HEMATOLOGIE TROPICALE PRATIQUE Notions de base

Transcription

Prins Leopold Instituut voor Tropische Geneeskunde
Institut de Médecine Tropicale Prince Léopold
Prince Leopold Institute of Tropical Medicine
Instituto de Medicina Tropical Principe Leopoldo
Nationalestraat, 155
B – 2000 Antwerpen
Stichting van Openbaar Nut 0410.057.701
HEMATOLOGIE
TROPICALE PRATIQUE
_______________________________
Notions de base
Philippe Gillet, Janvier 2006
TABLE DES MATIERES
TABLE DES MATIERES ............................................................................................................................................................ 2
PRISE DE SANG :...................................................................................................................................................................... 2
CAPILLAIRE : ........................................................................................................................................................................................ 4
VEINEUX :.............................................................................................................................................................................................. 4
DIFFERENCE ENTRE COAGULATION ET SEDIMENTATION : .................................................................................................. 5
DOSAGE DE L’HEMOGLOBINE................................................................................................................................................ 6
INTRODUCTION : ...................................................................................................................................................................................... 6
VALEURS DE REFERENCE : .................................................................................................................................................................... 7
METHODE HCS (HEMOGLOBINE COLOUR SCALE)...................................................................................................................... 8
PRINCIPE : ............................................................................................................................................................................................ 8
MATERIEL : ........................................................................................................................................................................................... 8
PRELEVEMENT :.................................................................................................................................................................................. 8
METHODE : ........................................................................................................................................................................................... 8
ENTRETIEN :......................................................................................................................................................................................... 9
METHODE LOVIBOND® (méthode simplifiée selon Harrison) ............................................................................................................ 9
PRINCIPE : ............................................................................................................................................................................................ 9
MATERIEL : ........................................................................................................................................................................................... 9
PRELEVEMENT :................................................................................................................................................................................ 10
METHODE : ......................................................................................................................................................................................... 10
PETITS PROBLEMES ET SOLUTIONS :........................................................................................................................................ 11
TABLE DE CONVERSION DU % LOVIBOND EN g / 100 ml :..................................................................................................... 12
METHODE A L’HEMATINE ACIDE SELON SAHLI :...................................................................................................................... 12
PRINCIPE : .......................................................................................................................................................................................... 12
MATERIEL : ......................................................................................................................................................................................... 12
REACTIFS : ......................................................................................................................................................................................... 13
PRELEVEMENT :................................................................................................................................................................................ 13
METHODE : ......................................................................................................................................................................................... 13
METHODE DE DRABKIN (méthode de référence) :............................................................................................................................ 14
PRINCIPE : .......................................................................................................................................................................................... 14
PRELEVEMENT :................................................................................................................................................................................ 14
REACTIFS : ......................................................................................................................................................................................... 14
METHODE : ......................................................................................................................................................................................... 15
HEMOCUE® ............................................................................................................................................................................................ 16
PRINCIPE : .......................................................................................................................................................................................... 16
MATERIEL : ......................................................................................................................................................................................... 16
PRELEVEMENT :................................................................................................................................................................................ 16
METHODE : ......................................................................................................................................................................................... 16
DHT (méthode à l’ammoniaque) ............................................................................................................................................................. 17
PRINCIPE : .......................................................................................................................................................................................... 17
MATERIEL : ......................................................................................................................................................................................... 17
PRELEVEMENT :................................................................................................................................................................................ 17
REACTIFS : ......................................................................................................................................................................................... 17
METHODE : ......................................................................................................................................................................................... 18
Hématologie tropicale pratique, notions de base ver pg médecins module 2 2006
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DETERMINATION DE L’HEMATOCRITE (METHODE MICRO, PAR CENTRIFUGATION) ..................................................... 21
PRINCIPE : .......................................................................................................................................................................................... 21
MATERIEL : ......................................................................................................................................................................................... 21
PRELEVEMENT :................................................................................................................................................................................ 21
METHODE : ......................................................................................................................................................................................... 21
REPONSES TYPES : ......................................................................................................................................................................... 22
REMARQUES : ................................................................................................................................................................................... 22
VALEURS DE REFERENCES :....................................................................................................................................................... 23
INTERPRETATION DES RESULTATS : ......................................................................................................................................... 23
INDICES (OU INDEX) : (MCHC) ............................................................................................................................................... 24
SOURCES D'ERREURS :.................................................................................................................................................................. 25
ASSURANCE QUALITE : .................................................................................................................................................................. 25
NUMERATION DES GLOBULES EN CELLULE DE NUMERATION ....................................................................................... 26
PRINCIPE GENERAL : ...................................................................................................................................................................... 26
MATERIEL GENERAL : ..................................................................................................................................................................... 26
LES CELLULES DE NUMERATION : .............................................................................................................................................. 26
NUMERATION DES GLOBULES BLANCS DANS LE SANG :................................................................................................ 29
REACTIFS : ......................................................................................................................................................................................... 29
PRELEVEMENT :................................................................................................................................................................................ 29
METHODE : ......................................................................................................................................................................................... 29
VALEURS DE REFERENCES : ........................................................................................................................................................ 30
ASSURANCE QUALITE..................................................................................................................................................................... 31
SOURCES D'ERREURS :.................................................................................................................................................................. 31
NUMERATION DES GLOBULES ROUGES DANS LE SANG : ............................................................................................... 31
INDICES (OU INDEX) :............................................................................................................................................................. 32
MCV.............................................................................................................................................................. 32
MCH ............................................................................................................................................................. 32
ANNEXE 1 : LISTE INDICATIVE DE PRIX POUR LES TECHNIQUES DE DETERMINATION DE L’ANEMIE ........................ 33
ANNEXE 2 : QUELQUES VALEURS DE REFERENCE EN HEMATOLOGIE .......................................................................... 34
ANNEXE 3 : MORPHOLOGIE DES ELEMENTS SANGUINS SUR FROTTIS COLORE AU MAY-GRÜNWALD-GIEMSA ...... 35
3 / 37
PRISE DE SANG :
CAPILLAIRE :
La technique la plus utilisée et la moins chère pour la prise d'échantillons hématologiques dans des
conditions difficiles est le prélèvement de sang capillaire. Ceci est particulièrement vrai pour les
enfants ou lorsque seule une petite quantité de sang est nécessaire (de l'ordre de 100 µl). Cependant,
comme aucun anticoagulant n’est utilisé, le sang doit être immédiatement analysé. Il est aussi
impossible de répéter un test en cas de résultat anormal.
ième
ième
Les emplacements de choix pour le prélèvement sont le 3
ou le 4
doigt de la main gauche
(index ou majeur). De préférence sur le côté du doigt qui est moins sensible que l’extrémité. Pour les
nourrissons de moins de 6 mois, le talon ou le gros orteil peuvent aussi être utilisés (attention à ne
pas enfoncer trop profondément la lancette : Risque d’ostéomyélite). Ne jamais prélever du sang à
un doigt ou un pied infecté. Ne jamais prélever du sang à un bras où coule une perfusion. Le
prélèvement capillaire doit être suffisamment profond pour obtenir un écoulement libre du sang. Si
une pression importante doit être exercée pour obtenir un volume de sang suffisant, une erreur de
dilution du sang par du liquide tissulaire sera introduite.
1. Préparer le matériel nécessaire : Lancette stérile en découpant le papier du côté opposé
à la pointe. 2 morceaux de coton. Le premier sec, l’autre imbibé d’alcool à 70 %,
instrument de prélèvement, …
2. Si possible, demander au patient de se laver les mains avec un savon doux et de l’eau
chaude (vasodilatation), puis de les sécher minutieusement.
3. Masser légèrement l’endroit à prélever : La main doit être chaude et relaxée. Si
nécessaire, la main froide peut être immergée dans de l’eau chaude. Les doigts du
patient doivent être droits et sans tension, afin d’éviter toute stase.
4. Désinfecter l'endroit choisi : D'abord avec un tampon de coton imbibé d'alcool à 70 %
(garder le tampon). Ensuite avec un tampon sec pour enlever toute trace d'alcool (garder
le tampon).
5. Sortir la lancette de son emballage et piquer d'un coup sec et rapide.
Jeter
immédiatement la lancette dans un conteneur à aiguilles.
6. Exécutez une pression légère sur le doigt, afin de réaliser un meilleur écoulement de
sang.
7. Essuyer la première goutte de sang avec le tampon de coton sec (pour éliminer l'alcool à
70 % qui restait éventuellement. Sauf dans le cadre de la recherche des microfilaires où
la sensibilité de la recherche est plus grande dans la première goutte de sang). Jeter le
coton dans la poubelle.
8. La goutte de sang doit être assez grande pour compléter le volume à prélever en une
seule fois.
9. Prélever le sang pour le test à effectuer, en pressant de votre main gauche le doigt piqué
pour faire sortir le sang.
10. Couvrir l'endroit de la piqûre avec le coton imbibé d'alcool à 70° et demander au patient
de le maintenir pendant quelques minutes.
Note particulière pour la détermination de la glycémie : L’usage d’éther ou d’un désinfectant
cutané, quel qu’il soit, risque d’interférer avec la réaction enzymatique du réactif de la bandelette
(glucose désoxyréductase). Pour la glycémie, afin de limiter le risque infectieux et l’interférence
possible de débris alimentaires (trace de jus d’un fruit ou de sucre par exemple), il est recommandé
de demander au patient de se laver les mains avec un savon doux puis de les sécher minutieusement
avant de réaliser un prélèvement capillaire.
VEINEUX :
Lorsqu'une plus grande quantité de sang est nécessaire, lorsque différents services doivent travailler
sur le même échantillon ou lorsqu'un échantillon de sérum est nécessaire, la prise de sang veineuse
est utilisée.
Pour éviter la coagulation et pour maintenir les cellules dans un état naturel, l’usage d’un
anticoagulant est alors nécessaire. Les anticoagulants fonctionnent via différents mécanismes :
- par élimination des ions calcium libres (exemples : EDTA, citrate trisodique)
4 / 37
- par interférences avec les facteurs de la coagulation (exemple : Héparine)
Pour les examens hématologiques courants (hémoglobine, numération globulaire, groupages
sanguins, etc.), le sel dipotassique de l'EDTA est recommandé par rapport aux autres
(complexonII, complexon III, K3EDTA, Na2EDTA, …)
Des tubes contenant de l'anticoagulant peuvent être préparés de la manière suivante : verser 40 µl de la solution du
sel dipotassique de l'EDTA (10 g / 100 ml d'eau distillée) dans un tube de 3 ml. Laisser sécher à température
ambiante en protégeant les tubes de la poussière. Boucher les tubes après séchage. Ces tubes doivent être
remplis avec 2.5 ml de sang. Il est important de respecter la concentration correcte en anticoagulant (soit plus ou
moins 1,5 mg d'EDTA par ml de sang) : une concentration trop faible en anticoagulant n'évitera que partiellement la
coagulation, tandis qu'une concentration trop élevée déformera les cellules. Il faut donc toujours remplir le tube du
volume prévu de sang.
Pour la vitesse de sédimentation le citrate trisodique est utilisé à la dilution suivante 1 volume
d'une solution de citrate trisodique à 32 g/l pour 4 volumes de sang.
DIFFERENCE ENTRE COAGULATION ET SEDIMENTATION :
Sans anticoagulant
Coagulation
(Solidification)
Avec anticoagulant
Sédimentation
(ou après centrifugation)
Sérum
Plasma
GB (buffycoat)
(GR+GB dans une
structure de fibrine)
Prothrombine
Culot
GR
Thrombine
Fibrinogène
Fibrine (en quelques min) puis formation
d’un réseau spongieux (après quelques heures, formation de
grumeaux)
SERUM = PLASMA SANS LES PROTEINES INTERVENANT DANS LA COAGULATION
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DOSAGE DE L’HEMOGLOBINE
INTRODUCTION :
L’anémie est définie par une diminution du taux de l’hémoglobine (et non par une diminution du
nombre de globules rouges). L’anémie correspond donc à une diminution de la masse totale de
l’hémoglobine dans l’organisme ce qui se traduit par une diminution des valeurs données par
l’hémogramme.
L’anémie se définit par une hémoglobine inférieure à 11 g/100 ml (ce qui correspond à un hématocrite
inférieur à 33 %). Une hémoglobine inférieure à 7 g/100 ml signe une anémie sévère (soit un
hématocrite inférieur à 21 %). Certains auteurs (et peut être dans l’avenir l’OMS) prennent comme
valeur seuil 8 g/100 ml (soit un hématocrite inférieur à 24 %).
V o lu m e
p la s m a tiq u e
V o lu m e
g lo b u laire
N o rm a l
A n ém ie
v ra ie
F a u sse a n ém ie
(h é m o d ilu tio n )
Fig.1 : Anémie vraie et fausse anémie par hémodilution. Dans
certaines circonstances, la diminution des valeurs de l’hémogramme
est lié à une hémodilution par excès de plasma entraînant une fausse
anémie : grossesse, splénomégalie, insuffisance cardiaque,
Immunoglobuline monoclonale surtout IgM,…
L’hémoglobine est le principal constituant des globules rouges. C’est le pigment qui donne la couleur
rouge au sang. L’hémoglobine est responsable du transport de l’oxygène, du gaz carbonique et des
échanges gazeux tissulaires et pulmonaires.
L’hémoglobine est constituée de 4 chaînes protéiques (les globines) et de 4 molécules d’hème.
2+
L’hème est une protoporphyrine qui comporte un atome de fer divalent (Fe ). L’une des valences de
ce fer ferreux se fixe à la globine, l’autre fixe l’oxygène dans la forme oxygénée (Fig. 2). Chez
l’adulte, l’hémoglobine majoritaire est l’hémoglobine A, formée de 2 chaînes α et de 2 chaînes β
(α2β2). Elle représente plus de 97 % de l’hémoglobine totale. Il existe une fraction minoritaire
d’hémoglobine A2 (formée de 2 chaînes α et de 2 chaînes δ soit α2 δ 2). Chez le fœtus et le nouveauné, on retrouve un type particulier d’hémoglobine : L’hémoglobine fœtale (HbF, formée de 2 chaînes α
et de 2 chaînes γ, soit α2 γ 2). Son taux décroît au cours le la première année de vie, pendant laquelle
elle est remplacée par de l’hémoglobine A. Au-delà de la première année, elle n’est normalement
présente qu’à l’état de trace (moins de 1 %).
Fig 2 : Structure de l’hémoglobine
(Hémoglobine A)
globine
α
β
Fe
Fe
141 aa
146 aa
hème
(2-3 DPG)
β
α
Fe
Fe
146 aa
141 aa
2-3 DPG = 2-3 diphosphoglycérate
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Pour définir une anémie, il est donc important d’avoir une technique fiable et de préférence simple
pour déterminer l’hémoglobine. Différentes techniques plus ou moins fiables existent. Ces
techniques peuvent se regrouper sous 2 grandes familles :
1. Les techniques basées sur la couleur du sang complet, ni dilué ni hémolysé pour estimer
l’hémoglobine (Talquist, HCS, Lovibond, …).
2. Les techniques basées sur la couleur du sang après hémolyse des globules rouges pour
estimer l’hémoglobine (DHT,…).
3. Les techniques hémolysant et transformant le sang avant de déterminer l’hémoglobine (Sahli,
Hemocue, Drabkin,…).
Une autre alternative serait d’utiliser l’hématocrite pour définir l’anémie.
Le choix de la technique utilisée dépendra de sa fiabilité, de sa reproductibilité, de son prix, de
l’équipement nécessaire, du degré de difficulté, de la formation du personnel disponible, ...
1
VALEURS DE REFERENCE :
Les valeurs d’hémoglobine varient en fonction de l'âge, du sexe et de l'altitude.
Sexe
Age
Unités
Hémoglobine
en g/100 ml
3 mois – 12 mois
Homme et femme
10,0 – 14,0
1 an – 12 ans
Homme et femme
10,5 – 15,0
12 ans – 100 ans
Homme (Europe)
13,2 – 17,3
12 ans – 100 ans
Femme (Europe)
11,7 – 15,5
1
Les valeurs de références varient en fonction de la population et de la méthode utilisée par le laboratoire. Chaque laboratoire devrait donc
valider ces valeurs de références avec le laboratoire de référence pour l'hématologie le plus proche.
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METHODE HCS (HEMOGLOBINE COLOUR SCALE)
PRINCIPE :
La méthode HCS est une méthode visuelle simple permettant d'estimer la quantité d'hémoglobine. Il
s'agit de comparer la couleur du sang total (ni hémolysé, ni dilué) absorbé en couche mince sur un
papier buvard spécial, avec une série de couleurs de référence.
Les couleurs de références correspondent à différentes valeurs d’hémoglobine :
14, 12, 10, 8, 6 et 4 g /100 ml.
MATERIEL :
Matériel pour prélèvement capillaire +
Kit HCS contenant un livret avec une palette de six couleurs de référence, un distributeur de
bandelettes tests et des bandelettes tests (papier buvard spécial. N’utiliser que les bandelettes
spéciales commercialisées par Copack. D’autres bandelettes pourraient donner des résultats
erronés. Les bandelettes tests doivent être conservées à l’abri de la lumière, de l’humidité et de la
poussière), alcool à 70 %.
PRELEVEMENT :
Prélèvement de sang capillaire soit prélèvement de sang veineux. Le sang doit alors être prélevé sur
un anticoagulant sec (pour éviter la dilution). Les deux anticoagulants conseillés sont soit l'héparine
soit l'EDTA dipotassique.
METHODE :
Trouver un lieu convenable pour réaliser la détermination : Une pièce bien éclairée par la lumière ou
par une lumière artificielle, une véranda ou sous un arbre. (EVITER LE PLEIN SOLEIL ET LA
PENOMBRE). Lors de la comparaison des couleurs, la source d’éclairage doit venir par-dessus
l’épaule, en évitant l’ombre projetée par l’utilisateur.
1. Déposer une goutte de sang à l’une des extrémités de la bandelette en quantité suffisante
pour couvrir toute la surface des cercles découpés dans l’échelle de comparaison (environ 1
cm de diamètre).
Suffisamment pour que la tache
formée soit juste plus grande que
la surface des cercles découpés
dans les couleurs de références.
Trop peu de sang : La surface des
cercles découpés ne sera pas
entièrement recouverte de sang.
Trop de sang : La tache sera trop
épaisse et le sang mettra trop de
temps à sécher.
2. ATTENDRE ENVIRON 30 SECONDES après avoir déposé le sang. Comparer ensuite
immédiatement les couleurs. Tout retard dans la lecture du résultat sera source d’erreur car
la tâche de sang s’éclaircira et donnera donc une valeur faussement plus basse. Déplacer la
bandelette-test de haut en bas derrière les ouvertures pratiquées dans l’échelle en
commençant par la nuance la plus claire (4 g/dl) ou la plus sombre (14 g/dl), jusqu’à trouver la
couleur de référence qui correspond le mieux à la tache de sang. Pendant la lecture,
maintenir la bandelette test tout contre l’échelle de manière à éviter toute lumière parasite.
Essayer de tenir le livret dans différentes positions : modifier doucement l’angle d’observation
afin de trouver la meilleure position qui permet de distinguer au mieux les six nuances de
rouge.
8 / 37
•
Si la couleur de la goutte de sang correspond exactement à l’une des nuances de
rouge de référence, enregistrer le taux d’hémoglobine correspondant.
•
Si la couleur de la goutte de sang se situe entre deux teintes, retenir la valeur
moyenne entre les deux teintes.
•
En cas de doute entre deux teintes, enregistrer le taux le plus faible.
Exemple :
14 g/100 ml : trop claire.
12 g/100 ml: Couleur identique.
10 g/100 ml: Trop sombre.
8 g/100 ml : Trop sombre.
ENTRETIEN :
Le nettoyage de l’échelle se fait en essuyant sa surface arrière avec un mouchoir en papier humidifié
avec de l’alcool à 70 %, puis avec un mouchoir sec. L’échelle de couleurs de référence doit être
nettoyée après chaque usage.
L’échelle peut servir à des milliers de tests. Cependant, afin d’éviter toute dégradation des couleurs, il
y a lieu de toujours bien refermer le livret après utilisation et de ne jamais le laisser exposé en plein
soleil. Le livret doit être périodiquement replacé (comparer périodiquement les couleurs de références
avec un carnet neuf pour décider de son remplacement).
®
METHODE LOVIBOND (méthode simplifiée selon Harrison)
PRINCIPE :
La méthode Lovibond est une méthode visuelle permettant d'estimer la quantité d'hémoglobine. Il
s'agit de comparer la couleur du sang total (ni hémolysé, ni dilué) étalé en couche mince d’une
épaisseur calibrée dans une cellule spéciale avec une série d'étalons colorés (disques) dans le
comparateur LOVIBOND®.
MATERIEL :
Matériel pour prélèvement capillaire + Comparateur Lovibond, disques Lovibond 5/8 A et 5/8 B, cellule
Lovibond 004, compresse, papier doux, alcool 70 %, bécher, solution de chlore à 1 %.
Comparateur Lovibond® 2000
Cellule Lovibond® 004
Disque
Pince
Lamelle
Protubérance
Lame
La cellule spéciale est composée de deux plaques en verre de dimensions différentes (une lame et
une lamelle) que l'on peut accoler au moyen d'une petite pince. Trois protubérances sur la lamelle
maintiennent un espace calibré entre les plaques, dans lequel le sang à examiner est introduit
latéralement par capillarité (c.-à-d. en faisant MONTER le sang dans la cellule).
9 / 37
PRELEVEMENT :
Prélèvement de sang capillaire [ou prélèvement de sang veineux. Le sang doit alors être prélevé sur
soit l'EDTA dipotassique].
METHODE :
1. Rincer et essuyer la cellule à l'eau filtrée.
2. Rincer et essuyer la cellule à l'alcool (Ethanol 70 %).
3. Monter la cellule de telle façon que le chiffre 004 soit lisible sur la lamelle. Fixer la lamelle
avec la pince. Une cellule est fragile et coûteuse : Toujours effectuer le montage au-dessus
d'une table. Manipuler toujours la cellule pince dirigée vers le bas.
4. Vérifier l'état de propreté des disques de comparaison. S'ils sont sales, les nettoyer avec un
chiffon doux. Vérifier la coloration des conjonctives du patient. En fonction de leur coloration,
choisir le disque A pour les faibles valeurs d'hémoglobine ou le disque B pour les valeurs
élevées d'hémoglobine. Introduire le disque choisi dans le comparateur en s'assurant que les
références numérotées font face à l'utilisateur. Régler le comparateur sur la plus faible valeur
d’hémoglobine du disque.
VERIFIER LA CELLULE AVANT UTILISATION :
•
•
•
•
Il faut que la cellule soit préalablement décontaminée à l'eau de Javel puis désinfectée à l'alcool à 70 %.
Il faut qu'elle soit propre et sèche (pas de trace d'eau, d'alcool, de doigts ou de poussière).
Il faut que le chiffre 004 soit lisible sur la lamelle.
Il faut que la lamelle ne dépasse pas latéralement de la lame.
5. Utiliser du sang provenant d'une piqûre au doigt (prélèvement de sang capillaire) pour
remplir COMPLETEMENT la cellule en faisant MONTER le sang dans la cellule. S'il y a des
bulles d'air dans la cellule, recommencer au point 1 en utilisant une nouvelle cellule.
6. Eliminer le sang qui est sur la lamelle ou sous la lame avec un papier doux. Ne pas
éliminer le sang qui est sur le côté de la lame.
7. Enlever la pince.
8. Introduire la cellule dans la partie gauche du comparateur, lame dirigée vers l'observateur.
Tenir la cellule avec le doigt pour qu'elle soit parfaitement verticale dans le comparateur.
Chercher IMMEDIATEMENT, en lumière diffuse à 50 cm des yeux, la couleur correspondante
sur l'un des deux disques (La lecture doit être rapide pour éviter la coagulation et le
séchage du sang). Noter la valeur trouvée.
POUR OBTENIR UNE LUMIERE DIFFUSE :
•
•
•
La journée, diriger le comparateur en direction d’une surface blanche dans la direction opposée au soleil.
La nuit, diriger le comparateur vers une surface blanche qui est éclairée par une lampe mate.
En dirigeant directement le comparateur vers le soleil ou vers une lampe, la détermination ne sera
pas correcte.
10 / 37
9. Convertir le % trouvé en g/100 ml de sang à l'aide de la table de conversion.
10. Décontaminer la cellule (bain de 30 minutes dans une solution de Chlore à 1 %).
11. Rincer et essuyer la cellule à l'eau filtrée.
12. Rincer et essuyer la cellule à l'alcool (éthanol 70°).
13. RANGER LES DISQUES IMMEDIATEMENT DANS LEURS COFFRETS DE
PROTECTION ET LES CONSERVER A L'ABRI DE LA LUMIERE. (La lumière a un effet
décolorant sur les couleurs)
14. Monter les cellules dès la fin de leur désinfection pour être prêt pour un autre patient ou
une urgence. Protéger les cellules montées en les enroulant dans du papier doux (papier
hygiénique ou serviette en papier).
PETITS PROBLEMES ET SOLUTIONS :
TOUJOURS VERIFIER LA CONCORDANCE ENTRE LA VALEUR DE L'HEMOGLOBINE
ET LA COLORATION DES CONJONCTIVES.
1. Aucune valeur n'apparaît dans l'ouverture inférieure du comparateur.
⇒
Le disque est placé à l'envers. Enlever le disque et retourner le.
2. Aucune couleur ne correspond à la coloration du sang du patient.
⇒
Le disque utilisé ne correspond pas à la valeur d'hémoglobine attendue. Utiliser l'autre disque.
⇒ Le patient a un ictère (jaunisse). Ses conjonctives supérieures sont jaunes. Trouver la couleur la plus
proche et signaler dans votre réponse la présence de l'ictère.
⇒ La couleur du sang est inférieure au minimum du comparateur. Donner comme résultat < à 20 % soit
< à 3,3 g/100 ml.
3. La Valeur d'hémoglobine mesurée semble trop basse.
⇒ S'assurer que la lamelle est mise dans le bon sens (chiffre 004 lisible). Si ce n'est pas le cas,
recommencer le dosage avec une autre cellule.
⇒ S'assurer qu'il n'y a pas de bulles d'air entre la lame et la lamelle. Si c'est le cas, recommencer le
dosage avec une autre cellule.
⇒ Vérifier la propreté du disque de comparaison et le cas échéant, nettoyer le disque avec un chiffon
doux.
⇒ Vérifier la propreté de la plaque translucide du comparateur et le cas échéant, la nettoyer avec une
solution de chlore à 1 % puis à l'eau filtrée.
Si aucune de ces solutions ne marche et que les valeurs sont systématiquement trop basses,
effectuer une comparaison entre des nouveaux et des anciens disques (la couleur des disques se
dégrade avec la lumière).
4. Valeur d'hémoglobine trop haute.
⇒ Le dessus de la lamelle ou le dessous de la lame sont souillés par du sang. Eliminer le sang qui est
sur ou sous la lame avec un papier doux.
⇒ Le désinfectant utilisé pour le prélèvement est coloré (Bétadine par exemple). Recommencer le
dosage en utilisant de l'Ethanol à 70 %.
⇒ Vérifier la propreté de la plaque translucide du comparateur et le cas échéant, la nettoyer à l'eau de
Javel puis à l'eau filtrée.
⇒ Le patient a un ictère (jaunisse). Ses conjonctives supérieures sont jaunes. Pas de solution, signaler
dans votre réponse la présence de l'ictère.
⇒ Le patient est déshydraté (ce qui provoque une hémoconcentration). Pas de solution, signaler la
déshydratation dans votre réponse.
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TABLE DE CONVERSION DU % LOVIBOND EN g / 100 ml :
AU MOMENT OU VOUS PENSEZ AVOIR TROUVE LA BONNE COULEUR, VERIFIEZ QUE
LA COULEUR PRECEDENTE EST PLUS CLAIRE ET QUE LA COULEUR SUIVANTE EST
BIEN PLUS FONCEE QUE L'ECHANTILLON.
DISQUES
POURCENTAGE
g / 100 ml
20
24
28
32
36
40
46
52
58
3.3
4.0
4.7
5.3
6.0
6.7
7.3
8.7
9.7
64
70
76
84
92
100
110
120
130
10.7
11.7
12.7
14.0
15.3
16.7
18.3
20.0
21.7
Disque N° 5/8 A
(Couleurs claires)
Pour faibles
valeurs
d'hémoglobine
Disque N° 5/8 B
(Couleurs foncées)
Pour fortes
valeurs
d'hémoglobine
METHODE A L’HEMATINE ACIDE SELON SAHLI :
PRINCIPE :
Une quantité précise de sang est diluée avec une solution acide dans un tube spécial. La solution
lyse les globules rouges, libère l’hémoglobine et transforme l’hémoglobine en un composé brunâtre
(l’hématine acide). Le mélange sang – acide est dilué avec de l’eau distillée, jusqu’à obtenir la même
couleur que la couleur de référence de l’hémoglobinomètre de Sahli. La lecture de la graduation
obtenue sur le tube donne la concentration en hémoglobine en g/100 ml.
La méthode de Sahli, encore bien utilisée est à déconseiller : Elle ne donne pas un dosage exact de
l’hémoglobine. En effet, tous les types d’hémoglobine ne se transforment pas en hématine acide, les
changements de couleurs ne sont pas très sensibles et la couleur brune du verre de référence n’est
pas vraiment semblable à celle de l’hématine acide.
MATERIEL :
Matériel pour prélèvement capillaire + hémoglobinomètre de Sahli, bâtonnet en verre
pour mélanger, pipette de Sahli, système d’aspiration de sécurité, tube gradué de Sahli,
pipettes pasteur ou flacons compte-gouttes.
L’hémoglobinomètre de Sahli est un support pour tube encadré de part et d’autre par
des bâtonnets colorés en brun. Ces bâtonnets servent de couleur de référence pour la détermination
de l’hémoglobine. Le tube de Sahli qui s’insère au centre du support est gradué en g/100 ml. Il peut
aussi porter une deuxième graduation en % (100 % en Sahli correspondent à 16 g/100 ml).
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REACTIFS :
Solution d’acide chlorhydrique à 0,1 N :
Acide chlorhydrique concentré
Eau distillée
:
:
9,5 ml
jusque 1 litre
ATTENTION, l’acide chlorhydrique est nocif et extrêmement corrosif. Il est aussi irritant pour les yeux.
Ce produit est à manipuler avec une extrême prudence, fenêtres ouvertes (ou sous hotte chimique).
Ne jamais verser d'eau dans de l'Acide Chlorhydrique concentré. L'addition d'une faible quantité
d'eau dans un acide produit suffisamment de chaleur pour faire exploser la bouteille. Mesurer 500 ml
d’eau distillée dans un cylindre de 500 ml et la verser dans un ballon de 1.000 ml. Utiliser une pipette et
un ballon à pipeter pour ajouter lentement 9,5 ml d’Acide chlorhydrique dans le jaugé. Le contenu
s’échauffera. Après refroidissement, ajuster à 1.000 ml avec de l’eau distillée. La solution ainsi préparée
est stable au moins 1 an à température ambiante.
Eau distillée (ou éventuellement filtrée).
PRELEVEMENT :
Prélèvement de sang capillaire ou prélèvement de sang veineux. Le sang doit alors être prélevé sur
soit l'EDTA dipotassique.
METHODE :
1. Remplir à l’aide du compte-gouttes le tube gradué avec la solution d’HCl 0,1 N, et ce
jusqu’au premier trait de la graduation (le fond du ménisque doit être au niveau du premier
trait).
2. Vérifier la pointe de la pipette de Sahli.
volume).
Eliminer toute pipette ébréchée (erreur de
3. Aspirer dans la pipette de Sahli un peu plus de 20 µl de sang, provenant d’un prélèvement
capillaire. Essuyer le sang sur la paroi et rapporter le volume de sang à exactement 20 µl
en touchant la pointe de la pipette au moyen d’un papier absorbant.
4. Souffler les 20 µl de sang de la pipette au fond du tube contenant l’HCl 0,1 N.
5. Rincer à 3 reprises la pipette avec le mélange sang-HCl du fond du tube et homogénéiser
le tube.
6. Laisser reposer 1 minute pour permettre l’hémolyse des globules rouges et la
dénaturation de l’hémoglobine en hématine acide.
7. Ajouter goutte à goutte de l’eau distillée au moyen du compte-gouttes, tout en remuant le
contenu du tube au moyen du bâtonnet en verre, et ce jusqu’à obtenir dans le tube la
même teinte que celles des comparateurs de référence. Vérifier l’égalisation progressive
des couleurs en tenant l’appareil à environ 50 cm des yeux, sous lumière diffuse.
8. Après égalisation des couleurs, rechercher la graduation de l’échelle en g/100 ml qui se
trouve à hauteur de la partie la plus basse du ménisque du liquide.
9. Noter le résultat.
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METHODE DE DRABKIN (méthode de référence) :
PRINCIPE :
Il s’agit de la méthode de référence (Standard d’or ou golden standard) Le sang est dilué dans
du réactif de Drabkin qui hémolyse les hématies et libère l’hémoglobine. Ce même réactif transforme
l’hémoglobine en un complexe stable : La cyanométhémoglobine.
Hb + K3Fe(CN)6 MHb
MHb + KCN CNMHb
[Hb = hémoglobine, MHb = méthémoglobine, CNMHb = cyanométhémoglobine]
Cette réaction se déroule à un pH stabilisé par du phosphate monopotassique pour obtenir une
réaction complète en un temps raisonnable. L’addition d’un détergent facilite l’hémolyse et prévient la
turbidité due aux protéines plasmatiques.
Une quantité précise de sang est diluée dans un volume donné de réactif de Drabkin. Après
hémolyse et transformation de l’hémoglobine, la densité optique de cette solution est déterminée au
photomètre à la longueur d’onde d’absorption maximale de la cyanométhémoglobine (540 nm). Cette
densité optique est proportionnelle à la quantité d’hémoglobine présente dans le sang. La quantité
d’hémoglobine est déterminée par comparaison avec les densités optiques mesurées pour des
concentrations connues d’hémoglobine.
PRELEVEMENT :
Prélèvement de sang capillaire soit prélèvement de sang veineux. Le sang doit alors être prélevé sur
soit l'EDTA dipotassique. Le sang prélevé sur anticoagulant peut être congelé et conservé au moins
deux ans (utilisation comme contrôle).
MATERIEL :
Matériel pour prélèvement capillaire + spectrophotomètre (ou colorimètre) permettant mesurer des
densités optiques à 540 nm, pipette de Sahli avec un système d’aspiration de sécurité (ou pipette
automatique de 20 µl), pipette graduée de 5 ml et ballon à pipeter (ou distributeur automatique de 5
ml), tubes à essai, cuvettes pour colorimètre, différents ballons jaugés et pipettes jaugées (pour la
dilution des calibrateurs), papier millimétré.
REACTIFS :
Réactif de dilution de Drabkin (aussi disponible « prêt à l’emploi » exemple Sigma D 5941) :
Ferricyanure de potassium (K3Fe(CN)6) :
Cyanure de potassium (KCN)
Phosphate monopotassique (KH2PO4) :
Tween 20
:
Eau distillée
0,20 g
:
0,14 g
1 ml
:
0,05 g
jusque 1 litre
(Le Tween 20 peut être remplacé par 0,5 ml Brij-35 à 30%)
ATTENTION, le cyanure de potassium est hautement toxique.
La solution obtenue doit être jaune pâle et limpide. Elle se conserve dans un flacon brun hermétiquement
bouché pendant plusieurs mois. Si un trouble apparaît, elle ne doit plus être utilisée.
Solution de Référence cyanométhémoglobine (CNMHB) pour calibration :
Des solutions de calibration sont disponibles commercialement (ex. Haemoglobin standard de
IGMA, HiCN BS3985 de BDH,…).
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Suivre le mode d’emploi du fabricant (exemple pour l’haemoglobin standard de
SIGMA) :
- Ajouter 50,0 ml de réactif de Drabkin au flacon ″Haemoglobin standard″.
- Mélanger pour dissoudre le contenu.
- Attendre au minimum 30 minutes avant emploi.
Conservée à l’obscurité entre 2° et 8° C, cette solution de calibration est stable au
moins 6 mois.
Réaliser une courbe de calibration sur base de différentes dilutions de cette solution
de calibration. A 540 nm, régler le zéro de la densité optique (D.O.) sur base d’une
cuvette de réactif de Drabkin, puis lire les D.O. des solutions de calibration. La
calibration est linéaire et passe par l’origine.
Exemple de dilution : Sur base d'un calibrateur contenant 18 g% d’équivalente
hémoglobine diluée dans 50,0 ml de Drabkin, on peut effectuer une courbe sur base
de quelques points intéressants de dilution facile :
Tube
N°
1
2
3
4
5
6
Volume de
Drabkin
en ml
4
3.5
3
2
1
0
Volume de
calibrateur dilué
en ml
0
0.5
1
2
3
4
Concentration
finale
en g %
0
2.25
4.5
9
13.5
18
METHODE :
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Allumer le spectrophotomètre, sélectionner la longueur d’onde et laisser chauffer la lampe.
Préparer une série de tubes à essai (nombre d’analyses à prévoir).
Pipeter exactement 5,0 ml de réactif de Drabkin dans ces tubes à essai.
Ajouter 0,02 ml (20 µl) de sang capillaire ou sang prélevé sur EDTA à un des tubes.
Rincer 3 fois la pipette avec le réactif.
Mélanger et attendre 5 minutes pour avoir une réaction complète (attention, la réaction peut
prendre jusqu’à 30 minutes pour un échantillon contenant une proportion élevée de carboxy
hémoglobine).
7. Mesurer la densité optique (D.O.) à 540 nm dans le même spectrophotomètre que celui utilisé
pour la réalisation de la courbe de calibration : Remplir une cuvette de réactif de Drabkin pour
régler le zéro du spectrophotomètre à 540 nm (blanc). Lire les D.O. des analyses et de la (ou
des) solution(s) de contrôle(s). La couleur est stable durant quelques heures.
Sur base de la courbe de calibration, déterminer la valeur en hémoglobine pour chaque échantillon.
D.O.
[Hb] en g/100 ml
ou
Calcul :
D.O. analyse
---------------------- x concentration du calibrateur = Hb concentration échantillon
D.O. calibrateur
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HEMOCUE®
PRINCIPE :
L’Hemocue est un exemple d’hémoglobinomètre robuste, portable et précis. Bien que son coût
d’utilisation le rende inabordable pour un hôpital de district, il peut être utile dans des enquêtes
épidémiologiques. Le sang est introduit dans une cuvette réactive spéciale à usage unique. Cette
cuvette, d’un volume précis contient un réactif qui hémolyse les globules rouges et transforme
complètement, en moins d’une minute, l’hémoglobine en azideméthémoglobine (réaction de Vanzetti
modifiée, basée sur l’azide de sodium). La densité optique de cette solution est déterminée par un
HemoCue® (photomètre spécial utilisant deux longueurs d’ondes (570 nm et 880 nm). La densité
optique à 570 nm, corrigée en fonction de la turbidité (880 nm) est proportionnelle à la quantité
d’hémoglobine présente dans le sang et est automatiquement convertie en g/100 ml. Ce système est
commercialisé par Hemocue : Site internet : http://www.hemocue.co.uk/
MATERIEL :
Matériel pour prélèvement capillaire + cuvettes HemoCue® à usage unique, lecteur HemoCue®,
cuvette HemoCue® de contrôle, batteries.
PRELEVEMENT :
METHODE :
1. Vérifier le fonctionnement du photomètre HemoCue : insérer dans l’appareil la cuvette de contrôle.
Le résultat obtenu dans être dans les limites recommandées par le fabricant (soit pour notre
cellule de contrôle N° 0149-003-037 entre 11,0 et 11,6 g/100 ml)
2. Par prélèvement de sang capillaire, remplir COMPLETEMENT une cellule Hemocue neuve en
faisant MONTER le sang dans la cuvette.
3. Remplir en une fois toute la cuvette de la cellule. N’essayez jamais d’ajouter du sang après le
premier remplissage. S'il y a des bulles d'air dans la cellule, recommencer en utilisant une
nouvelle cellule.
4. Enlevez l’excès de sang à l’extérieur de la cuvette à l’aide de
papier absorbant, sans aspirer le sang contenu dans la cellule.
5. Insérer immédiatement la cuvette remplie dans le portoir du
lecteur Hemocue.
6. Repousser le portoir de cuvette dans la position de mesure.
7. Le résultat d’hémoglobine de sang en g/100 ml (ou g/l ou mmol/l en fonction
de l’appareil) apparaît après 30 à 50 secondes sur l’écran de l’appareil. La
cuvette doit être analysée dans les 10 minutes qui suivent le remplissage de
la cuvette. Après ce délai, le résultat mesuré ne sera plus fiable suite à
l’évaporation du liquide de la cellule).
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DHT (méthode à l’ammoniaque)
PRINCIPE :
Une quantité précise de sang est diluée dans un
volume précis d’une solution hémolysante
(ammoniaque à 0,04 %). L’hémoglobine libérée
des globules rouges donne la couleur rouge au
liquide. L’intensité de cette couleur est mesurée à
523 nm (longueur d’onde d’absorption maximale
commune
de
la
majorité
des
types
d’hémoglobines) dans un photomètre qui
transforme cette valeur en concentration.
La mesure de la concentration en hémoglobine
(en g/l) est automatiquement effectuée lors de
l’introduction d’une cuvette dans l’appareil. La valeur mesurée reste affichée durant 30 secondes,
puis l’appareil passe automatiquement en position « stand by » ce qui lui permet de faire
périodiquement des autocontrôles. Ce système est commercialisé par DHT : Site internet : www.dhtonline.co.uk
Cuvette
Fenêtre en verre
Filtre d’interférence
Photodiode
LED (Diode émettant une lumière verte)
MATERIEL :
Matériel pour prélèvement capillaire + hémoglobinomètre DHT, tubes à hémolyse, pipette de Sahli
avec un système d’aspiration de sécurité, (ou pipette automatique de 20µl), pipette graduée de 2 ml
(ou distributeur automatique de 2 ml), ballon à pipeter, tubes à essai, cuvettes pour colorimètre, ballon
jaugé de 1.000 ml.
PRELEVEMENT :
REACTIFS :
Solution d’ammoniaque à 0,04 % (v/v) :
Préparation sur base d’une solution d’ammoniaque à 28 % :
Ammoniaque à 28 %
Eau distillée
1,4 ml (pipettes en verre de 5 ml)
ad 1.000,0 ml (ballon jaugé de 1.000ml)
ATTENTION : L’ammoniaque concentrée produit des vapeurs irritantes et toxiques. N’ouvrir la bouteille que
dans un local bien ventilé (ou sous hotte chimique).
Cette préparation donne une concentration finale en ammoniaque de 0,0392 %. La solution diluée est stable 4
semaines dans un flacon blanc hermétiquement bouché à température ambiante.
Formule utilisée pour la calculer la dilution :
C1 x V1 = C2 x V2
17 / 37
Où
C1 = Concentration de la solution concentrée en ammoniaque
V1 = Volume de la solution concentrée en ammoniaque à utiliser
C2 = Concentration en ammoniaque à atteindre
V2 = Volume de la solution diluée à préparer
Exemple :
C1 = 28 %
V1 = ?
C2 = 0,04 %
V2 = 1.000 ml
Soit : 28 % x V1= 0,04 % x 1000 ml soit V1 = 1,429 ml
METHODE :
VERIFICATION DE LA CALIBRATION DE L’HEMOGLOBINOMETRE : (Attention : Les valeurs
données ne sont valables que pour l’hémoglobinomètre N° 0931 de l’ITG)
Eviter de salir les surfaces optiques des cuvettes. Ne jamais toucher les surfaces optiques. Toujours
manipuler les cuvettes en les tenant par leurs faces mates. Toutes traces de doigts, de salissures ou
de condensation doivent être enlevées avec un papier doux avant mesure.
Lors du remplissage de la cuvette, éviter la formation de bulles d’air qui affecterait la mesure.
A. REGLAGE DU BLANC :
Insérer une cuvette PROPRE ET SECHE dans l’appareil.
Attention, la cuvette doit être du même type que celles utilisées pour les dosages. La valeur
obtenue doit être comprise entre 14 et 24 g/l (pour l’appareil N° 0931). Si ce n’est pas le cas,
faites les vérifications suivantes :
CAUSES POSSIBLES
Cuvette mal insérée dans l’appareil :
Cuvette griffée :
Cuvette sale, ou humide :
Facteur de calibration (M) incorrect :
Réglage du zéro électronique de l’appareil
incorrect :
Le type de cuvette utilisée n’est pas le
même que celle utilisée pour la calibration :
La fenêtre optique de l’appareil est sale :
ACTIONS
Insérer la cuvette en sorte que le trajet optique rencontre les
faces transparentes de la cuvette.
Changer de cuvette. Revérifier la valeur obtenue avec une
cuvette neuve et sèche.
Laver et sécher la cuvette. Revérifier la valeur obtenue avec
la cuvette propre et sèche.
Vérifier et ajuster si nécessaire le facteur de calibration :
Enfoncer et maintenir pendant deux secondes la touche R.
Le symbole HHH sera afficher puis la valeur du facteur.
Relâcher la touche R dès que la valeur est affichée.
Si la valeur affichée n’est pas 162 (pour l’appareil N° 0931),
augmenter cette valeur en appuyant sur la touche L ou
diminuer cette valeur en appuyant sur la touche R.
Après ajustement, revérifier la valeur du blanc obtenue avec
Remplir une cuvette propre d’eau distillée. Insérer la cuvette
dans l’appareil, puis enfoncer et maintenir la touche L jusqu’à
l’émission d’un bruit. La nouvelle valeur du zéro est alors
enregistrée.
Revérifier la valeur du blanc obtenue avec la cuvette propre
et sèche.
enregistrée.
et sèche.
Nettoyer la fenêtre optique à l’aide d’un petit coton-tige
imbibé d’alcool à 70°. Laisser sécher. Revérifier la valeur du
blanc obtenue avec la cuvette propre et sèche.
B. VERIFICATION ET REGLAGE DU ZERO DU DOSAGE :
Insérer dans l’appareil une cuvette contenant 2 ml d’une solution d’ammoniaque à 0,04 %. La
valeur mesurée et affichée doit être égale à 0. Si la valeur obtenue n’est pas 0, enlever la
cuvette et dans les deux secondes qui suivent enfoncer et maintenir la touche L jusqu’à
l’émission d’un signal sonore. Insérer dans l’appareil une cuvette contenant 2 ml d’une
solution d’ammoniaque à 0,04 %. La valeur mesurée et affichée doit être égale à 0. Ce
contrôle est à faire avant chaque série de mesures.
18 / 37
C. VERIFICATION DE LA CALIBRATION :
Une cuvette de contrôle (N° 0931 pour notre appareil) est fournie avec chaque lecteur. La
valeur attendue pour notre cuvette de contrôle doit être comprise entre 133 et 143. Ce
contrôle est à effectuer avant chaque série de mesures
Insérer dans l’appareil la cuvette de calibration. Si la valeur mesurée n’est pas comprise dans
cet intervalle, réaliser les vérifications suivantes :
CAUSES POSSIBLES
Cuvette de contrôle mal insérée dans
l’appareil :
Cuvette de contrôle griffée :
Cuvette sale, ou humide :
Facteur de calibration (M) incorrect :
Réglage du zéro électronique de l’appareil
incorrect :
Le type de cuvette utilisée n’est pas le
même que celle utilisée pour la calibration :
La fenêtre optique de l’appareil est sale :
ACTIONS
Insérer la cuvette en sorte que le trajet optique rencontre les
faces transparentes de la cuvette.
Acheter une nouvelle cuvette de contrôle. Revérifier la valeur
obtenue avec une cuvette neuve et sèche.
Laver et sécher la cuvette. Revérifier la valeur obtenue avec
Vérifier et ajuster si nécessaire le facteur de calibration :
Enfoncer et maintenir pendant deux secondes la touche R.
Le symbole HHH sera afficher puis la valeur du facteur.
Relâcher la touche R dès que la valeur est affichée.
Si la valeur affichée n’est pas 162 (pour l’appareil 0931),
augmenter cette valeur en appuyant sur la touche L ou
diminuer cette valeur en appuyant sur la touche R.
et sèche.
enregistrée.
et sèche.
enregistrée.
et sèche.
Nettoyer la fenêtre optique à l’aide d’un petit coton-tige
imbibé d’alcool. Laisser sécher. Revérifier la valeur du blanc
obtenue avec la cuvette propre et sèche.
REALISATION D’UN DOSAGE :
ATTENTION : La précision de la mesure dépend de la bonne concentration en ammoniaque,
de la qualité de l’eau distillée utilisée pour la préparation du réactif d’hémolyse, de la précision
de la mesure du volume d’ammoniaque et de la précision de la mesure du volume de sang.
Pour chaque échantillon, prévoir un tube contenant 2,0 ml du réactif d’hémolyse
Vérifier si la pipette de Sahli est propre, sèche et non ébréchée.
Prélever 20 µl de sang (pipette de Sahli sur laquelle est adaptée une seringue à insuline).
Aspirer le sang un peu au dessus du trait de jauge.
Essuyer l’excès de sang sur la paroi extérieure de la pipette avec un papier hygiénique et ajuster
au trait de jauge avec le papier hygiénique.
6. Refouler le sang dans le tube contenant 2 ml du liquide d’hémolyse.
7. Rincer 3 fois par refoulement la pipette de Sahli avec le mélange de sang et de liquide d’hémolyse
(L’hémolyse ne demande que quelques secondes).
8. Après homogénéisation, transférer le contenu du tube dans une cuvette optique. La couleur reste
stable pour 6 à 8 heures.
9. Insérer la cuvette dans l’appareil
10. Lire la valeur (en g/l) affichée sur l’appareil.
1.
2.
3.
4.
5.
Attention, si le signal sonore se termine avant que la cuvette soit totalement insérée dans l’appareil, la
valeur affichée sera fausse. Attendre le signal sonore suivant pour utiliser la valeur.
19 / 37
20 / 37
DETERMINATION DE L’HEMATOCRITE (méthode micro, par centrifugation)
PRINCIPE :
La mesure de l’hématocrite (Ht) consiste à apprécier le volume occupé par les globules rouges par
rapport au volume occupé par le plasma, permettant de rechercher une hémoconcentration ou une
anémie. L’hématocrite s’exprimait en pourcentage, car c’est un rapport de volume.
Volume des globules rouges
Ht = -------------------------------------- x 100
Volume du sang total
Les nouvelles unités sont en nombre absolu (même formule, mais sans multiplier par 100)
On remplit un tube capillaire de sang que l’on centrifuge à grande vitesse. Après centrifugation, le
pourcentage du volume du sang occupé par les globules rouges est mesuré. Comme le diamètre du
tube capillaire est constant, la hauteur des différentes couches est directement proportionnelle à leur
volume. La mesure des hauteurs est donc suffisante.
Hauteur des globules rouges
Ht = ------------------------------------------ x 100
Hauteur du sang total
MATERIEL :
Matériel pour prélèvement capillaire + centrifugeuse hématocrite, tube capillaire hépariné (tubes
rouges, 75 mm diamètre de 1.5 mm), lampe à alcool (ou pâte à modeler), échelle pour lecture des
résultats.
PRELEVEMENT :
Prélèvement de sang capillaire ou prélèvement de sang veineux. Le sang doit alors être prélevé sur
un anticoagulant sec (pour éviter la dilution) qui en outre n'influence pas le volume des globules
rouges. Les deux anticoagulants conseillés sont soit l'héparine soit l'EDTA dipotassique. Dans le cas
d’un prélèvement veineux sur anticoagulant, des tubes capillaires secs (sans anticoagulant) peuvent
être utilisés). Comme l’hématocrite augmente en fonction de la durée de conservation, l’examen doit
être réalisé endéans les 6 heures.
METHODE :
1. Placer l’extrémité rouge du tube capillaire hépariné dans une goutte de sang. Le sang pénètre par
capillarité. Remplir le tube capillaire au trois quart de sang.
2. Sceller à la flamme (ou boucher à la pâte à modeler) l’extrémité du tube qui n’est pas entrée en
contact avec le sang. Vérifier que le capillaire est hermétiquement bouché.
3. Déposer le tube capillaire dans une des rainures numérotées du rotor de la centrifugeuse.
L’extrémité scellée du capillaire doit être placée vers l’extérieur de la centrifugeuse. Reporter le
numéro de la rainure sur le bulletin de demande d’analyse du patient.
21 / 37
4. Equilibrer la centrifugeuse en mettant un tube capillaire en face de celui du patient. Fermer le
couvercle du rotor et centrifuger à grande vitesse (12.000 RPM ou 15.000 g) pendant 5 minutes.
5. Après centrifugation, le tube contient 3 couches :
En haut une colonne de plasma (P).
Au milieu une fine couche (buffy coat) de globules
blancs (GB) et les plaquettes.
En bas une colonne de globules rouges (GR).
C’est exactement au sommet de cette couche de globules rouges que se mesure l’hématocrite.
Mettre le tube sur l’échelle de lecture, en plaçant le bas de la colonne de globules rouges (et non le
bas du tube) sur le 0 et le haut de la colonne de plasma sur le 100. Déplacer la latte mobile pour que
le trait coïncide avec le haut de la colonne des globules rouges. Lire le pourcentage donné dans la
fenêtre de lecture. Après lecture, élimer immédiatement les capillaires dans un conteneur à aiguilles.
REPONSES TYPES :
Hématocrite : ___ %.
REMARQUES :
L'inspection du plasma surnageant renseigne sur l'existence éventuelle :
•
•
•
•
•
•
d'une lipémie (plasma opalescent ou laiteux).
d'un ictère (plasma jaune).
d'une hémolyse (plasma rosé pour de l'hémoglobine libre ou plasma brun pour la
méthémoglobine). LE TEST EST ALORS À RECOMMENCER
d'une drépanocytose majeure (colonne des globules rouges de couleur très foncée).
d'une forte hyperleucocytose (épaississement de la couche intermédiaire).
…
Une augmentation de la couche du buffy coat indique une augmentation significative du nombre de
globules blancs. Ceci est visible pour des valeurs supérieures à 20.000 leucocytes par mm³.
L’examen microscopique de la couche des globules blancs et de la partie du plasma immédiatement
adjacente permet de rechercher des trypanosomes (et des microfilaires). On parle alors de la
technique de Woo.
22 / 37
2
VALEURS DE REFERENCES :
Comme pour l'hémoglobine, les valeurs d'hématocrites varient en fonction de l'âge, du sexe et de
l'altitude.
Hématocrite en %
Age
(en valeurs absolues)
Nouveau-nés
Nourrissons (3 mois)
1 an
5 ans
Femmes adultes
Hommes adultes
50 à 58
35 à 40
31 à 36
33 à 37
36 à 45
42 à 49
(0.50 à 0.58)
(0.35 à 0.40)
(0.31 à 0.36)
(0.33 à 0.37)
(0.36 à 0.45)
(0.42 à 0.49)
INTERPRETATION DES RESULTATS :
L’hématocrite est une analyse simple et précise qui permet de détecter la plupart des anémies.
L’hématocrite est aussi utile dans le cadre de la dengue. L'hématocrite est influencé par le nombre de
globules rouges, la taille des globules rouges et le volume plasmatique. Lorsque le volume des
globules rouges est dans les limites de la normale, 1 % d'hématocrite correspond approximativement
à 110.000 globules rouges par mm³ de sang.
Comme le rapport entre la teneur moyenne en hémoglobine des globules rouges et le volume
globulaire moyen ne varie qu'entre des limites très étroites, l'hématocrite est le reflet assez fidèle de la
concentration en hémoglobine du sang complet. La valeur de l'hématocrite (en %) multiplié par 0.3 +
2 donne une idée très approximative de la concentration en hémoglobine. Ce calcul ne remplace
cependant pas le dosage de l’hémoglobine.
Exemple : Pour un hématocrite de 33 %, on estime la concentration en hémoglobine à (33 x
0.3) + 0.2 soit 10.1g/100 ml.
Dans le cas d’une anémie normocytaire ou normochrome, la formule se maintient, puisque
l’hématocrite et l’hémoglobine sont parallèlement diminués.
Exemple : Pour un hématocrite de 27 %, on estime la concentration en hémoglobine à :
(27 x 0.3) + 0.2 soit 8.4 g/100 ml.
Dans le cas d’une anémie macrocytaire ou hypochrome ou mégaloblastique, mais aussi dans
le cas d’une anémie microcytaire, cette estimation ne fonctionne pas.
L’hématocrite est abaissé chez les patients anémiques.
V o lu m e
p la s m a tiq u e
V o lu m e
g lo b u la ir e
N orm al
A n é m ie
v r a ie
F a u s s e a n é m ie
(h é m o d ilu tio n )
Fig.3 : Anémie vraie et fausse anémie par hémodilution
L’hématocrite est augmenté en cas de perte de plasma, de brûlure grave, de déshydratation, de
diarrhée des nourrissons, de choléra, de dengue et plus rarement de polycytémie.
2
Les valeurs de références varient en fonction de la population et de la méthode utilisée par le laboratoire. Chaque laboratoire
devrait valider ces valeurs de références avec le laboratoire de référence pour l'hématologie le plus proche.
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INDICES (OU INDEX) : (MCHC)
A partir des valeurs de l’hémoglobine et de l’hématocrite, il est possible de calculer la Concentration
Corpusculaire Moyenne en Hémoglobine : CCMH (ou MCHC en anglais pour Mean Corpuscular
Haemoglobin Concentration). La CCMH exprime donc la concentration en hémoglobine contenue
dans les globules rouges.
La CCMH est donnée par la formule Hg/Ht x 100
Exemple : Un patient a une hémoglobine de 16 g/100 ml et un hématocrite de 45 %.
Sa CCMH est de 16/45 x 100 = 36 g %.
Fig. 4 : Tableau de détermination du CCMH.
La CCMH s’exprime en g/100 ml (g%). Sa valeur de référence est comprise entre 30 à 36 g%.
La CCMH permet d’orienter vers la cause de l’anémie :
CCMH < 30 g%
Anémie hypochrome.
CCMH entre 30 et 36 g%
Anémie normochrome.
Il n’existe pas d’anémie hyperchrome puisque cela supposerait que les globules rouges contiendraient
plus d’hémoglobine qu’ils ne peuvent en contenir (avec un cas particulier pour l’anémie
mégaloblastique).
Anémies hypochromes < 30 Anémies normochromes > 36 “Anémies hyperchromes”
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SOURCES D'ERREURS :
Augmentation :
•
•
•
•
•
Position du patient durant le prélèvement (hématocrite en position couchée est plus au moins
égal à l’hématocrite en position debout + 10 %).
Conservation longue du prélèvement (6-8 heures) avant la détermination de l’hématocrite.
Délai trop long entre la centrifugation et la lecture (évaporation du plasma).
Stase veineuse prolongée (>1 minute) lors du prélèvement sanguin (hémoconcentration).
…
Diminution :
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Fuite inapparente du capillaire.
Centrifugation trop courte ou vitesse de centrifugation trop basse (tassement incomplet).
Dégradation des globules rouges par la chaleur (hémolyse).
Utilisation de la première goutte de sang d’un prélèvement capillaire (dilution du sang par du
liquide interstitiel).
Pression excessive sur le doigt pour obtenir du sang capillaire (dilution du sang par du liquide
interstitiel).
Dégradation de l’héparine par la chaleur (température de conservation des capillaires).
Sang incorrectement oxygéné.
Lyse des globules rouges durant la centrifugation (échauffement).
Coagulation du sang dans le tube de prélèvement.
Concentration trop élevée en EDTA (diminution du volume des globules rouges).
…
Indéterminée :
•
•
•
•
Erreur de lecture (parallaxe).
Non homogénéisation du tube de sang avant de remplir le capillaire.
Utilisation de tubes de mauvaise qualité, de diamètre non constant.
…
ASSURANCE QUALITE :
Réalisation en double sur un même échantillon : La différence de mesure doit être inférieure à 3 %.
Vérification du tassement optimal des globules rouges : Après réalisation et lecture de la valeur de
l’hématocrite, re-centrifuger le tube pendant 2, 3 et 5 minutes. Aucune diminution de la valeur de
l’hématocrite ne peut être observée. Dans le cas contraire, choisir le temps de centrifugation minimal
qui donne une valeur constante d’hématocrite.
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NUMERATION DES GLOBULES EN CELLULE DE NUMERATION
PRINCIPE GENERAL :
Le comptage des cellules par unité de volume est un aspect important d’aide au diagnostic qu’un
laboratoire peut fournir. Des compteurs électroniques de particules peuvent être utilisés dans les
grands laboratoires, mais pour des laboratoires tropicaux, une méthode manuelle utilisant un
microscope peut être la seule alternative réaliste.
La méthode manuelle consiste à compter sous microscope le nombre de globules présents dans un
volume défini (cellule de numération). En fonction du type de liquide à analyser (et donc du nombre
de cellules attendu) une dilution est éventuellement réalisée pour obtenir un nombre de globules
comptables. Cette dilution peut aussi avoir pour but de détruire des globules indésirables (globules
rouges si l’on désire compter des globules blancs par exemple). Un simple calcul, tenant compte du
nombre d’éléments comptés, du volume utilisé pour le comptage et de la dilution éventuelle permet
d’obtenir le nombre de globules par mm³ de liquide biologique.
MATERIEL GENERAL :
Matériel pour prélèvement
+ Pipette de Sahli avec un système d’aspiration de sécurité, pipette de 1 ml, ballon à pipetter, papier
absorbant, tube à hémolyse, liquide de dilution, crayon noir à mine grasse, cellule de numération,
lamelle plane pour cellule de numération, pipette pasteur en plastique, compteur à une touche, papier
pour lentilles, microscope (objectif 10 x et 40 x), solution de chlore, éthanol.
LES CELLULES DE NUMERATION :
Une cellule de numération est composée d’une lame porte-objet épaisse et d’une lamelle couvre objet
plane de 20mm x 26mm x 0,4 mm.
C
B
A
B
C
Cellule de numération de Neubauer, vue du dessus
C
B
A
B
C
Cellule de numération de Neubauer, vue latérale
B
A
B
Cellule de numération de Neubauer, vue latérale
La lame porte objet est divisée en 5 parties (C, B, A, B et C) séparées par des rainures. La partie
centrale A est de plus divisée en deux par une rainure transversale et chacune de ces deux surfaces
présente un quadrillage gravé. Ce quadrillage varie suivant le type de cellule de numération (cf. infra).
La partie centrale A est plus base que les parties B. Cette différence de hauteur, variable suivant le
type de cellule, est appelée profondeur de la cellule (souvent indiquée sur la partie C de la cellule).
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En appliquant une lamelle plane sur la lame porte objet, on obtient ainsi un volume déterminé par la
profondeur de la cellule et la surface délimitée par le quadrillage.
Sont donnés ici la reproduction du quadrillage et les caractéristiques des cellules de numération les
plus courantes :
Cellules de numération à petit volume :
Cellule de Thoma :
Surface : 1 mm x 1 mm soit 1 mm².
Profondeur : 0,1 mm.
Volume total : 0,1 mm³ ou µl.
Cellules de numération à volume moyen :
Cellule de Neubauer :
Cellule de Neubauer (double improved) :
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Cellule de Malassez :
Surface : 2 mm x 2,5 mm soit 5 mm².
Volume total : 1 mm³ ou µl.
Cellules de numération à grand volume :
Cellule de Fuchs-Rosenthal :
Profondeur : 0.2 mm.
Cellule de Nageotte :
Profondeur : 0,25 mm ;
0,50 mm ;
ou 1mm.
Volume total : 25 mm³ ou µl ;
50 mm³ ou µl ;
100 mm³ ou µl.
Les cellules de numération à petit volume sont utilisables pour la numération de globules dans des
liquides contenant beaucoup de cellules (globules rouges dans le sang par exemple), alors que les
cellules de numération à grand volume sont utilisables pour la numération de globules dans des
liquides contenant peu de cellules (globules blancs dans un liquide céphalo-rachidien par exemple).
Pour standardiser les techniques de numération, il est donc souhaitable d’utiliser une cellule de
numération à volume moyen, utilisable dans tous les cas de figure. La cellule de numération
correspondant le mieux à ce critère et la plus répandue est la cellule ce Neubauer double improved.
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NUMERATION DES GLOBULES BLANCS DANS LE SANG :
REACTIFS :
Liquide de Türck :
Mettre dans un flacon 96 ml d'eau distillée.
Ajouter 3 ml d'acide acétique glacial (CH3COOH)
Puis 1 ml de violet de gentiane à 1 % (ou 1 ml de bleu de méthylène aqueux).
ATTENTION : L'Acide Acétique Glacial est inflammable, nocif et extrêmement corrosif. Il est aussi
irritant pour les yeux. Manipuler ce produit avec précaution, loin d’une flamme, fenêtres ouvertes (ou
sous hotte chimique). Ne jamais verser d'Eau dans l'Acide Acétique Glacial. L'addition d'une faible
quantité d'eau dans un acide produit suffisamment de chaleur pour faire exploser la bouteille.
CONSERVATION : Quelques mois au FRIGO. Eliminer tous les 3 mois.
PRELEVEMENT :
EDTA dipotassique]. La numération doit être réalisée dans les 6 heures qui suivent le prélèvement.
METHODE :
1. S'assurer que la pipette de Sahli (20 µl) est intacte (éliminer toute pipette dont l'extrémité n'est
pas intacte), propre et sèche.
2. A l'aide d'une pipette graduée de 1 ml, verser 0,380 ml de liquide de Türk dans un tube en
plastique à usage unique. Utiliser un ballon à pipeter. Attention : Le liquide de Türk se conserve
au frigo.
3. Inscrire le numéro du patient sur le tube.
4. Aspirer du sang capillaire, à l’aide d’un dispositif de sécurité, jusqu'à la marque 0.02 de la
pipette de Sahli. Ne pas laisser pénétrer de bulles d'air.
5. Essuyer l'extérieur de la pipette avec du papier absorbant. S'assurer que le niveau du sang
coïncide avec le repère.
6. Souffler le sang dans le tube à hémolyse contenant le liquide de Türk. Rincer la pipette de
Sahli en aspirant et refoulant le liquide à trois reprises. La dilution du sang est de 1/20.
7. Homogénéiser et attendre 3 minutes avant de remplir la cellule (temps de lyse des globules
rouges).
8. Nettoyer immédiatement la pipette de Sahli.
9. Préparer la cellule de Neubauer (Neubauer double improved) : Humidifier les surfaces
surélevées "B". Appliquer la lamelle en exerçant une pression suffisante. Si la lamelle est bien en
place, on voit apparaître les couleurs de l'arc en ciel (anneau de Newton) aux niveaux des
surfaces surélevées "B".
C
B
A
B
C
Cellule de numération de Neubauer, vue du dessus
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10. A l'aide d'une pipette Pasteur en plastique, bien mélanger le sang dilué dans le liquide de
Türk, puis remplir complètement la moitié de la chambre A de la cellule, sans que le liquide ne
déborde dans les rainures. Attention : Si le liquide déborde de la zone située entre les 2
chambres, recommencer l'opération, après avoir nettoyé la lamelle et la cellule.
11. Laisser la cellule au repos sur une surface plane pendant au moins 3 minutes afin de
permettre aux leucocytes de sédimenter.
12. Placer la cellule de numération sur la platine du microscope, maintenue en position
horizontale (la numération ne doit jamais être faite sur une platine inclinée).
13. Avec l'objectif 10 x, repérer le quadrillage en évitant un éclairage trop intense (réduire le
diaphragme). Mettre au point sur les lignes et les cellules. La numération se fait à l'objectif
40 x. Tous les leucocytes doivent être dans le même plan, sinon attendre quelques minutes.
A l'objectif 40 x, les leucocytes apparaissent comme des cellules rondes, légèrement
brillantes, dans lesquelles on distingue un noyau faiblement bleuté. Ces critères permettent
de ne pas confondre les leucocytes avec des poussières, des plaquettes ou des amas
d'hématies lysées. Compter les leucocytes dans les 4 grands carrés de 1 mm². Sont
comptés :
•
•
Les leucocytes situés à l'intérieur du quadrillage.
Pour les leucocytes situés "à cheval" sur les lignes de bordure, ne
compter pour chaque carré, que les cellules "à cheval" sur les lignes
"droites" ou "supérieures", et qui ne touchent aucune autre ligne. Ceci
afin de ne pas compter 2 fois la même cellule. On continue de la même
façon pour le carré suivant.
14. Pour obtenir le nombre de globules blancs présents par mm³ de sang, il faut multiplier le
nombre de cellules comptées dans 4 grands carrés par 50 :
•
•
Facteur de dilution : 20 µl de sang + 380 µl de liquide de Türk soit une dilution de 20
x [(20+380)/20].
Facteur de volume : 4 grands carrés analysés, soit 4 x 0.1 mm³ soit un résultat à
multiplier par 2,5 pour obtenir un résultat par µl [10/4].
Soit un facteur de correction total de 50 [20 x 2,5)].
Exemple :
Grand carré n° 1
Grand carré n° 2
Grand carré n° 3
Grand carré n° 4
Total pour les 4 grand carrés :
25 leucocytes
26 leucocytes
24 leucocytes
26 leucocytes
101 leucocytes
Nombre de leucocytes par mm3 (ou µl) de sang = 101 x 50 = 5.050
VALEURS DE REFERENCES :
Résultats normaux par âge (valeur absolue par mm3 de sang)
AGE
1 jour
15 jours 2 mois
6 mois
2 ans
6 ans
9.000
6.000
5.500
6.000
6.000
5.000
Nombre
à
à
à
à
à
à
30.000
20.000
18.800
17.500
17.000
14.500
3
12 ans
5.000
à
13.500
Adulte
4.000
à
11.000
3
Cf. aussi Annexe 2. Les valeurs de références varient en fonction de la population et de la méthode utilisée par le laboratoire.
Chaque laboratoire devrait valider ces valeurs de références avec le laboratoire de référence pour l'hématologie le plus proche.
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ASSURANCE QUALITE
La précision d'une numération effectuée par un laborantin entraîné est d'environ 20 %. Un nombre
minimal de cellules doivent être comptées pour diminuer l’erreur liée à la distribution des cellules (au
moins 100). Adapter, si nécessaire, le nombre de carrés comptés (Attention, changer alors la formule de
calcul).
Une autre validation de la bonne distribution des cellules est de comparer le nombre de cellules
comptées dans chaque grand carré. Le nombre de cellules ne doit pas varier de plus de 10 % entre
chacun des 4 grands carrés.
SOURCES D'ERREURS :
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
SOP (Standard Operating Procedure) non adaptée aux conditions réelles de réalisation du
test.
Erreurs administratives dans l’enregistrement du patient.
Position lors du prélèvement (patient debout, assis, allongé,…). La position debout diminue le
volume plasmatique [hémoconcentration].
Patient anémique en régénération (présence d’érythroblastes). Correction possible si le
nombre d’érythroblaste est connu).
Usage prolongé (> à 1 minute) du garrot lors du prélèvement veineux [hémoconcentration].
Numération pour un patient déshydraté [hémoconcentration].
Non respect du temps entre le prélèvement et la réalisation du test [maximum 6 heures pour
éviter la dégradation des leucocytes].
Contamination du sang par le désinfectant utilisé sur la peau [hémolyse ou coagulation].
Prélèvement du sang au niveau d’un bras ou coule une perfusion [hémodilution].
Usage d’un anticoagulant inapproprié du type citrate (dilution par un anticoagulant liquide).
Coagulation de l’échantillon.
Mélange du sang et de l'anticoagulant insuffisant.
Délai trop important entre la prise de sang et la réalisation du test. L’échantillon doit être
analysé dans les 6 heures qui suivent la collecte.
Agitation trop violente du sang, produisant une hémolyse mécanique et des erreurs de
pipetage.
Non homogénéisation de l’échantillon de sang avant de réaliser la dilution.
Verrerie sale ou humide [hémolyse, dilution].
Liquide de Türck contenant des particules.
Lyse des globules rouges insuffisante, posant un problème d’identification des leucocytes.
Bulles d'air dans les pipettes ou dans la chambre de numération [erreur de volume].
Présence de sang sur l’extérieur de la pipette.
Rinçage insuffisant de la pipette.
Chambre de numération mal montée ou montée avec une lamelle non plane. Chambre de
numération sale.
Remplissage trop important de la cellule de numération.
Non respect des temps d’attente avant lecture [temps d’hémolyse ou temps de sédimentation
dans la cellule de numération].
Utilisation d’un éclairage trop intense lors de la lecture microscopique.
Erreur de calcul.
Erreur administrative dans le rendu des résultats.
…
NUMERATION DES GLOBULES ROUGES DANS LE SANG :
La précision de la numération manuelle des globules rouges dans le sang n’est pas suffisante pour
permettre de calculer les indices (MCV et MCH). Cette analyse, fastidieuse est donc d’un intérêt
limité. En absence d’un compteur électronique de cellules, la plupart des laboratoires de district ne
seront pas à même de calculer ces indices. L’examen d’un frottis sanguin, pour peu qu’il soit bien
réalisé et coloré, peut alors être utile par la détermination de macrocytose et de microcytose.
31 / 37
INDICES (OU INDEX) :
MCV
Mean Corpuscular Volume
MCV =
Hématocrite (%)
-15
-------------------------------------------------------------- x 10 l
Nombre de globules rouges par µl (en millions)
-15
Valeurs de référence : 82 à 92 fl (pour les adultes ; pour les enfants : variations selon l’âge) [fl= 10
l]
POUR LES ADULTES
Anémies microcytaires < 82 Anémies normocytaires > 92 Anémies macrocytaires
MCH
Mean Corpuscular Haemoglobin
MCH
=
Taux d’hémoglobine (g/l)
-------------------------------------------------------Nombre de globules rouges par µl (en millions)
Valeurs de références : 28 à 32 pg (pour les adultes ; pour les enfants : variations selon l’âge)
POUR LES ADULTES
> 32 “Anémies hyperchromes”
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ANNEXE 1 : Liste indicative de prix pour les techniques de détermination de l’anémie
HCS (échelle colorimétrique visuelle):
•
Kit de démarrage contenant : 1 boîte de protection avec 1 distributeur de bandelettes tests et 200 bandelettes tests, 1 livret
avec une palette de 6 couleurs de référence, 1 manuel d’instruction, 4 recharge de 200 bandelettes-tests chacun.
21,80 € (Février 2004, Copack).
•
Kit de Recharge contenant : 10 distributeurs contenant chacun 200 bandelettes tests (soit un total de 2000 tests).
32,75 € (Février 2004, Copack).
Hémoglobinomètre LOVIBOND® (méthode simplifiée selon Harrison) :
•
•
•
•
Comparateur Lovibond® 2000 :
Cellule capillaire spéciale Pour Lovibond® :
Disque de comparaison 5/8 A (valeurs d’hémoglobine basses) :
Disque de comparaison 5/8 B (valeurs d’hémoglobine hautes) :
456,22 € (Janvier 2004, Transfer)
SAHLI (méthode à l’hématine acide):
•
•
Sahli kit complet contenant : un comparateur, un tube de Sahli, une pipette de Sahli, un goupillon de nettoyage, un
agitateur en verre, un flacon compte-gouttes pour l’HCl et un autre pour l’eau distillée:
57,35 € (Févier 2004, VWR)
9,35 € (Févier 2004, VWR)
Acide chlorhydrique min. 37 % 1 litre (PRODUIT TRES CORROSIF ET IRRITANT) :
Hémoglobinomètre DHT (méthode à l’ammoniaque) [www.dht-online.co.uk] :
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Hémoglobinomètre DHT HB 523 :
Ammoniaque à 30 % 1 litre (PRODUIT CORROSIF ET IRRITANT) :
Pipette de Sahli 20µl :
Pipette graduée en verre de 2 ml:
OU
Distributeur automatique 2 ml Ceramus :
Ballon de sécurité pour pipette en verre :
Cuvettes optique en plastique 10 mm (100 cuvettes) :
Batteries 4 (Type N alcaline) :
+ Bouteilles + éprouvettes graduées + tubes à essais + support pour tubes
543,00 € (Févier 2004, DHT)
5,35 € (Févier 2004, VWR)
1,34 € (Février 2004, DHT)
1,93 € (Févier 2004, VWR)
217,00 € (Févier 2004, VWR).
2,92 € (Févier 2004, VWR)
4,58 € (Févier 2004, DHT)
6,35 € (Févier 2004, DHT)
HEMOCUE® (méthode simplifié utilisant des consommables à usage unique) :
•
•
•
Photomètre Hemocue® avec cuvette de contrôle :
Cuvettes à usage unique (50 cuvettes) :
Batteries 4 (Type N alcaline) :
555,00 € (Févier 2004, Hemocue)
60,00 € (Févier 2004, Hemocue)
6,35 € (Févier 2004, DHT)
Méthode colorimétrique au DRABKIN (technique de référence) :
•
•
Colorimètre WPA C0700D, gamme de λ : 400-700 nm :
Kit Hémoglobine Sigma 525-A 1000 déterminations :
734,00 € (Février 2004, DHT)
80,74 € (Décembre 2003, Sigma)
(TRANSPORT ET CONSERVATION ENTRE 2-8°C)
•
•
•
•
•
•
Pipette de Sahli 20µl :
Pipette graduée en verre de 5 ml:
OU
Distributeur automatique 5 ml Ceramus :
Ballon de sécurité pour pipette en verre :
Cuvettes optique en plastique 10 mm (100 cuvettes) :
+ Bouteilles + éprouvettes graduées + tubes à essais + support pour tubes
1,34 € (Février 2004, DHT)
1,93 € (Févier 2004, VWR)
217,00 € (Févier 2004, VWR)
2,92 € (Févier 2004, VWR)
4,58 € (Févier 2004, DHT)
Détermination de l’HÉMATOCRITE :
•
•
•
•
Centrifugeuse (modèle DHT 590):
Centrifugeuse (modèle Transfer) :
Tubes capillaires héparinisé 75 mm (200 tubes):
Pâte de scellement pour capillaires (6 pièces):
832,25 € (Février. 2004, DHT)
1.500,00 € (Février. 2004, Transfer)
4,80 € (Février 2004, DHT)
4,00 € (Février 2004, DHT)
+ MATERIEL GENERAL :
•
•
•
•
•
•
Vaccinostyles
Décontaminant (hypochlorite de sodium ou autre désinfectant libérant du chlore)
Cotton
Gants à usage unique
Alcool à 70 %
…
33 / 37
ANNEXE 2 : QUELQUES VALEURS DE REFERENCE EN HEMATOLOGIE4
Hémoglobine
Globules
Rouges
Hématocrite
MCHC
MCV
Globules
blancs
g/100 ml
par µl
x 10 6
%
g/100 ml
fl
par µl
x 10 ³
3 mois – 12 mois Homme
10,0 – 14,0
3,0 – 5,6
26 – 41
28,4 – 40,0
70 - 105
5,5 – 17,5
3 mois – 12 mois Femme
10,0 – 14,0
3,0 – 5,6
26 – 41
28,4 – 40,0
70 – 105
5,5 – 17,5
1 an – 12 ans
Homme
10,5 – 15,0
3,8 – 5,5
32 – 42
32,0 – 37,0
72 - 94
5,0 – 14,0
1 ans – 12 ans
Femme
10,5 – 15,0
3,8 – 5,5
32 – 42
32,0 – 37,0
72 – 94
5,0 – 14,0
32,0 – 36,0
81 - 100
4,0 – 11,0
31,5 – 36,0
81 – 100
4,0 – 11,0
Sexe
Age
Unités
Homme
13,2 – 17,3
4,3 – 5,7
39 – 49
(Europe)
Femme
11,7 – 15,5
3,8 – 5,1
35 – 45
12 ans – 100 ans
(Europe)
N.B. : Homme et femme (Asiatique) : 4.000 – 10.000 leucocytes /µl
Homme et femme (Africain) : 2.600 – 8.300 leucocytes /µl
12 ans – 100 ans
Formule leucocytaire :
Types cellulaires
Valeurs relatives (valeurs absolues)
Européen + Asiatique
Africain
Basophiles
0 – 1 % (0 - 200)
0 – 1 % (0 - 200)
Eosinophiles
0 – 4 % (0 - 400)
0 – 5 % (0 - 500)
Neutrophiles non segmentés
0 – 5 % (0 - 700)
0 – 5 % (0 - 700)
50 – 75 % (1.800 - 7.000)
30 – 40 % (900 - 4.000)
30 – 40 % (1.000 - 4.000)
40 – 60 % (1.200 - 6.000)
0 – 8 % (0 - 800)
0 – 8 % (0 - 800)
Polymorphonucléaires
Neutrophiles segmentés
Monomorphonucléaires
Lymphocytes
Monocytes
Réticulocytes :
Valeurs relatives :
Adulte et enfant :
Nouveau-né :
2 - 15 / 1.000 globules rouges
20 - 60 / 1.000 globules rouges
Valeurs absolues :
Adulte et enfant :
Nouveau-né :
25.000 - 160.000 / µl
jusqu'à 150.000 /µl
Plaquettes sanguines :
150.000 - 400.000 / µl
4
Les valeurs de références varient en fonction de la population et de la méthode utilisée par le laboratoire. Chaque laboratoire
devrait valider ces valeurs de références avec le laboratoire de référence pour l'hématologie le plus proche.
34 / 37
ANNEXE 3 : MORPHOLOGIE DES ELEMENTS SANGUINS SUR FROTTIS COLORE AU MAY-GRÜNWALD-GIEMSA
TYPE CELLULAIRE
GRANULOCYTES
TAILLE
NOYAU
µm
FORME
COULEUR
LEUCOCYTES : GRANULOCYTES POLYMORPHONUCLEAIRES
En boudin ou
en forme de fer
à cheval,
Incurvation
NEUTROPHILES NON
centrale égale
Bleu pourpre
12 – 15
clair
au maximum
SEGMENTES
au tiers de la
largeur des
extrémités des
5
lobes
NEUTROPHILES
SEGMENTES
EOSINOPHILES
BASOPHILES
6
12 – 15
2 à 5 lobes
12 – 15
Le plus
souvent à 2
lobes (pincenez)
(parfois 3
lobes)
11 – 13
Lobes mal
séparés
(polymorphe)
peu visible
Bleu pourpre
foncé
Bleu pourpre
Bleu pourpre
CYTOPLASME
STRUCTURE
DE LA
CHROMATINE
QUANTITE
COULEUR
Réseau peu
épais
+++
Rose pâle
Réseau assez
épais et grossier
+++
Rose
Epaisse,
grossière
+++
Epaisse,
grossière,
recouverte par
les granules
+++
Rose
Rose pâle
GRANULATIONS
Très fines
granulations,
Rose ou violacée.
(parfois absentes)
Très fines
granulations,
Rose ou rose violet
Grosses
granulations de
calibre uniforme,
Jaune orange,
Grains accolés.
Grosses
granulations de
calibre variable,
Bleu très foncé,
Grains bien
séparés,
Peu nombreuses.
5
Déviation à gauche de la formule d’Arneth : Les neutrophiles segmentés constituent la majorité des neutrophiles dans la formule leucocytaire normale. Une augmentation des non segmentés au-dessus de 16 % signifie une
déviation à gauche (vers les formes plus jeunes). Cela se retrouve dans les processus inflammatoires, mais aussi dans des conditions de stress,…
6
Déviation à droite de la formule d’Arneth : Contrairement à la déviation à gauche où les noyaux segmentés sont rares voire absents, la déviation à droite présente des neutrophiles hyper-segmentés, c’est-à-dire à cinq
segments ou davantage. Une hyper-segmentation est caractéristique des anémies mégaloblastiques. A leur début, celles-ci révèlent sur 100 granulocytes plus d’un neutrophile à 6 segments, plus de 3 à 5 segments ou plus de
25 à 4 segments.
35 / 37
TYPE CELLULAIRE
AGRANULOCYTES
TAILLE
NOYAU
µm
FORME
COULEUR
CYTOPLASME
STRUCTURE
DE LA
CHROMATINE
QUANTITE
COULEUR
GRANULATIONS
LEUCOCYTES : AGRANULOCYTES MONOMORPHONUCLEAIRES
7 -10
Rond ou
ovoïde
Parfois
échancré
Rouge
pourpre
foncé
10 – 15
Rond ou
ovoïde
Parfois
échancré
Rouge
pourpre clair
MONOCYTES
15 – 25
Rond, ovoïde
ou en forme de
haricot
ERYTHROCYTES
6,7 – 7,7
PETIT LYMPHOCYTES
GRAND LYMPHOCYTES
TROMBOCYTES
1,5 – 2 (5)
Bleu violet
clair
Grandes masse
d’intensité de
coloration
hétérogène ou
pycnotique
Grandes masse
formant des
zones foncées
et d’autres plus
claires
Fine, réseau
ressemblant à
une l’intérieur
d’un éponge
(-) ou +
++
+++
Contient
généralement
des vacuoles.
Bleu ciel
(parfois
apparemment
absent
Bleu ciel
Absentes ou
quelques granules
azurophiles (rose
violet)
Gris ou gris
bleu
Très fines
granulation
(poussière),
azurophiles (rose
violet)
Disque
biconcave, rose
Aucunes
Légèrement
bleu
Rougeâtres
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HEMATOLOGIE TROPICALE PRATIQUE Notions de base

Transcription

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