materiels et methodes

II.
MATERIELS ET METHODES
28
Matériels et Méthodes
II.1.
Matériels et réactifs
Liste alphabétique.
Acétone
Acide acétique
Acide chlorhydrique
Acide linoléique (C18:2 ∆ 9,12), 99 %
Acide linolénique (C18:3 ∆ 9,12,15), 99 %
Acide oléique (C18:1 ∆ 9), 99 %
Acide stéarique (C18:0), 99 %
Acide tranéxamique
Acrylogel 40 % (37/1)
Actinomycine D
Anticorps anti-immunoglogulines de lapin couplé à la phosphatase
Anticorps anti-immunoglogulines de mouton couplé à la péroxydase
Anticorps anti-MMP-1 humaine (Ab-3)
Anticorps anti-MMP-3 humaine
APMA, acide phényl mercurique acétate
Appareil à point critique CPD 030
Appareil PCR GeneAmp® PCR System 9700
Appareil photo numérique DKC CM-30
Aprotinine
APS, persulfate d’ammonium
Benzamidine
BIAcore X
Bleu de Coomassie G-250
Bleu de Coomassie R-250
Bleu de Toluidine
Bleu Trypan
Butanol
CaCl2
caséine bovine, α-caséine
Culture cellulaire, Consommables
Culture cellulaire, Réactifs
Cuve d'électrophorèse Mighty Small SE-250
DMSO, diméthylsulfoxyde
DTT, 1,4-dithiothréitol
εACA, acide ε-aminocaropoïque
ECL, réactif de détection par chimiluminescence
ECM Gel (Matrigel)
EDTA, acide éthylène-diamine-téra-acétique
Elastase leucocytaire humaine
Endothelial Cell KIT.HUVEC-p
Ethanol
Evaporateur Ion Sputter JFC-110
Prolabo
Prolabo
Prolabo
Sigma
Sigma
Sigma
Sigma
Sigma
BDH
Sigma
Sigma
Sigma
Calbiochem
Biogenesis
Sigma
Baltec
PE Biosystems
Sony
Sigma
Merck
Sigma
Pharmacia Biosensor
Serva
Serva
Sigma
Sigma
Prolabo
Merck
Sigma
Poly Labo
Gibco BRL
Hoefer
Sigma
Merck
Sigma
Amersham
Sigma
Sigma
EPC
PromoCell
Prolabo
Joel
29
Matériels et Méthodes
Filtre Nucleopore PC MB 13MM 8.0UM PVPF
Gélatine
Glycérol
Glycine
Hépès, acide éthylène-diamine-tétraacétique
Hotte à flux laminaire MSC12
Hyperfilm ECL
Immobilon-P
Incubateur à CO2 Heraeus 600
Isopropanol
Lactose
LBS-I, Lysin Binding Site-I
Logiciel d'analyse d'image BioProfil
Logiciel d'analyse de courbe, BIAevaluation
Logiciel d'analyse de courbe, Grafit 4.0
Mca-Pro-Leu
Mca-Pro-leu-Gly-Leu-(Dnp)-Ala-Arg-NH2
Méthanol
Microconcentrateur Nanosep™
Microscope électronique à balayage 5400 LV
Microscope Inversé Axiovert 25
MMP-1 humaine
MTT, 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium
n-octyl-β-D-glucopyranose
NaCl
NBT/BCIP Sigma Fast
NEM, N-éthyl-maléide
Oligonuclétides
para-nitroaniline
Plaque noire 96 puits
Plaque transparente 96 puits
Plasmine humaine sans εACA et sans Lysine
Plasminogène humain sans εACA et sans Lysine
PMSF, phénylméthylsulonylfluorure
ProMMP-2 humaine
ProMMP-3 humaine
S-2251
SAB, sérum albumine bovine
SDS, dodécyl sulfate de sodium
Sécheur de gel, Gel Air Drying Système
Sensor Chip HPA
Soude
Spectrofluorimètre HTS 7000+
Spectrophotomètre Titertek Multiscan+
Système d'acquisition d'image en fluorescence LAS-1000
Système d'acquisition d'image en lumière blanche BioCapt
Corning
Sigma
Sigma
Euromedex
Euromedex
Jouan
Amersham
Millipore
Heraeus
Prolabo
Sigma
Sigma
Vilber Lourmat
Pharmacia Biosensor
Erithacus
Bachem
Bachem
Prolabo
Pall Filtron
Joel
Zeiss
Calbiochem
Sigma
Euromedex
Merck
Sigma
Sigma
Eurogentec
Sigma
Cliniplate
Greiner
Calbiochem
Calbiochem
Sigma
Calbiochem
Valbiotech
Chromogenix
Euromedex
BDH
Bio-Rad
Pharmacia Biosensor
Prolabo
Perkin Elmer
Labsystems
Fuji Medical System
Vilber Lourmat
30
Matériels et Méthodes
Système de transfert semi-dry Trans-Blot® SD.
TIMP-2 humain
Tris, (tris-(hydroxyméthyl))-aminométhane
Triton-X100
Tween-20
Ultracentrifugeuse L-60
Urokinase humaine sans εACA et sans Lysine
II.2.
Bio-Rad
Calbiochem
Gibco BRL
Sigma
Sigma
Beckman
Calbiochem
Isolement de l’élastine insoluble
L’élastine fibreuse insoluble est isolée du ligament large de la nuque de bœuf dont elle
représente 80 % (p/p) du poids sec, selon la méthode d’hydrolyse alcaline améliorée par
Robert L. et al., 1976. Ce procédé reste à l’heure actuelle une méthode de référence pour la
purification de l’élastine insoluble [Daamen W.F., 2001].
Le ligament large de la nuque de bœuf est lavé abondamment dans une solution de
sérum physiologique en présence d’inhibiteurs de protéases (NEM 5 mM, EDTA 5 mM,
PMSF 2 mM) puis rincé avec une solution de NaCl à 10 % (p/v). Afin d’éliminer les lipides, il
est ensuite incubé 1 heure dans une solution de butanol 1 M puis 1 heure dans une solution
d’acétone 100 %. Après lyophilisation, le matériel obtenu est broyé dans un Potter. Il est
ensuite hydrolysé par traitement à la soude 0,1 M pendant 15 min dans un bain-marie à
+98°C, sous agitation constante. L’hydrolysât ainsi obtenu est centrifugé à 12 000 g pendant
15 min. Cette étape d’extraction par la soude est répétée 3 fois. En effet, seul un traitement
alcalin de 45 min permet d’éliminer tous les éléments contaminant les fibres élastiques tels
que les collagènes ou les glycoprotéines de structure. Après refroidissement et neutralisation
de la soude par une solution d’acide chlorhydrique 1 M, l’hydrolysât est centrifugé à 12 000 g
pendant 15 min. Le culot obtenu est rincé avec de l’eau distillée jusqu’à l’obtention d’un pH
neutre (pH 7,0) puis séché à l’aide d’acétone. L’élastine insoluble ainsi isolée est ensuite
broyée à sec et tamisée ; le diamètre des fibres élastiques utilisées dans nos expériences
est inférieur ou égal à 125 µm. Hormis l’étape d’extraction par la soude 0,1 M, toutes les
étapes d’isolement sont réalisées à température ambiante. La pureté de l’élastine insoluble
est déterminée par analyse des acides aminés par chromatographie liquide haute
performance et par l’absence d’hexoses et d’hexosamines dans la préparation [Jacob M.P.,
1985].
31
Matériels et Méthodes
II.3.
Préparation d’hydrolysât d’élastine insoluble
II.3.1.
Hydrolysât chimique
L’élastine insoluble peut être solubilisée par la potasse en milieu éthanolique. Cette
méthode d’hydrolyse génère des peptides d’élastine soluble appelés kappa-élastine (kE)
[Jacob M.P., 1985].
1 g d’élastine insoluble est mis en suspension dans 100 ml d’un mélange éthanol/eau
80/20 (v/v) contenant 1 M de potasse (KOH). Le mélange est maintenu sous agitation
constante pendant 1 heure à +37°C ; cette température favorise la solubilisation de l’élastine.
Après centrifugation à 12 000 g pendant 15 min, le surnageant qui contient les peptides de
kE est conservé. Le culot d’élastine insoluble non hydrolysé est incubé à nouveau dans un
mélange éthanol/eau 80/20 (v/v) contenant 1 M de potasse (KOH). Les différents
surnageants obtenus sont neutralisés par de l’acide perchlorique puis mis à décanter
pendant 18 heures à +4°C. Après centrifugation, le culot contenant les sels de perchlorate
de potassium est éliminé et le surnageant contenant les peptides de kE est dialysé contre de
l’eau distillée puis lyophilisé.
Les peptides de kE ainsi générés présentent une grande hétérogénéité de masses
moléculaires. Ils sont donc fractionnés en fonction de leur masse moléculaire par
chromatographie d’exclusion (Sephadex G-100). La fraction de peptides de kE de masse
moléculaire apparente de 75 kDa est retenue pour les expériences ultérieures.
II.3.2. Hydrolysât enzymatique
75 mg d’élastine insoluble sont mis en suspension dans 7,5 ml de tampon Tris-HCl 0,1
M, CaCl2 5 mM, NaN3 0,02 % (p/v) pH 8,0 et maintenus sous agitation constante pendant 18
heures à +4°C. 37,5 µg (1,25 µmol) d’élastase leucocytaire sont ajoutés au milieu
réactionnel. Le mélange est alors incubé sous agitation constante à +4°C pendant 1 à 24
heures. La réaction enzymatique est stoppée par addition de 75 µl de PMSF à 0,2 M. Après
centrifugation à 10 000 g pendant 10 min à +4°C, le surnageant contenant les peptides
d’élastine est dialysé contre de l’eau distillée puis lyophilisé. Les quantités de peptides
générés sont déterminées par dosage des protéines selon la méthode de Bradford en
utilisant la kappa-élastine comme standard [Jacob M.P., 1985]. Après 1 et 24 heures
d'incubation, des hydrolyses de l’élastine de 6,6 et 37,1 %, respectivement, sont observées.
32
Matériels et Méthodes
II.4.
Synthèse des peptides utilisés
Les peptides VGVAPG et (VGVAPG)3 ainsi que les banques de peptides VXVAPG et
XGVAPG ont été synthétisés par le Laboratoire de Biochimie Analytique de M. le Pr. Jean
Wallach à Lyon.
Le
protocole
utilisé
est
basé
sur
la
synthèse
en
mode
Fmoc
ou
fluorenylmethoxycarbonyle et les couplages sont effectués avec des esters d’acide aminéFmoc-pentafluorophényl (Fmoc-acide aminé-OPfp) [Welling D.A., 1997]. Le greffage des
acides aminés est réalisé sur une phase solide en présence d’un excès de chaque acide
aminé et se fait successivement en présence de 1-hydroxybenzotriazole. La phase solide
utilisée est une résine Fmoc-Val-Wang. Toutes les étapes de déprotection Fmoc impliquent
un traitement avec une solution de diméthylformamide/piperidine 20% pendant 10 minutes.
La coupure du peptide de la résine est obtenue par un traitement avec un mélange acide
trifluoroacétique/eau (95/5 ; v/v) pendant 6 heures, suivi par des lavages successifs de la
résine avec de l’éther. Les peptides sont ensuite purifiés par HPLC en phase inverse et leurs
puretés vérifiées par spectrométrie de masse à bombardement atomique rapide.
Les banques de peptides VXVAPG et XGVAPG ont été synthétisés selon un protocole
similaire en utilisant la méthodologie de chimie combinatoire par « division-synthèse »
[Houghten R.A., 1991 ; Lam K.S., 1991]. La séquence Fmoc-VAPGV est synthétisée en
premier sur une résine Fmoc-Val-Wang et divisée en deux fractions. Pour la synthèse de
VXVAPG, 19 sous-fractions de 20 mg chacune sont effectuées à l’aide du système
Multipeptide Biotech BT 400. A chaque sous-fraction est couplé un ester d’acide aminé
Fmoc-OPfp (hormis l’acide aminé cystéine). Après lavage et séchage, les 19 sous-fractions
sont rassemblées avant l’addition du résidu Valine final. La seconde banque de peptide est
réalisée de la même manière. Le résidu Fmoc-Gly-Opfp est greffé sur la résine FmocVAPGV avant le processus de division en sous-fractions et de couplage final des différents
acides aminés.
33
Matériels et Méthodes
II.5.
Mesure des activités enzymatiques des protéinases
II.5.1.
Principe
Une enzyme est une protéine capable de catalyser spécifiquement la transformation
d’un ou deux substrats. En prenant un modèle simplifié de réaction enzymatique :
d ( P)
d (S )
E
S → P , la vitesse de réaction s’écrit : v =
=−
.
dt
dt
Pour tracer une courbe ( P) = f (t ) , l’enzyme E agit sur le substrat S ; le temps zéro
correspond au déclenchement de la réaction. L’apparition du produit P est mesuré en
fonction du temps (Figure 7).
Figure 7
Courbe (P) = f(t), relation entre l’apparition du produit P et le temps t
La vitesse de réaction v =
d ( P)
est constante pendant les conditions initiales (partie
dt
de courbe 0A). Pour cette portion de courbe, la tangente à l’origine se confond avec la
courbe : la vitesse, pente de la tangente 0A, est appelée vitesse initiale. Puis la vitesse
diminue (portion de courbe AB) et s’annule (portion BC). La vitesse s’annule lorsque l’un des
substrats est consommé ou lorsqu’il s’établit un équilibre.
34
Matériels et Méthodes
Lorsque la vitesse d’une réaction enzymatique est déterminée, c’est toujours la vitesse
initiale qui est calculée. Les mesures de vitesse sont donc faites dans les conditions initiales
où moins de 10 % de la quantité de substrat est hydrolysé. Tant que [S ] ff [E ] , la vitesse
initiale est proportionnelle à la concentration de l’enzyme : elle traduit donc l’activité d’une
préparation de l’enzyme exprimée en unités enzymatiques.
L’unité internationale (UI ou U) représente la quantité d’enzyme qui catalyse la
transformation d’une micromole de substrat par minute.
II.5.2. La plasmine
L’activité enzymatique de la plasmine est mesurée par l’hydrolyse d’un substrat
spécifique, le S-2251 : H-D-Val-Leu-Lys-pNA 2HCl (pNA, para-nitroanilide) [Christensen U.,
1979]. La cinétique de libération du para-nitroaniline est suivie par mesure de l’absorbance à
405 nm.
II.5.2.1.
Mesure de l’activité plasmine dans les milieux conditionnés
Après incubation, les milieux conditionnés sont prélevés, centrifugés à 10 000 g
pendant 10 min à +4°C afin d’éliminer les débris cellulaires et ajustés à la même
concentration protéique. Le rouge de phénol contenu dans le milieu de culture est éliminé
par diafiltration à l’aide de microconcentrateur Nanosep™ avec une membrane ayant un
seuil de coupure de 10 kDa. 50 µl de milieux conditionnés sont centrifugés à 14 000 g
pendant 6 min à +4°C. Le retentât est remis en suspension dans 50 µl de tampon Tris-HCl
0,1 M pH 7,8 et centrifugé à nouveau dans les mêmes conditions. Cette étape est répétée 3
fois permettant ainsi d’éliminer totalement le rouge de phénol.
20 µl de milieux conditionnés sans rouge de phénol sont ajoutés à 160 µl de tampon
Tris-HCl 0,1 M pH 7,8 en plaque transparente de 96 puits. La réaction est initiée par addition
du substrat S-2251 à la concentration finale de 0,3 mM dans un volume réactionnel final de
200 µl. Les variations d’absorbance (λ : 405 nm) au cours du temps sont suivies à l’aide d’un
spectrophotomètre lecteur de plaque HTS 7000+ à +20°C. La courbe représentant
l’absorbance (en unités d’absorbance) en fonction du temps (en minutes) est tracée.
La vitesse initiale de la réaction est déterminée par le calcul de la pente de la tangente
à l’origine. Le nombre d’unités d’activité plasmine contenu dans les différents milieux
conditionnés est calculé par conversion de la variation d’absorbance par min en variation de
mole de substrat libéré par min en appliquant la Loi de Beer Lambert : A = ε l C ou A
représente l’absorbance ; ε, le coefficient d’extinction molaire (l mol-1 cm-1) ; l, l’épaisseur de
solution traversée (cm) et C, la concentration de la solution (mol l-1).
35
Matériels et Méthodes
Une courbe d’étalonnage est réalisée à l’aide de différentes concentrations de paranitroaniline (Figure 8) afin de déterminer la valeur du coefficient d’extinction molaire du paranitroalinine dans nos conditions expérimentales (spectrophotomètre et tampon utilisés) ainsi
que la valeur de l’absorbance correspondant à 10 % d’hydrolyse du substrat.
Abs 405 nm
1.5
y = 6303x + 0.0048
2
R = 0.9999
1.0
0.5
0.0
0
0.00005
0.0001
0.00015
0.0002
para-nitroaniline (M)
Figure 8
Courbe d’étalonnage Abs 405 nm = f (para-nitroaniline)
L’analyse par régression linéaire de la courbe permet de déterminer la pente de la
droite représentant le coefficient ε l : 6303. 10 % d’hydrolyse du substrat est équivalent à 30
10-6 M de para-nitroaniline libérées. A = 6303 * 30 10-6. Ainsi toute mesure d’absorbance à
405 nm au cours du temps devra être inférieure à environ 0,2 unité d’absorbance pour le
calcul de l’activité enzymatique de la plasmine.
II.5.2.2.
Modulation de l’activité plasmine en présence d’effecteur
12 nM de plasmine humaine sont pré-incubés à +20°C pendant 5 minutes en absence
ou en présence d’effecteurs dans un tampon Tris-HCl 0,1 M pH 7,8 en plaque transparente
de 96 puits ; le substrat S-2251 est ensuite ajouté à la concentration finale de 0,3 mM. Les
variations d’absorbance (λ : 405 nm) au cours du temps sont suivies à l’aide d’un
spectrophotomètre lecteur de plaque HTS 7000+ à +20°C. La courbe représentant
l’absorbance (en unités d’absorbance) en fonction du temps (en minutes) est tracée.
La vitesse initiale de la réaction est déterminée par le calcul de la pente de la tangente
à l’origine. V0 représente la vitesse initiale en absence d’effecteur et Vi cette vitesse en
présence d’un effecteur. Le rapport Vi/V0 est calculé : si ce rapport est égal à 1, l’effecteur
36
Matériels et Méthodes
n’a pas d’effet sur l’activité de l’enzyme ; s’il est inférieur à 1, l’effecteur est un inhibiteur de
l’activité de l’enzyme ; s’il est supérieur à 1, il s’agit d’un activateur.
II.5.3. Les MMPs
La mesure de l’activité enzymatique des MMPs est basée sur le principe du transfert
d’énergie par résonance, RET ou encore transfert d’énergie de fluorescence par résonance,
FRET (Figure 9). Le substrat est constitué d’un oligopeptide comportant un groupement
fluorescent (F), donneur d’énergie et un groupement éteignant (Q, pour quenching),
accepteur d’énergie. Après hydrolyse, le groupement éteignant est libéré, permettant de
mesurer l’augmentation de fluorescence.
De nombreux couples fluorescent/éteignant ont été développés pour la mesure de
l’activité
enzymatique
des
MMPs
dont
le
couple
7-méthoxycoumarine-4-acétyl
(Mca)/dinitrophenyl-diaminopropionyl (Dnp) [Knight C.G., 1991 ; Knight C.G., 1992].
excitation
émission
F
excitation
émission
Q
F
PEPTIDE 1
absorption
OLIGOPEPTIDE
protéinase
×
Q
absorption
PEPTIDE 2
Figure 9
Représentation schématique de la mesure d’activité enzymatique basée sur le
principe d’extinction de fluorescence intramoléculaire
37
Matériels et Méthodes
II.5.3.1.
Mise au point de la mesure de l’activité enzymatique des MMPs à l’aide d’un
spectrofluorimètre lecteur de plaque
La solution stock du substrat fluorescent est conservée à +4°C et à l’abri de la lumière.
Ces substrats sont très insolubles et doivent donc être dissous dans des solvants organiques
tel que le diméthylsulfoxyde (DMSO). Toutefois la quantité finale de solvant dans l’essai doit
être inférieure à 1% de manière à éviter tout risque de dénaturation de l’enzyme ou de
modifications de ses constantes cinétiques.
La concentration molaire du substrat fluorescent après reconstitution doit être
déterminée précisément. Pour les substrats contenant un groupement Dnp, l’absorbance à
410 nm de la solution est mesurée. La concentration molaire est calculée en appliquant la
Loi de Beer Lambert : A = ε l C soit C = A / (ε l) avec ε = 7500 l mol-1 cm-1 et l = 1 cm.
Des changements artificiels de fluorescence dus aux variations de température
peuvent apparaître au cours du temps. Le spectrofluorimètre doit donc être thermostable afin
de travailler à température constante.
Il n’est pas nécessaire d’utiliser un appareil à haute résolution. Cependant la largeur de
la bande passante des filtres d’excitation et d’émission est importante. En effet le principe
d’extinction de fluorescence intramoléculaire requiert des bandes passantes étroites (5 à 10
nm) pour les longueurs d’onde d’excitation et d’émission employées. Les filtres standards
équipant un spectrofluorimètre lecteur de plaque ont une bande passante plus large (20 à 35
nm), permettant ainsi la mesure de la fluorescence de plusieurs fluorophores. Les longueurs
d’ondes d’excitation (328 nm) et d’émission (393 nm) du groupement Mca ne sont pas
compatibles avec ce type d’appareil. Le groupement coumarine possédant un pic d’émission
de fluorescence à 450 nm, les mesures de fluorescence ont été effectuées en utilisant un
filtre de 326 nm (bande passante 5 nm) pour la longueur d’onde d’excitation et un filtre de
465 nm (bande passante 35 nm) pour la longueur d’onde d’émission.
Le spectrofluorimètre HTS 7000+ amplifie aussi le signal par un facteur de gain
permettant d’obtenir une différence la plus importante possible entre le signal le plus faible et
le plus fort. La valeur de ce coefficient de gain est obtenue par mesure de la fluorescence
d’une solution de Mca-Pro-Leu, peptide mimant le peptide substrat hydrolysé, à 0,2 µM (soit
10 % d’hydrolyse du peptide substrat). Dans nos conditions expérimentales, un coefficient de
180 permet une telle différence.
38
Matériels et Méthodes
Une courbe d’étalonnage est réalisée à l’aide de différentes concentrations de McaPro-Leu (Figure 10) afin de vérifier la relation linéaire entre la concentration de fluorophore et
le fluorescence dans les conditions expérimentales employées : longueurs d’onde
d’excitation 326 nm et d’émission 465 nm, coefficient de gain : 180. Ce type de courbe
permet aussi la conversion des unités de réponse de fluorescence (RFU, response
fluorescence units) en mole de Mca-Pro-Leu pour le calcul du nombre d’unité d’activité
enzymatique des MMPs.
30000
25000
y = 1E+11x - 94.5
R2 = 0.9914
RFU
20000
15000
10000
5000
0
0.E+00
1.E-07
2.E-07
Mca (M)
Figure 10 Courbe d’étalonnage RFU (λ ex : 326 nm, λ ém : 465 nm) = f (Mca)
II.5.3.2.
Mesure de l’activité MMPs dans les milieux conditionnés
Après incubation, les milieux conditionnés sont prélevés, centrifugés à 10 000 g
pendant 10 min à +4°C afin d’éliminer les débris cellulaires et ajustés à la même
concentration protéique. Le rouge de phénol contenu dans le milieu de culture est éliminé
par diafiltration à l’aide de microconcentrateur Nanosep™ avec une membrane ayant un
seuil de coupure de 10 kDa. 50 µl de milieux conditionnés sont centrifugés à 14 000 g
pendant 6 min à +4°C. Le retentât est remis en suspension dans 50 µl de tampon Tris-HCl
50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM pH 7,5 et centrifugé à nouveau dans les mêmes
conditions. Cette étape est répétée 3 fois permettant ainsi d’éliminer totalement le rouge de
phénol.
20 µl de milieux conditionnés sans rouge de phénol sont ajoutés à 170 µl de tampon
Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM pH 7,5 en plaque noire de 96 puits dont les
sites de liaisons non-spécifiques ont été bloqués à l’aide d’une solution de sérum albumine
bovine (SAB) à 0,1 % (p/v) dans un tampon Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM pH
7,5. La réaction est initiée par addition de 10 µl de substrat Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-(Dnp)-Ala39
Matériels et Méthodes
Arg-NH2 à la concentration finale de 2 µM dans un volume réactionnel final de 200 µl. Les
variations de fluorescence (λ excitation : 326 nm, λ émission : 465 nm) au cours du temps
sont suivies à l’aide d’un spectrofluorimètre lecteur de plaque HTS 7000+ à +20°C. La
courbe représentant la fluorescence (en RFU) en fonction du temps (en minutes) est tracée.
La vitesse initiale de la réaction est déterminée par le calcul de la pente de la tangente
à l’origine. Le nombre d’unités d’activité MMPs contenu dans les différents milieux
conditionnés est calculé par conversion de la variation de fluorescence par min en variation
de moles de substrat libérées par min.
II.5.3.3.
Modulation de l’activité MMPs en présence d’effecteur
Activation des proMMPs
La proMMP-2 est activée par incubation pendant 18 heures à +4°C en présence de 1
mM d’APMA (préparé à la concentration de 10 mM dans la soude 0,1 M). La proMMP-3 est
activée par incubation pendant 8 heures à +37°C en présence de 2 mM d’APMA (préparé à
la concentration de 10 mM dans 100 % (v/v) de DMSO).
Mesure de l’activité
200 pM de chaque MMP testée sont pré-incubés à +20°C pendant 5 minutes en
absence ou en présence d’effecteurs dans un tampon Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2
5 mM pH 7,5 en plaque 96 puits noire dont les sites de liaisons non-spécifiques ont été
bloqués à l’aide d’une solution de SAB à 0,1 % (p/v) dans le même tampon. La réaction est
initiée par addition de 10 µl de substrat Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-(Dnp)-Ala-Arg-NH2 à la
concentration finale de 2 µM dans un volume réactionnel final de 200 µl. Les variations de
fluorescence (λ excitation : 326 nm, λ émission : 465 nm) au cours du temps sont suivies à
l’aide d’un spectrofluorimètre lecteur de plaque HTS 7000+ à +20°C. La courbe représentant
la fluorescence (en RFU) en fonction du temps (en minutes) est tracée.
La vitesse initiale de la réaction est déterminée par le calcul de la pente de la tangente
à l’origine. Le rapport Vi/V0 est calculé.
II.6.
Activation de la proMMP-3 par la plasmine
100 nM de proMMP-3 sont incubés avec 65 nM de plasmine en absence ou en
présence des effecteurs, aux différentes concentrations indiquées dans le texte et les
légendes, dans un tampon Tris-HCl 50 mM NaCl 150 mM CaCl2 5 mM pH 7,5. La réaction
est arrêtée aux temps indiqués par addition de 0,3 mg/ml d’aprotinine, un inhibiteur de sérine
protéinase, et les échantillons sont conservés à -80°C jusqu'à utilisation. Un témoin proMMP-3 incubé sans plasmine et un témoin pro-MMP-3 incubé avec plasmine et aprotinine
(0,5 mg/ml dans le tampon Tris-HCl 50 mM NaCl 150 mM CaCl2 5 mM pH 7,5) sont réalisés.
40
Matériels et Méthodes
Les échantillons sont ensuite soumis à une électrophorèse en gel de polyacrylamide à
10 % (p/v) en présence de dodécyl sulfate de sodium en vue de séparer les différentes
protéines présentes.
II.7.
Electrophorèse en gel de polyacrylamide en présence
de dodécyl sulfate de sodium
Les protéines sont séparées en fonction de leur masse moléculaire apparente par
électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de dodécyl sulfate de sodium ou
PAGE-SDS selon la méthode décrite par Laemmli U.K., et al., 1970.
Les échantillons sont mis en suspension dans le tampon échantillon (Tris-HCl 62,5
mM, SDS 2 % (p/v), Glycérol 5 % (v/v), bleu de bromophénol 0,001 % (p/v) pH 6,8), sans
dépasser un volume de 25 µl et réduits en présence de 0,1 mM de DTT. Un gel de
polyacrylamide à 10 % (p/v) est préparé (Tris-HCl 0,375 M, SDS 0,1 % (p/v), APS 0,05 %
(p/v), TEMED 0,05% (v/v) pH 8.8). Les échantillons ainsi qu’un témoin de masses
moléculaires sont déposés. Le gel est alors soumis à un courant de 10 mA pendant 30
minutes puis de 20 mA pendant 1 heure 30 permettant respectivement la concentration et la
migration des échantillons (tampon de migration : Tris 25 mM, SDS 0,1 % (p/v), Glycine 192
mM pH 8,3).
Après migration, le gel est démoulé. Il peut alors être coloré ce qui révèle alors les
protéines présentes (Bleu de Coomassie R-250 0,025 % (p/v), méthanol 40 % (v/v) acide
acétique 7 % (v/v)) ou bien, celles-ci peuvent être électrotransférées et immuno-révélées.
II.8.
Electrotransfert et immuno-révélation des protéines
Des protéines séparées en PAGE-SDS peuvent être révélées par la technique de
Western blot selon la méthode décrite par Towbin H., et al., 1979.
Après migration, le gel d’électrophorèse est équilibré 30 minutes dans le tampon de
transfert (Tris 48 mM, Glycine 39 mM, méthanol 20 % (v/v) pH 8,2). Les protéines sont alors
électrotransférées par une tension de 15 V pendant 30 minutes à température ambiante sur
une membrane de polyvinyldifluorate (PVDF) Immobilon-P mise au contact du gel à l’aide du
système de transfert semi-dry Trans-Blot® SD.
Après électrotransfert, la membrane est rincée avec le tampon TBS (Tris-HCl 50 mM
NaCl 150 mM pH 7,6) + 0,05 % (v/v) de Tween 20 (TBS-T). La partie de la membrane
correspondant à la piste de migration des témoins de masses moléculaires est découpée et
colorée à l’aide d’une solution de bleu de Coomassie R-250 (bleu de Coomassie R-250 0,1
% (p/v), méthanol 50 % (v/v), acide acétique 7 % (v/v)). Ceci permet de vérifier que la
migration et le transfert des protéines ont bien eu lieu.
41
Matériels et Méthodes
La membrane est incubée pendant 30 minutes en présence de tampon TBS-T + 5 %
(p/v) de sérum de veau fœtal (SVF) sous agitation en vue de saturer les sites de liaisons non
spécifiques. La membrane est ensuite mise en présence du premier anticorps pendant 2
heures puis en présence de l’anticorps secondaire couplé à la phosphatase alcaline. Entre
chaque incubation, la membrane est lavée une fois 10 minutes puis 3 fois 5 minutes avec le
tampon TBS-T. La présence de phosphatase alcaline est révélée par incubation de la
membrane pendant 10 minutes avec un substrat chromogène spécifique : 5-bromo-4-chloro3-indolyl phosphate et nitro bleu de tétrazolium (BCIP/NBT) Sigma Fast. Après révélation, la
membrane est rincée dans de l’eau distillée, séchée et photographiée.
Lors de révélation par chimioluminescence, l’anticorps secondaire utilisé est couplé à
la péroxydase. La membrane est traitée de la même manière. Avant l’étape de révélation, la
membrane est lavée 3 fois pendant 5 minutes avec le tampon TBS afin d’éliminer toute trace
de Tween 20. La mise en évidence de l’activité péroxydase est réalisée par incubation de la
membrane avec le substrat de chimioluminescence ECL pendant une minute. La membrane
est ensuite mise à exposer sur un film photographique (Hyperfilm ECL) pendant 30
secondes à 15 minutes. Le film photographique est ensuite développé, séché et
photographié.
II.9.
Identification et quantification des protéinases et
de leurs inhibiteurs selon la technique de
zymographie
II.9.1.
Principe
La présence des protéinases sécrétées dans le milieu de culture est mesurée par la
méthode de zymographie [Overall C.M., 1988]. Cette technique repose sur le principe d’une
PAGE-SDS où un substrat protéique a été ajouté avant la polymérisation du gel de
séparation. Après polymérisation, le substrat protéique se trouve donc piégé dans les mailles
d’acrylamide. La migration se déroule dans des conditions identiques à une PAGE-SDS
classique, les protéinases migrent donc en fonction de leur masse moléculaire respective.
Après la migration, le SDS est éliminé afin de renaturer les protéinases. Le gel est alors
incubé 18 heures à +37°C, permettant la dégradation du substrat protéique par les
protéinases. Le gel est ensuite coloré au bleu de Coomassie. Seuls les endroits où le
substrat protéique n’a pas été dégradé sont colorés en bleu. Il apparaît donc des bandes
blanches indiquant la présence de protéinases. L’intensité de dégradation pour une bande
est proportionnelle à la quantité de protéinase présente.
42
Matériels et Méthodes
Cette technique présente une particularité pour les MMPs, notamment pour leurs
proformes. Le passage de la proforme en une forme active nécessite le remplacement d’une
liaison Zn-Cys en Zn-H2O. Le SDS supprime l’interaction cystéine-Zn2+ par dénaturation de
la protéine et permet l’activation des MMPs. Après élimination du SDS, la protéine retrouve
une forme normale mais conserve la liaison Zn-H2O. Par un phénomène d’auto-clivage, le
prodomaine est éliminé permettant l’activation de la MMP. Comme l'auto-clivage a lieu après
la migration des protéines, la proforme conserve sa masse moléculaire apparente plus
importante. La distance de migration électrophorétique de la proforme est donc moins
grande que celle de la forme active. La zymographie permet donc de révéler et de distinguer
les proformes et les formes actives des MMPs.
II.9.2. Zymographie en gel de gélatine
Ce type de zymographie permet en autre la révélation des gélatinases (MMP-2 et
MMP-9). Dans la préparation du gel de polyacrylamide à 10 % (p/v), 0,1 % (p/v) de gélatine
est ajouté au mélange. La gélatine se prépare par dissolution de 1 g pour 100 ml d’eau
distillée en chauffant à +50°C. Elle est alors aliquotée et congelée à -20°C. Avant usage et
après décongélation, la gélatine est chauffée 30 minutes à +37°C dans un bain. Les
échantillons sont mis en suspension dans du tampon échantillon dans un volume de 25 µl au
maximum, sans réduction au DTT. La migration des échantillons se fait dans les mêmes
conditions qu’une PAGE-SDS.
Après migration des échantillons, le gel est démoulé et placé 2 fois pendant 30 minutes
dans un bain d'eau distillée contenant 2,5 % (p/v) de Triton X-100. Le Triton X-100 déplace
le SDS fixé aux protéines et permet donc leur renaturation. Le gel est ensuite incubé
pendant 18 heures à +37°C dans un tampon Tris-HCl 50 mM CaCl2 5 mM Triton X-100 0,02
% (p/v) pH 7,6. Les MMPs sont calcium-dépendantes d’où l’addition de CaCl2 dans le
tampon d’incubation. Après incubation, le gel est coloré à l’aide d’une solution de bleu de
Coomassie G-250 (bleu de Coomassie G-250 0,1 % (p/v), acide acétique 10 % (v/v),
méthanol 40 % (v/v)).
Après décoloration à l’aide d’une solution d’acide acétique à 10 % (v/v) et de méthanol
à 20 % (v/v), le gel est étudié à l’aide d’un système d’analyse d’image BioProfil couplé au
logiciel BioCapt. La quantification de la dégradation se fait par la mesure de l’intensité et de
surface. Les résultats sont exprimés en volume de dégradation. Le gel est ensuite séché
entre 2 feuilles de cellophanes par un courant d’air chaud pendant 1 heure 30.
Comme témoin positif, de la proMMP-2 ou de la MMP-2 activée en présence de 1 mM
d’APMA ont été déposées en parallèle. Comme témoin négatif, 10 mM d’EDTA ont été
ajoutés au tampon d’incubation. La zone de linéarité de l’activité enzymatique est obtenue
entre 10 et 200 pg d’enzyme [Kleiner D.E., 1994].
43
Matériels et Méthodes
II.9.3. Zymographie inverse en gel de gélatine
Le principe est identique à celui de la zymographie. 20 ng/ml de MMP-2 activée en
présence de 1 mM d’APMA pendant 18 heures à +4°C, sont ajoutés au mélange acrylamide
15 % (p/v) / gélatine 0,1 % (p/v). Pendant l’incubation, la MMP-2 dégrade la gélatine hormis
les zones où les TIMPs sont présents. Ainsi seules ces zones apparaissent après coloration
du gel au bleu de Coomassie [DeClerck Y.A., 1988].
Du TIMP-1 ou du TIMP-2 ont été déposés en parallèle comme marqueur. La zone de
linéarité est obtenu entre 10 et 60 pg d’inhibiteur [Oliver G.W., 1997].
II.9.4. Zymographie en gel de caséine-plasminogène
Ce type de zymographie permet la mise en évidence des activateurs du plasminogène
de type urinaire (uPA) ou urokinase et de type tissulaire (tPA) [Heussen C., 1980]. Dans la
préparation du gel de polyacrylamide à 10 % (p/v), 1 mg/ml d’α-caséine et 10 µg/ml de
plasminogène sont ajoutés au mélange. Après migration électrophorétique et élimination du
SDS, le gel est incubé pendant 18 heures à +37°C dans un tampon Glycine 100 mM, EDTA
5 mM pH 8,0. Après coloration du gel au bleu de Coomassie, des zones blanches
apparaissent résultant d’une activité caséinolytique due à la présence de plasmine après
activation du plasminogène.
Comme témoin positif, de l’uPA a été déposé en parallèle. Comme témoin négatif, 2
mM de PMSF ont été ajoutés au tampon d’incubation. La présence d’EDTA dans le tampon
d’incubation inhibe l’activité caséinolytique de MMPs tels que les stromélysines. En parallèle,
un gel caséine sans plasminogène doit être réalisé afin de vérifier que les zones de lyse
observées ne soient pas dues à l’action d'autres sérine protéinases.
II.10. Etude des interactions biomoléculaires en temps réel
Le phénomène optique de résonance plasmonique de surface (SPR) permet la mesure
en temps réel des interactions entre deux molécules [Fagerstam L.G., 1992]. Le système de
détection enregistre les changements de concentration massique de macromolécules
présentes à la surface d’une fine couche métallique appelée sensor chip. Ces variations sont
visualisées dans un graphique, appelé sensorgramme, où sont représentées les variations
de résonance en fonction du temps (les variations de résonances étant exprimées en unité
de résonance ou RU). A titre d’exemple, la liaison de 1 ng d’une protéine par mm2 à la
surface d’une sensor chip entraîne une variation du signal de 1000 RU.
L’étude des interactions acide gras / protéine en temps réel par SPR est réalisé à l’aide
d’un appareil BIAcore X. Une sensor chip permettant la liaison de molécule hydrophobe
(sensor chip HPA) est employée pour l’ensemble des expérimentations.
44
Matériels et Méthodes
Un débit de 5 µl/min est appliqué au flux liquidien et l’appareil est thermostaté à +25°C.
Dans un premier temps, la sensor chip est rincée pendant 5 min par une solution de n-octyl
β-D-glucopyranoside à 40 mM dans l’eau. 20 µl d’une solution d’acide gras à 8 mM dans le
DMSO sont injectés après l’étape de lavage (1 acide gras par sensor chip HPA). Le
processus d’adsorption spontanée de l’acide gras sur la surface de la sensor chip est
mesuré. Quand le signal du sensorgramme devient stable, le débit du flux liquidien est
augmenté brièvement à 100 µl/min. Cette augmentation permet d’éliminer les multiples
couches lipidiques qui ont pu se former lors du processus d’adsorption spontanée. En
complément, une injection de 10 µl de NaOH à 10 mM est réalisée afin de régénérer la
sensor chip et d’obtenir une ligne de base stable du signal du sensorgramme.
Le recouvrement de la totalité de la surface de la sensor chip est évalué par l’injection
de 10 µl d’une solution de SAB à 0,1 g/l. Selon les données du fabriquant (Pharmacia
Biosensor), une telle injection sur une sensor chip totalement recouverte de plamitoyl-oleoyl
phosphatidylcholine doit entraîner une variation du signal inférieur à 100 RU. Après 1 minute
de passage du tampon d’élution (NaPO4 4,4 mM, NaCl 130 mM, KCl 3 mM pH 7,4), une
variation de 43 RU du signal est observée. Cette valeur étant bien inférieure à la limite
donnée par le constructeur, la sensor chip est donc bien totalement recouverte par l’acide
gras.
Les réactions de liaisons acide gras / protéine sont réalisées à l’aide du même tampon
d’élution et la régénération de la sensor chip est obtenue après l’injection unique de 10 µl de
NaOH à 10 mM. Ces conditions de régénération permettent d’obtenir la même valeur de
ligne de base du signal observée avant l’injection des protéines.
Les constantes de liaison de chaque protéine sont déterminées en duplicata par
l’injection de trois concentrations croissantes de chaque protéine. Les sensorgrammes
obtenus pour chaque concentration d’une protéine étudiée sont rassemblées dans un même
graphique. Les courbes de liaison ainsi obtenues sont analysées par régression non linéaire
à l’aide du logiciel BIAevaluation permettant le calcul des constantes de vitesse d’association
(ka) et de dissociation (kd) ainsi que les constantes à l’équilibre d’association (KA) et de
dissociation (KD). En prenant un modèle de formation d’un complexe binaire :
ka
A + B←

→
AB

kd
La vitesse d’association s’écrit :
d [ AB ]
= ka[ A][B ]
dt
La vitesse de dissociation s’écrit : −
d [ AB ]
= kd [ AB ]
dt
A l’équilibre les vitesses d’association et de dissociation sont égales, soit :
ka[ A][B ] = kd [ AB ] ,
45
Matériels et Méthodes
qui peut être réarrangé pour donner :
kd [ A][B ]
=
= KD
ka [ AB ]
ou
ka [ AB ]
=
= KA
kd [ A][B ]
II.11.
Culture cellulaire
II.11.1. Lignée HT1080
La lignée de cellule HT-1080 a été obtenue à partir de cellules humaines issues d’un
fibrosarcome d’un male caucasien âgé de 35 ans [Rasheed S., 1974]. Le patient est décédé
3 mois plus tard en n’ayant pas subi de chimiothérapie ou de radiothérapie.
Ex vivo, les cellules HT-1080 ont un fort pouvoir tumorigène.
II.11.2. Lignée BZR
La lignée de cellules épithéliales bronchiques BZR a été obtenue à partir de cellules
humaines normales. Ces cellules ont été immortalisées par transfection du gène codant pour
le grand antigène T de SV 40. Elles ont aussi été infectées par l’oncogène v-Ha-ras.
Les cellules BZR sont considérées comme des cellules bronchiques cancéreuses. Ex
vivo, elles sont hautement tumorigènes, invasives et peuvent former des métastases [Ura H.,
1989].
II.11.3. Lignée 16HBE
La lignée de cellules épithéliales bronchiques 16HBE a été obtenue à partir de cellules
humaines normales. Ces cellules ont été immortalisées par transfection du gène codant pour
le grand antigène T de SV 40.
Les cellules 16HBE sont considérées comme des cellules bronchiques cancéreuses.
Ex vivo, elles sont peu tumorigènes et non invasives [Ura H., 1989].
II.11.4. Culture des cellules
Les cellules sont conservées congelées à -180°C dans du milieu minimum essentiel
d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 20 % (v/v) de sérum de veau fœtal (SVF),
10 % (v/v) de DMSO et 1 % (v/v) de pénicilline 100 UI/ml + streptomycine 100 UI/ml
(PEN/STREPTO). Les cellules sont décongelées rapidement à +37°C sous agitation, puis
cultivées en présence de 12 ml de milieu DMEM contenant 20 % (v/v) de SVF et 1 % (v/v) de
46
Matériels et Méthodes
PEN/STREPTO dans des boîtes de 75 cm2 incubées 24 heures à +37°C sous atmosphère
humide et en présence de 5 % (v/v) de CO2. Après 24 heures, le milieu est remplacé par un
volume égal de DMEM avec 10 % (v/v) de SVF et 1 % (v/v) de PEN/STREPTO. Celui-ci est
ensuite changé tous les 3 jours jusqu'à confluence des cellules. A confluence, les cellules
sont détachées de la boîte par addition de 0,25 % (v/v) de trypsine dans du tampon PBS
(KH2PO4 1 mM, Na2HPO4 3 mM, NaCl 155 mM pH 7,4). Après centrifugation à 500 g, le culot
cellulaire est remis en suspension dans du milieu DMEM avec 10 % (v/v) de SVF et 1 % (v/v)
de PEN/STREPTO. Elles peuvent aussi être utilisées pour des études dans les conditions
indiquées dans le texte et les légendes.
II.12. Modèle d’étude de l’angiogenèse
II.12.1. Cellules endothéliales humaines issues de veine ombilicale
Nous nous sommes procuré les cellules endothéliales humaines via la Société
PromoCell. Les cellules sont isolées selon les protocoles standards à partir de tissus
humains normaux [Jaffe E.A., 1973 ; Marin V., 2001].
Les cellules sont transportées en flacon de 25 cm2 contenant 500 000 cellules en
phase de croissance. A réception, le milieu de culture est remplacé par 10 ml de milieu de
base pour cellule endothéliale comportant 0,4 % de supplément de croissance et d’héparine
(ECGS/H), 2 % de SVF, 0,1 ng/ml de facteur de croissance épidermique (EGF), 1 µg/ml
d’hydrocortisone, 1 ng/ml de facteur de croissance fibroblastique basique (bFGF), 50 ng/ml
d’amphotéricine B et 50 µg/ml de gentamicine (milieu EGM). Après 12 à 48 heures
d’incubation à +37°C sous atmosphère humide et en présence de 5 % (v/v) de CO2, la subconfluence des cellules est observée : environ 80 % de la surface de la boîte de culture est
occupé par les cellules. Les cellules sont alors trypsinées, divisées en deux lots et remises
en culture selon les instructions du fabriquant. Une boîte de culture contenant du milieu EGM
(200 µl/cm2) est placée 30 min à +37°C sous atmosphère humide et en présence de 5 %
(v/v) de CO2. Les cellules sont rincées à l’aide d’une solution saline tamponnée par l’Hépès
(solution HBSS, Hépès 10 mM, KH2PO4 1,47 mM, Na2HPO4 8,1 mM, KCl 2,67 mM, NaCl 128
mM pH 7,2) et détachées par addition d’une solution de Trypsine à 0,04 % (v/v) et d’EDTA à
0,03 % (p/v) dans le tampon HBSS (100 µl/cm2). Le détachement des cellules est suivi par
observation sous microscope. Quand environ la moitié des cellules s’est détachée, la boîte
de culture est délicatement agitée afin de détacher toutes les cellules et de bien les
individualiser. Le temps total de trypsinisation ne doit pas dépasser plus de 7 min. L’action
de la trypsine est stoppée par addition d’une Solution Neutralisant la Trypsine (TNS,
albumine sérique bovine 0,05 % (p/v), inhibiteur de trypsine de soja 0,05 % (p/v) dans le
tampon HBSS, 100 µl/cm2). La suspension cellulaire ainsi obtenue est centrifugée pendant 4
47
Matériels et Méthodes
min à 220g. Le surnageant est éliminé et le culot de cellules remis en suspension dans 2 ml
de milieu EGM. 1 ml de cette suspension cellulaire est ensuite distribué dans les boîtes de
culture préalablement placées à +37°C. Les cellules sont observées après 24 heures
d’incubation ; au moins 80 % des cellules doit avoir adhéré. Le milieu de culture est alors
remplacé par du milieu frais. Il est ensuite changé tous les deux jours jusqu’à la subconfluence des cellules.
II.12.2. Formation de structures en pseudo-tube
Les cellules endothéliales cultivées sur un gel épais de Matrigel forment spontanément
des structures en pseudo-tube [Cockerill G.W., 1995 ; Vailhe B., 2001]. Ces structures sont
comparables à des vaisseaux sanguins. Cette propriété est utilisée pour étudier les
phénomènes de formation de néo-vaisseaux ou angiogenèse.
250 µl/puit d’une solution de Matrigel à 10 mg/ml sont déposés stérilement dans une
plaque 24 puits. La formation du gel de Matrigel est obtenue par incubation de la plaque
pendant 30 min à +37°C.
Une culture de cellules endothéliales à sub-confluence est détachée de son support
par addition de trypsine. Après neutralisation de la trypsine et centrifugation pendant 4 min à
220 g, elles sont remises en suspension dans le milieu EGM et amenées à une
concentration de 300 000 cellules/ml après numération sous microscope à l’aide d’une
cellule de Thomas. 100 µl de cette suspension cellulaire sont déposés à la surface du gel de
Matrigel. Après incubation pendant 30 min à +37°C sous atmosphère humide et en présence
de 5 % (v/v) de CO2, permettant l’adhésion des cellules à la surface du Matrigel, 500 µl de
milieu de culture contenant ou ne contenant pas les différents effecteurs sont ajoutés. Après
3 et 14 heures d’incubation à +37°C sous atmosphère humide et en présence de 5 % (v/v)
de CO2, la formation des pseudo-tubes est suivie par observation sous microscope et
photographiée à l’aide d’un appareil photo numérique SONY DKC CM-30. L’activité
protéolytique est évaluée après coloration à l’aide d’une solution de bleu de Coomassie G250 (bleu de Coomassie G-250 0,1 % (p/v), acide acétique 10 % (v/v), méthanol 40 % (v/v))
et décoloration à l’aide d’une solution d’acide acétique à 10 % (v/v) et de méthanol à 20 %
(v/v).
La longueur des pseudo-tubes formés est déterminée selon une méthode semiquantitative décrite par Steenstrup T., et al., 2000, adaptée à nos besoins. A l’aide des
fonctions de retouche d’image du logiciel Adobe Photoshop 5.5 ®, les photo numériques
obtenues sont transformées en noir et blanc. Les pseudo-tubes apparaissent en noir sur un
fond blanc. La couleur noire est sélectionnée et le nombre de pixel noir par rapport au
nombre de pixel total est déterminé. Toutes les photos ayant été prises au même
48
Matériels et Méthodes
grossissement, le nombre de pixel noir par photo est donc proportionnel à la longueur des
pseudo-tubes formés.
II.13. Prolifération / viabilité
Mesure de la prolifération cellulaire par coloration des noyaux au violet cristal
Les cellules sont rincées avec le tampon PBS et fixées par addition d’une solution de
glutaraldéhyde à 1,1 % (v/v) dans le tampon PBS. Après incubation pendant 20 min à
température ambiante, l’excès de glutaraldéhyde est éliminé et les cellules sont rincées
abondamment à l’eau distillée. Après séchage, le noyau des cellules est coloré par addition
d’une solution de violet cristal à 0,1 % (p/v) dans un tampon Hépès 0,2 M pH 6,0 pendant 20
min [Kueng W., 1989]. L’excès de colorant est éliminé. Les cellules sont de nouveau rincées
abondamment et séchées. Le colorant, fixé par le noyau des cellules, est extrait par addition
d’un même volume d’acide acétique à 10 % (v/v) sous agitation pendant 15 min.
L’absorbance à 560 nm de la solution obtenue est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre
lecteur de plaque Titertek Multiscan+. Si l’absorbance mesurée est supérieure à une unité
d’absorbance, la solution est diluée à l’aide d’acide acétique 10 %.
Mesure de la viabilité cellulaire
La toxicité des effecteurs sur les cellules est évaluée selon le test d’exclusion du bleu
Trypan. A la fin de la période d’incubation, le milieu de culture est éliminé. Une solution de
tampon PBS contenant 0,4% (v/v) de bleu Trypan est mis au contact des cellules pendant 5
minutes à +37°C sous atmosphère humide et en présence de 5 % (v/v) de CO2.
Le nombre total de cellules et celui des cellules dont le corps cellulaire est coloré en
bleu sont comptés manuellement par observation microscopique dans 5 champs différents
choisis au hasard. Le pourcentage de cellules viables est estimé selon la formule :
% de viabilité = (nombre total de cellules - nombre de cellules colorées)/nombre total de
cellules *100
Mesure de la prolifération et de la viabilité cellulaire par mesure de la réduction du MMT
Suite à l’action des déshydrogénases mitochondriales des cellules vivantes, le bromure
de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) est réduit en cristaux bleus de
formazan [Mosmann T., 1983].
Le MTT est préparé à 5 mg/ml dans le tampon PBS, stérilisé par passage au travers
d’un filtre de 0,22 µm et conservé à +4°C à l’abri de la lumière.
Après la période d’incubation des cellules en absence ou en présence d’effecteurs,
10 µl de la solution stock de MTT pour 100 µl de milieu de culture sont ajoutés dans chaque
puits et la plaque de culture est incubée pendant 4 heures à +37°C sous atmosphère humide
49
Matériels et Méthodes
et en présence de 5 % (v/v) de CO2. La formation des cristaux bleus de formazan est suivie
par observation sous microscope.
Le milieu de culture est éliminé. Un même volume d’isopropanol est ajouté dans
chaque puits et la plaque est soumise à une forte agitation permettant la dissolution des
cristaux. L’absorbance à 570 nm de la solution obtenue est mesurée à l’aide d’un
spectrophotomètre lecteur de plaque HTS 7000+. Si l’absorbance mesurée est supérieure à
une unité d’absorbance, la solution est diluée à l’aide d’isopropanol.
II.14. Mesure de l’adhérence des cellules
L’adhérence des cellules sur un substrat est évaluée selon une méthode semiquantitative par coloration et mesure de l’absorbance.
Afin que les cellules soient en phase de croissance lors de la mesure de l’adhérence,
celles-ci, à confluence, sont trypsinées et remises en culture un jour avant l’expérimentation.
100 µl/puits d’une solution de concentration croissante du substrat dilué dans le
tampon PBS sont déposés stérilement, en triplicata, dans une plaque transparente de 96
puits. La plaque est incubée pendant 18 heures à température ambiante. Les puits sont
rincés 3 fois avec le tampon PBS et les sites de liaisons aspécifiques sont bloqués par
addition de 100 µl/puits d’une solution de SAB à 1 mg/ml dans le tampon PBS pendant 30
min à +37°C. Les puits sont à nouveau rincés 3 fois avec le tampon PBS.
Les cellules sont détachées de leur support de culture par addition d’EDTA à 2 mM
dans le tampon PBS. Après centrifugation à 500 g, le culot cellulaire est remis en suspension
à la concentration de 2,5 105 cellules/ml dans le milieu DMEM contenant 2 mg/ml de SAB.
100 µl de la suspension cellulaire sont ajoutés dans chaque puits et la plaque est incubée
pendant 60 min à +37°C sous atmosphère humide et en présence de 5 % (v/v) de CO2.
L’attachement des cellules est vérifié par observation sous microscope.
Les cellules n’ayant pas adhéré sont éliminées par lavage des puits avec le tampon
PBS. Les cellules ayant adhéré sont fixées par addition de 100 µl/puits d’une solution de
formaldéhyde à 3,7 % (v/v) dans le tampon PBS. Après incubation pendant 30 min à +37°C,
100 µl/puits de bleu de Toluidine à 1 % (p/v) dans le tampon PBS contenant 3,7 % (v/v) de
formaldéhyde sont ajoutés. La plaque est alors incubée pendant 18 heures à température
ambiante.
Après lavage exhaustif par l’eau distillée, la plaque est séchée et le colorant fixé par
les cellules est extrait par addition de 100 µl/puits d’une solution d'eau distillée contenant 2
% (p/v) de SDS. La plaque est maintenue sous agitation pendant 15 min. L’absorbance à
600 nm est alors mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre lecteur de plaque HTS 7000+.
50
Matériels et Méthodes
II.15. Extraction des protéines membranaires au RIPA
Les cellules à confluence sont rincées deux fois à l’aide d’un tampon PBS. L’ensemble
des étapes suivantes est effectué à +4°C pour éviter tout phénomène de dénaturation ou de
dégradation des protéines. Les cellules sont recueillies par grattage dans le tampon PBS. La
suspension cellulaire ainsi obtenue est centrifugée pendant 5 minutes à 200 g. Le culot
cellulaire est remis en suspension dans le tampon RIPA : Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM,
Nonidet-P40 1 % (v/v), Triton X-100 1 % (v/v), déoxycholate de sodium 1 % (p/v), SDS 0,1 %
(p/v), iodoacétamine 5 mM, PMSF 1 mM pH 7,4 (100 µl/puits pour des cellules cultivées en
plaque 6 puits). Afin de solubiliser les protéines membranaires, la suspension cellulaire est
agitée activement par 5 allers et retours au travers d’une aiguille de 21G et incubée pendant
15 min. Après centrifugation à 12 500 g pendant 5 min, le surnageant est récolté et son
contenu en protéine est déterminé selon la Méthode de Lowry.
II.16. Mise en évidence du récepteur de l’élastine
de 67 kDa
Les cellules à confluence sont rincées deux fois à l’aide d’un tampon PBS. L’ensemble
des étapes suivantes est effectué à +4°C pour éviter tout phénomène de dénaturation ou de
dégradation des protéines. Les cellules sont recueillies par grattage dans un tampon HEPES
10 mM, sucrose 8% (p/v), EDTA 1 mM, NEM 1 mM, PMSF 2 mM, DTT 0,5 mM pH 7,6. La
suspension cellulaire ainsi obtenue est soumise aux ultrasons 3 fois pendant 10 secondes
puis centrifugée pendant 5 minutes à 4000 g. Le surnageant est récolté et ultracentrifugé à
100 000g pendant 1 heure. Après élimination du surnageant, le culot est remis en
suspension dans 1 ml de Tampon Tris-HCl 50 mM, NaCl 140 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM,
NEM 1 mM, PMSF 2 mM, DTT 0,5 mM, NaN3 0,02 % (p/v), Nonidet-P40 2 % (p/v) pH 7,6.
Cette suspension est alors soumise à une forte agitation pendant 24 heures afin de
solubiliser les protéines membranaires. Après centrifugation à 10 000 g pendant 10 min, le
surnageant est conservé et dialysé exhaustivement contre un tampon bicarbonate de sodium
100 mM, EDTA 5 mM, NEM 2 mM, PMSF 2 mM pH 8,0. Le dialysât est transféré dans un
microtube contenant 50 µl d’une suspension d’élastine-sépharose. L’ensemble est maintenu
sous agitation constante pendant 18 heures puis centrifugé 30 secondes à 1500 rpm. Le
surnageant est éliminé. Le culot d’élastine-sépharose est alors rincé 3 fois par 1 ml de
tampon bicarbonate de sodium 100 mM, EDTA 5 mM, NEM 2 mM, PMSF 2 mM pH 8,0.
Après le dernier lavage, le culot est remis en suspension dans 20 µl de tampon échantillon
PAGE-SDS en présence de DTT. Les échantillons obtenus sont ensuite analysés par
électrophorèse en gel de polyacrylamide 10 % (p/v). Après migration, les protéines
présentes sont électrotransférées et immuno-révélées à l’aide d’un anticorps anti-récepteur
51
Matériels et Méthodes
de l’élastine fourni par le Dr. Bob MECHAM, Department of Cell Biology and Physiology,
Washington University School of Medicine, St. Louis, USA.
II.17. Mesure du potentiel invasif en Chambre de Boyden
Les capacités invasives des cellules ont été déterminées par mesure de leur migration
au travers un filtre recouvert d’une matrice protéique selon la technique modifiée de la
« Chambre de boyden » [Polette M., 1998 ; Simon N., 1992]. Pour cela, des filtres de 13 mm
de diamètre possédant des pores de 8 µm ont été utilisés.
Avant utilisation, les filtres sont préalablement tapissés par 2 x 100 µl d’une solution de
Matrigel à 125 µg/ml, pour les expériences avec les cellules 16HBE et BZR, ou à 250 µg/ml,
pour celles avec les cellules HT-1080. Le Matrigel est un extrait de membrane basale de
tumeur d’Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) constitué majoritairement de collagène de type IV,
de laminine et de protéoglycanes à héparane sulfate [Kleinman H.K., 1986]. A 37°C, il forme
spontanément un gel mimant une membrane basale et permet d’évaluer le potentiel invasif
des cellules. Lors de l’étude des propriétés invasives des cellules HT-1080 au travers des
filtres recouverts de collagène de type I, 2 x 100 µl d’une solution de collagène de type I à
100 µg/ml ont été déposés. Entre chaque application et avant expérimentation, les filtres
sont évaporés sous une hotte à flux laminaire pendant 18 heures. 200 µl de milieu DMEM
contenant les chemoattractants, le SVF à 10 % (v/v) et la SAB à 2 % (p/v), sont déposés
dans le compartiment inférieur de la chambre. Les filtres, préalablement réhydratés à l’aide
de milieu DMEM pendant 30 min, sont délicatement déposés à la surface du milieu DMEM
avec les chemoattractants. 100 000 cellules, en suspension dans un milieu DMEM sans
sérum contenant 0,2 % de SAB (p/v), en absence ou en présence d’effecteur, sont déposées
dans le compartiment supérieur, situé au dessus du filtre. Les « Chambres » sont alors
mises à incuber à +37°C sous atmosphère humide et en présence de 5 % (v/v) de CO2.
A la fin de la période d’incubation, les filtres sont rincés à l’aide d’une solution de PBS
et les cellules sont fixées à l’aide de méthanol 100 % pendant 10 min, puis colorées par
l’hématoxyline pendant 5 min. Les filtres sont abondamment rincés à l’eau et déposés sur
des lamelles couvre-objets, face inférieur vers le bas. Le Matrigel ainsi que les cellules
n'ayant pas traversé le Matrigel sont éliminés mécaniquement. Les cellules ayant migré et
été fixées sur la face inférieur du filtre, sont comptées par observation sous microscope,
dans 30 champs à un grossissement de 40 fois, choisis au hasard.
Les expériences ont été reproduites trois fois en triplicata. Les valeurs moyennes du
nombre total de cellules comptées sont déterminées et exprimées avec l’erreur standard de
la moyenne (SEM).
52
Matériels et Méthodes
II.18. Préparation des cellules cultivées en gel de Matrigel
pour observation par microscopie électronique à
balayage
Après la période d’incubation des cellules cultivées sur gel de Matrigel, celles-ci sont
fixées par addition d’une solution de glutaraldéhyde à 2,5 % (v/v) dans le tampon PBS.
Après incubation pendant 2 heures à température ambiante, les gels sont rincés 3 fois 10
min avec le tampon PBS. Afin de permettre une observation de la structure interne du gel de
Matrigel, les échantillons sont plongés dans de l’azote liquide, puis fracturés par chocs
mécaniques. Pour cela, les gels sont au préalable transférés dans des cassettes
métalliques.
La déshydratation des gels est obtenue par passage dans des solutions alcooliques de
concentrations croissantes : éthanol à 50°, 10 min ; éthanol 70°, 10 min ; éthanol 95°, 10
min ; éthanol 100°, 2 fois 10 min ; éthanol 100°, 15 min.
Les échantillons sont amenés au point de température critique (+41°C sous 73
atmosphère) permettant un passage continu de la phase liquide à la phase gazeuse. A
volume constant, la température d’un liquide (le CO2) est élevé au dessus de celle de son
point critique ; pour ce faire un appareil à point critique Baltec CPD 030 est employé. Au
préalable, les échantillons sont plongés dans une solution d’éthanol-acétone (1/1 ; v/v)
pendant 15 min puis dans de l’acétone pur ( 2 fois 10 min).
Les gels sont finalement métallisés à l’or palladium dans un évaporateur JEOL ION
SPUTTER JFC-1100 (8 mA, 1,2 kV) et observés à l’aide d’un microscope électronique à
balayage JEOL 5400 LV.
II.19. Extraction des ARN totaux
Les ARN totaux de cellules en culture sont obtenus selon la méthode d’extraction à
l’isothiocyanate de guanidium [Chomczynski P., 1987 ; MacDonald R.J., 1987].
Le culot de cellules, issu de la trypsinisation d’une boite de culture de 25 cm2, est remis
en suspension dans une solution d’acétate de sodium à 25 mM pH 6,0 contenant 4 M
d’isothiocyanate de guanidium et 120 mM de 2-mercaptoéthanol. La suspension cellulaire
est agitée activement par 5 allers et retours au travers d’une aiguille de 21G et déposé
délicatement sur le coussin d’un gradient de CsCl (0,9597 g/cm3) dans un tube à
ultracentrifugation. Les tubes sont centrifugés à 104 000 g pendant 21 heures à +20°C.
Après élimination du surnageant, le culot est repris dans 300 µl d’eau milli-Q autoclavée. 30
µl d’une solution d’acétate de sodium à 3 M pH 5,2 et 100 µl d’éthanol absolu sont alors
ajoutés. La précipitation des ARN totaux est obtenue après incubation à -20°C pendant 18
53
Matériels et Méthodes
heures. Les ARN totaux sont récoltés par centrifugation à 12 000 g pendant 5 min à +4°C,
lavés à l’aide d’une solution d’éthanol à 70 % (v/v) et remis en suspension dans de l’eau
milli-Q autoclavée.
La concentration en ARN est déterminée par mesure de l’absorbance à 260 nm. Une
unité d’absorbance correspond à 40 µg/ml d’ARN.
II.20. RT-PCR semi-quantitative
La RT-PCR semi-quantitative permet de comparer les variations relatives d’expression
de gènes en les comparant à celle d’un gène « domestique » dont l’expression est
constante. Elle comporte deux étapes : une étape de transcription inverse (ou RT),
permettant de synthétiser l’ADNc à partir des ARN totaux, et une étape d’amplification par
réaction de polymérisation en chaîne (ou PCR) de l’ADNc.
L’étude par RT-PCR de l’expression de gènes est réalisé à l’aide du kit GeneAmp
Thermostable RNA PCR Kit et d’un appareil GeneAmp® PCR System 9700.
10 ng d’ARN totaux de cellules cultivées en absence ou en présence de 50 µg/ml de
kE sont utilisés pour cela ainsi que deux paires d’oligonucléotides pour chaque gène analysé
dont les séquences sont données :
MMP-2 humaine :
• sens
5’-GGCTGGTCAGTGGCTTGGGGTA-3’
• anti-sens
5’-AGATCTTCTTCTTCAAGGACCGGTT-3’
MT1-MMP humaine :
• sens
5’-CCATTGGGCATCCAGAAGAGAGC-3’
• anti-sens
5’-GGATACCCAATGCCCATTGGCCA-3’
TIMP-2 humain :
• sens
5’-GTCATCTTGATCTCATAACGCTGG-3’
• anti-sens
5’-AGCCCATCTGTACCTGTGGTTCA-3’
MMP-1 humaine :
• sens
5’-GAGCAAACACATCTGAGGTACAGGA-3’
• anti-sens
5’-TTGTCCCGATGATCTCCCCTGACA-3’
28S :
• sens
5’-GTTCACCCACTAATAGGGAACGTGA-3’
• anti-sens
5’-GATTCTGACTTAGAGGCGTTCAGT-3’
54
Matériels et Méthodes
La transcription inverse est réalisée à +70°C pendant 15 min, suivie d’une incubation
pendant deux minutes à +95°C permettant la dénaturation des hétéroduplexes ARN-ADN.
L’amplification est effectuée par une série d’incubations successives ou cycles :
• à +94°C pendant 15 sec pour la dénaturation des ADN double brin,
• à +68°C pendant 20 sec pour l’appariement des oligonucléotides,
• à +72°C pendant 10 sec pour l’élongation des séquences.
Pour chaque gène dont l’expression est analysée, le nombre de cycles est déterminé de
manière à se situer dans la phase exponentielle de l’amplification par PCR, permettant ainsi
l’analyse semi-quantitative de l’expression du gène, soit 30 cycles pour les gènes de la
MMP-1 et de la MMP-2, 25 cycles pour les gènes de la MT1-MMP et du TIMP-2 et 19 cycles
pour celui de la 28S. L’amplification est terminée par une étape supplémentaire d’élongation
de deux minutes.
Les produits de RT-PCR ainsi obtenus sont séparés par PAGE (polyacrylamide 10 %
(p/v), Tris 90 mM, acide borique 90 mM, EDTA 2 mM pH 8,0). Après migration (Tris 90 mM,
acide borique 90 mM, EDTA 2 mM pH 8,0), ces produits sont visualisés à l’aide d’un agent
intercalant fluorescent. Le gel est analysé après capture d’image en fluorescence à l’aide du
système LAS-1000. L’intensité de fluorescence mesurée est proportionnelle à la quantité
d’ADN amplifié présent. Les intensités de fluorescence sont rapportées à celle mesurée pour
le gène domestique (28S) permettant ainsi l’analyse semi-quantitative de l’expression des
gènes dans les cellules en fonction des conditions de cultures.
II.21. Evaluation statistique
Les études statistiques ont été réalisées suivant le test t de Student. Les valeurs
moyennes sont déterminées et exprimées avec l’erreur standard de la moyenne (SEM).
Les différences entre les valeurs des moyennes sont considérées statistiquement
significative quand P est inférieur à 0,05.
* P < 0,01. ** P < 0,005.
*** P < 0,001.
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