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introduction

INTRODUCTION
Depuis leur découverte par Pfeiffer au siècle dernier (32 )sous le nom
d'endotoxines, les lipopolysaccharides (LPS) des bactéries à Gram négatif n'ont cessé
d'être l'objet de recherches pointues.
Les LPS contribuent hautement à la virulence de ces germes, ils constituent un
facteur primordial dans le déclenchement du processus inflammatoire (32).
Ils induisent la libération de cytokines (IL1, TNF) et d'autres médiateurs de la
réponse immune par action directe sur les cellules de l'immunité telles que les
monocytes-macrophages et les polynucléaires neutrophiles.
D'autre part, les endotoxines sont des activateurs polyclônaux des lymphocytes
B et peuvent ainsi induire la production d'anticorps anti-LPS qui peuvent être
protecteurs. (46)
Constituants majeurs de la membrane externe, les LPS sont incriminés dans le
choc septique à bactérie à Gram négatif et dans la résistance de ces germes aux
agents thérapeutiques courants principalement quand ils proviennent d'infections
nosocomiales.
C'est dans ce contexte que nous nous sommes proposé d'étudier les LPS de
plusieurs souches bactériennes.
Par ailleurs, il existe des différences dans la structure du LPS selon le type de
colonie (lisse ou rugueuse) formé par la bactérie.
Les souches rugueuses , de LPS plus simple sont généralement moins
virulentes (7,21) et ont un comportement vis à vis des antibiotiques , différent de
celui des souches lisses parentales (55).
Notre étude consistera donc à :
- réisoler des souches bactériennes de profils d'antibiorésistance et ou de
virulence connus,
- transformer les formes lisses d'origine en forme rugueuses,
- extraire les LPS des deux types de souches (LPSS et LPSR),
- caractériser ces LPS par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en
présence
de dodécyl sulfate de sodium (SDS-PAGE),
- tenter d'établir une corrélation entre la structure de l'endotoxine et
la virulence et ou l'antibiorésistance des souches.
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I- STRUCTURE EXTERNE DE LA BACTERIE.
Au delà de la membrane cytoplasmique, les enveloppes bactériennes sont
indispensables à la vie. Elles consistent en :
- une paroi rigide nécessaire au maintien de l’importante pression osmotique
intracellulaire générée par les fortes concentrations en ions, métabolites et autres
macromolécules.
- une membrane externe qui surplombe la paroi.
La paroi, de par sa rigidité confère sa forme à la bactérie et assure avec
l’enveloppe externe, la protection (physique, chimique et immunologique) de la
cellule (36).
La plupart des bactéries d’intérêt médical sont classées selon l’architecture de
leur paroi.
La différence dans la structure de cette paroi est révélée par la coloration de Gram
(63)
- les bactéries à Gram positif apparaissent bleu-violet.
- les bactéries à Gram négatif apparaissent rose-rouge.
Le mécanisme de coloration de Gram semble lié à l'épaisseur de la paroi et à sa
perméabilité. La seule composition chimique de la paroi ne permet pas à priori
d'expliquer cette différence de coloration. En effet les champignons levuriformes de
structure différente des bactéries à Gram positif se révèlent également Gram positif.
L'enveloppe des bactéries à Gram négatif est plus fine que celles des bactéries
à Gram positif et est caractérisée par une membrane externe de structure complexe,
support de la pathogénie de ces bactéries.
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I.1. Constituants de l’enveloppe des bactéries à Gram négatif
(Figure 1)
De l'intérieur vers l'extérieur on distingue :
I.1.1. La membrane cytoplasmique (4).
- La membrane cytoplasmique est constituée d'une bicouche phospholipidique,
dont la perméabilité, très limitée pour les molécules pôlaires, est influencée par la
longueur des chaînes et le degré de saturation des acides gras qui la composent
- il existe des protéines appelées "perméases" qui sont insérées dans cette
double couche hydrophobe et qui facilitent le passage à travers la membrane.
- le feuillet externe de la membrane cytoplasmique porte les protéines liant les
pénicillines (PBP= penicillin binding protein), protéines cibles de l'action
antibiotique des bêta lactamines.
L'accés aux PBP est limité chez les bactéries à Gram négatif, du fait de la
difficulté de pénétration de leur paroi par les bêta lactamines.
I.1.2. L'espace périplasmique (4).
L'espace périplasmique est la zone se trouvant immédiatement après le
membrane cytoplasmique. Il renferme entre autres substances, les bêta lactamases
qui sont des enzymes capables d'hydrolyser les bêta lactamines.
Les bêta lactamases, situées stratégiquement sur le passage obligé des bêta
lactamines, constituent le mécanisme principal de résistance des bactéries à ces
antibiotiques.
I.1.3. La paroi.
Elle est essentiellement constituée du peptidoglycane ou muréine (52).
Il est spécifiquement responsable de la forme et de la rigidité structurale de la
bactérie.
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- C'est un énorme polymère composé de longues chaînes polysaccharidiques
constituées de N- acétyl glucosamine et d'acide N- acétyl muramique reliées entre
elles par des ponts peptidiques.
- Plusieurs enzymes interviennent dans la synthèse du peptidoglycane.Les
principales sont :
- la transglycosylase, responsable de la formation des chaînes
polysaccharidiques.
- la transpeptidase, qui permet l'union des chaînes polysaccharidiques
entre elles.
- la carboxypeptidase qui inhibe l'action de la transpeptidase
déterminant
ainsi une régulation dans la synthèse du peptidoglycane et donc
de son
épaisseur (4).
- les bêta lactamines agissent en inhibant les transpeptidases : elles se fixent sur ces
enzymes cibles (ou PBP) et bloquent la synthèse du peptidogycane. Ceci aboutit à
l'arrêt de la croissance puis à la mort de la bactérie.
I.1.4. La membrane externe (64).
La membrane externe est une structure complexe, plissée, crevassée et
ondulée, d'une épaisseur de 75 Å. Comme la membrane cytoplasmique elle est
formée d'une bicouche hydrophobe, à la seule différence que la dite bicouche est
asymétrique ; les lipides constituant les feuillets internes et externes; étant différents.
La membrane externe agit donc comme une barrière de perméabilité sélective,
qui empêche l'entrée de substances aussi bien hydrophobes qu'hydrophiles au delà
d'une certaine taille. Elle retient en outre les protéines périplasmiques à l'intérieur
(4).
Du point de vue physiologique, la membrane externe permet à la bactérie de
résister aux facteurs de défense de l'hôte tels que le lysozyme ou des protéines
leucocytaires très toxiques pour les bactéries à Gram positif. Elle assure la protection
des entérobactéries germes commensaux du tractus digestif, contre la dégradation par
les sels bilaires ou les enzymes digestives.
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La membrane externe comprend :
I.1.4.1. Les phospholipides (64)
Les phospholipides sont situés sur le feuillet interne et sont essentiellement
constitués de phosphatidyl éthanolamine. Ils sont constitués d'acides gras peu
saturés, d'où leur fluidité (1).
I.1.4.2. Les lipopolysaccharides (LPS) (52)
Les LPS ou endotoxines sont situés sur le feuillet externe de la membrane
externe.
Comme leur nom l'indique, ils sont constitués d'une partie lipidique et d'une
partie polyosidique.
A l'opposé des phospholipides, ils constituent la partie externe de la bicouche
hydrophobe. Ils forment une couche moins fluide que les phospholipides : d'une part
parce que leurs acides gras constitutifs ont un degré de saturation plus important,
d'autre part, parce que les chaînes de LPS sont reliées entre elles par des ions Mg2+
ou Ca2+, assurant la stabilité de l'ensemble.
I.1.4.3. Les protéines (4)
Elles représentent près de la moitié du poids total de la membrane externe.
Les principales sont :
* Les porines
- ce sont des canaux protéiques remplis d'eau permettant le passage de petites
molécules hydrophiles à travers la couche phospholipidique et la membrane externe.
- Les porines sont indispensables à la survie de la bactérie : elles permettent la
diffusion de nutriments essentiels. Il existe une interaction entre porines et LPS. En
effet, ces derniers déterminent leurs orientation et exposition à la surface
bactérienne.
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* La muréine - lipoprotéine
Elle assure la stabilité de l'ensemble de la membrane externe : elle a pour rôle
de mieux ancrer la membrane externe au reste de la cellule. Une de ses extrémités est
liée à la surface externe du peptidoglycane, l'autre, lipidique s’insère dans la
membrane externe.
La particularité fonctionnelle de la membrane externe des bactéries à Gram
négatif réside dans la forte sélectivité de la barrière qu'elle constitue.
I.2. Les lipopolysaccharides.
I.2.1. Définition.
Au siècle dernier, Pfeiffer inventa le terme "ENDOTOXINE", pour nommer
une substance thermo-stable, biologiquement active, découverte dans le filtrat de
culture de bactéries à Gram négatif. (32)
L'endotoxine également appelée lipopolysaccharide est un élément constitutif
de la paroi de toute bactérie à Gram négatif. C'est un complexe macromoléculaire
glucido-lipidoprotéique présentant l'antigène somatique des bactéries de souches
lisses. Les mutants rugueux de ces souches ont une endotoxine de structure plus
simple (27).
En réalité, le terme "endotoxine" désignait à l'époque de sa découverte, une
toxine en majorité polysaccharidique, thermostable et retrouvée dans le filtrat de
culture sous forme encore liée à la cellule au niveau des protéines de la membrane
externe. Ce terme avait donc été choisi par opposition au premier type de toxine
connu "l'exotoxine", de nature protéique, thermolabile et retrouvée libre, détachée de
la cellule, dans le filtrat de culture.
Le lipopolysaccharide proprement dit était donc la substance thermostable,
biologiquement active découverte par PFEIFFER. L'ensemble LPS lié aux protéines
de la membrane externe formait alors, l'endotoxine.
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Cependant, il est possible pour simplifier, d'utiliser l'un ou l'autre des 2 termes
pour évoquer les propriétés endotoxiques thermostables du LPS, siégeant dans sa
portion lipidique (64).
I.2.2. Localisation.
Les lipopolysaccharides (LPS) constituent la couche lipidique la plus externe
de la paroi des bactéries à Gram négatif.
Les LPS sont situés sur le feuillet externe de la membrane externe où ils
forment une surface lipidique plus rigide que celle classiquement formée par les
phospholipides dans les autres membranes (46).
Les LPS représentent 40 % de la surface cellulaire ; la membrane externe est
asymétrique, en ce sens que tous les LPS se concentrent dans son feuillet externe
(64).
Le LPS est le produit final d'un processus biosynthétique complexe. Cette
synthèse a lieu au niveau de la membrane cytoplasmique où sont assemblés les
divers constituants de la macromolécule ; il se produit ensuite une translocation
rapide qui transfere irréversiblement le LPS complet sur la membrane externe (64,
47).
L'endotoxine est l'élément déterminant de l'interaction de la bactérie à Gram
négatif, avec son environnement ; cette fonction est assurée par ses chaînes latérales
polysaccharidiques, support de la spécificité antigénique O.
Des techniques utilisant la ferritine conjuguée à des anticorps anti LPS et
couplés à la microscopie électronique montrent que l'antigène O peut s'étendre sous
forme de rubans jusqu'à 150 nm au delà de la paroi (61).
I.2.3. Etude immunochimique du LPS.
Le LPS est le constituant majeur de la membrane externe des bactéries à Gram
négatif (13). C’est un complexe macromoléculaire hétérogène comprenant :
- une fraction polyosidique
- une fraction lipidique
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En effet, le microscope électronique permet de visualiser, chez les souches
lisses, la structure tridimensionnelle (41) du LPS "complet" qui comporte:
- deux couches de polysaccharides
- des lipides apôlaires, occupant la zone interne ancrée dans la membrane.
Le LPS est lié aux autres constituants de la paroi par des ions bivalents tels
que les ions magnésium Mg2+. Ceci explique le fait que des agents chélateurs tel
que l'EDTA puissent libérer jusqu'à 50% du LPS total des bactéries à Gram négatif.
I.2.3.1. Extraction du LPS.
En vue d'isoler et d'étudier le LPS, plusieurs méthodes d'extraction ont été
entreprises au niveau de la membrane bactérienne (61).
- dans la méthode de BOIVIN, l'acide trichloracétique libère un complexe
glucido-lipidoprotéique qui est précipité par l'alcool.
- dans la méthode phénol-eau de WESTPHAL
- la couche lipoprotéinique est dissoute par le phénol
- le LPS passe dans la phase aqueuse (62).
Dans la méthode de WESTPHAL, l'extraction est suivie d'une purification par
précipitation fractionnée dans l'alcool et par action de nucléases.
- Le LPS des souches rugueuses (LPSR) peut être extrait par la méthode de
GALANOS, qui utilise un mélange phénol-chloroforme-éther de pétrole.(31)
En outre, l'électrodialyse permet d'obtenir des LPSR sous forme de sels de
solubilité satisfaisante : après extraction, l'endotoxine donne généralement une
structure filamenteuse agrégée difficilement dissociable (61).
L'une des premières informations fournies par ces diverses préparations est la
taille du LPS qui peut varier de 10 à 200 Kilodaltons.
Cette donnée est d'autant plus importante que l'activité biologique du LPS,
dont l'étude constitue l'enjeu premier de son extraction, dépend du poids moléculaire
de ladite particule.
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Il régne,en conséquence, une forte hétérogénéité, au niveau des molécules de
lipopolysaccharides, au sein d'une même espèce bactérienne.(15)
I.2.3.2. Etude immunochimique du LPS.
Selon Westphal (62), le LPS obtenu par la méthode phénol eau à partir de
bactéries de souches lisses, comprend trois régions :
I- les chaînes latérales polysaccharidiques, à spécificité O
II- le noyau polysaccharidique de base ou "core oligosaccharide"
III- le lipide A (Figure 2)
- Les fractions polyosidiques portent les caractéres antigéniques :
. O, au niveau des chaines latérales, quand il s'agit de souches lisses (S)
. R, au niveau du polysaccharide de base, pour les souches rugueuses (R).
Les LPS les plus étudiés sont ceux des entérobactéries, particulièrement ceux
des salmonelles.
Ainsi, la classification de KAUFFMAN-WHITE permet de distinguer les
salmonelles en fonction de la nature de leurs antigénes O et H. (24,28); pour une
étude sérologique et biochimique, les régions I et II peuvent être séparées de la
région III non hydrosoluble par hydrolyse acide douce, à pH3 (64).
I-2-3-2-1- Les chaînes polysaccharidiques à spécificité
O.
Elles consistent en un polymère antigénique (antigéne O) communément
appelé "chaînes latérales", du fait de leur émergence à la surface de la bactérie.
L'hydrolyse acide permet d'obtenir ces polyosides en vue d'en étudier la
structure.
Les chaînes latérales sont composées de séquences oligo-saccharidiques
répétitives de 3 ou 4 monosaccharides (64).
Chez Salmonella typhimurium, le monomère constituant l'antigéne O est un
tétrasaccharide formé de :
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- galactose
- rhamnose
- mannose
- abequose
- Aprés assemblage sur un lipide transporteur, les monomères d'antigéne O
se polymérisent. La polymérisation est catalysée par une polymérase. Le géne
codant pour cette enzyme se situe sur le locus rfc. Pendant que la polymérisation se
poursuit, une fraction du polymère déjà formé est détachée du pool de
polymérisation et transférée à une molécule "lipide A-core oligosaccharide" déjà
formée.
L'enzyme responsable de ce transfert est une ligase, dont le géne codant
correspond aux loci rfb T et rfal.
Le LPS complet ainsi formé migre par translocation de la surface externe de
la membrane cytoplasmique à la membrane externe.
L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide, en présence de dodécyl sulfate de
sodium a révélé que la distribution des monomères d'antigéne O, dans la molécule de
LPS n'est pas uniforme au sein des bactéries à Gram négatif; elle est multimodale et
spécifique d'une souche bactérienne (13).
Ceci explique le polymorphisme des LPS.
En effet, chez Escherichia coli,on connaît 170 formes d'antigéne O (46). De
même chez les salmonelles, on distingue 67 facteurs O différents selon la
constitution de l'oside terminal des chaînes latérales : c'est à dire la nature et/ou le
mode de liaison d'au moins 3 ou 4 sucres.
Il existe par conséquent, un lien étroit entre la spécificité antigénique O d'un
sérovar de salmonelle et la structure chimique de son LPS (24, 28).
- En outre, l'antigéne O constitue un site récepteur, spécifique de certains
bactériophages (64).
Cette spécificité "bactériophagique" est elle aussi, déterminée par le profil
hydrocarboné de la molécule de LPS.
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- Certaines souches bactériennes perdent l'antigéne O quand elles sont
cultivées au laboratoire, dans des conditions particulières. Ce phénomène est le
résultat d'une mutation qui affecte soit la synthèse de l'antigène O lui même (mutant
rfb) soit la synthèse du coreoligosaccharide (mutant rfa) : l'antigène O, en général, ne
se lie pas à un core incomplet (46).
Ces deux types de mutants donnent sur gélose, des colonies plates et
rugueuses (souches R).
I.2.3.2.2. Le noyau polysaccharidique de base ou core
oligosaccharide.
- Cette région peut être arbitrairement scindée en core interne et core externe (63)
-Le core interne est composé de :
. acide 2 céto 3 déoxyoctonique (KDO)
. heptose
. phosphate
. pyrophosphate lié à de l'éthanolamine.
Le KDO est lié au glucosamine du lipide A.
Le core interne est commun à tous les LPS des souches lisses et des mutants
rugueux de type Ra.
- le core externe comprend :
. des hexoses : glucose, galactose, N-acétylglucosamine
Toutes les Salmonella ont un core oligosaccharide commun,(Figure 3) lequel
différe de celui des Shigella ou des Escherichia.
C'est au niveau de la membrane cytoplasmique que le core se forme : ses
sucres constitutifs sont additionnés au lipide A de façon séquentielle, pour former
l'unité "lipid A-core" auquel viendra se fixer la polymère d'antigéne O (13).
Comme le montre le Figure 3, le core des Salmonella est un polysaccharide
linéaire. Les mutants R, incapables de synthétiser l'antigéne O ou de franchir
l'ensemble des étapes de la synthése du noyau oligosaccharide peuvent être classés
en fonction du niveau d'avancement de la synthèse de leur chaîne polysaccharidique :
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les mutants rugueux "profonds" qui sont incapables de synthétiser le core
interne : mutants Re.
. les mutants "superficiels" qui ne synthétisent pas le core externe.
Par ailleurs, cette mutation revêt un intérêt clinique. En effet, les patients
présentant des titres élevés en anticorps anti LPS Re, ont moins de risque de choc et
de décès que ceux ayant des taux bas (64).
I.2.3.2.3. Le lipide A
- pour étudier le lipide A, Lüderitz et coll (29) utilisent des mutants Re, qui
sont les formes les plus rudimentaires de LPS .
- le lipide A des Salmonelles est constitué d'un squelette de Béta 1-6
diglucosamine auquel se rattachent :
des phosphates
de longues chaînes d'acides gras (acides laurique, myristique,
hydroxymyristique et palmitique...) liés au diglucosamine (13) au niveau de ses
groupements hydroxyl et amine.
Ces acides gras constituent 60% du poids total de la molécule.
- Du fait de sa richesse en acides gras, le lipide A se comporte comme un
phosphoglycolipide trés peu soluble dans l'eau.
Le KDO améliore l'hydrosolubilité du lipide A et peut en être séparé par
hydrolyse acide douce laquelle clive la liaison cétosique.
Le lipide A est la partie la plus interne du LPS : il est complétement ancré
dans la membrane externe où il se lie à des phospholipides et à des protéines
membranaires.
La synthèse du lipide A est la première étape de l'élaboration du LPS. Les
gènes impliqués sont dispersés, et dans certains cas,associés à des gènes
responsables de la synthése d'autres macromolécules. On présume que ceci permet de
coupler la biosynthése du LPS à la croissance bactérienne. (1)
Le lipide A isolé n'existe pas dans la nature, en tant que précurseur du LPS :
au niveau de la membrane cytoplasmique, il se forme un composé précurseur du
lipide A, auquel se fixe le KDO : (Lipide A+ KDO = Re LPS), puis les sucres
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composant le core viennent s'ajouter de façon séquentielle pour former l'unité
"Lipide A - core oligosaccharide".
Les monomères d'antigéne O préalablement formés dans le cytoplasme et pris
en charge par un lipide transporteur passe sur la surface externe de la membrane
plasmique où ils se lient à la molécule Lipide A-core (13).
II. ETUDE PHYSIOLOGIQUE DU LPS : propriétés biologiques
L'endotoxine ou LPS, complexe macromoléculaire comportant une portion
lipidique liée de façon covalente à une partie polysaccharidique est responsable de la
majorité des effets biologiques liés à l'infection par les germes à Gram négatif.
La composante glycolipidique constante du LPS, le lipide A, est le support des
propriétés endotoxiniques thermostables.
La spécificité sérologique réside dans la portion polysaccharidique variable,
qui correspond à l'antigène somatique O des bactéries à Gram négatif.
II.1.
Propriètés
physiopathologique.
endotoxiniques
thermostables
du
LPS:
L'injection de LPS à l'animal produit des effets variables tels que : la fièvre, le
choc fotal, la nécrose tissulaire et des actions intravasculaires et/ou abortives.
II.1.1. L'effet pyrogène.
Il constitue l'action endotoxinique la mieux connue, car l'homme y est
paticulièrement sensible ; la contamnation des liquides de transfusion par les LPS a
longtemps été une intrigue. La sensibilité du lapin à cet effet du LPS, en fait l'animal
de prédilection pour le contrôle des produits pharmaceutiques injectables à l'homme.
Le mécanisme de la réponse fébrile est complexe . Le temps de latence qui la
précède a suggéré que l'action du LPS n'était pas directe sur les centres
hypothalamiques de régulation de la température ; il existe un médiateur d'origine
leucocytaire (monocyte-macrophage) appelé "pyrogène endogène" qui induit la
synthèse de prostaglandines hypothalamiques responsables de la fièvre (34).
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Cette fièvre s'accompagne d'une modification du taux des protéines
plasmatiques dites de la phase aiguë de la réaction inflammatoire, à savoir le
fibrinogène, la protéine C-réactive, la transferrine etc...
II.1.2. L'effet léthal (23).
- Le chien et le lapin ont une sensibilité relativement importante à l'effet léthal
de l'endotoxine (DL50 = 0,025mg/Kg)
- Les oiseaux, comme la plupart des animaux à sang froid sont réfractaires à
cet effet. Cependant, l'embryon de poulet est tué par l'injection intraveineuse de très
faibles doses d'endotoxine (DL 50 : 0,003 mg/kg)
- Les gluco-corticoïdes jouent un rôle important dans la résistance au choc
fatal. Il semblerait que l'action hormonale ait lieu sur la perméabilité capillaire.
- Un état d'hyperréactivité aux endotoxines s'observe chez la souris quelques
jours ou quelques semaines après l'injection de bactéries viables ou tuées comme
Bordetella pertussis.
Le mécanisme de cette sensibilisation est probablement lié à la prolifération
des macrophages et à la stimulation de l'activité phagocytaire qui s'accompagnent
d'une augmentation de la résistance aux infections.
Par ailleurs, les endotoxines étant des substances antigéniques susceptibles de
présenter de nombreuses réactions croisées, certains auteurs ont tenté d'expliquer le
choc à bactéries Gram négatif comme étant une réaction d'hypersensibilité.
Cependant, de nombreuses thèses attestent qu'il ne s'agit pas d'un processus
immunologique.
C'est ainsi que KIM et Watson (25) ont démontré la toxicité primaire du LPS
chez le porcelet nouveau-né avant même l'ingestion du colostrum.
II.1.3. La nécrose tissulaire
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L'injection intraveineuse de deux faibles doses d'endotoxine, à 24 ou 48
heures d'intervalle, provoque chez le lapin une nécrose rénale bilatérale aboutissant à
la mort : c'est la réaction généralisée de SCHWARTZMAN.
La réaction localisée de SCHWARTZMAN est quant à elle, le résultat d'une
probable action locale d'adrénaline. Elle consiste en une lésion hémorragique de la
peau, au lieu d'injection : le lapin est sensibilisé par une première dose intradermique
avant de recevoir, 24 heures plus tard, une seconde dose intraveineuse.
II.1.4. Les manifestations vasculaires
Ceux ci sont essentiellement :
- l'hypotension artérielle qui conduit à une congestion des organes.
- l'activation de la coagulation sanguine : à cet effet des LPS coopèrent les
plaquettes, les leucocytes et le complément (34)
II.1.5. L'action abortive
Elle s'observe chez la souris gestante. On l'attribue à une libération de
sérotonine par les plaquettes, suite à une injection de LPS.
II.1.6. Actions diverses
Le LPS est en outre responsable de troubles mineurs tels que :
- leucopénie
- troubles du métabolisme (du glucose notamment), par atteinte du foie (32)
- augmentation de la sensibilité à l'adrénaline. (23)
Il est à noter par ailleurs, que le peptidoglycane possède des propriètés
"Endotoxin-like" anciennement connues, et non imputables à une contamination par
l'endotoxine; le peptidoglycane pouvant être extrait de la paroi des bacilles à gram
positif, indemne de LPS.
II.2. Propriétés immunologiques du LPS.
II.2.1. La spécificité sérologique (46).
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- Elle réside dans la portion polysaccharidique variable du LPS qui correspond
à l'antigéne somatique O des souches lisses ou à la partie externe du core
oligosaccharide des souches R.
- L'injection de bactéries à Gram négatif ou de LPS à un animal induit la
production d'anticorps dirigés contre les déterminants polysaccharidiques.
- L'antigéne O est hautement immunogénique. Cependant, l'immunogénicité
diminue considérablement ou s'annule quand, il est séparé du lipide A. L'antigéne O
se comporte donc comme un haptène dont l'activité immunologique nécessite l'effet
adjuvant du lipide A ou d'une protéine, quand il s'agit de l'antigène O préparé par
hydrolyse acide du LPS.
L'antigène O est un antigène thymo indépendant, c'est à dire qu'il donne une
réponse anticorps en l'absence de cellules T.
Les complexes antigène-anticorps formés activent ensuite le système
complément en se fixant à son composant C1q (voie classique) aboutissant à la lyse,
cellulaire ou à la phagocytose.
Les anticorps produits sous l'effet du LPS sont essentiellement de nature IgM.
Il peut également s'agir d'IgA, c'est le cas lors d'immunisation par Salmonella
enteritica (serovar typhi), ou d'IgG. Les raisons de la stimulation préférentielle
d'IgM restent encore inexpliquées.
-Tous ces anticorps sont protecteurs mais la protection conférée par les IgM est
1000 fois plus effective, cet anticorps étant plus apte à provoquer la lyse. Ceci a pu
être démontré par l'utilisation d'anticorps monoclônaux.
- Théoriquement, les anticorps dirigés contre des portions actives du LPS donnent
lieu à des réactions croisées anti-LPS et protectrices, lors d'infections systémiques à
bactéries à Gram négatif diverses. (32)
Ce phénomène est accentué chez les souches R, chez lesquelles la spécificité
antigénique est pratiquement nulle.
- Il existe une tolérance immunologique aux LPS :
. une tolérance précoce induite par l'exposition à des doses subléthales de LPS
: l'injection est suivie par une réponse qui décroît en 3 à 4 jours et se normalise. Cette
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tolérance est attribuée à des modifications hématopoïétiques spécifiques et à une
diminution de la capacité à produire des cytokines.
. une tolérance tardive, durable, Antigéne O spécifique, qui est le résultat de la
production d'anticorps anti - LPS.
Contrairement à la tolérance précoce, la tolérance tardive est seulement
spécifique du LPS inducteur.
II.2.2. Mécanisme d'action In vivo des LPS
- Quand le LPS est libéré de la surface bactérienne, il se complexe avec des
protéines liant le LPS (LBP) telle que la CD 14, avant de se lier à des récepteurs
spécifiques des LPS sur les cellules hôtes (monocytes, macrophages ou
neutrophiles). Il s'en suit une activation cellulaire.
- Les macrophages activés libèrent des cytokines : l'interleukine I (IL1) et le
TNF (tumor necrosis factor).
Ces deux types de cytokines agissent sur presque toutes les cellules, et
augmentent l'expression des gènes impliqués dans le processus inflammatoire.
- L'endotoxine stimule également l'immunité humorale. La grande variété des
anticorps anti-LPS produits, témoigne de la diversité de structure de l'endotoxine et
des particularités des différentes bactéries à gram négatif.
II.2.3. Propriétés immunologiques non spécifiques du LPS
II.2.3.1. L'effet adjuvant :
Il est attribué au lipide A. Il a été démontré en 1956 par Johnson et Coll (19):
que le LPS augmente de façon non spécifique la réponse immune à un antigéne
administré simultanément.
D'autre part, l'endotoxine rompt la tolérance immunologique à un antigène.
II.2.3.2. L'effet mitogène sur les lymphocytes B.
- L'endotoxine stimule la prolifération de lymphocytes B de souris en
provoquant l'augmentation de la synthèse de l'acide désoxyribonucléique
(DNA).
19
- L'addition de LPS à une culture de lymphocytes B stimule et leur
multiplication et leur différenciation en cellules productrices d'anticorps, pour des
antigènes trés différents du LPS.
- Cet effet mitogène est conféré par le lipide A.
II.2.3.3. Activation du complément
Le LPS peut activer le complément par la voie alterne : le composant C3 en
association avec des protéines sériques, complexe le lipide A, aboutissant à la lyse.
La bactérie est protégée de cette action non spécifique du complément par
l'antigéne O. C'est pourquoi, les mutants rugueux y sont plus sensibles.
20
III. LPS ET VIRULENCE BACTERIENNE
- Il existe un lien étroit entre la structure du LPS et la virulence d'une souche
bactérienne (7, 21).
- Les chaînes latérales à spécificité O constituent la région du LPS la plus
impliquée dans la virulence.
C'est pourquoi les souches rugueuses sont généralement moins virulentes que
les souches lisses.
- L'antigène O intervient d'abord dans la première phase de l'infection : il
constitue un moyen d'attachement à des récepteurs cellulaires. Chez Neisseria
gonorrheae, l'antigéne O permet l'adaptation et la translocation de la bactérie à
travers la barrière muqueuse (56).
Le LPS méningococcique augmente l'invasivté des souches lisses de
meningocoques (57).
Chez Actinobacillus pleuropneumoniae, les sérotypes ayant un LPS de type
lisse adhèrent plus massivement aux anneaux trachéens que les LPS de type
intermédiaire (3).
- Dans une étape plus tardive, l'antigène O permet à la bactérie d'échapper aux
mécanismes de défense de l'hôte. En effet, le complément peut être activé par la voie
alterne, par fixation de son composant C3 sur le lipide A. Pour la plupart des germes,
cette lyse n'est possible que pour les mutants rugueux : les chaînes latérales à
spécificité O bloquent l'accès du complément à la bactérie.
- L'importance du LPS lisse pour la virulence des Shigelles a été démontrée
avec Shigella sonnei et Shigella flexneri ; Sansonetti a montré que les souches
virulentes de Shigella sonnei possédent un plasmide de 120 mégadaltons qui code
pour une chaîne latérale à spécificité O. La perte de ce plasmide donne naissance à
des souches rugueuses avirulentes (49).
21
- Une étude comparative du LPS de souches virulentes et avirulentes de
Shigella sonnei phase I a montré que l'immunisation de souris par les dits LPS
induisait une formation de cellules productrices d'anticorps beaucoup plus
importante dans le cas où le LPS de la souche virulente était utilisé comme
immunogène (39).
L'immunogénicité de la souche avirulente était fortement réduite (3 - 4 fois).
Cette modification biologique dans la souche avirulente est une conséquence
évidente d'une modification dans la structure du LPS (40).
- L'antigène O protège donc la bactérie de la lyse. La composition du core
oligosaccharide de Aeromonas hydrophila contribue à la résistance du germe vis à
vis du complément (30).
- Chez Escherichia coli, l'inhibition de la biosynthèse du core
polysaccharidique augmente la sensibilité de la bactérie à la phagocytose, à l'activité
du complément, et améliore l'élimination du germe de la circulation sanguine de la
souris (14).
De même, des mutations opérées sur les gènes rfa H et Gal U impliqués dans
la synthèse du LPS ont considérablement réduit la sécrétion d'alpha hémolysine,
facteur majeur de virulence de Escherichia coli (60).
- Une souche rugueuse de Salmonella enterica s. v Choleraesuis n'était
virulente qu'après inoculation dans une veine ou dans le péritoine, et non après
administration orale : l'antigène O est nécessaire à la survie du germe dans le tractus
digestif (16).
- En outre, chez les souches lisses (S), l’accès du complément à la bactérie
diminue avec l'épaisseur de l'antigène O.
22
IV. LPS ET RESISTANCE BACTERIENNE AUX
ANTIBIOTIQUES (4)
- Les antibiotiques les plus couramment testés sont ceux appartenant à la
classe des Bêta-lactamines. Ces substances ont pour site d'action, les "penicillin Binding - proteins" (PBP) situés sur le feuillet interne de la membrane
cytoplasmique.
- L'essentiel des résistances à ces antibiotiques a été observé chez les bactéries
à Gram négatif (38,53).
- En effet, leur membrane externe, comportant des lipopolysaccharides en
surface, constitue une barrière hydrophobe pour les bêta-lactamines qui sont des
molécules hydrophiles. Dès lors, leur passage occasionnel à travers la membrane
n'est possible qu'au niveau des porines, canaux hydrophiles insérés dans la couche
hydrophobe. C'est ainsi que l'on explique la résistance intrinsèque d'Eschericha coli
à la pénicilline G, à la méticilline et à l'oxacilline et celle de Pseudomonas
aeruginosa à la méticilline et à certaines céphalosporines.
- D'autre part, l'espace périplasmique des bactéries à Gram négatif est plus
étendu que celui des bactéries à Gram positif. Et c'est là que se trouvent les Bêta lactamases, sur le passage obligé de la Bêta-lactamine vers sa cible.
Il est à noter en revanche, que les mutants rugueux de souches de bactéries à
Gram négatif, perdent une bonne partie de cette fonction de barrière (55). Certains
mutants apparaissent même plus sensibles aux antibiotiques hydrophiles (6).
- Les mutants rugueux de Proteus mirabilis sont sensibles aux polymyxines B
et E alors que les autres souches de P. mirabilis sont résistantes (22).
- A des conditions normales de croissance, le mutant LPXA2 de E.coli qui
produit des quantités très réduites de lipide A s'avère être très sensible à un certain
nombre d'antibiotiques (59) :
* les concentrations minimales inhibitrices (CMI) d'antibiotiques
hydrophobes tel que la Rifampicine, l'Erythromycine, la Clindamycine et l'Acide
fusidique sont 32 à plus de 128 fois plus basses que pour les souches parentales.
Pour des antibiotiques peptidiques tels que la Vancomycine et la Bacitracine,
les CMI sont respectivement 32 et 256 fois plus basses.
23
V. METHODE D’ETUDE DES LPS (18, 44)
- Les LPS sont des macromolécules complexes très hétérogènes.
- La caractérisation des LPS des entérobactéries a pu être réalisée après
élimination du lipide A par hydrolyse acide douce et fractionnement de la portion
polysaccharidique par chromatographie sur gel (colonne Séphadex) (18)
- Cette technique a montré la grande diversité dans la composition des chaînes
polysaccharidiques, et, qu'une bactérie pouvait présenter à sa surface plusieurs types
de lipopolysaccharides.
- L'hétérogénéité ne pouvait donc être observée qu’après dégradation des
extraits de LPS et fractionnement des LPS ainsi dégradés.
- Du fait de la lourdeur et de la durée de cette procédure, il a été adopté une
méthode plus simple d'analyse des différents types moléculaires de LPS (S,SR,R) :
l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide, en présence de dodécylsulfate de sodium
(SDS-PAGE) (18).
- La méthode SDS-PAGE date de 1969 et a été initié par WEBER et
OSBORN (44).
C'est une électrophorèse de zone qui permet de séparer les molécules en
fonction de leur taille : ceci aboutit à la caractérisation des molécules par la
détermination de leurs poids moléculaires grâce à des marqueurs de taille.
. Le gel de polyacrylamide peut avoir une porosité uniforme : la séparation est
rapide (2 - 3 heures), mais elle n'est pas excellente, surtout pour les molécules de
petite taille, du fait de la diffusion.
. Le gel peut aussi être utilisé en gradient de concentration : la résolution est
meilleure, mais elle dure plus longtemps (une nuit);
- Le SDS est un détergent anionique qui a pour rôle :
. d'uniformiser la charge des molécules à séparer et
. de solubiliser la molécule de LPS qui est amphipatique. En effet, le
SDS se lie au lipide A qui constitue la région hydrophobe du LPS (18).
24
- Les LPS séparés peuvent être détectés par diverses techniques, après avoir
retiré le gel de la plaque de verre :
. coloration au bleu de coomassie.
. coloration au nitrate d'argent.
. coloration au bromure d'éthidium.
Dans les deux premiers cas, les bandes sont visibles tout de suite après la
coloration.
Avec le bromure d'éthidium, elles sont visualisés en lumière ultraviolette
(λ = 300 nm).
Les gels peuvent ensuite être photographiés ou séchés pour la conservation.
On peut également les conserver dans un sac plastique à fermeture contenant
de l’eau.
25
I : PRESENTATION
I - 1 - Cadre de l'étude.
Ce travail a été réalisé au laboratoire de Bactériologie-Virologie de l'hôpital
Aristide le Dantec de Dakar, situé sur l'avenue Pasteur.
Outre son statut de laboratoire de référence pour les MST (maladies
sexuellement transmissibles) en Afrique, il abrite plusieurs projets de recherche sur
le Virus HIV (Human Immunodeficiency Virus) et le SIDA (Syndrôme
d'Immunodéficience acquise).
Au sein du laboratoire sont également entrepris :
- des travaux de recherche appliquée ou fondamentale, dans le cadre de Thèses
de médecine, pharmacie, chirurgie dentaire, voire de la faculté des sciences.
- et des analyses biologiques dans le diagnostic de routine d'infections virales
ou bactériologiques.
I - 2 - Objectifs du travail
- Devant les manifestations particulièrement néfastes des infections à germes
Gram négatif, nous nous sommes proposé d'étudier l'endotoxine des dit-germes,
incriminée dans leur physiopathologie.
- Les grands axes du travail sont :
. Le réisolement de souches bactériennes conservées, de profils
d'antibiorésistance et ou de virulence connus.
. La transformation des souches lisses (S) obtenues, en souches rugueuses (R).
. L'extraction des lipopolysaccharides des deux types de souches (LPSS et
LPSR).
. La caractérisation des LPS par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en
présence de dodécyl sulfate de sodium (SDS - PAGE).
26
. Enfin tenter d'établir une corrélation entre la structure de l'endotoxine et les
données que nous possédons sur l'antibiorésistance et ou la virulence des souches
respectives.
27
II :Matériel et Méthode
II - 1 - Souches Bactériennes
Il s'agit :
- de souches d'entérobactéries d'origines diverses, isolées au laboratoire, à
partir de différents prélèvements : (voir le tableau I) durant la période
1993- 94 .
- Salmonelles, au nombre de 20
- Shigelles, au nombre de 33
- Escherichia coli, au nombre de 10
- de souches de Vibrio cholerae isolées lors de la récente épidémie d'Août
1995 à Janvier 1996 au Sénégal, au nombre de 11.
Toutes ces souches étaient conservées en tubes Nunc à -70°C.
II - 2 - Obtention du matériel à extraire
II - 2 - 1 - Matériel :
II - 2 - 1 - 1- Souches bactériennes
II - 2 - 1- 2- Milieux de culture :
- bouillon viande-foie glucosé pour la réactivation des souches et l'extraction
des souches lisses - (B.VFG)
- gélose Müller - Hinton en boîte pour le réisolement des souches (MH)
- bouillon nutritif simple pour la préparation des souches R - (BN)
- gélose nutritive simple pour l'isolement des souches R - (GN)
NB : voir la composition des milieux en annexe.
28
II - 2 - 1 - 3 - Réactifs :
- solution mère de chlorure de sodium à 100 grammes par litre (Nacl 100 g/l)
- solution mère de chlorure de lithium à 100 grammes par litre (Licl 100 g/l)
- solution mère de D-alanine à 100 grammes par litre (D - Ala 100 g/l)
NB : voir la préparation en annexe.
II - 2 - 1- 4 - Matériel divers
- tubes à hémolyse pour la réactivation des souches.
- tubes à essais de 16 ml, avec bouchon pour les bouillons d'extraction.
- boîtes de pétri.
- étuve à 37°C.
- "Hospital Jar" pour la conservation des boîtes de Pétri.
- pipette Eppendorf de 1000µl.
- embouts stériles de 1000µl.
- portoirs pour tubes Eppendorf.
- ensemenceurs stériles, anse de platine.
II - 2 - 2 - Méthode
II - 2 - 2 - 1 - Obtention des souches lisses (S)
* Réactivation
- sortir la souche conservée à -70°C.
- En prélever une petite quantité par grattage avec l'anse de platine et
ensemencer un microbouillon viande - foie glucosé.
- incuber 24 heures à l'étuve à 37°C.
* Réisolement et enrichissement
- avec l'anse, repiquer le bouillon (s'il y a eu pousse) sur une gélose MH.
- incuber 24 heures à l'étuve à 37°C.
29
* préparation du bouillon d'extraction
- le lendemain, prélever une colonie (après avoir vérifié que la culture est
pure) et la mettre en culture dans un tube à essai à vis contenant 10 ml de bouillon
viande - foie glucosé.
- incuber 24 heures à 37°C.
II - 2 - 2 - 2 - Obtention des souches rugueuses (R) (6)
- une colonie de la boîte MH précédente est repiquée dans un bouillon nutritif
préparé comme suit :
- dans un tube à essai contenant 9 ml de bouillon nutritif, ajouter 1ml :
. de la solution mère de NaCl ou de Li Cl s'il s'agit des Salmonelles ou des
Shigelles.
. de la solution mère de Nacl s'il s'agit des vibrions
. de la solution mère de D-Ala ou de LiCl s'il s'agit de Escherichia coli.
On obtient 10 ml de bouillon à une concentration finale de 10g/l.
Toutes ces solutions sont stérilisées par autoclavage en même temps que le
bouillon nutritif.
Les manipulations ont lieu dans un arc stérile, autour de la flamme d'un bec bunsen.
l'on
* incuber le bouillon à 37°C
* durant une période de 10 à 15 jours, repiquer le bouillon tous les 2 à 3 jours
sur gélose nutritive contenant 10g/l de Nacl ou de D-alamine pour voir si
obtient des colonies rugueuses.
* on prélève alors une ou deux colonies R que l'on extrait directement sans
ensemencer un bouillon.
II - 3 - Extraction des lipopolysaccharides
II - 3 - 1 - Matériel
II - 3 - 1 - 1 - souches bactériennes :
- bactéries en bouillon de culture pour les souches S.
- colonies isolées sur gélose pour les souches R.
30
II - 3 - 1 - 2 - Réactifs (17).
1 - Tampon Tris - acétate - EDTA (T.A.E) pour mettre le culot bactérien en
suspension.
2 - Solution alcaline de lyse pour lyser les bactéries.
3 - mélange phénol-chloroforme-alcool isoamylique (25-24-1) pour
l'extraction.
4 - Solution d’acétate de sodium 3 M à pH 5,2 pour favoriser la précipitation
des LPS.
5 - mélange Tris - HCl 50 mM à pH 8 + acétate de sodium 100 mM
6 - eau distillée
7 - éthanol à 70° pour précipiter les LPS.
NB : voir la préparation des réactifs en annexe
II - 3 - 1 - 3 - Matériel divers :
- tubes Eppendorf de 1,5 ml.
- Micropipettes Eppendorf et embouts adaptés.
- Vortex pour homogénéiser les suspensions.
- Micro centrifugeuse KM 15.200.
- Bain-Marie
C'est la méthode rapide de Nobuo - Kido. (42)
II - 3 - 2 - 1 - Principe
- Après lyse de la paroi cellulaire, le LPS est extrait par centrifugation en
présence d'une solution de phénol - chloroforme; le LPS passe dans la phase aqueuse
supérieure qui est recueillie.
- Dans cette phase, le LPS est précipité par de l'éthanol en présence d'une forte
concentration saline.
31
II - 3 - 2 - 2 - Mode opératoire
1 - Prélever :
. 1,5ml de bouillon de culture (souches S) dans un tube Eppendorf ou
. 1 colonie (souches R) dans un tube Eppendorf contenant 1,5 ml de bouillon
nutritif.
2 - Centrifuger pendant 5 - 10 mn à 16.000 tours/mn.
Eliminer le surnageant avec une pipette pasteur
3 - mettre le culot bactérien en suspension dans 100µl de tampon T.A.E.
Vortexer, pour avoir une suspension homogène.
4 - ajouter 200µl de solution de lyse
Chauffer le mélange pendant 70 mn au bain - marie entre 55 et 60°C.
5 - ajouter 1ml de mélange phénol - chloroforme
- centrifuger 10 mn à 16.000 t/mn
- recueillir le surnageant dans un 2e tube Eppendorf à l'aide d'une pipette
pasteur (éviter la couche blanchâtre de protéines à l'interface).
6 - ajouter au surnageant : . 200 µl d'eau distillée
+
50 µl acètate de sodium 3M à pH 5,2
- vortexer
7 - ajouter 2 volumes d'Ethanol à 70° - mélanger par retournements.
- laisser précipiter une nuit à - 20°C.
8 - centrifuger - éliminer le surnageant.
- resuspendre le précipité dans 200µL de mélange
Tris - Hcl 50 mM (pH8) + acétate de sodium 100 mM
- vortexer
9 - ajouter 2 volumes d'éthanol à 70° - mélanger par retournements.
- relarguer le LPS à -70°C pendant 15 - 20 mn.
10 - centrifuger - éliminer le surnageant - mettre en suspension le culot final de LPS dans 50µl d'eau distillée.
Cet extrait peut être conservé à -20 ou -70°C, indéfiniment.
32
II - 4 - Electrophorèse des LPS sur gel de polyacrylamide en présence de
dodécyl sulfate de sodium (SDS - PAGE)
II - 4 - 1- Matériel
II - 4 - 1 - 1 - Réactifs (48)
1 - solution d'acrylamide - bisacrylamide à 30%;
- L'acrylamide est un monomère de formule CH2=CH-C-NH2, qui en
présence
de radicaux libres, se polymérise en longues chaînes.
- Le bisacrylamide (plutôt N, N', méthylène bisacrylamide) permet aux
chaînes
de polyacrylamide de s'entrecroiser pour former un gel.
2 - solution de persulfate d'ammonium (APS) à 30% l'APS fournit les radicaux libres qui permettent la polymérisation.
3 - solution de tétraméthyléne diamine (TEMED) qui accélère la
polymérisation
en catalysant la libération de radicaux libres à partir de l'APS.
4 - tampon Tris-HCl à pH 8,8 pour la résolution.
5 - tampon Tris-HCl à pH 6,8 pour le regroupement.
6 - tampon Tris-glycine à pH 8,3 pour la migration.
7 - tampon échantillon
NB : voir la préparation des réactifs en annexe.
II - 4 - 1 - 2 - Matériel divers (Figure 4)
- marqueurs de poids moléculaire
- cuve électrophorétique verticale (BIORAD).
- plaques de verre (8 x 11cm) pour couler les gels.
- espaceurs à intercaler entre les plaques pour former des moules.
- peignes pour la formation des puits de dépôt.
- dispositif de montage.
- support de migration.
- papier buvard.
- tubes Eppendorf pour la préparation des échantillons.
- vortex pour homogénéiser les échantillons.
- bain - marie.
33
- pipettes graduées et micropipettes.
- générateur de tension.
Méthode de Laemmli (26) modifiée par Tsaï et Frasch (54)
II - 4 - 2 - 1 - Principe (8)
- Elle consiste en une séparation des molécules de LPS contenues dans
l'extrait, en fonction de leur taille : l'échantillon migre à travers le gel de
polyacrylamide qui constitue un tamis moléculaire dont les mailles sont déterminées
par la concentration de la solution d'acrylamide.
- Du SDS est adjoint au gel. C'est un détergent anionique qui se fixe aux
différentes molécules et annule leurs charges : la préparation se fait alors,
uniquement en fonction de la taille et non de la charge électrique.
II - 4 - 2 - 2 - Description de la méthode
- C'est une électrophorése verticale, sur minigel : les substances migrent de
haut en bas et d'autant plus loin qu'elles sont plus légères. Le LPS complet se localise
en général dans la première moitié du gel.
- Le système est dissociant (50)
. non seulement, l'échantillon est traité avec du SDS (chargé négativement)
qui en modifie la charge, mais
. il est mis en suspension dans un tampon contenant du Bétamercaptoéthanol
(composé à groupement thiol) qui rompt les ponts disulfure. Ceci permet d'étaler les
molécules.
- La migration se fait selon un mode discontinu
l'échantillon traverse deux gels superposés :
34
. un gel de regroupement supérieur dit "stacking gel" qui est plus lâche (à 3%).
Il permet le tassement de l'échantillon dans le puit de dépôt en vue d'une bonne
séparation en bandes nettes.
. un gel de résolution inférieur dit "resolving gel" dont les mailles sont plus
serrées (12,5%). A travers ce gel, les LPS ont une hauteur de migration inversement
proportionnelle à leur poids moléculaire.
- Un générateur de tension connecté au système d'électrophorèse fournit du
courant électrique. Les différences de pH entre les deux gels et le tampon de
migration créent une différence de potentiel.
II - 4 - 2 - 3 - Mode opératoire
II - 4 - 2 - 3 - 1 - Montage du système d'électrophorèse
- nettoyer 4 plaques de verre (2 grandes + 2 petites) avec de l'alcool à 70°C.
- intercaler deux espaceurs (enduits légèrement de vaseline pour améliorer
l'étanchéité) de même épaisseur, du côté de la largeur, pour former un
moule.
- fixer l'ensemble sur l'assembleur en serrant délicatement les vis placer le
tout sur le support de montage.
- vérifier l'étanchéité du montage en faisant couler de l'eau distillée
II - 4 - 2 - 3 - 2 - préparation des gels
1 - gel de résolution à 12,5%
. Dans un flacon propre (genre pot de selles), mélanger :
- tampon de résolution (Lower buffer),
6ml
- Acrylamide - Bisacrylamide à 30%
8,3ml
- eau distillée
5,7ml
. Au moment de couler, et aprés avoir éliminé l'eau entre les plaques, ajouter
rapidement :
- APS à 30%
- TEMED
80µl
20µl
35
. couler la solution immédiatement avec une pipette de grand volume, jusqu'à
1,5 cm du bord supérieur de la plaque - Eviter les bulles d'air.
A l'aide d'une pipette, couvrir la surface du gel avec de l'eau distillée pour le
protéger de l'air : l'oxygène gêne la polymérisation.
. laisser polymériser le gel 30 à 45 mn à la température ambiante.
- 2 gel de regroupement à 3%
- Dans un flacon identique, mélanger :
- tampon de regroupement (upper buffer)
6,25ml
- Acrylamide - Bisacrylamide à 30%
3,75ml
- Eau distillée
15ml
. Au moment de couler, aprés avoir vidé l'eau recouvrant le 1er gel, ajouter
rapidement :
- APS à 30%
- TEMED
75µl
25µl
. couler immédiatement la solution
. insérer tout de suite les peignes afin de creuser les puits.
II - 4 - 2 - 3 - 3 - préparation des échantillons
- pendant que le "stacking gel" se polymèrise, on peut préparer les
échantillons.
- Dans un tube Eppendorf de 1,5ml, introduire :
. eau distillée
20µl
. tampon échantillon
20µl
. extrait de LPS
ou marqueur de poids moléculaire
20µl
- Vortexer
- chauffer le mélange au bain - marie à 100°C pendant 2 à 3 mn.
- Conserver le tube au réfrigérateur (4°C) jusqu'au moment du dépôt.
II - 4 - 2 - 3 - 4 - Dépôt des échantillons
36
- quand la polymérisation du "stacking gel" est achevée, retirer les peignes et
éponger les restes de tampon contenus dans les puits à l'aide de papier
buvard.
- Sortir les échantillons du réfrigérateur et les vortexer.
- Avec une micropipette, déposer dans chaque puit ( au besoin) 15µl de
mélange
- Echantillon.
II - 4 - 2 - 3 - 5 - Mise en route de la migration
- remplir la cuve au 1/4 avec le tampon de migration
- transférer les gels sur le support d'électrophorèse aprés avoir nettoyé la partie
inférieure des plaques avec du papier buvard pour ne pas gêner le contact du
gel avec le tampon de migration.
- introduire les gels dans la cuve.
- achever de la remplir avec le tampon.
Remplir la partie centrale de la cuve avec le tampon de sorte qu'il soit en
contact avec la partie supérieure des gels.
- refermer la cuve et la connecter au générateur de tension en respectant la
pôlarité.
- la migration se fait à intensité constante : 45 mA pendant 2 à 3 heures.
II - 4 - 2 - 3 - 6 - Arrêt de la migration
Quand le front de migration, formé par le bleu de bromophénol contenu dans
le tampon échantillon, a atteint l'extrémité du gel, il faut :
. arrêter le générateur de tension
. sortir les plaques et décoler délicatement les gels pour la détection des
bandes.
II - 5 - Détection des bandes de LPS
II - 5 - 1 - Détection par coloration des gels avec du bleu de
Coomassie brillant.
37
II - 5 - 1 - 1- Matériel
II - 5 - 1 - 1 - 1- Réactifs
- solution de coloration avec bleu de Coomassie brillant.
- solution de décoloration sans bleu de Coomassie.
NB : voir la préparation des solutions en annexe.
II - 5 - 1 - 1 - 2 - Matériel divers
- hotte chimique
- agitateur rotatif
- gants
II - 5 - 1 - 2 - Méthode
II - 5 - 1 - 2 - 1- Fixation - Coloration
1 - le gel retiré de la plaque est trempé dans le bain de coloration.
2 - la coloration se fait sous agitation lente pendant une heure et trente
minutes,
sous la hotte.
3 - vider la solution de coloration et décolorer.
II - 5 - 1 - 2 - 2- Décoloration
1 - verser la solution de décoloration dans la cuvette.
2 - faire une prédécoloration, sous agitation lente pendant 15 mn
- puis jeter ce premier bain.
3 - faire une 2e prédécoloration avec un deuxième bain, pendant 15 mn
- puis jeter.
4 - Rajouter la solution de décoloration et laisser décolorer sous agitation
lente,
toute la nuit.
38
I- Répartition des souches.
Notre étude a été effectuée sur un total de 74 souches incluant une série
d’Entérobactéries et des Vibrio cholerae isolés lors de la dernière épidémie de
choléra d’Août à Décembre 1995, au Sénégal.
Les entérobactéries comprenaient :
.10 souches de Escherichia coli uropathogènes originaires du sénégal, du
togo,
et du Niger.(N°s 1s -3s, 1T - 3T, 1N - 4N)
.20 souches de Salmonella comportant :
.7 Salmonella Typhi (N°S 1-7)
.10 Salmonella spp
.3 Salmonella enteritidis (N°S 1-3)
Les Salmonella spp étaient constituées de :
Salmonella Saint-Paul (N°S 1- 2),
Salmonella Kentucky (1),
Salmonella Bredney (1),
Salmonella Goelzau (1),
Salmonella spp (N°S 1-5).
33 souches de shigella comportant :
11 souches de Shigelle flexneri (N°S 1-11)
7 souches de Shigella dysenteriae(N°S 1-7)
7 souches de Shigella boydii (N°S 1-7)
8 souches de Shigella sonnei (N°S 1-8)
Les Salmonella et les Shigella ont toutes été isolées à Dakar.
Les Vibrio cholerae au nombre de 11 ont été isolés de prélèvements provenant
de divers endroits du Sénégal.( N°S 1-11)
De toutes nos souches, il a été établi des profils d’antibiorésistance et/ou de
virulence .
39
Tableau I : Répartition des souches dans notre échantillon
Souches
Escherichia coli
Salmonella
Shigella
Vibrio cholerae
Effectifs
n=74
10
20
33
11
Fréquence
13,5%
27%
44,5%
15%
II- Profil de virulence des souches.
II-1- Profil de virulence des souches de E coli.
Le critère de virulence recherché chez nos souches était la sécrétion d’alphahémolysine.
Tabaleau II-1 : Sécrétion d’alpha-hémolysine par nos souches de E coli
Origine
SENEGAL
TOGO
NIGER
Souches de E coli
E.coli1
E coli2
E coli3
E coli1
E coli2
E coli3
E coli1
E coli
E coli
E coli
Alpha-hémolysine
+
+
+
+
+
+
-
Les souches étudiées ont été en majorité sécrétrices d’alpha-hémolysine :
-deux souches sur les trois du Sénégal
- deux souches sur les trois du Togo
- deux souches sur les quatre du Niger.
40
II -2- Profil de virulence des souches de Shigella
Sur nos 33 souches de Shigella, 27 soit 82% ont donné un test de Sereny
positif, principalement toutes les souches de Shigella boydii.
Le test de Sereny consiste en une recherche de Kérato-conjonctivite chez le
cobaye après inoculation d’une suspension de culture de shigella au niveau de la
conjonctive. Un test de Sereny positif détermine une souche invasive.
Tableau II-2 : Résultat du test de Sereny sur les souches de Shigella en fonction
de l’espèce.
Résultats du test de Sereny /
Espèces de shigelles
Shigella flexneri (11)
Shigella dysenteriae (7)
Shigella boydii (7)
Shigella sonnei (8)
POSITIF
Effectif N = 33
8
6
7
6
Fréquence
72,70%
85,70%
100%
75%
II-3- Profil de virulence des souches de Vibrio cholerae
Nous avons considéré comme critère de virulence la sécrétion d’hémolysine
Tableau II-3 : Sécrétion d’hémolysine par nos souches de Vibrio cholerae.
Origine
DARA MOUSTY
NIORO
SAINT-LOUIS
DAKAR
Souches de virulence
V. cholerae1
V. cholerae2
V. cholerae
V. cholerae4
V. cholerae5
V. cholerae6
V. cholerae7
V. cholerae8
V. cholerae9
V. cholerae10
NAG
Hémolysine
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Une seule des souches étudiées était sécrétrice d’une hémolysine
41
III - Profil de sensibilité des souches
III-1- Profil de sensibilité des souches de Salmonella
Tableau III-1 : Sensibilité de nos souches de Salmonella
Souches de
Bêta
Salmonella lactamase
S. spp1
S. Kentucky
S. Typhi2
S. Typhi3
S. Typhi409
S. Typhi5
S. Typhi6
S. Typhi7
+
+
+
+
-
ANTIBIOTIQUES
AMP
R
R
S
S
R
S
S
S
AMX
R
R
R
R
R
R
R
R
AMC
R
R
R
R
R
R
R
S
CRO
S
R
R
S
R
R
R
R
CFZ
S
S
S
S
S
R
R
R
CTX
R
R
R
R
R
R
R
R
Les souches testées ont toutes été résistantes à la céfotaxime et à l’amoxicilline
III-2 Profil de sensibilité des souches de E coli
Tableau III-2 : Sensibilité des souches de E coli d’origine urinaire isolées en
milieu hospitalier au Sénégal, au togo et au Niger
ORIGINE
Souches
de E. coli
E. coli1
SENEGAL E. coli2
E. coli3
E. coli1T
TOGO
E. coli2T
E. coli3T
E. coli1N
NIGER E. coli2N
E. coli3N
E. coli4N
ANTIBIOTIQUES
AMP
R
R
I
R
R
S
R
R
R
S
CRO
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
IPM
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
STX
S
R
I
S
R
S
S
S
S
S
ATM
S
S
S
S
R
S
S
S
S
S
NOR
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
NI
I
S
S
I
I
I
I
S
S
I
42
Toutes nos souches de E. coli, indépendemment de leurs origines étaient
sensibles à la CRO, à l’IPM; à la NOR.
Seule la souche 2 du Togo était résistante à l’ATM.
La STX était inactive sur les souches 2 du Sénégal et du Togo. La souche 3 du
sénégal était intermédiaire.
Les souches 3 du Togo et 4 du Niger étaient sensibles à l’AMC. La souche 3
du Sénégal était intermédiaire.
La NI était totalement efficace contre les souches du Togo et du Niger (sauf la
souche 2N) ; de même que sur les souches du Sénégal sauf la souche 1S qui était
intermédiare.
43
III-3- Profil de sensibilité des souches de Shigella
Tableau III-3 : Fréquence de résistance des souches de Shigella à divers
antibiotiques
Souches
Fréq. des
S. flexneri
S.
S. boydii
S. sonnei
shigella
souches
dysenteriae
Antibiotique N=11 % N=7
% N=7 % N=8
% N=33 %
s
1
9%
0
0%
1
14%
1
13%
3
9%
C
4
36%
1
14%
1
14%
1
13%
7 21%
TIC
4
36%
1
14%
1
14%
0
0%
6 18%
AMC
5
46%
1
14%
5
71%
6
75% 17 52%
AMP
3
27%
2
29%
1
14%
0
0%
6 18%
AMX
3
27%
1
14%
0
0%
8 100% 12 36%
STX
8
73%
7
100%
6
86%
8 100% 29 88%
Te
Les souches de Shigella ont montré globalement une résistance importante à la
tétracycline, en particulier les souches de Shigella dysenteriae et Shigella sonnei.
III-4- Profil de sensibilité des souches de Vibrio cholerae.
Tableau III-4 : Antribiorésistance des souches de Vibrio cholerae
Souches de
V.cholerae
0129
R
V.C.ogawa1
R
V.C.ogawa2
R
V.C.ogawa3
R
V.C.ogawa4
R
V.C.ogawa5
R
V.C.ogawa6
R
V.C.ogawa7
R
V.C.ogawa8
R
V.C.ogawa9
S
V.C.ogawa10
R
V.C.ogawa11
ANTIBIOTIQUES
STX
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
C
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
AMP AMC
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
R
R
I
I
I
I
I
I
I
I
OM
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
AN
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
Fe
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
44
Nous avons noté une résistance généralisée à l’0129 et par conséquent, une
résistance croisée à l’association sulfamétazole + triméthoprime. Seule la souche de
Vibrio cholerae NAG était sensible à l’0129.
Les souches avaient entre autres particularités d’être résistantes au
chloramphénicol.
IV- Obtention des souches rugueuses.
IV-1- Obtention des souches R de Salmonella.
Le délai d’obtention des colonies rugueuses variait avec :
- la substance introduite dans le bouillon de culture
- le gélose de réisolement
- la souche elle même.
Ainsi, pour Salmonella, la substance la plus efficace était la D-alanine : au
bout de 10 jours, le bouillon pour souches R repiqué sur gélose nutritive additionnée
de D-alanine a donné après une semaine d’incubation sur la paillasse des colonies
rugueuses. Elles étaient géantes, opaques, sèches, à contour régulier ou crénelé et
paraissaient ancrées dans la gélose.
Sur les 20 souches de Salmonella étudiées :
- 14 ont montré une transformation des colonies S en colonies R sur la gélose.
- 5 sont demeurées sous forme S quelle que fût la substance utilisée
- 1 a conservé la forme intermédiaire S-R, sans évolution.
Tableau IV-1 : Différentes formes de colonies obtenues après traitement des
souches de Salmonella avec la solution de D-alanine.
Formes des colonies
Rugueuse (R)
Lisse (S)
Intermédiare (I)
Effectif
N=20
14
5
1
Fréquence de formation
70,00%
25,00%
5,00%
45
Tableau IV-2 : Comparaison des aptitudes à la transformation des différentes
espèces de Salmonella étudiées.
Espèces de salmonella
Effectif N=20
Nombre de souches
formant des colonies R
des colonies R
n=15
5
33,30%
S .typhi
2
13,30%
S. enteritidis
8
53,30%
S. spp
Les souches de Salmonella spp qui incluaient Salmonella Saint-Paul,
Salmonella Kentucky, Salmonella bredney, Salmonella goelzau (avaient une plus
grande tendance a se dissocier en colonies R que les souches de Salmonella Typhi et
Salmonella enteritidis.
IV-2 : Obtention des souches R de Escherichia coli.
Pour Escherichia coli, au bout de 10 jours d’incubation, la solution de Dalanine n’a induit une transformation que chez 2 souches : elles ont formé des
colonies R et le reste des souches est demeuré lisse.
Les formes lisses des souches de E .coli se sont transformées difficilement en
formes rugueuses. Même après incubation prolongée sur la paillasse, le résultat
restait inchangé.
IV-3 : Obtention des souches R de shigella.
Pour les Shigella, le NaCl a permis d’obtenir des colonies R sur gélose
nutritive, pour la grande majorité des souches étudiées .
Au bout de 10 jours, on a obtenu sur gélose nutritive « simple » de petites
colonies à contours réguliers, plates et sèches.
46
Tableau IV-3 : Formes des colonies obtenues après traitement des souches de
Shigella avec la solution de NaCl.
Formes des colonies
Rugueuse R
Intermédiare S-R
Lisse S
Effectif
n=33
25
0
8
type de colonie
75,75%
0,00%
24,24%
Aucune souche n’a donné de colonies de type intermédiaire S-R.
La tendance à la transformation des souches de Shigella a été très importante.
Tableau IV-4 : Comparaison des aptitudes à la transformation des différentes
espèces de shigella étudiées.
Espèces de shigella /
Effectif n=33
Sh. flexneri (11)
Sh. dysenteriae (7)
Sh. boydii (7)
Sh. sonnei (8)
Nombre de souches
7
6
5
7
des colonies R
63,63%
85,70%
71,40%
87,50%
Une seule souche Shigella sonnei et Shigella dysenteriae sont demeurées lisses.
Par contre les souches de Shigella flexneri se sont transformées de façon
prédominante.
IV-4 : Obtention des souches R de Vibrio cholerae
Pour les souches de Vibrio , le NaCl s’est révélé plus commode pour la
transformation des souches S en souches R : au bout de 12 jours, on obtenait sur
gélose nutritive « simple », des colonies très plates, sèches, de contour régulier,
présentant quelquefois un aspect fongiforme.
Sur les 11 souches de Vibrio étudiées, 3 seulement sont demeurées « S » au
delà de la période déterminée pour la transformation. Les 8 autres ont montré sur la
gélose, des colonies rugueuses.
47
Tableau IV-5 : Formes des colonies obtenues après traitement des souches de
Vibrio cholerae avec la solution de NaCl
Formes des colonies
Rugueuse R
Intermédiare S-R
Lisse S
Effectif
n=11
8
0
3
du type de colonie
72,72%
0,00%
27,27%
Après les Shigella, les souches de Vibrio sont celles qui ont montré la
meilleure aptitude à la transformation.
Tableau IV-6 : Comparaison des aptitudes à la transfromation des différentes
souches de notre échantillon.
Nature des germes /
Effectif
Salmonelles (20)
Vibrions (11)
E. coli (10)
Shigelles (33)
Nombre de souches
14
8
2
25
des colonies R
70,00%
72,7%
20,00%
75,75%
48
V- Profils électrophorétiques des lipopolysaccharides (LPS) des
différentes
souches.
V-1- Evaluation des bandes et détermination de la taille des LPS.
La méthode SDS-PAGE permet d’uniformiser les molécules à étudier du point
de vue de leurs configurations et de leurs charges. toute différence dans la mobilité
au sein du gel résulte d’une différence de taille.
Les poids moléculaires correspondant aux diverses bandes obtenues sur gel
sont déterminées par comparaison avec le profil observé pour le marqueur de taille
en fonction de la distance de migration des protéines composant le marqueur.
Détermination du poids moléculaire :
1- Mesurer la mobilité relative (Rf) des différentes protéines du marqueur de taille.
Distance de migration de la protéine à partir de l’origine
Rf =------------------------------------------------------------------------Distance de l’origine à un point de référence.
2-Tracer la courbe d’étalonnage des poids moléculaires (logarithme népérien) en
fonction du rf.
3- Pour une bande donnée, mesurer le Rf et chercher sur la courbe le poids
moléculaire correspondant.
Le standard Laemmli que nous avons utilisé ne permet pas de détecter des
molécules de poids moléculaire supérieur à 200Kd.
Ainsi, entre 60 et 95Kd, migrent les lipopolysaccharides à longues chaînes
latérales.Au délà de 95Kd, ce sont de très longues chaînes latérales. Il s’agit de LPS
de structure compléte, extraits de souche formant des colonies lisses.
Entre 60et 50Kd, migrent les LPS de structure intermédiaire, leur chaîne
latérale est incomplète.
49
En deçà de 50Kd, se trouvent les LPS de structure rudimentaire, c’est à dire
sans chaîne latérale à spécificité 0.Et la chaîne polysaccharidique de base est courte,
très courte (Ra------Rd) ou inexistante (Re) (voir figure 3).
V-2- Profils électrophorétiques globaux des différentes souches.
V-2-1- Souches de Salmonella.
L’électrophorèse du LPS des souches lisses de Salmonella a livré un profil
global en « échelle » comportant deux à neuf bandes dont un à quatre doublets.
Les bandes s’étageaient dans une zone de poids moléculaire allant de 19 à
113Kd.
Pour les LPS des souches R, le profil a été moins étalé avec deux à six bandes
dont un à deux doublets. Les différentes bandes ayant des tailles allant de 19 à 20Kd.
Quatorze formes lisses ont eu un LPS de taille supérieure à 75Kd.
Certaines formes R ont livré le même profil que les formes S mères ;
cependant les premières bandes de haut poids moléculaire, disparaissaient toujours.
50
Tableau V-1- Taille des bandes obtenues à l’électrophorèse du LPS des 19
souches lisses de Salmonella
Classe de poids
moléculaire
15 - 35 Kd
35 -55 Kd
55 - 75 Kd
75 -95 Kd
95 - 115 Kd
115 - 135 Kd
Effectifs
N=19
14
18
17
10
4
0
Fréquence d’apparition
73,68%
94,73%
89,47%
52,63%
21,05%
0,00%
La plupart des souches de Salmonella (95 et 90%) ont donné des bandes de
LPS :
. entre 35 et 55 Kd : chaînes courtes
. entre 55 et 75 Kd chaînes peu longues et de type intermédiaire.
Aucune souche n’a donné de LPS au delà de 115Kd.
Tableau V-2- Taille des bandes obtenues à l’électrophorèse du LPS des 15
souches rugueuses de Salmonella
Classe de poids
moléculaire
15 - 35 Kd
35 -55 Kd
55 - 75 Kd
75 -95 Kd
95 - 115 Kd
115 - 135 Kd
Effectifs
N=19
14
15
7
4
0
0
93,33%
100%
46,66%
26,66%
0,00%
0,00%
Aucune souche n’a donné de bande de LPS au delà de 95Kd.
Les bandes de LPS à chaînes très courtes sont apparues prédominantes
51
Tableau V-3- Comparaison de la taille globale des bandes obtenues à
l’électrophorèse des LPS des souches lisses (S) et rugueuses (R) de Salmonella
Classe de poids
moléculaire
Effectifs des souches
S=19
15 - 35 Kd
35 -55 Kd
55 - 75 Kd
75 -95 Kd
95 - 115 Kd
115 - 135 Kd
14
18
17
10
4
0
R=15
14
15
7
4
0
0
chez les souches
S
R
73,68%
93,33%
94,73%
100%
89,47%
46,66%
52,63%
26,66%
21,05%
0,00%
0,00%
0,00%
La comparaison des profils a montré une grande rareté des chaînes longues
pour les formes R de Salmonella, et que très peu de souches S ont eu des LPS de
plus de 95Kd.
V- 2-2- Souches de E. coli
Le profil électrophorètique global des LPS des formes lisses a montré un
modéle « en échelle » avec un nombre de bandes allant de 3 à 8, incluant 1 à 3
doublets.
La taille des bandes variait de:
. 76 à 30 Kd pour les souches de Sénégal
. 90 à 32 Kd pour les souches du Togo
. 81 à 33 Kd pour les souches du Niger
Pour les souches rugueuses (R), il était possible de visualiser une ou deux
bandes, dont un doublet à 33 Kd.
52
Tableau V-4- Taille des bandes obtenues à l’électrophorèseb du LPS des 10
souches lisses de E. coli
Classe de poids
moléculaire
25 - 35 Kd
35 - 45 Kd
45 - 55 Kd
55 - 65 Kd
65 - 75 Kd
75 - 85 Kd
85 - 95 Kd
Effectifs
N=10
9
8
9
3
9
8
1
90%
80%
90%
30%
90%
80%
10%
Pour les souches de E.coli, nous avons observé très peu de bandes à chaînes
longues entre 85 et 95 Kd (une seule souche sur les dix a présenté une bande)
Tableau V-5- Comparaison de la taille globale des bandes obtenues à
l’électrophorèse du LPS des formes lisses de E. coli en fonction de
leur origine
Classe de poids
moléculaire
25 - 35 Kd
35 - 45 Kd
45 - 55 Kd
55 - 65 Kd
65 - 75 Kd
75 - 85 Kd
85 - 95 Kd
S = Sénégal
S=3
2
2
2
1
2
1
0
T = Togo
Effectifs
T=3
3
3
2
1
3
3
0
N=4
4
4
1
1
4
4
0
S
T
N
67%
100%
100%
67%
100%
100%
67%
67%
25%
33%
33%
25%
67%
100%
100%
33%
100%
100%
0%
0%
0%
N = Niger
V-2-3- Souches de Shigella
Globalement, l’électrophorèse des LPS des souches lisses de Shigella livrait
un profil en « échelle » de trois à huit bandes, incluant un à cinq doublets.La taille
des bandes variant de 25 à 130 Kd pour les souches rugueuses, le profil a été
beaucoup plus simple, montrant généralement une à trois bandes dont un doublet.
Les bandes avaient des tailles allant de 25 à 60 Kd.
53
Il est arrivé que les souches R (2) livrent le même profil que la souche lisse
d’origine. Dans ce cas, ou les bandes de grande taille, ou les doublets disparaissaient.
Tableau V-6- Taille des bandes obtenues à l’électrophorèse des LPS de 33
souches lisses de Shigella.
Classe de poids
moléculaire
25 - 50 Kd
50 - 75 Kd
]75 - 100 ] Kd
100 - 125 Kd
125 - 150 Kd
Effectifs
N=33
31
29
30
4
1
93,93%
87,87%
90;90%
12,12%
3,03%
Les souches S en grande majorité (94% ; 91%) ont donné des bandes de LPS
comprises:
. entre 25 et 55 Kd : chaînes courtes
. entre 75 et 100 Kd chaînes longues
Seule une souche a donné une bande au delà de 125 Kd.
Tableau V-7- :Taille des bandes obtenues à l’électrophorèse du LPS des 25
souches rugueuses de shigella
Classe de poids
moléculaire
[25 - 50 ] Kd
]50 - 75 Kd]
]75 - 100 ]Kd
]100 - 125 ] Kd
]125 -150] Kd
Effectifs
N=25
25
3
2
0
0
100%
12%
8%
0%
0%
Toutes les souches (100% ) ont développé des bandes appartenant à la classe
des [25 - 50 Kd]: LPS à chaînes courtes.
Seules deux souches ont donné des bandes dans la classe des 75 - 100 Kd.
Aucune souche n’a donné de bande au delà de 100 Kd.
54
Tableau V-8- : Comparaison de la taille globale des bandes obtenues à
l’électrophorése des LPS des souches lisses (S) et rugueuses (R)
de Shigella
Classe de poids
moléculaire
S=33
[25 - 50 ] Kd
]50 - 75 ] Kd
]75 - 100] Kd
]100 - 125] Kd
]125 - 150] Kd
31
29
30
4
1
R=25
25
3
2
0
0
chez les souches
S
R
93,93%
100%
87,87%
12%
90,90%
8%
12,12%
0%
3,03%
0%
La bande entre 25 et 50 Kd est quasi constante, quelle que fût la forme de
Shigella
V-2-4- Souches de Vibrion cholerae
L’électrophorèse des extraits lipopolysaccharidiques n’a pas montré pour les
souches de vibrions un profil en « échelle » comme pour les entérobactéries.
Pour les différentes souches on avait deux bandes d’apparition constante:
- la première correspondant à un poids moléculaire inclus dans la classe des 65 80Kd.
- la deuxième appartenant à la classe des 35 - 50 Kd.
Entre ces deux bandes principales, ou quelques fois situées plus bas dans le
gel , se trouvaient des bandes moins importantes correspondant à des poids
moléculaires allant de 20 à 60 Kd.(Figure 5)
55
Tableau V-9- : Taille des bandes obtenues à l’électrophorèse du LPS des 11
souches lisses de Vibrions.
Classe de poids
moléculaire
20 - 35 Kd
35 - 50 Kd
50 - 65 Kd
65 80 Kd
80 - 95 Kd
95 - 110 Kd
Effectifs
N=11
8
11
10
10
1
0
72,70%
100%
90,90%
90,90%
9,09%
0,00%
L’essentiel des souches a donné des bandes de LPS compris entre 35 - 80 Kd
Une seule souche a donné une bande de plus de 80 Kd.
Tableau V-10 : Taille des bandes obtenues à l’électrophorèse du LPS des 8
souches rugueuses de Vibrio
Classe de poids
moléculaire
20 - 35 Kd
35 - 50 Kd
50 - 65 Kd
65 - 80 Kd
80 - 95 Kd
95 - 100 Kd
Effectifs
N=8
8
8
6
2
0
0
100%
100%
75%
25%
0%
0%
L’ensemble des formes R (100%) a présenté des bandes comprises entre 20 et
35 Kd : c’étaient des LPS à chaînes polysaccharidiques très courtes ou inexistantes.
Deux souches seulement, ont donné des bandes de plus de 65 Kd.
56
Tableau V-11 : Comparaison de la taille globale des bandes obtenues à
l’électrophorèse des LPS des souches S et R de Vibrio
Classe de poids
moléculaire
S=11
8
11
10
10
1
0
20 - 35 Kd
35 - 50 Kd
50 - 65 Kd
65 - 80 Kd
80 - 95 Kd
95 - 100 Kd
R=8
8
8
6
2
0
0
chez les souches
S
R
72,70%
100%
100,00%
100%
90,90%
75%
90,90%
25%
9,09%
0%
0,00%
0%
Comme dans le cas des Shigella, nous avons observé une disparition fréquente
des bandes de LPS à chaînes très longues.
V-3- Profils détaillé des différentes souches (Figure 5)
V-3-1- Souches de Salmonella.
Tableau VI-1- : Taille des bandes obtenues à l’électrophorèse du LPS des
souches S de Salmonella en fonction de l’espèce
Espèces / Classe de
poids moléculaire
15 - 35 Kd
35 - 55 Kd
55 - 75 Kd
75 -95 Kd
95 - 115 Kd
115 - 135 Kd
Salmonella typhi
N=6
5
6
5
1
1
0
%
83,33%
100,00%
83,33%
16,66%
16,66%
0,00%
Salmonella
enteritidis
N=3
%
2
66,66%
3
100,00%
3
100,00%
2
66,66%
0
0,00%
0
0,00%
Salmonella spp
N=10
7
9
9
7
3
0
%
70%
90%
90%
70%
30%
0%
Quelle que soit l’espèce, nous avons noté une faible fréquence des bandes de
LPS à chaînes longues et très longues.
57
Tableau VI-2 : Taille des bandes obtenues à l’électrophorèse du LPS des
souches
R de Salmonella en fonction de l’espèce
Espèces / Classe de
poids moléculaire
15 - 35 Kd
35 - 55 Kd
55 - 75 Kd
75 - 95 Kd
95 - 115 Kd
115 - 135 Kd
Salmonella typhi
N=5
5
5
1
0
0
0
%
100%
100%
20%
0%
0%
0
Salmonella
enteridis
N=2
%
2
100%
2
100%
1
50%
1
50%
0
0%
0
0%
Salmonella spp
N=8
7
8
4
3
0
0
%
88%
100%
50,00%
37,50%
0,00%
0,00%
Les souches ont toutes pratiquement donné des chaînes courtes. Par contre, les
chaînes longues et très longues avaient tendance à disparaître.
58
Tableau VI-3 : Comparaison des profils électrphorétiques des LPS des souches lisses et
rugueuses de Salmonella.
Souches de Salmonella
Type de colonie
S.Spp1
S
R
S
R
S
R
S
R
S
R
S
R
S
R
S
S
S
R
S
R
S
R
S
S
R
S
R
S
S
S
S. St paul 1
S. Spp 2
S. St paul 2
S. Spp 3
S. Goelzau
S. Bredeney
S. Shwazengrund
S. Spp4
S. Kentucky
S. enteritidis 1
S. enteritidis 2
S. enteritidis 3
S. typhi 1
S. typhi 2
S.typhi 3
S.typhi4 03
S.typhi 5
S.typhi 6
S.typhi 7
R
R
S
S-R
Taille des LPS
correspondant aux
différentes bandes
90 -81 - 67 - 45 - 30
37 - 30
90 - 67 - 40 - 37
67 - 37 - 30 - 22
110 - 99 - 74 - 67 - 48 -42
90 - 67 - 48 - 42
106- 90 - 81- 67 -48 - 42
90 - 81 - 67 - 48 - 42 - 24
76 - 62 - 34 - 30
45 - 34 - 30 - 20
76 - 62 - 48 - 34 - 30
76- 48 - 34 -30 - 20
76 - 62 - 45 - 34 - 30
62 - 45 - 34 - 30
67 - 62 - 45 -34 -30
76-55- 30
107 -58 - 45 - 30
45 - 37 - 30
81 - 67 - 60 - 40 - 37 - 20
40 - 37 - 20
81- 67 - 60 - 40 - 37
81 - 67 - 60 - 40 - 37 - 20
67 - 45 - 34 - 30
90 - 60 - 49 - 40 - 37 - 20
45 - 40 - 37 - 30 - 20
72 - 62 - 51 - 37 - 30
58 - 42 - 37 - 30
55 - 30
67 - 55 - 45 - 37 - 30
113-107-71-58-51-45-3730-19
42 - 37 - 30 -19
45 - 37 - 30
72 - 60 - 58 - 55
45 - 30
Caractères gras : bandes les plus fréquentes chez les formes lisses.
Caractères en italique : bandes les plus fréquentes chez les formes rugueuses
Caractères soulignés : bandes sous forme de doublet.
59
Chez les souches lisses, les bandes à 67 - 62, 45 et 30 Kd étaient quasi
constantes. Seules quelques souches (4) ont eu des bandes de plus de 100 Kd.
Les profils des formes R étaient, dans leur ensemble plus réduits que ceux des
formes S.On observait une grande fréquence des bandes à 30, 37, et 45 Kd.
Quelque fois, le profil de la souche S se répétait de façon identique ou avec perte
d’une ou deux bandes supérieures.
Plus généralement, le profil de la souche R ne présentait que les bandes R de
la souche S avec ou non des bandes R supplémentaires.
V-3-2- Souches de E. coli.
Les souches de E. coli ont livré un profil très étalé présentant :
- Trois ou quatre bandes pour les souches du Sénégal, avec deux
doublets
à chaque fois.
- Quatre à huit bandes pour les souches du Togo avec deux ou trois
doublets.
- Cinq ou six bandes pour les souches du Niger avec deux ou trois
doublets.
Les deux souches rugueuses que nous avons obtenues (une du Sénégal et une
du Togo) présentaient respectivement deux bandes et une bande, dont un doublet.
Tableau VI-4 : Comparaison des profils électrophorétiques des LPS des formes
lisses et rugueuses des deux souches transformées
Origine des souches
Sénégal
(souche 2)
Togo
(souche 1)
Type de colonie
Taille de LPS
correspondant aux
différentes bandes
S
R
67 - 51 - 33
42 - 33
S
90 - 81 - 74 - 58 55 - 49 - 42
30
33
R
60
Tableau VI 4’ : Profil électrophorétique détaillé des souches lisses de E. coli en
fonction de l’origine
Origine
Souches de E coli
E.coli 1S
E. coli 2S
E. coli 3S
E. coli 1T
E. coli 2T
E. coli 3T
E. coli 1N
E. coli 2N
E. coli 3N
E. coli 4N
SENEGAL
TOGO
NIGER
Tailles de LPS correspondant
aux diférentes bandes
76 -58 - 37
67 - 51 - 33
74 - 55 - 49 - 30
90- 81- 74- 58 -55 49- 42- 30
81 - 67 - 45 - 33
81 - 67 - 55 - 45 - 32
81 - 67 45 - 39 - 33
81 - 67 - 45 - 40 - 33
81 - 67 - 58 - 45 - 40 - 33
81 - 67 - 55 - 45 - 42 - 33
Les souches de E.coli présentaient toutes une bande dans les 30 Kd.
Toutes les souches du Togo et du Niger ont donné des bandes à 81 et 67 Kd.
Les profils des souches du Niger étaient tous identiques.
V-3-3 Souches de Shigella
Tableau VI-5 : Taille des bandes obtenues à l’électrophorèse des souches S de
Shigella en fonction de l’espèce.
Espèces /
Classe de
poids
moléculaire
Shigella
flexneri
N=11
%
Shigella
dysenteriae
N=7
%
Shigella boydii
N=7
Shigella
sonnei
%
N=8
[25 - 50] Kd
]50 - 75] Kd
75 - 100 Kd
100 - 125 Kd
125 - 150 Kd
%
11
100%
6
85,70%
6
85,70%
8
100%
11
100%
5
71,40%
6
85,70%
8
100%
10
90,90%
6
85,70%
7
100,00%
7
87,50%
1
9,09%
2
28,50%
1
14,28%
1
12,50%
1
9,09%
0
0,00%
0
0,00%
0
0%
61
Comme constaté précédemment avec les autres Entérobactéries, les bandes à
chaînes courtes étaient fréquemment présentes dans les profils des différentes
espèces de Shigella.
Par contre, les chaînes très longues l’étaient beaucoup moins : seule une
souche de Shigella flexneri a donné une bande dans la classe des 125 - 150 Kd
Tableau VI-6 Taille des bandes obtenues à l’électrophorése des bandes R de
Shigella en fonction de l’espèce.
Espèces /
Classe de
poids
moléculaire
25 - 50 Kd
50 - 75 Kd
75 - 100 Kd
100 - 125 Kd
125 - 150 Kd
Shigella
flexneri
N=7
%
7
0
0
0
0
100%
0%
0%
0%
0%
Shigella
dysenteriae
N=6
%
6
0
0
0
0
100%
0%
0%
0%
0%
Shigella
Shigella
boydii
sonnei
N=5
% N=7
%
5
1
0
0
0
100%
20%
0%
0%
0%
7
2
1
0
0
100%
28,57%
14,28%
0%
0%
Avec les souches R de Shigella, en particulier celles Sh. dysenteriae et Sh.
flexneri, seules les bandes entre 25 et 50 Kd étaient quasi constantes.
62
Tableau VI-7 : comparaison détaillée des profils électrophrétiques des LPS des souches lisses
(S) et rugueuses (R) de Shigella
Souches de Shigella
Type de colonie
Sh. flexneri 1
S
R
S
S
S
S
R
S
R
S
R
S
R
S
R
S
R
S
S
S
R
S
R
S
R
S
R
S
R
S
R
S
R
S
S
R
S
S
R
S
R
S
Sh. flexneri 2
Sh. flexneri 3
Sh. flexneri 4
Sh. flexneri 5
Sh. flexneri 6
Sh. flexneri 7
Sh. flexneri 8
Sh. flexneri 9
Sh. flexneri 10
Sh. flexneri 11
Sh. Dysenteriae A21
Sh. dysenteriae A11
Sh. dysenteriae A12
Sh. dysenteriae A13
Sh. dysenteriae A14
Sh. dysenteriae A15
Sh. dysenteriae A16
Sh. boydii 1
Sh. boydii 2
Sh. boydii C1
Sh. boydii 3
Sh. boydii 4
Sh. boydii 5
Sh. boydii 31
Taille de LPS correspondant aux
différentes bandes
58 -58 - 33
34 - 33
100 - 62 - 55 - 45
90 - 76 - 58- 51 -42
76 - 67 55 - 45 - 37 - 30
90 - 82 - 67 - 45 - 39 - 30
45 - 39-30
87 - 67 -60 51 - 33 - 26
26
87-72-65-55-45-37-30
37-30
130-110-90-74-67-60-45-37 30
30
90-72-45-30
39-30
90-72-67-58-46-40-30
30
90 - 76-67-51-42-32
113 - 90-67-58-47
113-87- 82 -67-55
37
72-56-45-37-31
33
90-82-39-34
30
90 -72-48-32-30-27
27
90-76-67 -55-48-39- 34
25
100 - 82 - 76 - 49
37- 30
100 - 90 - 67 - 40 - 33
46- 33
90 - 71 - 58 - 51 - 39
82 - 74 - 62 - 51 - 45
33
125 - 107 - 82 - 65 - 51
90 - 82 - 48 - 34
90 - 72 - 42 - 30
90 - 76 - 67 - 55 - 45 - 39 - 30 - 25
48 - 33 - 30
84 - 76 - 72 - 46 - 42 33
63
Sh. sonnei 1
Sh. sonnei 2
Sh. sonnei 3
Sh. sonnei 4
Sh. sonnei 5
Sh. sonnei 6
Sh. sonnei 7
Sh. sonnei 8
R
S
R
S
R
S
R
S
R
S
R
S
R
S
R
S
33
110 90 - 67 - 58 - 46
33
82 - 59 - - 39 - 33 - 26
26
82 - 72 - 55 - 32 - 26
26
82 - 67 55 - 51 - 37 - 32 - 26
40 -26
71 - 67 - 45 - 37 31 30
90 - 84 - 72 - 46 - 42 - 33
60- 46 - 40 - 33
90 - 72 - 62 - 46 - 40 - 30
90 - 72 62 46 - 40 - 30
90 - 72 - 67 - 58 -46 - 40 - 30
Les profils des souches S présentaient tous pratiquement une bande à 30 - 33
et 80 - 90 Kd.
Huit souches donnaient des bandes de taille supérieure ou égale à 100 Kd.
Les souches R donnaient également une bande à 30 Kd, parfois à 26 Kd.
Contrairement aux Salmonella, on obtenait rarement, avec les souches R le
même profil que les souches S.
64
V - 3 - 4 - Souches de Vibrio cholerae
Tableau VI-8 : Comparaison des profils électrophorétiques des LPS des souches
lisses (S) et rugueuses R de vibrio cholerae
Origine des souches
DARA MOUSTY
Souches de
Vibrio cholerae
Type
de
colonie
Taille des LPS
correspondant aux
différentes bandes
V. cholerae Ogawa 1
S
R
S
R
S
R
S
R
S
R
S
R
S
R
S
S
S
R
S
60-55-45-38-31
60-45-38-30
74-67-55-45-30
55-45-20
71-60-45-33
45-40-20
74-67-55-45
60-45-37-20
71-55-45-35
60-45-35
67-55-45-38-30
67-55-45-38-31
67-58-45-35
67-45-40-22
74-67-55-45
74-45
71-60-45-33
45-40-20
74-55-45-38-31
V. cholerae Ogawa 2
V. cholerae Ogawa 3
V. cholerae Ogawa 4
NIORO
V. cholerae Ogawa 5
SAINT-LOUIS
V. cholerae Ogawa 6
V. cholerae Ogawa 7
DAKAR
V. cholera Ogawa 8
V. cholerae Ogawa 9
V. cholerae NAG 10
V. cholerae 11
La bande à 45 Kd a été constante, quel que soit le type de colonie et quelle que
soit la souche de Vibrio cholerae.(Figure 5)
65
VI - Analyse du profil électrophorétique des LPS en fonction de la
virulence.
VI-1 Souches d’ E. coli
Tableau VII-1 : Profils des LPS et détection de lalpha hémolysine chez les
souches d’ E. coli.
Origine
Souches de
α-hémolysine
E. coli
SENEGAL
TOGO
NIGER
profil électrophorétique
des LPS
E.coli1S
E coli2S
+
+
76 -58 - 37
67 - 51 - 33
E coli3S
-
74 - 55 - 49 - 30
E coli1T
+
90- 81- 74- 58 -55 49- 42- 30
E coli2T
E coli3T
+
-
81 - 67 - 45 - 33
81 - 67 - 55 - 45 - 32
E coli1N
E coli2N
E coli3N
+
+
-
81 - 67 45 - 39 - 33
81 - 67 - 45 - 40 - 33
81 - 67 - 58 - 45 - 40 - 33
E coli4N
-
81 - 67 - 55 - 45 - 42 - 33
Les souches alpha hémolysine positives comme alpha hémolysine négatives
ont eu généralement les mêmes profils.
De plus certaines souches alpha hémolysine négatives ont eu des bandes à
chaînes plus longues (E. Coli 2s) que les souches alpha hémolysine négatives. .
66
VI-2 Souches de Shigella
Tableau VII-2: Profils des LPS et et test de Sereny chez les souches de Shigella
Souches de
Shigella
Sh. flexneri 1
Sh. flexneri 3
Sh. flexneri 6
Sh. flexneri 2
Sh. flexneri 7
Sh. dysenteriae A12
Sh. dysenteriae A14
Sh. dysenteriae A2
Sh. boydii 1
Sh. boydii C3
Sh. sonnei7
Sh. sonnei4
Sh. sonnei 1
Sh. sonnei 8
Test de
Sereny
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Profil électrophorétique
des LPS
58 -58 - 33
90-76-58-51-42
90-82-67-45-39-30
100-62-55-45
87-67-60-51-33-26
72-56-45-37-31
90-72-48-32-30-27
113-90-67-58-47
100-90-67-40-33
84-76-72-46-42-33
90-72-62-46-40-30
82-67-55-51-37-32-26
110-90-67-58-46
90-72-67-58-46-40-30
Les souches à tester de Sereny négatif ont toutes eu des bandes à très longues
chaînes. Sh. flexneri 1 à test de Sereny positif n’avait sa plus haute bande qu’à 58
Kd.
67
VI-3- Souches de Vibrio cholerae
Tableau VII-3: Profil des LPS et détection de l’alpha hémolysine chez les
souches de Vibrio cholerae.
Origine des souches
DARA MOUSTY
NIORO
SAINT-LOUIS
DAKAR
Souches de Vibrio
cholerae
hémolysine
V cholerae Ogawa 1
+
V cholerae Ogawa 2
V cholerae Ogawa 3
V cholerae Ogawa 4
V cholerae Ogawa 5
+
+
+
V cholerae Ogawa 6
V cholerae Ogawa 7
V cholera Ogawa 8
+
+
+
V cholerae Ogawa 9
V cholerae NAG 10
V cholerae 11
+
+
+
des LPS
60-55-45-38-31
74-67-55-45-30
71-60-45-33
74-67-55-45
71-55-45-35
67-55-45-38-30
67-58-45-35
74-67-55-45
74-45
71-60-45 -33
74-55-45 -38-31
La seule souche à hémolysine négative s’est avérée être parmi celles ayant les
bandes à plus longues chaînes.
68
VII- Analyse du profil électrophorétique des LPS en fonction de la
sensibilité aux antibiotiques
VII-1- Souches de Salmonella
Tableau VII-1: Profils de LPS et de sensibilité des souches de Salmonella
Souches de
Bêta
Salmonella
lactamase
ANTIBIOTIQUES
Profil
électrophorétique
des LPS
AMP
AMX
AMC CRO
CFZ CTX
S. Typhi 7
S. Kentucky
S. Typhi 2
S. Typhi 3
S. Spp 1
S. Typhi 409
S. Typhi 5
+
+
+
S
R
S
S
R
R
S
R
R
R
R
R
R
R
S
R
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
R
R
R
S
S
S
S
S
R
R
R
R
R
R
R
R
S. Typhi 6
+
S
R
S
R
R
R
72 -60 - 58 -55
107-58-45-30
72-62-51-37-30
55-30
90-81-67-45-30
67-55-45-37-30
113-107-71-5851-45-37-30-19
45-37-30
Pour les souches à Bêta-lactamase positive, nous avons observé des
résistances à tous les antibiotiques sauf à la CRO et CFZ (S. spp 1) ) la CFZ (S.Typhi
O9) et l’AMP (S. Typhi5 ) .
Pour les souches à bêta-lactamase négative, en revanche, nous avons noté la
multirésistance de la souche de Salmonella kentucky qui pouvait être en rapport
avec la multiplcité de ses doublets (dont un à très longue chaînes (107 kd). Cette
souche seule, était résistante à l’ampicilline. De plus, la souche de S. typhi3 qui était
la seule souche sensible à la ceftriaxone était dépourvue de bandes de LPS à longues
chaînes.
69
VII-2- Souches de E. coli.
Tableau VIII-2 : Profils des LPS et de sensibilité des souches de E. coli
Origine
SENEGAL
TOGO
NIGER
Souches de
E. coli
profil
électrophorétique
des LPS
ANTIBIOTIQUES
AMP
CRO
IPM
STX
ATM
NOR
NI
E.coli1S
E coli2S
E coli3S
E coli1T
R
R
I
R
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
I
S
S
S
S
S
S
S
S
S
I
S
S
I
E coli2T
E coli3T
E coli1N
E coli2N
E coli3N
E coli4N
R
S
R
R
R
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
S
S
S
S
S
R
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
I
I
I
S
I
I
76-58-37
67-51-33
74-55-49-30
90- 81-74-58-55
49-42-30
81-67-45-33
81-67-55-45-32
81-67-45-39-33
81-67-45-40-33
8167-58-45-40-33
81-67-55-45-4233
E. Coli 3T était la seule souche sensible à l’ampicilline pourtant, son profil
pouvait se superposer aux autres profils.Et comportait même un doublet à 81 Kd,
inexistant chez les souches du sénégal.
E. Coli 2S et E. Coli 2T seulement ont été résistante à l’association
sulfaméthoxazole + triméthoprime ; elles ont eu en commun les bandes à 33 et 67
Kd, bandes également données par les autres souches qui possédaient par ailleurs des
LPS de taille plus élevée.
Enfin, E. Coli 2t était l’unique souches résistante à l’azthréonam malgré son profil
très proche notamment de ceux des souches du Niger, toutes sensibles.
70
VII - 3 - Souches de Shigella
Tableau VIII-3 : Profils des LPS et de sensibilté des souches de shigella.
ANTIBIOTIQUES
Souches de shigella
des LPS
C
TIC
AMC
AM
AMX
STX
TE
AN
GM
Sh. flexneri 1
S
S
S
S
S
S
R
S
S
58-58-33
Sh. flexneri 2
R
R
R
R
R
S
R
S
S
100-62-55-45
Sh. flexneri 4
S
S
S
S
S
R
S
S
S
90-76-67-51-42-32
Sh. flexneri 11
S
R
R
R
R
R
R
S
S
90-72-67-58-46-40-30
Sh. Dysenteriae A2 1
S
R
R
R
R
R
R
S
S
113-90-67-58-47
Sh. dysenteriae A1 1
S
S
S
S
S
S
R
S
S
113-87-82-67-55
Sh. boydii 6
S
S
S
R
S
S
S
S
S
90-76-67-55-45-39-30
Sh. boydii C 3 1
R
R
R
R
R
R
R
S
S
84-76-72-46-42-33
Sh. sonnei1
S
R
S
R
S
R
R
S
S
110-90-67-58-46
Sh. sonnei3
S
S
S
S
S
R
R
S
S
82-72-55-32-26
Sh. sonnei 8
S
S
S
R
S
R
R
R
R
90-72-67-58-46-40-30
Sh. flexneri 2 et 11, Sh. dysenteriae A2 et Sh. boydii C3, se sont montrée
particulièrement multirésistantes.
Leurs profils présentaient toujours une bande à 90 Kd ou plus, sauf pour
Sh.boydii C3, dont la plus haute bande n’était qu’à 84 Kd.
Les souches de Shigella étaient toutes résistantes à la Tétracycline. Bien que
Sh. flexneri 4 et Sh. boydii 6 aient eu les mêmes profils pratiquement, ceux -ci se
superposaient pourtant aux profils d’autres souches.
71
VII - 4 Souches de Vibrio cholerae
Tableau VIII -4 : Profil des LPS et de sensibilté des souches de Vibrio cholorae
V cholerae Ogawa 1
V cholerae Ogawa 2
V cholerae Ogawa 3
V cholerae Ogawa 4
V cholerae Ogawa 5
V cholerae Ogawa 6
V cholerae Ogawa 7
V cholera Ogawa 8
V cholerae Ogawa 9
V cholerae NAG 10
V cholerae 11
profil
électrophorétique
des LPS
ANTIBIOTIQUES
Souches de Vibrio
cholerae
O129
STX
C
AM
AMC
GM
AN
TE
R
R
R
R
R
R
R
R
R
S
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
S
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
I
I
I
I
I
I
R
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
R
I
I
I
I
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
60-55-45-38-31
74-67-55-45-30
71-60-45-33
74-67-55-45
71-55-45-35
67-55-45-38-30
67-58-45-35
74-67-55-45
74-45
71-60-45-33
74-55-45-38-31
V. cholerae ogawa 7 était seule résistante et à l’ampicilline et à l’association
amoxicilline + acide clavulanique.
V. cholerae NAG n’était résistante qu’à la colistine.
72
I- Obtention des souches rugueuses(R)
- Nous avons utilisé du bouillon nutritif additionné de solutions de D- alanine,
chlorure de sodium ou chlorure de Lithium à 10g/l pour induire la formation de
souches R.
- Le bouillon de transformation, au bout d'une semaine à 10 jours, était repiqué
sur gélose nutritive (milieu minimum). Aprés incubation de 24 heures à 37°C, s'il y
avait pousse, la boîte était à nouveau incubée 10 jours sur la paillasse pour obtenir
des colonies R.
- L'obtention de colonies R a été plus rapide avec Vibrio cholerae, ceci
pourrait s'expliquer par la structure du LPS : Bahrani et Oliver ont démontré avec
des souches de Vibrio vulnificus que les profils électrophorétiques des LPS des
colonies S et R étaient identiques (2).
Cependant, certaines souches sont quand même demeurées lisses au bout des 10
jours.
- Les Shigella ont été ensuite les souches les plus sensibles aux solutions de
transformation.
Puis venaient Salmonella et E.coli.
Nous avons tenté d'expliquer ce phénomène par les différences au départ, dans
la forme des colonies S ; elles étaient trés grosses, épaisses et trés muqueuses pour
Salmonella et surtout E.coli, alors que les colonies S de Shigella étaient de taille
moyenne et trés peu muqueuses.
- Pour permettre à un plus grand nombre de souches de se transformer, il aurait
peut-être fallu laisser les boîtes plus longtemps et utiliser pour toutes les souches,
sans distinction, la solution de D-alanine, aussi bien dans le bouillon que dans la
gélose nutritifs.
II - Extraction des LPS des souches S et des Souches R
- La méthode de Nobuo-Kido (42) que nous avons appliquée, n'était
consignée nulle part pour l'extraction ni des LPSR ni des LPSS.
73
- La méthode généralement employée pour les LPSR est celle de Galanos et
coll (11 in 1, 15, 18, 31) plus spécifique, dans laquelle, l'extraction est réalisée avec
un mélange de phénol-chloroforme-éther de pétrole à température ambiante.
Ceci est un élément important dans l'analyse des profils électrophorètiques du
LPS de nos souches R.
- Pour l'extraction du LPS des souches S la majorité des auteurs ont utilisé la
méthode phénol-eau de Westphal à 65°C (11 in 15, 18).
- Enfin, dans l'ensemble des études effectuées sur les LPS, l'extrait était purifié
généralement soit par digestion en présence de protéinase K (15) pendant
l'extraction, soit en phase finale par ultracentrifugation (18)
- Notre méthode d'extraction quant à elle, ne comportait pas d'étape de
purification. Nous avons donc misé sur le temps d'incubation (1h 30 à 2h au lieu de
70 mn à 55 - 60°C) pendant l'extraction, et sur le temps de dégradation (15 - 20mn au
lieu d'une minute, à 100°C) avant le dépôt des échantillons pour l'électrophorèse.
III - Electrophorèse des LPS sur gel de polyacrylamide en présence de
dodécyl sulfate de sodium (SDS-PAGE)
- Les études réalisées sur les LPS appliquaient toutes, la méthode standard de
Laemmli (2, 15, 32, 55).
- Cette technique qui permet de séparer les molécules allant jusqu'à 200Kd
constitue une échelle serrée de poids moléculaire, pour l'élution de l'ensemble des
LPSR, SR et S (15).
- Hitchcock et Brown, contrairement à nous, n'ont pas rajouté le SDS (agent
dissociant) dans les gels de regroupement et de résolution (15).
- Jann et Coll (18), Pinon et Coll (45) ont utilisé pour le tampon échantillon,
du dithiotréitol à la place du bêta mercaptoéthanol.
Néanmoins, toutes ces variations ne modifiaient en rien l'efficience de la
résolution.
- Enfin, certains auteurs comme Pinon et Coll (45) ont pratiqué une
électrophorèse sur gel en gradient de concentration. Elle permet une séparation plus
fine, comparable à une chromatographie. Cette méthode présente cependant,
74
l'inconvénient d'être plus laborieuse et beaucoup plus longue (se réalisant sur 2
jours).
- Du point de vue de la détection des bandes de LPS, la coloration au nitrate
d'argent de Tsaï et Frasch (54) est la technique la plus répandue (15, 18,45) du fait
de son importante sensibilité et de sa plus grande spécificité à l’égard aux LPS.
Par rapport aux profils proprement dit, les entérobactéries ont montré pour les
souches S un profil «en escalier» avec tous les types de LPS : S, SR, R. Ce caractère
a été établi depuis plusieurs travaux notamment ceux de Hitchock et Brown en 1983
(15) et Jann et coll en 1975 (18).
Les premiers ont étudié l'hétérogénéité des LPS de Salmonella en gel de
polyacrylamide teint avec du nitrate d'argent. Ils ont montré que des souches S de
Salmonella typhi murium donnaient des bandes des différents chimiotypes S, SR et
R.
Jann et coll quant à eux, dans une étude de l'hétérogénéité des LPS sur gel de
polyacrylamide coloré au shiff-acide périodique ont montré la même diversité
structurale dans le patrimoine LPS d'une souche lisse de Citrobacter 396.
Les souches R, donnaient généralement une ou deux bandes dans la moitié
inférieure du gel. Ou quelquefois, un doublet isolé (cas des Shigella). Ceci étaint en
accord avec les résultats de Jann et coll (18) qui ont montré qu'une souche R de E
coli F470, donnait une seule bande de forte mobilité.
Cependant certaines souches, celles de Salmonella, notamment livraient un
profil identique pour les souches S et R. ce problème pouvait être dû au mode de
prélèvement de la colonie R. En effet, le plus souvent, la colonie R observée est très
superficielle, ou est accolée à d'autres colonies formées de bactéries non encore
transformées ou en cours de transformation. Dans ce cas, il aurait fallu ne pas racler
l'ensemble de la colonie, mais en prélever juste la surface pour éviter de prendre les
colonies S sous-jacentes.
Pour ce même problème Jann et coll (18) ont incriminé la méthode
d'extraction qui, si elle avait été spécifique au chimiotype R, comme préconisé par
Galanos et coll (18) aurait permis d'obtenir un profil plus spécifique.
En ce qui concerne V. cholerae, les formes S et R de nos souches donnaient
globalement le même profil de LPS. Des résultats identiques ont été trouvés par
Bahrani et Oliver (2) qui ont étudié des formes S et R de Vibrio vulnificus.
75
cependant, nos souches présentaient des bandes de LPS à longues chaînes
contrairement à ce que donnaient leurs souches ; toutes les bandes étaient des LPS à
chaînes courtes comme l’ont stipulé Shimizu et coll (51) qui ont démontré que le
LPS de Vibrio Anguillarum, dépourvu de KDO, avait une action antitumorale chez
la souris.
D'autre part, Bahrani et coll faisaient état pour les souches S comme pour les
souches R, d'une large bande de LPS R unique et constante. Cette bande correspond
fort probablement à la bande à 45 Kd que nous avons obtenue de nos souches S et R
Par ailleurs, les multiples autres bandes que nous avons détectées peuvent avoir été
le fait du bleu coomassie qui s'avère être une méthode de coloration très peu
spécifique, pouvant colorer aussi bien les protéines que des restes de sucre. En effet,
il est reconnu que les protéines peuvent même gêner la migration des LPS en gel de
polyacrylamide (15). D'où encore une fois, la caractère primordial de la purification
de l'extrait lipopolysaccharidique.
IV- LPS et virulence bactérienne
Il a été clairement établi que le LPS joue un rôle déterminant dans la
pathogénicité des bactéries à Gram négatif (7, 21).
Outre les propriétés endotoximiques constantes quelque soit le type de la souche :
Dues au lipide A, la chaîne polysaccharidique constitue elle même un facteur
de virulence certain, surtout chez les souches lisses.
C'est ainsi que Belanger et coll (3) ont montré que les souches lisses de
Actinobacillus pleuro pneumoniae adhéraient plus massivement aux anneaux
trachéens que les souches de type rugueux ou intermédiaire.
De même, Merino et coll(30) ont prouvé que les chaînes polysaccharidiques à
spécificité O permettaient à la bactérie de type lisse d'échapper aux défenses de
l'hôte..
En effet, ils ont montré que la composition du core oligosaccharide de souches de
Aeromonas hydrophila contribuait à la résistance de ces germes vis à vis du
complément.
Généralement, il est admis une relation directe entre la longueur des chaînes
polysaccharidiques (correspondant à des LPS de haut poids moléculaire) et la
virulence d'une souche.
76
Cependant, pour l'ensemble des souches dont nous avons étudié un facteur de
virulence :
- hémolysine pour les souches de E. coli et de Vibrio cholerae.
- Test de Sereny pour les souches de Shigella, cette évidence n'était pas
vérifiée, eu égard aux profils électrophorétiques identiques des souches positives et
négatives aux différents tests de virulence.
Pourtant Wandersman et Letoffé (60) ont démontré chez des souches de
E.coli que le LPS était bien impliqué dans l'incorporation correcte, au niveau de
l'enveloppe cellulaire, de la protéine Tolc requise pour la sécrétion d'hémolysine.
Vu le mécanisme génétique profond de ce procédé, l'observation unique des
bandes de LPS n'est sûrement pas un argument suffisant pour discuter un tel
phénomène.
Notre étude a montré que les souches de Shigella à test de Sereny négatif ont
toutes eu des bandes à trés longues chaînes et que par ailleurs la souche de Shigella
flexneri1 à test de Sereny positif n'avait sa bande supérieure qu'à 58Kd.
Cependant des travaux menés par Nikolaeva et coll (39) confirmaient bien que
les chaînes latérales jouent un rôle dans la pathogénéicité de souches de Shigella
sonnei.Pourtant leur étude portait comme la nôtre sur des souches lisses virulentes et
non virulentes.
Mais, n'ayant pas précisé le caractère de virulencve qu'ils avaient considéré,
nous pouvons supposer que le test de Sereny que nous avons appliqué, et la molécule
de LPS sont des facteurs de virulence indépendants.
Pour nos souches de Vibrio cholerae, la seule souche à hémolysine négative
s"est avérée être parmi celles ayant les bandes à plus longues chaînes . Cela nous
laisse supposer qu'il n'éxiste pas de lien entre la sécrétion d'hémolysine et la taille du
LPS.
Nos résultats rejoignent ceux de Bahrani et Oliver (2), qui ont étudié des
souches virulentes et non virulentes de Vibrio vulnificus et ont émis l'hypothèse qu'il
n'existe pas de lien,entre le LPS et la virulence des dites souches.
De même sur une étude portant sur l'analyse électrophorétique des protéines
de membrane et des LPS de souches d'Haemophilus influenzae, Pinon et coll (45)
ont déclaré ne pas pouvoir établir de relation entre le pouvoir pathogène et le LPS de
ces souches.
77
Prenant en compte toutes ces considérations, nous pouvons conclure que les
LPS peuvent jouer un rôle dans la virulence. Mais la physiopathologie des infections
à Vibrio cholerae, à Shigella et à Escherichia coli est liée à la présence de toxines
très proches : ST(thermostable) et LT(thermolabile) (12) repose essentiellement sur
la sécrétion.
V- LPS et sensibilité bactérienne aux antibiotiques
La résistance bactérienne est le fait de plusieurs mécanismes qui peuvent se
cumuler (33):
- interférences dans le transport, la pénétration et le maintien de l'antibiotique
dans la bactérie : augmentation de l'efflux (exemple : porines de
bacilles à Gram négatif). Ce premier mécanisme peut concerner plusieurs
familles d'antibiotiques (mécanisme pleiotropique).
- détoxification enzymatique de l'antibiotique (Exemple: bêta-lactamase ou
enzyme inactivant les aminosides)
- altération de la cible (Streptococcus pneumoniae et Bêta-lactamines)
- substitution de la cible (Exemple: sulfamide-triméthoprime).
Les mécanismes de résistance mettant en jeu l'accès du médicament à sa cible
sont d'origine génétique, soit secondaires à une mutation chromosomique, soit dus à
l'acquisition de gènes étrangers (plasmides, transposons).
L'étude de la sensibilité des bactéries à Gram négatif intégre de plus en plus
celle des LPS. Il est généralement admis que la grande taille de ces molécules, en
rapport avec l'importance de leurs chaînes polysaccharidiques, favorise la résistance
des germes à certains antibiotiques.
Ainsi, Kaca et coll (22) dans une étude portant sur Proteus mirabilis ont
constaté que les souches rugueuses étaient sensibles aux polymyxines B et E,
contrairement aux souches lisses.
En revanche, Dechêne et Leying (9) ont établi un lien entre la résistance des
souches de Serratia marcescens 992 à la ciprofloxacine et la baisse de la quantité de
KDO au niveau de leur membrane externe.
De même, Borneleit et coll (5) ont montré par électrophorèse d'affinité que les
porines se liaient de façon plus spécifique aux LPS des souches lisses qu’à ceux des
souches rugueuses.
78
Par rapport au mécanisme de résistance par défaut de pénétration ou de
transport, ceci nous permet de comprendre qu’il existe des mutants LPS, déficients
en un ou plusieurs osides nécessaires au transport de certains antibiotiques. De plus,
l'orientation des porines au niveau de la membrane externe est souvent déterminée
par les LPS (5). Or, les antibiotiques hydrophiles comme les bêtalactamines
empruntent ces porines aménagées dans la membrane externe.
Cependant, le LPS n'intervient pas seulement par sa portion
polysaccharidique, sur la sensibilité.
Vuorio et Vaara (59) ont travaillé sur le mutant LPxA2 de E.coli produisant
des quantités fortement réduites de lipide A. Ce mutant s'est avéré être à des
conditions normales de croissance très sensible à de nombreux antibiotiques tels que
l'acide fusidique et la vancomycine.
D'autre part, chez des mutants de Vibrio cholerae résistants aux antibiotiques
courants, Paul S. et coll (43) ont évalué le contenu en acide gras du lipide A :
50-56% chez les souches mutantes et 29-37% chez les souches sauvages.
Ainsi, en fonction de la taille des LPS, la multi-résistance de certaines souches
à Bêta lactamase négative par exemple pourrait s'expliquer par:
- un défaut de transport de certains antibiotiques : les chaînes latérales des LPS de
haut poids moléculaire créant un encombrement allostérique à l'entrée des porines
adjacentes.
- un manque d'atteinte de la cible : efflux
Pour la résistance des souches dont les petites tailles de LPS n'expliquaient pas
le phénoméne, on peut penser à l'absence de sucres indispensables au transport des
antibiotiques concernés.
La résistance des souches à Bêta lactamase positive était à priori imputable à
l'enzyme .
Cependant, il arrivait que des souches à Bêta lactamase positive, soient par
exemple sensibles à l’ampicilline. Dans ce cas, nous avons spéculé en faveur d'une
Bêta lactamase de bas niveau inductible ou constitutive ou d’une Bêta lactamase
spécifique pour le cas présent, une céphalosporinase.
En conclusion il peut être retenu que la résistance bactérienne aux
antibiotiques, imputée aux LPS peut s’expliquer de façons diverses:
79
- le passage des antibiotiques hydrophiles peut être gêné par les LPS à longues
chaînes latérales (Souches lisses), qui créent un encombrement à l’entrée des porines.
- pour les antibiotiques hydrophobes, l’efficacité sur les souches de bactéries à
Gram négatif peut varier avec le contenu en acides gras du lipide A.
80
Devant les manifestations particulièrement spectaculaires des septicémies à
bacilles à Gram négatif, nous nous sommes proposé
d'étudier les
lipopolysaccharides des formes lisses et rugueuses de certains germes responsables
d'infections graves.
L'enveloppe bactérienne est le support de l'interaction du microorganisme avec
son environnement.
Chez les bactéries à Gram négatif, cette fonction est assurée par la membrane
externe qui est constituée essentiellement de lipopolysaccharides. Ces composants
membranaires sont déterminants dans la virulence et l'antibiosusceptibilité de ces
germes.
Les variations structurales et fonctionelles du LPS selon le type de colonie
formé par la bactérie nous ont amené à étudier les LPS de souches lisses et rugueuses
obtenus à partir de 74 souches d'agents infectieux comprenant des Salmonella,
Escherichia coli, Shigella et Vibrio cholerae.
Après transformation des formes lisses d'origine en formes rugueuses, les LPS
des deux types (LPSS et LPS R) ont été extraits puis caractérisés par électrophorèse
sur gel de polyacrylamide en présence de dodécyl sulfate de sodium (SDS-PAGE).
Les profils électrophorétiques obtenus ont été analysés en fonction des
données préalablement recueillies sur la virulence et/ou l'antibiorésistance des
diverses souches.
Il découle de notre étude que l'obtention des souches R dépend de la substance
utilisée pour induire la dissociation mais aussi et surtout de la souche elle-même.
Ainsi, les Shigella ont donné le plus grand nombre de transformations (25 sur 33
souches contre 2 souches sur 10 pour Escherichia coli par exemple).
En ce qui concerne l'électrophorèse, les entérobactéries ont donné pour les
formes lisses, un profil « en escalier » comportant tous les chimiotypes de LPS :
S-SR-R-. Les formes rugueuses quant à elles, ont donné généralement une à deux
bandes de type R.
Les souches de Vibrio cholerae ont livré un profil plus simple qui dans
l'ensemble, s'est avéré identique pour les formes lisses et les formes rugueuses.
L'analyse du modèle électrophorétique des LPS des différentes souches eu
égard à leurs profils de virulence, nous a permis de retenir que le LPS pouvait être
considéré comme un facteur de virulence à part entière.Ce caractère pouvant être lié
à d’autres facteurs (LPS et Alpha hémolysine chez E. Coli),ou s’exprimer
81
indépendemment d’autres composantes telles que les toxines de Shigella, E. Coli,
Vibrio cholerae.
Du point de vue de la sensibilité, nous avons pu constater le lien essentiel
entre ces molécules et la résistance à certains antibiotiques:
- d'une part, le LPS peut interférer de par sa taille, , avec la
pénétration des antibiotiques hydrophiles comme les Bêta-lactamines. Il crée avec
ses chaînes latérales, un encombrement allostérique à l'entrée des porines, canaux
protéiques empruntés par ces substances.
- d'autre part, le LPS peut intervenir de par sa structure.La chaîne
polysaccharidique de certains mutants résistants peut montrer un déficit en osides
nécessaires au transport des antibiotiques en cause.
De même, des modifications au niveau du lipide A peuvent être à l'origine d'un
accroissement ou d'une baisse de la sensibilité.
Néanmoins, il serait judicieux d'approfondir notre travail, en soumettant les
formes R obtenues, après résolution du problème de leur conservation, aux mêmes
tests de virulence et de sensibilité que les formes S parentales.En effet, l'étude plus
pousséedes formes R est d'autant plus intéressante que leurs LPS ont des effets
biologiques atténués et conservent une immunogénicité satisfaisante. C'est la raison
pour laquelle, les LPS et les LOS sont appelés à supplanter l'adjuvant de Freund dans
la préparation des vaccins.
82
ANNEXES
ANNEXES
I - Milieux de culture - composition pour 1 litre
1 - Bouillon viande - foie glucosé à 2°/°°
- base viande - foie
29,5 g
- glucose
2g
- chlorhydrate de cysténie
0,5 g
pH final 7,4 plus ou moins 0,2
2 - Bouillon nutritif :
- macérat de viande
- peptone trypsique
- Nacl ou Kcl
1l
15 g
5g
préparation des bouillons :
- peser la quantité de milieu lyophilisé nécessaire.
- Dissoudre dans l'eau distillée sur un agitateur magnétique en chauffant.
- ajuster le pH.
- répartir dans des tubes à vis
- Autoclaver.
- Conserver au réfrigérateur à 4°C.
3 - Gélose Müller - Hinton.
- infusion de viande de boeuf
- hydrolysat de caséine
- Amidon
- gélose (agar)
- pH final 7,4
300 g
17,5 g
1,5 g
17 g
83
4 - Gélose nutritive
- macérat de viande
- peptonetrypsique
- Nacl ou Kcl
- Agar
1l
15 g
5g
15 - 20 g
- peser la quantité de milieu lyophilisé nécessaire
- Dissoudre dans l'eau distillée sur un agitateur magnétique en chauffant
jusqu'à ébullition.
- ajuster le pH.
- Autoclaver.
- Couler la gélose dans des boîtes de pétri stériles.
- Conserver les boîtes au réfrigérateur à 4°C.
Solutions pour obtention des souches R
1 - solution mère de chlorure de sodium à 100 g/l
- Nacl en cristaux
- eau distillée QSP
10 g
100 ml
2 - solution mère de chlorure de Lithium à 100 g/l
- Licl en cristaux
10 g
100 ml
3 - solution mère de D - alamine à 100 g/l
- D - ala en poudre
- Eau distillée QSP
10 g
100 ml
préparation des solutions :
- peser le réactif
- le dissoudre dans 50 ml d'eau, sur un agitateur magnétique.
- Complèter le volume à 100 ml
84
II - Réactifs d'extraction
II -1 - Solution d'EDTA 0,5M
- EDTA
23,25 g
125 ml
Dissoudre sur agitateur magnétique.
Conserver à température ambiante.
NB * l'EDTA ne se dissout qu'à un pH aux environs de 8.
II -2 - Tampon Tris - Acétate - EDTA (T.A.E)
50x (x : 40mM Tris 2mM EDTA)
- Tris base
24,2 g
- Acide acétique
5,71 ml
- EDTA 0,5 M
10 ml
100 ml
Conserver à 4°C;
II -3 - Solution de soude : NaOH 2N.
- NaOH (pastilles)
10 g
125 ml
II -4 - Solution base de Kado pour la lyse.
- Tris base
0,6 g
100 ml
85
II - 5 - Solution alcaline de lyse :
- Solution base de Kado
10 ml
- NaOH 2N
250 µl
pour obtenir un pH d'environ 12,6.
Utiliser imédiatement, ne se conserve pas.
II - 6 - Solution Tris - cl 0,5M à pH8
- Tris base
15,15 g
250 ml
II - 7 - Solution Tris - Cl 0,1M à pH8
- Tris base
3,03 g
250 ml
Dissoudre le Tris avec une partie de l'eau.
Ajuster le pH à 8 avec de l'Hcl 2N.
Compléter le volume avec le reste de l'eau.
II - 8 - Solution de phénol équilibré (33)
- Au préalable, faire fondre des cristaux de phénol au bain - marie et
conserver le phénol ainsi liquéfié dans un flacon teinté à -20°C.
- Au moment de la préparation,
1 - retirer le phénol des -20°C.
- abaisser sa température sur la paillasse (à l'air libre).
- puis le faire fondre au bain - marie à 68°C.
2 - prélever 100 ml de ce phénol dans un flacon teinté.
- ajouter 100 ml de Tris-cl O,5 M à pH 8.
- Agiter 20 mn sur agitateur magnétique.
- laisser reposer. Lorsque les 2 phases sont séparées, éliminer la phase
aqueuse supérieure avec une pipette aid.
86
3 - A la phase phénolique, ajouter 100 ml de Tris-cl 0,1M à pH8.
- agiter 20 mn sur agitateur magnétique.
- laisser reposer et retirer entièrement la phase aqueuse supérieure.
3' - Vérifier le pH de la phase phénolique avec du papier pH :
Si le pH est supérieur à 7,8, le phénol est équilibré.
Sinon, répéter l'étape (4), jusqu'à ce que la phase phénolique ait un pH
supérieur à 7,8 ;
4 - A la surface de la phase phénolique, ajouter 10 ml de Tris-cl 0,1 M à pH 8.
5 - ajouter
. 9 6 ml de chloroforme.
. 4 ml d'alcool isoamylique.
6 - rajouter au mélange final 10 ml de Tris-cl 0,1 M à pH 8.
- conserver dans la bouteille teintée et enveloppée de papier aluminium à
4°C.
la
- lors de l'utilisation, prélever la phase phénolique inférieure en y plongeant
pipette.
9 - Solution d'acétate de sodium 3 M à pH 5,2
- Acétate de sodium
30,75 g
125 ml
Dissoudre le sel avec une partie de l'eau.
Ajuster le pH à 5,2 avec de l'acide acétique.
Compléter le volume avec le reste de l'eau.
10 - Ethanol à 70°
mouillage de l'alcool à 95° :
- éthanol à 95°
- Eau distillée
Volume totale
73,7 ml
26 3 ml
______
1 0 0 ml
87
III - réactifs d'électrophorèse
III - 1 - tampon de résolution ("lower buffer") à pH 8,8
- Tris 1,5 M
18,17 g*
- SDS
0,4 g
100 ml
III - 2 - tampon de regroupement ("upper buffer") à pH 6,8
- tris 0,5 M
12 g*
- SDS
0,8 g
200 ml
*Ces quantités permettent de préparer les solutions à 1,5 M et 0,5M
. puis il faut ajouter le SDS et ajuster le pH avec l'HCl concentré.
III - 3 - solution d'acrylamide - Bisacrylamide à 30%
- acrylamide
29,7 g
- N,N' méthyléne Bisacrylamide
0,3 g
100 ml
NB : . l'acrylamide est un toxique du système nerveux central. le Tris et le
SDS sont cancérigènes .
Ces produits ne doivent être ni inhalés, ni portés au contact de la peau. Il
faut les peser avec un masque et des gants, puis nettoyer la balance et ses alentours.
. Le pH des solutions est ajusté avec Hcl 12 N.
III - 4 - persulfate d'ammonium à 30%
- APS
1,5 g
5 ml
Aliquoter (100 µl) et conserver au froid à -20°C ou -70°C
III - 5 - TEMED
C'est une solution prête à l'emploi trouvée dans le commerce.
88
III - 6 - solution de Tris - glycine 10X pour la migration
- Tris base
30,3 g
- Glycine
144 g
1000 ml
III - 7 - tampon de migration ( "Running buffer")
- solution Tris glycine 10X
100 ml
- SDS à 10%
10 ml
Ajuster le pH à 8,2 avec Hcl 12N
1000 ml
III - 8 - tampon échantillon ("sample buffer")
- Tris 1,5 M pH 6,8
2,68 ml
- Bétamercaptoéthanol
2,5 ml
- SDS
1,15 g
- glycérol pur
4 ml
- bleu de bromophénol à 1% dans l'eau
(50 mg /5 ml)
0,5 ml
IV : réactifs de détection
IV - 1 - solution de coloration au bleu de Coomassie brillant.
- bleu de coomassie brillant
3,8 g
- Ethanol à 95°
1895 ml
- Acide acètique
380 ml
- Eau distillée
1525 ml
______
Volume total
3800 ml
IV - 2 - solution de décoloration sans bleu de Coomassie.
- Ethanol à 95°
189 ml
- Acide acètique
135 ml
- Eau distillée
1800 ml
______
Volume total
2124 ml
89
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introduction

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