cmi e test

Détermination in Vitro de la CMI (E-test)
Introduction
La CMI n'est pas, pour une bactérie donnée, une constante biologique. Elle est définie par le
Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CA-SFM) comme
étant la plus faible concentration d’une gamme de dilutions d’antibiotique de demi en, demi
qui entraîne l’inhibition de toute croissance bactérienne visible.
La méthode par dilution successive en milieu solide est la méthode de référence pour
déterminer la sensibilité bactérienne aux antibiotiques. Cette détermination exige une
standardisation rigoureuse du protocole expérimental (influence de l'inoculum, du délai
séparant ensemencement et observation, milieu de culture), toute modification des conditions
expérimentales rendant l’interprétation difficile.
D’autres méthodes sont applicables : dilutions successives en milieu liquide (croissance
bactérienne appréciée par l’apparition d’un trouble) ; E-Test (bandelettes imprégnées d’un
gradient d’antibiotique).
Détermination de la CMI par E-test®
Principe
Le principe de l’E-test® est basé sur la combinaison des deux concepts : dilution
et diffusion. Le système E-test® consiste en une bande en plastique non poreuse calibrée par
un gradient pré établi de concentration d’antibiotiques couvrant 15 dilutions pour déterminer
la CMI en µg/ml d’une souche testée en milieu gélosé.
Le gradient couvre une rangée de concentrations allant de 0,016 à 256 µg/ml ou 0,002 à 32
µg/ml selon l’antibiotique.
Méthodes de réalisation
• Préparation de l’inoculum
L’inoculum a été préparé en réalisant une suspension de colonies obtenues d’une culture pure
de 20 à 24heures dans de l’eau physiologique. La suspension a été calibrée à l’échelle 0.5
Mac Farland.
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• Ensemencement
Le E-test® se fait de préférence dans des boîtes de pétri de 150mm de diamètre.
Ce qui permet de déposer un maximum de 6 bandes. La gélose MH a été coulée avec une
épaisseur de 4.5 à 5mm. Une fois la gélose solidifiée, la boîte a été mise à l’étuve pour avoir
une surface bien sèche.
L’ensemencement a été effectué par écouvillonnage, c’est la méthode de KIRBY-BAUER
préconisée par le NCCLS : imbiber un écouvillon stérile de la suspension bactérienne et
essorer sur le rebord du tube. Passer l’écouvillon sur toute la surface de la gélose par simple
rotation de 120°. S’assurer que toute la boîte est bien ensemencée.
• Application des bandes E-test®
- Sortir le paquet de bandes à utiliser du freezer (-20°C) et le laisser revenir à la température
ambiante jusqu’à ce que toute l’humidité s’évapore avant de l’ouvrir.
- Vérifier l’absence de fentes et de trous sur les paquets d’E-test ; si le paquet est endommagé,
ne pas l’utiliser.
- Retirer les bandes avec une pince par la partie supérieure où il est marqué E.
- Eviter de toucher la zone chargée à la main.
- Placer les bandes dans la cassette d’insertion des bandes, chaque puits peut contenir 20
bandes.
- Mettre le même type d’antibiotique par puits.
- Remplir les puits de la cassette suivant l’antibiogramme de l’espèce à tester.
- Prélever bande par bande à l’aide de l’applicateur et les déposer à la surface de la gélose
(après 50 bandes, changer la bande adhésive de l’applicateur).
- Incuber immédiatement les boîtes à 37°C sous une atmosphère enrichie à 5% de CO2
pendant 20 à 24 heures et en air ambiant.
Remarque
Ne pas déplacer une bande E-test® une fois déposée sur la gélose car la libération de
l’antibiotique est instantanée.
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• Lecture de la valeur de la CMI
L’inhibition de la croissance se traduit par une ellipse. La valeur de la CMI correspond au
point d’intersection entre la limite de la zone d’inhibition et la bande d’E-test®.
Stockage des bandes E-test®
Les paquets d’E-test® sont stockés au Freezer à -20°C.
Après ouverture d’un paquet, les bandes inutilisées doivent être gardées dans des tubes de
stockage hermétique contenant un dessiccateur et placées à -20°C. Il faut toujours s’assurer
que le dessiccateur est bleu avant l’utilisation de la bande. Les tubes de stockage sont marqués
avec une étiquette indiquant la date péremption, le numéro de lot et le code l’antibiotique.
Critères d’interprétation
· Calcul des CMI50 et CMI90
C’est la détermination de la médiane par la méthode d’extrapolation linéaire. Les
CMI50 et CMI90 sont données par la formule suivante :
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A-B
X = x (Z-Y) +Y
C-B
Si X = CMI50
A = moitié des souches inhibées
Si X = CMI90
A = 90% des souches inhibées
B = effectifs cumulés immédiatement inférieurs à A
C = effectifs cumulés immédiatement supérieurs à A
B<A<C
Y = CMI de B
Z = CMI de C
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