé sur un support inerte constitué d’une
couche mince de plastique.
- Une phase mobile constituée d’un mélange de 3 solvants : butan 2-one / acide acétique
/ méthanol, plus apolaire que la phase fixe.
la phase fixe étant de nature solide, il s’agit d’une chromatographie d’adsorption.
2-Révélation
Après migration, les spots obtenus sont révélés par une réaction colorée spécifique des
glucides. On utilise comme révélateur le réactif de Molish qui donne une coloration
bleue-violette en présence de glucides.
3-Mode opératoire
3.1-Préparation de la cuve
-Tapisser les parois de la cuve avec du papier filtre.
-Introduire dans la cuve environ 1 cm de mélange de solvants : butan 2-one / acide acétique
/ méthanol dans les proportions 3V/1V/1V).
-Laisser l'atmosphère de la cuve se saturer en vapeurs de solvants pendant 15 minutes.
3.2-Réalisation des dépôts
Attention : manipuler soigneusement les plaques pour ne pas rayer la silice. Ne pas toucher
avec les doigts : utiliser des pinces et déposer les plaques sur du papier filtre.
-Matérialiser la ligne de dépôts en traçant, très légèrement au crayon de papier, une ligne
horizontale à environ 3 cm du bord inférieur de la plaque.
Remarque : les plaques sont fournies réactivées par passage à l’étuve à 100°C / 30 min.
-Marquer les emplacements des dépôts, régulièrement espacés, en laissant une marge de
chaque côté pour limiter les effets de bord.
-A l’aide d’un capillaire calibré de 3 µL, déposer la solution de sucres pour chaque dépôt. On
surcharge chaque dépôt 3 fois (sécher immédiatement entre chaque dépôt au séchoir
électrique, pour éviter l'étalement de la tache qui ne doit pas excéder 3 mm de diamètre).
-Déposer sur la plaque :
- 3 solutions témoins (à choisir par parmi les solutions suivantes disponibles :
saccharose, glucose, arginine, galactose, tyrosine, lactose).
- deux essais du filtrat du lait cru après défécation.
3.3-Migration
-Introduire la plaque dans la cuve en évitant les mouvements du solvant et en vérifiant que
la ligne de dépôt se trouve au dessus du niveau du solvant.
-Laisser migrer jusqu'à ce que la phase mobile ait parcouru au moins les 4/5 de la hauteur
de la plaque.
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3.4-Révélation
-Sortir la plaque de la cuve (sous hotte ventilée).
-Noter immédiatement, et à main levée, à l'aide d'un crayon le front du solvant.
-Laisser sécher la plaque sous hotte, en s'aidant éventuellement du séchoir électrique.
-Lorsque la plaque est sèche, sous hotte ventilée, appliquer le réactif de Molisch à l’aide d’un
pinceau, de la façon la plus homogène possible, sans appuyer sur le pinceau pour éviter de
rayer le gel de silice.
-Laisser la coloration se développer en plaçant la plaque à l'étuve à 100°C pendant 15 min.
4-Exploitation
-Justifier le choix des 3 solutions témoins
-Faire un schéma du chromatogramme.
-Dans un tableau, préciser la forme et la couleur des spots obtenus et calculer les Rf.
-Expliquer les différences de migration entre les glucides testés.
-Identifier le/les sucres dans le filtrat du lait cru.
-Que penser de la qualité du lait ?
III-Dosage du lactose dans le lait par méthode enzymatique en point final avec
un étalon unique
L’échantillon utilisé pour réaliser le dosage est le filtrat du lait cru après défécation.
1-Réflexion préliminaire autour du protocole
-Estimer la concentration massique approximative en lactose du filtrat.
-La limite de validité de la méthode de dosage spectrophotométrique qui sera utilisée est de
3 g/L de lactose. Proposer la dilution du filtrat à prévoir pour réaliser le dosage dans de
bonnes conditions (volume maximal de filtrat dilué à préparer = 50 mL)
2-Mode opératoire
On dispose : -d’une solution étalon de lactose à 2 g/L,
-du filtrat préalablement dilué par vos soins.
Réaliser le dosage selon le protocole suivant (cuves spectrophotométriques standards) :
Echantillon (µL)
Tampon acétate pH 4,5 (µL)
Etalon
100
Essai (x2)
100
200
200
Solution de β galactosidase (µL)
100
100
Incuber 30 min à 37 °C
Tampon phosphate pH 7 - 1 mol/L (µL)
200
200
Solution réactionnelle à la glucose oxydase
2
2
/ peroxydase (mL)
Incuber 15 min à 37°C
Lire l’absorbance à 505 nm contre un blanc adapté (la composition est à prévoir)
ATTENTION : bien identifier la nature de l’échantillon qui sera à placer dans chaque cuve.
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3-Exploitation
Questions :
-Quel est le rôle de la β galactosidase utilisée dans le protocole ?
-Sachant que la solution réactionnelle utilisée est la même que celle de la séance précédente
(kit de dosage Glucose RTU), écrire les équations de réactions successives qui se déroulent
lors de ce protocole.
-Ce dosage est une méthode enzymatique dit en « point final ». Expliquer cette notion.
-Faire un logigramme schématique résumant la manipulation, en partant de l’étape de
défécation préliminaire, jusqu’au dosage spectrophotométrique final.
Exploitation des résultats expérimentaux :
-Pour chacun des essais, calculer la concentration massique en lactose dans le filtrat, puis
dans le lait cru.
-Comparer la concentration massique en lactose du lait obtenue expérimentalement et le
résultat théorique attendu.
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Formules développées des composés témoins à disposition pour la CCM
Saccharose
H2C
OH
Galactose
O
H2C
OH
OH
OH
O
H
OH
OH
OH
OH
CH2OH
O
O
OH
OH
CH2OH
OH
Tyrosine
O
H2N
Glucose
H2C
CH
C
OH
CH2
OH
O
OH
OH
OH
OH
OH
Lactose
Arginine
O
H2N
CH
C
OH
CH2
CH2
CH2
NH
C
NH
NH2
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