Vitrification des embryons et ovocytes

Vitrification des ovocytes et
embryons .
Méthodologies et indications
Vanderzwalmen P
Chirec – Braine l’alleud - Cavell IVF unit Brussel Belgium
Institut for Reproductive Medicine and Endocrinology, Bregenz, Austria
GIGA-Research, Transgenic Platform, University of Liège, Liège, Belgium
La cryopréservation une discipline qui prend de plus en plus
d´importance dans un programme de PMA et qui permet de faire face
à des situations inattendues
Eau:
Composant majeur de nos cellules
Membrane
cytoskeleton
« Crystallization is incompatible
with living systems and
should be avoided whenever possible » Luyet (1937)
Stratégie pour éliminer les cristaux?
obtention d’un état
Intracellulaire et extracellulaire
VITREUX – AMORPHE
Which strategy to eliminate ice crystal formation?
T°
20°C
Liquid H20
0°C
Thermal
hysteresis
Heterogenous
~-40°C
Solid crystalline H20
Tm melting T°
-100°C
Tg glass transition T°
-137°C
Solid Glass – vitreous- amorphe H20
Concentration of SALT
Vitrification: definition
+
La vitrification consiste en la solidification d´une solution par
augmentation extrême de la viscosité de cette solution en
surfusion au cours du refroidissement
Liquid Water
Ice crystals
Vitrified water
Vitrification:
Conditions favorisant l’obtention d’un
état vitrifiant ?
Comment réduire la formation de
cristaux durant le transit à travers la
phase cristalline?
CONDITION N° 1: Concentration élevée en CRYOPROTECTEUR
Augmenter la viscosité
Molécules capables de former des ponts hydrogènes avec l’eau
=> perturbent et retardent la formation cristalline
CPs perméables:
Petits PM
Actions intra et
extracellulaires
Par effet osmotique
CPs non perméables
Moyens PM
Actions extra et
intracellulaires
Par effet osmotique
CPs non perméables
Hauts PM
Action extracellulaire
Aucun effet osmotique
Exposition aux solutions de CP
principe de base
Avant de plonger le matériel biologique
dans L2
Cryoprotectant concentrations
les ovocytes ou embryons sont exposés à 2
types de solutions de CP.
Sol. vitrifiantes
30% - 40%
Sol. NON
vitrifiantes
10% - 20%
2.4 – 3.2 M
CP perméables
Prépare le
compartiment
intracellulaire à une
concentration optimale
en CP.
3 to 12 min.
4.8 – 6.4 M
CP perméables et
NON perméables
Concentre par
déshydratation, le CP
qui est rentré au cours
de la première étape
en vue de créer un état
vitrifiant intracellulaire.
30 to 90 sec.
10 to 15 min.
Concentration élevée en Cryoprotecteurs:
Une crainte justifiée ?
Cryoprotectant concentrations
VITRIFYING
Solution
4.8 – 6.4 M
NON vitrifying
Solution
5600 - 7300 mosm
2.4 - 3.2 M
1.6 M
2700 - 3500 mosm
3 to 12 min.
VITRIFIED
Slow freezing
1900 mosm
30 to 90 sec.
10 to 15 min.
Hum Reprod 2013
 Concentration intracellulaire en CP est de loin inférieure (2.14M) à
celle présente dans la solution finale de vitrification (4.8 – 6.4 M)
Hum Reprod 2013
 Concentration intracellulaire en CP est de loin inférieure (2.14M) à
celle présente dans la solution finale de vitrification (4.8 – 6.4 M)
 La concentration intracellulaire en CP lors d´une vitrification est
inférieure à la concentration intracellulaire lors d´une congélation
lente.
CONDITION N° 2: Vitesse de rrefroidissement et de réchauffement rapide.
Etat liquide
Tg
20°C
-40°C
Etat cristallin
Etat vitreux - amorphe
-120°C
Tg
Concentration
1000 - >20.000°C/min
Congélation lente
Vitrification
CONDITION N° 2: Vitesse de rrefroidissement et de réchauffement rapide.
Etat liquide
Tg
20°C
-40°C
Etat cristallin
Etat vitreux - amorphe
-120°C
Tg
Concentration
Supports de vitrification
OUVERT
Contact du matériel biologique avec LN2
Cryoloop (CL)
(Lane 1999; Mukaida 2001, 2003; Liebermann &
EM grid
Tucker, 2002; Reed et al., 2002; Liebermann &
Tucker, 2003)
(Martino 1996,; Park 2000; Chung
2000; Wu 2001; Son 2003; Yoon
2003)
Vitesse refroidissement > 20.000°C/min
Vitesse réchauffement > 20.000°C/min
Cryotop
(Kuwayama & Kato, 2000, ; Liebermann &
Tucker, 2003 Al Hasani 2006)
Hemi-straw system (HS)
(Vanderzwalmen 2000, 2003; Liebermann & Tucker
2002; Sugioka 2003, Zech 2005)
European Union directive concerning the packaging of cells and
tissues
„Following procurement, all recovered tissues and cells must be packaged in a
manner which minimises the risk of contamination and must be stored at
temperatures that preserve the required characteristics and biological function
of the cells/tissues“
•
Les techniques ultra-rapides (système de contention ouvert ) ne pouvant
garantir une sécurité (sanitaire et effet physico-chimique de LN2) à
cause du contact direct de l´échantillon avec LN2, il est impératif
– D´utiliser une méthode
– et un système de contention
– permettant un isolement total de l’échantillon aussi bien lors du
refroidissement que du stockage, tout en conservant des taux de
survies compatibles avec une utilisation en pratique.
Supports FERME ou OUVERT : un débat encore d´actualité
VITRIFICATION
ULTRA – RAPID
NON ASEPTIC
„OUVERT“
ASEPTIC
„FERME“
Isolation of the sample from LN2
Thermo-insulating barrier
Supports FERME ou OUVERT : un débat encore d´actualité
VITRIFICATION
ULTRA – RAPID
NON ASEPTIC
„OUVERT“
ASEPTIC
„FERME“
Isolation of the sample from LN2
Thermo-insulating barrier
 Possible de vitrifier avec des vitesses de refroidissements réduites?
 Ovocytes
 Embryons ( zygotes au blastocyste)
Support de vitrification
FERME
 HSV straw
Absence de contact avecLN2 au cours du
refroidissement et réchauffement.




Cryotip
HSV straw
Vitrisafe
Rapid i
Vitesse refroidissement ~ 1.300°C/min
Vitesse réchauffement > 20.000°C/min
Conditions favorisant l’obtention
d’un état vitrifiant ?
Vitesse refroidissement - réchauffement X Viscosité
Volume de l‘ échantillon
Au plus élevées seront les vitesses de
refroidissements et de réchauffements, moins il sera
nécessaire de faire pénétrer du CP, et vice versa.
Arav et al.,
Application Clinique
Vitrification système
ouvert
fermé
VITRIFICATION of MII OVOCYTES
vitrification of oocytes: indications
 Fertility preservation
before medical treatment e.g. before chemotherapy
 IVF-Cycles
ethical (Replace embryo freezing)
legal reasons
 Oocytes Donation Cycles : oocyte banking
Vitrification ovocytaire
Congélation lente (2-3 x moins d´ovocytes)
Transfert frais
Devenir enfants
Aucune différence
Congélation ovocytaire
système ouvert
Don ovocyte (résultats > 50 % Grossesse)
Vs
Ovocyte de la patiente ???
Vitrification of oocytes: efficient >>>>>>> enlarge the indications
 Fertility preservation
before medical treatment e.g. before chemotherapy
 IVF-Cycles
ethical or legal reasons
 Oocytes Donation Cycles : oocyte banking
 for social reasons :
No partner,
Egg freezing to prevent age-related fertility decline
 risk for OHSS, endometrium problem
 Avoid embryo storage
 low-responders – (cryo accumulation)
Results and oocytes quality
Cobo A Alpha London 2012
Cumulative ongoing pregnancy rate achieved with oocyte
vitrification and cleavage stage transfer without embryo
selection in a standard infertility program.
Ubaldi et al., HR 2010
Cumulative ongoing pregnancy rate achieved with oocyte
vitrification and cleavage stage transfer without embryo
selection in a standard infertility program.
Ubaldi et al., HR 2010
Aseptic Oocyte vitrification
Our experience with the vitrisafe
Closed carrier
Vitrification of oocytes: efficient >>>>>>> enlarge the indications
 Fertility preservation
before medical treatment e.g. before chemotherapy
 IVF-Cycles
ethical or legal reasons
 Oocytes Donation Cycles : oocyte banking
 for social reasons :
No partner,
Egg freezing to prevent age-related fertility decline
 risk for OHSS, endometrium problem
 low-responders – (cryo accumulation)
 Impossibility to receive the sperm on time or to few spermatozoa
Vitrification Ovocytaire
Absence imprévue de l´échantillon le jour de la ponction ovocytaire
Impossibilité de produire l´échantillon á temps
(psychologique – dysfonction érectile)
(n=39)
Vieillissement ovocytaire !!!!
Absence imprévue du partenaire le jour du PU
(n=11)
Azoospermie >>> biopsie testiculaire non plannifiée mais
réticence du partenaire
(n=6)
Horaire d´un programme de vitrification ovocytaire
OPU
2h
Hyal / cumulase
Vitrification
Storage
warming
2-3h
ICSI
IMSI
~ 39 - 41h
post hCG
Impossibility to produce a semen sample according to a
normal timetable
ICSI
Wait for 6 h to 8h the semen sample
~ 41 - 44h
post hCG
Annonce at the end of the day the Impossibility
to produce a semen sample
~ 10 h Oocyte aging !!!!
OPU
> 6h – 8h
Hyal / cumulase
vitrification
warming
2h
ICSI
IMSI
> 45 h
post hCG
!!!!!!!
Impossibility to produce a semen sample according to a
normal timetable
If no semen 2 – 3 h
after OPU
Oocyte aging
(n = 39)
Hyal / cumulase
Vitrification
Storage
Embryo development after 56 vitrification/warming cycles in case of
unexpected sperm production
(no partner – no testicular biopsy – delayed of sperm production)
Cycles V / W
Mean age
MII oocytes
56
34.5
455
Survival rate
416/455 (91.4 %)
Fertilization rate
297/416 (71.4 %)
Cleavage rate d3
283/297 (95.3%)
Top-embryos d3
83/297 (27.9%)
Blastocyst rate
118/297 (39.7%)
Top-blastocysts
32/297 (10.8%)
Top-blasto: 4AA- 3AA - 4AB – 4BA
Embryo development after 56 vitrification/warming cycles in case of
unexpected sperm production
(no partner – no testicular biopsy – delayed of sperm production)
Embryo transfers
56
No. Day 5 Emb. transf.
108 (1.9)
Ongoing Pregnancy Rate 24/56 (42.8 %)
Implantation Rate
23/112 (20.5 %)
Deliveries/ Birth Rate
18/56 (32.1 %)
Babies born
21
Deuxième circonstance
Oligozoospermie très sévère.
Observation de quelques sp. mobiles
Moins de spermatozoïdes que d´ovocytes
Recherche 2 h – 2 biologistes
Quelle stratégie adopter si moins de spermatozoïdes que d´ovocytes
1
Vitrifie les ovocytes en MII : UN / paille
2
Echantillon arrive au labo (après qlq jours, semaines, mois)
Recherche et isole après lavages les spermatozoïdes
Le nombre d´ovocytes réchauffés = nombre de spermatozoïdes trouvés
Effectue ICSI
3
Jour + 1
Observe les fécondations
Vitrifie les 2 PN
Cryo- accumule les 2PN
4
Lorsque tous les ovocytes sont utilisés (3, 4 échantillons de Sp) on
prépare la patiente pour le cycle de transfert des zygotes vitrifiés.
5
Réchauffe tous les zygotes et culture jusqu´au blastocyste (J5)
Case
1
Nb
samples
Average
SP
Nb of
oocyte
warming
cycles
survival
2PN
% blasto after cryoaccumation of 2PN
Pregnancy
clinical Preg
Birth
4
4
94%
81%
31%
1
1 (abortion 16 W)
0
3
88%
71%
43%
1
1
1 (girl)
5
91%
74%
32%
0
Still revitri blasto
3
83%
75%
16%
1
1 (ongoing 28 w)
4.1
Case
2
3
3.7
Case
3
6
3.9
Case
4
4
5.2
Embryo vitrification in open system
Survival
90 – 95%
85 – 95%
70 – 95%
Gross évolutives
25 – 35%
30 – 45%
25 – 55%
Implantation
15 – 20%
20- 30%
25- 40%
Kuwuyama (2006), Al Hasani (2007), Desai (2007) Raju (2005) Nagata clinic
(2006) balaban (2008) Vanderzwalmen (2002) Choi (2000) , Reed (2002), Son
(2003) Lieberman (2003) Vanderzwalmen (2003) Mukaida (2004) Kuwayama
(2005)
Perinatal outcome of blastocyst transfer with vitrification using
the cryoloop (DMSO – EG)
Oral Perinatal outcome of vitrified human blastocysts in 9 year
experience (3601 attempted cycles) including the incidence rate of monozygotic
twinning
T. Mukaida ESHRE Amsterdam 2009
Chromosomal abnormalities or neonatal complications 2.3%
MZT
3.3%
Fresh 2.3%
3.2%
Embryo vitrification in closed system
Aseptic vitrification of blastocysts
Clinical applications
• IVF-Cycles
- Surplus embryos on day of transfer / d5 - d6
- no fresh ET due to medical reasons
- Optimize cumulative PR
- “vitrify the best, transfer the moderate”
- after IVM
- PGS
• Fertility preservation
Clinical results aseptic vitrification of
blastocysts
2009 - 2012
Mean age 36.5 (21 – 47)
.
ETs
1004
Warmed blastocysts
3166
Survival rate
2832
89.4% (bef ET)
Blastocysts transferred
1532
1.5
PR
436
43.6%
Ongoing PR
362
36.2%
Birth rate
341
33.9%
Babies born
375
VANDERZWALMEN P, ZECH NH. Aseptic vitrification of blastocysts from infertile patients,
egg donors and after IVM.
Reprod Biomed Online 2009, 19(5):700-7
VANDERZWALMEN P., ZECH N., 2010.
Closed carrier device: a reality to vitrify oocytes and embryos in aseptic conditions.
Gynecol. Obstet. Fertil., 38, 541-546.
Open vs. closed vitrification of blastocysts resulted from an oocyte donation program;
a prospective randomized study RBMonline 2013 Y Panagiotidis - Vanderzwalmen
Group 1
Group 2
Open
Closed
n=208
(vitrisafe)
(492 embryos)
n=224
P value
(513 embryos)
Embryo survival rate, (%)
414/492(84.1)
421/513(82.1)
NS
Clinical pregnancy / transfer, n (%)
89/194(45.9)
87/205(42.4)
NS
Twins
17/89
14/87
NS
Triplets
0
1
NS
Implantation rate, n (%)
106/414(25.6)
103/421(24.5)
NS
Ongoing pregnancy >22nd week, n (%)
82/194(42.3)
85/205(41.5)
NS
Live Birth / transfer, n (%)
80/194 (41.2)
84/205 (40.9)
NS
Babies born / transferred blastocyst, n (%)
94/414 (22.7)
98/421 (23.2)
NS
Before ET (2:30h)
Before vitrification
After warming
Patient 34 Y– OHSS in fresh cycle –
ET of A and B – Triplet Pregnancy ongoing with A + B
Is it possible to vitrify hatching or hatched
blastocysts?
Vitrification of Hatching and Hatched Blastocyst
Before vitrification
ET 128
ET 29
After Thawing
Survie 96 %
Survie 92 %
After 3- 24 hours
Ong Preg 38.4 %
Ong Preg 26.6 %
Is it possible to vitrify biopsied embryos ?
Van Landuyt
Survival
Irvine media
VHS support
Biopsie on J3
day 5
90%
day 6
71%
laser
Trophectoderm biopsy
CGH
Microarray
24sure
Seite 2/3
30 min after biopsy
3 hrs after warming
In CP 5/5 DMSO/EG
20 hrs after warming
After thawing
20 hrs after warming
Embryons de qualités
sub-optimales !!!
Vitrifiés ou Eliminer ?
Embryons de qualités
sub-optimales !!!
áJ3
Vitrifiés ou Eliminer ?
2013
J3
4 – 6 cells20 %
frag.
Granularité
Blast. inégaux
Résultats après transferts à J3 ou J5
d´embryons vitrifiés
Blastocystes issus de J3 de
mauvaises qualités
J3 de bonnes
qualités
Embryons de qualités
sub-optimales !!!
áJ5
Vitrifiés ou Eliminer
Do we have the right attitude when deselecting
low quality blastocysts and excluding them for
vitrification ?
After fresh ET of the “best” one:
Vitrification policy ?
 Do we have to vitrify only top-blastocysts ?
 Do we have to vitrify moderate blastocysts or also those with poor
morphology ?
After fresh ET of the “best” one:
Vitrification policy ?
EXPANSION ?
 Do we have to vitrify only top-blastocysts ?
 Do we have to vitrify moderate blastocysts or also those with poor
morphology ?
 Do we have to taken into account expansion, ICM and/or
trophectoderm quality?
 Is there a level in terms of embryo quality under which it is not
helpful?
 Vitrification on day 5/ or day 6 ?
Blastocyst score
Prediction of pregnancy rate by blastocyst
morphological score and age, based on
1,488 single frozen-thawed blastocyst
transfer cycles
Sakae Goto et al. Hum Reprod 2011
ET fresh
Vandenabeele et al 2013 RBMonline 2013
Significant correlation between blastocyst quality (according to the
Gardner Schoolcraft score) and pregnancy rate/ birth rate in addition
to the influence of age
Which treshold ? Clinical value ?
Honnma H et al., FS 2012
Blastocoel expansion and
trophectoderm grade –
most significant
pre-freeze morphological
predictors
104
Patients and Methods
Morphological grading on day 5 before vitrification
Quality
Group
Expansion
ICM
TE
I
2,3,4,5
A
A
B
A
B
A
II
2,3,4,5
B
B
C
B
C
B
III
2,3,4,5,
C
C
IV
Ybl a, b, c
Morulae
V
Cleavage
stage
Compactions
Results
Survival Rate in different morphological groups
Group
I
ETs
Age of
Patients
Embryos
warmed
287
35.4
3.3±
(21-43)
1.6
35.7
3.1±
(21-46)
1.1
34.9
3.4±
(28-44)
1.3
36.2
2.6±
(29-42)
1.1
38.1
2.7±
(29-42)
1.3
AA/AB/BA
II
358
BB/BC/CB
III
11
CC
IV
32
Ybl Mor
V
Comp/clea
vage stage
12
Survival rate **: before ET ( min. 3 h culture)
Survival
Rate **
86 %
Embryos
transfered
1.7±
0.5
85 %
1.8±
0.5
82 %
1.9±
0.3
83 %
1.8±
0.6
76 %
1.8±
0.7
Results
Abortion Rate / Birth Rate
Group
Embryo
Transfers
I
287
AA/AB/BA
II
358
11
CC
IV
32
Ybl Mor
V
Comp/cleav stage
Birth Rate
18
88 (116)
6.2 %
30.7 %
18
122 (149)
5.0 %
BB/BC/CB
III
Abortion
Rate
12
34.1 %
1
3 (3)
9.1 %
27.3 %
1
8 (9)
3.1 %
25.0 %
0
1 (1)
0%
8.3 %
transfert
vitrifié
Frais ****
Group
21 - 46
29 - 33
I
30.7 %
12 - 47 %
34.1 %
15 – 42 %
AA/AB/BA
II
BB/BC/CB
III
27.3 %
CC
IV
25.0 %
5 – 23 %
Ybl Mor
V
Comp/cleav
stage
8.3 %
Pas
rapporté
**** Association between blastocyst morphology and outcome of singleblastocyst transfer Van den abbeel RBMonline 2013
110
transfert
vitrifié
Frais ****
frais
Group
21 - 46
29 - 33
29 - 33
29 - 33
I
30.7 %
48.4 %
12 - 47 %
45.3 %
34.1 %
44,2 %
15 – 42 %
40.4%
27.3 %
Aucun cas
25.0 %
40.1%
8.3 %
Aucun cas
AA/AB/BA
II
BB/BC/CB
III
24.3%
CC
IV
5 – 23 %
36.4%
Ybl Mor
V
Comp/cleav
stage
Pas
rapporté
Culture J6
**** Association between blastocyst morphology and outcome of singleblastocyst transfer Van den abbeel RBMonline 2013
111
Embryons avec retards de
développement à J5
Quelle stratégie ?
112
Embryons avec retards de développement à J5
Quelle stratégie ?
Culture J6
Vitrification J6
si blasto
J5
Compact
Morulae
8 cell.
Culture J6
Vitrification J5
Transfert si
blasto
Embryons avec retards de développement à J5
Quelle stratégie ?
82 cycles de vit (37.2 an) survie 92.3% 34 gross évol: 41.4%
Culture J6
Vitrification J6
si blasto
J5
Compact
Morulae
8 cell.
Culture J6
Vitrification J5
Transfert si
blasto
37 cycles de vit (36.4 an) survie 86.4% (J5) 74.2 % (J6) 10 gross évol: 27.0%
Kovalesky Fert Steril 2013
115
Une telle conclusion est aussi valable pour les J6
116
Aspect morphologique
après réchauffement
117
Which embryo to select?
Maturation In Vitro
vitrification: la solution ?
Vanderzwalmen et al. RBMonline 2009
Fertil Steril (in Press)
119
Effet du stockage à long
terme
122
123
CONCLUSIONS : Vitrification of oocytes in case:
o of unexpected semen production or inability to produce the sample
according to a normal schedule post hCG is a valuable strategy.
o of severe oligozoospermia is also an approach that permits to rescue
oocytes.
 Of course such strategy implies the vitrification of zygotes (or
embryos) post fertilization of the warmed oocytes.
 Three cycles of vitrification (oocyte – zygote – blastocyst) seems to have no
adverse effect (but only one case)
 Kryo-accumulation of oocytes in case of poor responder may be a
good option. However a disparity in our results in term of embryo
development post warming is noticed, reflecting probably the intrinsic
problem linked with the oocyte quality.
Conclusions générales:
 En système ouvert et fermé la vitrification d´ovocytes et embryons permet
d´obtenir des taux de grossesses supérieures à la congélation lente.
 Une moyenne de 6 á 8 ovocytes est suffisante pour obtenir une grossesse.
 Pas de différence en terme de malformation après vitrification (ovocytes et
embryons)
 Le stockage sur une période de 6 ans n´a pas d éffet négatif en terme de
survie, naissance et santé des enfants nés.
 Les concentrations intracellulaires en CP sont de loin inférieures
 à la concentration de la solution vitrifiante.
 à la concentration intracellulaire après congélation lente.
Conclusions générales:
 Dans le but d´augmenter le taux de grossesses cumulatives:
 La vitrification d´un embryon par support est indispensable (fct qualité)
 Eviter les revitrifications
 Vitrification de blastocystes de qualités moyennes donne des résultats
acceptables.
 La culture jusqu´au jour 6 (7) des embryons avec un retard de développement
permet de vitrifier avec succès des embryons qui normalement n´auraient pas
été cryopréserver à J5
Future de la vitrification
• On peut s´attendre que dans un future proche les cycles de
vitrifications vont augmenter au dépend des transferts à
frais afin de replacer les embryons dans un environnement
utérin plus physiologique.
• Le transfert frais d´embryons de seconde qualité et la
vitrification des meilleures est une stratégie à ne pas
négliger.
VANDERZWALMEN P, ZECH NH, WIRLEITNER B
Blastocyst transfer after aseptic vitrification of zygotes: an approach to
overcome an impaired uterine environment.
Reprod Biomed Online. 2012
129
CHIREC, Belgium
Lejeune, Delval , Imbert , Puissant , Greindel ,
Vanderzwalmen , Van Damme, Uranga ,
GIGA-Research, Transgenic Platform, University of Liège, Belgium
Ectors , Grobet
IVF Zentren Prof. Zech
Römerstrasse 2
6900 Bregenz, Österreich
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