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Apport du modèle expérimental à la prise en - Infectio
Apport du modèle expérimental à la prise en charge des infections pulmonaires à Pseudomonas aeruginosa DUACAI 26 avril 2007 Karine Faure Service de Gestion du Risque Infectieux et des Vigilances CHRU Lille Laboratoire de Recherche en Pathologie Infectieuse EA 2689 Faculté de Médecine de Lille, Université Lille 2 La problématique • 11% des infections nosocomiales • 21,7% des infections respiratoires • Le premier agent responsable des pneumonies nosocomiales (avec S. aureus) • Mortalité des pneumonies à P. aeruginosa supérieure aux pneumonies dues à d’autres bactéries (mortalité attribuable 40%) La problématique Anomalie génétique Mucoviscidose Anomalie récepteur CFTR • Maladie génétique la + fréquente chez les caucasiens (1/47000) • Colonisation précoce des voies aériennes des patients atteints de mucoviscidose 80% des patients de plus de 26 ans Mouvement de sodium, chlore, eau Mucus épais et visqueux Obstruction Mucus épais des VA Cercle vicieux Infection • • clairance bactérienne des poumons difficile et limitation mouvements phagocytes • 1ère infection, puis 2ème épisode infectieux... infection chronique dommages pulmonaires, souche très résistante aux AB Infection non contrôlée (90% de décès) Protéases Inflammation Destruction tissulaire progressive Défaillance respiratoire La problématique Bactérie environnementale Bactérie aquaphile eaux de rivière, d'égouts, de piscine, de mer eau potable, minérales ou thermales, eaux déminéralisées Environnement hospitalier Matériel: hôtelier (robinetterie) médical (sondes, trocarts, cathéters) chirurgical (instruments, prothèses) Solutions: antiseptiques, injectables Sols humides végétaux, fleurs légumes, fruits Exceptionnellement, flore intestinale de l'homme ou de l'animal La problématique • Bactérie versatile, adaptabilité +++ • Le plus large génome bactérien connu à ce jour • Perception et adaptation aux signaux environnementaux Micro-organisme opportuniste - Normalement présent dans l’environnement de l’Homme et profite d’une diminution des défenses pour provoquer une infection - Peu pathogène chez les sujets en bonne santé - Très pathogène chez les sujets immunodéprimés - Dose infectieuse ? Flore transitoire - Ensemble d'espèces s'établissant de façon temporaire et provenant de l'environnement et des autres individus - Isolé de prélèvements variés: urines, selles, sécrétions respiratoires, peau présence ≠ infection Quelles sont les relations Homme - P. aeruginosa ? Elimination Contact Commensal Symbiose Conflit Colonisation Guérison Colonisation Infection chronique Infection aiguë Infection aiguë Décès P. aeruginosa Agressivité Inoculum Hôte Porte d’entrée Susceptibilité Défense Interactions hôte - pathogène P. aeruginosa Défense Voies aériennes indemne de P. aeruginosa P. aeruginosa Défense Colonisation des voies aériennes Défense P. aeruginosa Pneumonie à P. aeruginosa Notion de Pouvoir pathogène – Facteurs de risque de l’hôte Notion de Virulence du pathogène – Défenses de l’hôte La problématique • Colonisation/infection sur terrain fragile immunodéprimé au sens large – – – – – Neutropénie Cancer Pathologies pulmonaires chroniques Personnes âgées Brûlé La problématique Nombreuses résistances naturelles Nombreux mécanismes de résistance acquise Association des mécanismes très fréquente Efflux Antibiotique Imperméabilité Porine Pompe Membrane externe PLP Modification de la cible Enzyme Inactivation antibiotique Rapport EARSS 2005 Rapport EARSS 2005 Combinaison des résistances Donc • Nécessité de développer de nouvelles thérapeutiques anti-infectieuses – Dirigées contre les facteurs de virulence du pathogène – Dirigées contre la réponse de l’hôte – Nouveaux antibiotiques dirigés contre les souches multirésistantes improbable « Bad bugs, no drugs » IDSA 2004 Urgemment! Louis Pasteur (1822-1895) Importance de connaître le « mode de vie » des microorganismes afin de les domestiquer et de contrer leurs éventuels effets néfastes Couple hôte - pathogène Solutions ? Mieux comprendre la physiopathologie des maladies infectieuses La médecine aujourd’hui c’est... La médecine aujourd’hui c’est... Le lien ? Pseudomonas aeruginosa Facteurs cellulaires Adhésion et croissance Pili Flagelle LP S Lectines Adhésines Alginate Facteurs extracellulaires Enzymes Toxines Lésions cellulaires Lésions tissulaires Expression variable selon l’environnement ADAPTABILITE Le poumon Surface alvéolaire = 75m2, épaisseur de la barrière = 4-8 µm Epithélium respiratoire = barrière physique, mécanique, chimique Macrophages alvéolaires Protéines du surfactant Défensines Immunité non spécifique (innée) 1ère ligne Les acteurs en place Les acteurs recrutés La réaction inflammatoire Cytokines Chémokines Activation Phagocytose Espace alvéolaire Lymphocytes Secteur vasculaire Neutrophiles Immunité spécifique (adaptative) Lymphocytes Mobilité et adhésion Plusieurs facteurs d’adhésion Plusieurs récepteurs sur la cellules épithéliales Activation Le contact avec la cellule eucaryote va activer la machinerie qui permettra l’étape suivante: l’invasion 1- lésion, 2- colonisation/multiplication OU 1- colonisation/multiplication, 2- lésion Bactérie Macrophage alvéolaire Molécules inflammatoires Toxines Epithelium respiratoire Biofilm Colonisation/multiplication Biofilm matrice protectrice Bactérie Lésion Antibiotique Anticorps Biofilm Phagocyte Epithélium Communication Quorum sensing Multiplication Activation Lésion Destruction du surfactant Inhibition de la phagocytose Toxines Enzymes Destruction des jonctions serrées Pompes Œdème Réparation Fuite eau et protéines Mort des cellules épithéliales - Rupture de la barrière alvéolocapillaire - Destruction tissulaire - Exacerbation de la réponse inflammatoire Pilines Tang H, Kays M, Prince A. Infect Immun 2001 Pilines Hertle R, Mrsny R, Fitzgerald DJ. Infect Immun 2001 Pilines Données personnelles 131 I-Album in % in Blood Lung Epithelial Injury 15 10 5 0 6.7 vaccine 9.9 8.5 7.4 vaccine+adjv vector vector+adjv Lung Edema Wet/Dry 6 5,5 5 4,5 5.1 vaccine 4.9vaccine+adjv * * 5.6 5.5 vector vector+adjv Données personnelles (suite) Bacteria in Lungs CFU 1.E+08 1.E+08 8.E+07 6.E+07 4.E+07 2.E+07 0.E+00 * vaccine vaccine+adjv vector vector+adjv Bacteria in Blood CFU/ml 1.5E+03 1.0E+03 5.0E+02 0.0E+00 vaccine vaccine+adjv vector vector+adjv Le système de sécrétion de type III SSTT Kudoh et al, Am J Physiol 1994 Exotoxines A S49kDa S53kDa Ctr PAK PAKexsA PA103 PA103exsA PA103toxA + + ++ ++ - ++ - + ++ ++ Acute lung injury Blood W/D (% inst) 3+/-2 * 16+/-4 6+/-1 * 21+/-7 5+/-3 * 27+/-12 # # 5.1+/-0.5 5.8+/-0.9 5.0+/-0.2 * 7.6+/-0.2 5.3+/-0.4 * 8.6+/-2.0 SSTT Kurahashi et al, J Clin Invest 1999 MAP (mmHg) 140 Ctr PA103 dUT (%baseline) 140 120 120 100 100 80 80 60 60 40 Ctr PA103 dUT Cardiac Output 40 0 1 2 3 4 5 6 7 Time (hours) 0 1 2 3 4 5 Time (hours) 6 7 SSTT Kurahashi et al, J Clin Invest 1999 (suite) 125 Ctr PA103 dUT I-alb in blood (%) 25 20 15 10 5 0 0 1 2 3 4 5 Time (hours) 6 7 SSTT Sawa et al, Nature Med 1999 Lung epithelial injury (%131I-Alb) Cytotoxicity (%) PCR Vecteur E. Coli rPcrV rPcrV IgG anti-PcrV Shime et al, J Immunol 2001 Shime et al, J Immunol 2001 (suite) Shime et al, J Immunol 2001 (suite) Shime et al, J Immunol 2001 (suite) Sawa et al., JID 2003 Sawa et al., JID 2003 (suite) Faure et al., J Immune Based Ther Vaccines 2003 Faure et al., J Immune Based Ther Vaccines 2003 (suite) Faure et al., J Immune Based Ther Vaccines 2003 (suite) Faure et al., J Immune Based Ther Vaccines 2003 (suite) Clinique humaine Virulence • Toutes les souches n’expriment pas le SSTT • Expression du SSTT = surmortalité Roy-Burman A et al. JID 2001;183:1767–74 Clinique humaine Détection Ajayi T et al. J Clin Microbiol. 2003; 41(8):3526-31 Faure et al. J Clin Microbiol 2003; 41(5):2158-60 – Voie de signalisation du LPS/TLR4 LPS MD- 2 Activité anti - microbienne Agression tissulaire Immunité cellulaire Immunité humorale Lipide A TLR4 CD14 TIR TIR MyD88 IRAK iNOS Cytokines TRAF6 IκB NF-κB ADN H0 H4 H10 J3 C3H/HeJ C3H/FeJ PA103 5x103 UFC PA103 6x104 UFC PA103 5x105 UFC PA103∆UT 5x105 UFC Contrôle SSI Cytokines Agression pulmonaire • perméabilité épithéliale • W/D Clairance bactérienne pulmonaire Bactériémie J7 Etude de survie Agression pulmonaire ** * * ** * * Clairance bactérienne Poumon H4 J3 Cytokines Influence du SSTT sur la réponse inflammatoire alvéolaire H0 Instillation Injection CHA: 1x109 UFC; 0.5ml/kg CHA-D1: 1x109 UFC; 0.5ml/kg H2 H4 H12 H24 H72 Agression pulmonaire • [Protéines] LBA • W/D Clairance bactérienne pulmonaire Leucocytes LBA Cytokines (TNFα, IL-1, CINC, IL-10) • Mortalité à 72 heures • CHA: • CHA-D1: 100% 0% • Cytotoxicité in vitro (A549) Souche H4 (%) CHA 26 ± 1 * o CHA-D1 0±0 H6 (%) 85 ± 4 * o 28 ± 13 PA103 66 ± 18 100 ± 0 PAO1 0±0 26 ± 3 • Agression pulmonaire CHA CHA D1 * 4.5 3.5 3 CHA CHA D1 2.5 *o 2 H2 H4 Temps aprè s infe ction H12 Protéines dans LBA (g/dL) W/D 4 1 *o 0.8 0.6 0.4 0.2 0 H2 H4 Temps aprè s infe ction H12 • Bactériologie CHA CHA D1 1.00E+10 * CFU lung 1.00E+09 1.00E+08 1.00E+07 1.00E+06 1.00E+05 H2 H4 Time H12 • Réponse inflammatoire PNNs CHA CHA D1 o 5000 PNN/mm3 4000 3000 * 2000 1000 0 H2 H4 Temps après infection H12 • Réponse inflammatoire Cytokines 10000 * * 1000 100 IL-1 dans LBA (pg/ml) TNF-α dans LBA (pg/ml) 10000 1000 100 10 10 H2 H4 H2 H12 * IL10 dans LBA (pg/ml) CINC dans LBA (pg/ml) 100 10 H4 , CHA ; , CHA-D1. 1000 1000 H2 H12 Te mps aprè s infection Te mps aprè s infe ction 10000 H4 H12 100 10 H2 H4 Temps après infection Te mps aprè s infe ction H12 Le Quorum sensing (QS) + GacA, Vfr rsaL - + Gènes régulants lasR lasI + rhlR LasI LasR Exotoxine A RhlI + RhlR 3-oxo-C12-HSL exoA rhlI C4-HSL + lasA lasB Elastase A aprA rhlAB Protease alcaline Rhamnolipide Elastase B Gènes régulés (97 ou +) pyc Pyocyanine Gènes régulants lasR lasI rhlR rhlI RhlI LasI RhlR 3-oxo-C12-HSL C4-HSL LasR exoA Exotoxine A lasA lasB Elastase A aprA rhlAB Protease alcaline Rhamnolipide Elastase B Gènes régulés (97) pyc Pyocyanine Inhibition des AHLs • Reimmann C. et al. Microbiology 2002; 148:923-32 Plasmide Gène aiiA Lactonases AHLs ⌧ Transcription des gènes de virulence Limites Réversibilité – fermeture spontanée du cycle Taille des enzymes (voie systémique impossible) et stabilité Application envisageable Outils d’étude du QS Topique cutané (brûlés) Reimmann C. et al. Microbiology 2002 Inhibition des AHLs (suite) • Smith R et al. JCI 2003; 185:7222-30 Anticorps anti 3-oxo-C12-HSL AHLs MAb ⌧ extracellulaire intracellulaire Inhibition de l’activation de lasB et production d’IL-8 • Hoang T et al. J Bacteriol 1999; 181:5489-97 • Modification des précurseurs des AHLs = acides gras • Production d’AG à courte chaîne => saturation de LasI • Diminution des AHLs actifs Inhibition des complexes LasR/HSL et RhlR/HSL • Smith K et al. Chem Biol 2003; 10:563-71 – Principe: analogues des AHLs qui antagonisent 3-oxo-C12-HSL et C4-HSL – Plusieurs antagonistes testés in vitro – Approche en cours de développement • Hentzer M et al. Microbiology 2002; 148:87-102 – Furanones: sécrétées par une algue, déplacent la liaison LuxRAHL => inhibent la colonisation de l’algue – PAO1 exposé à une furanone synthétique => Répression (80%) des gènes régulés par le QS • Wu H et al. JAC 2004; 53(6): 1054-61 – Modèle murin d’infection chronique à PAO1 + furanones IV – 1ère étude in vivo d’inhibiteurs du QS +++ Inhibition de la transcription de LasR/LasI et RhlR/RhlI • Délétion des gènes gacA et vfr • Reimmann C et al. Mol Microbiol 1997; 24:309-19 • Albus AM et al. J Bacteriol 1997; 179:3928-35 – Etudes in vitro – Réduction de la production de LasR et RhlR • Oligonucléotides antisens (ARNm de lasR, lasI, rhlR et rhlI) • Smith R et al. JCI 2003; 185:7222-30 – Efficacité de la technique chez les bactéries? – Problèmes de perméabilité cellulaire, mode de délivrance … Inhibition du QS par les macrolides • Tateda K et al. AAC 2001; 45:1930-3 Elastase Ni bactéricide Ni bactériostatique Inhibition du QS Rhamnolipide Tateda K et al. AAC 2001 (suite) Auto-inducteurs synthétiques restaurent partiellement l’expression de lasB et rhlAB Etude pyopneumagene • Objectif principal – déterminer l’influence du SSTT et du QS dans la gravité des pneumonies acquises sous ventilation (PAV) • Moyens: – Etude multicentrique – Tous les patients présentant une PAVM à P. aeruginosa – Modèle animal: étude du niveau d’expression des gènes de virulence dépendant du SSTT et du QS au cours de l’infection aiguë par PCR temps réel – Confrontation de ces résultats au polymorphisme génétique des protéines SP-A et SP-D des patients ayant développé une PAV à P. aeruginosa (étude pneumagene) • Réponse de l’hôte – Apoptose CD95L ROS CD95 Bcl-2 Caspase 3 Mitochondrie Caspase 8 Etude de l’apoptose et des mouvements liquidiens pulmonaires H4 H0 Instillation Injection Co: SSI, IT et IV Pn: PAO1 IT et SSI IV ZPn: PAO1 IT et ZVAD IV ZVAD: SSI IT et ZVAD IV Sacrifice Histologie Apoptose: TUNEL Oligonucléosomes Caspase 3 Agression pulmonaire: W/D EPE • Etude morphologique de l’apoptose pulmonaire Cellules épithéliales Cellules endothéliales • Oligonucléosomes cytoplasmiques 3,17 10,3 4,22 Co Z-VAD Pn ZPn 26.82 • Activité de la caspase 3 ZPn 4,3 Pn Z-VAD Co 12,95 2,62 2,57 • Oedème pulmonaire * 4,5 4 3,5 3 2,5 2 Co Z-VAD Pn ZPn • Perméabilité endothéliale * 0,15 0,1 0,05 0 Co Z-VAD Pn ZPn Limites du modèle expérimental Why do animal models (sometimes) fail to mimic human sepsis ? Esmon CT, Crit Care Med 2004 ; 32 Réflexion critique sur les modèles animaux • • • • • • jeunes animaux adultes sains sans comorbidité(s) (diabète, HTA, cancer…) animaux de labo coprophages : sensibilité diminuée au LPS 1 inoculum bactérien ou LPS prédéterminés au plan de la virulence et de la sensibilité aux ATB Processus infectieux induit artificiellement (“de novo”), d’évolution aiguë Comment extrapoler des résultats expérimentaux issus de populations animales sans support ventilatoire et/ou hémodynamique sur des populations de patients dont ces fonctions sont optimisées ? Esmon CT, Crit Care Med 2004 ; 32 Clinical trials of immunomodulatory therapies in severe sepsis and septic shock Vincent et al, CID 2002 ;34 “The past : why have trials failed ?” • L’agent expérimental est ineffectif Warren et al, J Exp med 1993 • Les doses de l’agent expérimental sont inadéquates • le “timing” expérimental n’est pas le bon Wang et al, Science 1995 • Les populations de patients sont hétérogènes Damas et al, Crit Care Med 1997 • Sur des mécanismes aussi complexes, une voie thérapeutique ne saurait être curative à elle seule Synthèse Limites du modèle expérimental • Reproductibilité chez l'animal ? – – – – – Intra-espèce (poids, taille, sexe…) Inter-espèces variation des inocula Variabilité des conditions expérimentales (anesthésie…) Techniques d ’exploitation des informations : parle-t-on tous de la même chose ? Utilisons-nous tous les même paramètres ? Synthèse Limites du modèle expérimental • Pertinence des résultats obtenus ? Divergence de résultats, voire inversion de résultats souvent constatées d ’un modèle à un autre… Synthèse Limites du modèle expérimental • Faisabilité du modèle ? • Problème de l’approche globale de la maladie Exemples : – Il faut immnunodéprimer un rat pour reproduire une pneumopathie à staphylocoque aureus ce qui limite l’interprétation des paramètres immunologiques… – Pour les mycobactéries, seul les cochons d’Inde peuvent reproduire une infection granulomateuse caséeuse ce qui ne permet pas de doser certains paramètres immunologiques non accessibles avec ce genre d’animaux… – ……… Synthèse Limites du modèle expérimental L'extrapolation est-elle possible ? L’extrapolation est-elle toujours possible ? Bonne connaissance de son modèle Rigueur méthodologique Rigueur statistique Rigueur d’interprétation Remerciements • EA2689 Mr le Pr. Chopin Mr le Pr. Matran Mr le Pr. Nevière Mr le Pr. Guery Rozenn, Flo, Maud, Steve • UCSF Mme le Pr. Wiener-Kronish Mr le Dr. Sawa Mr le Pr. Matthay David, Temi, Nobuaki • Grenoble DBMS Mr le Pr. Polack Mr le Dr. Toussaint Olivier • Laboratoire de Bactériologie Mr le Pr. Courcol Mme le Dr. Husson Mme le Dr. Roussel-Delvallez •Laboratoire de Biophysique Mr le Pr. Marchandise Pascal, Nathalie, Mado • •Inserm U459 Mr le Pr. Formstecher Mr le Dr. Marchetti Harold, Anne-Marie, Martine, Isabelle, Edith • Laboratoire d’anatomopathologie Mr le Dr. Leroy • Inserm U416 Mr le Dr. Gosset • Ministère des Affaires Etrangères • Association “Vaincre la Mucoviscidose”
