université paul cezanne aix-marseille iii

Transcription

UNIVERSITÉ PAUL CEZANNE AIX-MARSEILLE III
N° attribué par la bibliothèque
/__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/
Caractérisation de la biodisponibilité du cuivre
dans les écosystèmes aquatiques par
échantillonnage passif (DGT : Diffusion Gradient in Thin films),
bio-indication (bryophytes aquatiques),
et modélisation (BLM : Biotic Ligand Model)
THESE
pour obtenir le grade de
DOCTEUR EN SCIENCES DE L’UNIVERSITÉ PAUL CEZANNE
Faculté des Sciences et Techniques
Spécialité : Chimie, Environnement et Santé
Présentée et soutenue publiquement par
Daniel FERREIRA
Le 16 janvier 2009
Devant le jury d’examen composé de :
Pr. Landis HARE
Dr. Jacqueline GARNIER LAPLACE
Dr. Eric THYBAUD
Dr. Christophe MOUVET
Pr. Alain BOTTA
Dr Philippe CIFFROY
Dr. Jean-Marie GARNIER
Dr. Marie-Hélène TUSSEAU-VUILLEMIN
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Examinateur
Examinateur
Examinateur
Directeur de thèse
Co-directrice de thèse
Caractérisation de la biodisponibilité du cuivre
dans les écosystèmes aquatiques par
Echantillonnage passif (DGT : Diffusion Gradient in Thin films),
Bio-indication (bryophytes aquatiques),
et Modélisation (BLM : Biotic Ligand Model)
Mémoire de T H E S E
Daniel FERREIRA
3
Sommaire
SOMMAIRE
SOMMAIRE..................................................................................................................................... 5
LISTE DES ABBREVIATIONS .................................................................................................... 9
INTRODUCTION GENERALE .................................................................................................. 11
CHAPITRE I.
METHODES D’ESTIMATION DE LA SPECIATION ET
BIODISPONIBILITE DES METAUX EN MILIEU AQUATIQUE........................................ 15
1.
SPECIATION DES METAUX EN MILIEU AQUATIQUE............................................... 15
1.1
Processus contrôlant la spéciation des métaux en milieu aquatique .......................... 15
1.2
Pouvoir complexant de la matière organique - Interactions entre matière organique et
métaux en milieu aquatique naturel......................................................................................... 17
2. METHODES DE MONITORING DE LA SPECIATION ET DE LA BIODISPONIBILITE
DES METAUX DANS LES ECOSYSTEMES AQUATIQUES................................................ 19
2.1
Analyse et modélisation de la spéciation des métaux traces ....................................... 19
2.1.1
Les techniques électrochimiques non séparatives ............................................... 19
2.1.2
La potentiométrie ................................................................................................. 20
2.1.3
La voltamétrie – l’exemple de la DP-ASV ........................................................... 20
2.1.4
Les techniques séparatives – l’exemple de la technique DGT............................. 21
2.1.5
Les modèles de spéciation chimique .................................................................... 24
3. OUTILS DE MONITORING DE LA SPECIATION ET LA BIODISPONIBILITE DES
METAUX EN MILIEU AQUATIQUE ....................................................................................... 26
3.1
Outils de biomonitoring – utilisation des bryophytes aquatiques comme traceurs de la
biodisponibilité des métaux traces........................................................................................... 26
3.1.1
Généralités sur l’emploi de bryophytes comme outils de biomonitoring ............ 26
3.1.2
Cinétiques d’accumulation des métaux par les bryophytes................................. 27
3.1.3
Paramètres environnementaux influençant l’accumulation des métaux dans les
bryophytes ............................................................................................................................ 29
3.2
Le modèle de l’ion libre (FIAM) et ses dérivés (Biotic Ligand Models – BLM) ......... 30
3.2.1
Le modèle de l’ion Libre ...................................................................................... 30
3.2.2
Le modèle du ligand biologique (BLM) ............................................................... 32
3.2.3
Les exceptions au modèle de l’ion libre............................................................... 34
OBJECTIFS ET DEMARCHE GENERALE............................................................................. 39
CHAPITRE II. BIOACCUMULATION DU CUIVRE DANS LES BRYOPHYTES :
MODELISATION CINETIQUE ET FORMULATION D’UN BLM ...................................... 43
1. INTRODUCTION ............................................................................................................... 43
2. MODELISATION CINETIQUE DE LA BIOACCUMULATION DU CUIVRE DANS LES
BRYOPHYTES ........................................................................................................................... 43
2.1.
Formalisme et hypothèses du modèle cinétique : cinétiques d’échange du cuivre à
l’interface eau-bryophytes ....................................................................................................... 44
2.2.
Détermination expérimentale des constantes cinétiques ............................................. 49
3. EFFET DES CATIONS : FORMULATION D’UN BLM-CU POUR LES BRYOPHYTES
50
3.1
Formalisme et hypothèses du BLM.............................................................................. 51
5
Sommaire
3.2
Calcul des constantes d’affinité cation – Ligand biologique ( K Ci BL1 ) ........................ 52
CHAPITRE III. EFFET DES CATIONS MAJEURS SUR LES CINETIQUES DE
BIOACCUMULATION DU CUIVRE DANS LES BRYOPHYTES........................................ 55
1.
2.
INTRODUCTION ............................................................................................................... 55
ETUDE EXPERIMENTALE............................................................................................... 56
2.1
Protocole expérimental................................................................................................ 56
2.1.1
Mises au point méthodologiques du biotest en laboratoire ................................. 56
2.1.2
Préparation des milieux d’exposition .................................................................. 59
2.2
Exploitation des résultats............................................................................................. 60
2.2.1
Calage et validation du modèle cinétique décrivant les échanges du Cu à
l’interface eau-bryophytes ................................................................................................... 60
2.2.2
Sensibilité de la méthode aux faibles niveaux de contamination......................... 60
3. RESULTATS....................................................................................................................... 63
3.1
Cinétiques d’accumulation du Cu par les mousses aquatiques................................... 63
3.2
Cinétiques de relargage du Cu .................................................................................... 66
4. CALCUL DES CONSTANTES D’AFFINITE CATIONS – LIGAND BIOLOGIQUE:
DEVELOPPEMENT D’UN BLM–CU POUR LES BRYOPHYTES.......................................... 68
5. APPLICATION DU BLM– BRYOPHYTES POUR EVALUER LES TENEURS EN
CUIVRE BIODISPONIBLE DANS L’EAU ............................................................................... 71
CHAPITRE IV. INFLUENCE DES MATIERES ORGANIQUES DISSOUTES (MOD)
SUR LA BIODISPONIBILITE DU CUIVRE : ETUDE COMPARATIVE ENTRE UN
OUTIL BIOMIMETIQUE (DGT) ET UN BIOINDICATEUR (BRYOPHYTES)................. 75
1.
2.
INTRODUCTION ............................................................................................................... 75
ETUDE EXPERIMENTALE............................................................................................... 76
2.1.
Protocole expérimental du biotest ............................................................................... 76
2.1.1
Exposition des bryophytes.................................................................................... 76
2.1.2
Choix des MOD étudiés et préparation des solutions d’exposition..................... 78
2.2.
Spéciation du cuivre en présence de Matières Organiques Dissoutes (MOD)
contrastées ............................................................................................................................... 79
2.2.1
Echantillonnage et mesure du cuivre labile par DGT ......................................... 79
2.2.2
Echantillonnage et mesure du cuivre labile par voltammétrie impulsionnelle
différentielle à re-dissolution anodique (DP-ASV).............................................................. 80
3. RESULTATS....................................................................................................................... 82
3.1.
Bilans de masse............................................................................................................ 82
3.2.
Mesure de la spéciation du cuivre en présence de MOD selon trois techniques
d’analyse (DGT-R, DGT-NR et DP-ASV)................................................................................ 83
3.3.
Influence des matières organiques dissoutes sur les cinétiques de bioaccumulation du
cuivre 87
3.3.1
Le cas particulier des extraits d’algues vertes .................................................... 87
3.3.2
Cas des trois autres MOD (méthylcellulose et MOD extraites de Seine)............ 89
4. INTERPRETATION............................................................................................................ 93
4.1
Caractérisation de la labilité des différents complexes Cu-MOD............................... 93
4.2
Etude comparative des différentes techniques de mesure de la spéciation (DGT et DPASV) pour évaluer la fraction métallique biodisponible ......................................................... 95
4.2.1
Calcul des concentrations de métal biodisponible à partir des cinétiques initiales
de bioaccumulation :............................................................................................................ 95
4.2.2
La fraction de métal labile est-elle représentative de la fraction biodisponible ?
96
6
Sommaire
CHAPITRE V.
COUPLAGE DGT - BLM : VALIDATION IN VITRO ET IN SITU
D’UNE APPROCHE INTEGREE POUR EVALUER LA BIODISPONIBILITE DU
CUIVRE
101
1.
2.
INTRODUCTION ............................................................................................................. 101
DEMARCHE EXPERIMENTALE ................................................................................... 101
2.1.
Schéma expérimental et démarche analytique adoptés ............................................. 101
2.2.
Protocole d’exposition des bryophytes et des DGT................................................... 102
2.3.
Sélection des sites d’étude ......................................................................................... 105
2.4.
Caractérisation du milieu .......................................................................................... 106
2.5.
Calage du modèle cinétique sur les données expérimentales.................................... 108
3. RESULTATS..................................................................................................................... 109
3.1
Comparaison inter-sites de la spéciation du Cu dissous ........................................... 109
3.2
Comparaison inter-sites des fractions de Cu bioaccumulé à t = 7 jours .................. 111
4. DISCUSSION .................................................................................................................... 112
4.1
Spéciation et bioaccumulation du Cu : les DGT mesurent-elles la fraction de métal
bioaccumulable (i.e. biodisponible) ?................................................................................... 112
4.2
Validation de l’approche intégrée (couplage DGT – BLM)...................................... 115
5. CONCLUSION : INTERET DE L’APPROCHE INTEGREE (BLM – DGT) POUR SURVEILLER IN
SITU LA CONTAMINATION EN METAUX BIODISPONIBILES DANS LES EAUX DE REJETS INDUSTRIELS
117
CONCLUSION ET PERSPECTIVES....................................................................................... 121
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES .................................................................................. 126
ANNEXES .................................................................................................................................... 135
1.
ARTICLES ........................................................................................................................ 135
ARTICLE 1 .................................................................................................................................. 137
ARTICLE 2 .................................................................................................................................. 160
ARTICLE 3 .................................................................................................................................. 183
2.
PRELEVEMENTS ET ANALYSES ................................................................................. 203
2.1
Mesure de Cu par Spectrométrie d’Absorption Atomique four (SAA-four) .............. 203
2.1.1
Prélèvements et conditionnement des échantillons pour analyse du Cu dissous .. 203
2.1.2
Principe de la mesure par SAA-four...................................................................... 204
2.2
Principe et procédure de la mesure de Cu labile par voltamétrie à redissolution
anodique sur électrode à goutte de mercure (DP-ASV) ........................................................ 207
2.3
Mesure du cuivre bioaccumulé dans les bryophytes.................................................. 209
2.3.1
Collecte et conditionnement des mousses aquatiques ....................................... 209
2.3.2
Extraction des fractions adsorbées et internalisées........................................... 209
2.4
Analyses physico-chimiques de l’eau......................................................................... 211
2.4.1
Cations majeurs ................................................................................................. 211
2.4.2
Carbonne Organique Dissous (COD) ............................................................... 211
2.5
Protocole d’extraction sur colonne (XAD-8 ET XAD-4) des MOD de Seine :.......... 211
2.6
Composition cationique et localisation des 80 stations sélectionnées : .................... 214
RESUME ...................................................................................................................................... 220
ABSTRACT.................................................................................................................................. 220
7
8
Liste des Abréviations
LISTE DES ABBREVIATIONS
BLM
Biotic Ligand Model
CEMAGREF CEntre national du Machinisme Agricole, du Génie Rural, des Eaux et des Forêts
CEREGE
Centre Européen de Recherche et d’Enseignement des Géosciences de l’Environnement
C Dissous
C Labile
C Inerte
COD
COP
COT
Concentration en Cu dissous (labile + inerte) dans l’eau filtrée (µg/L)
Concentration en Cu libre ou faiblement fixé sur les ligands organique et inorganique (µg/L)
Concentration en Cu fixé sur les matières organiques (µg/L)
Carbone Organique Dissous (mgC/L)
Carbone Organique Particulaire (mgC/L)
Carbone Organique Total (mgC/L)
DCE
DGT
DP-ASV
Directive Cadre Européenne sur l’eau
Diffusion Gradient in Thin films
Differential Pulse Anodic Stripping Voltametry
EDF
Electricité De France
FIAM
Free Ion Activity Model
ISE
Ion Selective Electrode
IHSS
International Humic Substances Society
J Bioacc
J Ads
J Int
Flux d’adsorption du Cu sur l’organisme (µg.g-1.h-1)
K C BL
Constante d’affinitié d’un cation Ci sur les sites extra-cellulaires – BL1 de la membrane biologique
i
1
Flux total (adsorbé + internalisé) de bioaccumulation du Cu par l’organisme (µg.g-1.h-1)
Flux d’internalisation du Cu dans l’organisme (µg.g-1.h-1)
(L/molBL)
K MOD
Constante d’affinité à l’équilibre décrivant la fixation du métal sur le carbone organique
dissous (L/mgC)
MES
MIM
MO
MOD
MOP
MON
Matières En Suspension
Module Intégrateur de Micropolluants
Matière Organique
Matière Organique Dissoute
Matière Organique Praticulaire
Matière Organique Naturelle
PEC
PNEC
Predicted Environmental Concentration
Predicted No Effect Concentration
US EPA
United States Enviornmental Protection Agency
SAA
Spectrométrie d’Absorption Atomique
WQS
Water Quality Standard
9
10
Introduction
INTRODUCTION GENERALE
Certaines substances chimiques issues de l’activité humaine (industrielle, agricole, urbaine…) sont
susceptibles de contaminer à court ou moyen terme l’environnement, et à plus long terme d’altérer la
qualité des écosystèmes aquatiques. L’évaluation et la gestion du risque environnemental associé aux
rejets de micropolluants aux faibles niveaux de concentrations dans les écosystèmes aquatiques, est une
approche qui nécessite l’intégration de nombreuses connaissances dans le domaine de l’environnement.
L’eau en particulier est un vecteur majeur des contaminants anthropiques et par conséquent les
écosystèmes aquatiques sont un récepteur des micro-polluants. Le transport (lacs, rivières…) et les
transformations (biodégradation, hydrolyse, photolyse…) de ces polluants ainsi que l’évaluation de
leurs effets sur les composants des écosystèmes aquatiques doivent être intégrés dans une démarche
d’évaluation des risques.
Dans ce contexte environnemental complexe, la caractérisation du risque environnemental occasionné
par le rejet de micro-polluants dans un écosystème aquatique requiert l’étude d’une part, de l’exposition
à laquelle il est soumis (niveaux de concentrations) et d’autre part, du danger associé à la substance
(effets toxiques sur les composantes de l’écosystème (Sutter 1993)).
Contrairement aux polluants organiques susceptibles de se dégrader, les pollutions métalliques sont
persistantes. C’est pourquoi l’étude de leur mobilité et de leur transfert est de première importance. En
ce qui concerne l’effet potentiel des métaux sur les organismes aquatiques, de nombreuses études ont
montré qu’ils peuvent être toxiques à l’état de trace, mais aussi que la seule connaissance des
concentrations totales en métaux dans l’environnement ne permet pas d’évaluer leur effet potentiel sur
les organismes. La biodisponibilité 1 des métaux est étroitement liée aux formes chimiques auxquelles
les organismes sont exposés (Anderson et al. 1978; Morel 1983). L’étude de la spéciation chimique des
métaux traces dans les eaux (Buffle 1988) et leur répartition dans les différentes fractions (particulaires,
colloïdales et dissoutes) apparaissent indispensables pour mieux comprendre les facteurs contrôlant
leur transfert dans les écosystèmes et leur biodisponibilité pour les organismes aquatiques (Tessier et al.
1995). Néanmoins, en milieu aquatique naturel, la complexité des réponses d’un organisme suite à
l’exposition à un métal est telle que, même si on connaît les différentes formes chimiques présentes en
solution, l’effet ne peut être entièrement compris par l’approche chimique seule. Afin de comprendre
les facteurs qui gouvernent la biodisponibilité, la seconde approche consiste à mesurer la réponse d’un
organisme aquatique suite à l’exposition à un polluant. A l’heure actuelle, les tests in vitro donnent une
1
La biodisponibilité désigne « la fraction de produit chimique présent dans le milieu environnemental qui est disponible
pour être accumulée par les organismes » (G. M. Rand, P. G. Wells et L. S. Mc Carthy. 1995. Introduction to Aquatic
Toxicology. Effects, environmental fate and risk assesment., London, pp. 3-67: Taylor and Francis).
11
Introduction
information intégrée sur l’effet potentiel des polluants présents. La mise en relation de la spéciation
physico-chimique et de la biodisponibilité pour des organismes vivants, sur laquelle peu d’études de
terrain existent à l’heure actuelle, semble indispensable.
A partir des années 1970, la combinaison de ces deux approches, à la fois chimique (spéciation
chimique) et biologique (biotest sur organismes) a permis de mettre en évidence le lien entre la
spéciation des métaux et leur biodisponibilité pour les organismes aquatiques. Ce type d’étude a
maintes fois été reproduit en laboratoire, pour différents métaux, différents organismes du milieu
aquatique, et a donné lieu pour les métaux à une interprétation mécanistique formalisée dans deux
familles successives de modèles, le modèle de l’ion libre (Morel 1983), puis le modèle du ligand
biologique (Di Toro et al. 2001).
Le présent travail s’inscrit dans le contexte de la contamination métallique des écosystèmes aquatiques
par les pollutions diffuses d’origine industrielle. Pour refroidir les réacteurs de certains centrales
nucléaires, Electricité de France (EDF) utilise des condenseurs en laiton (alliage Cu/Zn) qui subissent
une érosion avec le temps. Du fait de cette corrosion, les eaux de refroidissement rejetées dans les
rivières contiennent du Cu et du Zn, dans des proportions pouvant atteindre quelques kilogrammes par
unité de production et par jour (Edf - Division Production Nucléaire 2008). Depuis plusieurs années,
EDF s’intéresse à l’emploi de bioindicateurs (e.g. les bryophytes aquatiques) pour surveiller la
contamination métallique biodisponible de ces rejets, fortement enrichis en métaux. Plus récemment, le
département environnement de la direction des études et recherches de EDF cherche à simplifier et
fiabiliser sa procédure de suivi, de manière à anticiper les réglementations qui découleront de la
nouvelle directive cadre européenne (DCE) visant à imposer le suivi des concentrations en métal
biodisponible des installations industrielles. Récemment, des systèmes d’échantillonnage appropriés (la
technique du gradient de diffusion en couche mince - DGT) (Davison et al. 1994) ainsi que des outils
de modélisation (Biotic Ligand Model - BLM) ont été intensivement développés afin de prédire la
biodisponibilité de certains métaux en milieu aquatique en fonction des paramètres de qualité d’eau.
Cette étude a pour objectif d’évaluer la capacité de ces deux approches (la technique DGT, et le Biotic
Ligand Model) à mesurer les fractions métalliques bioaccumulables par les bryophytes (et donc
biodisponibles) en fonction des paramètres de qualité d’eau (matières organiques naturelles, cations
majeurs, pH, ...).
Pour cela, ces approches seront testées in vitro, et feront l’objet de quatre campagnes de validation in situ
sur des sites où le milieu récepteur est de qualité physico-chimique est contrastée.
12
13
14
Synthèse bibliographique
Chapitre I.
METHODES D’ESTIMATION DE LA SPECIATION ET
BIODISPONIBILITE DES METAUX EN MILIEU
AQUATIQUE
1. SPECIATION DES METAUX EN MILIEU AQUATIQUE
En milieu aquatique naturel, les micropolluants existent sous forme dissoute ou particulaire et
s’associent aux différentes espèces chimiques en solution. Les micropolluants organiques s’associent
préférentiellement aux molécules hydrophobes, alors que les micropolluants métalliques forment des
complexes avec de nombreux ligands (organiques et inorganiques), ou s’adsorbent sur des surfaces
minérales ; le métal dissous sous la forme ionique, dite libre, subsiste alors en faible proportion.
1.1
Processus contrôlant la spéciation des métaux en milieu aquatique
Les eaux naturelles contiennent un mélange de cations majeurs, de ligands inorganiques (e.g. OH-, Cl-,
SO42-, HCO3-, PO43-) et organiques (e.g. substances humiques et fulviques) en solution. De plus, les
éléments dissous sont en contact avec les particules du sol, des sédiments ou matières en suspension,
qui agissent comme des surfaces d’échange complexes. Le comportement d’un métal dans un
écosystème aquatique dépend donc des conditions physico-chimiques du milieu, et il peut exister sous
différentes formes, réparties entre la phase dissoute et la phase particulaire (Buffle 1988; Tessier et al.
1995; Stumm et al. 1996) :
•
ion libre hydraté ;
•
complexé par des ligands inorganiques ;
•
complexé par des ligands organiques ;
•
complexé à des molécules organiques de haut poids moléculaire (substances humiques et
fulviques, polysaccharides) ;
•
adsorbé sur des colloïdes ou particules inorganiques (FeOOH, Fe(OH)3, oxydes de Mn,
Ag2S, argiles, ...) et organiques ;
•
précipité, co-précipité ;
•
adsorbé sur des particules organiques, reste d’organismes vivants ...
15
La Figure 1 (Buffle 1988) illustre les principales interactions entre les éléments traces métalliques et les
différents ligands (particules, composés inorganiques, organismes), influençant la spéciation des métaux
en milieu aquatique.
Colonne d’eau
Phase dissoute
Phase particulaire
Complexes organiques :
Organismes vivants :
Ex. Poissons, micro-crustacés, phytoplancton,
…
M j(Lorg )i n-i
Ex : Acides Humiques,
Colloïdes,
EDTA4-, …
Métal libre
hydraté
M(H2O)xZ+
Particules inorganiques /
organiques :
Complexes inorganiques :
Mj(Linorg)in-i
M
Ex : Cl- , CO32-, SO42-
Adsorpion, échange d’ions
Ex : argile, débris
d’organismes vivants, …
Sédimentation
Sédiments
Figure 1. Principales interactions d’un métal M avec les constituants particulaires, organiques et inorganiques et
les organismes vivants du milieu aquatique. D’après Buffle (1988).
Les trois types d’interactions contrôlant la spéciation des métaux en milieu aquatique sont : la
précipitation, l’adsorption et la complexation.

La précipitation : C’est le passage d’une espèce de l’état dissous à l’état solide. Les métaux
peuvent précipiter dans l’eau intersticielle ou à la surface des particules solides. En milieu
aquatique naturel, les métaux précipitent principalement sous forme d’hydroxyde, de
carbonates, de phosphates ou de sulfures. Les équilibres de précipitation sont gouvernés par les
produits de solubilité (KS) :
Eq. 1
K S = ( A ) x .( B ) y
où : (A) et (B) représentent les activités des espèces dans le liquide et x et y leur stœchiométrie
respectives. Le solide précipite quand le produit de solubilité est dépassé.
16

L’adsorption : l’adsorption physique (ou physisorption) est le phénomène par lequel des métaux
se fixent sur la surface solide d’un substrat. Certains minéraux, comme les argiles ou les zéolites,
sont d’excellents adsorbants, grâce à leurs très grandes surfaces spécifiques. On appelle
désorption le processus inverse de l’adsorption, par lequel les métaux adsorbés se détachent du
substrat. L’adsorption physique (ou physisorption) est attribuable à l’attraction électrostatique
d’un soluté par une surface polarisée, afin de maintenir l’électroneutralité. Les énergies de
liaisons mises en jeu sont relativement faibles, du type forces de Van der Waals. Les espèces
ainsi adsorbées gardent les molécules d’eau qui leur sont associées. L’adsorption physique est
généralement facilement réversible (Manceau et al. 2002).

La complexation (ou chimisorption) : le métal adère à la suface des particules par liaisons
ioniques ou covalentes. Elle est souvent difficilement réversible. Cette liaison est spécifique,
c’est-à-dire qu’elle n’est possible qu’entre éléments ayant une configuration électronique
adaptée (Sigg et al. 2000). On parle de complexation de surface lorsqu’un ion métallique réagit
avec un groupement anionique qui fonctionne comme un ligand inorganique (comme OH-, Cl-,
SO4-, CO32-) ; ainsi ces sites de surface forment des liaisons chimiques avec les ions en solution.
La matière organique dans les eaux naturelles est aussi une source importante de ligands
complexants pour les métaux, en particulier pour le cuivre. Le rôle particulier de ces substances
organiques plus complexes est abordé plus en détail dans le paragraphe suivant (cf. § 1.2).
1.2
Pouvoir complexant de la matière organique - Interactions entre matière organique et
métaux en milieu aquatique naturel
En milieu aquatique, la biodisponibilité et la toxicité des métaux dépend généralement des formes
chimiques dans lesquelles ils se trouvent dans le milieu, les rendant plus ou moins accessible aux
organismes. Il est donc nécessaire de pouvoir décrire sous quelles formes le polluant se trouve dans le
milieu, i.e. de connaître sa spéciation. En plus des ligands inorganiques cités plus haut, les eaux
naturelles présentent aussi de nombreux ligands organiques susceptibles de complexer fortement les
métaux et de modifier leur spéciation (cf. Figure 1).
On peut généralement distinguer, par filtration (communément à 0.45 µm ou 0.7µm), deux types de
matières organiques : la matière organique dissoute (MOD) et la matière organique particulaire (MOP).
La quantification de la MO dans le milieu aquatique se fait par la mesure des concentrations en carbone
organique. Selon l’échantillon, on mesure le carbone organique total (COT, échantillon liquide brut), le
carbone organique particulaire (COP, analyse du filtre) ou le carbone organique dissous (COD,
échantillon après filtration). Dans les eaux souterraines, les concentrations en COD peuvent varier
entre 0.1 mgC/L et plusieurs centaines de mgC/L dans les eaux brutes (Buckau et al. 2000; Fest et al.
17
2007). Selon les conditions hydrologiques et la saison, les concentrations de COD en rivière sont très
variables. Dans les eaux de surfaces, le COD varie généralement entre 2 et 10 mgC/L (Peuravuori et al.
1997). En rivière, le COD représente généralement 90% du carbone organique total (COT) (Thurman
1985). Cependant, en période de forte poussée algale ou bactérienne, la fraction de COP peut
représenter jusqu’à 50% du COT (Wetzel 1983).
La matière organique naturelle (MON 1) observable dans les eaux naturelles possède une très grande
variété de propriétés et est constituée d’un mélange extrêmement complexe de composés dont au
moins 80% ne sont pas structurellement identifiés à l’heure actuelle (Garnier 2004). La matière
organique naturelle dissoute des eaux naturelles présente souvent une structure complexe qui englobe
une grande diversité de composés (Sigg et al. 1992). Les acides organiques de faible taille comme les
acides aminés, les acides carboxyliques, etc., mais aussi des ligands macromoléculaires comme les
protéines, les glucides, etc. en font partie. Ces composés organiques contiennent les groupes
fonctionnels -COOH, -OH, -NH2 et -SH qui sont facilement caractérisables par les techniques
classiques d’analyse (Garnier 2004).
De part cette forte variabilité naturelle, les interactions des métaux avec les MON sont complexes et
déterminantes pour comprendre le devenir de ces contaminants dans l’écosystème. De surcroît, la forte
affinité des MON vis à vis des métaux est également valable pour les autres cations présents dans l’eau
naturelle (calcium, magnésium, sodium, proton, ...) : cela se traduit par des effets compétitifs entre les
métaux et les cations pour se fixer sur les sites complexants de la MON (Lu et al. 2002; Garnier 2004).
Par exemple, ces effets compétitifs se traduisent, par une désorption progressive du métal lorsque les
concentrations en cations (ou en protons) augmentent en solution. Par conséquent, pour correctement
comprendre l’influence d’une MON sur la spéciation d’un métal, il faut aussi connaître ses affinités visà-vis de l’ensemble des espèces cationiques présentes en milieu aquatique (cations majeurs et
métalliques).
Pour comprendre l’effet de ces MON sur la spéciation des métaux, différentes techniques analytiques
existent. Elles reposent principalement sur la mesure de la concentration en métal libre ou faiblement
complexé avec les ligands inorganiques ou organiques (fraction labile). Certaines de ces techniques
utilisent des protocoles d’extraction (dites techniques séparatives du métal ou de la MON) alors que
d’autres peuvent s’appliquer directement à un échantillon (non séparatives).
La MON regroupe l’ensemble des matières organiques d’un écosystème naturel, autres que les organismes vivants et les
composés d’origines synthétiques, donc anthropiques (Buffle, 1988).
1
18
2. METHODES DE MONITORING DE LA SPECIATION ET DE LA
BIODISPONIBILITE DES METAUX DANS LES ECOSYSTEMES AQUATIQUES
2.1
Analyse et modélisation de la spéciation des métaux traces
Le terme labile est généralement défini par rapport à une méthode analytique donnée et reflète la
réactivité d’une espèce donnée. De façon générale, ce qui est labile correspond ainsi aux espèces
aisément modifiables, échangeables, en interaction facile et rapide avec la solution environnante. Par
conséquent, cette fraction comprend généralement les espèces libres ainsi que des complexes peu
stables (Tusseau-Vuillemin et al. 2003).
Dans le cas des métaux en solution, on distingue généralement deux grandes catégories de méthodes de
spéciation : les méthodes séparatives et les méthodes électrochimiques non séparatives (Buffle 1988).
Les méthodes séparatives s’attachent à quantifier la fraction libre ou labile en la séparant, soit parce
qu’elle est de petite taille (ions dissous), qu’elle est chargée positivement (cations métalliques) ou que les
complexes labiles sont capables de se dissocier pour échanger le métal. D’autre part, les méthodes
électrochimiques permettent de mesurer spécifiquement l’ion libre et/ou les complexes labiles. Enfin,
dans certains cas simples, comme des solutions inorganiques ou contenant des ligands organiques
connus (EDTA par exemple, voire certaines substances humiques), des modèles permettent de simuler
la spéciation d’un élément (Benedetti et al. 1995; Tipping 1998; Gustafsson 2001). En revanche, pour
des cas plus complexes (e.g. en présence de matières organiques plus complexes telles que les MON),
plus représentatifs des écosystèmes aquatiques, ces modèles sont difficilement applicables.
2.1.1
Les techniques électrochimiques non séparatives
D’une manière générale, on considère souvent que la fraction de métal labile regroupe l’ensemble des
complexes métalliques (inorganique ou organique) pouvant s’échanger facilement et s’équilibrer
rapidement avec la solution environnante (Tusseau-Vuillemin et al. 2003; van Leeuwen et al. 2005).
Cette définition touche aux propriétés cinétiques des réactions de formation et de dissociation des
complexes et s’appuie sur des méthodes analytiques d’observation.
Les méthodes électrochimiques (potentiomètrie et voltampérométrie), intensivement développées
depuis les années 70, reposent sur la mesure d’un courant induit par l’oxydation ou la réduction de l’ion
métallique à une électrode. Le terme labile fait alors référence à l’ensemble des complexes métalliques
(inorganiques et organiques) capables de se dissocier au voisinage de l’électrode, pendant le temps
caractéristique de la mesure (Guthrie et al. 2005; van Leeuwen et al. 2005).
Parmi les méthodes électrochimiques, on distingue celles qui sont basées sur des mesures de potentiel
de membrane (la potentiométrie) de celles basées sur l’interprétation des courbes intensité de courant différence de potentiel obtenue pour une concentration donnée (voltamétrie).
19
2.1.2
La potentiométrie
La méthode potentiométrique la plus couramment utilisée, l’électrode spécifique (ISE-Ion Selective
Electrode), mesure la différence de potentiel (par rapport à une électrode de référence) existant de part
et d’autre d’une membrane perméable à l’ion étudié. Cette différence de potentiel est liée à la différence
d’activité de l’ion étudié entre les deux solutions (Mota et al. 1995). L’utilisation d’une ISE présente le
double avantage (i) de mesurer la concentration en ion libre stricto sensu, (ii) sans perturber la spéciation
de la solution (i.e. sans affecter l’équilibre de la solution). Des ISE existent pour Cd, Cu, Pb et Ag
principalement. Son principal désavantage réside dans ses limites de détection assez éloignées des
faibles concentrations couramment rencontrées en milieu aquatique naturel. En effet, ces électrodes
spécifiques permettent généralement une mesure fiable du métal libre pour des concentrations
supérieures à 10-6 M (Mota et al. 1995), alors que par exemple des concentrations de l’ordre de 10-12 M
pour Cd2+ (Xue et al. 1998) sont observables dans des eaux naturelles.
2.1.3
La voltamétrie – l’exemple de la DP-ASV
La voltamétrie repose sur la mesure du courant induit par la réduction de l’ion métallique à l’électrode
(l’électrode de mercure est la plus fréquemment utilisée). Dans ce cas, la fraction de métal labile
mesurée correspond à l’ensemble des espèces métalliques (ions libres, complexes inorganiques et
quelques complexes organiques) susceptibles de se dissocier au voisinage de l’électrode, pendant le
temps caractéristique de la mesure (van Leeuwen et al. 2005).
La DP-ASV (voltamétrie impulsionnelle différentielle à re-dissolution anodique) est souvent utilisée
dans les eaux naturelles du fait de sa bonne sensibilité. Elle s’effectue en deux étapes principales. Tout
d’abord, une étape de réduction permet de concentrer les métaux dans la goutte de mercure (formation
d’amalgames M-Hg) par une pré-électrolyse à potentiel fixe suffisamment faible pour réduire
électrochimiquement les ions métalliques en solution (libres ou complexés). Ensuite, un balayage de
potentiel vers les valeurs supérieures permet la réoxydation du métal amalgamé et fait apparaître par
voltampérométrie anodique un signal de courant à un potentiel spécifique de l’élément métallique préconcentré. Des concentrations très faibles peuvent être déterminées par cette méthode (10-9 – 10-10 M),
en particulier en allongeant le temps de pré-électrolyse.
D’une manière générale, les méthodes électrochimiques citées ci-dessus, ont en commun de ne pouvoir
être mise en oeuvre que par des spécialistes de l’électrochimie, à des niveaux de concentration parfois
contraignants, d’être difficilement utilisables directement en milieu naturel, ou bien de nécessiter un
traitement préalable de l’échantillon.
20
2.1.4
Les techniques séparatives – l’exemple de la technique DGT
Davison et Zhang (Université de Lancaster, GB) ont développé, dans les années 90, une nouvelle
technique de mesure de l’ion libre et de son cortège de complexes labiles (Davison et al. 1994)
permettant de s’affranchir d’un certain nombre des difficultés liées aux méthodes électrochimiques
citées ci-dessus. L’attrait pour cette technique tient à ce qu’elle est d’un usage particulièrement simple et
s’utilise directement in situ, sans modification de l’échantillon, en intégrant la contamination dans le
temps si celle-ci est variable.

Principe de la méthode
Le sonde DGT est composé d’un dispositif comprenant un gel diffusif et une résine échangeuse d’ions
(Chelex-100), capable de fixer de manière irréversible les cations métalliques, maintenus accolés entre le
support en téflon et la bague scellante (cf. Figure 2).
Bague scellante
Figure 2. Schéma descriptif d’un
dispositif DGT démonté.
A : surface du gel en
contact avec la solution
Δg : épaisseur du gel
Gel diffusif
Résine chelatrice
(Chelex-100)
Support téflon
Le gel diffusif, dans une configuration classique, est composé par un gel d’agarose contenant un
polymère de polyacrylamide. Il permet la diffusion de l’ensemble des espèces dissoutes, non colloïdales,
de manière similaire à leur diffusion dans l’eau (Zhang et al. 1999).
D’après Davisson et Zhang (1994), la quantité de métal accumulée pendant l’exposition sur la résine est
liée à la concentration en métal labile de la solution selon l’équation suivante :
Eq. 2
C DGT =
M.Δg
t.A.D
où :
- M est la quantité de métal accumulée sur la résine (ng)
- Δg représente l’épaisseur du gel diffusif (mm)
- t représente la durée d’exposition du dispositif dans la solution (s)
- A est à la surface du gel en contact avec la solution (cm²)
- D est le coefficient de diffusion du métal dans le gel (10-6 cm².s-1)
Expérimentalement, nous évaluons la quantité M de métal accumulé après élution de la résine dans une
solution d’acide nitrique (1 M). La concentration de l’éluat est dosée par absorption atomique et
ramenée à la masse M selon la relation suivante :
21
où :
Eq. 3
M=
- Ce est concentration en métal dans l’éluat (µg.L-1)
C e × (Ve + Vr )
Fe
- Ve et Vr sont les volumes de l’éluat et de la résine (mL)
- Fe représente le rendement de l’élution (estimé à 80%
par Zhang et al., (1995))

Labilité des espèces mesurées par la technique DGT
En solution, le métal est en équilibre avec ses différents complexes. On considère généralement que
l’ensemble des complexes métalliques présents en solution peuvent diffuser au travers du gel tout en
restant en équilibre dynamique avec leur forme dissociée. En revanche, seule une fraction de ces
complexes est capable de se dissocier au cours de leur migration au travers du gel diffusif, pour se fixer
sur la résine. Ces complexes sont dits labiles (facilement dissociables, échangeables) et sont donc
potentiellement mesurables par la DGT.
La dissociation des complexes labiles puis la fixation du cation métallique sur la résine crée un gradient
de concentration à l’intérieur du gel (de la solution vers résine). L’allure du gradient de concentration
est fonction de la concentration du métal en solution ainsi que de sa labilité (i.e. de la capacité du métal
complexé à se dissocier pour venir se fixer sur la résine) (Figure 3). De manière générale, plus la
constante de dissociation kdis du complexe métallique est élevée, plus le complexe est labile. Ceci
correspond à la définition de la labilité comme faisant référence à la stabilité des complexes.
Solution
[ML] Inerte
Resin Layer
Plastic Holder
Diffusive gel
[M] S
t
me n
i elle
t
r
a
] P
[ML
e
labil
ML
kf kdis
L]
[M
e
bi l
La
fixé sur
la résine
M
+
L
Diffusion of ML
DML
Diffusion of M & L
DM , DL
ML
kf
kdis
M
+
L
x axis
x=R
x=N
x=S
Figure 3. Représentation schématique du gradient de concentration des espèces métalliques en fonction de leur
labilité, d’après Tusseau-Vuillemin et al. (2003).
En considérant le métal en équilibre dynamique avec son complexe au cours de la diffusion dans le gel
(cf. le schéma réactionnel représenté sur la Figure 3), l’évolution cinétique de la concentration des
22
différentes espèces (le métal M, le ligand L et leur forme complexée ML) en tout point x du gel
s’exprime à partir de la seconde loi de Fick 1 (Tusseau-Vuillemin et al. 2003) tel que :
Eq. 4
où :
∂²[ M ]x
⎧ ∂[ M ]x
⎪ ∂t = D M ∂x ² + ( kdis [ ML ]x − k f [ M ]x [ L ]x )
⎪
∂²[ L ]x
⎪ ∂[ L ]x
= DL
+ ( kdis [ ML ]x − k f [ M ]x [ L ]x )
⎨
∂x ²
⎪ ∂t
∂²[ ML ]x
⎪ ∂[ ML ]x
= D ML
+ ( −kdis [ ML ]x + k f [ M ]x [ L ]x )
⎪ ∂t
∂x ²
⎩
- kdis et kf sont les constantes cinétiques de dissociation et de formation associées à l’équilibre
entre ligand, métal libre et métal complexé
- DM, DL et DML sont les coefficients de diffusion au travers du gel du métal M du ligand L et de
leur forme complexée ML.
L’analyse formelle de système d’équations nous permet, par intégration de ces équations à l’état
stationnaire, d’écrire le flux d’accumulation du métal J sur la résine comme suit :
J=
Eq. 5
1
1
D ML ([ ML ]S − [ ML ]N ) + D M [ M ]S
Δg
Δg
Δg représente l’épaisseur du gel, et les indices S et N réfèrent respectivement aux
où :
concentrations en solution et au voisinage de la résine (cf. Figure 3).
Les cinétiques de formation - dissociation (kf et kdis) au cours de la diffusion dans le gel permet de
distinguer trois catégories de complexes :

les complexes labiles qui se caractérisent par des cinétiques d’échange rapides avec les ligands.
L’ensemble de ces complexes labiles sont rapidement dissociés au cours de leur diffusion au
travers du gel, et les cations métallique ainsi dissociés sont fixés sur la résine. Le complexe
arrive sous forme dissociée au niveau de la résine ([ML]x=N = 0). L’ensemble du métal est alors
fixé sur la résine. Cette concentration nulle au voisinage de la résine induit un flux de métal
accumulé sur la résine proportionnel à la concentration en métal total dans la solution
([M]S+[ML]S). Si l’on considère que DM ~ DML , l’Eq. 5 se simplifie :
Eq. 6
1
J=
1
DM ([ M ]S + [ ML ]S )
Δg
La seconde loi de Fick décrit la diffusion des espèces
23
Dans ce cas, on mesure la concentration de métal libre majorée de la concentration en
complexes entièrement labiles. C’est le cas, par exemple, des complexes inorganiques comme
les hydroxydes ou les carbonates (Gimpel et al. 2001) et de quelques complexes organiques peu
stables comme le complexe Cu-citrate (Tusseau-Vuillemin et al. 2003).

les complexes partiellement labiles qui se caractérisent par des cinétiques de dissociation
lentes. Dans ce cas, les concentrations en complexes au voisinage de la résine sont plus faibles
que celles rencontrées dans la solution ([ML]x=N < [ML]x=S), mais non nulles ([ML]x=N ≠ 0). La
concentration des complexes au voisinage de la résine dépend alors du coefficient de labilité (ζ )
tel que : ([ML]x=N = (1- ζ) ([ML]x=S).
En considérant que DML ~ DM , l’Eq. 5 se simplifie alors :
J=
Eq. 7
1
DM ([ M ]S + ξ[ ML ]S )
Δg
On mesure donc une fraction labile comprenant le métal libre et une partie du complexe
capable de se dissocier et donc partiellement labile. C’est notamment le cas des complexes avec
les acides fulviques (Unsworth et al. 2005) ou humiques (Ferreira et al. 2008).

les complexes inertes qui se caractérisent par un équilibre entre métal libre M et le complexe
métallique ML, et des cinétiques de dissociation très lentes. Dans ce cas, le complexe arrive au
niveau de la résine sous forme non dissociée ([ML]x=N = [ML]x=S). Seul le métal libre se fixe à la
résine, et le flux d’accumulation du métal sur la résine s’écrit alors :
J=
Eq. 8
1
DM [ M ]S
Δg
On ne mesure que le métal libre en solution. Le complexe est alors dit inerte. C’est le cas des
complexes très stable comme Cu-EDTA (Tusseau-Vuillemin et al. 2003; Ferreira et al. 2008).
2.1.5

Les modèles de spéciation chimique
Modèles de spéciation inorganique
En plus des méthodes analytiques présentées ci-dessus, le développement de modèles
thermodynamiques ont facilité les études de spéciation des métaux en milieu aquatique. Ces modèles
utilisent les constantes thermodynamiques de stabilité de différents complexes connus, pour décrire et
24
prédire la distribution des espèces chimiques dans un milieu donné. Les calculs sont réalisés pour des
systèmes aqueux naturels ou reconstitués en laboratoire, sous l’hypothèse qu’ils soient à l’équilibre. Les
données indispensables à la modélisation se composent en général des concentrations totales dissoutes
des différentes espèces (métaux étudiés, ions majeurs) ainsi que d’autres données caractérisant le milieu
d’étude comme le pH, le potentiel rédox, ou encore la présence de composés solides pouvant se
solubiliser avant qu’un équilibre ne soit atteint. De nombreux exemples de ces modèles sont
disponibles dans la littérature et plusieurs programmes informatiques sont mis à la disposition des
utilisateurs. Parmi les modèles les plus couramment utilisés, on peut citer à titre d’exemple les
programmes FITEQL (Westall 1982), Visual MINTEQA2 (Allison et al. 1991) et MINEQL+
(Schecher et al. 1998).

Modèles de spéciation organique
Du fait de la forte hétérogénéité des macromolécules constituant la MON, leurs propriétés de
complexation des métaux traces sont fortement variables en fonction de sa nature (humique, fluvique,
algale, bactérienne, anthropique, ...).
Au cours des vingt dernières années, la réactivité des matières organiques a largement été étudiée, via le
développement de modèles thermodynamiques décrivant leurs propriétés acido-basiques et leurs
affinités vis à vis des métaux. A ce jour, les développements de ces modèles ont été effectués
principalement selon deux approches conceptuelles :
- soit les propriétés physico-chimiques des sites réactifs se distribuent de façon discrète : la MON
est représentée par des groupes de sites, chacun caractérisé par des propriétés de complexation,
d’acidité, ... C’est par exemple le cas du WHAM 1 (Tipping 1994; Lu et al. 2002) ou encore le
Stockholm Humic Model (Gustafsson 2001).
- soit les propriétés physico-chimiques des sites réactifs se distribuent de façon continue : dans ce
cas, la MON est représentée par un continuum de propriétés à l’aide d’une ou plusieurs
fonctions du type log(LT) = f(log(K)) (où LT est concentration totale en sites, K : constante de
complexation ou d’acidité). On peut, à titre d’exemple, citer le modèle NICA2 couplé avec un
modèle électrostatique Donnan (Benedetti et al. 1995; Benedetti et al. 1996; Kinniburgh et al.
1996).
Parmi ces modèles, le WHAM a particulièrement bénéficié d’un grand nombre de phases de
calibrations, de validations et d’améliorations dans le cadre des «Biotic Ligand Models » (plus détaillée
dans le § 3.2 de ce chapitre). Le WHAM est dans ce cas utilisé en amont du BLM pour les calculs de
complexation des métaux avec la matière organique.
1
2
WHAM : Windermere Humic Aqueous Model
NICA : Non Ideal Competitive Adsorption Model
25
3. OUTILS DE MONITORING DE LA SPECIATION ET LA BIODISPONIBILITE
DES METAUX EN MILIEU AQUATIQUE
3.1
Outils de biomonitoring – utilisation des bryophytes aquatiques comme
indicateurs de la biodisponibilité des métaux traces
3.1.1
Généralités sur l’emploi de bryophytes comme outils de biomonitoring
Du fait du caractère discontinu des rejets industriels et des conditions hydrologiques des cours d’eau,
les concentrations en métaux dans l’eau se caractérisent souvent par une forte variabilité spatiotemporelle. Malgré le développement de méthodes analytiques toujours plus sensibles aux faibles
niveaux de contamination, il s’avère dans ce cas délicat d’extrapoler des résultats obtenus à partir
d’échantillons instantanés, et d’établir des conclusions quant à l’état moyen de la pollution du milieu
aquatique. A partir des années 1970, l’attention s’est alors portée sur l’utilisation de compartiments
intégrateurs du milieu aquatique, tels que les bryophytes (ou mousses) aquatiques.
Dans le cadre de programmes de suivi des rejets en micro-polluants en rivière, on distingue
généralement deux méthodes pour l’emploi des bryophytes aquatiques. La première consiste en une
mesure directe du niveau de contamination des mousses autochtones, à savoir naturellement présentes
sur le site à étudier. La seconde consiste à transférer des bryophytes d’un milieu non pollué vers le site à
étudier.
L’éventail de micro-polluants détectables par les bryophytes est très large. Des études spécifiques en
laboratoire ou des suivis sur sites ont ainsi mis en évidence une bonne sensibilité des mousses
aquatiques pour la détection de traces métalliques variées tels que le cuivre (Mouvet 1987; Claveri et al.
1994; Gonçalves et al. 1998), le zinc (Mouvet 1987; Martins et al. 2002), le cadmium (Claveri et al.
1995; Croisetiere et al. 2005). Les bryophytes peuvent également être employées pour le suivi de rejets
radioactifs 1 ainsi que pour les rejets de micro-polluants organiques 2 (lindane, phencyclidine,
hexachlorocyclohexane). Elles ont été utilisées pour suivre des pollutions industrielles aériennes (Couto
et al. 2003) ou aquatiques (Bruns et al. 1997; Cenci 2001; Nimis et al. 2002; Samecka-Cymerman et al.
2002).
Ces organismes permettent d’obtenir une évaluation globale de la qualité environnementale du milieu et
des concentrations ambiantes de polluants. Cette dernière application est favorisée par le fait que de
nombreuses bryophytes aquatiques résistent à la toxicité en polluants et les accumulent dans leurs tissus
ce qui en fait de bons bioindicateurs (Mouvet 1984).
1
Gamme de radioisotopes étudiés :
51Cr, 54Mn, 58Co, 6OCo, 106Ru, 110Ag, 131I, 134C , 137Cs.
S
D’après (Maurel-Kermarrec et al. 1983; Baudin et al. 1991; Vray et al. 1992).
2
Gamme de micropolluants organiques détectés :
le lindane, la phencyclidine (PCP) et l’ Hexachlorocyclohexane (HCH)
(Mouvet et al. 1993).
26
Les mousses aquatiques présentent des caractéristiques morphologiques, tissulaires et écologiques qui
constituent des avantages non négligeables pour leur utilisation en tant qu’indicateur d’accumulation de
métaux traces. En effet, elles se caractérisent par une large répartition géographique, une pérennité
saisonnière et une stabilité spatio-temporelle des populations, une facilité de prélèvement, une forte
capacité d’accumulation, des cinétiques rapides d’accumulation et un échange direct entre les feuilles et
l’eau. De plus, elles sont fixes, ne possèdent pas de système racinaire mais puisent les nutriments au
travers des parties feuillées. Du fait de leur système d’alimentation, les feuilles, constituées le plus
souvent d’une couche unicellulaire, ne sont pas protégées par une cuticule ou des cires, ce qui ne limite
pas les échanges avec le milieu (Mouvet 1984; Claveri et al. 1995).
Les espèces les plus communément utilisées comme indicateurs d’accumulation des métaux traces en
milieu aquatique appartiennent à la classe des Musci, sous-classe des Bryidae et aux genres Fontinalis,
Rhynchostegium et Cinclidotus.
3.1.2
Cinétiques d’accumulation des métaux par les bryophytes
L’intérêt pour l’emploi des bryophytes aquatiques comme bioindicateurs de la pollution métallique des
cours d’eau a fait l’objet de nombreuses études au cours des trente dernières années. La capacité des
bryophytes à accumuler les cations métalliques est généralement attribuée aux propriétés d’échange
cationique de leur paroi membranaire. Breuer (1990) et Tyler (1990) attribuent cette capacité d’échange
cationique aux groupements carboxyliques, phénoliques et peptidiques présents sur la paroi
membranaire des bryophytes. La fixation (ou adsorption) des espèces cationiques sur ces sites est
l’étape préalable à la pénétration intracellulaire (étape d’internalisation) (Haynes 1980).
La pénétration intracellulaire des espèces métalliques se fait généralement par l’intermédiaire de sites de
transport. Les travaux antérieurs de Brown et al., (1990) et de Tyler (1990) montrent que
l’internalisation d’un élément est déterminée par son affinité pour ce site de transport, par la présence
éventuelle d’autres éléments en compétition pour le même site, et par le taux de turn-over du site. La
pénétration intra-cellulaire des éléments est généralement plus lente que l’étape d’adsorption sur les
sites extracellulaires. Brown et al. (1990) montrent que cette internalisation est à la fois régulée par un
transport actif, dépensant de l’énergie et probablement la concentration intracellulaire de l’élément
(effets de saturation).
Selon les conditions d’exposition, l’évolution cinétique des teneurs en métaux dans les mousses nous
permet théoriquement de distinguer deux phases (Figure 4):

A. La phase d’accumulation :
Dans ce cas, une augmentation des concentrations en métal en solution se traduit par une accumulation
rapide durant une période variant de quelques heures à quelques jours, selon les conditions
27
expérimentales. La vitesse d’accumulation durant cette phase est interprétée comme la résultante d’un
mécanisme physico-chimique d’adsorption au niveau des sites de fixation de la paroi membranaire,
suivie d’une internalisation plus lente qui tend vers un plateau d’équilibre (Figure 4. A). De
nombreuses études en laboratoires (Mouvet 1987; Claveri et al. 1994; Gonçalves et al. 1998; Martins et
al. 2004; Croisetiere et al. 2005) ont permis de montrer que le plateau d’équilibre vers lequel tendent les
concentrations dans les mousses dépend principalement de la concentration en métal dans la solution
d’exposition.

B. La phase de relargage (ou décontamination) :
A l’instar de la cinétique d’accumulation, le mécanisme de relargage des métaux par des bryophytes
contaminées, placés dans un milieu non contaminé, se décompose également selon deux étapes
(Mouvet 1987; Claveri et al. 1994; Gonçalves et al. 1998; Martins et al. 2004; Croisetiere et al. 2005)
(Figure 4.B). La première étape correspond à une désorption rapide du métal fixé sur les sites extracellulaires. La seconde, traduit une lente excrétion du métal intra-cellulaire vers la solution. Ce pseudoéquilibre reflète la forte capacité accumulatrice des bryophytes empêchant le relargage complet des
métaux internalisés (Mouvet 1987; Claveri et al. 1995). Cette propriété confère aux mousses la capacité
de conserver une empreinte d’un épisode de pollution passé, même lorsque celui-ci n’est plus
détectable dans l’eau.
(µg/gd.w )
A. ACCUMULATION
B. RELARGAGE
A dsorpt ion
C mousses
Int ernali sat ion
t0
t1
tf in= t’0 t’1
Durée
t’f in
(heures)
Figure 4. Evolution théoriques des concentrations en métaux lourds dans les mousses aquatiques (C mousses) au
cours des phases d’accumulation (contamination) et de relargage (décontamination). D’après Ciffroy et al., (1994)
et Claveri (1995).
28
3.1.3
Paramètres environnementaux influençant l’accumulation des métaux dans les bryophytes
Une revue bibliographique, nous permet d’identifier les différents paramètres environnementaux
(hydrauliques ou physico-chimiques) pouvant altérer les cinétiques d’échanges eau/bryophytes :

Paramètres hydrauliques
Du fait de la forte variabilité spatiale-temporelle des régimes hydrodynamiques des cours d’eau,
plusieurs études ont cherché à quantifier l’influence des conditions hydrauliques du milieu sur les
échanges de métaux à l’interface eau-bryophytes.
Par exemple, Mouvet (1987) a étudié l’influence de la vitesse du courant sur les cinétiques de relargage
du Pb, Zn et Ni par des mousses contaminées, transférées vers un site non pollué. Ces dernières sont
placées en deux points, où la physico-chimie de l’eau est identique, mais où les vitesses de courant sont
respectivement égales à 0,05 m/s et 1,30 m/s. On constate qu’à tout moment de l’expérience, les
mousses placées dans la zone à courant lent ont des concentrations en Pb et Zn supérieures, dans un
rapport variant de 1,5 à 2, à celles obtenues sur les mousses situées dans la zone à courant rapide.
L’influence des conditions hydrauliques sur les échanges eau/bryophytes est également confirmée par
des expériences de laboratoire. Ainsi, Claveri (1995) a étudié l’effet du débit sur les cinétiques
d’accumulation des métaux (Cu, Zn et Cr). Pour cette étude, une quantité définie de mousses est placée
dans un bac d’exposition alimenté en continu par une solution présentant une concentration constante
en métal (Cu, Zn ou Cr). Dans ces conditions, on constate que l’accumulation de Cu par les bryophytes
est d’autant plus rapide que le temps de renouvellement du milieu est court ; pour une durée
d’exposition de 9 jours, le niveau de contamination des mousses atteint respectivement 350, 550 et 950
µg.g-1 d.w..
Ces deux études semblent donc démontrer l’influence prépondérante des conditions hydrauliques du
milieu sur les échanges (accumulation et relargage) de métaux à l’interface eau/bryophytes. Toutefois,
Croisetière (2001) ont récemment démontré que ces observations comportaient probablement un biais
expérimental (des conditions d’exposition en continu étant difficiles à maintenir constantes) et que la
bioaccumulation dépendait peu du courant.
Cette dernière étude nous permet d’envisager des essais en conditions contrôlées et statiques, beaucoup
plus simples à mettre en œuvre pour étudier le lien entre la composition chimique des milieux et la
bioaccumulation par les mousses, observé en milieu naturel.

Les complexants
L’influence des matières organiques, et en particulier des substances humiques et fulviques, sur
l’accumulation des métaux dans les mousses aquatiques a fait l’objet de nombreuses études. Ainsi,
Wher et al. (1987) et Ferreira et al. (2008) ont montré qu’une teneur croissante en EDTA diminuait
l’accumulation de métaux par les bryophytes.
29
Il semble toutefois que l’effet des matières organiques sur la résultante finale des échanges
eau/bryophytes ne soit qu’une conséquence des modifications qu’elles induisent sur la spéciation des
micropolluants en solution. La grande complexité des matières organiques permet en effet de larges
possibilités de complexation, susceptibles de réduire la biodisponibilité et la bioaccumulation du métal
étudié.

Les compétiteurs « cationiques »
Comme décrit précédemment (cf. § 3.1.2), les processus d’accumulation et de relargage des métaux
entre l’eau et les mousses s’effectuent en partie par échanges de cations ; les diverses espèces
cationiques sont donc susceptibles d’entrer en compétition vis-à-vis des sites d’adsorption disponibles à
la surface des bryophytes.
De tels effets compétitifs ont été observés au cours de diverses expérimentations. Ainsi, Brown et
Beckett (1985) constatent une compétition par le Ca ou le Mg lors des processus d’accumulation du Cd
dans les mousses aquatiques (Rhytidiadelphus squarrosus). De même, les travaux de Say et Whitton (1983)
montrent que l’accumulation du Cu et du Zn dans les mousses aquatiques (Fontinalis antipyretica) est
inhibée par une augmentation des concentrations en calcium dans le milieu.
Plusieurs travaux (Vázquez et al. 2000; Fernandez et al. 2006) ont mis en évidence que les protons (H+)
sont également des compétiteurs des métaux pour l’accumulation des métaux par les mousses
aquatiques (Fontinalis antipyretica).
3.2 Le modèle de l’ion libre (FIAM 1) et ses dérivés (Biotic Ligand Model – BLM)
3.2.1
Le modèle de l’ion Libre
Comme tout composé chimique, l’effet des métaux sur les organismes aquatiques dépend de la dose à
laquelle ils sont exposés. Lorsqu’il s’agit d’un métal essentiel, aussi bien sa carence que son excès sont
dommageables pour l’organisme. Les premières observations de la biodisponibilité des métaux
reposent curieusement, non sur leur toxicité, mais au contraire sur leur carence pour certaines algues,
observée en particulier en milieu marin. La Figure 5 (Anderson et al. 1978), est restée célèbre et
particulièrement explicite ; ces travaux montrent que la croissance algale augmente avec les ajouts de
zinc, mais qu’un même effet biologique (ici un taux de croissance) peut être obtenu avec des
concentrations en zinc total variant de plusieurs ordres de grandeur (Figure 5 A.). En revanche,
lorsque ces concentrations sont exprimées en zinc libre (Zn2+) de manière à prendre en compte les
1
FIAM : Free Ion Activity Model
30
complexants ajoutés au milieu de culture, une relation quasi-univoque est obtenue entre l’effet
biologique et les concentrations d’exposition (Figure 5 B.).
Figure 5. Variation des taux de croissance d’une diatomée marine (Thalassiosira weissflogii) en fonction des
concentrations d’exposition de zinc exprimées (A) en métal total, (B) en métal libre (Zn2+). D’après Anderson et
al. (1978).
Ce type d’expérience, maintes fois répétées en laboratoire (pour différents métaux, différents
organismes du milieu aquatique), a permis de mettre en évidence le lien entre spéciation des métaux et
effet toxique. Ces travaux ont donné lieu à une interprétation mécanistique formalisée par Morel (1983)
dans le cadre du modèle de l’ion libre. Dans sa formulation, le FIAM suppose l’existence, à la surface
de l’organisme exposé au milieu, de sites spécifiques de fixation des métaux au travers desquels l’effet
biologique s’exprime. Une des hypothèses majeures est que l’effet biologique est proportionnel au
nombre de sites membranaires occupés par le métal, qui est en équilibre avec ces sites comme avec les
autres ligands de la solution. Le modèle de l’ion libre décrit les interactions existant entre le métal et
l’organisme (illustrée sur la Figure 6) selon trois étapes successives (Campbell 1995) :
- La diffusion du métal de la solution vers la surface de l’organisme ;
- La complexation (fixation) du métal sur les sites spécifiques ;
- Le transport (internalisation) éventuel à travers la membrane.
L’hypothèse d’équilibre avec la solution suppose que l’internalisation du métal dans la cellule est lente
par rapport aux deux autres étapes (diffusion en solution et complexation sur les sites). Dans certains
cas, l’internalisation du métal par l’organisme peut être rapide : l’organisme « pompe » le métal de la
solution, créant un gradient de concentration et déplaçant les équilibres ; l’hypothèse d’équilibre n’est
31
alors plus vérifiée. Dans ce dernier cas le modèle de l’ion libre ne permet pas d’expliquer les
interactions metal-organisme (cf. § Chapitre I.3.2.3).
Dans le cas le plus simple (couramment rencontré dans la littérature), où l’internalisation du métal par
l’organisme est l’étape limitante, i.e. que l’hypothèse d’équilibre avec les espèces en solution est vérifiée,
la quantité de métal est alors directement proportionnelle à la concentration en métal libre en solution.
Dans ce cas, on observe alors une proportionnalité entre l’effet biologique sur l’organisme et la
concentration en métal libre en solution.
Figure 6. Modèle conceptuel des interactions des métaux avec les organismes (FIAM), d’après Campbell (1995)
Cependant, les mécanismes conduisant de l’accumulation du métal à l’expression de la toxicité pour un
organisme donné sont souvent complexes. C’est pourquoi, l’extrapolation des concepts du FIAM à la
prédiction de la toxicité est parfois délicate. Ainsi, plutôt que d’étudier directement un effet toxique, on
étudie souvent la bioaccumulation d’un métal, étape préalable à l’expression de la toxicité. Dans ce cas,
la biodisponibilité du métal est définie comme étant sa capacité à traverser une membrane biologique.
Le FIAM est alors souvent formulé comme une proportionnalité directe entre métal libre en solution et
quantité de métal bioaccumulé par l’organisme (Campbell et al. 2002; Vigneault et al. 2005).
3.2.2
Le modèle du ligand biologique (BLM)
Le modèle du ligand biologique, repose sur les mêmes fondements conceptuels que le FIAM,
schématisés sur la Figure 6, mais considère en plus les sites de fixation du métal sur la membrane
biologique comme des ligands parmi d’autres en solution, susceptibles de liaison avec l’ensemble des
espèces cationiques.
En effet, Sunda et Hunstsman (1982) ont montré que les groupements fonctionnels de fixation des
métaux ne sont généralement pas sélectifs à un métal unique. Certains ligands biologiques peuvent fixer
d’autres espèces cationiques possédant une conformation (monovalente, divalente, trivalente, ...)
similaire ou proche de ceux de certains métaux essentiels. Par exemple, Playle et al. (1998) montrent que
32
des phénomènes de compétition avec les ions H+, Ca2+, Mg2+, Na+ peuvent intervenir dans les
mécanismes d’accumulation sur les branchies de poissons. Ce dernier point pose principalement un
problème pour l’évaluation de risque étant donné l’hétérogénéité de la qualité de l’eau des milieux
naturels. Pagenkopf (1983) a, pour la première fois, proposé une interprétation de cet effet pour les
poissons dans son modèle d’interactions à la surface des branchies (GSIM 1). Le GSIM traduit la
modification de l’effet biologique par le pH et la dureté en considérant les cations présents dans le
milieu (i.e. H+, Ca2+, Mg2+…) comme des compétiteurs du métal pour la formation de ce complexe.
En reprenant les principales hypothèses du FIAM et du GSIM, Di Toro et al. (2001) proposent un
cadre conceptuel d’interprétation plus robuste intégrant la spéciation du métal et les effet compétitifs
des cations : le modèle du Ligand Biologique (graphiquement illustré sur la Figure 7). Initialement mis
au point pour le poisson (Di Toro et al. 2001), le modèle du ligand biologique a récemment été étendu
aux micro-crustacés (Santore et al. 2001; De Schamphelaere et al. 2002) et au phytoplancton (Campbell
et al. 2002; De Schamphelaere et al. 2005).
Figure 7. Modèle conceptuel des interactions des cations (majeurs et métalliques) avec les organismes et leur
milieu, d’après Paquin et al., (2002).
Selon le formalisme du BLM, l’effet biologique est proportionnel à la quantité de sites spécifiques
occupés par le métal et, toutes les espèces étant considérées à l’équilibre, cette quantité dépend
directement du métal libre en solution et des cations compétiteurs. Ces phénomènes de compétition
(graphiquement illustrés sur la Figure 7) sont régis par les constantes d’affinité respectives des
éléments impliqués, leurs concentrations respectives en ions libres et les cinétiques de réaction. Dans
un formalisme unique, le BLM montre que l’effet biologique dépend de la spéciation du métal et des
cations majeurs présents dans le milieu.
1
GSIM : Gill Surface Interaction Model
33
3.2.3
Les exceptions au modèle de l’ion libre
De nombreuses études en laboratoire ont permis de vérifier la validité du modèle de l’ion libre et de
ses dérivés. Cependant, plusieurs études ont permis de noter certaines exceptions notoires,
particulièrement lorsque les hypothèses à la base de ces modèles ne sont plus vérifiées (Campbell 1995).
Quelques cas pour lesquelles le modèle FIAM n’a pas donné de résultat satisfaisant sont développés ciaprès :

Le cas des complexes métalliques lipophiles à faible poids moléculaire
Dans l’étude menée par Errecalde et al. (1998), la toxicité de deux métaux (zinc et cadmium) vis-à-vis de
l’algue verte Selenastrum capricornutum a été testée en l’absence et en présence de différents ligands dont le
citrate, ligand de faible poids moléculaire. Il a été montré que la toxicité du cadmium et du zinc était
renforcée en présence de citrate, tout autre paramètre (pH, dureté, ligands inorganiques) maintenus
constants par ailleurs. Des mesures ont également montré que l’accumulation du cadmium et du zinc
était augmentée en présence de ce ligand. Dans ce cas, la membrane des algues semble donc
reconnaître le citrate comme un métabolite de faible masse molaire.
Ces complexes lipophiles sont suffisamment solubles dans les lipides pour être capable de diffuser
rapidement par absorption métallique passive à travers la membrane lipidique : ces complexes
lipophiles constituent donc une exception au modèle de l’ion libre (Campbell 1995). De récentes études
ont démontré que des complexes lipophiles et/ou des chélateurs organiques de certains métaux
divalents pouvaient également diffuser à travers les membranes cellulaires en court-circuitant de ce fait
les barrières cellulaires à l’assimilation de métaux toxiques. C’est par exemple le cas du mercure qui a la
caractéristique de former facilement des méthyles (CH3Hg) lipophile, de l’argent qui a une grande
affinité pour les chlorures et forme l’espèce neutre AgCl0 (Bury and Hogstrand, 2002) et du cuivre qui
forme des complexes lipophiles avec les oxines (Croot et al. 1999; Ginneken et al. 2000) ou le
dithiocarbamate (Phinney et al. 1994). Ces complexes peuvent être toxiques pour différents niveaux
d’organisation des écosystèmes, de la bactérie au phytoplancton, zooplancton et poissons (Poldoski
1979; Block et al. 1986; Phinney et al. 1994; Croot et al. 1999). Dans ce cas, Hudson (1998) propose un
modèle de pénétration des complexes métalliques lipophiles tel que décrit sur la Figure 8.
Complexes à faible poids moléculaire
lipophiles
L
Figure 8. Exceptions au modèle de l’ion libre (d’après
Hudson, (1998)) : mécanisme de transport intracellulaire des
complexes lipophiles à faible poids moléculaire
L
ML
ML
MCELL
34

Le cas des cinétiques d’internalisation rapides
Une des hypothèses majeures du FIAM (et donc de son dérivé – le BLM), est que la proportionnalité
entre l’effet biologique et le métal libre n’est valable qu’à partir du moment où toutes les espèces sont à
l’équilibre, c’est à dire que l’internalisation du métal est limitante devant la diffusion des espèces de la
solution vers les sites de la membrane biologique (Figure 9. A.). Dans ce cas, la vitesse de diffusion des
espèces est suffisante pour maintenir l’équilibre entre les espèces et atteindre un état stationnaire. A
l’inverse, une vitesse d’internalisation très élevée (pouvant traduire une adaptation de l’organisme à un
milieu particulièrement pauvre en métaux essentiels (Morel et al. 2003)), peut déplacer l’équilibre
chimique entre les espèces à l’interface solution-organisme. En effet, bien que l’interaction des formes
libres du métal avec la membrane soit toujours nécessaire pour l’incorporation, si celle-ci est réalisée
avant que l’équilibre chimique soit rétabli dans la solution, un gradient de concentration s’installe, qui
induit non seulement la diffusion du métal sous sa forme libre, mais aussi la dissociation des formes
complexées. Dans ce cas, ce sont donc les cinétiques de diffusion des espèces en solution et de
dissociation des complexes qui contrôle l’assimilation du métal dans l’organisme (Figure 9. B.).
C’est par exemple le cas pour l’algue Chlamydomonas reinhardtii pour laquelle la bioaccumulation de
l’argent est proportionnelle à la concentration en métal inorganique total, qu’il se trouve ou non sous
forme de complexes chlorures (Fortin et al. 2000). De même, Meylan et al. (2004) ont observé qu’aux
concentrations environnementales, le cuivre biodisponible pour le périphyton comprenait, non
seulement le cuivre inorganique, mais aussi une fraction de complexes organiques labiles,
thermodynamiquement plus faibles que les associations cuivre-périphyton. Pour ces deux organismes,
l’étape d’internalisation est si rapide que l’hypothèse d’équilibre du FIAM n’est plus vérifiée. Par
conséquent, la seule concentration en métal libre ne suffit pas à prédire la biodisponibilité pour
l’organisme.
A.
B.
Figure 9. Représentation schématique (d’après Hudson, (1998)) des deux cas limites pour l’assimilation des
métaux dans l’organisme : A. Hypothèse d’un état d’équilibre à l’interface solution-organisme assumé par le
modèle de l’ion libre (la cinétique d’internalisation est l’étape limitante) ; B. contrôle cinétique de l’accumulation
du métal (les cinétiques diffusion et de dissociation des complexes métalliques sont les étapes limitantes).
35

Modification de la perméabilité de la membrane biologique
Enfin, le modèle de l’ion libre s’appuie sur l’hypothèse que les propriétés de la membrane biologique
restent constantes durant l’exposition au métal. Néanmoins, on trouve dans la littérature de nombreux
exemples où la perméabilité de la membrane biologique est modifiée en présence de divers composés.
Par exemple, Penttinen et al. (1998) montrent qu’une augmentation de la dureté de l’eau (notamment
des concentrations Ca2+) diminue la perméabilité de la membrane biologique à l’ion Cd2+ chez la
daphnie et donc sa biodisponibilité. Des résultats similaires sont observés par Hassler et al. (2004) qui
ont observé le même type de résultats pour l’accumulation du Zn et Pb dans les algues vertes Chlorella
kesslerii. Enfin, Slaveykova et al. (2003) ont démontré expérimentalement que la présence d’acides
fulviques en solution augmente le potentiel de surface de l’algue Chlorella kesslerii. Dans cette dernière
étude, les concentrations en plomb total et en acides fulviques ont été augmentées en parallèle de
manière à conserver une concentration en Pb2+ libre constante. Dans ces conditions, le modèle FIAM
prédit une concentration cellulaire en Pb constante. Dans ces conditions, Slaveykova et al. (2003)
observent d’importantes différences entre la bioaccumulation mesurée de Pb dans les algues (Figure 10)
et celle prédite par l’activité de l’ion libre en fonction des concentrations en acides fluviques. Dans ce
cas, la concentration constante Pb2+ libre ne permettant pas d’expliquer ces différences, seule une
modification de la perméabilité de la membrane biologique permet d’expliquer un changement de la
vitesse d’internalisation du métal.
Figure 10. Concentrations en Pb dans les cellules
de l’algue Chlorella kesslerii, après 50 min
d’exposition à une concentration en plomb libre
Pb2+ constante (pour des concentrations
croissantes en Pb total et en acides fulviques
(SRFA)). D’après Slaveykova et al. (2003).
36
37
38
Problématique
OBJECTIFS ET DEMARCHE GENERALE
Objectifs de l’étude
Les objectifs d’amélioration de l’état des cours d’eau fixés par la Directive Cadre sur l’Eau (DCE) du 23
octobre 2000 imposent aux pays membres d’évaluer l’impact environnemental de leurs rejets industriels
à court et long terme sur les écosystèmes aquatiques aux abords de leurs installations industrielles. La
finalité de ces études d’impact est de protéger la faune aquatique et le transfert à l’homme le long de la
chaîne trophique. Le risque environnemental d’une substance chimique est aujourd’hui évalué, selon la
méthodologie définie au niveau européen par le Bureau Européen des substances Chimiques
(European Commission, 2003), par le rapport entre une Concentration Prévisible dans
l’Environnement (Predicted Environmental Concentration : PEC) et une Concentration Prévisible Sans
Effet (Predicted No Effect Concentration : PNEC). Jusqu’alors, la PEC est estimée en considérant la
concentration totale dissoute du polluant dans le milieu et la notion de biodisponibilité est donc
ignorée dans l’analyse. Dans le cas des métaux en particulier, il est reconnu que cette approche est
conservative, puisque seuls les formes labiles du polluant sont susceptibles d’atteindre une cible
biologique. Dans ce contexte, il conviendrait plutôt de considérer la concentration effectivement
biodisponible vis-à-vis des organismes du milieu. Encore faut-il disposer de techniques fiables de
mesure et de suivi des concentrations en métaux biodisponibles.
Afin d’intégrer la notion de biodisponibilité dans les évaluations de risque environnemental, et ainsi de
lever les conservatismes détaillés précédemment, deux approches sont communément pressenties
au niveau européen :
(i) une approche de modélisation basée sur le Biotic Ligand Model (BLM) ;
(ii) une approche de monitoring chimique basé sur des outils « biomimétiques » (e.g. la technique
du gradient de diffusion en couche mince – la technique DGT).
Dans ce contexte, Electricité de France (EDF) s’intéresse depuis plusieurs années, au développement
de nouveaux outils de biomonitoring pour surveiller la contamination métallique biodisponible des
rejets de circuit de refroidissement des centrales nucléaires, qui sont notament fortement enrichis en
cuivre. De manière à anticiper les réglementations qui découleront de la nouvelle directive cadre
européenne, le département environnement de la direction des études et recherches d’EDF cherche
39
Problématique
maintenant à simplifier et fiabiliser sa procédure de suivi de rejets en milieu naturel, via le
développement d’outils innovants tels que la technique DGT ou le BLM. La question se pose de savoir
si ces outils permettent de décrire correctement la biodisponibilité des métaux dans des eaux naturelles
présentant des caractéristiques physico-chimique contrastées (composition cationique pH, matières
organiques, etc...).
L’objectif principal de cette étude, sera d’évaluer la pertinence des ces deux approches complémentaires
pour prédire la biodisponibilité du Cu à des niveaux de contamination représentatifs du milieu naturel.
Démarche globale
L’étape préliminaire de cette étude a consisté à mettre au point un biotest, suffisamment sensible aux
faibles nivaux de concentration, permettant d’observer et quantifier l’effet des paramètres de qualité
d’eau sur la biodisponibilité du cuivre. Pour cela, nous avons mis au point un biotest où nous étudions
la cinétique de bioaccumulation du cuivre par les bryophytes en milieu non renouvelé, comme
indicateur de la biodisponibilité du cuivre dans le milieu d’exposition. Ce protocole est détaillé dans les
Chapitre III 1 et Chapitre IV 2 et a fait l’objet d’une publication (Article 1 présenté en annexe) à partir de
résultats antérieurs à ce travail de thèse.
A partir de cette méthodologie, nous avons cherché à identifier et quantifier l’influence des différents
facteurs environnementaux contrôlant la biodisponibilité (et donc la toxicité) des métaux dans les
écosystèmes aquatiques. Face à cette problématique environnementale, nous avons orienté notre travail
de recherche de manière à répondre aux différentes questions portant sur l’importance relative des
paramètres environnementaux sur la biodisponibilité du cuivre.
La cinétique d’accumulation et d’élimination du cuivre dans les bryophytes est-elle fortement influencée par les
concentrations de cations en solution?
L’effet de ces cations, est-il observable aux faibles niveaux de contamination en cuivre représentatifs d’une
pollution chronique généralement observable en milieu aquatique?
La forte variabilité spatio-temporelle des teneurs en cations majeurs dans les eaux naturelles, nous a
conduit dans un premier temps, à identifier et quantifier l’effet de ceux-ci sur la bioaccumulation (et
donc indirectement la biodisponibilité) des métaux pour les organismes aquatiques. Dans le cadre du
1
2
Chapitre III : Effet des cations majeurs sur les cinétiques de bioaccumulation du cuivre dans les bryophytes
Chapitre VI : Influence des matières organiques dissoutes (MOD) sur la biodisponibilité du cuivre : étude comparative
entre un outil « biomimétique » (DGT) et un bioindicateur (Bryophytes).
40
Problématique
développement du modèle du ligand biologique (BLM), de nombreuses études ont montré que les
cations jouent un rôle majeur sur l’accumulation et donc la toxicité des métaux pour divers organismes
aquatiques (poissons, daphnies, algues). Dans le Chapitre III, nous chercherons donc à vérifier
l’influence de ceux-ci sur la bioaccumulation du Cu par les bryophytes aquatiques.
Quel est l’effet de la nature des MOD naturelles sur la spéciation et la biodisponibilité du Cu ?
Une mesure de spéciation du cuivre permet-elle de prédire la biodisponibilité des métaux pour les bryophytes
aquatiques ?
Les complexants organiques (acides humiques, fulviques, ...) présents dans les milieux aquatiques
naturels, sont susceptibles de complexer une fraction importante des métaux et donc de contrôler leur
spéciation et leur biodisponibilité pour les organismes aquatiques. Les substances humiques et fulviques
ont largement été étudiées par le passé car elles constituent la majorité des matières organiques
dissoutes présentes dans les eaux naturelles. En revanche, peu de recherches ont à ce jour été menées
sur la capacité d’autres matières organiques dissoutes à modifier la biodisponibilité des métaux. Dans la
seconde partie de cette étude (Chapitre IV), nous avons donc étudié l’effet de différentes MOD
(d’origines algale, bactérienne ou anthropique) caractéristiques de milieux aquatiques naturels. Dans ce
chapitre nous cherchons à mettre en évidence le lien entre la spéciation des métaux et leur
biodisponibilité.
Une approche couplant une mesure de spéciation (technique DGT) avec le BLM-Cu développé en laboratoire
pour les bryophytes, permet-elle de décrire la biodisponibilité du Cu dans les bryophytes à des niveaux de
contamination représentatifs des milieux aquatiques naturels ?
Enfin, il ressort de la synthèse bibliographique que les approches in situ de la biodisponibilité des
métaux restent généralement peu développées, principalement à cause des difficultés techniques liées à
la mise en place de tels biotests. Il semble pourtant indispensable de valider les modèles développés à
partir de biotests de laboratoire en les confrontant à des observations en milieu naturel. Dans la
dernière partie de cette étude (Chapitre V), nous chercherons à vérifier in situ la validité des outils
(technique DGT – Biotic Ligand Model) développé en laboratoire, pour prédire la biodisponibilité du
Cu en milieu aquatique naturel.
41
42
Modélisation des cinétiques d’échange du Cu à l’interface eau-bryophytes
Chapitre II.
1.
BIOACCUMULATION DU CUIVRE DANS LES
BRYOPHYTES : MODELISATION CINETIQUE ET
FORMULATION D’UN BLM
INTRODUCTION
A l’heure actuelle, l’analyse des teneurs en métaux dans les mousses aquatiques se limite, par l’emploi
des grilles de qualité, à une évaluation semi-quantitative de la contamination métallique du milieu. Or, la
relation existant entre le niveau d’exposition en métal et les concentrations observées dans les mousses,
permet d’envisager une utilisation plus fine de ces organismes, où les quantités accumulées seraient
directement reliées à la teneur en métal dans l’eau. La principale difficulté à l’établissement d’une telle
relation est l’interdépendance des cinétiques d’accumulation et des paramètres chimiques de l’eau qui
contrôlent la biodisponibilité du métal pour les mousses. En effet, plusieurs facteurs environnementaux
(pH, matières organiques, cations majeurs, etc ...) influençant la spéciation du métal ou la disponibilité
des sites de fixation présents sur le ligand biologique, sont susceptibles de modifier les cinétiques
d’échange du métal avec les mousses aquatiques.
Dans ce chapitre, l’objectif est de développer un outil mathématique d’interprétation permettant de
décrire l’évolution des concentrations en métaux à l’interface eau-bryophytes en fonction des teneurs
en métaux biodisponibles mais aussi des paramètres de qualité d’eau (en particulier des cations majeurs
et du pH) pouvant modifier la biodisponibilité et les cinétiques d’accumulation des métaux dans
l’organisme aquatique.
2. MODELISATION CINETIQUE DE LA BIOACCUMULATION DU CUIVRE
DANS LES BRYOPHYTES
Plusieurs modèles toxico-cinétiques 1, applicables au cas du Cu pour les bryophytes, existent pour
décrire les cinétiques d’échanges polluant-organisme (Spacie et al. 1982; Widianarko et al. 1996). Le
plus couramment utilisé est le modèle cinétique à deux compartiments qui se caractérise par deux
processus successifs et réversibles : l’adsorption du métal biodisponible à la surface des mousses
Définition INERIS : Les modèles toxico-cinétiques décrivent le devenir des substances toxiques dans un organisme vivant
au cours du temps. Ce devenir est déterminé par divers processus : (i) d'absorption, (ii) de distribution, (iii) de métabolisme,
et (iii) d'élimination.
1
43
aquatique suivie d’une étape d’internalisation (lente) du métal adsorbé dans les cellules (Mouvet 1984;
Ciffroy et al. 1994; Croisetiere et al. 2005).
2.1. Formalisme et hypothèses du modèle cinétique : cinétiques d’échange du cuivre à
l’interface eau-bryophytes

Principales hypothèses du modèle
Le modèle cinétique à deux compartiments est basé sur la connaissance des mécanismes
d’accumulation (Mouvet 1984) des métaux dans les bryophytes et sur la localisation cellulaire des
métaux dans les cellules (Claveri 1995). Le modèle descriptif des phases d’accumulation et de relargage
du métal par les bryophytes repose sur l’hypothèse d’une accumulation qui résulte des deux processus
suivants :
- Une adsorption réversible du métal en solution sur les sites actifs de surface
- Un transport réversible du métal dans le compartiment intracellulaire

Schéma réactionnel
Ces hypothèses constituent les bases du modèle réactionnel suivant :
Paroi
cellulaire
Milieu extérieur
CuD
k1
k -1
Cu
BL1
1. Adsorption/
Désorpt ion
où :
k2
k -2
Cellule
Cu-BL2
2. Internalisat ion/
Eliminat ion
- CuD est le cuivre dissous biodisponible en solution (en µg.L-1)
- BL1 et -BL2 sont respectivement les sites de fixation extra- et intra-cellulaires (mol.g-1d.w.)
- Cu-BL1 et Cu-BL2 représentent respectivement le cuivre fixé sur les sites extra-cellulaires et le cuivre
internalisé dans les sites intra-cellulaires (en µg Cu.g-1d .w..)
- k1, k-1, k2, k-2 sont respectivement les constantes cinétiques des réactions d’adsorption, de désorption
des sites extra-cellulaires, d’internalisation et d’élimination des sites intra-cellulaires.
44

Equations du modèle cinétique
En supposant des cinétiques de réaction d’ordre 1, l’évolution des concentrations de cuivre
respectivement présent dans la phase dissoute [CuD], adsorbée {CuBL1} sur les sites extra-cellulaires, et
internalisée {CuBL2} sur les sites intra-cellulaires, est décrite par les équations suivantes :
Eq. 9
Eq. 10
Eq. 11
où :
⎧ d[Cu D ]
m bryos
= −k 1 {- BL 1}free [Cu D ] +
k −1 {CuBL 1}
⎪
V
⎪ dt
V
⎪ d{CuBL 1}
=
k 1 {- BL 1}free [Cu D ] − k −1 {CuBL 1} − k 2 {- BL 2}free {CuBL 1} + k −2 {CuBL 2}
⎨
dt
m bryos
⎪
⎪ d{CuBL }
2
= k 2 {- BL 2}free {CuBL 1} − k −2{CuBL 2}
⎪
dt
⎩
- [CuD], {CuBL1} et {CuBL2} représentent les concentrations du cuivre dissous en solution (µg Cu.L-1) ,
adsorbé sur les sites extra-cellulaires (en µg de Cu.g-1d.w.) et internalisés dans les sites intra-cellulaires
(en µg de Cu.g-1d.w.) ;
- {-BL1}free et {-BL2} free sont respectivement les concentrations des sites de fixation extra- et intracellulaires inoccupés (molBli .g-1d.w.) ;
- k1, k-1, k2, k-2 sont respectivement les constantes cinétiques des réactions d’adsorption (en g.molBL1-1.h–
–1
-1 –1
1), de désorption (en g.mol
BL2 .h ) des sites extra-cellulaires, d’internalisation (en h ) et d’élimination
–1
(en h ) des sites intra-cellulaires.
- le rapport m bryos / V représente la densité de biomasse (en gd.w..L-1).
Tel qu’il est écrit, ce système d’équations (Eq. 9 - Eq. 11) présente l’intérêt de pouvoir simuler la
saturation des sites d’adsorption et d’internalisation libres {-BL1}free et {-BL2}free pour les fortes
concentrations en cations compétiteurs (ce point est décrit dans le Chapitre II.3). La saturation de ces
sites se traduit par une diminution des termes décrivant l’adsorption (terme « k 1 {- BL 1}free [Cu D ] »
dans les Eq. 9 et Eq. 10) et d’internalisation (terme « k 2 {- BL 2 }free {CuBL1} » dans les Eq. 10 et Eq.
11) partiellement gouvernées par les concentrations en sites libres extra- et intra-cellulaires
(respectivement {-BL1}free et {-BL2} free).
Pour se conformer aux mesures expérimentales et simplifier la résolution mathématique du système
d’équations ci dessus (Eq. 9-Eq. 11), on définit les constantes cinétiques conditionnelles k’1 et k’2 en
fonction des concentrations en sites extra- et intra-cellulaires libres (respectivement {–BL1}free et
{–BL2}free) comme suit :
Eq. 12
k '1 = k 1 × {BL 1}free et
Eq. 13
45
k ' 2 = k 2 × {BL 2}free
A partir des Eq. 12 et Eq. 13, le système d’équations (Eq. 9-Eq. 11) décrivant l’évolution des
concentrations de cuivre dans les différents compartiments se simplifie de la manière suivante :
Eq. 14
Eq. 15
Eq. 16
⎧ d[Cu D ]
m bryos
= −k '1 [Cu D ] +
k −1 {CuBL 1}
⎪
V
⎪ dt
V
⎪ d{CuBL 1}
=
k '1 [Cu D ] − k −1 {CuBL 1} − k ' 2 {CuBL 1} + k ' −2 {CuBL 2}
⎨
dt
m bryos
⎪
⎪ d{CuBL }
2
= k ' 2 {CuBL 1} − k −2{CuBL 2}
⎪
dt
⎩

Résolution des équations différentielles du modèle
Les solutions analytiques décrivant l’évolution des concentrations de cuivre dans les différents
compartiments du modèle sont obtenues en résolvant les équations différentielles du système
d’équations ci dessus.
Pour cela, on dérive l’Eq. 14 par rapport au temps, comme suit :
Eq. 17
d²[ Cu D ]
d[ Cu D ] m bryos
d{CuBL1}
+ k '1
=
k -1
d² t
dt
V
dt
Soit en utilisant l’Eq. 15 :
Eq. 18
⎫⎪
d²[ Cu D ]
d[ Cu D ] m bryos ⎧⎪ V
+ k'1
=
k -1 ⎨
k '1 [ Cu D ] − ( k -1 + k -2 ){CuBL 1} + k -2{CuBL 2}⎬
d²t
dt
V
⎪⎩ m bryos
⎪⎭
En isolant le terme {CuBL1}dans l’Eq. 14, et en l’introduisant dans l’Eq. 18, on aboutit à l’équation
différentielle suivante :
Eq. 19
où :
d[ Cu D ]
d²[ Cu D ]
+ ( k'1 +k −1 + k' 2 +k −2 )
+ ( k −1k −2 + k 1k' 2 +k 1k −2 )[ Cu D ] = ( k −1k −2 )[ Cu TOT ]
d² t
dt
[CuTOT] est la concentration totale du cuivre (en µg/L) dans le système eau+bryophytes tel que :
[ Cu TOT ] = [ Cu D ] +
m bryos
V
× ({CuBL1} + {CuBL 2})
En posant α = ( k '1 + k −1 + k ' 2 + k −2 ) , β = ( k −1k −2 + k 1k' 2 +k 1k −2 ) et δ = ( k −1k −2 ) , on obtient une
équation
différentielle
d’ordre
2
avec
second
membre
du
type
d ²[ Cu D ]
d[ Cu D ]
+α
+ β[ Cu D ] = δ[ Cu TOT ] , dont la solution générale est la forme :
d²t
dt
46
Eq. 20
où :
Eq. 21
δ
[ Cu D ] = [ Cu TOT ] + A e r1t + B e r2t
β
- r1 et r2 sont les solutions de l’équation d’ordre 2 suivante : r ² + αr + β = 0 tel que :
r1 =
− α + α² − 4β
2
et
Eq. 22
r2 =
− α − α² − 4β
2
- A et B sont des constantes dont la valeur dépend des conditions aux limites.
Les solutions particulières dérivées de l’Eq. 20 décrivant l’évolution des concentrations du Cu dissous
dans le milieu, appliquées pour les expériences d’accumulation et de désorption (satisfaisant les
conditions aux limites pour chaque cas) sont récapitulées dans le Tableau 1.
47
Tableau 1. Récapitulatif des hypothèses utilisées pour simuler l’évolution des concentrations de cuivre dissous dans
les bacs d’exposition au cours des expériences d’accumulation et désorption.
- Au début des expériences (t=0), avant introduction des mousses
dans les bacs d’exposition, tout le Cu se trouve sous forme
dissoute :
[Cu D ]t = 0 = [Cu TOT ]
Hypothèses
Cas n°1
- Au début de l’expérience, le processus d’adsorption est
prédominant par rapport aux autres processus de désorption,
internalisation et élimination. On peut en déduire :
PHASE
d[Cu D ]
= −k ' 1 [Cu TOT ]
dt t →0
D’ACCUMULATION
Solution
particulière
Eq. 23
La solution particulière de l’Eq. 20, satisfaisant ces 2 conditions aux
limites, appliquée pour simuler l’évolution de la concentration en
cuivre dissous au cours des expériences d’adsorption est alors:
⎧⎪ δ
⎫⎪
⎡
⎛ δ ⎞⎤
⎛ δ⎞
1
× ⎢k ' 1 + r2 × ⎜⎜ 1 − ⎟⎟⎥ × (e r1t − e r2 t ) + ⎜⎜ 1 − ⎟⎟ × e r2t ⎬
[ Cu D ] = [ Cu ]TOT × ⎨ +
⎪⎩ β r2 − r1 ⎣
⎪⎭
⎝ β ⎠⎦
⎝ β⎠
- Pour les expériences de désorption les mousses contaminées sont
introduites dans un milieu non contaminé en cuivre. On en déduit :
[Cu D ]t =0 = 0
Cas n°2
Hypothèses
- Au début de l’expérience, le processus de désorption à partir des
sites extracellulaire -BL1 est prédominant. On peut en déduire :
d[ Cu D ]
V
= k −1
{CuBL 1}t = 0
dt t →0
m bryos
PHASE
DE RELARGAGE
Solution
particulière
Eq. 24
La solution particulière de l’Eq. 20, satisfaisant ces 2 conditions aux
limites, appliquée pour simuler l’évolution de la concentration en
cuivre dissous au cours des expériences d’adsorption est alors:
⎧k
⎫
⎛ m bryos
⎞
rk
1
× ⎜⎜
×{CuBL1}t =0 + 2 −2 × [ Cu TOT ]⎟⎟ × (e r1t − e r2t )⎬
[ Cu D ] = k −1 × ⎨ −2 × [ Cu TOT ] × (1 − e r2t ) +
−
β
r
r
V
β
1
2
⎝
⎠
⎩
⎭
Les équations décrivant l’évolution des concentrations du cuivre adsorbé {CuBL1} et internalisé dans
les mousses {CuBL2} peuvent être déduites des Eq. 15, Eq. 16 et Eq. 23 (ou Eq. 24 pour la phase de
relargage):
48
Eq. 25
{CuBL 1} =
1
V
⎞
⎛ d[ Cu D ]
×
×⎜
+ k ' 1 [ Cu D ]⎟
k −1 m bryos ⎝ dt
⎠
Eq. 26
{CuBL 2 } =
1 ⎛ d{CuBL1}
⎞
×⎜
− k ' 1 [ Cu D ] + (k −1 + k ' 2 ) ×{CuBL1} ⎟
k −2 ⎝
dt
⎠
2.2.
Détermination expérimentale des constantes cinétiques

Calcul de la constante conditionnelle d’adsorption k’1
La constante conditionnelle d’adsorption k’1 peut être estimée au début de la phase d’exposition au
métal (t→0), lorsque les phénomènes de désorption, d’internalisation et d’élimination peuvent être
considérés comme négligeables. On en déduit que le taux initial de bioaccumulation( − d[ Cu D ] dt t→0 ),
est proportionnel à la concentration en métal dissous biodisponible en solution. L’Eq. 14 peut alors
être simplifiée comme suit :
Eq. 27
d[Cu D ]
= −k ' 1 [Cu D ]t =0
dt t →0
A partir de l’Eq. 27, la valeur de la constante conditionnelle d’adsorption k’1 peut être calculée à partir
de l’équation suivante :
Eq. 28
k '1 = −
1
[ Cu D ]t =0
×
d[ Cu D ]
dt t →0
Expérimentalement, nous évaluons le taux initial de bioaccumulation ( − d[ Cu D ] dt t →0 sur les cinq
premières minutes d’exposition) comme suit :
Eq. 29
−

[ Cu D ]t =0 − [ Cu D ]t =5 min
d[ Cu D ]
=
dt t →0
t 5 min
Calcul de la constante de désorption k--1
La constante de désorption k-1, peut être estimée à partir de l’Eq. 14 en considérant un état d’équilibre
entre la solution et les bryophytes en fin d’expérience (hypothèse vérifiée expérimentalement). Cet état
d’équilibre se traduit par une variation du taux de bioaccumulation nulle ( − d[ Cu D ] dt t →72 h ~ 0 ) en fin
d’expérience (dans notre cas à t=72h). A partir de cette hypothèse, la constante k-1 peut être estimée à
partir de l’Eq. 14 selon l’équation suivante :
49
Eq. 30
k −1 = k ' 1 ×
V
m bryos
⎛ [ Cu D ] ⎞
⎟⎟
× ⎜⎜
⎝ {CuBL 1} ⎠ t =72 h
La valeur de la constante de désorption k-1 est ainsi calculée à partir de la valeur de la constante
conditionnelle d’adsorption k’1 (selon l’Eq. 28) et de la valeur du ratio entre les concentrations de
cuivre dans les phases dissoute et adsorbé, mesuré en fin d’expérience ( [ Cu D ]t =72 h {CuBL 1} t =72 h ).

Calcul des constantes d’internalisation k’2 et d’élimination k-2
Si l’expérience se poursuit sur une durée suffisante, on suppose que la distribution (adsorbé/internalisé)
du Cu dans les mousses aquatiques tend vers un état d’équilibre. L’état d’équilibre se traduit par un flux
d’internalisation nul ( − d{CuBL 2} dt t →72 h ~ 0 ). Ce flux d’internalisation nul se traduit dans l’Eq. 16
par un calcul du ratio k’2/k-2 estimé par l’équation suivante :
Eq. 31
k ' 2 {CuBL 2}t =72 h
=
k −2 {CuBL 1}t =72 h
On obtient ainsi une relation entre k’2 et k-2. La valeur de la constante k2 (ou celle de k -2) est ensuite
ajustée et en minimisant l’écart (méthode des moindres carrés) entre les concentrations de Cu mesurées
et calculées (Eq. 23, Eq. 24 et Eq. 25) dans les différents compartiments (dissous, adsorbé et
internalisé). Les estimations ainsi faites ne fournissent que des ordres de grandeur pour chacun deux
paramètres cinétiques, que l’on affine par minimisation des moindres carrés.
3. EFFET DES CATIONS : FORMULATION D’UN BLM-CU POUR LES
BRYOPHYTES
On a longtemps pensé que les seuls facteurs environnementaux susceptibles de modifier les cinétiques
d’accumulation, étaient essentiellement des facteurs dits de spéciation, c’est à dire les facteurs qui
régissent la répartition des métaux présents dans le milieu en fonction de la nature et de la
concentration en ligands, y compris celles accumulables par les mousses aquatiques. Si plusieurs travaux
ont été consacrées à l’influence du pH (Vázquez et al. 2000; Fernandez et al. 2006), des matières
organiques et inorganiques (Pelfrene 2004; Ferreira et al. 2008; Ferreira et al. 2008; Tipping et al. 2008),
plus rares sont celles portant sur l’interaction des cations majeurs sur les cinétiques d’accumulation par
les bryophytes aquatiques (Say et al. 1983).
En effet, outre le pH (i.e. la concentration en protons), les cations majeurs (Ca, Mg, Na, K) du milieu
aquatique peuvent devenir compétiteurs des métaux pour les sites d’échanges surfacique de la paroi
50
cellulaire. Les travaux de Say et al. (1983) montrent que l’accumulation du Cu et du Zn dans les
mousses aquatiques (Fontinalis antipyretica) est inhibée par une augmentation des concentrations en
calcium dans le milieu.
Plus récemment, le Biotic Ligand Model (BLM), développé par Di Toro et al. (2001), fournit le cadre
conceptuel permettant d’interpréter l’effet des cations majeurs sur l’accumulation des métaux dans les
organismes aquatiques. L’hypothèse centrale du BLM est que l’effet biologique est proportionnel à la
quantité de sites spécifiques occupés par le métal et, toutes les espèces étant considérées à l’équilibre,
cette quantité dépend directement du métal libre en solution et des cations compétiteurs.
Dans cette section, nous proposons une méthodologie permettant d’interpréter et quantifier les effets
compétitifs des cations majeurs sur les cinétiques d’accumulation du Cu dans les mousses aquatiques,
via l’estimation des constantes d’affinité des cations avec le ligand biologique.
3.1
Formalisme et hypothèses du BLM
Comme on l’a déjà vu, le modèle cinétique (Eq. 9 – Eq. 11) présente l’intérêt de pouvoir simuler la
saturation des sites d’adsorption et d’internalisation libres {-BL1}free et {-BL2}
free
pour les fortes
concentrations en cations compétiteurs. La saturation de ces sites se traduit par une diminution des
termes décrivant l’adsorption et l’internalisation du Cu, partiellement gouvernées par les concentrations
en sites libres extra- et intra-cellulaires (respectivement {-BL1}free et {-BL2}free).
Conformément aux travaux antérieurs de De Schamphelaere et al., (2002), nous définissons la capacité
complexante du ligand biologique CC BL1 comme étant le nombre total théorique de sites actifs
disponibles pour la fixation du Cu sur le ligand biologique. L’équation du bilan de masse des sites
extra-cellulaires BL1 potentiellement disponibles pour la fixation du Cu, s’écrit alors comme suit :
CCBL 1 = {- BL1}free + {CuBL1} + {CaBL1} + { MgBL1} + {NaBL1} + {HBL1}
Eq. 32
où :
- CC BL1 représente la capacité complexante du ligand biologique (mol.L-1)
- {-BL1}free représente la concentration des sites actifs extra-cellulaires –BL1 libres (mol.L-1).
- {CuBL1}, {CaBL1}, {MgBL1}, {NaBL1} et {HBL1} sont les concentrations en cations fixés
sur les sites actifs extra-cellulaires -BL1 (mol.L-1).
La concentration des sites extra-cellulaires –BL1 libres {-BL1}free peut alors s’écrire à partir de l’Eq. 32:
{- BL 1}free = CC BL1 − {CuBL 1} − ∑i{C i BL 1}
Eq. 33
où :
-
∑{C BL } représente la somme des concentrations des différents cations C fixés sur les
i
i
i
1
-1
sites actifs extra-cellulaires -BL1 (mol.L ).
51
Telle que décrite par l’Eq. 33, la saturation des sites extra-cellulaires va dépendre des concentrations en
cations compétitifs Ci , mais aussi de l’affinité spécifique de chacun des cations Ci vis à vis de ces sites.
Cette affinité se caractérise par la valeur de la constante d’affinité spécifique K Ci BL1 pour chacun des
cations (cation métallique ou autre cation compétitif).
3.2
Calcul des constantes d’affinité cation – Ligand biologique ( K Ci BL1 )
Ainsi, pour un cation compétiteur (ou métallique) donné Ci, on peut définir une constante d’affinité
K Ci BL1 à l’équilibre, représentative de la fixation des cations sur les sites extra-cellulaires libres {-BL1}free :
Eq. 34
où :
K Ci BL1 =
{C i BL 1}
[ C i ] × {- BL 1}free
- K Ci BL1 représente la constante d’affinité du cation Ci sur les sites extra-cellulaires -BL1 libres ;
- [Ci] est la concentration en cation dans le milieu ;
- {-BL1}free et {CiBL1} sont respectivement les concentrations en sites extra-cellulaires libres et
complexés.
En combinant les Eq. 33 et Eq. 34, l’évolution de la concentration de sites libres en fonction des
concentrations des cations compétitifs peut alors s’écrire selon l’équation suivante :
Eq. 35
⎛
⎞
1
⎟
{BL 1}free = CC BL1 × ⎜
⎜ 1 + ∑ K C BL × [ C i ] ⎟
i
1
i
⎝
⎠
L’Eq. 35 décrit ainsi une diminution (évolution de forme hyperbolique) des concentrations en sites
extracellulaires libres {BL1}free en fonction des concentrations en cations compétitifs [Ci]. Cette
équation présente l’intérêt de traduire une saturation des sites pour les fortes concentrations cations. La
saturation progressive des sites se traduit d’un point de vue cinétique par une diminution de la
constante conditionnelle d’adsorption k’1 (cf. Eq. 12 1 ). En combinant les Eq. 12 et Eq. 35,
l’évolution théorique de la constante conditionnelle d’adsorption en fonction des concentrations en
cations compétitifs s’écrit selon l’équation suivante :
Eq. 36
1
⎛
⎞
1
⎟
k '1 = k 1 × CC BL1 × ⎜
⎜ 1 + ∑ K C BL × [ C i ] ⎟
i
1
i
⎝
⎠
Rappel (Eq. 12) :
k '1 = k 1 × {BL 1}free
52
L’Eq. 36 nous permet ainsi de simuler l’évolution des constantes conditionnelles d’adsorption en
fonction des concentrations en cations dans le milieu d’exposition. Pour chaque série de cation testé,
nous pouvons ainsi quantifier la valeur de la constante d’affinité K Ci BL1 en minimisant les écarts entre
les valeurs de constantes conditionnelles d’adsorption k’1 simulées (k’1,SIMU calculé selon Eq. 36) et
déterminées expérimentalement (k’1, EXP expérimentalement déterminé selon Eq. 28 1) :
E = ∑ (k '1,EXP −k '1,SIMU )
2
Eq. 37
Ci
1
Rappel (Eq. 28) :
où :
k '1,EXP = −
1
d[ Cu D ]
×
[ Cu D ]t =0
dt t →0
− d[ Cu D ] dt t →0 représente le taux d’accumulation initial en solution tel que décrit par l’Eq. 29
( = ([ Cu D ]t = 0 − [ Cu D ]t = 5 min ) Δt 5 min ).
53
54
Effet des cations compétiteurs sur les cinétiques de bioaccumulation du Cu
Chapitre III.
EFFET DES CATIONS MAJEURS SUR LES CINETIQUES
DE BIOACCUMULATION DU CUIVRE DANS LES
BRYOPHYTES
1. INTRODUCTION
Les mousses aquatiques sont considérées comme des organismes particulièrement intéressants pour la
surveillance de la contamination des cours d’eau, du fait de (i) leur large répartition géographique dans
les écosystèmes lotique (Tyler 1990; Steinman et al. 1993), (ii) leur importance écologique en tant
qu’habitat et source de nutriment pour les espèces benthiques (Glime et al. 1972; Maurer et al. 1983;
Steinman et al. 1993), et (iii) leur capacité à accumuler rapidement les métaux,. De nombreuses études
en laboratoire et en milieu naturel, ont permis, via le développement de modèles cinétiques de
bioaccumulation, de mettre en relation les concentrations en métal accumulé dans les mousses avec les
niveaux de contamination métallique du milieu d’exposition. Ce type d’expériences maintes fois
répétées en laboratoire (pour différents métaux et différents espèces de mousses) a pu être validé pour
une large gamme de niveau de contamination (Claveri et al. 1995; Croisetiere et al. 2005), et appliqué
pour évaluer la contamination métallique des cours d’eau (Mouvet et al. 1993; Claveri et al. 1994; Nimis
et al. 2002; Figueira et al. 2005).
En revanche, l’effet compétitif des cations majeurs sur l’accumulation des métaux, bien qu’évoqué par
Pickering et al. (1969) et Say et al. (1983), n’a à l’heure actuelle, jamais fait l’objet d’une étude
approfondie pour les mousses aquatique. Ce type d’effet compétitif a en effet pu être mis en évidence
pour divers métaux (Cu, Zn, Cd et Ag) et organismes (truite arc-en-ciel, daphnies, algues unicellulaires)
dans le cadre du développement du Modèle du Ligand Biologique (BLM) (Di Toro et al. 2001; Santore
et al. 2001; De Schamphelaere et al. 2002; Heijerick et al. 2002). Mis à part quelques exceptions notoires
(cf. Chapitre I. §3.2.2), le BLM permet de prendre en compte la compétition des cations (H+, Ca2+,
Mg2+, etc…) avec le métal et ainsi de rendre compte des différences de bioaccumulation (ou toxicité)
observées, pour des solutions de composition cationique et de pH variables.
Dans ce chapitre, nous nous intéressons à l’effet de la composition cationique sur les cinétiques
d’accumulation et de relargage du Cu par les mousses aquatiques. L’objectif, à terme, est de pouvoir
prédire l’évolution des cinétiques d’échange du Cu eau-bryophytes, en connaissant les caractéristiques
du milieu et en particulier sa composition cationique.
55
Dans un premier temps, ce chapitre présente les résultats de l’étude expérimentale en laboratoire, où
nous étudions la cinétique de bioaccumulation du cuivre par les bryophytes en milieu non renouvelé
(test en réacteurs fermés), en fonction de la composition cationique du milieu. La modélisation de ces
paramètres cinétiques de bioaccumulation nous permet de caractériser l’effet de la composition
cationique sur la bioaccumulation du Cu dans les mousses, par le calcul des constantes d’affinité des
différents cations vis à vis des sites présents sur la membrane biologique.
Dans un second temps, nous illustrons, par le biais de deux exemples, comment le BLM
précédemment calibré en laboratoire peut être appliqué pour la (ré)interprétation de mesures de métaux
dans les bryophytes régulièrement recueillies dans le cadre des programmes de biosurveillance.
Les résultats présentés dans ce chapitre ont fait l’objet d’une publication (Article 2 présenté en annexe).
2. ETUDE EXPERIMENTALE
L’influence de la composition cationique sur la biodisponibilité du Cu a été évaluée en comparant les
cinétiques d’accumulation du Cu dans les bryophytes dans des milieux où les concentrations en cations
majeurs ont varié dans des ordres de grandeur représentatifs des concentrations en milieu naturel.
2.1
Protocole expérimental
2.1.1

Mises au point méthodologiques du biotest en laboratoire
Optimisation du protocole
On a longtemps pensé que l’intensité et la rapidité de bioaccumulation des métaux par les bryophytes
dépendait entre autre de la vitesse du courant du milieu dans lequel elles étaient exposées (Claveri
1995). Plus récemment, des études (Croisetiere et al. 2001) ont démontré que ces observations
relevaient probablement d’un biais expérimental (des conditions d’exposition en continu étant difficiles
à maintenir constantes) et que la bioaccumulation ne dépendait pas du courant. Cette observation
permet d’envisager des essais en conditions contrôlées et statiques, beaucoup plus simples à mettre en
œuvre pour étudier le lien entre la composition chimique des milieux et la bioaccumulation dans les
bryophytes, observé en milieu naturel (Vázquez et al. 2000; Vincent et al. 2001).
Les bryophytes sont des accumulateurs puissants des métaux, si bien qu’en quelques minutes, la
concentration en cuivre dissous du milieu d’exposition peut chuter à un niveau proche de la limite de
quantification (Absorption Atomique en four DL ~ 0,1µgCu/L ; QL ~ 0,3 µgCu/L). La Figure 11
compare par exemple les cinétiques de cuivre dissous obtenues en exposant différentes densités de
56
bryophytes (de 10 à 100 g poids frais) dans quinze litres de solution d’exposition à 25 µg/L de cuivre
dissous.
40
[CuD] (µg/L)
[CuD] (µg/L)
100 g de Bryophytes/15L
30
20
10
40
50g de bryophytes/15L
[CuD] (µg/L)
40
30
20
10
0
0
10
20
30
temps (h)
40
50
10g de bryophytes/15L
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
0
temps (h)
0
10
20
30
40
50
temps (h)
Figure 11. Evolution des concentrations en cuivre dissous lors de l’exposition de bryophytes en matrice
minérale, contaminée par 25 µg.L-1 de cuivre, pour 3 densité de bryophytes (100, 50 et 10 g de bryophytes
/15L), d’après (Pelfrene 2004) et (Ferreira 2005).
Le niveau du plateau final dépend de la densité de mousses, ainsi que la cinétique initiale, qui est plus
lente aux fortes densités. La bioaccumulation est, dans le cas des fortes densités de biomasse (100 g de
poids frais ; Figure 11.a.), limitée par la diffusion du cuivre dans l’amas de bryophytes (Figure 12.a) ce
qui se traduit par une forte hétérogénéité de la contamination de la biomasse (Pelfrene 2004).
Le choix méthodologique pour la suite des biotests, consiste donc à exposer une faible quantité de
bryophytes (10g, Figure 12b), sélectionnés pour être homogènes (utilisation de l’apex uniquement),
maintenus dans un bac de 15L, à une faible concentration en cuivre (5 µg/L).
a)
b)
Figure 12. Bacs d’exposition pour différentes densités de bryophytes ( 100 g (a) et 10 g (b) de bryophytes dans
un bac de 15L)

La phase d’accumulation
Nous exposons les bryophytes en milieu agité, non renouvelé, pendant 72 heures, au cours desquelles
nous réalisons un suivi cinétique des concentrations en cuivre dissous dans la solution d’exposition. A
l’issue des 72 heures, un échantillon de bryophytes (~100 mg en poids frais) est prélevé, séché,
minéralisée, puis analysée (SAA–four). Au début des expositions, avant l’ajout des bryophytes, le cuivre
57
total dissous et le cuivre labile sont analysés, après d’une part un prélèvement d’eau filtrée et acidifiée,
d’autre part de l’exposition pendant quelques heures des sondes DGT (Gradient de Diffusion en
couche mince). Ces biotests sont réalisés en milieu minéral (eau minérale Mont Calm® ; les
caractéristiques physico-chimiques de cette eau naturelle sont regroupées dans le Tableau 2) dopé
avec différentes concentrations en cations majeurs (Ca, Mg, Na, pH, Tableau 3) et contaminé avec 5
µg/L de Cu (Figure 13).
Tableau 2. Composition ionique de l’eau minérale Mont Calm®
Composition
(en mg/L)
Ca2+
Mg2+
K+
Na+
HCO3-
SO42-
Cl-
NO3-
pH
3
0.6
0.4
1.5
5.2
8.7
0.6
<1
6.8
SiO2 : 7,5 mg/L
Préparation des milieux d’exposition
Eau Minérale Mt Calm® dopée en
cations + 5 µg Cu / L
Introduction
des DGT
Introduction
des mousses
Retrait des
mousses
t=0
t=72h
Gamme de concentration en cations
Cu labile
(DGT)
Suivi Cinétique du Cu dissous
1
2
3
4
Mesure
Cu mousses
5
MODELIS ATION CINETIQUE
Ca 3 mg .L
; -1
Ca 10 mg .L -1
( µg /L)
5
Ca 20 mg .L -1
Ca 40 mg .L -1
BILANS DE MASS E
--1
80
Cu (µg ofCu)
C Dissous
Ca 150 mg .L
0
0
24
Durée (heures)
72
Cu Dissous
Cu Bioaccumulé
60
40
20
0
Ca 3 mg /L Ca 10 mg /L Ca 20 mg /L Ca 40 mg /LCa 150 mg /L
Figure 13. Représentation schématique de la méthodologie employée pour évaluer l’effet des cations sur la
bioaccululation du Cu par les mousses aquatiques (Fontinalis antipyretica)

La phase de relargage (ou dépuration)
Pour étudier la phase de relargage, les bryophytes précédemment contaminées, sont placées pendant 24
heures en milieu minéral (eau Mont Calm®, V=3L) non enrichie en cuivre et présentant différentes
58
concentrations en cations étudiées lors de la phase d’accumulation (Tableau 3). Durant cette phase de
dépuration, un suivi cinétique du Cu relargué en solution est effectué.
2.1.2
Préparation des milieux d’exposition
Pour les expériences d’accumulation et de relargage, les milieux d’exposition sont préparés par ajouts
dosés de cations majeurs (depuis des solutions concentrées de CaCl2, MgCl2, NaCl, HCl, and NaOH)
dans une eau minérale faiblement cationique (composition de la Mont Calm, Annexe 3) de manière à
obtenir une gamme de concentrations en cations majeurs. Les compositions cationiques du milieu
d’exposition sont récapitulées sur le Tableau 3.
Afin de s’affranchir des processus d’adsorption du métal sur les parois du bac, les milieux d’expositions
sont préparés 24 heures avant l’introduction des bryophytes, puis renouvelés 2 heures avant
introduction des soudes DGT et des bryophytes dans le milieu.
Tableau 3. Composition cationique (moy ± ET ; n = 3) des milieux d’exposition pour les biotests
d’accumulation.
Milieu d’exposition
Ca2+ (mg.L-1)
Mg2+ (mg.L-1)
Na+ (mg.L-1)
pH a
Mont Calm
3.1 (± 0.6)
0.64 (± 0.05)
1.42 (± 0.09)
6.85 a
9.9 (± 1.0)
19.7 (± 0.9)
41.1 (± 1.1)
153.1 (± 0.9)
3.3 (± 0.4)
3.1 (± 0.2)
3.0 (± 0.3)
2.9 (± 0.5)
3.2 (± 0.1)
3.0 (± 0.8)
2.9 (± 0.8)
2.8 (± 0.5)
2.8 (± 0.3)
2.9 (± 0.4)
3.2 (± 0.3)
3.1 (± 0.7)
0.63 (± 0.02)
0.58 (± 0.04)
0.54 (± 0.06)
0.60 (± 0.03)
2.1 (± 0.04)
5.1 (± 0.06)
10.4 (± 0.03)
48.8 (± 0.04)
0.60 (± 0.02)
0.55 (± 0.07)
0.51 (± 0.04)
0.57 (± 0.04)
0.62 (± 0.07)
0.56 (± 0.01)
0.65 (± 0.03)
0.66 (± 0.04)
1.56 (± 0.09)
1.52 (± 0.13)
1.47 (± 0.20)
1.44 (± 0.07)
1.53 (± 0.09)
1.49 (± 0.08)
1.44 (± 0.12)
1.41 (± 0.07)
3.21 (± 0.09)
11.0 (± 0.11)
21.6 (± 0.12)
103.5 (± 0.08)
1.46 (± 0.11)
1.49 (± 0.18)
1.58 (± 0.21)
1.44 (± 0.03)
6.90 a
6.71 a
6.80 a
6.69 a
6.92 a
6.86 a
6.88 a
6.75 a
6.78 a
6.94 a
6.88 a
6.80 a
8.40 (± 0.13)
7.70 (± 0.16)
5.90 (± 0.10)
4.80 (± 0.16)
Biotests Ca
Biotests Mg
Biotests Na
Biotests pH
a pas
de réplicat de mesure (n=1)
59
2.2 Exploitation des résultats
2.2.1
Calage et validation du modèle cinétique décrivant les échanges du Cu à l’interface eaubryophytes
Pour décrire l’accumulation du Cu dans les mousses, nous modélisons la bioaccumulation du cuivre par
les bryophytes (cf. Chapitre II.2), en considérant deux cinétiques du premier ordre pour l’adsorption du
cuivre biodisponible (Cub) sur les bryophytes, puis son internalisation dans l’organisme. Seules les
données obtenues pendant la phase d’accumulation sont utilisées pour le calage du modèle cinétique.
Le calage du modèle (selon les Eq. 23 - Eq. 25 - Eq. 26, décrites dans le Chapitre II.2.1) nous permet
de calculer les valeurs des constantes cinétiques d’échange du Cu à l’interface eau-bryophytes (k’1, k-1,
k’2, k-2) pour chacune des concentrations en cations (Ca, Mg, Na, pH) testées. La validité du modèle
pour décrire les échanges du Cu à l’interface eau-bryophytes en fonction de la composition cationique
du milieu d’exposition, est testée sur les données obtenues pendant la phase de relargage : les valeurs
des constantes cinétiques précédemment calculées par calage du modèle, sont utilisées pour simuler
(Eq. 24) l’évolution théorique des concentrations de Cu relargué en solution pour chaque milieu
d’exposition. La comparaison des valeurs ainsi simulées avec les mesures nous permet de juger de la
validité du modèle pour décrire les échanges de Cu à l’interface eau-bryophytes en fonction des la
composition cationique du milieu d’exposition.
2.2.2

Sensibilité de la méthode aux faibles niveaux de contamination
Sensibilité de la méthode aux faibles niveaux de contamination
Le formalisme du FIAM (repris dans le BLM) suppose que l’accumulation en métal dans l’organisme
est directement proportionnelle à la concentration en métal libre (ou labile) en solution. Afin de vérifier
la validité de cette hypothèse pour l’accumulation du Cu par les mousses aquatiques aux faibles niveaux
de contamination, nous exposons les bryophytes en matrice minérale (en eau minérale Mont Calm®,
composition cationique Tableau 3) à une gamme de concentration variant de 1 à 5 μg/L de cuivre.
Sur la Figure 14, on observe qu’il existe bien une relation linéaire entre le flux initial de
bioaccumulation ( − d[ Cu D ] dt t →0 en μg.L-1h-1 ; cf. Eq. 29) et la concentration initiale en cuivre, qu’elle
soit exprimée en cuivre total dissous ou labile, que la précision de la méthode est très bonne et permet
de réaliser des expériences à des concentrations en cuivre de l’ordre de celles du milieu naturel (1, 2 et 5
μg/L de cuivre total dissous). En milieu minéral, le cuivre total dissous est biodisponible pour
l’adsorption sur les bryophytes. L’ordonnée à l’origine de la régression obtenue étant très faible (0,28
μg.L-1h-1, σ = 0,18 μg.L-1h-1), nous pouvons définir, dans nos conditions opératoires de densité de
60
bryophytes ( m bryos = 10 g
poids frais
), de volume d’exposition (15 L) et d’agitation, la constante vraie
d’adsorption k1 à partir de la pente de la droite de régression (k1 = 2,44 L.gdw-1.h-1, σ = 0,06 L.gdw-1.h-1).
16
-1
-1
d [CuD] / dt I t->0 (µg.L .h )
14
y = 2.444x + 0.281
12
Figure 14. Flux initial de bioaccumulation
2
R = 0.986
10
( d[ Cu D ] dt t →0 ) du cuivre par les bryophytes en
8
6
eau minérale Mont Calm®, en fonction de la
4
concentration initiale de cuivre dissous (▲) et
2
labile (□).
0
0
1
2
3
4
5
6
-1
Cu concentrations (µg.L )
Initial Total dissolved Cu
initial Labile Cu
La Figure 14 nous permet de vérifier pour les faibles niveaux de contamination l’hypothèse principale
du modèle de l’ion libre (proportionnalité entre accumulation et niveaux d’exposition), et nous permet
également de mettre en évidence la bonne sensibilité de la méthode aux faibles niveaux de
contamination en métal (concentrations variant de 1à 5 µg /L de Cu).

Vérification des bilans de masse en fin d’expérience
Le protocole expérimental consiste à exposer une faible quantité de bryophytes (10g) maintenus sous
agitation dans un bac de 15L, à de faibles concentrations en cuivre (5 μg/L). Cette faible densité de
biomasse nous permet de suivre la cinétique de disparition du cuivre dissous en solution comme
indicateur indirect de la bioaccumulation dans les bryophytes. En revanche, cette faible densité de
biomasse ne nous permet pas d’effectuer un suivi cinétique de la contamination des bryophytes, car il y
a trop peu de biomasse. Nous faisons donc l’hypothèse que la disparition du cuivre dissous est due à la
bioaccumulation dans les bryophytes, que nous vérifions à la fin d’accumulation (t=72h) en effectuant
un bilan de masse (Figure 15).
Les fractions de métal adsorbé et internalisé par les mousses sont mesurées après les 72 heures de la
phase d’accumulation selon le protocole détaillé en Annexes (cf. Annexes §2.3). Un échantillon de
bryophytes est prélevé à la fin de la phase d’accumulation (t=72h), et placé dans une solution
complexante (EDTA – 1mM, 2h00). La fraction de métal adsorbé sur les mousses est mesuré dans la
solution d’EDTA (SAA-four), tandis que la fraction internalisée est directement mesuré dans les
mousses ainsi traitées après séchage à l’étuve (60°C, 48 heures) et minéralisation à l’acide nitrique
(HNO3, suprapur).
61
A. Biotests Calcium
60
40
20
Cu Dissous
Cu Internalisé
Cu Adsorbé
60
40
20
0
0
Ca 3 mg/L
Ca 10 mg/L
Ca 20 mg/L
Ca 40 mg/L Ca 150 mg/L
Mg 0.6 mg/L
C. Biotests Sodium
80
60
40
20
0
Mg 2 mg/L
Mg 5 mg/L
Mg 10 mg/L
Mg 50 mg/L
D. Biotests pH
80
Cu Dissous
Cu Internalisé
Cu Adsorbé
Δ Cu (µg de Cu)
Δ Cu (µg de Cu)
B. Biotests Magnesium
80
Cu Dissous
Cu Internalisé
Cu Adsorbé
Δ Cu (µg de Cu)
Δ Cu (µg de Cu)
80
Cu Dissous
Cu Internalisé
Cu Adsorbé
60
40
20
0
Na 1.5 mg/L
Na 3 mg/L
Na 10 mg/L
Na 20 mg/L Na 100 mg/L
pH 8.40
pH 7.70
pH 6.85
pH 5.90
pH 4.80
Figure 15. Vérification des bilans de masse du cuivre à la fin des 72 heures d’exposition, par comparaison entre la quantité totale de Cu accumulé (adsorbé +
intenalisé) dans les mousses et la quantité de Cu dissous consommé en solution pendant les 72h.
62
3. RESULTATS
3.1
Cinétiques d’accumulation du Cu par les mousses aquatiques
La Figure 16 présente l’évolution cinétique (représentée sous forme d’un rapport adimensionnel
[ Cu W ] / [ Cu W ]t =0 ; où [CuW] et [CuW]t=0 sont les concentrations de Cu dissous à l’instant t et à t=0 du
biotest) des concentrations mesurées (symboles) et simulées (traits) en cuivre dissous pendant la phase
d’accumulation, en matrice minérale enrichie en cuivre (5 μgCu/L), obtenues pour les différentes
compositions cationiques du milieu.
Pour l’ensemble des concentrations en cations testées, on note que les concentrations en Cu dissous
chutent rapidement sur les premières heures pour tendre vers un plateau en fin d’expérience (entre 0.5
et 1 µg/L), traduisant un état d’équilibre à l’interface eau-bryophytes. On note également que ce plateau
est atteint pour des durées d’exposition variables (entre 2h et 10h) qui dépendent de la composition
cationique du milieu d’exposition : de manière générale une augmentation des concentrations en
cations dans le milieu retarde l’atteinte de ce plateau d’équilibre.
A partir du modèle cinétique d’échange du Cu à l’interface solution-bryophytes (cf. Chapitre II.2), une
optimisation (modélisation inverse) a été réalisée, nous permettant d’identifier les paramètres cinétiques
(k’1, k-1, k’2, k-2). Les résultats de la simulation pour chacune des compositions cationiques sont
comparés aux résultats expérimentaux sur la Figure 16. D’une manière générale, on observe pour
l’ensemble des simulations une très bonne corrélation (r² ≥ 0.92) entre les valeurs mesurées et simulées.
Les paramètres cinétiques obtenus par simulation pour les milieux d’exposition sont regroupés dans le
Tableau 4.
De manière générale, on constate que la constante conditionnelle d’adsorption k’1 est le paramètre
cinétique le plus influencé par les variations de la composition cationique du milieu d’exposition. A
l’exception du sodium (Na), une augmentation des concentrations en cations majeurs en solution se
traduit par une diminution de la cinétique d’adsorption (k’1) du métal sur les mousses aquatiques.
En revanche on remarque que la valeur du ratio k’2/k-2 , qui décrit la distribution du Cu extra/intracellulaire dans les mousses en fin d’expérience (cf. Eq. 31), demeure constante (k’2/k-2 = 0.292±0.02 ;
n=17) quelle que soit la composition cationique du milieu d’exposition. Ce dernier résultat semble
indiquer que les cations majeurs n’influent pas les processus d’internalisation/élimination du métal,
alors qu’ils influent fortement en amont en limitant la cinétique d’adsorption du métal.
63
Tableau 4. Valeurs des différentes constantes cinétiques d’adsorption-desorption (k’1, k-1) et des ratios
d’internalisation/élimination (k’2 / k-2) en fonction des différentes compositions cationiques du milieu
d’exposition.
Biotest
Ca2+ (mg.L-1)
Mg2+ (mg.L-1)
Na+ (mg.L-1)
pH
Mont Calm
3.1
9.9
0.64
1.42
6.85
1.92
0.05
0.30
0.63
1.56
6.90
1.32
0.04
0.32
19.7
41.1
153.1
3.3
3.1
3.0
2.9
3.2
3.0
2.9
2.8
2.9
3.0
3.2
3.1
0.58
0.54
0.60
2.1
5.1
10.4
48.8
0.60
0.55
0.51
0.57
0.56
0.60
0.65
0.66
1.52
1.47
1.44
1.53
1.49
1.44
1.41
3.21
11.0
21.6
103.5
1.49
1.54
1.58
1.44
6.71
6.80
6.69
6.92
6.86
6.88
6.75
6.78
6.94
6.88
6.80
7.70
6.80
5.90
4.80
0.73
0.60
0.28
1.31
0.80
0.58
0.30
1.66
1.60
1.72
1.81
2.16
1.92
1.11
0.72
0.03
0.04
0.02
0.06
0.03
0.03
0.02
0.04
0.05
0.07
0.08
0.07
0.05
0.05
0.07
0.28
0.28
0.28
0.29
0.28
0.27
0.35
0.29
0.33
0.28
0.29
0.28
0.30
0.29
0.29
Ca
Mg
Na
pH
a
k’1 (h-1)
a
k –1 (h-1)
a
k’2 / k –2
le calcul des constantes cinétiques k’1 , k-1 et et du ratio k’2 / k-2 est détaillé dans le Chapitre II.2.2 (Eq. 28, Eq.
30 et Eq. 31 respectivement).
a
64
A. Effet du Ca sur la cinétique d’accumulation du Cu
B. Effet du Mg sur la cinétique d’accumulation du Cu
1.2
1.2
Mg 0.6 mg.L-1
Ca 3 mg.L -1
Ca 10 mg.L -1
Ca 20 mg .L -1
0.8
Ca 40 mg.L -1
Ca 150 mg .L -1
0.6
0.4
Mg 5 mg .L-1
0.8
Mg 10 mg.L-1
Mg 50 mg .L-1
0.6
0.4
0.2
0.2
0.0
0.01
Mg 2 mg.L-1
1.0
[Cuw] / [Cuw]t=0
[Cuw] / [Cuw]t=0
1.0
0.1
1
10
0.0
0.01
100
0.1
1
10
100
Time (hours)
Time (hours)
C. Effet du Na sur la cinétique d’accumulation du Cu
D. Effet du pH sur la cinétique d’accumulation du Cu
1.2
1.2
pH 8.4
Na 1.5 mg.L -1
Na 3 mg.L -1
pH 7.7
1.0
pH 6.8
Na 10 mg .L -1
0.8
Na 20
[Cuw] / [Cuw]t=0
[Cuw] / [Cuw]t=0
1.0
mg.L -1
Na 100 mg
.L -1
0.6
0.4
0.2
0.0
0.01
pH 5.9
0.8
pH 4.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0.1
1
10
100
0.01
Time (hours)
0.1
1
10
100
Time (hours)
Figure 16. Evolution cinétique du cuivre dissous ( [ Cu W ] / [ Cu W ]t =0 ) dans les différents milieux d’exposition (avec des concentrations variables de Ca, Mg, Na et
pH en solution) pendant les 72 h de la phase d’accumulation.
Les symboles et les lignes représentent respectivement les donnés expérimentales et simulées (solutions analytiques dérivées de l’Eq.
d’accumulation).
65
23 pour la phase
3.2
Cinétiques de relargage du Cu
La Figure 18 présente l’évolution cinétique des concentrations en cuivre dissous ([CuW]) en solution
pendant les 24 h de la phase de relargage pour les différentes compositions cationiques testées. Pour
l’ensemble des cations testés (à l’exception du sodium), on remarque qu’une augmentation de la
composition cationique (Ca, Mg, et Na) du milieu augmente la quantité de Cu relarguées par les
mousses en solution. A l’instar des cinétiques d’accumulation, ce résultat nous indique que les
cinétiques de relargage du Cu sont également influencées par les variations de la composition
cationique du milieu d’exposition : d’une manière générale, une augmentation des concentrations en
solution des cations majeurs (Ca, Mg, et protons) augmente le relargage de Cu des mousses vers la
solution. L’observation de ces phénomènes peut être attribuée aux effets compétitifs des cations
majeurs pour la fixation du Cu sur les sites extra-cellulaires de la membrane biologique.
Les résultats de la simulation obtenus pour la phase de relargage (Eq.
24) pour chacune des
compositions cationiques sont comparés aux résultats expérimentaux sur la Figure 17. Les
concentrations simulées (dérivées de l’Eq. 24) sont calculées en utilisant les valeurs des paramètres
cinétiques estimés à partir des phases d’accumulation pour chaque composition cationique testées
(valeurs récapitulées sur le Tableau 4). On constate en général une bonne corrélation (r²=0.90) entre
les concentrations simulées et celles mesurées pour l’ensemble des compositions cationique testées
(Figure 17), ce qui nous permet de valider la méthode et l’outil d’interprétation (modèle cinétique)
pour prédire les cinétiques d’échange du Cu (accumulation – relargage) par les mousses dans des
milieux de qualités d’eau contrastées.
-1
Cu dissous simulé [CuD] (µg.L )
1.5
1.2
Figure 17. Comparaison entre les concentrations
de Cu dissous simulées et mesurées au cours de la
phase de relargage pour l’ensemble des biotests (Ca,
Mg, Na, et pH).
0.9
0.6
Ca biotests
0.3
Mg biotests
Na biotests
pH biotests
0
0
0.3
0.6
0.9
Cu dissous mesuré [CuD]
1.2
1.5
Le trait plein correspond à une parfaite corrélation
(théorique) entre valeurs observées et mesurées ; les
traits en pointillées correspondent à des ratios 0.5 et 2
entre valeurs mesurées et simulées.
-1
(µg.L )
Les trois points qui se démarquent sur la Figure 17 peuvent en partie s’expliquer par les faibles niveaux
de concentration (< 0.2 µg/L) pour lesquels l’analyse de Cu par SAA-four n’est pas exempte d’une
forte incertitude analytique (Limite de Quantification du Cu par SAA-four = 0.3 µg/L).
66
A. Effet du Ca sur la cinétique de relargage du Cu
B. Effet du Mg sur la cinétique de relargage du Cu
2.0
1.5
Ca 3 mg.L -1
Ca 10
Mg 0.6 mg.L-1
mg.L -1
1.6
Mg 5 mg .L-1
[Cuw] (µg.L-1)
[Cuw] (µg.L-1)
Ca 40
1.2
Mg 2 mg.L-1
1.2
Ca 20 mg .L -1
mg.L -1
Ca 150 mg .L -1
0.8
0.4
Mg 10 mg.L-1
0.9
Mg 50 mg .L-1
0.6
0.3
0.0
0.0
0
5
10
15
20
25
0
5
10
Time (hours)
15
20
25
Time (hours)
C. Effet du Na sur la cinétique de relargage du Cu
1.5
D. Effet du pH sur la cinétique de relargage du Cu
1.5
Na 1.5 mg.L -1
pH 8.4
Na 3 mg.L -1
Na 20 mg.L -1
0.9
pH 7.7
1.2
Na 10 mg .L -1
[Cuw] (µg.L-1)
[Cuw] (µg.L-1)
1.2
Na 100 mg .L -1
0.6
0.3
pH 6.8
pH 5.9
0.9
pH 4.8
0.6
0.3
0.0
0.0
0
5
10
15
20
25
0
Time (hours)
5
10
15
20
25
Time (hours)
Figure 18. Evolution cinétique mesurée (symboles) et simulée (traits) des concentrations de cuivre dissous en solution ( [ Cu W ] en µg/L) au cours des 24h de la
phase de relargage (24h) en fonction de la composition cationique du milieu.
Les symboles et les lignes représentent respectivement les donnés expérimentales et simulées (solutions analytiques dérivées de l’Eq.
d’accumulation).
67
24 pour la phase
4. CALCUL DES CONSTANTES D’AFFINITE CATIONS – LIGAND BIOLOGIQUE:
DEVELOPPEMENT D’UN BLM–CU POUR LES BRYOPHYTES
Les cinétiques d’accumulation du Cu présentées précédemment, ont permis de mettre en évidence
l’effet des cations majeurs sur la cinétique globale d’accumulation du Cu par les mousses aquatiques.
Les valeurs des paramètres cinétiques (k’1, k-1, k’2, et k-2) nous informent que les cations majeurs
influent majoritairement sur l’étape de fixation (ou adsorption) du métal sur les sites extra-cellulaires –
BL1, alors que l’internalisation du métal dans l’organisme (sites intra-cellulaires) n’est pas modifiée par
ces paramètres de qualité d’eau.
Dans le but de pouvoir quantifier ces effets compétitifs, nous avons développé un modèle (dans le
Chapitre II §.3.2) permettant de relier la constante conditionnelle d’adsorption du métal sur les sites
extra-cellulaire k’1 (i.e. le paramètre cinétique le plus sensible) avec la composition cationique du
milieu :
⎛
⎞
1
⎟
k '1 = k 1 × CC BL1 × ⎜
⎜ 1 + ∑ K C BL × [ C i ] ⎟
i
1
i
⎝
⎠
(Rappel détails calculs:
Eq. 36
cf. Chapitre II.3.2)
où :
- CC BL : représente la capacité complexante
théorique de la membrane biologique
1
- K C BL est constante de complexation du
i
1
cation Ci sur les sites extra-cellulaire –BL1
de la membrane biologique
L’ajustement de ce modèle (Eq. 36) sur les donnés expérimentales (valeurs de k’1, cf. Tableau 4) nous
permet, via le calcul des constantes d’affinités K Ci BL1 , d’estimer (quantifier) la capacité compétitive de
chaque cation Ci sur le ligand biologique. L’évolution entre les constantes conditionnelles d’adsorption
k’1 et les concentrations en cations majeurs Ci, sont graphiquement représentées sur la Figure 19.
A l’exception du sodium (Na), on note que l’augmentation en cations Ci dans la solution se traduit par
une diminution des constantes cinétiques d’adsorption du Cu dans les mousses. Par exemple, pour le
cas du Ca et Mg (Figure 19 A. et Figure 19B.) on observe une diminution d’un facteur 6 de la
constante cinétique k’1 sur les gammes de concentrations en cations étudiées. En revanche, sur la
gamme de concentration en sodium étudiées (Figure 19 C.), on n’observe aucun effet sur la cinétique
d’adsorption. Ce résultat indique que le sodium n’entre pas en compétition avec le cuivre pour la
fixation sur les sites extra-cellulaires, et suggère que ces deux cations (Na et Cu) ne partagent pas les
mêmes sites d’assimilation sur la membrane biologique.
Pour l’effet des protons, on distingue globalement deux zones de pH selon lesquels l’effet des protons
sur la cinétique d’assimilation du Cu diffère : (i) une première phase où l'augmentation du pH (de 4,8 à
6,8) se traduit par une augmentation progressive du nombre de sites deprotonés de la membrane
biologique ({BL1}free = f ([H+]), et par une augmentation de la constante d’adsorption du Cu par les
mousses aquatiques (k’1 = f ([H+]), et (ii) une seconde phase (de pH 7.7 à 8.4) où l’ensemble (ou une
68
grande majorité) des sites de fixation sur la membrane biologique sont libres ({BL1}free = {BL1}max) se
traduisant par une constante cinétique d’adsorption constante (k’1 = k’1 MAX).
D’une manière générale, on constate que la valeur de la constante d’adsorption diffère au maximum
d’un facteur 6 sur une gamme de concentration en cations majeurs représentative des concentrations
généralement observable en milieu naturel. Ce résultat montre clairement que l’accumulation des
métaux dans les mousses aquatique n’est pas exclusivement contrôlée par la fraction de métal libre en
solution (et donc par la présence de ligands compétitifs organiques), mais que certains facteurs
abiotiques (ici les concentrations en cations majeurs) contrôlent et limitent également les cinétiques
d’accumulation. La réduction de ces cinétiques d’adsorption est majoritairement imputable aux effets
compétitifs des cations Ci pour la fixation du Cu sur les sites extra-cellulaires. Ces effets compétitifs
sont quantifiables via le calcul des constantes d’affinités K Ci BL1 tel que :
Tableau 5. Paramètres décrivant l’affinité des cations Ci et du Cu sur les sites extra-cellulaires
a
CATION
Taux maximal d’accumulation du Cu par les mousses
en l’absence de cations compétitifs ([Ci] = 0)
a k'
(h–1)
1 MAX = k1.{CCBL1 }max
Na
Ca
Mg
H
2.11
2.30
2.25
2.21
Constantes d’affinité du Cation Ci
a
log K C i BL 1 (L.mol–1)
1.00
3.47
3.89
5.13
k 1.{CC BL1 }max et K Ci BL1 sont calculées à partir de l’Eq. 36.
Le calcul des constantes d’affinité
K Ci BL1 à partir de la simulation des données expérimentales (selon
l’Eq. 36) nous permet de comparer l’effet des différents cations Ci sur l’accumulation du Cu par les
mousses. Ainsi, on note que les protons représentent les cations qui possèdent l’effet compétitif le plus
marqué, bien que celui-ci ne soit observable que pour des eaux acides (4.8 < pH < 6.8). Le calcium et le
magnésium possèdent quant à eux une affinité similaire pour les sites extra-cellulaires de la membrane
biologique ( log K C i BL 1 = 3.47 et 3.89 respectivement).
Les constantes d’affinité ( log K C i BL 1 ) pour le Ca, Mg, et H obtenus pour les bryophytes aquatiques (F.
antipyretica) sont du même ordre de grandeur que celles repportés pour les daphnies (De Schamphelaere
et al. 2002) ou les poissons (Santore et al. 2001; Niyogi et al. 2004). En revanche, l’effet du sodium pour
les bryophytes ( log K C i BL 1 = 1.00 ) est largement inférieur à celui observés pour les daphnies ( log K C i BL 1
= 3.19 pour D. magna ; (De Schamphelaere et al. 2002)) ou les poissons ( log K C i BL 1 = 3.0 ; (Santore et
al. 2001)).
69
3.0
3.0
k'1 MAX
k'1 MAX
r² = 0.9729
k'1 (h-1)
k'1 (h-1)
2.0
1.0
0.0
0.000
2.0
r² = 0.9872
1.0
0.0
0.001
0.002
0.003
0.004
0.0000
[Ca ] (mol.L-1)
A.
0.0005
0.0010
0.0015
0.0020
-1
[Mg] (mol.L )
B.
pH
9.0
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
3.0
k'1 MAX
k'1 MAX
2.0
k'1 (h -1 )
k'1 (h-1)
8.0
1.0
r² = 0.8721
2.0
1.0
SITES EXTRA-CELLULAIRES
DEPROTONES
SATURATION PROGRESSIVE DES SITES
0.0
0.0
0.000
C.
0.001
0.002
0.003
0.004
10-9
0.005
-1
[Na] (mol.L )
D.
Figure 19. Constantes conditionnelles d’adsorption (k’1) du Cu sur les mousses (mesurées
(C)Na, et (D) protons (pH) du milieu d’exposition.
70
10-8
10-7
10-6
+
10-5
10-4
-1
[H ] (mol.L )
et simulées ⎯ ; Eq. 36) en fonction des concentrations en (A)Ca, (B)Mg,
5. APPLICATION DU BLM– BRYOPHYTES POUR EVALUER LES TENEURS EN
CUIVRE BIODISPONIBLE DANS L’EAU
En fonction de la composition minéralogique des bassins qu’ils traversent, les cours d’eau présentent
généralement des compositions cationiques fortement variables. Comme nous avons pu le montrer en
conditions de laboratoire, la composition cationique modifie significativement les cinétiques
d’accumulation par les mousses aquatiques, et donc contrôle indirectement la biodisponibilité
potentielle du métal. Dans cette section, nous évaluons la sensibilité du modèle (précédemment calé et
validé en laboratoire) pour prédire la biodiponibilité en fonction sur une large gamme de composition
cationique représentative des cours d’eau français.
Exemple d’illustration :
Évaluation de la biodisponibilité du cuivre dans l'eau à partir de mesures
dans les mousses aquatiques autochtones
Dans cet exercice prospectif, nous étudions l'emploi du modèle actuel pour estimer les concentrations
en métal biodisponible dans l'eau à partir des teneurs en métaux des mousses aquatiques autochtones
présentes dans des rivières françaises choisies présentant une large gamme de compositions cationiques
de l’eau. Nous supposons que les bryophytres aquatiques autochtones sont à l'équilibre (i.e. état
stationaire à l’interface eau-bryophytes) avec le milieu pour chaque rivière "i" soumise à une
contamination chronique en métal. Pour chaque contexte hydrographique "i", caractérisé par sa propre
composition cationique (Cai, Mgi, Nai, pHi), les équations décrivant les échanges de métal à l’interface
eau-bryophytes (cf. Chapitre II.2), peuvent être simplifiées en utilisant l'hypothèse d'équilibre pour
calculer la concentration en cuivre biodisponible dans l'eau ( [ Cu W ]i ) :
Eq. 38
[ Cu W ]i =
k -1, i {Cu m }i
×
k'
k '1, i
1 + 2 ,i
k - 2,i
{Cu m }i = 100 µg.g-1
k'1,i = f ([Ca]i, [Mg] i, [Na] i, pH i) (Eq. 37) en L.g-1.h-1
k-1,i = 0.047 h-1
k'2,i = 0.087 h-1 / k –2,i = 0.30 h-1
(Source : Tableau 4, p. 48)
Pour cet exercice prospectif, nous faisons l’hypothèse que les teneurs en cuivre bioaccumulé sont
constantes ({Cu m }i = 100 μg.g-1) pour l’ensemble des mousses aquatique collectées dans les "i" cours
d’eau (i = 1 à 80). La détermination des constantes cinétiques introduites dans le modèle nécessite la
connaissance de la composition cationique du milieu (cf. le calcul de la constante cinétique
d’adsoprption k’1 , Eq. 37). Les teneurs en cations majeurs des 80 cours d’eau étudiés sont obtenues à
71
partir des bases de données des agences de l’eau (caractéristiques chimique de l’eau dans ces 80 stations
fournies en Annexe 2.6). A partir des chroniques de concentrations en cations majeurs (Ca, Mg, Na,
pH) disponibles pour quatre des six agences de l’eau françaises 1 nous avons calculé une concentration
médiane caractéristique pour chacun des cours d’eau "i".
La dispersion de ces concentrations en métal biodisponible [ Cu W ]i calculées pour l’ensemble des 80
"i" cours français sélectionnés est représenté sur la Figure 20. Les concentrations en métal
biodiponible ainsi calculées couvriraient une gamme de concentrations variant de 0.5 à 7 µg/L si la
concentration de cuivre bioaccumulables dans les mousses est supposée être la même pour les 80
échantillons de mousses ({Cu m }i =100 µg.g-1). Cette large dispersion des concentrations en métal
biodiponible calculées pour les ‘‘i’’ cours d’eau met en évidence l’influence de la composition cationique
de l'eau pour l'interprétation des teneurs en métal dans les mousses aquatiques autochtones.
A partir du modèle BLM-Cu on montre ainsi que la fraction biodisponibile pour les bryophytes varie
fortement (d’un facteur 15) en fonction de la composition cationique du milieu. L’application de ce
type de modèle permet ainsi d’envisager une interprétation plus fine des teneurs en métal dans les
mousses autochtones (couramment collectées dans le cadre de programmes de biomonitoring) en
évaluant les concentrations en métal biodisponibles spécifiques pour chaque composition cationique du
cours d’eau.
Composition
cationique faible
et pH > 8.0
Composition cationique
moyenne
et 6.5 < pH < 8.0
Composition cationique
élevée
et pH < 6.5
Fréquence (%)
20
15
10
5
0
0
1
5
th
2
3
percentile
4
5
th
95 percentile
6
7
[ Cu w] i (µg.L -1 )
Figure 20. Représentation graphique de la dispersion des concentrations en métal biodisponible ( [ Cu W ]i )
calculées pour les "i" contextes hydrographiques ("i" = 80 fleuves et rivières françaises).
1
-
Agence Loire-Bretagne :
Agence Rhin-Meuse :
Agence Seine-Normandie :
Agence Rhône-Méditérranné-Corse :
http://carto.eau-loire-bretagne.fr/osur/top.jsp
http://rhin-meuse.eaufrance.fr/choixtheme?lang=fr
http://www.eau-seine-normandie.fr/index.php?id=1628
http://sierm.eaurmc.fr/eaux-superficielles/index.php
72
CONCLUSIONS
Les interactions des cations avec les organismes aquatiques constituent un des facteurs de contrôle
majeurs de la biodisponibilité du cuivre pour les bryophytes en milieu aquatique. A notre connaissance,
peu d’études sont disponibles sur la modélisation de ces interactions entre les cations et les sites actifs à
l’interface eau-bryophytes. À l'heure actuelle, peu d’approches permettent d’incorporer l’effet des
cations pour calculer les seuls de qualité d’eau en fonction de la composition cationique du milieu. La
première approche a dans un premier temps été suggérée par l’US EPA (EPA 1985). Cette approche
consiste en un algorithme, pondérant simplement le critère de qualité d’eau pour les mousses (WQS :
Water Quality Standard) par la dureté de l’eau dans le milieu d’exposition :
Eq. 39
WQS pondéré
⎛H⎞
= WQS × ⎜ ⎟
⎝ 30 ⎠
où : - WQS : correspond au critère de qualité d’eau
pour les mousses aquatiques pour une dureté
d’eau fixée à 30 mg CaCO3 / L.
0.85
- H : est la dureté de l’eau mesurée dans le milieu
d’exposition (en mg CaCO3 / L).
Cependant, cette relation empirique (basée sur des études comparatives), ne prend pas en compte les
mécanismes spécifiques d’interaction des différents cations dont les affinités vis à vis de la membrane
biologique diffèrent selon leur nature (Ca, Mg, Na, protons). Il semblerait donc indispensable de
trouver d’autres critères quantitatifs et qualitatifs plus pertinents qu’une simple relation empirique.
Notre étude, basée sur l’étude des relations entre les concentrations en cations et les cinétiques
d’accumulation du Cu, nous montre que chacun des cations majeurs possèdent des affinités différentes
vis à vis de la membrane biologique des mousses. A l’exception du sodium, pour lequel nous
n’observons aucun effet sur la bioaccumulation du Cu, on observe que l’ensemble des cations majeurs
(Ca, Mg, et pH) réduisent fortement les cinétiques d’accumulation du Cu par les bryophytes aquatiques
sur des gammes de concentrations représentatives des eaux de rivières françaises. A partir de ces
relations il est maintenant possible de prédire l’effet des cations majeurs sur la biodiponibilité du Cu
pour les mousses aquatiques.
Sous réserve de quantifier les paramètres de qualité d’eau (pH, cations majeurs), un tel modèle
d’interprétation (BLM-Cu pour les bryophytes) permet de mieux évaluer la fraction de métal
biodisponible (bioaccumulable) pour des bryophytes exposées dans des milieux contrastés.
73
74
Influence de la MOD sur la biodisponibilité du Cu pour les bryophytes aquatiques
Chapitre IV.
INFLUENCE DES MATIERES ORGANIQUES DISSOUTES
(MOD) SUR LA BIODISPONIBILITE DU CUIVRE : ETUDE
COMPARATIVE ENTRE UN OUTIL BIOMIMETIQUE
(DGT) ET UN BIOINDICATEUR (Bryophytes)
1. INTRODUCTION
Les milieux aquatiques de surface qui subissent une pression anthropique sont souvent le réceptacle des
micro-polluants métalliques issus de l’activité humaine et industrielle. Ces milieux sont également
chargés en matière organique (MO) d’origine anthropique et naturelle. Les matières organiques
présentes dans les eaux naturelles possèdent une très large variété de propriétés et sont constituées d’un
mélange complexe de composés dont au moins 80% ne sont pas structurellement identifiés à l’heure
actuelle (Garnier 2004). De par cette forte variabilité naturelle, les interactions physico-chimiques des
micro-polluants métalliques avec ces matières organiques sont complexes et déterminantes pour
comprendre le devenir de ces contaminants en milieu aquatique. Les capacités de complexation des
matières organiques avec les métaux traces varient énormément selon la nature de la matière organique,
cette nature étant par conséquent un facteur prépondérant dans le contrôle de la spéciation et la
biodisponibilité des métaux en solution.
Depuis une vingtaine d’années, on considère que le paramètre explicatif de la biodisponibilité d’un
métal pour les organismes aquatiques est la concentration en métal libre en solution. Ainsi, le FIAM («
Free Ion Activity Model », (Morel 1983)), puis le BLM (“Biotic Ligand Model”, (De Schamphelaere et
al. 2002)), ont fourni un cadre conceptuel pour l’interprétation de nombreuses expériences portant sur
la biodisponibilité des métaux en présence de ligands organiques. Sauf exceptions notoires (e.g.
l’accumulation du zinc (Hassler et al. 2003), cf. Chapitre I.3.2.3), la concentration en ion libre
représente la fraction de métal la plus réactive vis à vis des ligands potentiels, parmi lesquels la
membrane biologique (et donc la fraction potentiellement la plus toxique pour les organismes).
Dans cette partie, notre objectif est de quantifier et tenter d’expliquer les variations de concentrations
en métal (Cu) biodisponible en fonction de la nature et de la quantité de matière organique présente
dans le milieu d’exposition. Cette étude vise également à évaluer si la concentration en cuivre labile
(estimé à l’aide de différentes techniques de spéciation telles que la DP-ASV 1 ou la technique DGT 2)
est représentative de la fraction de métal biodisponible pour les bryophytes aquatiques, en présence de
DP-ASV : Differential Pulse Anodic Stripping Voltammetry (voltammétrie impulsionnelle différentielle à re-dissolution
anodique)
2 DGT :
Diffusion in Thin Films (Gradient de Diffusion en couche mince)
1
75
différents types de matière organique dissoute présente dans le milieu naturel. Dans le cadre de notre
étude, nous nous intéressons à des MO qui diffèrent par leur origine (naturelle, anthropique ou
bactérienne), leur composition et leur capacité à interagir avec le cuivre.
Ce chapitre décrit dans un premier temps l’étude expérimentale dans laquelle nous testons, en
conditions contrôlées de laboratoire, l’effet de quatre ligands organiques d’origines différentes sur la
spéciation et la biodisponibilité du cuivre pour les bryophytes aquatiques, ainsi que sur l’accumulation
du Cu par un outil censé être ‘‘biomimétique’’, à savoir la DGT. Puis, dans un second temps, nous
interprétons les résultats issus de cette partie expérimentale à l’aide du modèle de bioaccumulation
cinétique (cf. Chapitre II) afin de décrire l’effet des MO sur les mécanismes d’interaction du métal avec
les différents ligands (organiques et biologiques) présents dans le milieu d’exposition.
2. ETUDE EXPERIMENTALE
2.1.
Protocole expérimental du biotest
2.1.1

Exposition des bryophytes
Protocole du biotest
Les bryophytes (10g, poids frais) sont exposées en milieu agité (bacs de 15L), non renouvelé (Figure
12.b), pendant 72 heures, au cours desquelles nous réalisons un suivi cinétique des concentrations en
cuivre dissous (CuD) dans la solution d’exposition (eau minérale Mont Calm ®, dopée à différentes
concentrations en matières organiques dissoutes).
Au début des expositions (t=0), avant l’ajout des bryophytes, le cuivre total dissous et le cuivre labile
sont analysés, au moyen d’une part d’un prélèvement d’eau filtrée (0.2 µm) et acidifiée (HNO3 à 1%),
d’autre part de l’exposition pendant quelques heures (de 2h à 5h) de systèmes DGT (Gradient de
Diffusion en couche mince équipés de gels restricitfs et open pores). A titre comparatif, un échantillon
(50mL) filtré de la solution initiale est également prélevé pour mesurer la fraction de cuivre labile par
voltamétrie à redissolution anodique sur électrode à goutte de mercure (DP-ASV) (cf. § 2.2).
En revanche, ce protocole d’exposition ne nous permet pas d’effectuer un suivi cinétique de la
contamination des bryophytes, car il y a trop peu de biomasse. Nous faisons donc l’hypothèse que la
disparition du cuivre dissous est due à la bioaccumulation dans les bryophytes. Nous vérifions cette
hypothèse à l’issue des 72 heures d’exposition en mesurant le cuivre bioaccumulé dans les bryophytes
(en différenciant les fractions de métal adsorbé et internalisé selon le protocole décrit en Annexes).
76

Les différentes étapes du biotest
Au cours de l’expérience, nous distinguons trois étapes successives au cours desquelles les aspects
dynamiques (bilan de masse théorique du Cu dans les différents compartiments du système) diffèrent :
- Pré-équilibration chimique en solution (24h) : Avant introduction des bryophytes dans le
milieu d’exposition, les solutions d’exposition contenant les matières organiques sont laissées
à équilibrer avec le cuivre ajouté (5µg/L) pendant 24 heures.
- Etape transitoire (de t=0 à t=72h) : Une fois que les bryophytes sont introduites en solution,
l’accumulation du Cu dans ce nouveau compartiment du système déplace les équilibres entre
les différentes formes du Cu en solution.
- Etat d’équilibre entre Cu dissous et Cu accumulé (à t= 72h) : À la fin de l’expérience (t =
72h), l’état d’équilibre est atteint à nouveau, et la solution tend vers l’équilibre chimique.
L’ensemble de ces trois étapes de notre protocole est résumé sur la Figure 21.
Pré-équilibre
chimique en
solution
Équilibre chimique
du système
bryophytes - solution
État transitoire :
déplacement
d’équilibre
CuD
Cunb
Cub
CuD
Cunb
CuD
Cunb
CuD : Cu Total Dissous
Cub
Cum
Cub
Cum
Cunb : Cu non
biodisponible (inerte)
Cub : Cu biodisponible
Cum : Cu bioaccumulé
dans les mousses
Introduction
des mousses
t=0
Mesure du Cu labile initial
et a priori biodisponible
[Cub ] (DGT & DP-ASV)
t=24h
t=72h
t=72h
Suivi cinétique du Cu dissous [CuD] au cours
de l’exposition des mousses
Cu bioaccumulé dans
les mousses (adsorbé
et internalisé)
Figure 21. Représentation schématique des bilans de masse de cuivre au cours des trois étapes successives. Les
flèches symbolisent les flux de cuivre entre ces compartiments.
77
2.1.2
Choix des MOD étudiés et préparation des solutions d’exposition
Par le passé, l’effet des substances humiques a largement été étudié car elles constituent la majorité des
MOD dans les eaux naturelles. Dans notre étude, nous avons sélectionné trois types de MOD
(d’origines algale, bactérienne et anthropique) caractéristiques de différents milieux aquatiques dans
lesquels on les rencontre :

Une Matière organique algale (MO d’origine naturelle) obtenue à partir d’une souche d’algue
fraîche Chlorella vulgaris (souche cultivée en laboratoire dans une eau minérale Mt Calm® dopée
en nitrate et phosphate pour accélérer la croissance algale). Cette MO est obtenue après lyse de
cellules par passage à l’autoclave (à 120 °C pendant 90 min) puis filtration (filtres GF/F grillés).
Le « jus d’algue verte » ainsi préparé est ensuite filtré (filtre GF/F). Le filtrat concentré en MO
algale est ensuite utilisé dilué 2 ou 3 fois dans l’eau Mont Calm® pour la préparation des
différentes concentrations dans le milieu d’exposition (de 0 à 5 mgC/L).

Deux matières organiques d’origine anthropique récoltées en aval de la station d’épuration
d’Achères (sur la Seine en Aval de Paris). Cette MO est extraite et purifiée selon le protocole
utilisé par l’IHSS (International Humic Substances Society) (Leenheer et al. 2000) afin d’en
séparer les fractions dites hydrophobe, transphilique et hydrophile. Le fractionnement de cette
MO selon ses caractéristiques d’hydrophobie est basé sur le passage de l’eau (eau de Seine dans
notre cas) sur des résines retenant de façon sélective certains composants de la MO (Leenheer
1981). La fraction hydrophobe de la MO est retenue sur la résine XAD 8, la fraction dite «
transphilique » est retenue sur la résine XAD 4 et la fraction hydrophile traverse les deux
colonnes (les protocoles d’extraction et de purification réalisés au CEREVE 1 sont décrits en
annexe 2.5). Seules les fractions hydrophobe et transphilique ont fait l’objet notre étude ; la
fraction hydrophile n’ayant pu être convenablement purifiée pour son utilisation dans les
biotests. Les solutions finales d’exposition (de 0 à 5 mgC/L) sont préparées à partir d’une
solution mère concentrée en MO à 250 mgC/L (elle-même préparée par dissolution des
poudres purifiées de MO hydrophobe et transphilique dans de l’eau Mont Calm® sous
agitation à 40°C).

Une matière organique d’origine bactérienne couramment rencontrée dans les eaux de rivière.
La méthylcellulose (dérivé soluble de la cellulose) est un exopolysaccharide (EPS) excrété par de
nombreuses bactéries telles Acetobacter xylinum ou Pseudomonas sp. (bactéries rencontrées en
milieu aquatique marin et d’eau douce (Gagnaire et al. 1980; Paterson-Beedle et al. 2000)). Les
milieux d’exposition (de 0 à 5 mgC/L) sont obtenus par dilution d’une solution mère à 300
CEREVE : Centre d’Enseignement et de Recherche Eau, Ville et Environnement. Laboratoire commun à l'École
Nationale des Ponts et Chaussées, à l'École Nationale du Génie Rural, des Eaux et des Forêts, et à l'Université Paris XII-Val
de Marne.
1
78
mgC/L préparée à partir de méthylcellulose (Sigma, p.a.) dissoute dans de l’eau Mont Calm
(sous agitation, à 40°C).
Notre choix de travailler sur des substrats modèles plutôt que des matrices réelles se justifie
principalement par la nécessité (i) d’avoir des expériences reproductibles, (ii) de différencier l’effet des
différentes sources de MO (algale, urbaine, bactérienne) sur la biodisponibilité du métal, (iii) d’éviter
une contamination de la solution d’exposition par d’autres polluants (potentiellement présents dans des
matrices naturelles) pouvant induire d’autres effets toxiques.
2.2.
Spéciation du cuivre en présence de Matières Organiques Dissoutes (MOD)
contrastées
2.2.1
Echantillonnage et mesure du cuivre labile par DGT
Avant l’introduction des bryophytes, nous effectuons une mesure du cuivre labile dans les solutions
d’exposition. Pour cela, nous utilisons deux types de sondes DGT respectivement équipées de gels
restrictifs (notées R) et non restrictifs (notées NR). L’emploi de ces deux types de gels diffusifs (R et
NR) permet de mesurer deux fractions de métaux en fonction de leur labilité et la taille des complexes
métalliques formés :
- Les sondes DGT équipés de gels dits ‘‘restrictifs’’ : La taille de pores de ces gels est inférieure
à 1 nm. L’emploi de ce type de gels permet de bloquer la diffusion de complexes relativement
larges comme les complexes humiques. Selon Zhang et Davison (2000), ce type de gels
permet une mesure directe du métal inorganique en solution.
- Les sondes DGT équipés de gels dits ‘‘Non Restricfs’’ (ou classiques) : La taille de pores de
ces gels est supérieure à 5 nm, permettant ainsi la diffusion de larges complexes métalliques
ML au travers du gel diffusif (Zhang et al. 2000).
Les sondes DGT sont introduites (triplicats pour chaque type de sondes DGT R et NR testées) dans
les solutions d’exposition (Figure 22) pendant un temps donné (de 4h à 6h pour nos expériences).
Afin de limiter toute source de contamination en laboratoire, les dispositifs DGT utilisés dans nos
expériences nous sont fournis pré-assemblés par le laboratoire DGT Research Ltd. 1 (Landcaster, GB)
du Docteur Hao Zhang.
1
Site internet : http://www.dgtresearch.com
79
NR
R
Figure 22. : Immersion des sondes DGT
(triplicats de mesures, respectivement équipées de
gels Restrictifs (R) et non restrictifs (NR)) dans le
bac d’exposition contenant les solutions à tester.
Le temps d’immersion minimum des dispositifs DGT est d’environ une heure afin d’atteindre l’état
stationnaire de la diffusion ; ce temps ne doit pas, par ailleurs, être trop long afin de s’assurer, d’une
part, que les concentrations en cuivre dans la solution ne varient pas significativement au cours de
l’expérience, et d’autre part que la résine ne soit pas saturée. Dans notre cas, les temps d’immersion des
DGT ont varié entre 4 heures et 6 heures.
Après exposition, les sondes DGT sont démontées sous hotte à flux laminaire. Les résines Chelex sont
placées dans des tubes en polypropylène pour l’élution dans 2 ou 3 mL d’acide nitrique 1 M (HNO3
65% Suprapur Merck dilué dans de l’eau ultrapure) pendant 12 heures (au moins) à 4°C. Hormis le fait
que l’acide permet la désorption des métaux fixés sur la résine, celui-ci permet également de s’affranchir
des problèmes de conservation et d’adsorption des métaux sur les parois du flacon. La concentration
en cuivre dans l’éluat est déterminée par analyse en SAA (four).
2.2.2
Echantillonnage et mesure du cuivre labile par voltammétrie impulsionnelle différentielle à redissolution anodique (DP-ASV)
En complément de la technique DGT, un échantillon de la solution initiale (50mL, triplicat de mesure)
est collecté pour une mesure du cuivre labile par voltamètrie à redissolution anodique sur électrode à
goutte de mercure (DP-ASV). Un descriptif de la procédure expérimentale est fourni en annexe (cf. §
2.2).
Les échantillons collectés dans des flacons en polyéthylène sont filtrés (filtres seringues en téflon, de
porosité 0.2 µm), et stabilisés par ajout d’azoture de sodium (NaN3, 1mM) afin de stopper toute activité
bactérienne dans l’échantillon au cours de la conservation.
Pour le dosage du cuivre labile par DP-ASV, nous avons recourt à des ajouts dosés (ajouts manuels à
partir d’une solution concentrée à 10 µg de Cu/L) dans la cellule de mesure électrochimique contenant
l’échantillon à analyser (dilué au dixième dans une solution électrolyte support de NaNO3 à 0.1 M). Un
récapitulatif du dispositif utilisé pour la mesure du cuivre labile par DP-ASV est décrit sur la Figure 23.
80
L’ensemble de ce dispositif expérimental est connecté à un PC, et piloté à l’aide du logiciel GPES
développé par EcoChemie. Les différents paramètres contrôlant la mesure du cuivre labile par DPASV ont fait l’objet d’une optimisation. Ces paramètres sont rassemblés dans le Tableau 6.
Tableau 6. Paramètres optimisés de la procédure de mesure par DP-ASV.
Etape de la mesure
Descriptif
1) Conditionnement
- Purge N2
- Agitation : 2000rpm
- Durée : 30min- 2h
2) Dépôt
3) Equilibre
4) Redissolution
- Durée 20s
- Agitation : 2000 rpm
- Durée 70s
- Potentiel fixe : - Potentiel initial : -1.1V
- Durée : 120s
- Potentiel fixe (E0) : -1.1V -1.1V
- Potentiel final :à 0.25V
- Vitesse scan : 19mV/s
Électrode de mercure (SMDE)
Électrode
auxiliaire
Agitation
Électrode de référence
N2
Figure 23. Schéma descriptif de la cellule voltamétrique utilisé pour la mesure DP-ASV d’après
Garnier (2004).
81
3. RESULTATS
3.1.
Bilans de masse
Les équations qui décrivent les relations d’échanges à l’interface eau-bryophytes (précédemment décrit
dans le Chapitre II) sont basées sur l’hypothèse d’un bilan de masse vérifié des flux de métal entre les
différents compartiments du modèle (dissous et bioaccumulé). Afin de valider cette hypothèse, nous
vérifions les bilans de masse à l’issue des 72h d’exposition en comparant la quantité de métal disparue
en solution avec la quantité de métal accumulé (adsorbé et internalisé) dans les bryophytes au cours du
biotest.
Le bilan métallique du Cu durant la phase d’accumulation (de t=0 à t=72h) est illustré sur la Figure 24,
pour chacune des matrices étudiées (extraits d’algues, méthylcellulose, et MO hydrophode et
transphilique extraites de Seine).
EXTRAITS D’ALGUES
20
Quantité Cu dissous disparue
Quantité Cu bioaccumulé
Quantité Cu diissous disparue
16
16
12
12
Δ Cu (µg Cu)
Δ Cu (µg Cu)
20
CELLULOSE
8
4
4
0
Extraits
algues
1m gC/L
Extraits
algues
2.5m gC/L
0
Extraits
algues
5m gC/L
Cellulose
1 m gC/L
MOD HYDROPHOBE (HPO) EXTRAITE DE SEINE
20
Cellulose
2.5 m gC/L
Cellulose
5 m gC/L
MOD TRANSPHILIQUE (TPH) EXTRAITE DE SEINE
20
16
16
12
Δ Cu (µg Cu)
Δ Cu (µg Cu)
8
8
4
12
8
4
0
HPO
1m gC/L
HPO
2.5m gC/L
0
HPO
5m gC/L
TPH
1m gC/L
TPH
2.5m gC/L
TPH
5m gC/L
Figure 24. Bilans de masse de Cu pour chacun des biotests en présence des différentes MO étudiées (extraits
d’algues, méthylcellulose, matières organiques hydrophobe et transphilique extraites de Seine). Comparaison
entre les quantités (µg de Cu) de Cu dissous disparu dans les bacs d’exposition et de Cu bioaccumulé dans les
bryophytes aucours des 72 heures d’exposition.
82
Un test de Student bilatéral a été utilisé pour vérifier si les différences entre les différentes fractions de
Cu dissous disparu en solution par rapport au Cu bioaccumulé par les bryophytes sont significatives. Le
niveau de signification adopté pour ce test est de 0,05. Ce test statistique de comparaison de moyenne
nous montre qu’il n’existe pas de différence statistique significative entre les quantités de Cu disparu et
bioaccumulé pour les différents biotests. Les résultats de ces comparaisons de moyennes nous
confirment que la majorité du cuivre dissous disparu en solution se retrouve bien associé aux
bryophytes en fin d’expérience.
3.2.
Mesure de la spéciation du cuivre en présence de MOD selon trois techniques
d’analyse (DGT-R, DGT-NR et DP-ASV)
Les concentrations initiales (avant introduction des bryophytes) en cuivre total dissous et labile
mesurées dans les solutions d’exposition sont représentées sur la Figure 25 pour chaque biotest en
présence des différentes MO testées (extraits d’algues fraîches, méthylcellulose, MOD hydrophobe et
transphilique extraites de Seine). La fraction de Cu labile est mesurée selon trois techniques analytiques:
- La technique DGT équipée de gels non restrictifs (DGT-NR, ) ;
- La technique DGT équipée de gels Restrictifs (DGT-R, ) ;
- La voltamétrie (DP-ASV, ).
83
EXTRAITS D'ALGUES
CELLULOSE
6.0
Concentrations Cu (µg/L)
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
Dissous
Labile DGT NR
Algae extracts 2.5
mgC/L
Labile DGT R
Labile DP-ASV
1.0
Dissous
b)
MO TRANSPHILIQUE (TPH) EXTRAITE DE SEINE
4.0
3.0
2.0
1.0
Méthylcellulose
2.5mgC/L
Labile DGT NR
Labile DGT R
Méthylcellulose
5mgC/L
Labile DP-ASV
MO HHYDROPHOBE (HPO) EXTRAITE DE SEINE
6.0
5.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
Extraits Seine TPH
1mgC/L
Dissous
2.0
Méthylcellulose
1mgC/L
0.0
c)
3.0
Algae extracts 5
mgC/L
6.0
4.0
0.0
Algae extracts 1
mgC/L
a)
5.0
Labile DGT NR
Extraits Seine TPH
2.5mgC/L
Labile DGT R
Extraits Seine TPH
5mgC/L
Labile DP-ASV
Seine River Extracts
1mgC/L
d)
Dissous
2.5mgC/L
Labile DGT NR
Labile DGT R
5mgC/L
Labile DP-ASV
Figure 25. Evolutions des concentrations initiales en Cu dissous et labile (mesuré par DGT Restrictive ou Non
Restrictive, et DP-ASV) en fonction des concentrations en MOD. Les barres d’incertitude représentent l’écart
type sur les réplicats de mesure (n=3 pour le Cu dissous, et mesures DGT ; n=2 pour la mesure par DP-ASV).
Sur l’ensemble des biotests, on constate que l’ajout progressif de ligands organiques (concentrations
variant 1 à 5 mgC/L pour le COD), réduit la fraction de Cu labile en solution (le rapport
[Culabile]i/[Cudissous] varie de 0.06 à 0.63 pour la technique DGT NR, de 0.05 à 0.45 pour la technique
DGT R, et de 0.02 à 0.26 pour la technique DP-ASV). Cependant, en fonction de la nature des ligands
organiques testés, on note des différences importantes pour la labilité du métal.
Tout d’abord, on constate que les extraits d’algues vertes (Figure 25.a) réduisent la fraction de métal
labile moins radicalement que les trois autres ligands organiques à concentration de COD équivalente.
Cette observation est particulièrement vraie lorsque l’on regarde la fraction labile mesurée par les DGT
équipés de gels Non Restrictifs, qui est supérieure, dans la plupart des cas, aux fractions labiles
mesurées par DGT Restrictive (elle même supérieure à celle estimée par DP-ASV). Cette fraction de
complexes organiques labiles exclus par les gels Restrictifs et pouvant diffuser au travers des gels Non
Restrictifs représente environ 15-20 % du Cu total dissous dans le cas des extraits d’algues ; alors
84
qu’elle est inférieure à 4% pour les trois autres ligands organiques étudiés. Cette fraction de complexes
organiques labiles est probablement attribuable à des complexes métal-ligand organique de tailles
comprises entre 1 nm (taille des pores des gels restrictifs,) et 5nm (taille des pores des gels non
restricitfs) qui vont ainsi pouvoir diffuser au travers des pores des gels NR alors qu’il seront exclus
(exclusion stérique) dans le cas des gels R. Des études antérieures (Scally et al. 2003; Tusseau-Vuillemin
et al. 2003) ont mis en évidence des résultats similaires pour des ligands organiques de faible taille
d’origine synthétique tels que le NTA (acide nitrilotriacétique).
En présence de méthylcellulose (Figure 25.b), nous ne constatons pas de différence significative entre
les concentrations de métal labile échantillonnés par DGT (restrictive et non-restrictives) ou par DPASV. Cette similitude entre les différentes techniques de mesure est probablement attribuable à la
formation de complexes Cu-méthylecellulose suffisamment stables (inertes) pour ne pas se dissocier au
cours de leur diffusion dans les gels DGT ou bien dans la couche de diffusion à l’interface solutionélectrode pour la mesure par DP-ASV. Nous supposons donc que les complexes Cu-méthylcellulose
sont des complexes inertes avec des cinétiques de dissociation lentes ne leur permettant pas de se
dissocier pour venir se fixer sur la résine chélatrice dans le cas de la technique DGT ou bien de se
dissocier au contact de l’électrode de Hg dans le cas de la mesure par DP-ASV. En présence de cette
MO d’origine cellulosique, le métal labile mesuré par les trois techniques est donc essentiellement
attribuable à la fraction de métal inorganique.
Dans le cas des fractions hydrophobes (HPO) et transphilique (TPH), Croué et al. (2004) ont pu mettre
en évidence que ces deux fractions de MOD possèdent des caractéristiques structurelles et des
propriétés physico-chimiques fortement contrastées pouvant influencer la spéciation des métaux. Les
extractions de MOD selon le protocole décrit par Croué et al. (2003) permettent théoriquement de
distinguer les deux fractions selon leur affinité vis à vis du cuivre :
- La fraction hydrophobe (fraction HPO isolée sur la résine XAD-8) se compose
majoritairement de substances humiques (composés aromatiques, avec de rapports C/H,
C/O, et C/N élevés) formant des complexes faibles avec le cuivre ;
- La fraction transphilique (fraction TPH isolée sur la résine XAD-4) regroupe majoritairement
les différentes exo-polysacharides, connues pour avoir une forte affinité pour le cuivre.
Néanmoins, aux faibles niveaux de concentrations étudiés nous n’observons pas de différences
significatives sur la spéciation du Cu en présence des deux MOD hydrophobes ou transphiliques
extraites de Seine (Figure 25.c et Figure 25.d). Cette forte similitude entre les deux fractions
(hydrophobe / transphilique) est probablement imputable aux faibles niveaux de contamination étudiés
: ces sites forts de complexation se trouvent probablement dans les deux cas en quantité suffisante par
rapport au cuivre ajouté (5µg/L de Cu dissous). En effet, en comparant les Figure 25.c et Figure 25.d,
on constate que les concentrations en cuivre labile obtenues pour ces deux fractions de MO, sont très
proches à concentration en COD équivalente. Contrairement aux extraits algaux, les concentrations en
85
cuivre labile mesurées par DGT équipées de gels Restrictifs ou Non Restrictifs sont très proches. Ce
résultat, nous indique que les complexes Cu-OM de Seine sont suffisamment stables (faiblement
labiles) pour ne pas se dissocier au cours lors de leur diffusion dans les gels DGT. En revanche, on
constate que les concentrations en cuivre labile mesurées par DP-ASV sont sensiblement inférieures à
celles mesurées par DGT. Néanmoins, ces différences restent minimes compte tenu des incertitudes
liées au protocole expérimental et aux techniques de mesure.
Les différentes concentrations en cuivre mesurées par DP-ASV, DGT R et DGT-NR sont comparées
deux à deux sur la Figure 26. Sur la Figure 26.c. On observe une bonne corrélation entre les
concentrations en Cu labile mesurées par DGT Restrictive et Non Restrictive (r² = 0.94). La Figure
26.c montre que les concentrations mesurées par DGT Non Restrictive sont logiquement supérieures
aux concentrations mesurées par DGT Restrictive (pente de la droite de régression : pc = 1.22). En
effet, la fraction mesurée par les DGT équipées de gels NR intègrent a la fois le métal inorganique,
également mesurée par les DGT R, mais aussi une partie des complexes organiques labiles capables de
se dissocier au cours de leur diffusion dans les gels NR pour venir se fixer sur la résine chélatrice de la
DGT. On note que les corrélations entre la fraction labile mesurée par DP-ASV et celles mesurées par
DGT Restrictive (Figure 26.a, r² = 0.71) ou DGT Non Restrictive (Figure 26.b, r² = 0.68) sont
nettement moins évidentes que pour les corrélations entres les fractions labiles mesurées par les
dipositifs DGT équipés de gels restrictifs et non restrictifs (Figure 26.c, r² = 0.94). La tendance qui se
dégage de ces graphes, nous montre que la mesure par DP-ASV est statistiquement inférieure à la
fraction mesurée à l’aide des dispositifs DGT (équipées de gels R ou NR, respectivement). Ces résultats
nous montrent que la DP-ASV échantillonne généralement une fraction de cuivre labile plus faible que
les dispositifs DGT (équipés de gels R ou NR) et donc probablement plus proche de la fraction
strictement inorganique.
86
2.5
3.5
y = 1.6486x
R2 = 0.6839
3
2
[Cu labile ]DGT NR (µg/L)
[Cu labile ]DGT R (µg/L)
y = 1.342x
R2 = 0.712
y=x
1.5
1
0.5
2.5
y=x
2
1.5
1
0.5
0
0
0
0.5
1
1.5
2
0
2.5
[Cu labile ]DP-ASV (µg/L)
a)
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
[Cu labile ]DP-ASV (µg/L)
b)
3.5
[Cu labile ]DGT NR (µg/L)
3
2.5
y =x
y = 1.2247x
R2 = 0.938
2
Exsudats d'algues
HPO
TPH
Cellulose
1.5
1
0.5
0
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
[Cu labile ]DGT R (µg/L)
c)
Figure 26. Corrélations entre les différentes fractions de Cu labile mesurées par DGT Restrictive, DGT Non
Restrictive, et DP-ASV.
3.3.
Influence
des
matières
organiques
dissoutes
sur
les
cinétiques
de
bioaccumulation du cuivre
3.3.1
Le cas particulier des extraits d’algues vertes
L’évolution des concentrations (mesurées et simulées) du cuivre total dissous, adsorbées sur les
bryophytes et internalisées dans les bryophytes en matrice minérale et organique (concentrations en
matière organique d’origine algale : 1.06, 2.47 et 4.92mgC/L de COD) sont illustrées sur la Figure 27.
On observe qu’en présence de matière organique algale, les cinétiques de disparition du cuivre dissous
[CuD] sont modifiées : le plateau final est supérieur à celui obtenu en milieu minéral, et les cinétiques
initiales de diparition du Cu dissous sont moins rapides. Les résultats expérimentaux et la modélisation
nous montrent que les cinétiques du cuivre dissous [CuD] en solution tendent vers un plateau indiquant
un état d’équilibre entre le cuivre en solution et le cuivre accumulé sur les bryophytes. A l’équilibre
(après 72h d’exposition), on observe une disparition de 62%, 49% et 37% du cuivre dissous initial (5 µg
de Cu/L) en présence de 1.06, 2.47 et 4,92 mgC/L en COD respectivement. De même, à l’issue des 72
87
heures d’exposition, l’analyse du cuivre dans les mousses nous indique que les deux tiers (63-66% du
Cu total accumulé) du cuivre bioaccumulé se trouve adsorbé sur les bryophytes alors que le tiers restant
(37-34% du Cu total accumulé) est internalisé.
Sur les trois concentrations étudiées, on constate que l’ajout de matière organique algale réduit les
cinétiques initiales de disparition du cuivre dissous en solution (et donc d’accumulation dans les
mousses) et les quantités de cuivre mesurées dans les bryophytes à l’issue des 72 heures d’exposition.
Cela signifie que la MO algale complexe le cuivre libre en solution, l’ajout de cette MO algale diminue
la fraction accumulable pour les bryophytes. Ceci confirme que la présence de matière organique algale
dissoute réduit la biodisponibilité du cuivre en solution pour les bryophytes.
Les paramètres cinétiques calculés par modélisation pour cette matrice organique sont regroupés dans
le Tableau 7, et comparés aux valeurs obtenues en matrice minérale.
Tableau 7. Valeurs des différentes constantes cinétiques (en h-1) obtenues par modélisation, décrivant
l’accumulation du cuivre dans les bryophytes en matrice minérale et organique algale.
Matrice
k’1 (h-1)
k-1 (h-1)
k’1 / k-1
k2 (h-1)
k-2 (h-1)
k’2 / k-2
2.842
0.377
7.54
0.036
0.020
1.80
0.881
0.652
0.443
0.882
1.034
1.017
1.00
0.63
0.44
0.029
0.033
0.035
0.030
0.033
0.033
0.99
1.00
1.07
Matrice Minérale (0 mgC/L)
Extraits d’algues 1.06 mgC/L
Les valeurs des constantes cinétiques issues de la modélisation, nous indiquent que la constante
cinétique conditionnelle d’adsorption k’1 est le paramètre le plus affecté par la présence et par la
variation de la concentration en MO algale dans le milieu (k’1 variant de 2.842 h-1 pour milieu minéral à
0.443 h-1 en présence de 5mgC/L d’extraits algaux). La constante cinétique de désorption k-1 varie peu
pour les trois concentrations de MO algale étudiées (valeur moyenne k-1 = 0.978 ± 0.083 h-1, n = 3),
mais demeure largement supérieure à la valeur obtenue en matrice minérale (k-1 = 0.377 h-1). Cette
différence pour les valeurs de la constante de désorption k-1 avec le milieu minéral s’explique par le fait
que la MO algale agit comme un ligand compétiteur dans le milieu pouvant désorber le Cu fixé sur les
sites de la paroi membranaire des bryophytes. Ce phénomène de compétition entre ligands organiques
et biologiques se traduit donc par des valeurs plus faibles de k-1 en matrice minérale et plus élevées en
présence de MO algale dans le milieu.
La valeur du rapport k’1/k-1 rend compte de l’état d’équilibre entre les cinétiques initiales d’adsorption
et de desorption. En effet, l’évolution de ce rapport en fonction des teneurs en MOD traduit
indirectement l’effet de celle-ci sur la cinétique globale de bioaccumulation : une diminution de la
cinétique initiale de bioaccumulation se traduit indirectement par une diminution de la valeur de ce
rapport de constantes. Ici, les différents ajouts de MO algale réduisent la valeur de ce rapport d’un
facteur 2.1 sur la gamme de concentration en MO étudiée (COD variant de 1.06 à 4.92 mgC/L). La
88
modification de ce rapport illustre le fait que la fraction initiale de Cu biodisponible est réduite par
l’ajout de MO en solution.
Les valeurs des constantes cinétiques d’internalisation et de relargage (k’2 et k-2) sont plus faibles (plus
d’un ordre de grandeur de différence) que les constantes cinétiques d’adsorption (k’1) et de desorption
(k-1) pour chaque concentration en MO étudiée. Cette différence, nous confirme que même en
présence d’extraits d’algues, qui réduisent la cinétique d’adsorption (cf. ci dessus), l’internalisation et le
relargage sont des processus bien plus lents que les échanges de Cu à l’interface eau-bryophytes
(adsorption/desorption). La variation de la concentration en MO algale dans le milieu n’influe pas
significativement sur les valeurs de ces constantes d’internalisation et relargage, bien que le rapportt
d’internalisation soit plus faible en présence de MO algale qu’en matrice minérale seule (k’2/k-2 = 1.80
en matrice minérale et 1.02 ± 0.04 en présence de MO algale).
3.3.2
Cas des trois autres MOD (méthylcellulose et MOD extraites de Seine)
Du fait de la similitude des résultats, l’effet de ces trois MOD sur les cinétiques de bioaccumulation du
Cu sont discutées dans un même paragraphe.
L’évolution des concentrations (mesurées et simulées) du cuivre total dissous, adsorbées sur les
bryophytes et internalisées dans les bryophytes en matrice minérale et organique (Méthylcellulose,
MOD Hydrophobe et Transphilique extraites de Seine) sont représentées sur les Figure 28, Figure 29
et Figure 30. L’ensemble des paramètres cinétiques calculés par modélisation pour chacune des trois
MOD sont regroupés dans le Tableau 8, et comparés aux valeurs obtenues en matrice minérale.
Tableau 8. Valeurs des différentes constantes cinétiques (en h-1) obtenues par modélisation, décrivant
l’accumulation du cuivre dans les bryophytes en matrice minérale et en présence de différentes MOD
(méthylcellulose, MOD Hydrophobe et Transphilique extraites de Seine).
Matrice
Matrice Minérale
Méthycellulose
Méthycellulose
Méthycellulose
MOD Hydrophobe
MOD Hydrophobe
MOD Hydrophobe
MOD Transphilique
MOD Transphilique
MOD Transphilique
0 mgC/L
1.11 mgC/L
2.21 mgC/L
5.09 mgC/L
1.24 mgC/L
2.52 mgC/L
5.05 mgC/L
1.42 mgC/L
2.50 mgC/L
5.36 mgC/L
k’1 (h-1)
k-1 (h-1)
k’1 / k-1
k2 (h-1)
2.842
0.377
7.54
0.036
0.020
1.80
1.066
0.682
0.458
1.435
1.043
0.775
0.74
0.65
0.59
0.043
0.035
0.033
0.042
0.033
0.030
1.03
1.08
1.11
1.055
0.799
0.343
2.015
1.720
0.956
0.52
0.47
0.36
0.083
0.073
0.112
0.044
0.037
0.053
1.91
2.00
2.10
0.897
1.220
0.74
0.054
0.060
0.89
0.698
0.334
1.252
0.670
0.56
0.50
0.052
0.044
0.051
0.049
1.01
0.90
89
k-2 (h-1)
k’2 / k-2
a) Cinétique de consomation du Cu dissous
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
50
40
40
d.w.)
2.5
0.5
{Cu ads} (µg/g
[CuD] (µg/L)
3.5
4
50
{Cuint} (µg/g d.w.)
5
c) Cinétique d'internalisation
b) Cinétique d'adsorption
4.5
3
2
1
30
20
30
20
10
10
0
0
12
24
36
48
60
0
0
72
0
12
24
36
t (heures)
48
60
0
72
12
24
36
48
60
72
t (heures)
t (heures)
Algues 5mgC/L-Mesuré
Algues 2.5mgC/L-Mesuré
Algues 1mgC/L-Mesuré
Matrice Minérale-Mesuré
Algues 5mgC/L-Simulation
Algues 2.5mgC/L-Simulation
Algues 1mgC/L-Simulation
Matrice Minérale-Simulation
Figure 27. Evolution en fonction du temps des concentrations mesurées et simulées en a) cuivre dissous [CuD], b) adsorbé {Cuads} et c) internalisé {Cuint}, en
présence d’extraits d’algues (1.06 , 2.47 et 4.92 mgC/L de COD) et en matrice minérale.
50
50
40
40
3.5
{Cuads} (µg/g d.w.)
4
2.5
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
3
2
4.5
5
[CuD] (µg/L)
30
20
0
0
0
0
12
24
36
48
60
72
20
10
10
1
30
0
12
24
t (heures)
36
48
60
72
0
12
24
36
48
60
72
t (heures)
t (heures)
Cellulos e 5m gC/L-Mes uré
Cellulos e 2.5m gC/L-Mes uré
Cellulos e 1m gC/L-Mes uré
Matrice Minérale-Mes uré
Cellulos e 5m gC/L-Sim ulation
Cellulos e 2.5m gC/L-Sim ulation
Cellulos e 1m gC/L-Sim ulation
Matrice Minérale-Sim ulation
Figure 28. Evolution en fonction du temps des concentrations mesurées et simulées du a) cuivre dissous [CuD], b) adsorbé {Cuads} et c) internalisé {Cuint}, en
présence de méthylcellulose (1.11 , 2.21 et 5.09 mgC/L de COD) et en matrice minérale.
90
D’une manière générale, on note de nombreuses similitudes sur les cinétiques de bioaccumulation du Cu
pour ces trois MOD, qui se traduisent par :
- un effet marqué des différentes MOD sur la cinétique initiale de bioaccumulation du Cu, qui se
traduit par des rapports k’1/k-1 plus faibles que ceux obtenus pour les extraits d’algues (à
concentration en COD comparable) ;
- une variation faible du rapport k’1/k-1 qui est d’un facteur 1.25-1.46 sur la gamme de
concentrations en COD pour l’ensemble des trois MOD (respectivement 1.25, 1.44 et 1.46 pour
les biotests en présence de méthylcellulose, d’extraits de MOD de Seine Hydrophobe et
Transphilique) ;
- des valeurs de plateaux d’équilibre (Cu dissous, adsorbé et internalisé) fortement déplacés en
présence de ces trois MOD par rapport aux résultats obtenus en matrice minérale ;
- des teneurs de Cu bioaccumulé (adsorbé + internalisé) en fin d’expérience (t = 72h) très proches
pour les trois MOD (statistiquement équivalentes) et plus faibles que celles mesurées pour les
extraits d’algues (à concentration en COD comparable).
Ces similitudes entre les trois MOD nous conduisent à conclure qu’aux concentrations (faibles) utilisées
dans cette étude, ces trois MOD possèdent des effets similaires sur la biodisponibilité initiale du Cu pour
les bryophytes.
Néanmoins, on note un effet particulier de la MOD Hydrophobe sur la cinétique d’internalisation du Cu.
En effet, en présence de MOD transphilique, le rapport k’2/k-2 ( k' 2/k - 2 = 2.00 ± 0.1 ; n = 3 concentrations
en COD) deux fois plus important que ceux habituellement observés pour les trois autres MOD (extraits
d’algues, méthylcellulose et MOD transphilique de Seine : k' 2/k - 2 = 1.01 ± 0.08 ; n = 9). Concrètement,
ceci signifie que l’internalisation du Cu par les bryophytes est deux fois plus rapide en présence de MOD
hydrophobe, qu’en présence d’extraits d’algues, de méthylcellulose ou de MOD transphilique extraite de
Seine. Contrairement aux exemples précédents (extraits d’algues, méthylcellulose, MOD transphilique
extraite de Seine), nous supposons qu’en présence de MOD hydrophobe de Seine, le ligand organique
participe à la formation d’un complexe métallique ternaire sur les sites spécifiques. Dans ce cas,
l’internalisation du métal est proportionnelle non seulement au métal labile en solution, mais également à la
concentration du ligand organique présent en solution. On recense dans la littérature plusieurs exemples de
biodisponibilité de complexes inorganiques comme CuOH+ pour la daphnie (Meador 1991), CdCl+ pour
des bactéries (Villaescusa et al. 1996) ou encore PbOH+ et PbCO3 pour des algues (Slaveykova et al. 2003).
De même, les travaux de Campbell et al. (2002) ont permis de démontrer que l’internalisation du cadmium
par l’algue verte Pseudokirchneriella subcapitata métal est partiellement contrôlée par la formation de
complexes ternaires Cd-alanine. Il pourrait en être de même avec des ligands plus complexes comme dans
le cas du complexe entre Pb et des acides fulviques (Slaveykova et al. 2003). Ce type d’interaction est
probablement également mis en jeu dans l’internalisation du Cu par les bryophytes aquatiques en présence
de MOD hydophobe extraite de Seine.
91
50
50
4.5
2.5
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
3
40
[CuD] (µg/L)
3.5
4
0.0
40
{Cuads } (µg/g d.w. )
5
30
20
2
30
20
10
10
1
0
0
0
12
24
36
48
60
0
72
12
24
t (heures)
36
48
60
0
72
0
12
24
36
t (heures)
HPO 5mgC/L-Mesuré
HPO 5mgC/L-Simulation
HPO 2.5mgC/L-Mesuré
HPO 2.5mgC/L-Simulation
48
60
72
t (heures)
HPO 1mgC/L-Mesuré
HPO 1mgC/L-Simulation
présence de MOD Hydrophobe extraite de Seine (1.24 , 2.62 et 5.25 mgC/L de COD) et en matrice minérale.
5
{Cuads} (µg/g d.w.)
[CuD] (µg/L)
3.5
4
2.5
0.0
3
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
2
1
50
50
40
40
4.5
30
20
0
12
24
36
48
60
0
72
0
0
12
t (heures)
24
36
48
60
72
t (heures)
TPH 5mgC/L-Mesure
TPH 5mgC/L-Simiulation
20
10
10
0
30
TPH 2.5mgC/L-Mesure
TPH 2.5mgC/L-Simulation
TPH 1mgC/L-Mesure
TPH 1mgC/L-Simulation
0
12
24
36
48
60
t (heures)
présence de MOD Transphilique extraite de Seine (1.42 , 2.52 et 5.36 mgC/L de COD) et en matrice minérale.
92
72
4. INTERPRETATION
4.1
Caractérisation de la labilité des différents complexes Cu-MOD

Modélisation
Le plus simple des modèles proposés pour décrire les interactions entre métaux et MOD consiste à
considérer que les polluants se partagent entre deux phases, l’eau et la matière organique. Ainsi pour
un métal donné et un type de MOD, on peut définir la constante d’affinité KMOD (en L/mgC), à
l’équilibre de la fixation du métal sur le carbone organique dissous :
K MOD =
où :
C MOD
C Labile × [COD ]
Eq. 40
- CMOD : concentration dans l’eau de métal fixé sur la MOD (en µg/L)
- CLabile : concentration dans l’eau de métal labile (en µg/L)
- COD : la concentration en matière organique dissoute dans l’eau (en mgC/L).
On a donc les concentrations en métal dans l’eau sous formes labile (CLabile), et dissoute fixée sur les
MOD (CMOD) qui s’écrivent en fonction de la concentration totale dissoute dans le milieu CTotal tel
que :
C Total = C Labile + C MOD
Eq. 41
A partir des Eq. 40 et Eq. 41 la concentration en métal labile en fonction de la concentration en
carbone organique s’écrit :
C Labile =
C Total
1 + K MOD × [COD ]
Eq. 42
Cette équation présente l’intérêt de pouvoir simuler la saturation des sites d’adsorption pour les
fortes concentrations en polluant.
Notons que cette approche reste très macroscopique dans la mesure où la concentration en matière
organique dissoute s’exprime dans l’Eq. 40 en mgC/L. Une caractérisation plus fine de la réactivité
la MOD nécessiterait de rapporter ce paramètre au nombre de sites réactionnels de la MOD. La
connaissance du nombre de sites réactionnels de la MOD nécessiterait des outils d’investigation tels
que le titrage potentiométrique de la MOD. Une telle caractérisation des MOD n’ayant pas fait
l’objet d’une étude approfondie dans notre cas, l’interprétation faite de la réactivité de la MOD telle
que décrite par l’Eq. 40, ne permet que de comparer les effets de la variation de la concentration en
MOD sur la spéciation du métal en solution.
93

Calcul des différentes constantes d’affinité apparentes pour chaque MOD
Pratiquement, la constante d’affinité KMOD est estimée pour chaque type de matière organique par
régression non-linéaire (Eq. 42) sur les valeurs des concentrations initiales mesurées de CLabile (par
DGT ou DP-ASV) en fonction des concentrations en MOD (mgC/L). Deux exemples
d’application du modèle sont représentés sur la Figure 31 (pour les cas des extraits d’algues et la
méthylcellulose).
Méthylcellulose
5
5
4
4
(µg/L)
6
3
K MOD = 0.65
CLabile
CLabile
(µg/L)
Extraits d'algues
6
2
K MOD = 1.13
1
K MOD = 1.98
3
K MOD = 2.59
2
1
K MOD =3.56
K MOD =2.00
0
0
0
1
2
3
4
5
6
0
[COD ] (mg/L)
1
2
3
4
5
6
[COD ] (mg/L)
DGT-NR Mesure
DGT-R Mesure
DP-ASV Mesure
DGT-NR Mesure
DGT-R Mesure
DP-ASV Mesure
DGT-NR Modèle
DGT-R Modèle
DP-ASV Modèle
DGT-NR Modèle
DGT-R Modèle
DP-ASV Modèle
Figure 31. Exemples d’ajustement du modèle (Eq. 42) sur des observations de réduction de la fraction labile
(mesurée par DGT R, DGT-NR et DP-ASV) par la MOD algale et la méthylcellulose.
Les valeurs des constantes d’affinité KMOD des différentes MOD ainsi calculées à partir des
concentrations de CLabile (mesurées par DGT-R, DGT-NR, DP-ASV) sont récapitulées sur le
Tableau 9.
Tableau 9. Valeurs des constantes d’affinités KMOD (en L/mgC) associé à chaque type de MOD, calculées à
partir de l’ Eq. 46 (r ² = coefficient de détermination de régression non-linéaire)
DGT-NR
Matrice
Extraits d’algues
MOD Transphilique
Méthylcellulose
MOD Hydrophobe
DGT-R
DP-ASV
KMOD
r²
KMOD
r²
KMOD
r²
0.65
1.89
1.98
2.34
0.99
0.98
0.88
0.89
1.13
2.26
2.59
3.01
0.99
0.99
0.96
0.97
2.00
3.51
3.56
4.10
0.96
0.79
0.94
0.67
94
Les valeurs de KMOD nous montre que l’affinité du Cu varie fortement en fonction de la nature de la
MOD. Les valeurs ainsi calculées nous permettent de comparer les différentes MOD entre elles en
fonction de leur capacité à fixer le métal :
MOD Hydrophobe de Seine > MOD Transphilique ~ Méthylcellulose > Extraits d’algues
Cette tendance est vérifiée pour les trois techniques de spéciation (DGT-R, DGT-NR et DP-ASV).
4.2
Etude comparative des différentes techniques de mesure de la spéciation
(DGT et DP-ASV) pour évaluer la fraction métallique biodisponible
Les études destinées à évaluer la pertinence de la fraction métallique labile comme « mime » de la
fraction biodisponible sont nombreuses (Meylan 2003; Meylan et al. 2003; Tusseau-Vuillemin et al.
2004). A notre connaissance, cette corrélation n’est pas démontrée pour les mousses aquatiques en
présence de MO naturelles. Il nous a donc semblé important de vérifier que les fractions
bioaccumulables par les bryophytes et labiles (mesurées à l’aide par différentes techniques de
spéciation) étaient effectivement comparables. L’objectif de cette section est donc de vérifier s’il
existe une corrélation entre la fraction de métal biodisponible pour les bryophytes et la fraction de
métal labile.
4.2.1
Calcul des concentrations de métal biodisponible à partir des cinétiques initiales de
bioaccumulation :
Au début de l’exposition, les bryophytes (qui ont été prélevées sur un site de référence), sont peu
contaminées en Cu (15,5 ± 2,6 µg.g-1) et ne désorbent pas de cuivre ([CuD]=0,08± 0,11 µg.L-1)
pendant 48 heures d’exposition en eau minérale non contaminée). Au cours des premières minutes
du biotest, les flux de desorption de désorption et d’élimination peuvent être considérés comme
négligeables par rapport à l’adsorption. Ces hypothèses nous permettent d’établir qu’à l’instant
initial, le taux de bioaccumulation, noté − d[ Cu D ] dt t∈V( 0 ) (µg of Cu.L-1.h-1) est proportionnel à la
concentration en métal biodisponible en solution et à la constante d’adsorption déterminée en
matrice minérale ( k 1, Minéral = 2.84 h −1 ; (Ferreira et al. 2008)) :
−
d[ Cu D ]
= k 1, Minéral × [ Cu biodipo ]t =0
dt t∈V( 0 )
Eq. 43
Expérimentalement, nous évaluons le taux initial de bioaccumulation tel que :
95
− d[ Cu D ] dt t∈V( 0 ) =
[ Cu D ]t =0 − [ Cu D ]t =5 min
t 5 min
Eq. 44
La concentration en métal biodisponible dans l’eau s’écrit alors :
− d[ Cu D ] dt t∈V( 0 )
[ Cu biodipo ] =
Eq. 45
k '1, Minéral
Les concentrations initiales en métal biodisponible ainsi estimées pour chaque concentration en
MOD, sont comparées aux concentrations en métal dissous et labiles (Figure 32).
4.2.2
La fraction de métal labile est-elle représentative de la fraction biodisponible ?
Pour chaque concentration en MOD, la comparaison des concentrations en cuivre biodisponible et
les concentrations en cuivre labile nous permettent de vérifier si les différentes approches de
détermination de la fraction de métal labile sont représentatives du métal biodisponible pour les
bryophytes. Un test de Student bilatéral a été utilisé pour vérifier si les différences entre ces
différentes fractions sont significatives.
Tout, d’abord, on note sur la Figure 32, que pour l’ensemble des MOD testées, les concentrations
en métal dissous surestiment largement les concentrations en métal biodisponible pour les
bryophytes. La fraction de métal dissous n’est donc pas représentative de la fraction biodisponible
pour les bryophytes.
La comparaison des concentrations labiles avec les concentrations biodisponibles estimées sur la
base de la bioaccumulation (Eq. 45) met en évidence des comportements particuliers pour les
différentes MOD. Ainsi, on constate que la fraction de métal biodisponible est systématiquement
supérieure (à l’exception du cas des MOD transphiliques extraites de Seine) à la fraction de métal
mesuré par les dispositifs DGT équipées de gels restrictifs (Zhang et al. 2000) ou par DP-ASV.
Similairement, des études antérieures (Meylan et al. 2004) ont montré que le cuivre biodisponible
pour le périphyton comprenait, non seulement le cuivre inorganique, mais aussi une fraction de
complexes labiles, plus faibles que les associations Cu-périphyton. Cette explication semble
vraisemblable pour expliquer la biodisponibilité du Cu pour les bryophyes en présence d’extraits
d’algues. Cette fraction de complexes labiles correspondrait alors à la différence entre les
concentrations en cuivre biodisponible et le cuivre inorganique mesuré par la DGT-R (mesurant
théoriquement la fraction strictement inorganique selon (Zhang et al. 2000)). Pour le cas des extraits
d’algues, on note que les concentrations en métal labile mesurées par les dispositifs DGT équipées
de gels non restrictifs se rapprochent le plus des concentrations en métal biodisponible. Cela semble
donc indiquer, qu’en présence d’extraits d’algues les gels NR permettent la diffusion de ces
96
complexes organiques thermodynamiquement faible et biodisponibles (contrairement aux gels
restrictifs ou à la DP-ASV qui sous estiment la fraction biodisponible).
En présence de méthylcellulose, les concentrations de métal labile (mesurées par DGT-R, DGTNR, ou DP-ASV) sous-estiment les concentrations en cuivre biodisponible pour les bryophytes. Ces
différences sont principalement attribuables au caractère plus ou moins « labile » de certains
complexes faiblement fixés sur la MOD, pouvant être désorbés au contact de la membrane
biologique (Ferreira et al. 2008), mais restant inaccessibles pour les DGT (R et NR) ou pour la
DPASV. Néanmoins, au vu des résultats sur la Figure 32, on peut considérer que la fraction de
métal biodisponible est assez bien mesurée par les différentes techniques d’échantillonnage (DGT,
DPASV), la fraction de complexes métalliques biodisponibles non-mesurables par ces techniques
représentant une fraction minime du métal biodisponible pour les bryophytes. De plus ces
différences (entre fractions labiles et biodisponible) demeurent difficilement interprétables compte
tenu des incertitudes liées au protocole expérimental, aux mesures, et aux régressions
mathématiques (notamment pour le calcul des concentration du Cu biodisponible, Eq. 45).
Pour les extraits de Seine hydrophobes et transphiliques, les concentrations de cuivre labile
mesurées par DGT (R ou NR) ou DP-ASV sont très proches des concentrations en Cu
biodisponible pour les bryophytes (excepté pour la fraction labile mesuré par DP-ASV qui sousestime le biodisponible en présence de 5 mgC/L de MOD hydrophobe).
L’ensemble de ces résultats met en évidence la forte variabilité de la capacité à moduler la
biodisponibilité et de la spéciation du cuivre selon la nature de la MO. Par exemple, à concentration
en COD comparable, les extraits d’algues vertes réduisent deux fois moins la biodisponibilité que
les extraits transphiliques issus de la Seine.
D’une manière générale, les extraits d’algues vertes ont un effet plus faible que les matières
organiques hydrophobes et transphiliques des MOD extraites de Seine. La méthylcellulose, présente
un effet intermédiaire entre la MOD d’origine algale et les MOD issues de rivières anthropisées. Ces
différences sont difficilement explicables de manière précise car les modes d’interactions des métaux
avec la MOD sont nombreux et cette dernière très complexe dans sa composition.
97
EXTRAITS D'ALGUES
5.0
4.0
3.0
2.0
**
1.0
**
*
0.0
Dissous
Labile DP-ASV
4.0
3.0
2.0
* *
1.0
Algae extracts 2.5
mgC/L
Labile DGT NR
Biodisponible
Algae extracts 5
mgC/L
Méthylcellulose
1m gC/L
Diss ous
Labile DP-ASV
Labile DGT R
MO TRANSPHILIQUE (TPH) EXTRAITE DE SEINE
6.0
5.0
5.0
0.0
Algae extracts 1
mgC/L
6.0
CELLULOSE
6.0
6.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
Méthylcellulos e
2.5m gC/L
Labile DGT NR
Biodiponible
Dissous
Labile DP-ASV
Extraits Seine TPH
2.5mgC/L
Labile DGT NR
Biodisponible
Extraits Seine TPH
5mgC/L
Labile DGT R
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
*
1mgC/L
Labile DGT R
Méthylcellulose
5m gC/L
MO HHYDROPHOBE (HPO) EXTRAITE DE SEINE
0.0
Extraits Seine TPH
1mgC/L
* * *
Dissous
Labile DP-ASV
2.5mgC/L
Labile DGT NR
Biodisponible
5mgC/L
Labile DGT R
Figure 32. Spéciation et biodisponibilité initiale du cuivre dans les solutions d’exposition : cuivre total dissous, labile (mesuré par la technique DGT équipée de gels
R ou NR et par DP-ASV) et biodisponible (estimé selon l’Eq. 45).
*
Différence significative par rapport à la fraction biodisponible ( p < 0.05) ;
98
**
Différence significative par rapport à la fraction biodisponible (p < 0.01).
CONCLUSION
L’objectif de cette étude était (i) de comprendre l’effet de la quantité et de la qualité des matières
organiques sur la biodisponibilité du Cu pour les bryophytes aquatiques et (ii) d’évaluer la capacité
de la technique DGT et de la DP-ASV à quantifier cette fraction métallique biodisponible selon la
nature de la matière organique.
Les résultats de cette étude nous montrent tout d’abord que les quatre MOD testées (d’origines
algale, anthropique et bactérienne) réduisent fortement la biodisponibilité du Cu pour les
bryophytes. Cette étude montre également une raisonnablement bonne corrélation entre la fraction
labile mesurée par DGT (ou par DP-ASV dans certains cas) et la fraction biodisponible pour les
bryophytes aquatiques. Dans quelques cas, en présence de méthylcellulose en particulier, la fraction
de métal labile sous-estime légèrement la fraction biodisponible, les fractions labiles échantillonnées
par DGT ou par la DP-ASV étant plus restrictives. Néanmoins, pour l’ensemble des MOD, l’erreur
faite en estimant la biodisponibilité par une mesure DGT-R est de moins de 25% dans 10 cas sur 12
et dans tous les cas si celle-ci est estimée à partir d’une mesure DGT équipée de gels NR. A titre de
comparaison, cette erreur est également inférieure à 25% dans seulement 4 cas sur 12, lorsque
l’estimation de la biodisponibilité est faite en utilisant la mesure DP-ASV.
Ces divergences nous paraissent acceptables (particulièrement dans le cas des DGT) compte tenu
des incertitudes liées au protocole expérimental et aux mesures.
Enfin la technique DGT présente de nombreux avantages opérationnels pour la mesure des
concentrations en métaux labiles (et potentiellement biodisponibles) permettant une utilisation de la
techique dans des milieux aussi variés que les lacs (Røyset et al. 2005), les rivières (Meylan et al.
2003; 2004), les eaux usées (Buzier et al. 2006; 2006) et les sédiments (Zhang et al. 2002; Roulier et
al. 2008) :
- Contrairement à la DP-ASV, la technique DGT permet un échantillonnage simple et
intégratif des métaux dans les milieux aquatiques naturels, permettant de dépasser les limites
de détection de l’analyse courante ;
- L’échantillonnage des métaux labiles par la technique DGT est intégratif et multiéléments,
ce qui signifie que le résultat apporte des informations sur des concentrations
éventuellement transitoires pendant la durée du déploiement ;
- Les analyses sont réalisées dans l’éluat acide de la résine du prélèvement et non dans la
matrice environnementale, ce qui élimine les problèmes d’interférences analytiques
(contrairement à la mesure par DP-ASV).
99
100
Evaluation in situ de la biodisponibilité du Cu
Chapitre V.
COUPLAGE DGT - BLM : VALIDATION IN VITRO ET IN
SITU D’UNE APPROCHE INTEGREE POUR EVALUER
LA BIODISPONIBILITE DU CUIVRE
1. INTRODUCTION
Les deux chapitres précédents ont permis de mettre en évidence la forte variabilité de la
biodisponibilité du Cu pour les bryophytes aquatiques en fonction des paramètres de qualité de l’eau
en conditions contrôlées de laboratoire. Il semble indispensable de valider ces résultats en
conditions d’exposition de terrain par le couplage d’un outil de monitoring chimique (DGT) et de
modélisation (le Biotic Ligand Model). La dernière partie de ce travail est donc consacrée à l’étude in
situ de l’influence de l’ensemble des paramètres de qualité d’eau (cations majeurs, pH, matières
organiques) sur la biodisponibilité du Cu pour les bryophytes aquatiques. Pour cela, quatre
campagnes de mesures ont été réalisées sur différents sites présentant des qualités d’eau contrastées.
Notre travail a consisté à comparer la réponse d’un bioindicateur (accumulation dans les
bryophytes) avec la réponse d’un outil prédictif combinant une mesure de spéciation (technique
DGT) et un outil de modélisation (Biotic Ligand Model).
L’objectif principal de cette partie est donc d’évaluer la pertinence de ces deux outils (DGT – BLM)
pour prédire la biodisponibilité du Cu pour les mousses aquatique en conditions d’exposition in situ.
Ce travail a fait l’objet de l’article 3 en Annexe.
2. DEMARCHE EXPERIMENTALE
2.1.
Schéma expérimental et démarche analytique adoptés
La démarche expérimentale adoptée découle de l’expérience acquise en laboratoire sur l’influence
des facteurs environnementaux (Ca, Mg, Na, pH, MOD) sur la biodisponibilité du Cu et la
bioaccumulation du Cu par les bryophytes aquatiques. L’expérimentation en conditions d’exposition
naturelles (in situ, milieu d’exposition renouvelé en continu) constitue une étape indispensable dans
le cadre de la validation des outils (DGT – BLM) testés et validés en conditions contrôlées de
laboratoire. Pour cela, l’approche expérimentale adoptée (Figure 33) consiste à exposer en parallèle
des bryophytes et des DGT dans des eaux de composition chimique contrastées afin de vérifier
l’influence des différents paramètres de qualité d’eau (pH, cations majeurs, MOD) sur la
101
bioaccumulation du Cu par les mousses aquatiques. Les teneurs en Cu mesurées dans les mousses
aquatiques sont ensuite comparées aux prédictions du modèle pour chacun des contextes
hydrochimiques étudiés.
MESURES
MODELISATION
Caractérisation du milieu d’exposition
• Spéciation : Mesure CuLabile
(DGT)
BLM-Cu : Modélisation cinétique de la bioccumulation
du Cu dans les mousses
• Composition cationique de l’eau
(Ca, Mg, Na, pH)
Paroi
cellulaire
Milieu extérieur
1. Adsorption/
Désorpt ion
??
=
CuD
k1
.
Cellule
2. Internalisat ion/
Eliminat ion
Cu
k -1
BL1
k2
k -2
Cu-BL2
Ca2+, Mg2+, Na+, H+
Mesure Cu dans les mousse s
Figure 33. Approche expérimentale adoptée pour les études de validation in situ.
2.2.
Protocole d’exposition des bryophytes et des DGT
Dans le cadre du développement de programmes de biosurveillance de la qualité des cours d’eau
mis en oeuvre dans les années 90, le département R&D d’EDF a conçu un module expérimental (le
MIM 1 – Module Intégrateur de Microplluants). L’utilisation du MIM permet d'exposer in situ des
bryophytes en conditions hydrauliques et physico-chimiques contrôlées. Un schéma général du
dispositif est décrit sur la Figure 34. Pour les applications présentées dans le cadre de cette thèse, le
module expérimental se compose des éléments majeurs suivants :

Un système d'alimentation en eau brute (1). L'apport de l'eau à analyser est assuré par une
pompe péristaltique, placée dans un coffre de rangement étanche et dont le débit peut être
manuellement réglé. La pompe est reliée au secteur ou bien à une batterie autonome placée
dans le coffre de rangement.
1
Brevet déposé le 18 mars 1994 sous le titre "Procédé de dosage de micro-polluants biodisponibles dans l'eau et un
dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé".
102

Un système d'élimination des Matières En Suspension (MES). L'eau est tout d'abord
orientée vers un décanteur lamellaire (2), qui permet de retenir une fraction importante des
MES. Le décanteur lamellaire assure ainsi une double fonction :
- une fonction "première" : il clarifie l'eau destinée à être mise en contact avec les
bryophytes et gomme ainsi certains effets parasites sur la mesure ;
- une fonction "étendue" : les MES décantées peuvent être régulièrement recueillies au
niveau de la vanne de purge (3), puis analysées. On peut ainsi estimer la
micropollution véhiculée par la matière particulaire.

Un module de contamination en cuivre de la solution d’exposition. En sortie du décanteur,
l'eau décantée est dirigée vers un bac de mélange (4) dans lequel une solution de Cu
concentrée (4) est injectée en continu à l’aide d’une pompe péristaltique à faible débit
(dP2=0.25 mL/min). La concentration en cuivre dans le bac de mélange (et donc dans le bac
d’immersion) est contrôlée en modifiant le débit d’alimentation du MIM (dP1=0.5 ou 0.2
L/min) et la concentration de la solution concentrée en Cu servant à l’injection de Cu dans
le système (à 10 ou 12 mg/L). En ajustant ces deux paramètres, on parvient à préparer en
continu des solutions d’exposition (7) avec des concentrations en Cu fixes (5 et 15 µg de
Cu/L).

Un bac d’immersion (7) contenant une masse de bryophytes connue (12 gpoids
frais
) et les
sondes DGT (3 DGT équipés de gels restrictifs + 3 DGT équipées de gels non restrictifs).
Ce bac d’immersion est alimenté en continu par la solution d’exposition (eau de rivière
décantée et contaminée à 5 ou 15 µg/L de Cu). Le bac d’immersion est également équipé
d’un échantillonneur automatique (8) programmable (ISCO 6700) pour collecter en continu
des échantillons d’eau servant à l’analyse ultérieure de la composition chimique du milieu
(l’échantillonneur automatique est programmé de façon à préparer un échantillon moyen
journalier d’environ 200 mL à partir de prélèvements ponctuels toutes les 6 heures). Afin de
limiter l’effet potentiel de la température ambiante (sur les processus de bioaccumulation,
ainsi que sur le fonctionnement du dispositif en cas de températures négatives), le bac
d’immersion est équipé d’un régulateur de température (fixé à 10 ± 1.5 °C).
103
1
6
8
2
7
3
4
5
Cours d’eau
9
Aq. mosses
(12 g fw)
6 DGT units
1
Système d’alimentation en eau (dP1 =0.5-0.2 L/min)
4 Bac de mélange (20 L)
7
Bac d’immersion (18L) des bryophytes et sondes DGT
2
Décanteur lamellaire
5 Solution étalon de Cu (10-12 mg/L)
8
Échantillonneur d’eau programmable (ISCO 6700)
3
Vanne de purge MES
6 Pompe péristaltique d’injection (dP2 =0.25 mL/min)
9
Régulateur de température (10 ± 1.5 °C)
Figure 34. Schéma descriptif du dispositif expérimental (MIM) employé pour l’exposition des bryophytes et des sondes DGT.
104
L’ensemble des caractéristiques techniques du module (dP1, dP2, densité de biomasse,...) optimisées
pour obtenir les concentrations nominales en Cu dissous dans les bacs d’immersion (5 et 15 µg/L)
sont récapitulées dans le Tableau 10.
Tableau 10. Caractéristiques techniques du module d’exposition optimisé pour atteindre les
concentrations nominales en Cu dans les bacs d’immersion de 5 et 15 µg/L.
Support biologique
Espèces
Biomasse
bryophytes
Fontinalis
antipyretica
~12 g f.w.
2.3.
Variables hydrauliques
Vol. bac
immersion
dP1 : Débit
d’alimentation
0.5 L/min
18 L
dP2 : Débit
injection Cu
0.25 mL/min
0.2 L/min
Variables chimiques
Concentration Concentrations nominales
solution Cu du Cu dans bac immersion
10 mg/L
5 µg/L
12 mg/L
15 µg/L
Sélection des sites d’étude
Nous avons sélectionné quatre sites d’étude présentant des teneurs en cations majeurs, en matières
organiques et pH fortement contrastés, de manière à disposer d’une large gamme de qualité d’eau
pour la validation du modèle. Pour cela, quatre sites d’études ont été identifiés : deux stations situées
en amont des centrales nucléaires de Belleville-sur-Loire et Cattenom (sur la Loire et la Moselle
respectivement) ainsi que deux stations localisées sur les barrages hydrauliques de Vassivière
(Limousin) et Sauviat (Auvergne) (Figure 35).
CATTENOM
BELLEVILLE – SUR - LOIRE
Pari s
Centrale Nucléaire
VASSIVIERE
SAUVIAT
Barrage H ydraul ique
Figure 35. Localisation des quatre sites de prélèvements ( ◪ : centrale nucléaire ; ■ : barrage hydraulique)
105
Dans le tableau ci-dessous (Tableau 11), les valeurs moyennes des paramètres de qualité d’eau pour
chaque semaine de campagne sont reportées, avec les écart-types correspondant. La variabilité des
valeurs n’est en général pas imputable aux variations dans l’environnement au cours de la période
d’échantillonnage, mais à la mesure.
Tableau 11. Valeurs moyennes (sur la semaine d’exposition) des paramètres physico-chimiques relevés au
cours des trois campagnes. L’écart-type est indiqué entre parenthèses.
Site
Cours d’eau
a
Temp (°C)
b
COD (mgC/L)
pH
Ca (mg/L) Mg (mg/L) Na (mg/L)
Belleville / Loire
Loire
9.1 (0.3)
3.4 (0.2)
8.3
40.6 (0.9)
7.1 (0.2)
10.8 (0.4)
Cattenom
Moselle
9.3 (0.8)
2.7 (0.3)
7.7
109.7 (0.8)
21.9 (0.4)
83.7 (0.5)
Vassivière
Maulde
11.9 (0.5)
4.9 (0.6)
6.5
2.3 (0.4)
1.8 (0.1)
3.4 (0.3)
11.8 (0.9)
3.4 (0.4)
6.9
2.5 (0.3)
1.2 (0.1)
1.5 (0.2)
Sauviat
a
Temp : Température /
2.4.
b
COD : Carbone Organique Dissous
Caractérisation du milieu
Les paramètres physico-chimiques sont nécessaires, non seulement au calcul des concentrations de
cuivre labile (notamment le pH, la température), mais aussi à l’interprétation de la spéciation du
métal (pH, matière organique dissoute) et de la bioaccumulation du Cu par les bryophytes (cations
majeurs, matière organique dissoute, ...). Au cours de la semaine d’exposition deux types de mesures
ont été effectués :
Mesures intégratives : - Support biologique : prélèvements de bryophytes pour mesure du Cu
bioaccumulé
- Support DGT : mesure intégrative du Cu labile dans le bac
d’immersion
Mesures ponctuelles : - Prélèvements d’eau (échantillonneur automatisé) pour mesure de la
composition en phase dissoute de l’eau (Cu, Ca, Mg, Na)
- Prélèvement d’eau dans le bac d’immersion pour mesure du COD
- Mesure du pH directement dans le bac d’immersion
Pour les quatre campagnes de mesure, l’organisation et la périodicité des prélèvements est similaire
(cf. Tableau 12).
106
Tableau 12. Récapitulatif des prélèvements et analyses d’échantillons récoltés au cours de la semaine (de J0 à J7) d’exposition des sondes DGT et des bryophytes in situ
Support
Elément mesuré
Périodicité des prélèvements
J0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7
Bryophytes
Cu bioaccumulé
×
× × ×
× ×
(extra/intra-cellulaire)
Mode prélèvement / Traitement
Prélèvement des apex (triplicats de mesure)
Immersion des apex dans 20 mL d’EDTA 1mM (2h)
↘ Séchage des apex (24h, 60°C) / Minéralisation
↘ Filtration (0.2µm ; Téflon) de la solution d’EDTA
↘ Acidification (HNO3, 1%) et conservation (4°C)
DGT
(Gels restrictifs
/non restrictifs)
Cu labile
×
×
↘ Démontage des DGT sous hotte
↘ Immersion des résines Chelex dans 3 mL d’HNO3 1M
Cu dissous
×
× × × × × × ×
Ö Analyse en SAA – four
(SpectrAA-800, Varian)
Retrait des DGT (triplicats pour chaque type de gels)
↘ Conservation 4°C
Eau filtrée
Analyse
Prélèvements automatiques d’eau dans le bac d’immersion
(V = 5 mL ; échantillon moyen 24h ; triplicats de mesure)
↘ Filtration de l’échantillon (0.2µm ; Téflon)
↘ Acidification (HNO3, 1%)
↘ Conservation à 4°C
Eau filtrée
Ca
Mg
Na
×
×
×
×
×
×
Prélèvements automatiques d’eau dans le bac d’immersion
↘ Filtration de l’échantillon (0.2µm ; Téflon)
↘ Acidification (HNO3, 1%)
Eau filtrée
×
Carbone
Organique Dissous
(COD)
×
↘ Filtration sur filtre GF/G grillés (0.7 µm)
pH
×
×
×
×
107
×
×
(Lyberty Series II, Varian)
Prélèvements ponctuels d’eau dans le bac d’immersion
↘ Acidification (H3PO4, 5%)
Eau brute
Ö Analyse ICP – AES
Mesure directe dans le bac d’immersion
Ö COTMETRE
(Model 700 Total Organic
Carbon)
Ö pH mètre
(pH 320, WTW GmbH)
Evaluation in situ de la biodisponibilité du Cu pour les bryophytes
2.5.
Calage du modèle cinétique sur les données expérimentales
Les données expérimentales de paramètres de qualité (composition cationique de l’eau, pH, et
spéciation du métal) nous permettent de simuler l’évolution cinétique de la bioaccumulation du Cu
dans les bryophytes aquatiques selon les équations du modèle de bioaccumulation. Les teneurs en
métal labile mesurées à l’aide des sondes DGT (gels restrictifs et non restrictifs) sont ici employées
comme données d’entrée du modèle décrit brièvement ci-après (ainsi que dans le Chapitre II.2 de
manière plus approfondie).

Conditions de simulation
A partir du système réactionnel (cf. Chapitre II.2.1) et des hypothèses émises (cinétiques du premier
ordre), l’évolution cinétique de la bioaccumulation du Cu dans les mousses (fractions extra-cellulaire
CuBL1 et intra-cellulaire CuBL2) est modélisée selon les équations suivantes :
V
⎧ d{CuBL 1}
k ' 1 [Cu D ] − k −1 {CuBL 1} − k ' 2 {CuBL 1} + k − 2 {CuBL 2 }
=
⎪⎪
m bryos
dt
⎨
⎪ d{CuBL 2 } = k ' {CuBL } − k {CuBL }
2
1
−2
2
⎪⎩
dt
Eq. 15
(rappel)
Eq. 16
(rappel)
où : - [CuD], {CuBL1} et {CuBL2} représentent respectivement les concentrations du cuivre dissous
biodisponible (µg Cu.L-1) , adsorbé sur les sites extra-cellulaires (en µg de Cu.g-1d.w.) et
internalisés dans les sites intra-cellulaires (en µg de Cu.g-1d.w.).
- k’1, k-1, k’2, k-2 sont respectivement les constantes cinétiques des réactions d’adsorption (en h–
1),
de désorption des sites extra-cellulaires (en h–1), d’internalisation (en h–1) et d’élimination
(en h–1) des sites intra-cellulaires.
- le rapport m bryos / V représente la densité de biomasse (en gd.w..L-1).

Paramètres fixes et variables ajustables du modèle
La résolution de ce modèle implique une connaissance précise des coefficients cinétiques k’1, k-1, k’2
et k-2, respectivement représentatifs des réactions d’adsorption, de désorption, d’internalisation et
d’élimination. Au travers des expériences en laboratoire, nous avons pu montrer que les coefficients
cinétiques des réactions de désorption, d’internalisation et d’élimination (k-1, k’2 et k-2) ne sont pas
(ou peu) influencées par les paramètres de qualité d’eau des milieux d’exposition. Par conséquent,
nous utilisons dans cette partie les valeurs moyennes obtenues en conditions contrôlées de
laboratoire (cf. Chapitre III.3.1 ; Tableau 4).
108
En revanche, la constante conditionnelle d’adsorption (k’1) est fortement dépendante de la
composition cationique du milieu. Par conséquent pour les différents sites d’études (présentant des
compositions cationiques variables), nous calculons la valeur spécifique de la constante
conditionnelle d’adsorption en fonction des teneurs en cations majeurs dans le milieu d’exposition :
Eq. 36
k '1 = k1, MAX
(Rappel)
⎛
⎞
1
⎟
×⎜
⎜ 1 + ∑ K C BL × [C i ] ⎟
i
1
i
⎝
⎠
où : - k’1, MAX : taux maximal d’adsorption (k’1, MAX = 2.54 h-1)
- K C i BL1 : constante d’affinité des cations Ci sur les
sites extra-cellulaires –BL1 (en L.mol-1)
3. RESULTATS
3.1
Comparaison inter-sites de la spéciation du Cu dissous
Pour chacun des quatre sites d’étude deux types de sondes DGT sont employées :
- des sondes DGT équipées de gels diffusifs dits ‘‘ restrictifs ’’, censés retenir la fraction de
métal libre et de complexes inorganiques (CuCO3, CuOH2, ...) ;
- des sondes DGT équipées de gels diffusifs dits ‘‘ non restrictifs ’’, censés retenir le métal
libre, les complexes inorganiques ainsi qu’une fraction de complexes organiques faibles
(facilement dissociables au cours de la diffusion dans le gel).
L’échantillonnage par DGT permet de distinguer les différentes fractions de métal dissous en
fonction de leur labilité : on identifie ainsi une fraction de métal labile (Clabile : fraction de métal
pouvant diffuser et se dissocier au cours de sa migration à travers le gel) et une fraction de métal
inerte (estimé par différence entre les teneurs en cuivre dissous et labile : Cinerte = C dissous - C labile).
La spéciation du Cu dissous (fractions labile et inerte) mesurée au cours de la semaine d’exposition
des sondes DGT est graphiquement représentée sur la Figure 36, pour chacun des sites d’étude
(Belleville, Cattenom, Vassivière et Sauviat).
109
A. DGT Restrictive
B. DGT Non Restrictive
20
20
Cdissous nominale 15µg/L
C dissous (µg/ L)
16
+15 µg/L
Inerte
Labile
12
8
27%
4
25%
75%
73%
25%
19%
22%
30%
22%
33%
75%
81%
78%
70%
78%
67%
23%
83%
77%
30%
21%
70%
79%
30%
70%
34%
12
8
4
66%
0
/L
/L
/L
/L
/L
g/L
g/L
g/L
µg
µg
µg
µg
µg
5µ
5µ
5µ
15
15
-5
-5
-5
-1
-1
iètèat
m
v
i
i
e
ille
i
l
a
o
m
v
v
l
i
v
s
i
i
n
u
s
no
uv
lle
ss
tte
llev
Sa
Va
tte
Sa
Be
Va
Ca
Be
Ca
16
+5 µg/L
+5 µg/L
17%
+15 µg/L
Inerte
Labile
0
/L
/L
/L
/L
/L
g/L
g/L
g/L
µg
µg
µg
µg
µg
5µ
5µ
5µ
15
15
-5
-5
-5
-1
-1
ièat
tèm
v
i
i
e
ille
i
l
a
m
o
v
v
l
i
v
s
i
i
n
u
s
no
uv
lle
ss
tte
llev
Sa
Va
tte
Sa
Be
Va
Ca
Be
Ca
Figure 36. Spéciation du cuivre dissous (Cu Labile / Cu inerte) dans les bac d’immersion des DGT pour
l’ensemble des quatre sites d’étude (Belleville, Cattenom, Sauviat et Vassivière). Les barres horizontales
représentent les concentrations nominales en Cu dissous (Cdissous nominales) ajoutées dans le bac d’immersion
des DGT (5 µg/L :
et 15 µg/L :
).
Les pourcentages quantifient les différentes fractions de métal labile ( x % ; mesuré directement dans les bacs
d’immersion à l’aide des sondes DGT équipées A. de gels restrictifs, et B. de gels Non restrictifs) et inerte
( x % ; estimé par différence entre les teneurs en cuivre dissous et labile : Cinerte = C dissous - C labile).
On observe, qu’à concentration en Cu dissous équivalente (5 ou 15 µg/L), les fractions de métal
labile mesurées sur chacun des quatre sites varient de 17% à 27% du Cu dissous lorsque l’on utilise
des DGT équipées de gels Restrictifs (Figure 36 A.), et de 22% à 33% lorsque les DGT sont
équipés de gels Non Restrictifs (Figure 36 B.). Ces différences de labilité sont probablement
essentiellement imputables (i) aux variations inter-sites de la quantité et de la nature de la matière
organique dissoute présente en solution sur chaque site, (ii) et au fait que sur le site de Cattenom se
caractérise par un ratio Cu/MOD supérieur à celui des autres sites (concentrations en Cu
naturellement présentes à Cattenom plus importantes que pour les autres sites). Par exemple, la
fraction de métal labile la plus élevée (27-30%) est observée pour le site de Cattenom pour lequel
nous constatons que la teneur en carbone organique dissous est la plus faible (COD = 2.7 mgC/L).
Cependant, on note également que la fraction de métal labile mesurée à Belleville (25-30% du Cu
dissous total) est sensiblement supérieure à celle observée à Sauviat (17-22%) alors que les teneurs
en carbone organique dissous sont équivalentes (COD = 3.4 mgC/L). Ces différences sont
essentiellement imputables à la qualité de la matière organique. Enfin, on note que les plus fortes
variations de Cu labile sont observées pour le site de Vassivière où la fraction de métal labile
représente 23% ou 34% lorsque les DGT sont respectivement équipées de gels restrictifs ou non
restrictifs. Cette différence est due à la discrimination physique qu’opèrent les gels restrictifs sur les
complexes organiques labiles (par ex. complexes faibles Cu-Acides Humiques). En effet, de
110
nombreuses tourbières 1 sont situées à proximité du lac de Vassivière (tourbières d'Auzoux, de la
Ribière de Gladière, de la Mazure, d'Orladeix, de Masgrangeas, d’Epinassou...). Les matières
organiques issues de ces tourbières sont majoritairement humiques et forment avec le Cu de grands
complexes thermodynamiquement faibles exclus stériquement par les gels restrictifs mais
partiellement échantillonnés par les gels non restrictifs.
3.2
Comparaison inter-sites des fractions de Cu bioaccumulé à t = 7 jours
La Figure 37 représente les teneurs en cuivre bioaccumulé (fractions extra et intra-cellulaire) par les
mousses aquatiques mesurées après sept jours d’exposition sur les quatre sites d’étude (Cattenom,
Belleville-sur-Loire, Sauviat et Vassivière). L’ensemble de ces valeurs est également récapitulé dans
le Tableau 13.
De manière générale, on constate une distribution équivalente du Cu dans les mousses pour
l’ensemble des sites après 7 jours d’exposition : le Cu intra-cellulaire {CuBL2} représente environ
27-32% du Cu total (extra et intra-cellulaire : {CuBL1}+{CuBL2}).
A l’exception de Cattenom (site pour lequel nous n’avons pu étudier qu’un seul niveau de
contamination : 5 µg/L), on note une bonne corrélation entre les concentrations de Cu dissous (5
ou 15 µg/L) et les concentrations en Cu accumulé dans les bryophytes (d’environ un facteur trois
pour chaque site). Cette relation de quasi-proportionnalité montre que dans des conditions
d’exposition équivalentes (composition physico-chimique d’eau équivalente), les bryophytes
aquatiques sont de bons indicateurs de la contamination métallique, sensibles à la variation du
niveau de contamination.
En revanche, à niveau de contamination de Cu équivalent (5 ou 15 µg/L), on note une variabilité du
Cu bioaccumulé à t=7 jours d’un facteur six entre les quatre sites d’étude. Ces résultats mettent en
évidence la forte capacité des paramètres de qualité d’eau à moduler la bioaccumulation du Cu par
les bryophytes aquatiques. On constate en effet que les faibles niveaux de contamination (Cattenom,
Belleville-sur-Loire) dans les mousses correspondent aux sites pour lesquels la composition
cationique est la plus élevée (composition cationique : Cattenom > Belleville > Sauviat - Vassivière).
Pour les sites à faible composition cationique (compositions équivalentes pour les sites de Sauviat et
Vassivière), on constate que la bioaccumulation dans les mousses est positivement corrélée avec les
concentrations en Cu labile (Clabile VASSIVIERE > Clabile SAUVIAT).
1
Une tourbière est une zone humide caractérisée un sol présentant de fortes teneurs en matière organique d'origine
végétale, peu ou pas décomposée. C'est un écosystème fragile dont les caractéristiques en font un puits de carbone,
car il y a plus de synthèse de matière organique que de dégradation.
111
Cu bioaccumulé (µg.g-1 d.w.)
1200
Intra-Cellulaire {CuBL2}
1000
Extra-cellulaire {CuBL1}
800
600
76%
72%
400
200
0
35%
37%
m
no
tte
Ca
g/L
5µ
lle
Be
72%
68%
65%
63%
73%
28%
32%
e5
vill
µg
/L
lle
Be
e1
vill
27%
g /L
5µ
Sa
iat
uv
5µ
g /L
Sa
u
t1
via
g
5µ
28%
24%
/L
/L
g /L
µg
5µ
15
e
r
e
r
iviè
iviè
ss
ss
a
Va
V
Figure 37. Teneurs en Cu dans les mousses aquatiques (fractions extra et intra-cellulaires) après sept jours
d’exposition sur les sites de Cattenom, Belleville-sur-Loire, Sauviat et Vassivière.
Tableau 13. Concentrations en cuivre dans les mousses aquatiques (fractions extra et intra-cellulaire),
mesurées à la fin de la période d'exposition (7 jours) sur les quatre sites d’étude (Cattenom, Belleville-surLoire, Sauviat et Vassivière).
Cu dissous
[CuW] (µg/L)
Cattenom
Belleville
Sauviat
Vassivière
Belleville
Sauviat
Vassivière
5
15
Cu bioaccumulé à t = 7 jours (µg.g-1 d.w.)
Cu extra-cellulaire {CuBL1} Cu intra-cellulaire {CuBL2} Total {Cum}
37.8
73.0
195.1
249.1
252.9
603.1
757.0
21.9
39.5
71.3
97.8
118.0
234.1
244.1
59.7
112.5
266.4
346.9
370.9
837.2
1001.1
4. DISCUSSION
4.1
Spéciation et bioaccumulation du Cu : les DGT mesurent-elles la fraction de
métal bioaccumulable (i.e. biodisponible) ?

Effet de la spéciation du Cu sur les cinétiques de bioaccummulation à court
terme (24h)
En conditions contrôlées de laboratoire, nous avons pu mettre en évidence une corrélation
significative entre les teneurs en métaux labiles (échantillonné par DGT équipées de gels restrictifs
ou non restrictifs) et les cinétiques initiales de bioaccumulation du Cu par les bryophytes aquatiques.
112
Ces résultats nous ont permis de valider la pertinence de la technique DGT pour évaluer la fraction
de métal dissous biodisponible en présence de différentes matières organiques naturelles. A l’instar
des biotests en laboratoire, nous cherchons à vérifier cette relation entre spéciation et
biodisponibilité en condition d’exposition in situ (eau naturelle, renouvellement du milieu). Pour
cela, nous étudions les corrélations entre flux initiaux de bioaccumulation (JBioacc - 24h), d’adsorption
(JAds-24h) et d’internalisation (JInt
- 24h
) et teneurs en métal (dissous ou labile) dans les solutions
d’exposition (Figure 38). Sur la Figure 38 on note tout d’abord une corrélation médiocre (r ² <
0.74) entre les flux de bioaccumulation et les concentrations en cuivre total dissous. A l’instar des
résultats des biotests en laboratoire, ces résultats nous confirment que le cuivre total dissous n’est
pas représentatif de la fraction de métal biodisponible pour les bryophytes. En revanche, la
corrélation est bien meilleure (r ² > 0.91) lorsque l’on utilise les concentrations en cuivre labile
mesurées par les dispositifs DGT équipés de gels restrictifs et non restrictifs. Ces résultats mettant
en évidence que sur les premières 24 heures d’exposition, l’accumulation (adsorption et
internalisation) du Cu est contrôlée cinétiquement par la spéciation du Cu en solution. Cependant,
comme le montre la Figure 38, pour les sites à forte charge cationique (points entourés en
pointillés), la prise en compte de la spéciation du Cu ne suffit pas à expliquer les flux de
bioaccumulation du Cu. Dans ces cas, d’autres facteurs environnementaux (i.e. la composition
cationique) modifient la bioaccumulation.
20
(b)
J Ads - 24h (µg/g/h)
24
y = 4.92x
2
r = 0.92
16
Labile DGT R
y = 3.76x
r 2 = 0.93
12
y = 1.04x
r 2 = 0.72
4
0
8
12
y = 0.84x
r 2 = 0.74
4
0
0
4
8
12
16
20
(c)
4
y = 3.02x
r 2 = 0.91
8
Dissous
8
0
12
Labile DGT NR
(µg/g/h)
(µg/g/h)
20
J Bioacc - 24h
y = 3.94x
r 2 = 0.92
16
16
20
J Int - 24h
(a)
5
y = 0.97x
r 2 = 0.92
4
3
y = 0.74x
r 2 = 0.93
2
y = 0.21x
r 2 = 0.71
1
0
0
4
8
12
16
20
Figure 38. Flux initial de bioaccumulation (a. Flux total de bioaccumulation : J Biaocc - 24h ; b. Flux
d’adsorption du Cu : J Ads - 24h et c. Flux d’internalisation du Cu : J Int - 24h ;) en fonction des concentrations en
Cu dissous ( ), et Cu labile (échantillonné par les dispositifs DGT équipés de gels restrictifs et de gels non
restrictifs ).
NB : Le site de Belleville n’ayant pas bénéficié d’une mesure de Cu bioaccumulé à t = 24h, seuls les sites de Vassivière
(5 et 15 µg Cu/L), Sauviat (5 et 15 µg Cu/L) et Cattenom (5 µg/L) sont représentés sur la figure.
113

Effet de la spéciation du Cu sur la bioaccumulation à moyen terme (7 jours)
Sur une période d’exposition supérieure (7 jours), l’influence de la composition cationique est
encore plus marquée que sur une courte période de 24h : on distingue très nettement que la quantité
de Cu dans les bryophytes est moins impotante lorsque la composition cationique du milieu
d’exposition augmente (Figure 39). On observe aussi que les concentrations en Cu bioaccumulé
(adsorbé + internalisé) après 7 jours d’exposition ne sont pas striictement corrélées avec les
concentrations en Cu dissous ou labiles mesurées dans les bacs d’exposition. En effet, la Figure 39
permet de distinguer les points à forte charge cationique (Belleville sur Loire et Cattenom) de ceux à
faible charge cationique (les sites de Vassivière et Sauviat ). Ce résultat met en évidence les limites
du modèle de l’ion libre selon lequel l’accumulation dans les organismes aquatiques serait
strictement contrôlée par la fraction de métal libre (ou labile) en solution. Sur l’ensemble des
résultats, on note en effet qu’une augmentation de la composition cationique du milieu d’exposition
réduit l’accumulation du Cu dans les bryophytes aquatiques. Ces résultats confirment les résultats
obtenus en conditions contrôlées de laboratoire (cf. Chapitre III) et nous permettent d’envisager
l’application du modèle de bioaccumulation intégrant l’effet des cations pour prédire l’accumulation
du Cu par les bryophytes.
CBiaccumulé à t= 7 jours (µg/g d.w.)
1200
a)
1000
Sites à faible composition cationique
(Sauviat et Vassivière)
800
r² = 0.52
600
Sites à forte composition cationique
(Cattenom et Belleville-sur-Loire)
400
200
0
0
4
8
12
16
CDissous (µg/L)
1200
b)
1000
1200
800
r² = 0.58
600
400
200
0
0
1
2
3
c)
1000
800
r² = 0.69
600
400
200
0
4
0
CLabile - DGT Restrctive (µg/L)
1
2
3
4
5
CLabile - DGT Non Restrctive (µg/L)
Figure 39. Relation en les teneurs de Cu bioaccummulé (adsorbé + internalisé) et les concentrations en Cu
dissous (a.) et labile (échantillonnéspar DGT restrictive et non restrictive sur les figures b. et c.
respectivement) mesurés dans les bacs d’immersion après 7 jours d’exposition.
Les points gris et blancs distinguent les sites à forte ( : Belleville et Cattenom) et faible composition
cationique ( : Vassivière et Sauviat).
114
Validation de l’approche intégrée (couplage DGT – BLM)
4.2
Pour tester la validité du modèle cinétique de bioccumulation in situ on compare l’évolution des
concentrations en Cu prédites et des concentrations en Cu mesurées dans les bryophytes au cours
de la semaine d’exposition. Le calage du modèle cinétique de bioaccumulation nécessite la
connaissance de deux types de données d’entrées :
-
les concentrations en Cu biodisponible mesurées dans les bacs d’immersion des
bryophytes : pour cela, trois simulations successives sont réalisées en utilisant (i) la
concentration en Cu dissous (CuDissous), (ii) la concentration en Cu labile mesurée à
l’aide de dispositifs DGT équipés de gels restrictifs (CuDGT – R ), (iii) la concentration
en Cu labile mesurée à l’aide dedispositifs DGT équipés de gels non restrictifs
(CuDGT - NR).
-
les concentrations moyennes en cations majeurs (Ca, Mg, Na et pH) pour le calcul
de la constante cinétique d’adsorption (k’1) spécifique pour chacun des sites d’étude
(le détail du calcul de ce paramètre cinétique est rappelé dans le Chapitre V.2.5).
L’ensemble des paramètres et données d’entrées utilisées pour les simulations sont récapitulées sur
les quatre sites d’étude sont récapitulés dans le Tableau 14.
Tableau 14. Récapitulatif des valeurs des données d’entrée (Cu biodsponible) du modèle de
bioaccumulation des paramètres cinétiques spécifiques pour chacun des sites d’étude.
Donnée d’entré du modèle : C Biodispo
C Labile (µg/L)
(µg/L)
[Cu DGT – R]
[Cu DGT – NR]
6.31
1.70
1.88
–
–
–
C Dissous
Cattenom
Paramètres cinétiques du modèle
k'1
k-1
k'2
k-2
(L.g-1.h-1)
(h-1)
(h-1)
(h-1)
1.05
0.058
0.172
0.297
1.20
4.05
1.44
4.65
2.68
0.058
0.172
0.297
Vassivière
14.34
4.94
3.15
1.22
1.66
4.78
9.53
0.058
0.172
0.297
Sauviat
5.09
15.36
0.88
3.17
1.12
3.52
10.83
0.058
0.172
0.297
↓
↓
↓
↓
↓
Résultats de la
simulation présentés sur
Figure 40. a) Figure 40. b) Figure 40. c)
↓
4.81
15.36
↓
Belleville
Figure 40. a) b) et c)
Sure la Figure 40, les concentrations en Cu bioaccumulé prédites par le modèle cinétique sont
comparées aux valeurs mesurées dans les bryophytes aux différents pas de temps de mesure 1 pour
chacun des sites d’étude.
1
Différents pas de temps d’échantillonnage sur les différents sites :
115
Measured Cu (µg/g d.w.)
10
100
Predicted Cu (µg/g d.w.)
a)
1000
Cu Dissous = input data
1000
SAUVIAT
VASSIVIERE
BELLEVILLE - SUR - LOIRE
100
CATTENOM
10
c)
Cu DGT - R = input data
Cu DGT - NR = input data
1000
1000
100
100
10
b)
10
10
100
1000
10
100
1000
Figure 40. Comparaisons inter-sites entre les concentrations de Cu mesurées dans les bryophytes et prédites
par le modèle cinétique. Trois simulations sont réalisées en utilisant comme donnée d’entrée du modèle : a) la
concentration moyenne en Cu dissous (CuDissous), b) la concentration moyenne en Cu labile mesurée par les
DGT équipées de gels restrictifs (CuDGT–R), et c) la concentration moyenne en Cu labile mesurée par les
DGT équipées de gels non restrictifs (CuDGT–NR).
) indique une correspondance parfaite entre valeurs observées et prédites. Les traits en
Le trait plein (
pointillés (
) indiquent une erreur d'un facteur deux entre valeurs mesurées et prédites.
Les comparaisons entre valeurs prédites par le modèle et valeurs mesurées dans les bryophytes nous
confirment avant tout que la concentration en Cu dissous (Figure 40.a) n’est pas représentative de
la fraction de métal bioaccumulable (i.e. biodisponible) par les bryophytes. En effet, on constate que
les concentrations prédites par le modèle calculées en utilisant le Cu dissous comme donnée
d’entrée surestiment de plus d’un facteur deux (traits en pointillés) les concentrations en Cu
accumulées par les bryophytes au cours de la période d’exposition. Cette surestimation s’explique
- Belleville : t = 0h et 168h.
- Cattenom : t = 0h, 24h, 96h et 168h.
- Sauviat et Vassivière : t = 0h, 24h, 48h, 72h et 144h.
116
principalement par la faible réactivité des complexes organiques Cu–MON 1 en comparaison des
fractions de métal libre et labile présentes en solution. Nous confirmons par ces mesures in situ les
résultats obtenus au laboratoire (Chapitre IV) relatifs à l’importance des matières organiques
dissoutes pour la spéciation et la biodisponibilité du cuivre dissous pour les bryophytes aquatiques.
La Figure 40.b) et la Figure 40.c) montrent que la prédiction du modèle de bioaccumulation est
bien meilleure lorsque l’on intègre dans le modèle la spéciation du métal mesurée en solution à l’aide
des sondes DGT équipées de gels restrictifs ou non restrictifs. Depuis les travaux fondateurs des
années 70-80 (Anderson et al. 1978; Morel 1983; Campbell 1995), on sait que, dans la plupart des
cas, c’est la concentration en métal libre qui contrôle sa biodisponibilité, et donc, à fortes doses, sa
toxicité. Des travaux plus récents (Meylan et al. 2003; Meylan et al. 2004; Tusseau-Vuillemin et al.
2004; Ferreira et al. 2008) ont permis de mettre en évidence pour le cas de faibles niveaux de
contamination, de bonnes corrélations entre une réponse biologique (accumulation, effet toxique) et
la fraction de métal labile en solution. Il semble que ce soit ce paramètre, plutôt que le métal total
(ou même le métal libre) dans l’eau qu’il convient de mesurer pou prédire une éventuelle réponse
biologique. Dans cette étude, nous montrons à travers ces investigations in situ que ces observations
sont également valables dans le cas des bryophytes aquatiques exposées dans des matrices
complexes (eaux naturelles aux abords d’installations industrielles). Cette approche intégrée permet,
en considérant d’une part la spéciation du métal dans l’eau (via la technique DGT), et d’autre part
l’effet des cations majeurs sur la disponibilité des sites actifs sur la membrane biologique (via le
Biotic Ligand Model), de prédire de façon fiable la bioaccumulation du Cu par les bryophytes avec
facteur d’erreur inférieur à un facteur deux (traits en pointillés sur la Figure 40.b et c).
5. CONCLUSION : INTERET DE L’APPROCHE INTEGREE (BLM – DGT)
POUR SURVEILLER IN SITU LA CONTAMINATION EN METAUX
BIODISPONIBILES DANS LES EAUX DE REJETS INDUSTRIELS
Cette approche présente de nombreux avantages opérationnels pour le suivi des concentrations en
métaux biodisponsibles dans les eaux de rejets industriels contaminés en micro-polluants
métalliques :
- la technique DGT permet un échantillonnage simple et intégratif des métaux dans les
milieux aquatiques naturels, permettant de dépasser les limites de détection de l’analyse
courante
1
MON : Matières Organiques Naturelles
117
- l’échantillonnage des métaux labiles par la technique DGT est intégratif et multiéléments, ce
qui signifie que le résultat apporte des informations sur des contaminations éventuellement
transitoires pendant la durée du déploiement
- les analyses sont réalisées dans l’éluat acide de la résine du prélèvement et non dans la
matrice environnementale, ce qui élimine les problèmes d’interférences analytiques
- l’application de la technique DGT pour le suivi chimique de la contamination métallique des
milieux aquatiques a été testée dans de nombreuses études pour une large gamme de
métaux, dans des milieux aussi divers que les lacs (Røyset et al. 2005), les rivières (Meylan
2003; Meylan et al. 2003), les eaux usées (Buzier et al. 2006; Buzier et al. 2006) et les
sédiments (Zhang et al. 2002; Roulier et al. 2008).
- enfin, la méthode intégrée permet, via la mesure des concentrations en cations majeurs dans
l’eau (paramètre de qualité d’eau couramment suivi par les agences de l’eau sur les fleuves et
rivières françaises), d’affiner la prédiction de la bioaccumulation du Cu dans l’organisme
aquatique en prenant en compte l’effet protecteur des cations majeurs sur la
bioaccumulation du Cu dans les bryophytes.
Néanmoins, la présente approche intégrée n’a, à ce jour, pu être développée et validée in situ que
pour le cas du Cu. Dans l’objectif de disposer d’un outil multi-éléments (Cd, Zn, Pb, ...) pour
l’évaluation globale du risque environnemental des eaux de rejets industriels (centrales nucléaires et
thermiques, barrages hydroélectriques), l’étude des interactions métal-bryophytes constitue une
perspective de ce travail de thèse.
118
119
120
Conclusions et Perspectives
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Avec la mise en oeuvre de la directive cadre européenne (DCE) sur l’eau, il devient nécessaire
d’évaluer l’impact des rejets industriels comme une source de métaux biodisponibles pour les
écosystèmes aquatiques. De manière à anticiper les réglementations qui découleront de l’application
de la nouvelle DCE sur l’eau, la redéfinition de seuils de qualité d’eau plus pertinents prenant en
compte la biodisponibilité des micro-polluants, nous amène à nous intéresser à l’effet des différents
paramètres de qualité de l’eau qui caractérisent le milieu aquatique récepteur et qui peuvent jouer sur
la biodisponibilité des métaux qui est contrôlée par des processus biologiques et physico-chimiques.
En effet de nombreux travaux ont montré que la composition cationique de l’eau et les interactions
des métaux avec les matières organiques, sont des facteurs clé contrôlant la biodisponibilité des
métaux pour les organismes aquatiques.
Depuis une trentaine d’années, de nombreuses études s’intéressent à l’emploi de bio-indicateurs tels
que les bryophytes aquatiques pour suivre la contamination métallique biodisponible dans les cours
d’eau. Cet outil biologique est intéressant de part ses propriétés bioaccumulatrices, mais demeure
lourd à mettre en oeuvre in situ et les résultats sont parfois difficiles à interpréter. En effet, ces
mousses aquatiques sont souvent implantées sur des sites présentant des caractéristiques
hydrauliques et physico-chimiques très variables ; l’impossibilité de tenir compte de certains
paramètres du milieu naturel, susceptibles de modifier fortement les échanges de micropolluants
entre l’eau et les bryophytes, rend délicate toute interprétation quantitative. C’est pourquoi, le
développement d’outils innovants simples et appropriés pour le suivi de la contamination de micropolluants biodisponibles des cours d’eau constitue un enjeu majeur de recherche. A cette fin, les
deux outils communément pressentis au niveau européen pour permettre une telle intégration ont
fait l’objet de cette étude :
-
une approche de modélisation basée sur le Biotic Ligand Model (BLM), permettant de
prendre en compte la spéciation du métal en phase dissoute, les interactions métal-ligand
biologique et les effets compétitifs des cations majeurs (Ca, Mg, Na, pH) interagissant
avec les ligands biologiques.
-
une approche de monitoring chimique basée sur des outils « biomimétiques », en
l’occurrence la technique DGT.
121
La question se pose de savoir si ces outils peuvent apporter autant d’informations que le suivi de la
bioaccumulation des métaux dans les bryophytes. Cette adéquation de l’outil dépend probablement
des paramètres de qualité d’eau du milieu aquatique : composition cationique, pH, matières
organiques d’origines naturelles ou urbaine, etc...
Afin de répondre à cette problématique, la pertinence de ces deux outils pour prédire la
bioaccumulation du Cu sur des bryophytes aquatiques a étée testés in vitro, et a fait l’objet de quatre
campagnes de validation in situ (par comparaison entre la bioaccumulation sur bryophytes observée
in situ et les prédictions du modèle).
Dans cette étude, nous avons développé une méthode simple et rapide d’estimation de la
bioaccumulation des métaux dans les bryophytes aquatiques ; dans un premier temps elle a été
validée pour le cuivre en conditions contrôlées de laboratoire. Pour cela, un protocole de
bioaccumulation du cuivre par les bryophytes en conditions contrôlées de laboratoire a été mis au
point dans l’objectif de réaliser des expositions à des concentrations environnementales (~ 5 µg/L
de cuivre total dissous), avec des caractéristiques chimiques des eaux représentatives de celles que
l’on pourrait trouver en milieu naturel. La méthode consiste à étudier l’influence des paramètres de
qualité d’eau sur la cinétique de bioaccumulation du cuivre par les bryophytes en milieu non
renouvelé, comme indicateur de la biodisponibilité du cuivre dans le milieu d’exposition. Cette
méthode a, dans un premier temps, été appliquée à l’étude de l’influence de la composition
cationique sur la bioaccumulation du Cu dans les bryophytes, puis, dans un second temps, à
l’influence de matière organique dissoute d’origine diverse.
Nous montrons que la bioaccumulation du cuivre par les bryophytes est modifiée par ces
paramètres de qualité d’eau (pH, cations, matières organiques). Ces biotests de laboratoire nous ont
permis de mettre en évidence le lien entre spéciation et biodisponibilité, i.e. que le cuivre labile
(mesuré par la technique du gradient de diffusion en couche mince – DGT) représente, dans un
milieu faiblement chargé en cations, le cuivre biodisponible pour la bioaccumulation. En revanche
pour des milieux fortement chargés en cations majeurs (et plus particulièrement en protons, Ca, et
Mg), on observe un effet marqué de ceux-ci sur les cinétiques d’accumulation du Cu par les
bryophytes aquatiques. Ces résultats ont fait l’objet d’une modélisation (sur la base du Biotic Ligand
Model) permettant de modéliser l’évolution de la bioaccumulation du Cu dans les bryophytes en
fonction de la charge cationique du milieu d’exposition.
122
Finalement, par ce travail nous mettons ainsi en avant la nécessité de prendre en compte la totalité
de ces paramètres en les incluant dans une approche intégrée afin d’évaluer la biodisponibilité du
cuivre en milieu aquatique naturel.
A partir de ces études en laboratoire, nous avons pu développer une approche intégrée couplant
une mesure de spéciation (la mesure du Cu labile par DGT) et une approche de modélisation
(Biotic Ligand Model) permettant de décrire la bioaccumulation du Cu par les bryophytes en
fonction des paramètres de qualité d’eau. Néanmoins, la validité de cette approche demandait à être
confirmée par comparaison avec des mesures de bioaccumulation en milieu naturel.
A cette fin, quatre campagnes de validation in situ ont été réalisées. Les données collectées
(accumulation dans les mousses et sondes DGT, concentrations en cations au cours de l’exposition)
dans le cadre de ces campagnes de mesures ont permis de tester la validité du modèle dans une
gamme assez large de qualité d’eau. Les concentrations en cations majeurs et en cuivre labile dans
l’eau (fraction collectée par les sondes DGT) nous permettent de calculer les constantes cinétiques
représentatives des processus d’accumulation par les mousses aquatiques. D’une manière générale,
on note une bonne corrélation entre les concentrations mesurées et calculées pour le Cu
bioaccumulé dans les mousses sur l’ensemble des quatre sites d’étude.
Ces campagnes de validation in situ nous ont permis de montrer qu’il était possible de prédire la
bioaccumulation du Cu dans les mousses aquatiques en fonction des paramètres de qualité d’eau.
Cette méthode peut s’avérer être une alternative intéressante à l’emploi de bioindicateurs classiques
(e.g. les mousses aquatiques) pour évaluer la fraction métallique biodisponible pour la biomasse en
milieu aquatique. En effet, à partir d’une simple mesure de spéciation (mesure DGT) completée par
une information sur la composition cationique du milieu (BLM), cette approche intégrée (DGT –
BLM) permet de décrire l’évolution des concentrations dans les mousses aquatiques et de remonter
à la concentration de métal biodisponible dans le milieu d’exposition.
Dans cette étude, nous avons accordé une part importante au compartiment dissous, ce qui a
permis de s’intéresser à l’accumulation par contact uniquement (forme prédominante
d’accumulation pour les bryophytes aquatiques ainsi que pour de nombreux organismes de la
colonne d’eau) et ainsi de limiter la complexité des phénomènes observés. Pour avoir une vision
plus complète de la biodisponibilité des micro-polluants dans les écosystèmes aquatiques, il semble
indispensable de s’intéresser à la contamination par voie trophique chez des organismes aquatiques
plus complexes tels que les poissons ou les micro-crustacés d’eau douce.
123
D’autre part, contrairement aux polluants organiques susceptibles de se dégrader, les micropolluants métalliques sont des substances persistantes. Leur persistance les conduit à s’accumuler
dans les sédiments où ils se trouvent piégés ; les sédiments sont ainsi souvent considérés comme un
récepteur privilégié de ces substances persistantes. L’étude de leur écotoxicité dans ce compartiment
important des écosystèmes aquatiques constitue par conséquent un enjeu majeur de recherche.
L’application de cette approche intégrée (couplage DGT – BLM) à d’autres micro-polluants ou
encore à d’autres organismes pour décrire l’évolution dans le temps et l’espace de la biodisponibilité
des micro-polluants constitue une perspective de ce travail.
124
125
Références Bibliographiques
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
Allison, J. D., D. S. Brown and Novo-Gradac. (1991). A Geochemical Assessment Model for
Environmental Systems: Version 3.0 User's Manual, U.S. Environmental Protection Agency.
Anderson, M. A., F. M. M. Morel and R. R. L. Guillard (1978). "Growth limitation of a coastal
diatom by low zinc ion activity." Nature 276(5683): 70-71.
Baudin, J. P., A. Lambrechts and M. Pally (1991). "Utilisation des mousses aquatiques comme
bioindicateurs de contamination radioactive " Hydroécologie Appliquée 3: 209-240.
Benedetti, M. F., C. J. Milne, D. G. Kinniburgh, W. H. Van Riemsdijk and L. K. Koopal (1995).
"Metal Ion Binding to Humic Substances: Application of the Non-Ideal Competitive
Adsorption Model." Environmental Science and Technology 29(2): 446-457.
Benedetti, M. F., W. H. Van Riemsdijk and L. K. Koopal (1996). "Humic Substances Considered as
a Heterogeneous Donnan Gel Phase." Environmental Science and Technology 30(6): 18051813.
Block, M. and P. Pärt (1986). "Increased availability of cadmium to perfused rainbow trout (Salmo
gairdneri, Rich.) gills in the presence of the complexing agents diethyl dithiocarbamate, ethyl
xanthate and isopropyl xanthate." Aquatic Toxicology 8(4): 295-302.
Breuer, K. and A. Melzer (1990). "Heavy metal accumulation (lead and cadmium) and ion exchange
in three species of Sphagnaceae." Oecologia 82(4): 468-473.
Brown, D. H. and J. W. Bates (1990). "Bryophytes and nutrient cycling." Botanical Journal of the
Linnean Society 104(1-3): 129-147.
Brown, D. H. and R. P. Beckett (1985). "Intracellular and Extracellular Uptake of Cadmium by the
Moss Rhytidiadelphus squarrosus." Annals of Botany 55(2): 179-188.
Bruns, I., K. Friese, B. Markert and G. J. Krauss (1997). "The use of Fontinalis antipyretica L. ex
Hedw. as a bioindicator for heavy metals. 2. Heavy metal accumulation and physiological
reaction of Fontinalis antipyretica L. ex Hedw. in active biomonitoring in the River Elbe."
Science of the Total Environment 204(2): 161-176.
Buckau, G., R. Artinger, S. Geyer, M. Wolf, P. Fritz and J. I. Kim (2000). "Groundwater in-situ
generation of aquatic humic and fulvic acids and the mineralization of sedimentary organic
carbon." Applied Geochemistry 15(6): 819-832.
Buffle, J. (1988). Complexation reactions in aquatic systems. An analytical approach. Chichester,
John Wiley & Sons.
Buffle, J. and M.-L. Tercier-Waber (2000). In situ voltammetry: concepts and practice for trace
analysis and speciation. In situ monitoring of aquatic systems : Chemical analysis and
speciation. J. Buffle and G. Horvai. Chichester Wiley. 6: 279-405.
Buzier, R., M.-H. Tusseau-Vuillemin, C. M. Dit Meriadec, O. Rousselot and J.-M. Mouchel (2006).
"Trace metal speciation and fluxes within a major French wastewater treatment plant:
Impact of the successive treatments stages." Chemosphere 65(11): 2419-2426.
Buzier, R., M.-H. Tusseau-Vuillemin and J.-M. Mouchel (2006). "Evaluation of DGT as a metal
speciation tool in wastewater." Science of The Total Environment 358(1-3): 277-285.
Campbell, P. G. C. (1995). Interactions between trace metals and aquatic organisms: a critic of the
free ion model. Metal speciation and bioavailability in aquatic systems. A. Tessier and D. R.
Turner, John Wiley and Sons: 45-102.
Campbell, P. G. C., O. Errecalde, C. Fortin, V. P. Hiriart-Baer and B. Vigneault (2002). "Metal
bioavailability to phytoplankton--applicability of the biotic ligand model." Comparative
Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology 133(1-2): 189-206.
126
Cenci, R. M. (2001). "The use of aquatic moss (Fontinalis antipyretica) as monitor of contamination in
standing and running waters: limits and advantages." Journal of Limnology 60(1): 53-61.
Ciffroy, P. (1994). Application du modèle descriptif des échanges de micropolluants à l'interface
eau-bryophytes : Suivi de la concentration en cuivre dissous en divers points de centrales
nucléaires. Chatou, Electricite de France: 72.
Ciffroy, P., D. Vazelle and B. Claveri (1994). Method for measuring bioavailable micropolluants
based on analysis of bryophytes in a cotrolled medium and on a numerical model for
quantitative interpretation of data : Technical File. Chatou, Electricité de France: 71.
Claveri, B. (1995). Les bryophytes comme traceurs de la contamination métallique des eaux
continentales. Metz, Université de Metz. ph.D.: 235.
Claveri, B., F. Guérold and J.-C. Pihan (1995). "Use of transplanted mosses to monitor trace metals
in acidic headwater streams in Vosges mountains." Hydroécol. Appl. 5: 111-125.
Claveri, B., E. Morhain and C. Mouvet (1994). "A methodology for the assessment of accidental
copper pollution using the aquatic moss Rhynchostegium riparioides." Chemosphere 28(11):
2001-2010.
Couto, J. A., J. A. Fernández, J. R. Aboal and A. Carballeira (2003). "Annual variability in heavymetal bioconcentration in moss: sampling protocol optimization." Atmospheric
Environment 37(25): 3517-3527.
Croisetiere, L., L. Hare and A. Tessier (2001). "Influence of Current Velocity on Cadmium
Accumulation by an Aquatic Moss and the Consequences for Its Use as a Biomonitor."
Environmental Science and Technology 35(5): 923-927.
Croisetiere, L., L. Hare, A. Tessier and S. Duchesne (2005). "Modeling cadmium exchange by an
aquatic moss (Fontinalis dalecarlica)." Environmental Science and Technology 39(9): 30563060.
Croot, P. L., B. Karlson, J. T. van Elteren and J. J. Kroon (1999). "Uptake of 64Cu-Oxine by
Marine Phytoplankton." Environmental Science and Technology 33(20): 3615-3621.
Croué, J.-P. (2004). "Isolation of Humic and Non-Humic NOM Fractions: Structural
Characterization." Environmental Monitoring and Assessment 92(1): 193-207.
Croué, J. P., M. F. Benedetti, D. Violleau and J. A. Leenheer (2003). "Characterization and Copper
Binding of Humic and Nonhumic Organic Matter Isolated from the South Platte River:
Evidence for the Presence of Nitrogenous Binding Site." Environmental Science and
Technology 37(2): 328-336.
Davison, W. and H. Zhang (1994). "In situ speciation measurements of trace components in natural
waters using thin-film gels." Nature 367(6463): 546-548.
De Schamphelaere, K. A. C. and C. R. Janssen (2002). "A biotic ligand model predicting acute
copper toxicity for Daphnia magna: The effects of calcium, magnesium, sodium, potassium,
and pH." Environmental Science and Technology 36(1): 48-54.
De Schamphelaere, K. A. C., J. L. Stauber, K. L. Wilde, S. J. Markich, P. L. Brown, N. M. Franklin,
N. M. Creighton and C. R. Janssen (2005). "Toward a Biotic Ligand Model for Freshwater
Green Algae: Surface-Bound and Internal Copper Are Better Predictors of Toxicity than
Free Cu2+ Ion Activity When pH Is Varied." Environmental Science and Technology 39(7):
2067-2072.
Di Toro, D. M., H. E. Allen, H. L. Bergman, J. S. Meyer, P. R. Paquin and R. C. Santore (2001).
"Biotic ligand model of the acute toxicity of metals. 1. Technical basis." Environmental
Toxicology and Chemistry 20(10): 2383-2396.
Edf - Division Production Nucléaire (2008). Bilan 2007 des rejets radioactifs et chimiques des
CNPE en exploitation et des réacteurs en arrêt d"finitif.
EPA (1985). Ambient Water Quality Criteria for Copper. Washington DC., U.S. Enviromnental
Protection Agency.
127
Errecalde, O., M. Seidl and P. G. C. Campbell (1998). "Influence of a low molecular weight
metabolite (citrate) on the toxicity of cadmium and zinc to the unicellular green alga
Selenastrum Capricornutum: An exception to the free-ion model." Water Research 32(2):
419-429.
Fernandez, J. A., M. D. Vazquez, J. Lopez and A. Carballeira (2006). "Modelling the extra and
intracellular uptake and discharge of heavy metals in Fontinalis antipyretica transplanted along
a heavy metal and pH contamination gradient." Environmental Pollution 139(1): 21-31.
Ferreira, D. (2005). Biodisponibilité du cuivre en milieu aquatique : estimation aux faibles niveaux
de contamination. Créteil, Université Paris XII-Val de Marne: 53.
Ferreira, D., P. Ciffroy, M.-H. Tusseau-Vuillemin and J.-M. Garnier (2008). "Modelling Exchange
Kinetics of Copper at the Water-Aquatic Moss (Fontinalis Antipyretica) Interface : Influence
of Water Cationic Composition (Ca, Mg, Na and pH)." Chemosphere In Press, Corrected
Proof.
Ferreira, D., N. Tousset, C. Ridame and M.-H. Tusseau-Vuillemin (2008). "More than inorganic
copper is bioavailable to aquatic mosses at environmentally relevant concentrations."
Environmental Toxicology and Chemistry 27(10): 2108-2116.
Fest, E. P. M. J., E. J. M. Temminghoff, J. Griffioen, B. Van Der Grift and W. H. Van Riemsdijk
(2007). "Groundwater chemistry of Al under Dutch sandy soils: Effects of land use and
depth." Applied Geochemistry 22(7): 1427-1438.
Figueira, R. and T. Ribeiro (2005). "Transplants of aquatic mosses as biomonitors of metals released
by a mine effluent." Environmental Pollution 136(2): 293-301.
Fortin, C. and P. G. C. Campbell (2000). "Silver uptake by the green alga Chlamydomonas reinhardtii in
relation to chemical speciation: influence of chloride." Environmental Toxicology and
Chemistry 19(11): 2769-2778.
Gagnaire, D. and F. R. Taravel (1980). "Biosynthese de cellulose bacterienne a partir de D-glucose
uniformement enrichi en 13C." European Journal of Biochemistry 103(1): 133-143.
Garnier, C. (2004). Modélisation et évaluation des équilibres de complexation entre la matière
organique naturelle, les métaux traces et le proton. Application aux eaux naturelles. Toulon,
Université du sud Toulon Var. phD: 202.
Gimpel, J., H. Zhang, W. Hutchinson and W. Davison (2001). "Effect of solution composition,
flow and deployment time on the measurement of trace metals by the diffusive gradient in
thin films technique." Analytica Chimica Acta 448(1-2): 93-103.
Ginneken, L. V. and R. Blust (2000). "Determination of conditional stability constants of cadmiumhumic acid complexes in freshwater by use of a competitive ligand equilibration-solvant
extration technique." Environmental Toxicology and Chemistry 19(2): 283-292.
Glime, J. M. and R. M. Clemons (1972). "Species diversity of stream insects on Fontinalis spp.
compared to diversity on artificial substrates." Ecology 53: 458-464.
Gonçalves, E. P. and R. A. R. Boaventura (1998). "Uptake and release kinetics of copper by the
aquatic moss Fontinalis antipyretica." Water Research 32(4): 1305-1313.
Gustafsson, J. P. (2001). "Modeling the Acid-Base Properties and Metal Complexation of Humic
Substances with the Stockholm Humic Model." Journal of Colloid and Interface Science
244(1): 102-112.
Guthrie, J. W., N. M. Hassan, M. S. A. Salam, I. I. Fasfous, C. A. Murimboh, J. Murimboh, C. L.
Chakrabarti and D. C. Grégoire (2005). "Complexation of Ni, Cu, Zn, and Cd by DOC in
some metal-impacted freshwater lakes: a comparison of approaches using electrochemical
determination of free-metal-ion and labile complexes and a computer speciation model,
WHAM V and VI." Analytica Chimica Acta 528(2): 205-218.
Hassler, C. S., V. I. Slaveykova and K. J. Wilkinson (2004). "Some fudamental (and often
overlooked) considerations underlying the free ion activity and biotic ligand models."
128
Hassler, C. S. and K. J. Wilkinson (2003). "Failure of the biotic ligand model and free-ion activity
models to explain zinc bioaccumulation by Chlorella kesslerii." Environmental Toxicology and
Chemistry 22(3): 620-626.
Haynes, R. (1980). "Ion exchange properties of roots and ionic interactions within the root
apoplasm: Their role in ion accumulation by plants." The Botanical Review 46(1): 75-99.
Heijerick, D. G., K. A. C. De Schamphelaere and C. R. Janssen (2002). "Biotic ligand model
development predicting Zn toxicity to the alga Pseudokirchneriella subcapitata: possibilities and
limitations." Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology
133(1-2): 207-218.
Hudson, R. J. M. (1998). "Which aqueous species control the rates of trace metal uptake by aquatic
biota? Observations and predictions of non-equilibrium effects." Science of the Total
Environment 219(2-3): 95-115.
Kinniburgh, D. G., C. J. Milne, M. F. Benedetti, J. P. Pinheiro, J. Filius, L. K. Koopal and W. H.
Van Riemsdijk (1996). "Metal Ion Binding by Humic Acid: Application of the NICADonnan Model." Environmental Science and Technology 30(5): 1687-1698.
Leenheer, J. A. (1981). "Comprehensive approach to preparative isolation and fractionation of
dissolved organic carbon from natural waters and wastewaters." Environmental Science and
Technology 15(5): 578-587.
Leenheer, J. A., J.-P. Croué, M. Benjamin, G. V. Korshin, C. J. Hwang, A. Bruchet and G. R. Aiken
(2000). Comprehensive Isolation of Natural Organic Matter from Water for Spectral
Characterizations and Reactivity Testing. Natural Organic Matter and Disinfection ByProducts: Characterization and Control in Drinking Water S. Barrett, S. W. Krasner and G.
L. Amy. Washington, American Chemical Society: 68-83.
Lu, Y. and H. E. Allen (2002). "Characterization of copper complexation with natural dissolved
organic matter (DOM)--link to acidic moieties of DOM and competition by Ca and Mg."
Water Research 36(20): 5083-5101.
Manceau, A., M. A. Marcus and N. Tamura (2002). "Quantitative Speciation of Heavy Metals in
Soils and Sediments by Synchrotron X-ray Techniques." Reviews in Mineralogy and
Geochemistry 49(1): 341-428.
Martins, R. J. E. and R. A. R. Boaventura (2002). "Uptake and release of zinc by aquatic bryophytes
(Fontinalis antipyretica L. ex. Hedw.)." Water Research 36(20): 5005-5012.
Martins, R. J. E., R. Pardo and R. A. R. Boaventura (2004). "Cadmium(II) and zinc(II) adsorption
by the aquatic moss Fontinalis antipyretica: effect of temperature, pH and water hardness."
Water Research 38(3): 693-699.
Maurel-Kermarrec, A., M. Pally, L. Foulquier and J. P. Hébrard (1983). Uptake and desorption
kinetics of a mixture of 60Co, 51Cr, 137Cs, 54Mn et 22Na by a freshwater musci Platyhypnidium
riparioides (Hedw.) Dix and a liverwort Chiloscyphus polyanthos (L.) Corda in Opiz. AixMarseille III. Aix-en-Provence, Paul Cezanne. : 299-313.
Maurer, M. A. and M. A. Brusven (1983). "Insect abundance and colonization rate in Fontinalis neomexicana (Bryophyta) in an Idaho Batholith stream, U.S.A." Hydrobiologia 98(1): 9-15.
Meador, J. P. (1991). "The interaction of pH, dissolved organic carbon, and total copper in the
determination of ionic copper and toxicity." Aquatic Toxicology 19(1): 13-32.
Meylan, S. (2003). Influence of metal speciation in natural freshwater on bioaccumulation of copper
and zinc in periphyton. Zürich, Swiss Federal Institute of technoloy Zürich. phD: 122.
Meylan, S., R. Behra and L. Sigg (2003). "Accumulation of copper and zinc in periphyton in
response to dynamic variations of metal speciation in freshwater." Environmental Science
and Technology 37(22): 5204-5212.
Meylan, S., R. Behra and L. Sigg (2004). "Influence of Metal Speciation in Natural Freshwater on
Bioaccumulation of Copper and Zinc in Periphyton: A Microcosm Study." Environmental
Science and Technology 38(11): 3104-3111.
129
Morel, F. M. M. (1983). Principles of Aquatic Chemistry. New York, John Wiley & Sons.
Morel, F. M. M. and N. M. Price (2003). "The Biogeochemical Cycles of Trace Metals in the
Oceans." Science 300(5621): 944-947.
Mota, A. M. and M. M. Correira Dos Santos (1995). Trace metal speciation of labile chemical
species in natural waters: electrochemical methods. Metal speciation and bioavailability in
aquatic systems. A. Tessier and D. R. Turner. Chichester, John Wiley and Sons. 3: 205–257.
Mouvet, C. (1984). Métaux lourds et mousses aquatiques. Spéciation physico-chimique,
bioaccumulation et toxicité. Liège, Université de Liège. PhD: 157.
Mouvet, C. (1987). Accumulation et relargage de plomb, zinc, cadmium, chrome et cuivre par des
mousses aquatiques en milieu naturel et au laboratoire. Laboratoire d'Ecologie. Metz,
Université de Metz: 122.
Mouvet, C., E. Morhain, C. Sutter and N. Couturieux (1993). "Aquatic mosses for the detection and
follow-up of accidental discharges in surface waters." Water, Air, & Soil Pollution 66(3):
333-348.
Nimis, P. L., F. Fumagalli, A. Bizzotto, M. Codogno and N. Skert (2002). "Bryophytes as indicators
of trace metal pollution in the River Brenta (NE Italy)." Science of The Total Environment
286(1-3): 233-242.
Niyogi, S., P. Couture, G. Plyle, D. G. McDonald and C. M. Wood (2004). "Acute cadmium biotic
ligand model characteristics of laboratory-reared and wild yellow perch (Perca flavescens)
relative to rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)." Canadian Journal of Fisheries and Aquatic
Sciences 61(6): 942-953
Pagenkopf, G. K. (1983). "Gill surface interaction model for trace-metal toxicity to fishes: role of
complexation, pH, and water hardness." Environmental Science and Technology 17(6): 342347.
Paquin, P. R., J. W. Gorsuch, S. Apte, G. E. Batley, K. C. Bowles, P. G. C. Campbell, C. G. Delos,
D. M. Di Toro, R. L. Dwyer, F. Galvez, R. W. Gensemer, G. G. Goss, C. Hogstrand, C. R.
Janssen, J. C. McGeer, R. B. Naddy, R. C. Playle, R. C. Santore, U. Schneider, W. A.
Stubblefield, C. M. Wood and K. B. Wu (2002). "The biotic ligand model: a historical
overview." Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology
133(1-2): 3-35.
Paterson-Beedle, M., J. F. Kennedy, F. A. D. Melo, L. L. Lloyd and V. Medeiros (2000). "A
cellulosic exopolysaccharide produced from sugarcane molasses by a Zoogloea sp."
Carbohydrate Polymers 42(4): 375-383.
Pelfrene, a. (2004). Mesure du cuivre biodisponible en milieu naturel et dans les rejets du circuit de
refroidissement d’une centrale EDF au moyen de bryophytes et de DGT (Diffusion
Gradient in Thin Films). Metz, Université de Metz: 71.
Penttinen, S., A. Kostamo and J. V. Kukkonen (1998). "Combined effects of dissolved organic
material and water hardness on toxicity of cadmium to Daphnia magna." Environmental
Toxicology and Chemistry 17(12): 2498–2503
Pernet-Coudrier, B., L. Clouzot, G. Varrault, M.-H. Tusseau-vuillemin, A. Verger and J.-M.
Mouchel (2008). "Dissolved organic matter from treated effluent of a major wastewater
treatment plant: Characterization and influence on copper toxicity." Chemosphere 73(4):
593-599.
Peuravuori, J. and K. Pihlaja (1997). "Molecular size distribution and spectroscopic properties of
aquatic humic substances." Analytica Chimica Acta 337(2): 133-149.
Phinney, J. T. and K. W. Bruland (1994). "Uptake of Lipophilic Organic Cu, Cd, and Pb Complexes
in the Coastal Diatom Thalassiosira weissflogii." Environmental Science & Technology
28(11): 1781-1790.
Pickering, D. C. and I. L. Puia (1969). "Mechanism for the Uptake of Zinc by Fontinalis antipyretica."
Physiologia Plantarum 22(4): 653-661.
130
Playle, R. C. (1998). "Modelling metal interactions at fish gills." Science of the Total Environment
219(2-3): 147-163.
Poldoski, J. E. (1979). "Cadmium bioaccumulation assays: their relationship to various ionic
equilibria in lake superior water." Environmental Science and Technology 13(6): Pages: 701706.
Roulier, J.-L., M.-H. Tusseau-Vuillemin, M. Coquery, O. Geffard and J. Garric (2008).
"Measurement of dynamic mobilization of trace metals in sediments using DGT and
comparison with bioaccumulation in Chironomus riparius: First results of an experimental
study." Chemosphere 70(5): 925-932.
Røyset, O., B. O. Rosseland, T. Kristensen, F. Kroglund, O. A. Garmo and E. Steinnes (2005).
"Diffusive Gradients in Thin Films Sampler Predicts Stress in Brown Trout (Salmo trutta L.)
Exposed to Aluminum in Acid Fresh Waters." Environmental Science and Technology
39(4): 1167-1174.
Samecka-Cymerman, A., K. Kolon and A. J. Kempers (2002). "Heavy Metals in Aquatic Bryophytes
from the Ore Mountains (Germany)." Ecotoxicology and Environmental Safety 52(3): 203210.
Santore, R. C., D. M. Di Toro, P. R. Paquin, H. E. Allen and J. S. Meyer (2001). "Biotic ligand
model of the acute toxicity of metals. 2. Application to acute copper toxicity in freshwater
fish and daphnia." Environmental Toxicology and Chemistry 20(10): 2397-2402.
Say, P. J. and B. A. Whitton (1983). "Accumulation of heavy metals by aquatic mosses. 1: Fontinalis
antipyretica Hedw." Hydrobiologia 100(1): 245-260.
Scally, S., W. Davison and H. Zhang (2003). "In Situ Measurements of Dissociation Kinetics and
Labilities of Metal Complexes in Solution Using DGT." Environmental Science and
Technology 37(7): 1379-1384.
Schecher, W. D. and D. C. McAvoy (1998). A Chemical Equilibrium Program for Personal
Computers. Hallowell, ME, USA, Environmental Research Software.
Sigg, L., P. Behra and W. Stumm (2000). Chimie des milieux aquatiques: Chimie des eaux naturelles
et des interfaces dans l'environnement. France, Dunod.
Sigg, L., W. Stumm and P. Berha (1992). Chimie des milieux aquatiques. Paris, Masson.
Slaveykova, V. I., K. J. Wilkinson, A. Ceresa and E. Pretsch (2003). "Role of Fulvic Acid on Lead
Bioaccumulation by Chlorella kesslerii." Environmental Science and Technology 37(6):
1114-1121.
Spacie, A. and J. L. Hamelink (1982). "Alternative models for describing the bioaccumulation of
organics in fish." Environmental Toxicology and Chemistry 1(4): 309-320.
Steinman, A. D. and H. L. Boston (1993). "The ecological role of aquatic bryophytes in a woodland
stream." Journal of the North American Benthological Society 12(1): 17-26.
Stumm, W. and J. J. Morgan (1996). Aquatic Chemistry: Chemical Equilibria and Rates in Natural
Waters. New York, John Wiley and Son Inc.
Sunda, W. G. and S. A. Huntsman (1982). "Effect of competitive interactions between manganese
and copper on cellular manganese and growth in estuarine and oceanic species of the
diatom Thalassiosira." Limnology and Oceanography 28(5): 924-934.
Sutter, G. (1993). Ecological Risk Assessment. , Boca raton, Lewis Pubs. .
Tessier, A. and D. R. Turner (1995). Metal Speciation and Bioavailability in Aquatic Systems
Chichester, WileyBlackwell.
Thurman, E. M. (1985). Organic Geochemistry of Natural Waters. Dordrecht Martinus
Nijhoff/Junk Publishers.
Tipping, E. (1994). "WHAM – a chemical equilibrium model and computer code for waters,
sediments and soils incorporating a discrete-site electrostatic model of ion-binding by humic
substances." Computers & Geosciences 20: 973–1023.
131
Tipping, E. (1998). "Humic Ion-Binding Model VI: An Improved Description of the Interactions
of Protons and Metal Ions with Humic Substances." Aquatic Geochemistry 4(1): 3-47.
Tipping, E., C. D. Vincent, A. J. Lawlor and S. Lofts (2008). "Metal accumulation by stream
bryophytes, related to chemical speciation." Environmental Pollution In Press, Corrected
Proof.
Tusseau-Vuillemin, M.-H., R. Gilbin, E. Bakkaus and J. Garric (2004). "Performance of diffsion
gradient in thin films to evaluate the toxic fraction of copper to Daphnia magna."
Tusseau-Vuillemin, M.-H., R. Gilbin and M. Taillefert (2003). "A Dynamic Numerical Model To
Characterize Labile Metal Complexes Collected with Diffusion Gradient in Thin Films
Devices." Environmental Science and Technology 37(8): 1645-1652.
Tyler, G. (1990). "Bryophytes and heavy metals: a literature review." Botanical Journal of the
Linnean Society 104(1-3): 231-253.
Unsworth, E. R., H. Zhang and W. Davison (2005). "Use of Diffusive Gradients in Thin Films To
Measure Cadmium Speciation in Solutions with Synthetic and Natural Ligands: Comparison
with Model Predictions." Environmental Science and Technology 39(2): 624-630.
van Leeuwen, H. P., R. M. Town, J. Buffle, R. F. M. J. Cleven, W. Davison, J. Puy, W. H.
vanRiemsdijk and L. Sigg (2005). "Dynamic Speciation Analysis and Bioavailability of
Metals in Aquatic Systems." Environmental Science and Technology 39(22): 8545-8556.
Vanderpoorten, A. (1999). "Aquatic bryophytes for a spatio-temporal monitoring of the water
pollution of the rivers Meuse and Sambre (Belgium)." Environmental Pollution 104(3): 401410.
Vázquez, M. D., J. A. Fernández, J. López and A. Carballeira (2000). "Effects of Water Acidity and
Metal Concentration on Accumulation and Within-Plant Distribution of Metals in the
Aquatic Bryophyte Fontinalis antipyretica." Water, Air, & Soil Pollution 120(1): 1-20.
Vigneault, B. and P. G. C. Campbell (2005). "Uptake of cadmium by freshwater green algae: effect
of pH and aquatic humic substances." Journal of phycology 41(1): 55-61.
Villaescusa, I., M. Pilar, C. Hosta, M. Martinez and J. C. Murat (1996). "Toxicity of cadmium species
on luminescent bacteria." Fresenius' Journal of Analytical Chemistry 354(5): 566-570.
Vincent, C. D., A. J. Lawlor and E. Tipping (2001). "Accumulation of Al, Mn, Fe, Cu, Zn, Cd and
Pb by the bryophyte Scapania undulata in three upland waters of different pH."
Environmental Pollution 114(1): 93-100.
Vray, F., J.-P. Baudin and M. Svadlenková (1992). "Effects of some factors on uptake and release of
106Ru by a freshwater moss, Plathypnidium riparioïdes." Archives of Environmental
Contamination and Toxicology 23(2): 190-197.
Wehr, J. D., M. G. Kelly and B. A. Whitton (1987). "Factors affecting accumulation and loss of zinc
by the aquatic moss Rhynchostegium riparioides (Hedw.) C. Jens." Aquatic Botany 29(3):
261-274.
Westall, J. C. (1982). FITEQL : A program for the determination of chemical equilibrium constants
from experimental data. Corvallis, Oregon State University.
Wetzel, R. G. (1983). Limnology. New York, CBS College Publishing.
Widianarko, B. and N. van Straalen (1996). "Toxicokinetics-based survival analysis in bioassays
using nonpersistent chemicals." Environmental Toxicology and Chemistry 15(3): 402-406.
Xue, H. and L. Sigg (1998). "Cadmium speciation and complexation by natural organic ligands in
fresh water." Analytica Chimica Acta 363(2-3): 249-259.
Zhang, H. and W. Davison (1995). "Performance Characteristics of Diffusion Gradients in Thin
Films for the in Situ Measurement of Trace Metals in Aqueous Solution." Analytical
Chemistry 67(19): 3391-3400.
Zhang, H. and W. Davison (1999). "Diffusional characteristics of hydrogels used in DGT and DET
techniques." Analytica Chimica Acta 398(2-3): 329-340.
132
Zhang, H. and W. Davison (2000). "Direct In Situ Measurements of Labile Inorganic and
Organically Bound Metal Species in Synthetic Solutions and Natural Waters Using Diffusive
Gradients in Thin Films." Analytical Chemistry 72(18): 4447-4457.
Zhang, H., W. Davison, R. J. G. Mortimer, M. D. Krom, P. J. Hayes and I. M. Davies (2002).
"Localised remobilization of metals in a marine sediment." Science of the Total
Environment 296(1-3): 175-187.
133
134
Annexes
ANNEXES
1. ARTICLES

Article 1
Ferreira, D., Tousset, N., Ridame, C., Tusseau-Vuillemin, M.-H., 2008. More Than Inorganic
Copper Is Bioavailable to Aquatic Mosses at Environmentally Relevant Concentrations.
Environmental Toxicology and Chemistry. 27, 2108-2116.

Article 2
Ferreira, D., Ciffroy, P., Tusseau-Vuillemin, M.-H., Garnier, C., Garnier, J.-M., In press. Modelling
Exchange Kinetics of Copper at the Water-Aquatic Moss (Fontinalis Antipyretica) Interface :
Influence of Water Cationic Composition (Ca, Mg, Na and pH).
À Paraitre dans Chemosphere (accepté pour publication).

Article 3
Ferreira, D., Ciffroy, P., Tusseau-Vuillemin, M.-H., Garnier, J.-M . An Integrated Method for
Predicting Bioaccumulation of Copper by Aquatic Mosses : an in situ Validation Study.
Soumission en cours à Chemosphere.
135
136
Annexes
Ar ticle 1
More Than Inorganic Copper is Bioavailable to
Aquatic Mosses at Environmentally Relevant
Concentrations
(Environmental Toxicology and Chemistry, 2008, Vol. 27, pp 2108-2116)
Daniel FERREIRA1, Nicolas TOUSSET1, Céline RIDAME2, Marie-Hélène TUSSEAU-VUILLEMIN3
1 Electricité
de France, Division Recherche et Développement, Laboratoire National d’Hydraulique et Environnement,
6 Quai Watier, 78401 Chatou, France.
²Université Pierre et Marie Curie, Laboratoire d’Océanographie et du Climat : Expérimentation et Approches
Numériques, 4 Place Jussieu, 75252 Paris Cedex 5, France.
3 Cemagref, UR Hydrosystèmes et Bioprocédés, Parc de Tourvoie, BP 44, 92163 Antony Cedex, France.
Abstract
The present study investigates how dissolved organic matter (DOM) alters copper bioavailability at
environmentally relevant concentrations (1–5 µg/L of dissolved copper, 1– 4 mg/L of dissolved
organic copper). A methodology combining two biological endpoints (short-term and steady-state
bioaccumulation of copper by the aquatic moss Fontinalis antipyretica) and a sampling of labile copper
with diffusion gradient in thin films (DGT) is proposed for batch experiments conducted with
mineral water and various DOM, ethylenediaminetetra-acetic acid (EDTA), humic acid, and natural
Seine River (France) extracts (hydrophobic and transphilic fractions). All types of DOM reduce the
bioavailability of copper to aquatic mosses, and this reduction was more pronounced for the shortterm biological endpoint, which was taken as being representative for environmental exposure.
137
Please cite this article as: Ferreira, D., N. Tousset, C. Ridame and M.-H. Tusseau-Vuillemin (2008). "More than
inorganic copper is bioavailable to aquatic mosses at environmentally relevant concentrations." Environmental
Annexes
Labile copper sampled with DGT made it possible to estimate short-term bioaccumulation in the
case of EDTA and natural Seine River extracts. With humic acid solutions, however, labile copper
was lower than bioavailable copper. This result suggests that at realistic metal concentrations and
with certain types of natural DOM, bioavailable copper might comprise not only inorganic copper
but also some weak organic complexes. Hence, labile copper, in situ sampled with DGT, might not
systematically overestimate bioavailable copper, as suggested previously on the basis of in vitro
toxicity studies.
Keywords : Aquatic mosses ; Diffusion gradient in thin films ; Bioaccumulation kinetics ; Lability ;
Copper
INTRODUCTION
In the general framework of the free-ion activity model (FIAM) [1,2] or its extension, the biotic
ligand model [3–5], passive samplers of labile metals, such as diffusion gradient in thin films (DGT)
as proposed by Davison and Zhang [6], were quickly considered to be promising tools for the
evaluation of bioavailable metals in the aquatic environment. Metal species collected by DGT,
however, comprise not only freeionic metal but also other inorganic species and a variable part of
metal complexes formed with organic ligands. These labile organic metal complexes sampled by
DGT are defined both by their dissociation kinetics [7] and by the kinetic window of DGT [8]. In
the general case of natural dissolved organic matter (DOM), which provides a wide variety of
binding sites of varying strengths [9], the lability of the metal complexes depends not only on the
intrinsic properties of DOM but also on the metal to ligand (or metal to DOM) ratio. Indeed, at a
low metal to DOM ratio, only the strongest sites of DOM will bind metal, whereas at a higher metal
to DOM ratio, weaker sites also will have a chance to be titrated, thus forming labile metal
complexes [10]. Hence, the balance between bioavailable and labile metal fractions is likely to vary
and needs to be assessed in various environments and at various metal to ligand ratios.
Tusseau-Vuillemin et al. [11] showed that the toxic concentration of copper could be adequately
measured using DGT equipped with restricted gels, provided that the DOM is com posed mainly of
humic acid (HA). In Norwegian streams, Røyset et al. [12] also found that labile aluminium, as
measured with DGT, was a good predictor of aluminium-induced stress in brown trout.
Conversely, in environments where DOM is enriched by a wastewater treatment plant discharge,
Buzier et al. [13] showed that labile copper and cadmium (as measured with DGT) could
138
Annexes
overestimate the toxic fractions. These studies investigated anomalously high metal concentrations
provoking toxic biological effects.
Little is known, however, regarding the relevance of labile metal concentrations as indicators of
their bioavailability in moderately contaminated aquatic systems, usually characterized by low metal
to DOM ratios [14]. Meylan et al. [15] found that under natural conditions, the bioaccumulation of
zinc in periphyton was controlled by the free zinc ion concentration; in contrast, the
bioaccumulation of copper was controlled by weakly complexed copper (adequately measured with
DGT). This contradiction with the FIAM was attributed to the very low concentration of free-ionic
copper, the diffusion of which toward periphyton eventually controlled its bioaccumulation. Indeed,
in his review on the FIAM, Campbell [2] emphasized that most of the literature supporting the
FIAM was obtained with unrealistically high metal concentrations and artificial organic ligands and
concluded that it still needs to be validated under natural conditions. The aim of the present study
was to assess how copper accumulation in aquatic mosses changes in response to variations in
copper speciation and whether labile copper concentration is a good predictor of its bioavailability
at natural copper and DOM levels. For this purpose, the aquatic moss Fontinalis antipyretica was
exposed to copper at environmentally relevant and usually nontoxic concentrations (1–5 µg/L) in
natural waters where speciation was varied by adding different types of DOM and then measured
with DGT. Because of their ecological importance [16,17], their widespread distribution in lotic
ecosystems, and their ability to accumulate metals, the aquatic mosses, among primary producers,
fulfill most of the criteria for suitable environmental biomonitoring, as shown by their use in
various monitoring programs [18–20]. Given that they take up metals very rapidly and efficiently,
we based our analysis on the kinetic response of the aquatic mosses. Because Croisetière et al. [21]
showed that the bioaccumulation kinetics of Cd by aquatic mosses did not depend on the current
velocity, we extrapolated the results obtained in batch experiments to the aquatic environment and
then analyzed how different types of DOM modified copper bioavailability at environmentally
relevant contamination levels.
MATERIALS AND METHODS
Biological material sampling
The aquatic mosses (F. antipyretica) were sampled in the Merdereau River (northeastern France) far
from significant anthropic pressure (third Strahler stream ordering) at the beginning of January 2005
and during April 2005. Samples were taken at places where mosses were fully submerged, ensuring a
good physiological state (constant flow of nutriment), as confirmed by the greenish coloration. The
139
Annexes
aquatic mosses were washed several times in river water to remove the attached particles and
invertebrates, then placed and stored in a prewashed polyethylene container. Once in the laboratory,
the material was washed three times with stream water to remove any obvious sediment. To limit
the biological variability, only new green tips (length, 2–3 cm) were kept; dark-green tips were
discarded. The selected green tips were then placed in clean plastic bags and stored in a cool room
(4°C) before the experiments. Just before being introduced in the exposure tanks, the tips were
washed three times in the mineral water used for the test.
Test solutions
All chemicals were of analytical grade. Exposure solutions consisted of mineral water (pH 6.8;
dissolved solids, 27.5 mg/L; dissolved organic carbon, < 0.4 mg/L; Mont Calm® ; Société des
Eaux de Saint-Amand, Saint Amant Les Eaux, France) (Table 1) spiked with copper and artificial
ligands or various types of DOM. To limit the fixation of copper on the walls, solutions were left to
equilibrate in the tanks for 24 h. Then, before introducing the mosses, the tanks were refilled and
left to equilibrate for 4 h to ensure chemical equilibrium between copper and the organic ligands
[22].
Table 1. Major ion composition of the mineral water (Mont Calm®; Société
des Eaux de Saint-Amand, Saint Amant Les Eaux, France) used for
bioaccumulation experiments.
Concentration (µmol/L)
Major ions
Ca2+
Mg2+
Na+
K+
HCO3–
SO42–
Cl–
NO3–
74.9
24.7
65.2
10.2
85.2
90.6
16.9
< 16
Ethylenediaminetetra-acetic acid (trace metals, <0.001% ; Na2-EDTA; Acros Organics, Geel,
Belgium), HA (Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France), and natural extracts from the Seine River
(France; hydrophobic and transphilic solid fractions) were used as organic ligands. The latter were
extracted on XAD8 and XAD4 columns (Supelco, Montluc¸on, France), respectively, according to
the International Humic Substances Society (http://www.ihss.gatech.edu/) protocol [23] after
filtration on a 0.4 µm membrane and acidification. Specific details regarding the extraction have
been provided by Gourlay et al. [24]. Stock solutions were prepared with ultrapure water. The HA
140
Annexes
stock solution (1 g/L of carbon) and the natural extracts from the Seine River (hydrophobic and
transphilic extracts) stock solutions (0.6 g/L of carbon) were prepared 24 h before experiments and
filtered on precombusted glass-fiber filters (Whatman, Maidstone, UK) before use and dissolved
organic carbon analysis. The copper stock solution was an atomic absorption spectroscopy standard
solution (1 mg/ml of copper in 2% HNO3; Acros Organics).
Different exposure solutions were prepared (only one tank per treatment with no replication) to
vary the copper speciation, with a constant nominal dissolved copper concentration (5 µg/L). The
EDTA solution was prepared to complex 50% of copper (Na2-EDTA, 3.93.10-2 µmol/L). Note
that for natural DOM solutions, the ratios between dissolved copper and DOM were kept in an
environmental range (1, 1.7, and 3.6 mg/L of carbon for HA and 2.0 mg/L of carbon for Seine
River extracts). In parallel, four mineral water exposure media were prepared, one without copper
addition and three with varying copper concentrations (1, 2, and 5 µg/L).
Bioaccumulation experiments
Previous experiments showed that aquatic mosses are very efficient in removing dissolved copper
from solution: 100 g of mosses (fresh wt) placed in a 15-L stirred tank could deplete 90% of a 100
µg/L of copper solution within only 2 h. With this biomass density, the bioaccumulation was very
heterogeneous; hence, we chose to use a constant and small amount of mosses (10 g fresh wt)
placed in 15-L stirred tanks (previously soaked for 24 h in 1% HNO3, then rinsed and washed with
deionized water) for each bioaccumulation experiment. With such a low biomass density, the tips
could move freely in the water and were homogeneously exposed. Moreover, the total dissolved
copper concentrations were still easily measurable over 48 h.
After a 48-h exposure, the mosses were removed (filtered with a 0.5-mm mesh) and dried at 60°C
for 72 h. The approximately 1.5 g dry weight of recovered moss was divided into 10 samples (~150
mg dry wt each), which were acid-mineralized according to the method described by Lopez and
Caraballeira [25]. Briefly, each 150-mg (dry wt) moss sample was mineralized with 10 ml of 65%
HNO3 (with 65% Suprapur nitric acid; Merck, Darmstadt, Germany) in acid-washed Teflon ®
tubes placed in a microwave oven (CEM-MDS Microwave Digestion System 2000; CEM µ Waves
Corporation, Saclay, France). The oven was set up with five mineralization sequences of increasing
pressure (1.4, 2.8, 5.2, 8.6, and 10.3 bars) and constant duration (5 min each). A 1-ml aliquot of this
solution was diluted 10 times with ultrapure water and analyzed by graphite-furnace atomic
absorption spectrometry (copper detection limit, ~0.2 µg/L; SpectrAA-220Z; Varian, Les Ulis,
France) to determine the total copper content (adsorbed and internalized) in the mosses ([Cum]t=48 h,
in µg/g dry wt). For each series of 10 samples, certified reference aquatic moss material (BCR 60;
Community Bureau of Reference, Brussels, Belgium) was mineralized and analyzed to determine the
141
Annexes
analytical precision and accuracy of copper determinations. Recovery of copper concentrations was
approximately 92% ± 6% (n = 32) in the reference material analyzed.
The kinetics of total dissolved copper concentrations ([CuT], in µg/L) in the exposure solution was
followed for 48 h according to an exponential base timing scale (n = 15).
Water analysis
The water samples for total dissolved copper analysis were collected in triplicate, filtered with
disposable polytetrafluoroethylene syringe filters (pore size, 0.45 µm), and then acidified with
analytical grade HNO3 to pH less than 2 before storage (4°C). Copper concentrations were
analyzed by graphite-furnace atomic absorption spectroscopy (Varian SpectrAA-220Z). Dissolved
organic and inorganic carbon (filtered through a 0.7-µm precombusted membrane; Whatman glass
fiber filters) were measured in each tank before introducing the mosses (model 700 total organic
carbon analyzer; OI Analytical, College Station, TX, USA) in triplicate. The pH was determined (pH
210; HANNA Instruments, Vernon Hills, IL, USA) at the beginning of each exposure period, with
a pH glass electrode calibrated before each measurement (pH 4 and 7 buffers).
Mass budgets
Mass budgets for copper were established by comparing the amount of bioaccumulated copper in
the mosses (ΔCum, in µg) and the depletion of total dissolved copper in the solution (ΔCuT, in µg) at
the end of each biotest (t = 48 h).
DGT sampling
Initial labile copper concentrations were measured using the DGT technique. The DGT units
(restrictive gel and Chelex-100® resins) were obtained from DGT Research (Lancaster, UK;
http://www.dgtresearch.com) and were suspended in triplicate using a clean nylon wire in the tanks
filled with the exposure solutions before introducing the aquatic mosses. The deployments were
carried out with appropriate stirring (magnetic bars covered with Teflon), and the temperature was
controlled. The pH was recorded and remained in the appropriate range for DGT use (pH 5–11
according to Gimpel et al. [26]). Note that for the DGT measurements and aquatic mosses
bioaccumulation tests, the speciation in solution was identical, because pH measurements were
taken at the same time in the same tanks. Immersion times varied from 4 to 24 h to ensure a
sufficient concentration of metals in the resins. After immersion, the DGT units were dismantled
under a laminar flow hood. The Chelex resins were placed in clean polypropylene tubes and eluted
in 3 ml of 1 M nitric acid (diluted in ultrapure water; 65% Suprapur) for at least 12 h at 4 C.
142
Annexes
Copper was measured in eluates by graphite-furnace atomic absorption spectroscopy (Varian
SpectrAA-220Z). The mass of metal sequestered on the resin was evaluated considering an 80%
yield of elution [27]. The labile copper concentration (CuDGT, in µg/L) was calculated using
Equation 1:
Cu DGT =
M.Δg
t.A.D
(1)
where M is the mass of copper accumulated on the resin after a deployment of duration t, A is the
surface of the window, and D is the diffusion coefficient of copper (typically, 4.76 .10-6 cm²/s at
22°C in restricted gels; data from DGT Research, available at http://www.dgtresearch.com). The
thickness of the diffusive layer (Δg) is theoretically equal to the 0.8-mm-thick hydrogel plus the
0.13-mm-thick surface membrane. Under realistic biotest conditions, however, a slight additional
diffusive boundary layer likely forms at the water–hydrogel interface (H. Zhang, DGT Research,
personal communication). This additional boundary layer is easily evaluated with tests in mineral
solutions, in which total dissolved copper is fully labile. On the basis of four different tests
performed in 0 to 5 µg/L of copper mineral solutions, we evaluated a 13% additional boundary
layer so that Δg = 1.05 mm.
Speciation modeling
The speciation of copper in solutions (in mineral water and in solutions spiked with EDTA and
HA) was simulated with the Stockholm Humic Model [28] used in the chemical equilibrium
program
Visual
MINTEQ
2.15
(http://www.lwr.kth.se/english/OurSoftware/vminteq/).
Concentrations of copper and major ions of interest (Cu2+, Ca2+, Na+, Mg2+, K+, Cl-, NO3-, SO42-,
CO2-, H+, and EDTA or HA if present) were introduced in the modeling program.
Modeling
The experiment comprises three successive steps in which the dynamic aspects differ. Before
introduction of mosses, the solutions are at equilibrium. Once mosses have been introduced, the
uptake is transitory, and the equilibrium is displaced. At the end of the experiment, steady state is
reached again, and the solution tends toward chemical equilibrium.
General statements
Because only part of total dissolved copper is expected to be bioavailable in the solutions, we
distinguish between [Cub] and [CuT] (both in µg/L) to denote dissolved bioavailable copper and
143
Annexes
total dissolved copper concentrations, respectively (Fig. 1). Bioavailable and total dissolved copper
concentrations are linked by chemical dynamics and do not remain constant during the experiment.
Once mosses are introduced, the dynamics of the copper compartments are displaced from
dissolved forms to the accumulated compartment (Fig. 1). Consequently, in batch experiments, with
constant volume and moss biomass, the following mass-balance equation must be verified for
copper:
d ([ Cu b ] +
m moss
× [ Cu m ])
V
=0
dt
(2)
where [Cum] is the total amount of copper accumulated in the aquatic mosses during the experiment
(in µg/g dry wt) and mmoss is the mass of bryophytes (in µg dry wt). According to the general
concepts of the toxicokinetic models [29,30], we describe the process of copper accumulation on
the mosses with reversible first-order kinetics [31] regarding the bioavailable copper and the
bioaccumulated copper. The background copper initially found in the mosses (15.5 ± 2.6 µg/g dry
wt) was low [32], although not insignificant as compared to accumulated copper at the end of the
experiment (Fig. 2). When placed in mineral water, however, these noncontaminated mosses (10 g
fresh wt of mosses placed in a 15-L stirred tank) did not release copper to the solution during the
first 6 h of exposure (after 6 h, [CuT] = 0.08 ± 0.11 µg/L). Hence, we consider that this
background copper was not releasable, and that desorption flux is only dependent on the
accumulated copper ([Cum], in µg/g dry wt) during the experiment.
d[ Cu T ]
V
=
× k 1 .[ Cu b ]-k -1 × [Cu m ]
dt
m moss
(3)
with this formalism, k1 (h-1) and k-1 (h-1) are the rate constants for copper uptake and release for
mosses.
Initial conditions
We focus here on the bioavailability of copper in the initial solution, which is at chemical
equilibrium. The initial solutions are representative of natural stream conditions, where the water is
continuously renewed.
At the beginning of the experiment, Equation 3 is made up of only the bioaccumulation term that
we call Φ (in µg of copper/L/h), Φ that is linearly dependent on the initially bioavailable copper
concentration.
144
Annexes
The equations characterizing the initial conditions are:
⎧[ Cu m ]t =0 = 0
⎪
V
⎨ d[ Cu m ]
=
× k 1 × [ Cu b ]
⎪ dt
m moss
t =0
⎩
(4)
Equations 5 and 6 become:
Φ=
m moss d[ Cu m ]
×
= k 1 × [ Cu b ]t =0
dt t =0
V
(5)
Combining Equations 2 and 5, it appears that the initial drop in total dissolved concentration is
related to the initially bioavailable copper concentration.
Φ=-
d[ Cu T ]
= k 1 × [ Cu b ]t =0
dt t =0
The initial bioaccumulation rate
Φ=
Φ
(6)
was experimentally determined with the following relationship:
[ Cu T ]t =0 − [ Cu T ]t =15 min
t = 15 min
(7)
where [ Cu T ]t =15 min is the total dissolved copper concentration after an exposure time of 15 min. If
k1 is known, initial [ Cu b ] can be estimated with the following relationship:
[ Cu b ]t =0 =
Φ
k1
(8)
Steady-state conditions
At steady state, [ Cu m ] (in µg/g
), [ Cu T ] (µg/L) and [ Cu b ] (µg/L) are constant. From
dry wt
Equation 3:
V
× k 1 .[ Cu b ] - k −1 × [ Cu m ] = 0
m moss
(9)
and
145
Annexes
[ Cu m ] =
k1
V
×
× [ Cu b ]
k −1 m moss
(10)
During the 48-h batch exposure, total dissolved copper is redistributed between mosses and
dissolved organic matter if present. The steady-state distribution is not representative of the
bioavailability in running waters, but allows comparing different types of organic ligands. We define
[ Cu b , TOT ] as the total copper potentially bioavailable in the 48-h batch experiments, that is, the
bioaccumulated copper plus the bioavailable copper remaining in the solution as a result of the
steady-state equilibrium (Eqn. 11).
[ Cu b , TOT ] =
m moss
× [ Cu m ]t =48 h + [ C u b ]t =48 h
V
[ Cu b , TOT ] = ([ Cu T ]t =0 − [ Cu T ]t =48 h ) + [ C u b ]t =48 h
(11)
(12)
Combining Equation 10 with Equation 12, it becomes :
[ Cu b , TOT ] = ([ Cu T ]t =0 − [ Cu T ]t =48 h ) +
k −1 m moss
×
× [ Cu m ]t =48 h
k1
V
(13)
The dynamics of the Cu compartments during the three successive steps are summarized below
(Fig. 1).
146
Annexes
Chemical
equilibrium in
solution
Transitory state:
displacement of
equilibrium
Chemical equilibrium in
solution, including
mosses
Cu T
Cu b
Cu T
Cu b
Cu T
Cu b,TOT
Cu m
Cu b
Cu m
Introduction
of mosses
t = 48 h
t=0
Figure 1. Schematic representation of copper mass budgets during the three successive steps. The arrows
symbolize copper fluxes between these compartments. CuT = Total dissolved copper; Cub = Bioavailable
copper (Eqn. 8); Cum = Accumulated copper in mosses ; Cub,TOT = Total bioavailable copper (Eqn. 13).
RESULTS
Mass budgets
Copper balances were checked at the end of the experiments (t = 48 h). There was no significant
difference (analysis of variance, p<0.05) between the 48-h bioaccumulated fraction and the
dissolved copper losses in solution (Fig. 2). This result confirms that adsorption on tanks is
negligible during the mosses exposure and that the loss of total dissolved copper stems from its
bioaccumulation in aquatic mosses. This confirms the relevance of the use of Φ as a biological
endpoint for the bioaccumulation kinetic of copper in the mosses.
147
Annexes
ΔCu (µg of Cu)
80
60
40
20
0
mineral water+
Ethylenediaminetetraacetic
5 µg Cu/L
Humic
acid
Acids
50%
- 3.6mgC/L
Humic
SeineAcids
River- extracts
1.7Seine
mgC/L
- River
Transphilic
extracts
fraction
- Hydrophobic
- 2 mgC/L
fraction - 2
EthylenediMineral
water aminetetraacetic
acid 50%
Humic
acids
3.6 mgC/L
Humic
acids
1.7 mgC/L
Seine river
extracts
– transphilic
fraction
2mgC/L
Seine river
extracts
– hydrophobic
fraction
2mgC/L
Figure 2: 48-h Cu budget for experiments spiked with 5 µg/L of Cu (excepted for the test involving 1
mgC/L of humic acid [HA]). ▨= Total dissolved Cu loss (Δ CuT) ; □= Accumulated Cu (Δ Cum).
Dissolved copper kinetics
The kinetics of total dissolved copper concentrations during the 48-h exposure period are displayed
in Figure 3. For each of the bioaccumulation experiments, ( [ Cu T ] ) decrease with initially rapid
kinetics, which progressively slows down after a few hours, and reaches a quasi-plateau after 2 d of
exposure (Fig. 3). Both the initial kinetics of total dissolved copper and the final plateau were
modified by the addition of dissolved organic matter, with the mineral solution the most depleted
and the most rapidly so. This preliminary observation supports the idea that only part of the total
dissolved copper might be available to bioaccumulation in mosses and that this bioavailable fraction
might depend both on the quality and quantity of dissolved organic ligands [33].
148
Annexes
6
[CuT] (µg/L)
5
4
3
2
1
0
0
10
20
30
40
50
Time (hours)
Figure 3. Total dissolved copper concentrations according to time in the various exposure media (▲=
Humic acids 3.6 mgC/L ; □ = Ethylenediaminetetraacetic acid 50% ; ▼ = Humic acids 1.7 mgC/L ; △=
Humic acids 1mgC/L ; ● = Seine river extracts – hydrophobic fraction 2mgC/L ; ○ = Seine River extracts
– transphilic fraction 2 mgC/L ; ◇ = Mineral water) spiked with 5 µg/L Cu (n=3 analytical replicates).
Initial copper speciation in the exposure media
Total dissolved ( [ Cu T ]t =0 ) and labile ( [ Cu DGT ]t =0 ) copper concentrations measured in the solutions
before introducing the mosses are shown on Table 2. The inorganic copper concentrations
( [ Cu inorg ]t =0 ) simulated with Stockholm Humic Model-Vminteq in the solutions were added for
comparison with labile Cu concentrations ( [ Cu DGT ]t =0 ) in Table 2.
149
Annexes
Table 2. Initial total dissolved ([CuT]t=0), labile ([CuDGT]t=0) and simulateda inorganic ([Cuinorg]t=0) copper
concentrations in the solutions spiked with copperb
Mineral water
5 µg/L
2 µg/L
1 µg/L
EDTA
XAD8
Himic Acids
XAD4
0.0393 µM
2 mgC/L
2 mgC/L
3.6 mgC/L
1.7 mgC/L
1 mgC/L
Total dissolved Cu
[CuT]t=0
5.12± 0.18 1.98± 0.25 1.02± 0.08
4.99± 0.10
4.30± 0.09
5.69± 0.24
5.02± 0.04
5.53± 0.39
5.21± 0.11
Labile Cu
[CuDGT]t=0
5.15± 0.26 1.88± 0.23 0.93± 0.12
2.55± 0.12
1.12± 0.14
1.28± 0.12
0.20± 0.04
0.37± 0.03
0.77± 0.10
2.43
–b
–b
6.3.10–3
2.1.10–2
2.3.10–2
Simulated inorganic
Cu [Cuinorg]t=0 a
5.12
1.98
1.02
Simulated data for inorganic copper with Stockholm Humic Model (SHM)–Visual MINTEQ 2.15 (KTH [Royal Institute of Technology],
Stockholm, Sweden) ; b EDTA : Ethylenediaminetetra-acetic acid; XAD8 and XAD4 : hydrophobic and transphilic fractions, respectively,
of the Seine River (France) extracts ; c XAD Seine River (France) extracts not referenced into SHM-Visual MINTEQ 2.15 database.
a
The initial labile copper fraction was variably reduced by the addition of organic ligands (varying
from 3.4 – 88.5% of the total dissolved copper). As expected, EDTA forms inert complexes with
copper (54% of the total dissolved copper), which are not taken into account by DGT
measurements because of their high stability. The labile copper fractions measured in both natural
Seine River extracts tested – 1.12 ± 0.14 µg/L for the hydrophobic fraction and 1.28 ± 0.12 µg/L
for the transphilic fraction– were not significantly different (analysis of variance analysis, p<0.05).
This result suggests a similar complexation capacity for both natural Seine River extracts with
copper. On the other hand, the humic acids (which are expected to behave like the natural
hydrophobic fraction) more radically decreased the labile fraction of copper in solution than Seine
River natural extracts at equivalent organic carbon concentrations (1.7 mgC/L for the HA and 2
mgC/L for the natural Seine River extracts). One reason might be that, despite their potential
chemical lability, Cu-HA complexes are physically at least partially excluded from the restricted
diffusion gel in DGT. Zhang and Davison [34] observed that in such solutions, labile copper was
equal to inorganic copper (simulated with Windermere Humic Aqueous Model). Here, labile copper
concentrations remained higher than inorganic copper simulations, except for mineral water and
EDTA solutions. In humic acid solutions, these differences between calculated inorganic and
measured labile copper can be attributed to a fraction of weak Cu-HA complexes that are locally
dissociated at the water-DGT interface (although equipped with restricted gels).
150
Annexes
DISCUSSION
In the following, we discuss whether labile copper concentration is related to bioavailable copper at
the beginning of the biotest and to what extent it is reduced by various types of dissolved organic
matter. Then we will compare the steady-state distributions of copper in the different solutions.
Parameter evaluation
Figure 4 illustrates the relationships obtained in mineral water between Φ and [ Cu DGT ]t =0 or
[ Cu T ]t =0 (Fig. 4a) and between [ Cu T ]t =48 h and [ Cu m ]t =48 h (Fig. 4b). The hypothesis of a first-
order initial kinetics for the bioaccumulation of copper was validated with the four experiments
conducted in mineral water by the linear relationship found for Φ with either total dissolved or
labile Cu concentrations (Fig. 4, α<0.05). This confirms that the bioavailable fraction of copper to
mosses ( [ Cu b ]t =0 ) in mineral water is proportional to total dissolved ( [ Cu T ]t =0 ) and labile
( [ Cu DGT ]t =0 ) copper concentrations. Since all the other experiments were conducted in the same
mineral matrix, we considered the ratio between bioavailable and total dissolved mineral copper
would remain constant, and we estimated k1 as the slope of the regression presented in Figure 4a.
The k1 is equal to 2.44 h-1 and the standard deviation σ is equal to 0.063 h-1.
Similarly, we expect a linear relationship between [ Cu b ]48 h , [ Cu T ]t =48 h , and [ Cu m ]t =48 h in mineral
water (Eqn. 10), with a slope equal to
k1
V
. However, in the less contaminated treatments,
×
k −1 m moss
[ Cu T ]t =48 h falls below the quantification level (0.6 µg of Cu/L, approximately three times the
copper detection limit). We did not use these data to compute k-1, and we used only the most
contaminated treatment ( [ Cu T ]t =0 = 5 µg / L ) to compute k1/k-1 = 7.2 and k-1 = 0.34 h-1.
151
Annexes
70
y = 2.444 x + 0.281
10
r ² = 0.986
8
[Cum] t=48h
(µg/ L/ h)
12
(µg/g dry wt)
14
Φ
6
4
2
60
50
40
30
20
10
0
0
0
1
a)
2
3
4
Cu concentrations (µg/L)
5
0
6
b)
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
[Cu T] t=48h (µg/L )
Figure 4: Mineral water experiments: (a) Initial dissolved Cu uptake rate Φ according to the initial total
dissolved (●) and labile (□) concentrations (n=3 analytical replicates). (b) Steady-state bioaccumulated Cu (
[ Cu m ]t =48 h ) according to the total dissolved steady-state copper concentrations (▲ ; [ Cu T ]t =48 h ) (n=3
analytical replicates).
Influence of DOM
The relation between trace metal speciation and bioavailability has long been studied within the
general framework of the free ion activity model [35] and more recently of the biotic ligand model
[3-5]. This steady-state model was generally verified in highly spiked solutions, with strong artificial
ligands such as EDTA, usually used for either starving algae or observing a toxicity [2]. However,
the study of natural water bodies encourages reconsidering the basis of the FIAM developments,
without assuming that the organism is at equilibrium with the surrounding solution. This leads to
considering the relative importance of several dynamic fluxes: diffusion, bio-uptake, complex
dissociation and recombination, etc., and points out the similarity between bioavailability and lability
concepts [8]. This is the reason we chose to check the relation between bioavailability and lability on
the basis of a kinetic biological endpoint (initial uptake rate Φ) and a chemical evaluation ( [ Cu T ]t =0
and [ Cu DGT ]t =0 ) of copper and dissolved organic matter speciation at environmentally relevant
concentrations.
The relationships between Φ and the initial copper concentrations, expressed as total dissolved
copper ( [ Cu T ]t =0 , Fig. 5a) or labile copper ( [ Cu DGT ]t =0 , Fig. 5b), are displayed in Figure 5. The
data obtained in solutions with dissolved organic matter fall well outside the correlation obtained
between Φ and [ Cu T ]t =0 in mineral water (Fig. 5a), while they are rather consistent with it when
expressed as labile copper (Fig. 5b). Obviously, dissolved organic matter lowers the initial
152
Annexes
bioavailability of copper, which is taken up less rapidly than in mineral water, and labile copper
predicts bioaccumulation more accurately. Hence, for all solutions, we estimated the initial
bioavailable copper [ Cu b ] (according to Eqn. 8 and the value of k1 estimated in mineral water) and
compared it to the initial total dissolved and labile copper concentration in Figure 6. This
estimation is also graphically illustrated in Figure 5a.
14
14
y = 2.444 x + 0.281
y = 2.444 x + 0.281
12
r ² = 0.986
10
Φ (µg/ L/ h)
Φ (µg/ L/ h)
12
8
6
4
r ² = 0.986
10
8
6
4
2
2
0
0
1
2
3
4
5
0
6
0
[Cu T]t=0 (µg/L)
a)
1
2
3
4
5
6
[Cu DGT]t=0 (µg/L)
* Predicted bioavailable
copper [Cub]t=0
b)
Figure 5. The initial uptake rate Φ of copper according to initial (a) total dissolved Cu and (b) labile Cu sampled
with DGT (diffusion gradient in thin films). The regressions were obtained with mineral water data only. The
vertical and horizontal bars represent uncertainties (standard deviation) on Φ measurements and dissolved and
labile copper concentrations (n=3 analytical replicates). (◇ : Minral aater ; □= ethylenediaminetetraacetic acid
50% ; ▲= Humic acids 3.6 mgC/L ; ▼ = Humic acids 1.7 mgC/L ; △= Humic acids 1mgC/L ; ● = Seine river
= Line
extracts – transphilic fraction 2mgC/L ; ○ = Seine river extracts – hydrophobic fraction 2 mgC/L ;
represents the regression curve for mineral water only).
* Predcted bioavailable copper [Cub]t=0 calculated using Equation 8.
In the EDTA solution, the labile copper concentration ( [ Cu DGT ]t =0 ) is slightly higher (20%) than
[ Cu b ]t =0 (statistically different, p < 0.05) expected from the initial bioaccumulation. On the other
hand, the labile copper measured in natural Seine River extract solutions fits very well with the
expected bioavailable copper concentrations ( [ Cu b ]t =0 and [ Cu DGT ]t =0 are not significantly
different, p < 0.05). Conversely, in humic acid solutions, the labile copper concentrations account
for
only
one-third
of
the
expected
bioavailable
copper
(Eqn.
8.)
concentrations
( [ Cu DGT ]t =0 = 0.33 ( ±0.05 ) × [ Cu b ]t =0 ). This means that some Cu-HA complexes are bioavailable to
153
Annexes
aquatic moss, while they are not sampled by DGT equipped with restricted gels. Indeed, in
environmental conditions Meylan et al. [15] observed that bioavailable copper for the periphyton
included not only inorganic copper, but also a fraction of labile complexes that dissociate at the
water-periphyton interface. Weak Cu-HA complexes are also likely to locally dissociate as mosses
deplete the copper solution. The labile copper concentration, even though higher than the
simulated inorganic concentration, still underestimates the bioavailable copper. Tusseau-Vuillemin
et al. [11] did not observe this underestimation of the bioavailable fraction during acute toxicity tests
on daphnids. Indeed, the observation of acute toxicity requires much higher copper levels, at which
the competition between biological and natural organic matter sites does not appear. The present
study underlines the necessity of evaluating bioavailability of metals at environmentally relevant
contamination levels.
Finally, we can conclude that for various types of dissolved organic matter (EDTA, Seine River
extracts), labile copper fits very well with the expected bioavailable concentrations, whereas when
dissolved organic matter is physically excluded by the restricted gels (typically humic acids), the
labile fraction of copper underestimates the bioavailable concentration. Note that in spite of the
specific behavior of the humic acid complexes, the use of the DGT devices permits a much better
prediction of the bioaccumulation, as illustrated in Figure 5b.
For all solutions, the initial bioavailable copper [ Cu b ]t =0 was compared to the total bioavailable
copper [ Cu b , TOT ] estimated at steady state (Eqn. 13) in Figure 6. The slight differences observed
between both concentrations in mineral water are only attributable to the poor precisions of
measurements below the quantification level. In all other solutions containing organic ligands, we
observed that [ Cu b ]t =0 < [ Cu b , TOT ] < [ Cu T ]t =0 , the smallest difference obtained in the EDTA
solution. This means that copper-mosses bindings are strong enough to displace the initial chemical
equilibrium, leading to the progressive dissociation of the weakest Cu-DOM complexes. The CuEDTA complexes are only slightly challenged by these Cu-moss interactions. In the solutions
containing natural DOM also, a small fraction of copper remains nonbioavailable ( [ Cu T ]t =0 and
[ Cu b , TOT ] are statistically different, p < 0.05), probably linked to the strongest DOM sites. The
Seine River extracts (hydrophobic and transphilic fractions) behave in a similar fashion as copper
ligands, since [ Cu b , TOT ] accounts for 72 and 81% of [ Cu T ]t =0 , respectively. In humic acid
solutions, [ Cu b , TOT ] is all the smallest because Has are concentrated (Fig. 6). This suggests a
progressive saturation of the strong complexation sites at low HA concentrations. These
observations again underline the kinetic nature of bioavailability, which is particularly crucial in
cases of natural dissolved organic matter offering a variety of potential ligands for copper.
154
[Cu] (µg/L)
Annexes
Ethylenedi- Seine river
Mineral
Mineral
Mineral
aminetetra- extracts –
water
water
water
+ 5 µg Cu/L + 2 µg Cu/L + 1 µg Cu/L acetic acid hydrophobic
fraction
50%
2mgC/L
Humic
Seine river
acids
extracts –
transphilic 3.6 mgC/L
fraction
2 mgC/L
Humic
acids
1.7 mgC/L
Humic
acids
1 mgC/L
Figure 6. Initial total dissolved ( [ Cu T ]t =0 ; ▨), labile ( [ Cu DGT ]t =0 ; ▧), initial predicted bioavailable
( [ Cu b ]t =0 ; ▬), and steady-state total bioavailable Cu concentrations ( [ Cu b , TOT ] ; ▭) in the
solutions. Initial predicted bioavailable concentrations were computed with Equation 8 and steadystate total bioavailable copper concentrations were estimated with Equation 13.
CONCLUSION
In the present study, batch exposure of the aquatic mosses to realistic copper and dissolved organic
matter concentrations were performed, in view of assessing copper bioavailability. The experimental
results show that bioavailability is an intrinsically kinetic notion, since bioavailable copper is
systematically higher when estimated at 48 h (steady state) than at the beginning of the exposure
period. Given that environmental flow conditions are best represented by a short-term exposure,
we based our analysis of copper bioavailability on a short-term biological endpoint. We found that
dissolved organic matter of various origins significantly lowered the bioavailability of copper to
aquatic mosses. Moreover, initial bioavailable copper was found to be equal or even higher than the
labile copper measured with DGT (except for the test involving the EDTA solution), and hence
higher than the inorganic copper. This finding contradicts previous results obtained with acute
toxicity tests and underscores the need to study metal bioavailability at relevant contamination
levels. From an operational point of view, DGT appears to be an interesting tool for monitoring
moderately contaminated sites in running waters and it would be worth obtaining an in situ
155
Annexes
validation of these batch results. Such a field validation would, however, require taking into account
variable environmental factors such as temperature and cationic competition.
REFERENCES
Morel FMM, Hering JG. 1993. Principles and Applications of Aquatic Chemistry. John Wiley, New York,
NY, USA.
Campbell PGC. 1995. Interactions between trace metals and aquatic organisms: A critique of the
free ion activity model. In Tessier A, Turner DR, eds, Metal Speciation and Bioavailability in
Aquatic Systems. John Wiley, Chichester, UK, pp 45-102.
Santore RC, Di Toro DM, Paquin PR, Allen HE, Meyer JS. 2001. Biotic ligand model of the acute
toxicity of metals. 2. Application to acute copper toxicity in freshwater fish and Daphnia.
Environ Toxicol Chem 20 :2397–2402.
Di Toro, DM, Allen HE, Bergman HL, Meyer JS, Paquin PR, Santore RC. 2001. Biotic ligand
model of the acute toxicity of metals. 1. Technical basis. Environ Toxicol Chem 20:2383-2396.
Paquin PR, Gorsuch JW, Apte S, Batley GE, Bowles KC, Campbell PGC, Delos CG, Di Toro DM,
Dwyer RL, Galvez F, Gensemer RW, Goss GG, Hogstrand C, Janssen CR, McGeer JC,
Naddy RB, Playle RC, Santore RC, Schneider U, Stubblefield WA, Wood CM, Wu KB. 2002.
The biotic ligand model: A historical overview. Comp Biochem Physiol C 133:3 – 35.
Davison W, Zhang H. 1994. In situ speciation measurements of trace components in natural waters
using thin-film gels. Nature 367:546-548.
Tusseau-Vuillemin MH, Gilbin R, Taillefert M. 2003. A dynamic numerical model to characterize
the labile metal complexes collected with DGT. Environ Sci Technol 37 :1645-1652.
Van Leeuwen HP, Town RM, Buffle J, Cleven RFMJ, Davison W, Puy J, Van Riemsdijk H, Sigg L.
2005. Dynamic speciation analysis and metal speciation in aquatic systems. Environ Sci Technol
39 :8545-8556.
Filella M, Town RM. 2005. A framework for interpretation and prediction of the effects of natural
organic matter heterogeneity on trace metal speciation in aquatic systems. In Lichtfouse E,
Schwarzbauer J, Robert D, eds, Environmental Chamistry: Green Chemistry and Pollutants in
Ecosystems. Springer, Heidelberg, Germany, pp 121-132.
156
Annexes
Town RM, Filella M. 2000. Dispelling the myths: Is the existence of L1 and L2 ligands necessary to
explain metal ion speciation in natural waters? Limnol Oceanogr 45:1341-1357.
Tusseau-Vuillemin MH, Gilbin R, Bakkaus E, Garric J. 2004. Performance of diffusion gradient in
thin films to evaluate the toxic fraction of copper to Daphnia magna. Environ Toxicol Chem
23 :2154-2161.
Røyset O, Rosseland BO, Kristensen T, Kroglund F, Garmo ØA, Steinnes E. 2004. Diffusive
gradients in thin films sampler predicts stress in brown trout (Salmo trutta L.) exposed to
aluminium in acid fresh waters. Environ Sci Technol 39 :1167-1174.
Buzier R, Tusseau-Vuillemin MH, Mouchel JM. 2006. Evaluation of the DGT as a speciation tool
in wastewater. Sci Total Environ 358 :277-285.
Xue H, Sigg L. 1993. Free cupric ion concentrations and Cu(II) speciation in a eutrophic lake.
Limnol. Oceanogr 38:1200-1213.
Meylan S, Behra R, Sigg L. 2004. Influence of metal speciation in natural freshwater on
bioaccumulation of copper and zinc in periphyton: A microcosm study. Environ Sci Technol
38 :3104-3111.
Brusven MA, Meeham WR, Biggam RC. 1990. The role of aquatic moss on community
composition and drift of fish-food organisms. Hydrobiologia 196:39-50.
Steinman AD, Boston HL. 1993. The ecological role of aquatic bryophytes in a woodland stream. J
North Am Benthol Soc 12:17-26.
Bleuel C, Wesenberg D, Sutter K, Miersch J,Braha B, Bärlocher F, Krauss GJ. 2005. The use of the
*aquatic moss Fontinalis antipyretica L. ex Hedw. As a bioindicator for heavy metals. 3. Cd2+
accumulation capacities and biochemical stress response of two Fontinalis species. Sci Total
Environ 345 :13-21.
Bruns I, Friese K, Markert B, Krauss GJ. 1997. The use of Fontinalis antipyretica L. ex Hedw. As a
bioindicator for heavy metals. 2. Heavy metal accumulation and physiological reaction of
Fontinalis antipyretica L. ex Hedw. In active biomonitoring in the River Elbe. Sci Total Environ
204 :161-176.
Nimis PL, Fumagalli F, Bizzotto A, Codogno M, Skert N. 2002. Bryophytes as indicators of trace
metals pollution in the River Brenta (NE Italy). Sci Total Environ 286 :233-242.
Croisetière L, Hare L, Tessier A. 2001. Influence of current velocity on cadmium accumulation by
an aquatic moss and the consequences for its use as a biomonitor. Environ Sci Technol 35 :923927.
157
Annexes
Ma H, Kim SD, Cha DH, Allen HE. 1999. Effect of kinetics of complexation by humic acid on the
toxicity of copper to Ceriodaphnia dubia. Environ Toxicol Chem 18 :828-837.
Leenheer JA, Croué JP. 2003. Characterizing dissolved aquatic organic matter. Environ Sci Technol
37 :18A-26A.
Gourlay C, Miege C, Noir A, Ravelet C, Garric J, Mouchel JM. 2005. How accurately do semipermeable membrane devices measure the bioavailability of polycyclic aromatic hydrocarbons
to Daphnia magna? Chemosphere 61:1734-1739.
Lopez J, Carballeira A. 1993. Interspecific differences in metal bioaccumulation and plant-water
concentration ratios in five aquatic bryophytes, Hydrobiologia 263:95-107.
Gimpel J, Zhang H, Hutchinson W, Davison W. 2001. Effect of solution composition, flow and
deployment time on the measurement of trace metals by the diffusive gradient in thin films
technique. Anal Chim Acta 448:93-103.
Zhang H and Davison W. 1995. Performance characteristics of diffusion gradients in thin films for
the in situ measurement of trace metals in aqueous solution. Anal Chem 67:3391-3400.
Gustafsson JP. 2001. Modeling the acid-base properties and metal complexation of humic
substances with the Stockholm Humic Model. J Colloid Interface Sci 244:102-112.
Spacie A, Hamelink JL. 1982. Accumulative models for describing the bioconcentration of organics
in fish. Environ Toxicol Chem 1 :309-320.
Wheeler MW, Bailer AJ. 2003. A simulation study of methods for constructing confidence intervals
for bioaccumulation factors. Environ Toxicol Chem 22 :921-927.
Croisetière L, Hare L, Tessier A, Duchesne S. 2005. Modelling cadmium exchange by an aquatic
moss (Fontinalis dalecarlica). Environ Sci Technol 39 :3056-3060.
Claveri B, Morhain E, Mouvet C. 1994. A methodology for the assessment of accidental copper
pollution using the aquatic moss Rhynchostegium riparioides. Chemosphere 28 : 2001-2010.
Richards JG, Curtis PJ, Burnison BK, Playle RC. 2001. Effects of natural organic matter source on
reducing metal toxicity to rainbow trout (Oncorhychus mykiss) and on metal binding to their
gills. Environ Toxicol Chem 20 :1159–1166.
Zhang H, Davison W. 2000. Direct in situ measurements of labile inorganic and organically bound
metal species in synthetic solutions and natural waters using diffusive gradients in thin films.
Anal Chem 72: 4447-4457.
Morel FMM. 1983. Principles of Aquatic Chemistry. John Wiley, New York, NY, USA.
158
159
Annexes
Ar ticle 2
Modelling Exchange Kinetics of Copper at the
Water-Aquatic Moss (Fontinalis antipyretica)
Interface : Influence of Water Cationic
Composition (Ca, Mg, Na and pH)
(A paraître dans Chemosphere)
Daniel FERREIRA1, Philipee CIFFROY1, Marie-Hélène TUSSEAU-VUILLEMIN2, Cédric
GARNIER 3 , Jean-Marie GARNIER 4
1 Electricité
de France, Division Recherche et Développement, Laboratoire National d’Hydraulique et Environnement,
6 Quai Watier, 78401 Chatou, France.
3 LPTC – ISM (UMR CNRS 5255), Université Bordeaux I, 33405 Talence, France.
4 CEREGE, Université Paul Cézanne, Aix-Marseille III, (UMR CNRS 6635), BP 80, F 13545, Aix en Provence,
France.
ABSTRACT
The present study investigated the effect of water cationic composition (Ca, Mg, Na, pH) on the
bioaccumulation and elimination rates of copper (Cu) by an aquatic moss (Fontinalis Antipyretica),
under laboratory conditions. For this purpose, mosses were exposed to copper at an
environmentally relevant and usually nontoxic concentration (5 µg/L) in natural waters where
cationic composition (Ca, Mg, Na, pH) and concentrations were varied.
160
Please cite this article in press as: Ferreira, D. et al., ″Modelling Exchange Kinetics of Copper at the Water-Aquatic
Moss (Fontinalis Antipyretica) Interface : Influence of Water Cationic Composition (Ca, Mg, Na and pH).″,
Chemosphere (2008), doi:10.1016/j.chemosphere.2008.10.031
Annexes
To describe copper bioaccumulation by aquatic mosses, a two-compartment model with first order
kinetics, was developed and calibrated under a wide range of water cationic composition.
Bioaccumulation rates of Cu in mosses were significantly reduced as the concentrations of
competitive cations in solution increased. This observation supports the concept of competitive
binding of these cations on transport sites at the organism–water interface. Hence, in hard water, Ca
and Mg cations play a protective role as they compete with Cu2+ ions for the absorption on
transport sites at the organism–water interface. Based on the relationships between each major
cation concentration and the exchange kinetics on mosses, the binding constants ( ) of each
competing cations to the biological surfaces were derived. Using the present cationic-dependant
kinetic model, it is now feasible to incorporate water cationic composition in the (re)-interpretation
of bryophytes contamination levels and in the (re)-definition of Water Quality Criteria (WQC) as
illustrated through two selected examples of biomonitoring programmes. In the framework of
future national water quality guidelines revisions, a such flexible and mechanistic biomonitoring tool
(integrating the protective effects of competing cations) may greatly improve the ability of
regulators to derive site-specific Cu (metal) guidelines for protecting aquatic biota, while limiting the
use of conservative assumptions.
Keywords : kinetic, bioaccumulation, copper, bryophytes, major cations
INTRODUCTION
The regulatory context related to the monitoring of water systems (e.g. the European Water
Framework Directive) requires that Water Quality Criteria (WQC) and surveillance networks are
based on biologically relevant endpoints, e.g. concentrations of pollutants accumulated in biota. In
order to provide biologically meaningful estimates of metal contamination in natural waters,
biological monitors have frequently been used in various monitoring programs (Claveri et al., 1995;
Croteau et al., 1998; Cenci, 2001). Among primary producers, aquatic mosses, because of (i) their
widespread distribution in lotic ecosystems (if not present, mosses are easily transplanted to sites
under investigation (Fernandez et al., 2006)), (ii) their ecological importance, (iii) their ability to
accumulate trace metals to easily measurable levels (Claveri, 1995), and (iv) their ability to rapidly
(days to weeks) respond to a change in ambient metal concentration (Nimis et al., 2002), fulfil most
of the criteria for suitable environmental biomonitoring, as shown by their use in various
monitoring programs (Cenci, 2001). Despite their long history as biomonitors, there has been little
161
Annexes
attempt to develop theoretically based models to rigorously relate metal concentrations in mosses to
those in water. Presently, measurements of trace metal concentrations in mosses exposed to
polluted waters are often simply compared to background metal concentrations to classify water
systems as to their relative degree of metal pollution. There is a need to put biomonitoring studies
using mosses on a deeper theoretical foundation by quantifying the influence of various
environmental variables on metal accumulation by these plants.
Recently, models incorporating bioavailability of metals (and thus their potential toxicity to aquatic
organisms) into operational risk assessments have also been proposed to assess their potential
impact on biota. For example, generalizing the concept of the free ion activity model (FIAM,
(Morel and Hering, 1993)), Biotic Ligand Models (BLMs) investigate how metal speciation and the
competing cations (majors cations and/or pH) alter metal binding with biological sites (De
Schamphelaere and Janssen, 2002; Heijerick et al., 2002; Niyogi and Wood, 2004; Borgmann et al.,
2005). The experience gained on other organisms (e.g. invertebrates and fish tested in the frame of
BLM development) suggests that cationic concentration in water could have a significant influence
on bioaccumulation on mosses (even if the endpoint investigated here, based on bioaccumulated
concentration, is different as the toxic endpoints commonly used in the BLMs). The present study
aims at evaluating the competing effects of water cationic composition (Ca, Mg, Na and pH) on the
exchange kinetics of copper by an aquatic moss (Fontinalis antipyretica). If such effects are actually
verified, they could indeed be incorporated in the interpretation of bryophytes contamination levels
and in the definition of associated WQC.
The methodology adopted in this study was thus based on the experimental and modelling analysis
of the exchange kinetics of copper (at environmental and usually non-toxic concentrations; 5 µg.L–
1) at water–bryophytes interface, in natural waters presenting various cationic compositions (Ca,
Mg, Na, pH). The competing effects of these major cations were characterised by the affinity
constants of the competing cations to the biological ligand (BL), derived from non-linear
relationships between each cation concentration and the metal uptake rate constants. Through two
selected examples, we illustrate how the modelling approach described in this paper could be
applied for the (re)-interpretation of bryophytes measurements routinely collected in biomonitoring
programmes.
162
Annexes
Bryophytes (Fontinalis antipyretica) were sampled in January and March 2006, in the Sauldre River
(north-eastern France), far from significant anthropic pressure (third Strahler stream ordering). To
limit biological variability, only new green tips (2–3 cm) were kept; dark green tips were discarded.
The selected green tips were then placed in clean plastic bags and stored in a cool room (4°C) prior
to the experiments. Just before immersion in the exposure tanks, the tips were rewashed three times
in the mineral water used for the test.
Test solutions
Exposure solutions consisted of mineral water (Mont Calm®, France, pH = 6.8, dissolved solids
= 27.5 mg.L–1, dissolved organic carbon < 0.4 mgC.L–1), with the following cationic
characteristics: (Ca2+)=3.1 mg.L–1; (Mg2+)=0.64 mg.L–1; (Na+)=1.43 mg.L–1; pH=6.8. This
mineral water was spiked with different volumes of stock solutions of CaCl2, MgCl2, NaCl,
HCl, and NaOH (Merck, Darmstadt, Germany, trace metals < 0.001%), to obtain five different
concentrations for each of the investigated cations: (Ca2+): 3.1, 9.9, 19.7, 41.1 and 153.1 mg.L–1;
(Mg2+): 0.64, 2.1, 5.1, 10.4 and 48.8 mg.L–1; (Na+): 1.43, 3.2, 11.0, 21.6 and 103.5 mg.L–1; pH:
8.4, 7.7, 6.8, 5.9 and 4.8. To investigate how cationic composition alters copper
bioaccumulation, the concentration of a given cation was varied, while keeping all other cationic
concentrations constant. Each exposure solution was spiked with a constant nominal dissolved
copper concentration (5 µg.L–1). In order to limit the fixation of copper on the walls, the tanks
were emptied and refilled with new solution before immersing the bryophytes.
Bioaccumulation experiments
The experimental procedure for the bioaccumulation biotests were conducted in three
successive steps:

Pre-equilibration step
To pre-equilibrate biotic ligand sites and cations before copper exposure, 10 g (fresh weight) of
bryophytes tips were exposed for 48 h in a solution spiked with the cationic composition
studied, but deprived of copper contamination.
163
Annexes

Accumulation step
After the pre-equilibration step, bryophytes were removed (0.5 mm filtered), and placed in a 15L stirred tank in the presence of copper (batch experiments without renewal of water). The
kinetics of total dissolved copper concentrations ( [CuW ] ) was followed for 72 h according to an
exponential base timing scale (n=15). Afterward, aliquots of bryophytes (approx 700 mg fresh
weight per triplicate) were sampled. Extra- and intracellular copper concentrations were
measured (see next section).
Desorption step
Cu exposed bryophytes were sampled at the end of the accumulation step and were resuspended
in a 3-L tank containing a solution with the same cationic composition as for the accumulation
step, but deprived of copper contamination. The desorbed copper ( [CuW ] ) was kinetically
followed for the 24-h desorption period (n=6).
Intracellular and extracellular metal content of bryophytes
At the end of the accumulation step, a triplicate of bryophytes (approximately 700 mg fresh
weight) were washed for 60 min with 50 mL of 1.0 mM EDTA (Na2-EDTA, Acros Organics,
Geel, Belgium) to remove the metals adsorbed to the cell wall (Meylan et al., 2003). Copper in
the EDTA solution is attributed to the extracellular metal content. Cu in the EDTA solution was
measured by Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry (GF-AAS – Varian, SpectrAA800, Varian). The washed bryophytes were dried at 60°C for 72 h and acid-mineralized (Merck,
Darmstadt, Germany, 65% suprapur nitric acid) for the measurement (by GF-AAS) of copper
attributed to the intracellular metal content of bryophytes.
Water analysis
Water samples for total dissolved copper analysis were collected in triplicate, filtered with
disposable PTFE syringe filters (0.2 µm, VWR International, USA), and then acidified with
analytical grade HNO3 to pH<2 prior to storage (4°C). Water samples for major cations (Ca, Mg
and Na) were collected in triplicate for each test at the beginning of each exposure period and
measured by ICP-AES.
Mass budgets
164
Annexes
The mass budgets for copper were checked at the end of the accumulation step (t=72 h) by
comparing total bioaccumulated copper (in µg of Cu) and total dissolved copper lost from bulk
solution (in µg of Cu).
Kinetic modelling
The key processes that control metal uptake and release by F. antipyretica are generally
described using a two-compartment model with first-order kinetics (Mersch et al., 1993;
Croisetiere et al., 2005) (Figure 1).
Cell
membrane
Medium
1. Adsorption/
Desorption
CuW
k1
k -1
Organism
2. Internalization/
Elimination
Cu BL1
k2
k -2
Cu-BL2
K CiBL1
Ca2+, Mg2+, Na+, H+
FIGURE 1. Conceptual model of physicochemical processes involved in the uptake/release of Cu by
aquatic bryophyte.
Cu W , CuBL 1 and CuBL 2 are the dissolved in the water, extracellular and intracellular copper,
respectively.
According to the model’s first-order kinetics assumption, the evolution of the copper
concentrations in the three different fractions (dissolved bioavailable in water Cu W ,
extracellular CuBL1 and intracellular CuBL2 copper) are modelled as follows:
165
Annexes
⎧ d[ Cu W ]
m bryos
= - k 1 .{BL 1}free .[ Cu W ] +
.k 1 .{CuBL 1}
⎪
V
⎪ dt
V
⎪ d{CuBL 1}
=
.k 1 .{BL 1}free .[ Cu W ] - k 1 .{CuBL 1} - k 2 .{BL 2}free .{CuBL 1} + k −2 .{CuBL 2}
⎨
dt
m bryos
⎪
⎪ d{CuBL }
2
= k 2 .{BL 2}free .{CuBL 1} - k - 2 .{CuBL 2}
⎪
dt
⎩
Eq. 1
Eq. 2
Eq. 3
where k1 (g.molBL1-1.s–1) and k2 (g.molBL2-1.s–1) are the adsorption and internalisation rate
constants. k-1 and k-2 (s–1) are the rate constants for copper desorption and elimination
processes; mbryos is the mass (in g bryos
d.w.)
of bryophytes suspended is the 15L solution ( V );
{ BL1 }free and { BL2 }free are the free extra- and intracellular site concentrations (mol.g-1);
[Cu W ] , {CuBL1 } and {CuBL2 } are, respectively, the dissolved (µg of Cu. L–1), the extracellular
(µg of Cu.g–1d.w.) and the intracellular (µg of Cu.g–1d.w.) copper concentrations. Please note that
the dissolved copper in water Cu W is there considered to be the bioavailable copper fraction
since biotests were carried out in mineral water (deprived of organic ligands).
The kinetic distribution of copper in the system will thus be partly governed by the initial
available free extra- and intracellular site concentrations ( {BL1}free and {BL2 }free ), which will
decrease as the concentrations of competitive cations (such as Ca, Mg, Na, H; see Figure 1)
increases. In addition, to conform with experimental measurements and simplify equations 1-3,
the conditional rate constants k′1 and k′2 (in s–1), depending on the extra- and intracellular site
concentrations {BL1 }free and {BL2 }free ), were defined as follows:
Eq. 4
k '1 = k 1 ×{BL1}free
Eq. 5
k' 2 = k 2 ×{BL2}free
Equations 1–5 were used to derive specific and identifiable analytical solutions (details of the
mathematical developments can be found in (Ciffroy et al., 2001)) describing the changes in
copper concentrations in water ( [Cu W ] ) and in the bryophytes ( {CuBL1 } and {CuBL2 } ).
Analytical solutions were used to fit experimental data ( [Cu W ] , {CuBL1 } and {CuBL2 } ) by
calibrating the kinetic parameters according to the procedure described hereafter.
166
Annexes
The conditional adsorption rate constant k′1, the desorption rate constant k-1 and the ratio
k ' 2 k -2 were calculated using the boundary conditions (initial conditions and steady state) of
the experimental accumulation step.
Based on our previous results (Ferreira et al., 2008), we assume that at t ~ 0, exchanges are
dominated by the accumulation from water to external binding sites {BL1}, even though the
intracellular content (17.1 ± 2.7 of Cu.g–1d.w.) is not negligible (our previous results show that
this background copper was not releasable (Ferreira et al., 2008)). Consequently, Eq.1 can be
simplified by deleting the desorption term (
mbryos
V
.k -1 .{CuBL1 } ).
Hence, the conditional adsorption rate constant k′1 is estimated after a short exposure time (t=5
min) as follows:
Eq. 6
k'1 = −
d[ Cu W ]
1
×
dt t =5 min [ Cu W ]t =0
When a plateau is reached for [ Cu W ] at t=72 h, Eq.1 becomes:
Eq. 7
k −1 = k ' 1 ×
[ Cu W ]t =72 h
V
×
m bryos {CuBL 1}t =72 h
where [ Cu W ]t =72 h and {CuBL 1}t =72 h are the total dissolved copper (in µg of Cu.L–1) and EDTAwashed copper (in µg of Cu.g–1 d.w.) on the bryophytes measured at t=72 h.
Assuming equilibrium at t=72 h, Eq. 3 can also be simplified, assuming a null value for the kinetic
term d{CuBL 2} dt . The k' 2 k - 2 ratio can thus be calculated as follows:
Eq. 8
k ' 2 {CuBL 2 }t =72 h
=
k − 2 {CuBL 1}t =72 h
Methodology for determining constants of competing cations to the biotic ligand
K Ci BL1
167
Annexes
According to the general concepts of metals and cations binding to biological surfaces (Xue et
al., 1988), the binding of metal and cations [Ci] to the free external binding sites {BL1 }free can
be characterized by a stability constant K Ci BL1 calculated as follows:
K Ci BL1 =
Eq. 9
{C i BL 1}
[ C i ] × {BL 1}free
In addition, the maximal complexing capacity of the biotic ligand {CC BL1 }max equals the sum of the
concentrations of the free external binding sites {BL 1}free , metal bound to the external binding sites
{CuBL 1} and competitors bound to the external binding sites
∑ {C BL } . Under equilibrium
i
i
1
conditions, it becomes:
Eq. 10
{ CC
BL 1
} max = { BL 1 } free + { CuBL 1 } +
∑ {C
i
i
BL 1 }
Moreover, at the low copper concentrations used for the experiment, it can be assumed that metal
bound to the external binding sites is negligible compared to competitors bound to the external
binding sites ({CuBL 1} << ∑i{C i BL 1} ). Hence, combining Eq. 9 and Eq. 10, the free biotic ligand
site concentration can be expressed as follows:
Eq. 11
⎛
⎞
1
⎟
{BL 1}free = {CC BL1 }max × ⎜
⎜ 1 + ∑ K C BL × [ C i ] ⎟
i
1
i
⎝
⎠
Combining Eq. 11 and Eq. 4, we obtained:
Eq. 12
⎛
⎞
1
⎟
k '1 = k 1 × {CC BL1 }max × ⎜
⎜ 1 + ∑ K C BL × [ C i ] ⎟
i
1
i
⎝
⎠
The stability constant K C i BL 1 was thus hyperbolically related to k′1 and could be estimated using
Eq. 12 and minimizing the quadratic error between measured and calculated k′1 values.
168
Annexes
RESULTS
Mass Budgets.
Copper budgets were checked at the end of the experiments (t=72 h). There was no significant
difference (ANOVA, p<0.05) between the 72-h bioaccumulated fraction and the dissolved copper
losses in solution. This result confirms that adsorption on tanks is negligible during the bryophytes
exposure.
Kinetic accumulation of copper by bryophytes
The kinetic copper accumulation by bryophytes is indirectly shown by the depletion of copper in
solution expressed by the ratio of Cu concentration at a given time to the initial Cu concentration in
solution, ( [ Cu W ] / [ Cu W ]t =0 ) (Figure 2). For each of the bioaccumulation experiments, the ratio
[ Cu W ] / [ Cu W ]t =0 rapidly drops and reaches a quasi plateau indicating a steady state at the water-
organism interface at the end of the experiment (t = 72). Steady states at the water-organism
interface are reached at different times, depending on the concentrations of the competing cations
in water (increases in cationic concentrations result in delayed times to reach the steady state at the
water-organism interface).
The comparisons between the measured and calculated values (analytical solutions derived from
Eqs. 1-5) for the sorption and release experiments are shown in Figure 2. The correlation
coefficients between measured and calculated values are generally higher than 0.92, indicating that
the two-compartment model properly describes the exchange kinetics of copper at the wateraquatic mosses.
169
Annexes
1.2
1.2
Ca
[Cuw] / [Cuw]t=0
[Cuw] / [Cuw]t=0
Mg
1.0
1.0
0.8
0.6
0.4
0.8
0.6
0.4
0.2
0.2
0.0
0.01
0.1
1
10
0.0
0.01
100
0.1
Time (hours)
Ca 3mg L -1 ;
Ca 10mg L -1;
Ca 40mg L -1 ;
Mg 0.6 mg L-1 ;
Ca 20mg L -1 ;
Ca 150mg L -1 ;
10
100
Mg 2 mg L-1 ;
Mg 10 mg L-1 ;
Mg 5 mg L-1 ;
Mg 50 mg L-1 ;
1.2
1.2
Na
pH
1.0
[Cuw] / [Cuw]t=0
1.0
[Cuw] / [Cuw]t=0
1
Time (hours)
0.8
0.6
0.4
0.8
0.6
0.4
0.2
0.2
0.0
0.0
0.01
0.1
1
10
0.01
100
Na 20 mg
L -1
;
Na 3 mg L -1 ;
Na 100 mg
1
10
100
Time (hours)
Time (hours)
Na 1.5 mg L -1 ;
0.1
Na 10 mg L -1 ;
pH 8.4 ;
L -1
pH 5.9 ;
pH 7.7 ;
pH 6.8 ;
pH 4.8 ;
FIGURE 2. Kinetic Cu loss in solution ( [ Cu W ] / [ Cu W ]t =0 ) in the various exposure media (with variable
Ca, Mg, Na and pH concentrations) over 72 h of exposure. Note that the x-axis is on a logarithmic scale.
Symbols and lines represent experimental and modelled data (analytical solutions derived from Eqs. 1-5).
For each cation biotest, the conditional metal adsorption rate k′1 determined from the experimental
data of accumulation experiments (Eqs 6–8) decreased with increasing Ca2+, Mg2+ and H+ (but not
Na+) concentrations (Table 1). This observation supports the concept of competitive binding of
these cations on transport sites at the organism–water interface.
Whatever the bioassay, the k ' 2 k - 2 ratio (Eq 8), which describes the distribution of copper
(intra/extra-cellular) at equilibrium (t=72 h) within aquatic mosses, remains fairly constant
170
Annexes
( ( k ' 2 k −2 )t =72 h = 0.294 ± 0.02 ; n=17) (Table 1). This suggests that the internalization process is
not influenced by cationic variations in the exposure medium.
TABLE 1. Adsorption-desorption rate constants (k’1, k-1) and internalization/elimination ratio values
(k’2 / k-2) as a function of the experimental conditions of each bioaccumulation biotest.
Bioassay set
Ca
Mg
Na
pH
a
Ca2+ (mg.L-1) Mg2+ (mg.L-1) Na+ (mg.L-1) pH
a
k’1 (s-1)
a
k -1 (s-1)
a k’
2 / k-2
3.1
9.9
19.7
41.1
153.1
0.64
0.63
0.58
0.54
0.60
1.42
1.56
1.52
1.47
1.44
6.85
6.90
6.71
6.80
6.69
5.33E-04
3.67E-04
2.02E-04
1.67E-04
7.78E-05
1.31E-05
1.02E-05
9.52E-06
1.14E-05
6.62E-06
0.30
0.32
0.28
0.28
0.28
3.1
0.64
1.39
6.91
5.33E-04
1.42E-05
0.30
3.3
3.1
3.0
2.9
2.1
5.1
10.4
48.8
1.53
1.49
1.44
1.41
6.92
6.86
6.88
6.75
3.65E-04
2.23E-04
1.61E-04
8.29E-05
1.61E-05
9.06E-06
9.62E-06
6.29E-06
0.29
0.28
0.27
0.35
3.0
0.61
1.43
6.79
5.33E-04
1.42E-05
0.30
3.2
3.0
2.9
2.8
0.60
0.55
0.51
0.57
3.21
11.0
21.6
103.5
6.78
6.94
6.88
6.80
4.33E-04
4.45E-04
4.79E-04
5.02E-04
1.16E-05
1.50E-05
1.92E-05
7.80E-05
0.29
0.33
0.28
0.29
2.8
0.62
1.46
8.40
6.05E-04
1.35E-05
0.28
2.9
3.0
3.2
3.1
0.56
0.60
0.65
0.66
1.49
1.54
1.58
1.44
7.70
6.80
5.90
4.80
5.99E-04
5.33E-04
3.08E-04
1.99E-04
2.08E-05
1.34E-05
1.29E-05
1.99E-05
0.28
0.30
0.29
0.29
k’1 , k-1 values and k’2 / k-2 ratios determined from the experimental data of accumulation experiments (Eqs. 6–8).
Desorption experiments
Experimental and calculated copper concentrations during the 24-h desorption period are depicted
in Figure 3. Increases in cationic concentrations result in higher released amounts of copper from
mosses in solution. This observation suggests that desorption kinetics depends on Ca2+, Mg2+ and
H+ (but not Na+) concentrations in solution. The values calculated for the desorption step were
derived from Equations 1-5, and these values are fairly well fitted with the measured copper in
solution (Figure 3), even if some gaps (mostly at low copper concentrations in solution) exist
between calculated and measured values at the beginning of the experiments. This results clearly
171
Annexes
indicate that release processes are well described by the two-compartment model (see the next
section below).
2.0
1.5
Ca
Mg
1.2
[Cuw] (µg.L-1)
[Cuw] (µg.L-1)
1.6
1.2
0.8
0.4
0.9
0.6
0.3
0.0
0.0
0
5
10
15
20
25
0
5
10
Time (hours)
Ca 3mg
L -1
Ca 40mg
;
L -1
Ca 10mg
;
Ca 150mg
20
Ca 20mg
L -1
Mg 0.6 mg L-1 ;
;
Mg 10 mg
;
L-1
Mg 2 mg L-1 ;
;
Mg 50 mg
Mg 5 mg L-1 ;
L-1
;
1.5
1.5
Na
pH
1.2
[Cuw] (µg.L-1)
1.2
[Cuw] (µg.L-1)
25
Time (hours)
L -1;
L -1
15
0.9
0.6
0.9
0.6
0.3
0.3
0.0
0.0
0
5
10
15
20
0
25
5
Time (hours)
Na 1.5 mg
L -1
Na 20 mg L -1 ;
;
Na 3 mg L -1 ;
10
15
20
25
Time (hours)
Na 10 mg L -1
Na 100 mg L -1
pH 8.4 ;
pH 5.9 ;
pH 7.7 ;
pH 6.8 ;
pH 4.8 ;
FIGURE 3. Desorption kinetics of observed and calculated copper concentrations ( [ Cu W ] during the 24-h
desorption period.
172
Annexes
DISCUSSION
Validation of the kinetic model
The data obtained during the desorption step (Figure 3) are used for the validation of the twocompartment kinetic model. This dataset is compared to values which were calculated by using
kinetic parameters previously calibrated from the accumulation dataset only (kinetic parameters are
presented in Table 1). Thus, comparing the observed and calculated dissolved concentrations for
each biotest showed that desorption experiments are well predicted, errors being lower than a factor
of 2 in 90% of the cases (n=100); this confirms the predictive capacity of the kinetic model
developed in this study. However, for three calcium biotests, the observed copper concentrations
fall below predicted concentrations, likely because of the low measured copper concentrations,
which were very close to the copper detection limit (0.2 µg of Cu.L–1).
Effects of major cations on short-term Cu bioaccumulation kinetics
An increase of the calcium concentration from 3.1 to 153.1 mg.L–1 (0.077 to 3.8 mM) reduced the
adsorption rate constant k′1 with a factor 6.8 (Figure 4 a. ; measured k′1 varied from 5.33 × 10 −4 to
7.78 × 10 −5 s–1). A similar effect is observed for magnesium, i.e., a significant decrease (of a factor
6.4) in adsorption rate constant k′1 (Figure 4 b. ; measured k′1 varied from 5.33 × 10 −4 to 8.29 × 10 −5
s–1) was observed when magnesium concentration in solution was increased from 0.64 to 48.8 mg.L–
1
(0.026 to 2.0 mM). These findings suggest that calcium and magnesium compete with Cu for
binding sites, indicating that these cations share the same uptake sites with Cu at the cell-surface
ligands.
However, no significant change in the adsorption rate constant k′1 (Figure 4 c. ; measured k′1 varied
from 5.33 × 10 −4 to 4.33 × 10 −4 s–1) was found when sodium in solution varied between 1.43 and
103.5 mg.L–1 (0.062 and 4.5 mM). This result indicates that Cu uptaken by aquatic mosses is not
competitively inhibited by sodium ions in solution, suggesting that sodium and copper ions do not
share the same binding sites on cell membrane.
Figure 4 d. shows that between pH 4.8 and 6.8, the adsorption rate constant k′1 increased from
6.05 × 10 −5 to 1.99 × 10 −4 s–1 (factor 3.0). Increase of the pH to 8.4 do not affect significantly k′1
( 5.99 × 10 −4 s–1 for pH 7.7 and 6.05 × 10 −4 s–1 for pH 8.4). On the basis on these results two distinct
phases can be identified (graphically represented in Figure 4 d.) : (i) a first phase where increasing
pH (from 4.8 to 6.8) results in a continuous increase of the number of deprotonated sites ({BL1}free)
onto the cell membrane, and thus in increase of the Cu adsorption rate constants by aquatic mosses
173
Annexes
(k′1) ; (ii) a second phase where increases in pH (from pH 7.7 to 8.4) do not result in significant
increases of the deprotonated sites, and thus in the observed adsorption rate constants k’1.
These observations clearly show that copper accumulation did not depend on free copper
concentration only, since the adsorption rate constant (k’1) differed by more than a factor 6.8 when
cationic composition were varied in environmentally relevant ranges.
a)
b)
0.0006
k'1 (s-1)
k'1 (s-1)
0.0006
0.0004
0.0002
0.0002
0.0000
0.000
0.0004
0.0000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.0000
0.0005
-1
0.0010
0.0015
0.0020
-1
[Ca ] (mol L )
[Mg] (mol L )
c)
d)
pH
9.0
7.0
6.0
5.0
4.0
0.0006
k'1 (s-1)
k'1 (s-1)
0.0006
8.0
0.0004
0.0004
0.0002
0.0002
ALL EXTERNAL BINDIING SITES
DEPROTONED
DEPROTONATION PHASE
0.0000
0.0000
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
10
-9
10
-8
10
-7
10-6
10-5
[H+] (mol L-1)
[Na] (mol L-1)
FIGURE 4. Measured (∇) and calculated (⎯ ; Eq. 12) adsorption rate constant of copper (k′1) by
bryophytes as a function of the (a) Ca, (b) Mg, (c) Na concentrations, and (d) pH.
174
10-4
Annexes
Binding constants of competing cations to the biological surfaces
The affinity constants K C i BL 1 (in L.mol–1) and the maximal uptake rate constant ( k 1 .{CC BL1 }max ,
7.07 × 10 -4 s–1) were calculated using Eq. 12.
Compared to the values of the affinity constants for calcium (log K CaBL1 = 3.47 ) , magnesium
(log K MgBL 1 = 3.87 ) and proton (log K HBL1 = 5.13 ) , the value for sodium ( log K NaBL1 = 0.01)
indicates that copper bioaccumulation on bryophytes is not affected by Na concentrations in the
exposure medium. The affinity constants value obtained for proton ( log K HBL1 = 5.13 ),
corresponding to the average pKa value of bryophyte binding sites, confirms the assumption of a
total deprotonation at neutral pH, under which the H/Cu competition occurs. The stability
constants ( log K Ci BL1 ) for Ca, Mg, and H obtained for F. antipyretica are on the same order of
magnitude as those reported for fish gills (Santore et al., 2001; Niyogi et al., 2004) or daphnids (De
Schamphelaere and Janssen, 2002).
Incorporation of cationic composition of water in the biomonitoring strategy
In order to illustrate how the modelling approach described in this paper could be incorporated in
the (re)-interpretation of bryophytes contamination levels commonly collected in monitoring
networks, we selected two prospective situations. The first one deals with the interpretation of
contamination levels of transplanted mosses, while the second one concerns contamination levels
autochthonous bryophytes.
(i) Example 1 :
Influence
of
water
cationic
compositions
for
predicting
copper
bioaccumulation by transplanted mosses
In this example we evaluate the performance of the cationic-dependant kinetic model to describe
the bioaccumulation in mosses transplanted in three contrasted water cationic compositions
(representative of three French rivers). In this example, we suppose that bryophytes originating
from a non-polluted area are transplanted on three different French rivers (the Loire, the Seine and
the Moselle rivers, respectively). Average water cationic compositions of these rivers are reported in
Table 2 (average values were determined from data collected by our institute during several in situ
campaigns). In this predictive exercise, we considered that each of the selected rivers was submitted
to an accidental contamination episode (96 hours contamination phase with about 5 µg.L-1 of
bioavailable Cu in water ([Cuw]), Table 2). Evolutions in the bioaccumulated concentrations of
copper ([Cum]) for mosses exposed to these three water cationic compositions (Moselle, Seine and
Loire) can be calculated using the previously developed cationic-dependant kinetic model.
175
Annexes
At the end of the 96 hours contamination period, a fourfold difference for bioaccumulated copper
([Cum]t=96h , Table 2) can be observed between the hard-water (the case of Moselle river) and softwater (Loire case) scenarios. As regard to water quality classes (given in the Table 2) used e.g. by
French water management agencies (Mersch and Claveri, 1998) to interpret bryophytes
measurements, different ‘pollution classes’ classes would be drawn from bryophytes levels obtained
on the Seine, Loire and Moselle rivers respectively (while the accidental scenario is considered to be
the same one): the bioaccumulated copper obtained in the Loire river would correspond to the socalled ‘Heavy pollution’ class, while those observed at the Moselle river would correspond to the
‘Safety range’ class. Using the present cationic-dependant kinetic model, it is now feasible to predict
the bioaccumulation of copper in aquatic mosses across a wide range of water quality conditions,
and thus to derive site-specific WQC. For example, the use of the present cationic-dependant
model may greatly improve the ability of regulators to (re)-defined lower discharges thresholds for
the Loire river (as compared to the Seine and Moselle rivers) in order to reach the recommended
‘Safety Range’ class.
TABLE 2. Predicted kinetic constants and 96h accumulated copper in mosses for three combinations of water
cationic compositions (Loire, Seine and Moselle rivers cases) compared with French Water Criterion (WQC).
Input data
[CuW]
Ca
Mg
Na pH
(µg.L-1) (mg.L-1) (mg.L-1) (mg.L-1)
River
Loire
5
36
7
18
8.5
Kinetic parameters
k’1 k-1
k2 k –2
(h-1) (h-1) (h-1) (h-1)
a
0.30
Output data
{Cum}t=96h
(µg.g-1d.w.)
0.058 0.086 0.29
239
Seine
5
136
6
7
8.3
0.15
0.058 0.086 0.29
123
Moselle
5
250
23
198
8.0
0.07
0.058 0.086 0.29
54
a
Interpretation
French Water Quality
Criterion (WQC)
200 <{Cum}t=96h<400 µg g-1d.w
Heavy pollution
66 <{Cum}t=96h< 200 µg g-1d.w
Proven pollution
33 <{Cum}t=96h< 66 µg g-1 d.w
Safety range
Conditional uptake rate constant calculated using Eq. 12
(ii) Example 2 : Evaluation of the bioavailable copper in water from measurements on
autochthonous mosses
In this example, we investigate the use of the present model to quantify the theoretical bioavailable
copper concentrations in water that would lead to a common aquatic mosses contamination in
French river waters with a wide range of water cationic compositions. We assume that
176
Annexes
autochthonous mosses are at equilibrium in chronically Cu-contaminated rivers “ i ”. For each river
“ i ”, characterized by its own cationic concentrations (Cai, Mgi, Nai, pHi), equations (1) to (3) can
be simplified using the equilibrium assumption to calculate the bioavailable copper concentration in
water [ Cu W ]i :
Eq. 13
[ Cu W ]i =
k -1, i [ Cu m ]i
×
k'
k '1, i
1 + 2,i
k - 2,i
In this schematic exercise, we considered that bryophytes were collected in eighty different rivers
(i=1 to 80) and that copper bioaccumulated concentration is 100 µg.g-1 for each of them. Average
cationic composition for these 80 rivers were obtained from national water agencies databases (data
available at http://www.lesagencesdeleau.fr). For each 80 water cationic composition (Cai varying
from 1.3 to 165 mg.L-1, Mgi from 0.6 to 38 mg.L-1, Nai from 2.7 to 109 mg.L-1 and pHi from 6.8 to
9.6), we calculated (Eq. 12) the corresponding adsorption rate constant k’1,i (varying from 2.5 × 10 −5
to 3.8 × 10 −4 L.g-1.s-1). Each bioavailable copper [ Cu W ]i was calculated using the previously
estimated site-specific adsorption rate constant k’1,i . The dispersion of the calculated bioavailable
concentrations in water ( [ Cu W ]i for each f the 80 rivers “ i ” is graphically represented in the
Figure 5. This results showed a fifteen-fold difference among the 80 calculated bioavailable
concentrations (calculated [ Cu W ]i varying from 0.44 µg.L-1 to 6.7 µg.L-1), while the bioaccumulated
copper concentration in mosses were assumed to be the same one. These results suggests that
cationic composition of water have significant implication in the interpretation of autochthonous
aquatic mosses contamination levels. The use of the present cationic-dependant model may greatly
help national water management agencies in the evaluation of site-specific bioavailable metal
contaminations in rivers.
177
Annexes
25
Aboundance (%)
20
15
10
5
0
0
1
2
3
4
5
6
7
[Cuw ]i (µg.L-1)
FIGURE 5. Dispersion of the calculated bioavailable copper fraction ( [ Cu W ]i ) for the eighty rivers “i”.
CONCLUSIONS
Our experimental and modelling results have shown that water cationic composition have to be
taken into account for predicting the bioaccumulation of copper by aquatic mosses. Based on the
relationships between each major cation concentration and the copper exchange kinetics on mosses,
the binding constants ( K C i BL 1 ) of each competing cations to the biological surfaces were derived.
We illustrate how a cation-dependent modelling approach could improve the interpretation of
bryophytes measurements routinely collected in biomonitoring programmes. The experimental
observations and the associated model developed in this paper may have important implications for
the protection and management of freshwater biota in terms of national water quality guidelines.
Hence, in the framework of future national water quality guidelines revisions, a such flexible and
mechanistic biomonitoring tool (integrating the protective effects of competing cations) may greatly
improve the ability of regulators to derive site-specific Cu (metal) guidelines for protecting aquatic
biota, while limiting the use of conservative assumptions.
178
Annexes
REFERENCES
Borgmann, U., Nowierski, M., Dixon, D.G., 2005. Effect of major ions on the toxicity of copper to
Hyalella azteca and implications for the biotic ligand model. Aquatic Toxicology 73, 268287.
Cenci, R.M., 2001. The use of aquatic moss (Fontinalis antipyretica) as monitor of contamination in
standing and running waters: limits and advantages. Journal of Limnology 60, 53-61.
Ciffroy, P., Garnier, J.-M., Khanh Pham, M., 2001. Kinetics of the adsorption and desorption of
radionuclides of Co, Mn, Cs, Fe, Ag and Cd in freshwater systems: experimental and
modelling approaches. Journal of Environmental Radioactivity 55, 71-91.
Claveri, B., 1995. Les bryophytes comme traceurs de la contamination métallique des eaux
continentales. Université de Metz, Metz, p. 235.
Claveri, B., Guérold, F., Pihan, J.-C., 1995. Use of transplanted mosses to monitor trace metals in
acidic headwater streams in Vosges mountains. Hydroécologie Appliquée 5, 111-125.
Croisetiere, L., Hare, L., Tessier, A., Duchesne, S., 2005. Modeling Cadmium Exchange by an
Aquatic Moss (Fontinalis dalecarlica). Environ. Sci. Technol. 39, 3056-3060.
Croteau, M.N., Hare, L., Tessier, A., 1998. Refining and testing a trace metal biomonitor
(Chaoborus) in highly acidic lakes. Environ. Sci. Technol. 32, 1348-1353.
De Schamphelaere, K.A.C., Janssen, C.R., 2002. A Biotic Ligand Model Predicting Acute Copper
Toxicity for Daphnia magna: The Effects of Calcium, Magnesium, Sodium, Potassium,
and pH. Environ. Sci. Technol. 36, 48-54.
Fernandez, J.A., Vazquez, M.D., Lopez, J., Carballeira, A., 2006. Modelling the extra and
intracellular uptake and discharge of heavy metals in Fontinalis antipyretica transplanted
along a heavy metal and pH contamination gradient. Environmental Pollution 139, 21-31.
Ferreira, D., Tousset, N., Ridame, C., Tusseau-Vuillemin, M.-H., 2008. More than inorganic copper
is bioavailable to aquatic mosses at environmentally relevant concentrations.
Environmental Toxicology and Chemistry 27, 2108-2116.
Heijerick, D.G., De Schamphelaere, K.A.C., Janssen, C.R., 2002. Biotic ligand model development
predicting Zn toxicity to the alga Pseudokirchneriella subcapitata: possibilities and
limitations. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology &
Pharmacology 133, 207-218.
179
Annexes
Mersch, J., Claveri, B., 1998. Les bryophytes comme outil de surveillance de la contamination des
eaux courantes par les micropolluants métalliques : Concept, méthodologie et
interprétation des données. Etude Inter Agence n°55. Agences de l’eau, p. 245.
Mersch, J., Morhain, E., Mouvet, C., 1993. Laboratory accumulation and depuration of copper and
cadmium in the freshwater mussel Dreissena polymorpha and the aquatic moss
Rhynchostegium riparioides. Chemosphere 27, 1475-1485.
Meylan, S., Behra, R., Sigg, L., 2003. Accumulation of Copper and Zinc in Periphyton in Response
to Dynamic Variations of Metal Speciation in Freshwater. Environ. Sci. Technol. 37,
5204-5212.
Morel, F.M.M., Hering, J.G., 1993. Principles and Applications of Aquatic Chemistry. John Wiley
and Sons, New York.
Nimis, P.L., Fumagalli, F., Bizzotto, A., Codogno, M., Skert, N., 2002. Bryophytes as indicators of
trace metal pollution in the River Brenta (NE Italy). The Science of The Total
Environment 286, 233-242.
Niyogi, S., Couture, P., Plyle, G., McDonald, D.G., Wood, C.M., 2004. Acute cadmium biotic ligand
model characteristics of laboratory-reared and wild yellow perch (Perca flavescens) relative
to rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Canadian journal of fisheries and aquatic
sciences 61, 942-953
Niyogi, S., Wood, C.M., 2004. Biotic Ligand Model, a Flexible Tool for Developing Site-Specific
Water Quality Guidelines for Metals. Environ. Sci. Technol. 38, 6177-6192.
Santore, R.C., Di Toro, D.M., Paquin, P.R., Allen, H.E., Meyer, J.S., 2001. Biotic ligand model of
the acute toxicity of metals. 2. Application to acute copper toxicity in freshwater fish and
daphnia. Environmental Toxicology and Chemistry 20, 2397-2402.
Xue, H.-B., Stumm, W., Sigg, L., 1988. The binding of heavy metals to algal surfaces. Water
Research 22, 917-926.
180
181
182
Annexes
Ar ticle 3
An Integrated Method for Predicting
Bioaccumulation of Copper by Aquatic Mosses :
an in situ Validation Study
(En préparation pour Chemosphere)
Daniel FERREIRA1, Philippe CIFFROY1, Marie-Hélène TUSSEAU-VUILLEMIN2, Jean-Marie
GARNIER3
1 Electricité
de France, Division Recherche et Développement, Laboratoire National d’Hydraulique et
Environnement, 6 Quai Watier, 78401 Chatou, France.
3 CEREGE, Université Paul Cézanne, Aix-Marseille III, (UMR CNRS 6635), BP 80, F 13545, Aix en
Provence, France.
Abstract
Although aquatic mosses have long been used for bioassessment and monitoring of bioavailable
metals concentrations in natural freshwaters, the environmental factors affecting the bioavailability
of metals for aquatic mosses are not fully understood and taken into account in risk assessment
strategies. Hence, in this study we investigate how waters quality conditions (dissolved organic
matters and water cationic compositions) alters the bioavailability and the bioaccumulation of
copper in aquatic mosses (Fontinalis antipyretica) under field conditions. For this purpose, aquatic
183
Please cite this article as : Ferreira, D., P. Ciffroy, M.-H. Tusseau-Vuillemin, and J.-M. Garnier (2008). "An Integrated
Method for Predicting Bioaccumulation of Copper by Aquatic Mosses : an in situ Validation Study." Chemosphere In
Press.
Annexes
mosses were exposed for 7 days to two nominal Cu concentrations (5 and 15 µg/L) in a flowthrough field microcosm supplied with four contrasted natural waters. At the end of the exposure
period, a 6-fold difference for bioaccumulated copper contamination levels were found between the
four deployment sites. These results showed that Cu accumulation by mosses were significantly
influenced by variations in water quality conditions. Metal speciation and water cationic
compositions are the main environmental factors governing metal bioaccumulation in aquatic
mosses.
These results showed that a bioaccumulation model that ignores water characteristics is not suitable
to describe/predict Cu accumulation by aquatic mosses under contrasted water quality conditions.
On the contrary, the present integrated approach coupling a metal speciation tool (DGT technique)
and a cationic-dependant model showed promises to predict the bioaccumulation of copper under a
wide range of water quality conditions. In the framework of future national water quality guidelines
revisions, a such flexible and mechanistic tool (integrating both the metal speciation and the
protective effects of competing cations) may greatly improve the ability of regulators to derive site
specific Cu (metal) guidelines for protecting aquatic biota, while limiting the use of conservative
assumptions.
INTRODUCTION
Trace metals are ubiquitous wherever human activities impinge aquatic ecosystems. The increasing
awareness that trace metals constitute a major threat to aquatic ecosystems has triggered the
development and the use of integrative biological indicators (or biomonitors). For this purpose,
aquatic mosses have long been used to monitor the bioavailable trace metal concentrations in
contaminated aquatic systems that display high copper concentrations. Despite their long history as
biomonitors [1-3], there has been little attempt to develop models to rigorously relate metal
concentrations in mosses to those in water, and the influence of the various environmental factors
that may alter metal bioaccumulation.
In our previous papers we investigated, under laboratory conditions, the individual effects of pH,
majors cations [4], and concentration/type of dissolved organic matter (DOM) [5] on copper
bioaccumulation kinetics by aquatic mosses (Fontinalis antipyretica). In general, it was observed that
copper bioaccumulation kinetics decreased with increasing concentrations of majors cations and
DOM. This is in agreement with most literature reports on the acute and chronic toxicity of copper
184
Press.
Annexes
to freshwater algae, cladocerans and fish [6-9]. In this paper, the results of these previously
conducted biotests are used to address the following questions. What are the combined effects of
different physicochemical water characteristics (pH; DOC concentration and DOM type;
concentrations of Ca, Mg, and Na) on the bioaccumulation of copper by aquatic mosses? Can a
coupling approach (mixing DGT measurements and BLM) improve the prediction of copper
bioaccumulation by aquatic mosses under field conditions?
For this purpose, aquatic mosses were exposed to Cu (water spiked with 5 and 15µ of Cu/L) under
contrasted water quality conditions (four contrasted deployment sites). In this study, we investigate
under field conditions the ability of an integrated approach, based on the use of a monitoring
speciation tool (the DGT technique) and a kinetic model, to describe and predict the
bioaccumulation of copper in aquatic mosses (Fontinalis antipyretica).
Deployment sites
Transplant sites, were located in four contrasted French catchments areas (Figure 1). The main
characteristics of these four sites are summarized in Table 1 (Temperature, pH, Dissolved Organic
Matter and major cations). Both Vassivière and Sauviat have low pH (6.50 and 6.97, respectively)
and very low water cationic compositions ([Ca] < 3 mg/L ; [Mg] < 2 mg/L and [Na] < 4 mg/L) but
differ in their typological characteristics. While Sauviat is a small hydroelectric reservoir supplied
with qwtwo small creeks (the Miodet and Dore creeks ; Strahler ordering : 1 and 2, respectively)
located in a mainly agricultural highland area, Vassivière is a large hydroelectric reservoir (surface of
the storage lake : 9.5ha) supplied with water from the Maulde river and located in a lowland peat
area (water strongly enriched with degraded organic matter ; DOC = 4.95 mgC/L). Both Bellevillesur-Loire and Cattenom were located upstream of two nuclear power plants on the Loire and
Moselle rivers, respectively. Both sites had high pH (7.7 – 8.2) but differ in their water cationic
compositions (moderate levels in the Loire river, while elevated in the Moselle river ; Table 1).
185
Press.
Annexes
Table 1. Temperature, Dissolved Organic Carbon (DOC), pH and major cations measured during our field
experiments.
Transplant Sites
River
Belleville-sur-Loire
Cattenom
Vassivière
Loire
Moselle
Maulde
Miodet/
Dore
Sauviat
Temp (°C) DOC (mgC/L) pH
9.05
9.30
11.9
11.8
3.41
2.66
4.95
3.38
Ca (mg/L) Mg (mg/L) Na (mg/L)
8.25
7.70
6.50
6.97
40.62
109.7
2.26
2.50
7.09
21.96
1.75
1.15
10.79
83.74
3.42
1.45
CATTENOM
BELLEVILLE
VASSIVIERES
SAUVIAT
Paris
Nuclear plants sampling
sites
Hydroelectric reservoirs
sampling sites
Figure 1. Location of the four deployment sites: Cattenom (on the Moselle river), Belleville (on the Loire
river), Vassiviere and Sauviat (hydroelectric reservoirs supplied by the Maulde and the Miodet rivers).
Aquatic mosses (Fontinalis antipyretica) were collected from a reference site (Sauldre River ; central
France), far from significant anthropic pressure (third Strahler stream ordering). To limit biological
variability, only new green tips (2–3 cm) were kept ; dark green tips were discarded.
Experimental procedure
The experimental procedure is described in Figure 2. To minimize the collection of suspended
particles, the aquatic mosses (12 g
f.w.
) and the DGT devices (6 units) were exposed in a bioreactor
186
Press.
Annexes
(18 L) supplied with decanted water pumped (P1) from the river (the input flow of the water from
river was continuous and constant during 7 days, i.e. the exposure period). Before being input into
the bioreactor, the water goes through a lamellar decanter where suspended particles are partially
eliminated. At the output of the decanter, water is directed to a reservoir and spiked with a wellknown concentration of copper from a stock solution.
(1)
(6)
(5)
(9)
(2)
(8)
(4)
(3)
(7)
River Water
Aq. mosses
(12 g fw)
6 DGT units
Figure 2. Apparatus used for our field experiment consisting of the following : (1) High-output pump P1
(d P1 = 0.5 or 0.2 L/min), (2) Lamellar decanter, (3) Purge valve (4) Cu stock solution (10 or 12 mg/L – 2
L), (5) Peristaltic pump P2 (d P2 = 0.25 mL/min), (6) Injection valve, (7) Reservoir for Cu-contaminated
water (20L), (8) Bioreactor (18L), (9) System overflow.
The experimental protocol was duplicated for each site in order to obtain two different dissolved
copper concentrations in the exposure solutions. Exposure solutions were prepared continuously in
a reservoir fed (20 L) with an appropriate injection of CuNO3 stock solution ([Cu] = 10 or 12 mg/L
; injection rate flow : dP2 = 0.25 mL/min) and decanted water (input rate flow dP1 = 0.5 and 0.2
L/min) river to obtain two nominal dissolved Cu concentrations ( [ Cu W ]i ) of 5 and 15 µg/L.
The major parameters of the experiment are summarized in Table 2.
Table 2. Hydro-chemical variables.
Biological variables
Biomass
Mosses species
Fontinalis
antipyretica
~12 g f.w.
Hydraulic variables
Input flow dP1
Bioreact. Vol. (L)
(L/min)
0.5
18
0.2
Chemical variables
Stock solution [Cu]
Bioreact. Nominal
(mg/L)
[CuW] (µg/L)
10
5
12
15
187
Press.
Annexes
Aquatic mosses sampling and copper content analysis
Aquatic mosses were collected in triplicates (each replicate ~ 100-200 mg fresh weight) after 0, 1, 2,
3, 6 and 7 days of exposure (except for the field experiment carried out at Belleville where samples
were collected at t=0 and 7 days only). Moss samples were washed for 60 min with 50 mL of 1.0
mM EDTA (Na2-EDTA, Acros Organics, Geel, Belgium) to remove the metals adsorbed to the
biological membrane (according to Meylan et al. [12]). The extra-cellular copper content bound to
the biological membrane was measured in the EDTA solution by GF-AAS (Varian, SpectrAA-800,
Varian). The washed bryophytes were dried at 60°C for 72 h and acid-mineralized (Merck,
Darmstadt, Germany, 65% suprapur nitric acid) for the measurement (GF-AAS) of copper
attributed to the intracellular metal content of bryophytes.
Labile copper concentration determination
Labile copper concentrations were measured using the diffusive gradient in thin films technique
(DGT). Open-pore (pore>5 nm) and restrictive gels (pore<1nm) were used simultaneously. Six preassembled
DGT
units
(obtained
from
DGT
Research,
Lancaster,
UK;
http://www.dgtresearch.com) comprising triplicate sets with the two different gels (open-pore and
restricted) were suspended in the exposure solutions for 7 days. After immersion, the DGT units
were dismantled under a laminar flow hood. The Chelex resins were placed in clean polypropylene
tubes and eluted in 3 ml of nitric acid 1 M (HNO3 65% Suprapur Merck (diluted in ultrapure water)
for at least 12 h at 4°C. Copper was measured in eluates by graphite furnace – atomic absorption
spectroscopy (Varian SpectrAA-220Z). The mass of metal sequestered on the resin was evaluated
considering an 80% yield of elution [13]. The labile copper concentration ( Cu DGT in µg/L) was
calculated using Eq. 1 :
Cu DGT =
M .Δg
t. A.D
Eq. 1
where M is the mass of copper accumulated on the resin after a deployment of duration t, A is the
surface of the window and D is the diffusion coefficient of copper (typically, 4.76 10-6 cm2/s in
restricted gels, and 6.06 10-6 cm2/s in open pores gels for Cu at 24 °C; data from DGT Research,
available at http://www.dgtresearch.com). The thickness of the diffusive layer (Δg) is theoretically
equal to the 0.8-mm-thick hydrogel plus the 0.13-mm-thick surface membrane. However, it is likely
that, under realistic conditions, a slight additional diffusive boundary layer forms at the waterhydrogel interface (H. Zhang, DGT Research, personal communication). Based on our previous
188
Press.
Annexes
results [5] this additional boundary layer was evaluated equal to 0.12 mm (a 13% additional
boundary layer), so that Δg = 1.05 mm.
Water sampling for dissolved copper and main water characteristics.
Water samples for Copper and major cations measurements were taken automatically at 6 hours
intervals by an autosampling device (ISCO 6700 portable samplers). An average sample was then
automatically daily reconstituted (4 samples per 24 hours). Average samples of water were taken in
polypropylene (PP) bottles, filtered (20 mL, in trpilicates) with disposable PTFE syringe filters (0.2
µm, VWR International, USA) and stored at 4°C. Filtered samples were then acidified to 0.01
HNO3 (suprapure) prior to storage (4°C). In order to limit metal contaminations, all handling was
performed with plastic gloves, PP bottles were previously washed with 0.1 M HNO3 for 24 hours.
Water samples for copper (Cu) and major cations measurments (Ca, Mg and Na) were measured by
Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry (GF-AAS – Varian, SpectrAA-800, Varian) for
copper and by inductively coupled plasma spectrometry (ICP-AES – Lyberty Series II, Varian) for
major cations.
Water samples taken for the dissolved organic matter were manually collected twice a week (in
duplicates). Samples were filtered on pre-combusted glass fiber filters (0.7 µm GF/F filters) and
DOC concentrations were measured using a Carbon Analyzer concentrations (O.I. Analytical,
College Station, TX, USA).
Temperature and pH were daily measured (pH meter WTW pH 320, WTW GmbH, Weilheim,
Germany).
Kinetic modeling
The key processes that control metal uptake and release by F. antipyretica are generally described
using a two-compartment model with first-order kinetics [4, 14] (Figure 3).
189
Press.
Annexes
Cell
membrane
Medium
1. Adsorption/
Desorption
CuW
k1
k -1
Organism
2. Internalization/
Elimination
Cu BL1
k2
k -2
Cu-BL2
K CiBL1
Ca2+, Mg2+, Na+, H+
Figure 3. Conceptual model of physicochemical processes involved in the uptake/release of Cu by aquatic
bryophyte.
Cu W , CuBL 1 and CuBL 2 are the dissolved in the water, extracellular and intracellular copper,
respectively.
According to first-order kinetics assumptions, the bioaccumulation kinetics of copper in the aquatic
mosses can be described by the following kinetic equations :
V
⎧ d{CuBL 1}
k1 {BL 1}free [Cu W ]-k-1 {CuBL 1}-k2 {BL 2} {CuBL 1} + k- 2 {CuBL 2}
=
⎪⎪
m bryos
dt
⎨
⎪ d{CuBL 2} = k {BL } {CuBL }-k {CuBL }
2
2 free
1
-2
2
⎪⎩
dt
Eq. 2
Eq. 3
Where [Cu W ] , {CuBL 1} and {CuBL 2} are, respectively the bioavailable dissolved copper, the
extra and intra-cellular copper concentrations; k1, k-1, k2 and k-2 are the kinetic rate constants for the
adsorption, desorption, internalization and elimination reactions, respectively BL 1 and BL 2 are the
free intra and extra-cellular binding sites ; V m bryos represents the biomass density in the bioreactor.
Computer software based on the above equations allows to predict the evolution of bioaccumulated
copper in the bryophytes from the concentration of the bioavailable copper concentration in water.
Obviously, to apply this model it is necessary to know the site-specific kinetics constants ; based on
190
Press.
Annexes
our previous results [4], their values were calculated under a wide range of water cationic
compositions as follows :
Determination of the kinetic constants
The validity of this model was previously tested under laboratory conditions [4]. In this previous
study, we investigated the effect of water cationic composition (Ca, Mg, Na, pH) on the
bioaccumulation and elimination rates of copper (Cu) by an aquatic moss (Fontinalis antipyretica). We
observed that the bioaccumulation rates of Cu in mosses were significantly reduced as the
concentrations of competitive cations in solution increased. Modelling results showed that the
values of the kinetic constants for desorption (k-1), internalisation (k2) and elimination (k-2), were
not related to the concentrations of major cations present in the solution. Hence, in this study, we
used average values for the desorption, internalisation and elimination rate constants (k-1 = 0.058 h-1
; k 2 = 0.245 h-1 ; k - 2 = 0.297 h-1).
Conversely, the conditional adsorption rate constant (k’1) was significantly reduced as the
concentrations of these cations in solution increased. The conditional rate constant k′1 (in L.g-1.h–1),
can easily be calculated as follows (details of the mathematical developments can be found in
supporting information) :
k' 1=
⎛
⎞
V
1
⎟
×k 1 ×{BL 1}max × ⎜
⎜ 1 + ∑ K C BL × [C i ] ⎟
m bryos
i
1
i
⎝
⎠
Eq. 4
Where k 1 ×{BL 1}max is the maximal uptake rate constant ( k 1 ×{BL 1}max = 2.54 h-1 ;[4]), K Ci BL1 is the
affinity constant of the cations C i (Ca, Mg, Na and H) on the external binding sites
( K CaBL1 = 2.95 × 10 3 , K MgBL1 = 7.41 × 10 3 , K NaBL1 = 1.02 , K
HBL
1
= 1 . 35 × 10
5
; [4]), and [ C i ] is
the concentration of each major cation present in the solution.
191
Press.
Annexes
RESULTS AND DISCUSSION
Copper speciation
Total dissolved [Cu W ] and labile [Cu DGT ] copper concentrations measured in the exposure
solutions are shown on Table 3. During the Cu-exposure period of our experiment, dissolved
copper concentrations ( [Cu W ] ) remained roughly constant (Standard Deviation ≤ 12 %) and were
close to nominal values (5 and 15 µg/L).
Table 3. Nominal and measured dissolved ( [Cu W ] ), labile (sampled using DGT devices equipped with
open pores, [Cu DGT ]OP ; and restricted gels, [Cu DGT ]R ) copper concentrations (mean ± SD ; n = 7 replicates
for dissolved concentrations ; n = 3 for labile concentrations) in the exposure solution spiked with 5 and
15 µg of Cu/L.
Dissolved Cu [Cu W ] (µg/L)
Transplant site
Belleville
Cattenom
Vassivière
Sauviat
Belleville
Vassivière
Sauviat
Labile Cu [Cu DGT ] (µg/L)
Nominal [Cu W ]
Measured [Cu W ]
Restricted [Cu DGT ]R
Open pores [Cu DGT ]OP
5
5
5
5
15
15
15
4.8 ± 0.3
6.3 ± 0.4
4.9 ± 0.6
5.1 ± 0.5
15.4 ± 1.0
14.3 ± 0.8
16.4 ± 1.0
1.20 ± 0.15
1.70 ± 0.21
0.97 ± 0.13
1.01 ± 0.14
4.05 ± 0.58
3.15 ± 0.68
3.17 ± 0.43
1.44 ± 0.16
1.88 ± 0.23
1.75 ± 0.21
1.12 ± 0.14
4.65 ± 0.65
4.48 ± 0.57
3.52 ± 0.50
Inorganic fraction of copper, sampled by DGT equipped with restricted gels ( [Cu DGT ]R ), varied
from 19 to 26% of the total dissolved copper concentrations ( [Cu W ] ) in the four studied sites (2627% at Belleville and Cattenom, 19-20% at Vassivière and Sauviat). These results indicate that a
substantial proportion (74-81 %) is complexed by organic ligands. The labile fraction of copper
measured by DGT equipped with open pores gels, were significantly higher (varying from 22 to
35% of the total dissolved in the 4 sampling sites) than the inorganic fraction measured by DGT
equipped with restricted gels. The comparison of these results ( [Cu DGT ]R
vs.
[Cu DGT ]OP ) suggests
that a fraction of the copper-OM complexes is physically excluded from the restricted diffusion gel.
This observation is particularly verified for the Vassivière case, where labile Cu-OM complexes
sampled
with
open
pores
accounts
for
16%
of
the
dissolved
copper
( ([Cu DGT ]OP − [Cu DGT ]R )/[Cu W ] ).
192
Press.
Annexes
Bioaccumulation of copper
The background values measured for intra-cellular copper content in aquatic mosses were roughly
constant and varied from 0.14 µmol/g dw (Cattenom) to 0.25 µmol/g dw (Vassivière) whereas the
extra-cellular contents
were approximately 2-4-fold lower (varying from 0.04 µmol/g dw to 0.10
µmol/g d.w.). This indicates that the initial metal content in aquatic mosses originating from the
reference site was mainly internalized (69-81 % of the total metal content) and that a minor fraction
was adsorbed on the extra-cellular binding sites (19-31% of the total metal content).
For each aqueous Cu concentration (5 and 15 µg Cu/L), increases in accumulated copper {Cu m}
were initially rapid, then slowed after about 6 days (Figure 1). Similar curves were reported for the
accumulation of copper and other metals in various moss species by several researchers [14, 15].
At the end of the exposure period (t = 7days), contamination levels in mosses (total copper
content) varied in 6-fold range between sites ({Cu m} in Table 4) for each nominal contamination
level (5 and 15 µg/L). This, results confirms that the bioaccumulation kinetics of copper in mosses
is partially controlled by physico-chemical parameters (major cations or/and speciation of the
metal in water).
Intracellular copper content in mosses after 7-days exposure varied from 0.62 to 1.54 µmol/g dw
and from 2.51 to 3.84 µmol/g dw for the experiments spiked with 5 and 15 µg Cu/L respectively,
while the extracellular varied from 0.60 to 3.92 and from 2.78 to 11.92 µmol/g dw for the
experiments spiked with 5 and 15 µg Cu/L respectively (Table 4). The proportion of intracellular
content {CuBL 2} compared to the total content {Cu m} was between 24 and 36%, the rest being
adsorbed on the cell walls (extracellular {CuBL 1} ) at the end of the exposure period. These
measured proportions of intracellular metal content remained roughly constant over the different
transplant sites, and consistent with our previous laboratory results where the measured internalised
fraction of copper represented 25% of the total metal content in mosses at the end of the
laboratory biotest (t = 72h). Nevertheless, the slight differences observed in the intracellar could be
attributed to the history of the transplanted aquatic organism. In effect, the lowest intracellular
fraction (24 %, aquatic mosses deployed at Sauviat) were recorded for mosses originated from the
reference river (Sauldre River) collected during the winter (February 2008). The low water
temperature of the reference river (about 3 °C in February 2008) contrasted with the moderate
water temperatures (varying from 8 to 11 °C) observed during the three other sampling campaigns.
A such seasonal factor may induces physiological stress in mosses and alters the internalisation
process (according to [16]) during the deployment period.
193
Press.
Annexes
Table 4. Copper concentrations in mosses (extra- and intra-cellular) measured at the end of the exposure
period (7 days).
Nominal [ Cu W ]
(µg/L)
Belleville
Cattenom
Vassivière
Sauviat
Belleville
Vassivière
Sauviat
7 days – Accumulated Cu (µmol.g-1 d.w.)
Extra-cellular {CuBL1}
Intra-cellular {CuBL 2}
Total {Cu m}
1.15 ± 0.07
0.60 ± 0.07
3.92 ± 0.51
3.07 ± 0.64
3.98 ± 0.24
11.92 ± 1.72
9.50 ± 1.61
0.62 ± 0.12
0.34 ± 0.09
1.54 ± 0.15
1.12 ± 0.20
1.86 ± 0.10
3.84 ± 0.32
3.69 ± 0.55
1.77 ± 0.21
0.94 ± 0.16
5.46 ± 0.66
4.20 ± 0.84
5.84 ± 0. 43
15.76 ± 2.0
13.18 ± 2.17
5
15
7
a) 5 µg Cu/L
Cu content (µmol/g d.w.)
6
Figure 4. Copper accumulation over time (means
5
± SD; n = 3) by moss held at various
4
contamination levels (5 and 15 µg Cu/L) in the
3
four transplant sites : Vassivière ( ), Sauviat
( ), Belleville ( ) and Cattenom ( ).
2
1
0
b) 15 µg Cu/L
Cu content (µmol/g d.w.)
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
24
48
72
96
120
144
168
192
Time (hours)
194
Press.
Annexes
Influence of metal speciation on the copper bioaccumulation
In order to evaluate whether the concentrations measured in mosses were a function of metal
speciation in water, regression analysis was performed for each metal fraction in water (dissolved
Cu [Cu W ] , inorganic Cu [Cu DGT ]R , and weakly complexed Cu [Cu DGT ]OP ) (Figure 5).
Cu content at 7 days (µmol/g d.w.)
18
18
a)
16
b)
c)
16
14
14
12
12
10
r² = 0.52
r² = 0.58
8
10
r² = 0.68
8
6
6
4
4
2
2
0
0
0
50
100
150
200
Dissolved Cu (nM)
250
0
10
20
30
40
50
Inorganic Cu [Cu DGT]R (nM)
60
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Weakly complexed Cu [Cu DGT]OP (nM)
Figure 5. Bioaccumulated copper in F. antipyretica after 7 days of exposure as a function of a) dissolved
copper ( , r² = 0.52, [Cu W ] , b) inorganic copper ( , r² = 0.58, [Cu DGT ]R sampled using DGT equipped
with restricted gels), and c) weakly complexed copper (
devices equipped with open pores gels)).
, r² = 0.68, [Cu DGT ]OP sampled using DGT
The correlations observed between copper accumulation in mosses and copper concentrations in
water were found to be higher when copper speciation was taken into account (Figure 5). The fact
that observed correlation coefficients (r² = 0.58 and 0.68 for the inorganic and weakly complexed
Cu concentrations respectively) between accumulated and labile concentrations (Figure 5 b. and c.)
were higher than for dissolved Cu (Figure 5.a, r² = 0.52), suggests that the labile copper
concentrations (and more particularly the weakly complexed Cu) controls the bioaccumulation.
Nevertheless, it should be note that a simple linear relation between accumulation in mosses and
speciation of copper in water do not match a perfect correlation. This observation suggests that
other environmental factors (e.g. water cationic composition) control the bioaccumulation of Cu in
mosses.
195
Press.
Annexes
Modelling metal accumulation kinetics as a function of water characteristics
In order to illustrate how the modelling approach described in this paper could be incorporated in
the (re)-interpretation/prediction of bryophytes contamination levels across a wide range of water
quality conditions we selected two contrasted situations (Vassiviere and Cattenom cases). The first
one (Vassiviere) deals with low water cationic and high dissolved organic matter concentrations,
while the second one (Cattenom) presented high water cationic compositions and moderate DOM
concentrations.
To describe Cu uptake by F. antipyretica, we first tested the simplest alternative, that of a kinetic
model where the speciation of Cu in water is integrated (labile Inorganic and weakly complexed Cu
are used as input data of the model) whereas the water cationic effects on Cu bioaccumulation are
neglected (i.e.
∑K
i
C i BL1
× [C i ] = 0 in Eq.4). Thus predicted Cu concentrations (dashed area in
Figure 6) are compared to measured concentrations in mosses (symbols on Figure 6) for two
contrasted cases (Vassiviere and Cattenom deployment sites). Areas on Figure 6 are delimited by
the predicted Cu concentration in mosses calculated using inorganic (
complexed (
; [Cu DGT ]R ) and weakly
; [Cu DGT ]OP ) copper concentrations. Model thus calibrated did not satisfactorily
predict copper bioaccumulation of copper in mosses. Thus calibrated model overestimates the
copper concentrations in mosses (less than a factor 2 at Vassiviere and more than a factor 10 at
Cattenom). This differences between predicted and observed Cu concentrations in mosses indicates
that the major cations play an important role for the bioaccumulation of Cu in aquatic mosses.
Similarly, the ability of the cationc-dependant model was investigated across the selected wide range
of water quality conditions (results shown for Vassiviere and Cattenom). The cationic-dependant
model was calibrated for each deployment site by integrating a site specific adsorption rate constant
(k’1 values were calculated using Eq. 4 and the site specific water cationic composition detailed in
Table 1 ; k’1 = 9.50 and 1.05 L.g-1.h-1 for Vassiviere and Cattenom, respectively). Thus predicted Cu
concentrations (graphically represented on Figure 6 by grey areas, delimited by prediction results
obtained using inorganic or weakly complexed copper concentrations as input data of the model)
are compared with observed Cu concentrations in aquatic mosses (examples given for Vassiviere
and Cattenom deployment sites in Figure 6). In the general, the predicted evolutions of Cu
concentrations in aquatic mosses fits correctly with observed Cu concentrations in mosses (Figure
6). The results indicates that for waters presenting very high water cationic concentrations
(Cattenom deployment site) The bioaccumulation of Cu is mainly significantly controlled by the
water cationic composition (bioaccumulation reduced by a factor 10 as compared to mosses
exposed in a solution where major cations concentration are negligible). On the contrary, the
bioaccumulation is mainly controlled by the metal speciation in water for the Vassiviere case, where
196
Press.
Annexes
very low water cationic compositions and high DOM concentrations were observed (Table 1)
whereas mainly controlled by the speciation of metal in the second one (Vassiviere) where very low
water cationic compositions and high DOM concentrations are observed (Table 1).
Based on the present coupled approach (integrating both the metal speciation and the competing
cationic effects), it is now feasible to predict the bioaccumulation of copper in F. antipyretica across a
wide range of water quality conditions.
a) VASSIVIERE - 5 µg/L
Cu content (µmol/g d.w)
14
12
10
-1
k'1 = 16.6 L.g .h
-1
8
6
-1
k'1 = 9.50 L.g .h
-1
4
2
Input Cu : [Cu DGT]R = 0.97 µg/L
Input Cu : [Cu DGT]OP = 1.75 µg/L
0
0
24
48
72
96
120
144
168
Time (hours)
Figure 6. Bioaccumulated copper concentrations in aquatic mosses transplanted in Vassiviere (a., ) and
Cattenom (b., ) contaminated waters (5 µg/L case). Areas represent the model predictions (Eqs 23) integrating the cationic effects ( ; k’1 = 9.50 and 1.05 L.g-1.h-1 for Vassiviere and Cattenom
respectively) or not ( ; k’1 = 16.6 L.g-1.h-1). Each of these areas are delimited by the predicted Cu
concentration calculated using inorganic (
; [ Cu DGT ]R ) and weakly complexed (
; [ Cu DGT ]OP )
copper concentrations as input data of the kinetic model.
Validation the integrated approach across a wide range of water quality conditions
In order to validate the present integrated approach under field conditions, the predictive capacity
of the model was tested by comparing predicted to observed Cu concentrations values each
deployment sites (Figure 7). For this field validation, we progressively integrated in the model the
various environmental factors (metal speciation and majors cations) that affect copper
bioaccumulation of Cu in mosses :
The validity of the model was first tested by only integrating the speciation of copper in water as
input data (inorganic and weakly complexed Cu concentration for Figures 7 a. and b.), whereas the
197
Press.
Annexes
effects of major cations are neglected ( ∑iK Ci BL1 × [C i ] = 0 in Eq. 4 , i.e. k’1 = 16.6 L.g-1.h-1). Figures
7 a. and b. demonstrated that the model overestimates the observed bioaccumulated Cu by more
than a factor 6 and 10 for the Belleville and Cattenom cases (surrounded values on Figure 7 a. and
b.), whereas the predicted bioaccumulated Cu values are overestimated with factor of 2 between
predicted and observed values for Sauviat and Vassiviere cases. Hence, we observed that a weaker
performance of the model when higher major cations concentrations in water are observed. The
weaker performance of the model for the Belleville and Cattenom cases can thus be partially
explained by the competion of major cations which compete with copper for adsorption on
biological binding sites and thus reduces the bioaccumulation of copper. This results clearly show
that labile copper concentrations are not sufficient to accurately predict the bioaccumulated copper
in aquatic mosses across a wide range of water quality conditions (particularly for high water
cationic compositions cases).
In the next validation phase, the ability of the integrated approach (mixing both the major cations
effects (Eq. 4) and the copper speciation in water), to predict the bioaccumulated Cu concentrations
in aquatic mosses, was investigated for the various deployment sites. Predicted values are compared
with measured Cu concentrations in mosses for whole deployment sites (predicted values on
Figures 7 c. and d. were calculated using inorganic or weakly complexed Cu concentrations as
input data of the model, respectively). All predicted Cu bioaccumulated concentrations are within a
factor of two, and ninety-two percent of the predictions vary less than a factor 1.5 from the
observed when inorganic copper concentrations are used as input data (Figure 7 c.). Similarly,
when using the weakly complexed Cu concentrations as input data, all the predicted bioaccumulated
Cu values are within a factor of two, while eighty percent of the predicted values vary less than a
factor 1.5 from the observed (Figure 7 d.).
It should be noted that 75 % of the predicted values slightly underestimates the observed Cu
concentrations in mosses when inorganic copper concentration in water was used as input data of
the model (Figure 7 c.), while 83 % of the predicted values slightly overestimates the observed
values when weakly Cu concentrations are used as input data for modelling (Figure 7 d.). This
observation suggests that the effective bioavailable copper concentration may be comprised
between inorganic copper and weakly complexed copper concentrations. These observations
confirm, previous laboratory results indicating that more than inoragnic copper is bioavailable for
bryophytes [5].
198
Press.
Annexes
Measured Cu (µmol/g d.w.)
1
1
10
10
10
Samples with high
water cationic
concentrations
Samples with high
water cationic
concentrations
1
1
BELLEVILLE
CATTENOM
SAUVIAT
VASSIVIERE
d)
c)
Predicted Cu (µmol/g d.w.)
BELLEVILLE
CATTENOM
SAUVIAT
VASSIVIERE
b)
10
10
1
1
BELLEVILLE
CATTENOM
SAUVIAT
VASSIVIERE
BELLEVILLE
CATTENOM
SAUVIAT
VASSIVIERE
1
1
10
a)
10
10
Figure 7. Predictive capacity of the kinetic model as shown by measured versus predicted bioaccumulated
copper in mosses (in µmol/g d.w.) for each transplant site (Belleville ( ), Cattenom ( ), Sauviat ( ), and
Vassiviere ( )).The solid line is the 1:1 reference line indicating a perfect match between measured
and predicted values ; the long-dashed lines indicate an error within a factor of two between observed and
predicted values ; the grey area delimitate an error within a factor of 1.5.
Input data used for the model predictions : a) inorganic Cu concenttrations ( [Cu DGT ]R ), b) weakly
complexed Cu concentrations ( [Cu DGT ]OP ), c) inorganic Cu concenttrations ( [Cu DGT ]R ) and major
cations, d) weakly complexed Cu concentrations ( [Cu DGT ]OP ) and major cations.
199
Press.
Annexes
CONCLUSIONS
Aquatic mosses and DGT devices were deployed in various waters presenting a wide range of water
compositions in order to evaluate and quantify the environmental factors that affects the
bioavailability of copper for aquatic mosses. Our experimental results have shown that major
cations and dissolved organic matter significantly reduces the bioaccumulation of metal in the
aquatic mosses. In order to describe and predict the bioaccumulation of Cu as a function of water
quality, we developed an integrated approach coupling metal speciation monitoring (DGT devices)
and a cationic-dependant model. The relevance and the robustness of the present integrated
approach were validated under four contrasted water quality conditions.
In the framework of future national water quality guidelines revisions, a such flexible and
mechanistic biomonitoring tool (integrating both metal speciation and the protective effects of
competing cations) may greatly improve the ability of regulators to derive sites-specific Cu (metal)
guidelines for protecting aquatic biota, while limiting the use of conservative assumptions.
REFEENCES
[1]
Bruns, I.; Friese, K.; Markert, B.; Krauss, G. J., The use of Fontinalis antipyretica L. ex Hedw.
As a bioindicator for heavy metals. 2. Heavy metal accumulation and physiological reaction of
Fontinalis antipyretica L. ex Hedw. In active biomonitoring in the River Elbe. Science of the
Total Environment 1997, 204, (2), 161-176.
[2]
Cenci, R. M., The use of aquatic moss (Fontinalis antipyretica) as monitor of contamination in
standing and running waters: limits and advantages. Journal of Limnology 2001, 60, (1), 53-61.
[3]
Claveri, B.; Guérold, F.; Pihan, J.-C., Use of transplanted mosses to monitor trace metals in
acidic headwater streams in Vosges mountains. Hydroécologie Appliquée 1995, 5, 111-125.
[4]
Ferreira, D.; Ciffroy, P.; Tusseau-Vuillemin, M. H.; Garnier, C.; Garnier, J. M., Modelling
Exchange Kinetics of Copper at the Water-Aquatic Moss (Fontinalis Antipyretica) Interface :
Influence of Water Cationic Composition (Ca, Mg, Na and pH). Chemosphere In press, 000000.
200
Press.
Annexes
[5]
Ferreira, D.; Tousset, N.; Ridame, C.; Tusseau-Vuillemin, M.-H., More than inorganic copper
is bioavailable to aquatic mosses at environmentally relevant concentrations. Environmental
Toxicology and Chemistry 2008, 29, (10), Preprint.
[6]
Campbell, P. G. C.; Errecalde, O.; Fortin, C.; Hiriart-Baer, V. P.; Vigneault, B., Metal
bioavailability to phytoplankton—applicability of the biotic ligand model. Comparative
Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology 2002, 133, (1-2), 189-206.
[7]
De Schamphelaere, K. A. C.; Stauber, J. L.; Wilde, K. L.; Markich, S. J.; Brown, P. L.;
Franklin, N. M.; Creighton, N. M.; Janssen, C. R., Toward a Biotic Ligand Model for
Freshwater Green Algae: Surface-Bound and Internal Copper Are Better Predictors of
Toxicity than Free Cu2+ Ion Activity When pH Is Varied. Environ. Sci. Technol. 2005, 39,
(7), 2067-2072.
[8]
Heijerick, D. G.; De Schamphelaere, K. A. C.; Janssen, C. R., Biotic ligand model
development predicting Zn toxicity to the alga Pseudokirchneriella subcapitata: possibilities
and limitations. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology &
Pharmacology 2002, 133, (1-2), 207-218.
[9]
Santore, R. C.; Di Toro, D. M.; Paquin, P. R.; Allen, H. E.; Meyer, J. S., Biotic ligand model of
the acute toxicity of metals. 2. Application to acute copper toxicity in freshwater fish and
daphnia. Environmental Toxicology and Chemistry 2001, 20, (10), 2397-2402.
[10] Aulio, K., Metal accumulation capacity of five species of Sphagnum moss. Bull. Environ.
Contam. Toxicol. ; Vol/Issue: 35:4 1985, Pages: 439-442.
[11] Borgmann, U.; Nowierski, M.; Dixon, D. G., Effect of major ions on the toxicity of copper to
Hyalella azteca and implications for the biotic ligand model. Aquatic Toxicology 2005, 73, (3),
268-287.
[12] Meylan, S.; Behra, R.; Sigg, L., Accumulation of Copper and Zinc in Periphyton in Response
to Dynamic Variations of Metal Speciation in Freshwater. Environ. Sci. Technol. 2003, 37,
(22), 5204-5212.
[13] Zhang, H.; Davison, W., Performance Characteristics of Diffusion Gradients in Thin Films
for the in Situ Measurement of Trace Metals in Aqueous Solution. Anal. Chem. 1995, 67, (19),
3391-3400.
[14] Croisetiere, L.; Hare, L.; Tessier, A.; Duchesne, S., Modeling Cadmium Exchange by an
Aquatic Moss (Fontinalis dalecarlica). Environ. Sci. Technol. 2005, 39, (9), 3056-3060.
[15] Fernandez, J. A.; Vazquez, M. D.; Lopez, J.; Carballeira, A., Modelling the extra and
intracellular uptake and discharge of heavy metals in Fontinalis antipyretica transplanted along
a heavy metal and pH contamination gradient. Environmental Pollution 2006, 139, (1), 21-31.
201
Press.
Annexes
[16] Figueira, R.; Ribeiro, T., Transplants of aquatic mosses as biomonitors of metals released by a
mine effluent. Environmental Pollution 2005, 136, (2), 293-301.
202
Press.
Annexes
2. PRELEVEMENTS ET ANALYSES
2.1
2.1.1
Mesure de Cu par Spectrométrie d’Absorption Atomique four (SAA-four)
Prélèvements et conditionnement des échantillons pour analyse du Cu dissous
En laboratoire, le cuivre dissous dans le milieu d’exposition, est mesuré après filtration de 5 mL à
l’aide de filtres seringues 0,2 µm téflon (PTFE). Le filtrat est récupéré dans un tube en
polypropylène puis acidifié à 1% par HNO3 (suprapur) sous une hotte à flux laminaire, et conservé
au réfrigérateur à 4°C avant dosage. Les échantillons sont analysés par spectrométrie d’absorption
atomique SAA-four (SpectrAA-800, Varian) (Figure 41).
Figure 41. Spectromètre d’absorption atomique Varian, SAA-
Et SpectrAA-800
Pour l’ensemble des expériences réalisées en laboratoire et in situ, les prélèvements sont réalisés en
triplicat (n=3). Le coefficient de variation est inférieur à 5 % pour l’ensemble des échantillons.
Pour les biotests en laboratoire, la quantité de cuivre dissous disparue dans le bac au cours de la
phase d’exposition ( ΔCu D en µg) est calculée selon l’équation suivante :
ΔCuD = ([CuD ]t =0 − [CuD ]t =72h ) × V
Eq. 46
avec [CuD ]t =0 , [CuD ]t =72h , les concentrations en cuivre total dissous initiale (t=0) et finale (t=72h)
respectivement (en µg/L) et V, le volume d’exposition (en L).
203
Annexes
2.1.2
Principe de la mesure par SAA-four
Il s’agit d’une méthode de dosage d’éléments chimiques fondée sur l’absorption de radiations
lumineuses par des éléments mis à l’état d’atomes neutres en phase vapeur. La source de lumière est
constituée par une lampe à cathode creuse dont la nature est différente suivant l’élément à
déterminer. Cette lampe doit émettre la radiation de la longueur d’onde qui doit être absorbée.
Le dispositif d’atomisation peut être soit de type « flamme », soit de type « four » pour une
détermination à plus bas niveau ; nous avons donc utilisé un four en graphite pour l’analyse du
cuivre.
La méthode de mesure employée ici est la méthode directe où pour trouver la concentration, on
reporte l’absorbance obtenue sur la courbe d’étalonnage.

Principe de l’émission et de l’absorption
Dans un atome, les électrons situés autour du noyau se répartissent sur différents niveaux d’énergie
En (Figure 42). Si un atome à l’état fondamental (niveau d’énergie de l’atome dans son état stable)
absorbe de l’énergie, alors il passe à un état excité. En absorption atomique, ces transitions
énergétiques sont dues aux transitions électroniques. Selon la loi de Kirchoff, un atome ne peut
absorber que les radiations qu’il peut émettre et réciproquement.
Figure 42. Principe de l’émission et de l’absorption de photons.

Principe de la mesure
La lampe émet des photons à une longueur d’onde spécifique de l’élément à doser puis les atomes
de ce même élément présents dans la solution étudiée absorbent une partie du rayonnement
incident I0 et il ressort du four une lumière d’intensité moindre IT (Figure 43). L’appareil mesure Io
et IT et calcule l’absorbance A.
204
Annexes
Figure 43. Schéma simplifié de l’émission et l’absorption de photons spécifiques de l’élément à doser.
⇒
T=IT/I0
A=logI0/IT
où
A=log1/T
T : transmittance
A : absorbance

Constitution d’un appareil d’absorption atomique
Figure 44. Schéma simplifié d’un spectromètre d’absorption atomique en four.

Le processus d’atomisation
La solution, introduite dans le four en graphite, est soumise à un programme électrothermique et
subit une montée en température constituée de différents paliers :
- tout d’abord, une étape de séchage qui consiste à évaporer le solvant (ici HNO3) présent
dans la solution
- puis une étape de décomposition qui a pour but d’éliminer une bonne partie de la matrice
constituant « le bruit de fond »
- l’étape suivante est l’atomisation où l’élément dosé M est isolé de son complexe MX et est
transformé en radicaux M*
- pour finir une étape de nettoyage, à très fortes températures, afin d’éliminer tous résidus
présents dans le four.
205
Annexes

Le système dispersif
Le rayonnement incident contient les radiations émises par la source, et éventuellement par le tube
graphite ou par la matrice. Grâce au monochromateur, la raie recherchée est isolée en perdant le
moins d’énergie possible.

Le système récepteur
Le photomultiplicateur permet la conversion du signal lumineux en signal électrique et l’amplifie.
L’ordinateur procède ensuite au traitement du signal.

Interférences et corrections
Des interférences spectrales non spécifiques se superposent à l’absorption atomique de l’élément
analysé. Elles sont dues principalement à la matrice résiduelle constituée de différents éléments
présents dans l’échantillon dont principalement des sels (majeurs par rapport aux traces), et des
complexes organiques et inorganiques très stables, absorbants durant l’atomisation à la même
longueur d’onde que le composé étudié.
Pour corriger le plus efficacement ces interférences, il faut chercher à éliminer l’essentiel de la
matrice par un prétraitement thermique, mais sans pertes de élément dosé et décaler les signaux de
élément et de la matrice (effet Zeeman). Durant le prétraitement, il y a rarement élimination
complète de la matrice d’où utilisation de l’effet Zeeman. Ce processus permet grâce à l’application
d’un fort champ magnétique pendant l’atomisation, de décomposer la raie spectrale d’absorption de
l’élément dosé en multiplet.
206
Annexes
2.2
Principe et procédure de la mesure de Cu labile par voltamétrie à redissolution
anodique sur électrode à goutte de mercure (DP-ASV)
La mesure par voltamétrie à redissolution anodique sur électrode à goutte de mercure (DP-ASV) du
métal labile en solution met en jeu une succession de processus chimique et électrochimique au
cours des différentes étapes de la mesures. Les quatre processus (représentés sur la Figure 45) ainsi
mis en jeu au cours de la mesure DP-ASV sont décrites dans la littérature ((Buffle et al. 2000))
comme suit :

Conditionnement :
Avant toute mesure, il est indispensable de d’éliminer l’oxygène dissous en solution qui peut
perturber la mesure en générant des interférences sur le polarogramme causées par sa réduction
H2O2 puis H2O. Pour cela, nous purgeons la solution avec un gaz inerte (dans notre cas nous
utilisons de l’azote). Cette étape de conditionnement est répétée après chaque ajout dosé de Cu dans
la solution. Enfin, cette étape de conditionnement permet également aux espèces métalliques
présentes en solution de s’équilibrer après chaque ajout dosé de Cu. Les réactions chimiques ainsi
mis en jeu au cours de cette étape peuvent se schématiser comme suit :
Mz+ + Lz-
kf
kd
ML
Cette équilibre chimique se caractérisé par ses constantes cinétiques de formation et dissociation kf
et kd. En fonction des différents types de MO testées (ligands LZ-) , la durée de cette étape de
conditionnement peut varier entre 30 minutes et 2 heures pour chaque mesure après l’ajout dosé de
Cu dans la cellule de mesure.

Etape de dépôt (préconcentration) :
Il s’agit d’une étape de déposition des espèces réactives électrochimiquement sur l’électrode de
mercure (cathode) par imposition d’un potentiel (inférieur au potentiel standard E0 de réduction de
l’espèce que l’on dose). A à ce potentiel, le métal réduit à la cathode forme un amalgame avec le
mercure, selon la réaction suivante :
Mz+ + z e-
E0
M(Hg)
La quantité de métal ainsi amalgamé dans l’électrode de mercure est proportionnelle à l’intensité du
courant d’électrolyse et au temps d’électrolyse (ou temps de dépôt). Le courant d’électrolyse est luimême proportionnel à la concentration de l’élément dosé, à l’agitation de la solution et à la surface
de l’électrode de mercure. Cette première étape correspond à l’étape de pré-concentration du métal
dans l’électrode de mercure.
207
Annexes

Etape d’équilibre :
Avant l’étape de redissolution anodique, un temps d’équilibre (temps de repos) est nécessaire à
l’homogénéisation de la concentration de métal dans la goutte de mercure. Pour l’ensemble de nos
mesures, nos avons fixé la durée de cette étape à 20s (sans agitation).

Etape de redissolution :
Cette dernière étape consiste en un balayage de potentiel vers les valeurs positives (dans notre cas
de –1.1V à 0.25V), afin de permettre une réoxydation du métal précédemment réduit à la cathode
lorsque le potentiel standard E0 du couple métal amalgamé-métal libre est atteint selon la réaction
suivante :
E0
M(Hg)
Mz+ + z e-
Lorsque le potentiel standard du couple métal amalgamé – métal libre est atteint, un courant
résultant de la réoxydation du métal amalgamé est observé. L’intensité du pic caractéristique d’un
métal est proportionnelle à la concentration de métal amalgamé dans l’électrode, et donc à la
concentration dans la solution.
Électrode
Solution
L
L
DL
M(Hg)
+
Mz+
+
DM
DR
E0
Mz+
M(Hg)
DR
M(Hg)
DR
kf
K
ML
DML
1
Équilibre
kd
M(Hg)
ML
2
Diffusion
Formation/
Dissociation
3
Dépôt sur
goutte Hg
4
Redissolution
anodique
208
Equilibre :
Diffusion dans
goutte de Hg
Annexes
Figure 45. Principaux processus et paramètres influençant a mesure par DP-ASV sur électrode de mercure.
K=constante d’équilibre de la réaction de complexation ; kd, kf = constantes cinétiques de formation et
dissociation du complexe métallique ; DM, DML=coefficients de diffusion en solution de M et ML ; E0=
potentiel standard redoax ; DR=coefficient de diffusion du métal amalgamé M(Hg) dans la goutte de mercure
2.3
2.3.1
Mesure du cuivre bioaccumulé dans les bryophytes
Collecte et conditionnement des mousses aquatiques
Nous avons utilisé la mousse Fontinalis antipyretica comme organisme modèle, l’une des mousses
aquatiques les plus répandues dans les écosystèmes aquatiques français (Figure 46), et couramment
utilisée dans les programmes de biomonitoring (Mouvet 1987; Vanderpoorten 1999; Cenci 2001).
Figure 46. Photographies d’une
bryophyte aquatique Fontinalis antipyretica
Les mousses aquatiques sont collectées sur un site de référence (station RNB sur la Petite Sauldre
située à Ménétréol-sur-Sauldre en Sologne) éloigné de toute source de contamination métallique.
Les prélèvements sont réalisés avec précaution, de façon à ne pas détacher la base des plants du
substrat et permettre ainsi une repousse ultérieure dans la zonne de prélèvement. Les brins de
mousse sont rincés avec l’eau de la rivière de façon à éliminer la majeure grande partie les corps
étrangers (sédiments, invertébrés, brindilles), puis légèrement essorés. Les prélèvements servant aux
expérimentations de laboratoires, sont placés et transportés dans une glacière au laboratoire, où ils
sont triés une seconde fois puis conservés à 4°C jusqu’aux expériences. Au cours de ce second tri,
seules les pousses vertes sont sélectionnées afin de minimiser la variabilité biologique du matériel
biologique utilisé pour les expériences ultérieurs.
2.3.2
Extraction des fractions adsorbées et internalisées
La fraction de cuivre internalisée est obtenue après lavage des bryophytes à l’EDTA (1mM) pendant
une durée minimum de 2 heures. Après lavage à l’EDTA, les bryophytes sont placées à l’étuve à
60°C pendant plusieurs jours, jusqu’à déshydratation complète.
209
Annexes
Après cette étape de séchage, les bryophytes sont minéralisées selon le protocole mis au point par
Lopez et al. (1993,). Le protocole de minéralisation est basé sur une attaque par voie acide (HNO3
suprapur).
Le principe est le suivant : après pesée, les échantillons de bryophytes secs (environ 100 mg en
poids sec) sont introduits dans des réacteurs en Téflon, dans lesquels sont ajoutés 10 mL d’HNO3
suprapur (65%). L’ensemble de ces opérations est réalisé sous hotte à flux laminaire afin limiter les
risques de contamination. Les échantillons sont ensuite minéralisés en four micro-ondes (Figure
47) (suivant le protocole décrit dans un précédent article (Ferreira et al. 2008)).
Figure 47. Four à µ-ondes utilisé pour les minéralisations des
bryophytes (CEM, Mars 5).
Le minéralisat est ensuite analysé en SAA-Et (four). Pour chaque carrousel (20 réacteurs), un blanc
témoin (sans bryophyte) est réalisé afin de détecter une éventuelle contamination, ainsi qu’un
témoin de référence (bryophyte non contaminée) de façon à vérifier la valeur de référence. De
même, pour chaque série de minéralisation, un échantillon de bryophytes certifiées (BCR60) a été
minéralisé afin de contrôler l’efficacité de la minéralisation (92 % ± 6 % ; pour n = 218
échantillons).
La concentration en cuivre adsorbé (Cu adsorbé) sur les bryophytes (en µg/g sec) est obtenue de la
manière suivante :
Cu adsorbé =
Ce × v
m
Eq. 47
avec Ce la concentration de cuivre mesurée en SAA (en µg/L), v le volume d’EDTA (25 mL) et m, la
masse sèche de bryophytes exposées à l’EDTA (en g).
Les concentrations de cuivre internalisé (Cu internalisé) dans les bryophytes, exprimées en µg/g sec,
sont obtenues grâce à la formule suivante :
Ce =
Ce × V
m
Eq. 48
210
Annexes
avec Ce la concentration en cuivre mesurée dans le minéralisat par SAA (en µg/L), V le volume de
minéralisat (en L) et m le poids sec de bryophyte minéralisée après le lavage à l’EDTA (en g).
La quantité totale de cuivre accumulée dans les bryophytes ( ΔCu moss ; en µg de Cu) a été
déterminée pour les 72h de la phase d’accumulation de la façon suivante :
ΔCu moss = {(Cu adsorbé + Cu int ernalisé ) × mmoss }t =72 h − {(Cu adsorbé + Cu int ernalisé ) × mmoss }t =0
Eq. 49
avec mmoss (en g de poids sec), la masse totale de bryophytes exposée pendant les 72h de la phase
d’accumulation.
2.4
Analyses physico-chimiques de l’eau
2.4.1
Cations majeurs
2.4.2
Carbonne Organique Dissous (COD)
Des mesures de COD (carbone organique dissous) ont été réalisées au cours des biotests en
laboraoire et des essais in situ, avant et après immersion des bryophytes dans les différents bacs
d’immersion. Pour cela, des &échantillons de 30 mL d’eau sont prélevés, filtrés sur des filtres grillés
0,7 µm (Whatman GF/F), stabilisé par ajout de H3PO4 (5%), puis analysés au COTMETRE (Model
700 Total Organic Carbon Analyser –O.I Analytical). Le blanc de COD (eau Milli-Q) de l’ordre de
0,4 mg/L, a été retranché à toutes les valeurs obtenues dans les échantillons.
2.5
Protocole d’extraction sur colonne (XAD-8 ET XAD-4) des MOD de Seine :
Les MO extraites de Seine utilisées dans notre étude nous sont fournies par le laboratoire du
CEREVE de Créteil (Centre d’Enseignement et de Recherche sur l’Eau la Ville et
l’Environnement). Les MO utilisées pour nos biotests proviennent sont issus d’une campagne
d’échantillonnage effectuée en aval de la station d’épuration d’Achères en avril 2006.
Le protocole le plus couramment utilisé pour ce type d’extraction est celui de l’IHSS (International
Humic Substances Society) (Leenheer et al., 2000) qui consiste en un fractionnement de la MO sur
des colonnes contenant des résines de type XAD. La fraction hydrophobe de la MO est retenue sur
la résine XAD 8, la fraction dite « transphilique » est retenue sur la résine XAD 4 et la fraction
hydrophile traverse les deux colonnes. Chaque fraction peut ensuite être séparée selon son acidité
par élution sélective.
Les grandes lignes du protocole expérimental utilisé sont décrites ci-dessous (Figure 48) :
1. Sortir les récipients contenant l’échantillon de la chambre froide.
211
Annexes
2. Vérifier à l’aide d’une éprouvette et d’un chronomètre que le débit d’entrée soit compris entre
1.4 et 3 litres/h.
3. Conditionner les résines en colonne avec 1 litre de solution d’HCl à 0.1 M préparée en
introduisant 100 ml d’HCl à 1 M (commercial en ampoule) dans une fiole de 1 L complétée avec
de l’eau milliQ. Les effluents des résines partent dans le flacon « poubelle ».
4. Faire percoler 7 litres de l’échantillon (filtré à 0.45 μm et acidifié à pH=2 avec HCl). Les
effluents des résines partent dans le flacon « poubelle ».
5. Prendre 80 ml d’eau pour des mesures de COD :
•
dans le bidon initial,
•
à l’entrée de XAD-8,
•
à la sortie de XAD-8 (ce qui équivaut à l’entrée de XAD-4),
•
à la sortie de XAD-4.
6. Faire percoler le reste de l’échantillon
7. Eliminer les sels en faisant passer dans chaque colonne séparément 1 L d’une solution d’acide
formique à pH = 2 préparée en introduisant 48 ml d’acide formique concentré à 99% dans une
fiole de 2 L complétée avec de l’eau milliQ. Les effluents des résines partent dans le flacon «
poubelle ».
8. Eluer les MODs en faisant passer dans chaque colonne séparément 500 ml d’un mélange
acétonitrile/eau 75/25 (V:V) préparé en diluant 250 ml d’eau par 750 ml d’AcN dans une fiole
de 1 L. Les effluents sont récupérés dans des flacons de 500 mL.
9. Rincer les résines :
•
Rincer l’extérieur du tuyau d’entrée avec du papier imbibé d’eau milliQ.
•
Faire passer 1 litre d’eau milliQ à partir d’un bidon intermédiaire propre.
•
Faire passer 2 litres d’eau milliQ à partir du bidon de 20 litres propre.
•
Faire passer 2.5 litres d’une solution de soude à 0,1 M préparée en dissolvant 10 g de
pastilles de soude dans 2.5 litres d’eau milliQ.
•
Faire passer un minimum de 5 litres d’eau milliQ.
212
Annexes
Eau brute
Prétraitement
Filtration 10 µm et 0,45 µm
Adoucissement sur résine échangeuse cationique (Na +)
Concentration
Osmose inverse
Concentrat acidifié (pH 2, HCl)
DAX-8
MOD hydrophile
(HPI)
XAD-4
Elution
Acétonitrile/Eau
(75% / 25%)
MOD hydrophobe
(HPO)
(Substance s Humique s)
Fractionnement
MOD transphilique
(TPI)
Distillation zéotrophique
(élimination de la
matrice minérale)
Évaporation sous vide de l’acétonitrile
Purification
Congélation
Lyophilisation
Figure 48. Représentation schématique des étapes successives d’extraction des trois fractions de matières
organiques à partir de l’eau brute de Seine. D’après (Pernet-Coudrier et al. 2008)
213
Annexes
2.6
Composition cationique et localisation des 80 stations sélectionnées :
Pour l’exercice d’application du modèle cinétique présenté dans le Chapitre III.5, nous avons sélectionné 80 stations, dont la localisation et les
paramètres de qualité d’eau (pH et composition cationque) sont récapitulés dans le tableau ci-après :
Bassin Cours d'eau
Mg (mg/L)
Na (mg/L)
pH
Département
Code Station
Periode
Loire
SAINTE-EULALIE
ARDECHE (07)
04 000100
2000-2006
Moyenne
3.4
Ecartype
0.7
Moyenne
1.1
Ecartype
0.2
Moyenne
2.7
Ecartype
0.8
Moyenne
7.4
Loire
GIEN
LOIRET (45)
04 048000
1992-2007
30.6
5.2
4.8
0.8
13.1
3.6
8.3
MINE ET LOIRE (49)
04 134700
1982-2006
46.1
8.3
5.2
0.8
13.4
3.6
7.9
SAINT-SETIERS
CREUSE (23)
04 075700
1997-2007
1.3
0.3
0.6
0.2
3.3
0.6
6.2
Loire
Vienne
LOIRE BRETAGNE
Ca (mg/L)
Commune
MONTJEAN sur LOIRE
Vienne
VALDIVIENNE
VIENNE (86)
04 082500
1982-2007
12.9
3.7
3.4
1.0
17.3
7.4
7.3
Vienne
CANDES-SAINT-MARTIN
MAINE-ET-LOIRE (49)
04 098200
1981-2007
39.9
10.8
4.6
1.0
14.0
4.5
7.9
Allier
LANGOGNE
ARDECHE (07)
04 026900
1992-2007
3.0
0.8
1.1
0.3
3.4
0.9
7.3
PUY DE DOME (63)
04 030000
1981-2007
14.7
2.6
4.7
1.0
8.7
2.2
7.8
04 045000
1980-2007
24.3
6.3
5.6
1.5
12.8
4.3
7.8
Allier
ORBEIL
Allier
CUFFY
CHER (18)
Creuse
CLAIRVAUX
CREUSE (23)
04 086550
1997-2007
3.7
0.9
1.6
0.4
5.1
0.8
6.9
Creuse
RIVARENNES
INDRE (36)
04 091400
1997-2007
24.9
9.7
3.5
0.5
7.4
1.5
7.7
Creuse
CELLE-SAINT-AVANT
INDRE ET LOIRE (37)
04 097200
1997-2007
41.2
14.2
5.1
1.4
9.8
2.0
7.8
1997-2007
10.3
1.5
2.6
0.5
9.0
2.0
7.6
Cher
DONTREIX
CREUSE (23)
04 056400
Cher
BRUERE-ALLICHAMPS
CHER (18)
04 064000
1981-2007
27.9
7.6
6.2
2.2
24.9
14.5
7.9
8.1
Cher
SAVONNIERES
INDRE ET LOIRE (37)
04 072000
1981-2007
62.6
11.8
4.5
0.6
15.4
5.7
Mayenne
LALACELLE
ORNE (61)
04 123100
1997-2007
7.6
1.7
3.8
0.6
9.5
1.2
6.9
Mayenne
MONTREUIL-JUIGNE
MAINE-ET-LOIRE (49)
04 132500
1980-2007
26.5
4.3
8.4
2.2
19.6
5.4
8.0
Vilaine
BOURGON
ILLE-ET-VILAINE (35)
04 200595
1997-2007
25.9
3.3
10.8
2.1
16.7
2.6
7.4
MORANNES
MAINE-ET-LOIRE (49)
04 122100
1980-2007
108.3
5.8
5.0
0.4
9.0
0.8
8.1
Odet
LANGOLEN
FINISTERE (29)
04 181920
1981-2007
10.4
1.2
5.6
0.7
15.3
3.4
7.0
Yonne
LAROCHE-SAINT-CYDROINE YONNE (89)
3029140
2003-2006
73.0
14.7
3.1
0.3
7.8
1.5
8.0
POUSSEAUX
NIEVRE
0302600
1971-2005
54.7
21.0
2.1
1.0
5.4
1.2
7.7
1971-2005
23.7
4.1
3.2
0.8
3.6
1.6
7.4
1976-1981
92.1
15.5
4.7
1.9
5.8
1.7
8.1
Sarthe
Yonne
Yonne
CORBIGNY
NIEVRE
03024585
Marne
TOURS-SUR-MARNE
MARNE (51)
03105000
214
Annexes
Marne
MATOUGUES
MARNE (51)
03104000
2003-2006
78.7
14.4
6.6
0.5
6.6
1.7
8.0
Vesle
CIRY-SALSOGNE
AISNE (02)
03162000
1971-2006
114.8
8.4
11.8
2.1
22.1
9.5
7.8
Ourcq
ROZET-SAINT-ALBIN
AISNE (02)
03115000
2005 - 2006
115.2
3.9
26.1
3.5
13.6
2.8
8.0
AISNE (02)
03153660
1987-2005
105.9
12.7
6.4
1.7
10.5
3.1
7.9
AISNE (02)
03128745
1989-2006
37.9
12.3
2.9
0.7
9.9
4.8
7.7
03130000
1971-2006
79.8
19.0
3.2
1.1
7.9
1.9
8.0
SEINE NORMANDIE
Aisne
Oise
OHIS
Oise
MACQUIGNY
AISNE (02)
Oise
QUIERZY
AISNE (02)
101.4
17.1
6.2
1.5
17.4
6.2
8.0
Loing
CHALETTE-SUR-LOING
LOIRET (45)
03053000
2005-2006
98.7
5.8
2.6
0.2
9.9
1.1
7.9
Essonne
DADONVILLE
LOIRET (45)
03065000
1971-2000
95.5
23.4
5.8
1.1
42.8
24.6
7.6
SERMAISE (91)
03071080
1971-2005
93.6
7.5
6.9
0.6
19.6
4.8
8.1
2003-2006
85.6
7.4
2.3
0.3
3.7
0.5
8.1
Orge
SERMAISE
Seine
NOD-SUR-SEINE
COTE-D'OR (21)
03001000
Seine
BOUGIVAL
YVELINES (78)
03084000
1971-1981
93.1
7.2
8.5
4.8
20.6
9.5
7.6
Seine
IGOVILLE
EURE (27)
03174211
1971-2006
100.1
7.9
7.0
1.2
18.9
4.7
7.7
Orne
CAEN
CALVADOS (14)
03238000
1971-1982
52.0
14.4
5.8
3.4
47.5
44.8
7.9
CALVADOS (14)
03247275
1989-2006
42.8
8.7
7.3
0.7
17.2
2.6
7.7
03208520
1996-2006
112.0
2.5
3.0
0.1
9.1
0.6
8.0
Drome
RHONE MÉDITÉRANNÉE CORSE
POMMIERS
SULLY
Bresle
GAMACHES
Var
ENTREVAUX
VAR (84)
210450
1998-2006
124.7
32.7
17.2
7.0
9.9
3.9
8.1
Var
SAINT LAURENT DU VAR
VAR (84)
213000
1972-2006
82.2
17.8
13.8
5.8
16.5
9.0
8.0
Doubs
SAUNIERES
SAÔNE-ET-LOIRE (71)
35500
1982-2006
82.5
39.8
3.3
1.7
7.7
2.9
8.1
59500
1987-2006
77.5
8.5
4.6
0.7
29.0
18.2
8.0
Saône
LYON
RHÔNE (69)
Saône
APREMONT
AIN (01)
5500
1988-2006
60.6
8.8
9.5
2.5
7.3
3.5
7.9
Ardeche
SAINT JULIEN DE PEYROLAS GARD (30)
115700
1976-2006
34.9
11.3
2.6
0.9
3.8
1.2
8.0
Drôme
CHARENS
DRÔME (26)
109050
2007
61.0
2.8
7.5
1.1
6.1
0.9
8.0
DRÔME (26)
109100
1988-2006
68.3
7.1
6.9
1.5
4.8
1.1
8.1
128000
1971-1997
70.0
25.6
19.9
7.8
42.2
28.3
7.7
7.7
Drôme
Gardon d'Alès
LIVRON
SAINT HILAIRE DE
BRETHMAS
GARD (30)
Gardon d'Alès
BRETHMAS
GARD (30)
128050
2001-2006
92.5
25.9
20.8
4.1
41.4
17.7
ISERE (38)
141900
1982-2006
90.1
13.9
13.4
5.7
6.9
2.1
8.0
166000
1976-2006
85.0
11.6
13.2
1.9
15.7
3.3
8.1
160500
1987-2006
73.9
12.9
5.7
3.5
30.4
23.4
10.3
Isère
GRENOBLE
Durance
CAUMONT SUR DURANCE
Verdon
CASTELLANE
VAUCLUSE (84)
ALPES HAUTE
PROVENCE (04)
Lez
LATTES
HERAULT (34)
189500
1980-2206
112.0
14.4
9.3
3.9
57.5
25.2
7.7
HERAULT (34)
183500
1989-2006
67.7
6.3
14.1
4.6
10.4
4.1
8.2
178000
1971-2006
66.2
11.0
7.8
2.1
14.1
5.6
8.0
170000
1971-2006
21.7
6.1
3.3
0.9
4.9
1.4
7.9
191000
1971-2006
99.7
13.0
13.0
2.9
22.0
13.5
8.0
Hérault
ASPIRAN
Aude
CARCASSONNE
Têt
EUS
AUDE (11)
PYRENEES
ORIENTALES (66)
Vidourle
SOMMIERES
GARD (30)
215
RHIN MEUSE
Annexes
Rhône
MASSIGNIEU DE RIVES
AIN (01)
69550
2003-2007
52.0
5.7
6.0
0.1
6.2
0.5
8.1
Rhône
GARD (30)
126600
1987-2006
68.9
8.7
6.1
1.7
11.2
2.9
8.0
Rhin
ARAMON
RHINAU À LAUTERBOURGKARLSRUHE
2047300
1992-2007
54.7
5.4
7.1
1.5
24.5
12.9
7.7
Meurthe
VALTIN
2061250
2002-2006
6.9
1.0
2.2
0.1
8.5
2.4
6.7
Meurthe
SAINT-CLEMENT
2067150
2005-2006
16.2
3.3
4.5
0.5
8.4
3.0
6.9
Meurthe
DAMELEVIERES
BAS-RHIN (67)
MEURTHE-ETMOSELLE (54)
2070250
1998-2006
33.2
6.1
7.9
2.0
9.2
2.9
7.1
Meuse
BASSONCOURT
HAUTE-MARNE (52)
2106500
1992-2006
87.0
16.5
7.8
4.5
15.4
18.3
7.8
Meuse
DOMREMY
HAUTE-MARNE (52)
2106825
1992-2006
102.3
18.8
10.9
4.1
16.9
12.1
7.6
Moselle
SAULX
MARNE (51)
2049000
1992-2006
5.9
2.4
1.3
0.7
6.5
3.7
6.6
2054100
1992-2006
9.6
4.1
1.7
1.1
11.7
6.2
6.6
2057000
1990-2006
29.2
9.2
7.3
2.5
12.3
4.7
7.3
2061000
1992-2006
51.3
10.7
9.1
3.2
12.2
5.3
7.2
Moselle
CHAVELOT
Moselle
MEREVILLE
Moselle
FROUARD
VOSGES (88)
Moselle
UCKANGE
MOSELLE (57)
2090000
1992-2006
164.9
34.2
14.8
6.1
109.4
38.9
7.2
ill
STRASBUORG
BAS-RHIN (67)
2037000
1992-2007
57.1
10.4
7.1
1.8
27.2
13.9
7.3
ill
RUELISHEIM
BAS-RHIN (67)
2007000
1992-2007
64.5
13.0
8.7
1.4
11.9
2.9
8.0
BAS-RHIN (67)
2004000
1998-2007
92.1
12.5
9.0
1.9
15.3
3.7
8.0
1998-2006
105.6
10.4
9.4
2.0
17.6
6.6
8.0
ill
BRUNSTATT
ill
TAGOLSHEIM
BAS-RHIN (67)
2003200
ill
OLTINGUE
HAUT-RHIN (68)
2001750
1998-2006
112.8
6.5
5.9
9.4
10.1
7.6
8.0
Sarre
AMBACOURT
VOSGES (88)
2057400
1992-2007
145.5
43.5
38.1
13.5
9.6
4.3
7.6
Zorn
HASELBOURG
MOSELLE (57)
2042700
1997-2006
6.4
0.8
1.7
0.5
3.2
1.6
6.5
BAS-RHIN (67)
2043600
1992-2007
30.1
6.7
8.6
3.2
10.0
4.0
7.2
BAS-RHIN (67)
2044000
1992-2006
59.8
10.7
12.0
2.2
13.9
3.9
7.2
Zorn
Zorn
STEINBOURG
BIETLENHEIM
216
217
218
219
RESUME
La contamination métallique des écosystèmes aquatiques est souvent associée aux rejets issus des circuits de
refroidissement (condenseurs en laiton – alliage Cu/Zn) des Centrales Nucléaires de Production Electrique
(CNPE). La forte variabilité spatio-temporelle des paramètres de qualité d’eau des cours d’eau modifie
fortement les interactions des métaux avec les organismes aquatiques ; i.e. modifie leur biodiponibilité pour
les organismes aquatiques. Ce travail s’intéresse à l’influence de la variabilité de ces paramètres de qualité
d’eau (matières organiques, pH, cations majeurs) sur la biodiponibilité des polluants métalliques. Le cuivre,
qui est un des rejets majeurs des circuits de refroidissement des CNPE a été choisi comme modèle de
contaminant métallique.
En milieu aquatique naturel, les métaux, et plus particulièrement le Cu, interagissent fortement avec les
différents ligands inorganiques et organiques, modifiant ainsi leur spéciation. Dans cette étude, nous nous
intéressons à l’influence de matières organiques dissoutes d’origines naturelles (algale ou bactérienne) et
anthropiques (extraites de Seine, en aval de la station d’épuration d’Achères) sur la spéciation et la
biodiponibilité du Cu à des niveaux de contamination représentatifs du milieu naturel. Pour cela, nous avons
étudié les relations entre les concentrations labiles du cuivre et une réponse biologique, sur la base de
biotests de laboratoire permettant d’évaluer simultanément une réponse biologique (nous étudions ici la
cinétique de bioaccumulation du Cu par les bryophytes comme indicateur de la biodisponibilité du Cu) et la
spéciation du milieu d’exposition, à des niveaux de contamination représentatifs du milieu naturel. De
manière similaire, nous avons étudié l’effet des cations majeurs sur les cinétiques d’accumulation des
métaux.
En conditions contrôlées de laboratoire, nous avons pu observer que des concentrations croissantes en
matières organiques ou en cations compétiteurs réduisent fortement les cinétiques d’accumulation du Cu
dans les bryophytes aquatiques. Nous avons ainsi, d’une part, validé en conditions contrôlées de laboratoire,
la technique DGT pour l’étude des faibles niveaux de contamination métalliques et, d’autre part, développé
un Biotic Ligand Model – Cuivre pour décrire l’effet de cations sur l’accumulation du Cu dans les
bryophytes aquatiques.
La complémentarité des ces deux outils (DGT – BLM) a ensuite été confrontée à des mesures de
biodisponibilité du Cu in situ sur des eaux naturelles possédant des paramètres de qualité d’eau contrastés.
Mots clés :
Biodisponibilité – Spéciation – Métaux – Diffusion Gradient in Thin films – Biotic Ligand
Model – Bryophytes Aquatiques – Matière Organique Naturelle.
ABSTRACT
The increasing awareness that trace metals constitute a major threat to aquatic ecosystems has triggered the
development and the use of integrative biological indicators. Electricité de France (EDF) has been using
aquatic mosses (bryophytes) for years in order to monitor the bioavailable trace metal concentrations in the
discharges of the nuclear plants cooling systems, that display high copper concentrations. The objective of
this study was to evaluate and quantify the influence of the environmental factors that can alter the
bioavailability of Cu for aquatic mosses.
Under natural conditions, interactions between of copper with inorganic and organic ligands significantly
reduce the speciation of metals. In this work we investigate how natural (algal and bacterial) and anthropic
(Seine River extracts) dissolved organic matters alter the speciation and the bioavailability of Cu at
environmentally relevant concentrations. In controlled laboratory experiments, we were able to significantly
correlate the labile copper fractions and the bioavilability (estimated on the basis of bioaccumulation
kinetics of Cu in aquatic mosses), in the presence of various organic ligands. Similarly, we also investigate
the effects of major cations on the copper bioaccumulation kinetics of Cu in the aquatic mosses.
On the basis of these laboratory experiments, we showed that dissolved organic maters as well as major
cations reduced the bioaccumulation kinetics of copper in aquatic mosses.
Finally, an integrated approach coupling approach was validated under field conditions conducted in
different contrasting rivers, using systematic comparison with in situ bioaccumulation in aquatic mosses.
Under field conditions, the concomitant use of DGT and BLM was proved to be an efficient integrated in
situ monitoring tool of meal’s bioavailability.
Key words : Bioavailability – Speciation – Heavy Metals – Diffusion Gradient in Thin films – Biotic
Ligand Model – Aquatic Bryophytes – Natural Organic Maters.
220