DIUOP 25 03 2016

Apport de la biologie à la compréhension
et la prise en charge des LAM
Hélène LAPILLONNE
Université Pierre et Marie Curie
Service d’hématologie biologique, hôpital Trousseau
INSERM, UMR_S938 Equipe Douay
Paris- France
PLAN
 INTRODUCTION
 PHYSIOPATHOLOGIE
 BIOLOGIE: STRATIFICATION au DIAGNOSTIC
 BIOLOGIE: STRATIFICATION et MALADIE
RESIDUELLE
 PERSPECTIVES
INTRODUCTION
INTRODUCTION
 Leucémies aigues myéloblastiques de l’enfant
 Ensemble de maladies hétérogènes
 Cas particuliers: LAM < 1 an, LAM7 et T21, prédispositions
 Epidémiologie:
 Rare: 0 à 14 ans: ~ 75 cas/an, 15 à 19 ans: ~ 25 cas/an
 Polychimiothérapie +/- allogreffe de MO
 Rémission complète RC1: 90%
 Survie globale: ~ 60-70%
 Place et enjeux de la biologie
 Aider au diagnostic  pronostic
 Aider à la stratification  greffe ou pas ?
 Aider au suivi: bon répondeur / mauvais répondeur  greffe ou
pas ?
 Physiopathologie et Innovation thérapeutique
19ème siècle
VELPEAU BENETT
1827
1856
20ème siècle
21ème siècle
EBSTEIN NAEGELI
1887 1900
1950 1976
1960: Chromosome Philadelphie
1970: t(9;22)
1983: transcrit BCR-ABL
TRANSCRIPTOME
GENOME
PROTEOME
 Information croissante
METHYLOME
EPIGENETIQUE…
Outils d’analyse des leucémies
 Morphologie cellulaire – FAB
 Immunophénotypage – CMF
 Cytogénétique – Caryotype, FISH, CGH array
 Anomalie de nombre: monosomie 7, trisomie 8
 Anomalie de structure
• Equilibrée: t(8;21)(q22;q22)
• Déséquilibrée: ins, del, …
 Anomalie cryptique non vue au caryotype
• FISH : MLL, AML1
• CGH: Gain, perte, perte d’hétérozygotie
 Biologie moléculaire
 Statut mutationnel du clone tumoral
 Recherche de transcrits de fusion
 …..
 Thèque: Cellules, ADN, ARN
Outils d’analyse des leucémies
Morphologie - FAB
Répartition FAB des LAM de l’enfant ELAM02
• Cytopathologie (n=438)
6.3%
15.4%
22.4%
19.5%
23.8%
2.7%
6.1%
2.3%
1.1%
0.2%
Outils d’analyse des leucémies
ADN
ARN
SS lin
CD33 PE
CD13 PE
Protéine
FS lin
CD7 FITC
HLA-DR FITC
Corrélations
Cytologie / Cytogénétique / Biologie moléculaire
FAB
Anomalie
cytogénétique
Transcrit de fusion
M2
t(8;21)
AML1-ETO
M3
t(15;17)
PML-RAR
M4 éosino
inv 16
CBF-MYH11
M5
t(9;11)
MLL-AF9
t(10;11)
MLL-AF10
anomalies 11q23
(MLL)
M7
t(1;22)
OTT-MAL
LAM2 – t(8;21)(q22;q22)
LAM4 éosinophile – inv(16)(p13q22)
LAM5 – remaniement du gène MLL
Enfant 5 ans, LAM5A, t(10;11)
10
Chromosome 11
NL
11
MLL réarrangé
Cytogénétique et groupes pronostiques
 364 enfants < 15 ans
 Classification: 3 groupes « Cytogénétique »
•
•
•
« Favorable »: t(8;21) ; t(15;17) ; inv (16)
« Intermédiaire »: normale ou autres anomalies
« Défavorable »: -5 ; -7 ; del (5q), anomalies 3q et complexes
 Evolution
Groupe
(1)
(2)
(3)
N
88
219
33
RR (3 ans)
32 % (± 5)
40 % (± 3)
61 % (± 9)
SG (3 ans)
78 % (± 4)
55 % (± 3)
42 % (± 8)
Grimwade et al, Blood, 1998
Cytogénétique et impact pronostique
Grimwade et al, Blood, 1998
PHYSIOPATHOLOGIE
PHYSIOPATHOLOGIE
Rosenbauer et al, Nature Rev Immunol, 2007
Leucémogenèse: « programme génétique »
?
?
?
Rosenbauer et al, Nature Rev Immunol, 2007
Oncogenèse multi-étapes
Oncogenèse multi-étapes
Peterson, Blood, 2007
Coopération oncogénique nécessaire
Classe I:
Signalisation
FLT3, JAK, RAS,
KIT, PTPN11, …
Classe II: Facteurs de transcription
RUNX1-RUNX1T1,
CBFB-MYH11,
PML-RARA,
CEBPA, NPM1,…
LAM
Classe VI: Cohésine
SMC1A, SMC3,
RAD21, STAG1/2,
PDS5A/B, NIPBL …
Classe I:
Classe V: Suppresseurs de tumeurs
Signalisation
TP53, CDKN2A/B,
WT1, …
FLT3, JAK, RAS,
KIT, PTPN11, …
Classe II: Facteurs de transcription
LAM
RUNX1-RUNX1T1,
CBFB-MYH11,
PML-RARA,
CEBPA, NPM1, …
Classe IV: Maturation de l’ARN
SF3B1, SRSF2,
U2AF1, ZRSR2,
SF1,…
Classe III: Epigénétique
ASXL1, EZH2,
SUZ12, EED,
DNMT3A,
IDH1/2, TET2,…
Autres facteurs génétiques: Prédisposition
aux LAM
 Trisomie 21
• Risque x 10 à 20, x 400 pour LAM7, âge < 4 ans
• GATA1
 Anémie de Fanconi
 ELA2 et maladie de Kostman
 SBDS et syndrome de Shwachman-Diamond
 NF1 et maladie de Recklinghausen
 PTPN11 et syndrome de Noonan
 AML1 et thrombopénie constitutionnelle
BIOLOGIE ET STRATIFICATION
Au DIAGNOSTIC
OBJECTIFS
 Détecter les sujets à risque
– Marqueur génétique défavorable au diagnostic
– Mauvais répondeur au traitement: MRD
 Outils utilisés :
– Caryotype
– Biologie moléculaire:
• Etude des transcrits récurrents
• Etude des mutations: FLT3, NPM1, NRAS, WT1, …
• Etude d’expression de transcrit de fusion / transcrit simple
(WT1)
• …
– CMF
Cytogénétique : facteur pronostic majeur
Grimwade et al, Blood, 1998
 Population: 729 patients
 Cytogénétique: facteur pronostic majeur
– Facteurs de bon pronostic:
• LAM « CBP »: inv(16), t(8;21)
– Facteurs de mauvais pronostic:
• -7, 12q, abn(5q)



Favorable: t(8;21) and inv(16) , soit 20%
Défavorable: abn(12), t(6;9), abn(5q), -7, t(9;22), soit 11%
Intermediaire: patients not included in the other two groups, soit 69%
Protocole ELAM02
Stratification au Diagnostic - 2005
• Good risk
– t(8;21)(q22;q22), inv(16)(p13;q22) or t(16;16)
• Standard risk
• High risk
– Monosomy 7, abn5q, t(6;9)(p23;q34), t(6;11)(q27;q23), inv(3)(q21q26 or
t(3;3)(q21;q26)
– Complex karyotype (>3 abn)
– No CR after 2 courses
– Secondary AML
Répartition des caryotypes
dans les LAM de l’enfant
Missing=6
1,4%
MRC3=54
12,2%
MRC1=97
22%
MRC2=78
17,7%
Normal=109
24,7%
Pui et al, JCO, 2011
Protocole ELAM02
MLL=97
22%
Répartition des caryotypes
dans les LAM de l’enfant
Gène MLL en 11q23
Pui et al, JCO, 2011
36,5%
62% enfant
35% < 1an
< 1 an, ALL > AML 20%
AML=ALL 50%
Meyer et al, Leukemia, 2013
Gène MLL en 11q23
dans les LAM de l’enfant
Meyer et al, Leukemia, 2013
Gène MLL en 11q23
dans les LAM de l’enfant
EFS
OS
Balgobind et al. Blood 2009;114:2489-2496
BIOLOGIE MOLECULAIRE
Statut mutationnel
FLT3-ITD, FLT3-D835
C-KIT
N-RAS, K-RAS
CEBPA
NPM1
PTPN11
WT1 ….
Répartition des génotypes
dans les LAM de l’enfant
n=237
Creutzig U et al. Blood 2012;120:3187-3205
Répartition des génotypes
dans les LAM de l’enfant
LAM à caryotype normal
n=40
Creutzig U et al. Blood 2012;120:3187-3205
Fréquence des mutations ELAM02
Positive
Négative
FLT3-ITD
42
301
FLT3-D835
18
252
NPM
33
253
CEBPA
10
122
Tested samples
343
270
286
132
Total
441
441
441
441
Frequency / tested samples (%)
12,2
6,7
11,5
7,9
LAM-CBF
Répartition des mutations au diagnostic
AML1-ETO
Frequency / tested
CBFb-MYH11
samples (%)
n=61
Frequency / tested
samples (%)
n=36
C-KIT
18
50
10
40
RAS
5
14,7
9
36
FLT3-ITD
4
8
0
0
FLT3-D835
1
2,5
2
8
ASXL1
2
5,7
ND
ND
ASXL2
9
25,7
ND
ND
Impact pronostique des mutations au diagnostic
Mutation
Fréquence
Cytogénétique
FAB
GB
Association
FLT3-ITD
10-15%
Normal / MRC2
NS
FLT3-D835
5-10%
Normal / MRC2 / inv(16)
NS
NS
NPM1
Indéfini
NPM1
5-8%
Normal
NS
NS
FLT3
Favorable
WT1
8-10%
MRC2
NS
Hyper
FLT3-ITD
Défavorable
Hyper NPM1 / WT1
Pronostic
Défavorable
A discuter
Ratio ITD / wt > 0,4
Distinction ITD / D835
Impact péjoratif de FLT3-ITD
Meshinchi, Blood 2001, 2003, 2006, 2008; Zwaan, Blood 2003; Brown, Blood 2007; Hollink, Leukemia 2009; Hollink,
Blood 2009; Lapillonne, Leukemia 2009
Statut mutationnel – FLT3-ITD et NPM1
 Statut mutationnel:
– FLT3, NPM1, CEBPA,WT1
– n= 185 LAM enfants
 Expression:
– ERG, MN1, BAALC, FLT3,WT1
– n= 149 LAM enfants
 Impact pronostique défavorable
de
FLT3-ITD
hyperexpression BAALC
Staffas et al, Blood, 2011
Impact pronostique des mutations WT1
WT1
Miyagawa, 1999
Willasch, Leukemia 2009
Lapillonne, Leukemia 2009
Hollink, Blood 2009
Fréquence
13% (6/46)
11,5% (7/69)
8% (6/76)
12% (35/298)
OS
Age
GB
CytoG
Mutation
RC
EFS 5y
OS 5y
10,7
9,2
44 G/l
57 G/l
MRC2
MRC2
ITD (66%)
ITD (43%)
CEBPA (19%)
ns
ns
17±15
22±8
ns
35±8
EFS
Impact pronostique des mutations au diagnostic
Mutation
Fréquence
Cytogénétique
FAB
GB
Association
Pronostic
CEBPA
5-6%
Normal / MRC2
M1, M2, M4
NS
NS
Favorable
N-RAS
12-15%
CBF
NS
NS
NS
Controversé
K-RAS
2-3%
NS
NS
NS
NS
Indéfini
C-KIT
4-6%
CBF
M2, M4Eo
NS
NS
Défavorable t(8;21)
AML1
6%
21
M0
NS
NS
NS
A discuter
A investiguer ?
A investiguer ?
Lapillonne, Leukemia 2009; Ho, Blood 2009; Goemans, Leukemia 2005; Shimada, Blood 2006; Beghini, Haematologica
2004; Corbacioglu, Blood 2006;.
Impact pronostique des mutations CEBPA
CEBPA
Liang, Leukemia 2004
Lapillonne, Leukemia 2009
Ho, Blood 2009
Fréquence
6% (7/117)
9% (7/76)
4,5% (38/847)
Age
13,5
FAB
M1, M2, M4
M1, M2, M4
M1, M2
CytoG
Normal
Mutation
ITD (2/7)
N-RAS (2/7)
Normal/MRC2
ns
Normal/MRC2
ns
RC
ns
ns
EFS 5y
0S 5y
Pas de rechute
70±16 (p=0,015) 83±13 (p=0,023)
Répartition des anomalies épigénétiques
dans les LAM à CN de l’enfant
Valerio DG et al, Haematologica, 2014
En cours ELAM02
 NGS – Panel 38 gènes sur 396 patients
 CGH array – sur 396 patients
 Exome pour certains patients
 Phylogénie clonale et MLL
 ….
 RT-MLPA – en cours
 Micro-RNA: pas de « motif type »
BIOLOGIE, STRATIFICATION
et MRD
MRD sensibilité
 Morphologie
1%
Systématique
 Cytogénétique
1 à 0,1%
Parfois en FISH, MLL
 Cytométrie de flux
0,1 à 0,01%
Identifier un profil d’expression antigénique anormal LAIP au DG
 Biologie moléculaire
0,01 à 0,001%
Par PCR quantitative si anomalie présente au DG
 Réponse souhaitée en fin de conso 1 : 10-3
MRD et transcrits
dans les LAM de l’enfant
944
10000
2028
Transcrit de fusion et MRD: AML1 - ETO
56
232
280
100%
100
10-1
21
10-2
1
10
0.01
01/12/2002
0.39
10-3
01/02/2003 01/04/2003
10-4
0.04
0.1
0.03
1
0.28
0.14
Nombre de copies de AML1 / ETO
1000
01/06/2003
01/08/2003
01/10/2003
01/12/2003
01/02/2004
Transcrit de fusion et MRD: AML1-ETO
Risque de rechute
Survie globale
Yin J A L et al. Blood 2012;120:2826-2835
LAM-CBF ELAM02
Survie sans événement à 5 ans
Inv(16): 5yr EFS 80% +/- 7%
t(8;21): 5yr EFS 53% +/- 7%
ELAM02: 5yr EFS 53% +/- 2%
LAM – CBF
Analyse des transcrits et maladie résiduelle
AML1-ETO
Median fusion
transcript, ratio %
Range
CBFb-MYH11
Median fusion
transcript, ratio %
Range
Diagnostic
MRD1
MRD2
MRD3
MRD4
55
47
46
38
47
258,73
0,37
0,074
0,014
0,0125
20-1685
0,005-32
<0,001-48
<0,001-0,82
<0,001-163
34
30
30
27
28
94,388
0,139
0,341
0,408
0,156
31,5-447
<0,001-18
<0,001-5,96
<0,001-1,12
<0,001-1,11
MRD AML1-ETO Log réduction / Diagnostic
1000
AML1-ETO Log Réduction / Diagnostic
100
10
1
3 log réduction
0,1
0,01
0,001
Rechute
MRD2+
MRD2-
MRD3+
MRD3-
MRD4+
MRD4-
19
27
8
30
7
40
9
11
4
11
4
16
Survie selon MRD2 - AML1-ETO
Survie selon MRD2 - AML1-ETO
MRD CBFb-MYH11 Log réduction / Diagnostic
100
CBFb-MYH11 Log réduction / Diagnostic
10
1
3 log réduction
0,1
0,01
0,001
Rechute
MRD2+
MRD2-
MRD3+
MRD3-
MRD4+
MRD4-
20
10
18
9
6
22
4
0
4
1
1
2
LAM-CBF
Survie globale à 5 ans
Inv(16): 5yr OS 100%
t(8;21): 5yr OS 87% +/- 4%
ELAM02: 5yr OS 71% +/- 2%
Autres marqueurs pronostiques:
MRD et transcrit WT1
Figure 2. WT1 expression at diagnosis and during the follow-up in AML
WT1 copy number (WT1/TBP x1000)
100000
10000
1000
100
WT1 > 50
Positive baseline
10
1
Normal BM
Diagnosis
M1
M3-5
M6-8
Relapse
92 patients, 78% hyperexpression
Lapillonne et al, JCO, 2006
Expression WT1
Rate of overall survival
Figure 4. Overall survival according to WT1 value at D35-50
1
1.0
,8
0.8
WT1 <50
,6
0.6
P<0.001
,4
0.4
,2
0.2
WT1 >50
0
0.0
0
20
20
40
40
60
60
80
80
100
100
Time (months)
N=46
Lapillonne et al, JCO, 2006
MRD sensibilité
+1LOG BM:SANG
Schnittger Blood 2003
Hokland Blood 2010
MRD et Cytométrie de flux
dans les LAM
ss
MRD cytométrie de flux
Blastes au diagnostic
CD13
ss
CD7
CD45
CD7
CD117
[singulets AND Cell AND Leuco]
LegendColor Name
% Gated
0x00000000 GateY
38.60
0x000080FF CD34
0.68
0x00FF0000 DsBla
67.16
0x00FF00FF DsLY
22.37
0x0000FF00 DsMono
6.18
0x000000FF DsGRA
2.26
0x00F0CAA6 Leuco
100.00
0x00A4A0A0 Cell
100.00
Number
12725
224
22141
7376
2036
746
32968
32968
CD64
CD33
CD19
DR
CD33
CD33
CD45
CD34
CD34
% of cells with the
LAIP at diagnosis :
38.6%
CD13
ss
CD7
CD45
CD7
CD117
[singulets AND Cell AND Leuco]
LegendColor Name
% Gated
0x00000000 GateY
0.09
0x000080FF CD34
2.83
0x00FF0000 Bla
12.36
0x00FF00FF LY
9.31
0x0000FF00 Mono
5.73
0x000000FF GRA
69.78
x00F0CAA6
Leuco
100.00
0x00A4A0A0 Cell
100.00
CD64
CD33
CD19
DR
CD33
CD33
MRD cytométrie de flux
Profil LAIP dans une moelle normale
CD34
Number
491
15436
67386
50751
31248
3804050
545146
545146
CD34
% of cells with the
same profile in normal
bone marrow : 0.09%
ss
MRD cytométrie de flux
Blastes résiduels en fin d’induction
CD13
ss
CD7
CD45
CD7
CD117
[singulets AND Cell AND Leuco]
LegendColor Name
% Gated
0x00000000 GateY
0.39
0x000080FF CD34
0.62
0x00FF0000 DsBla
4.00
0x00FF00FF DsLY
17.72
0x0000FF00 DsMono
20.92
0x000000FF DsGRA
54.39
0x00F0CAA6 Leuco
100.00
0x00A4A0A0 Cell
100.00
Number
1466
2343
15090
66797
78838
205000
376897
376897
CD64
CD33
CD19
DR
CD33
CD33
CD45
CD34
CD34
% de cells with LAIP
profile in MRD1: 0.39%
MRD positive
ss
MRD cytométrie de flux
Blastes résiduels en fin de conso1
ss
CD13
CD45
CD7
CD7
CD117
[singulets AND Cell AND Leuco]
LegendColor Name
% Gated
r0x00000000 GateY
0.60
0x000080FF CD34
0.08
0x00FF0000 DsBla
10.12
0x00FF00FF DsLY
6.96
0x0000FF00 DsMono
5.36
0x000000FF DsGRA
67.94
0x00F0CAA6 Leuco
100.00
0x00A4A0A0 Cell
100.00
Numbe
1304
180
22113
15210
11721
148462
218535
218535
CD64
CD33
CD19
DR
CD33
CD33
CD45
CD34
CD34
% de cells with LAIP
profile at MRD2 : 0.60%
MRD positive
MRD - LAM – Protocole
Inaba et al, JCO, 2012
EFS after course 1
EFS after course 2
En Résumé
Outils biologiques
DIAGNOSTIC et SUIVI:
 Classification FAB
 Immunophénotypage
 Cytogénétique standard
+ FISH, CGH
 Transcrits récurrents
RQ-PCR, RT-MLPA
 Mutations gènes:
FLT3 ITD, NPM1, CEBPA
WT1, FLT3 TKD…..
NGS ……
FAB
Caryotype
Transcrit
de fusion
M2
t(8;21)
AML1ETO
M3
t(15;17)
PMLRAR
M4Eo
inv 16
CBFMYH11
M5
t(9;11)
MLL-AF9
t(10;11)
MLL-AF10
anomalies 11q23
(MLL)
M7
t(1;22)
OTT-MAL
FACTEURS PRONOSTIQUES
 Pronostic favorable – Risque standard :
- Leucémies « CBP »: Inv(16), t(16;16), t(8;21)
- Mutation NPM1 sans FLT3-ITD
- Mutation CEBPA sans FLT3-ITD
 Pronostic défavorable – Risque élevé:
- Monosomie 7, anomalie 5q
- FLT3-ITD
- Caryotype complexe
- t(6;9); t(6;11); t(10;11)
ELAM02: 3 groupes de risque
Risque Standard
Risque Elevé
PERSPECTIVES
Futur protocole
Stratification au diagnostic
•
Good risk
– CBF leukemias: t(8;21)(q22;q22), inv(16)(p13;q22)
– Normal Karyotype with NPM1mutation w/o FLT3-ITD
– Normal Karyotype with double CEBPA mutant w/o FLT3-ITD
•
Standard risk
•
High risk
–
–
–
–
–
–
–
–
–
Monosomy 7, Monosomy 5 and del(5q),
t(6;9)(p23;q34)/DEK-NUP214
t(9;22)(q34;q11)/BCR-ABL
t(6;11)(q27;q23), t(4;11)(q21;q23), t(10;11)(p11.2;q23)
inv(3)(q21q26)/ t(3;3)(q21;q26)
t(5;11)(q35;p15)/NUP98-NSD1, t(11;15)(p15;q35)/NUP98-JARID1A
Inv(16)(p13q24)/CBFA2T3-GLIS2
12p abnormalities
FLT3-ITD w/o NPM1 or CBF
PERSPECTIVES
 MRD dans les LAM
– CFM / Biologie moléculaire, réponse attendue < 10-3
 Optimiser l’identification des patients à risque de
rechute
 améliorer les indications d’allogreffe de MO
 Thérapeutiques innovantes:
– Anticorps monoclonaux: CD33 et Myélotarg
– Inhibiteurs de TK: FLT3 et midostaurin (essai ouvert chez l’enfant)
– Modificateurs épigénétiques:
• Décitabine, …
Course 3
Course 2
GR & MRD –
after course 2
R1
R2
DNX + Ara-C
+
GO 3mg/m2 D4
*Risk Assessment 1 based on cytogenetic /
molecular data and morphological
response
**Risk Assessment 2 based on Minimal
Residual Disease (MRD)
MRD + > 10-3
MRD - ≤ 10-3
High Risk Patients
DNX + Ara-C
+
GO 3mg/m2 D4,7±10
Risk Assessment 1*
Mito + Ara-C
+
GO 3mg/m2 D4,7±10
Mito
+
Ara-C
DNX
+
Ara-C
Risk Assessment 2**
Mito + Ara-C
+
GO 3mg/m2 D4
Good / Standard Risk Patients
MyeChild 01 Trial
Course 1
R3
SR & MRD –
after course 1
Course 4
HD
Ara-C
HD
Ara-C
FLA
FLA
HD
Ara-C
MRD –
GR & MRD +
after course 1
and 2
FLA-Ida
SR & MRD +
after course 1
& MRD - after
course 2
FLA-Ida
SR & MRD +
after course 1
and 2
FLA-Ida
MRD +
HD
Ara-C
R4
FLA-Ida
FLA
MAC:
Bu/Cy
HSCT
RIC:
Bu/Flu