2008

TP biochimie 2ème année
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Extraction and analysis of yeast lipids
Etudiants :
Lorraine de Montmollin, Elliott Croset et Alexandre Dumoulin (Groupe 4)
Assistants : Ursula Loizides Mangold, Sharon Epstein, Isabelle Riezman
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TP biochimie 2ème année
Introduction :
Dans ce TP nous allons analyser les différents lipides présents dans des levures
(s.cerevisiae). Il y a quatre sortes de lipides : Les phosphoglycérides, les stérols, les
triglycérides et les sphingolipides. Ces lipides comportent tous une partie hydrophobe et une
partie hydrophile ce qui permet aux phospholipides par exemple de former la double couche
lipidique qui forme les membranes et est essentiel à la structure de la cellule. Ils participent
entre autres à la fluidité plus ou moins élevée des membranes (les insaturations augmentent
la fluidité ainsi que les lipides cyclique : les stérols), à la formation de vésicules dans le
cytoplasme pour stocker des acides gras (triglycérides) ou même comme molécules de
signal à la surface de la membrane (phosphatydilcholine).
La comparaison d’une levure mutante à une de type sauvage va permettre l’identification de
possibles mutations dans les gênes codant pour les différents enzymes qui font partie de la
voie de synthèse lipidique. Pour cela, on utilise la méthode de la TLC (Thin layer
chromatography) : la chromatographie en couche mince. Ceci va permettre de séparer les
lipides selon leur affinité aux solvants utilisés. On utilise même la TLC en deux dimensions,
ce qui permet de séparer des types de lipides ayant la même affinité au premier type
d’éluant.
I.Méthodes :
Les manipulations effectuées sont les suivantes :
Toutes les manipulations sont effectuées à double, une fois avec le wild type et une fois avec
le mutant.
Les tubes contenant les billes de verre sont refroidis dans la glace. On y ajoute 3ml d’eau,
1.5g de cell pellet et on refroidit pendant 5min. On ajoute 1.5ml de méthanol et on vortex
trois fois 30 secondes en refroidissant dans la glace entre chaque étape.
On ajoute 3ml de chloroforme et on vortex pendant 10min à TA. On centrifuge 1min à
500rpm et on transfère le surnageant dans un nouveau tube. Les billes de verre sont lavées
avec 1.5 ml de chloroforme méthanol 2 :1. On centrifuge 1min à 500rpm et on mélange les
deux surnageant. On ajoute 1ml de MgCl2 à 0.034% et on vortx 10min. On centrifuge 5min à
2000rpm. La phase supérieure est retirée et on ajoute 1ml de KCl Méthanol 4 :1 et on vortex
pendant 5min. On centrifuge 2min à 2000rpm et on retire la phase supérieure. 1ml de
artificial upper phase et on vortex rapidement. On centrifuge encore 5min à 2000rpm. La
phase supérieure est retirée et la phase inférieure (organique) est transférée dans un autre
tube. On ajoute 1ml d’artificial upper phase et on vortex 5min. On centrifuge 10min à
4000rpm et la phase supérieure est retirée. La phase inférieure est transférée dans un autre
tube. On sèche sous courant d’azote.
Il y a trois différentes manières de révéler les lipides sur les plaques chromatographiques. La
première est non spécifique, c’est-à-dire qu’elle va colorer tous les lipides sur la plaque. On
utilise de la vapeur d’iode qui va colorer les lipides en jaune. Cela dit cette méthode n’est pas
très performante pour ce qui est de détecter les lipides complètement saturer ainsi que les
glycolipides issus de cellules animales.
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La deuxième est aussi non spécifique mais permet quand même d’identifier les lipides par
leurs couleurs. C’est la méthode du dichromate et l’acide sulfurique.
La dernière méthode, qui est la coloration par le ninhydrine est elle spécifique aux
phospholipides contenant un groupe amino libre. On notera que ces méthodes ne permettent
pas d’identifier les sphingolipides donc on prendra en comptes seulement les trois autres
type de lipides. Les résultats ainsi obtenus permettent alors de dresser le bilan des lipides
qui sont absents ou en plus faible concentration par rapport à la souche sauvage de la
levure. On peut alors remonter dans les différentes voies de synthèse de ces derniers, au
locus du gène qui code pour l’enzyme ou aux enzymes manquants qui sont responsables
des changements.
II.Résultats :
Préparation de l’extrait de lipides :
Nous avons suivi le protocole pour extraire les lipides des levures (L’organigramme est en
annexe). Cette étape n’a pas marché pour tout les groupes (il y a eu une réaction de
saponification), c’est pourquoi dans les TLC qui suivent il y a aussi un aussi un échantillon
Wild type et mutant préparé pas les assistants.
TLC en 2 dimensions des glycerophospholipids:
Tout d’abord nous faisons un TLC en 2 dimensions pour séparer tous les types de lipides
(phospholipide, stérol, triglycéride, sphingtolipides). La première élution a été faite avec
chloroforme/méthanol/ammoniaque (25%) (65 : 35 : 5) et la seconde a été fait après avoir
tourné la plaque de 90° avec du chloroforme/acétone/méthanol/acide acétique/eau (50 : 20 :
10 : 10 : 5).
La révélation à été fait avec des vapeurs d’iode.
L
Figure Wild type (groupe)
Figure Mutant (groupe)
Figure Mutant (assistant)
Nous n’observons pas de disparition de spot entre les mutants et le Wild type, il faut donc
maintenant vérifier s’il y a des différences dans les groupes lipides.
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TLC des stérols et lipides neutre :
Le but est de comparer des lipides purifié avec les échantillons. L’élution à été effectué en
deux fois : les 3 premiers centimètres avec du éther de pétrole/éther diéthylique (1 : 1) et de
3 à 6 cm avec du pétrole/éther diéthylique (49 : 1).
Nous avons révélé la plaque en la trempant dans une solution de MnCl2, méthanol, d’acide
sulfurique et d’eau (0,63 g de MnCl2, 60 mL d’eau, 60 mL de méthanol et 4 mL d’acide
concentré). La plaque à ensuite été passé au four pendant 3min à 110°C.
Figure Plaque révélée à la ninhydrine
Se test est important car il est sélectif aux différents lipides. Par exemple, on peu voir une
tache mauve au niveau de la trioléine pour les mutants, mais la tache du standard de
trioléine est jaune donc elle manque bien dans le mutant.
TLC de glycérophospholipides :
Il nous reste à voir s’il manque des glycérophospholipides dans le mutant. L’élution se fait
cette fois en une seule fois avec du chloroforme/méthanol/ammoniaque (25%) (50 : 25 : 6).
La révélation se fait de 2 manières : avec l’iode (comme pour la TCL en 2 dimensions) et
avec de la ninhydrine. L’iode colore toutes les lipides alors que la ninhydrine est sélective et
ne colore que les phospholipides qui contiennent un groupe amine libre
(phosphatidylethanolamine : PE et phosphatidylserine : PS, comme on l’a vu dans
l’introduction). Comme la PS et la PA migre de la même façon sur la plaque on peu alors
distingue laquelle manque réellement.
Figure Plaque révélée à l'iode
On constate qu’il ne manque aucuns lipides.
Figure Plaque révélée à la ninhydrine
De nouveau, tous les lipides sont apparents.
III.Discussion :
D’après les spots qui manquent sur les TLC, il nous manque la trioléine qui est un
triacylglycérol ainsi que le cholesterol oleate standard qui est un ester de stérol. D’après la
voie de biosynthèse des phosphoglycérides nous déduisons que les gènes mutés sont
DGA1 et LR01 qui codent pour l’enzyme qui permet la transformation du diacylglycérol en
triacylglycérol. L’autre mutation intervient sur les gènes ARE1 et ARE2 qui permettent de
synthétiser l’enzyme d’estérification de l’ergostérol.
Les résultats entre les extraits de lipides des assistants et les nôtres sont identiques, ce qui
signifie que l’expérience s’est bien passée.
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IV.Références :
•
L.Stryer, J.M. Berg,
(2003),Flammarion.
•
Polycopié du cours : “Extraction and analyse of yeast protein”
J.L.
Tymoczko,
Biochimie
,
5ème
édition
«J’atteste que dans ce texte, toute affirmation qui n’est pas le fruit de ma reflexion
personnelle est attribuée à sa source et que tout passage recopié d’une autre source est en
outre place entre guillemets.»
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