Mémoire Soutenue publiquement Contribution à l`étude de

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UNIVERSITE KASDI MERBAH - OUARGLA
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Département des Sciences Biologiques
N° d’enregistrement
Mémoire
En vue de l'obtention du Diplôme de
MAGISTER
Spécialité: Biologie
Option : Biochimie et Analyse des Bioproduits
Présentée par: Kebili Zohra
Contribution à l’étude de quelques activités
biologiques des extraits de Ephedra alata de la
région de Ouargla
Soutenue publiquement
Le: 28-01-2016
Devant le jury composé de
Mme BISSATI-BOUAFIA Samia
Professeur
U.K.M. Ouargla
Présidente
Mr HADJ MAHAMMED Mahfoud
Professeur
U.K.M. Ouargla
Rapporteur
Mme DEHAK Karima
M.C.A
U.K.M. Ouargla
Examinatrice
Mme SIBOUKEUR Oumelkheir
Professeur
U.K.M. Ouargla
Examinatrice
Mme BOUDJENAH Saliha
M.C.A
U.K.M. Ouargla
Examinatrice
Remerciements
Avant tout, je remercie Dieu le tout puissant de m’avoir accordé la force, le courage et les
moyens afin de pouvoir accomplir ce modeste travail.
Je tiens à exprimer mes vifs remerciements et toute ma reconnaissance à l’égard de
Monsieur HADJ MAHAMMED Mahfoud, Professeur à l'Université Kasdi Merbah- Ouargla
pour avoir accepté de diriger ce travail et son accueil au laboratoire de Biogéochimie des
Milieux Désertiques, qu’il trouve ici l’expression de ma profonde gratitude.
Ma gratitude s’adresse aussi à Mme DEHAK Karima, M.C.A à l'Université Kasdi MerbahOuargla pour avoir accepté de co-diriger ce travail, mais aussi pour son enthousiasme
commutatif, sa compétence, sa disponibilité et surtout sa patience, qu’elle trouve ici l’expression
de ma profonde reconnaissance, j'ai beaucoup appris de vous.
J’adresse mes sincères remerciements à Mme BISSATI BOUAFIA Samia, Professeur à
l'Université Kasdi Merbah- Ouargla, pour l’honneur qu’elle me fait de présider le jury et
d’évaluer ce travail ; qu’elle trouve ici l’expression de ma grande reconnaissance.
Je suis très sensible à l’honneur que me font Mme SIBOUKEUR Oumelkheir, Professeur, et
Mme BOUDJENAH Saliha, Maitre de Conférences A, à l'Université Kasdi Merbah- Ouargla,
en acceptant d'examiner ce travail et de faire partie du jury. Qu’elles trouvent ici mes sincères
remerciements. Permettez-moi de vous exprimer ma profonde gratitude et mon profond respect.
J’aimerais également exprimer ma gratitude à Monsieur EDDOUD Amar, Maitre Assistant A,
à l'université Kasdi Merbah Ouargla, qu'il trouve ici ma profonde reconnaissance pour son aide
précieuse m'ayant permis la valorisation statistique des résultats, mais aussi pour sa patience
malgré ses nombreuses préoccupations.
J’exprime aussi mes remerciements et ma gratitude à Melle HAMMOUDI R. M.C.B à l'Université
Kasdi Merbah- Ouargla pour tout…, et à tout le personnel du laboratoire de Biogéochimie des
milieux désertiques (UKMOuargla), pour leurs encouragements et leurs aides précieuses durant toute la
période de ma formation en Magister.
Dédicace
À la bougie qui est la source de la lumière de ma vie, qui se fond toujours
pour éclairer ma route, à mon cher père je dédie ce travail et je lui souhaite
une longue belle vie;
À la fleur qui rehausse et aromatise mes jours, qui garde les nuits pour que
je me rendorme, à ma très chère mère je dédie ce travail et je lui souhaite une
longue belle vie
À mes sœurs; Houaria et Nacira;
À mes frères; Ahmed, Sahraoui et Mokhtar;
A la mémoire de mon frère Abdallah
A toute ma famille pédagogique
- a tous mes enseignants de l’université de KASDI MERBAH-Ouargla
-A mes collègues de la promotion de magister "Biochimie et analyse de
bioproduits"
-A tous les membres du laboratoire de Biogéochimie des Milieux Désertiques de
l’université KASDI MERBAH-Ouargla
À toute ma famille de près ou de loin
À toutes mes amies
À tous ceux qui me connaissent
Je dédie ce modeste travail
Zohra Kebili
Liste de figures
Figure1: Répartition géographique de l'Ephedra dans le monde.
Figure 2: Ephedra alata alenda (N'Goussa "Novembre 2014") (originale)
Figure 3: Illustration de la méthode des aromatogrammes sur boîte de Pétri.
Figure 4: Schéma du mécanisme réactionnel invoqué dans la détoxification enzymatique.
Figure 5: Principaux hétérocycles de base et leurs précurseurs.
Figure 6: Exemple de biosynthèse de certains dérivés de phénylalanine.
Figure 7: Squelette de base et numérotation adoptée des flavonoïdes.
Figure 8: Les diverses classes de flavonoïdes d’après Buneton (2009).
Figure 9: Biosynthèse des flavonoïdes.
Figure 10: Mécanisme réactionnel intervenant lors du test DPPH entre l'espèce radicalaire et un
antioxydant (AH)
Figure 11: Mécanisme réactionnel intervenant lors du test FRAP entre le complexe
tripyridyltriazine ferrique (Fe(III)-TPTZ) et un antioxydant (AH).
Figure 12: Répartition en pourcentage de l'échantillon enquêté selon la connaissance de la plante
et de ses utilisations.
Figure13: Répartition en moyenne d'âge de l'échantillon selon la connaissance de la plante et de
ses utilisations
Figure 14: Fréquences de différentes utilisations de l'E.alata selon l'enquête ethnobotanique
Figure 15: Sensibilité des trois souches envers les différents extraits de l'Ephedra alata alenda.
Figure 16: Pouvoir inhibiteur des différents extraits de l'Ephedra alata alenda sur la croissance
de Pseudomonas aeruginosa
de Escherichia coli
de Staphylococcus aureus
Figure 19 (a-f): Courbes d'étalonnage de l'acide ascorbique et des différents extraits de l'E.alata
alenda.
Figure 20: Comparaison de l'IC50 de différents extraits avec celui de l’acide ascorbique.
Figure 21 (a-b): Courbes d'étalonnage de l'acide ascorbique et de la quercétine
Figure 22: Pouvoir antioxydant de différents extraits de l'E.alata alenda classés par ordre
décroissant
Figure 23 (a-b): Courbes d'étalonnage de l'acide gallique et de la catéchine.
Figure 24: Teneur en polyphénols totaux des différents extraits de l'E.alata alenda classés par
ordre décroissant
Figure 25: Courbe d'étalonnage de la rutine
Figure 26: Teneur en flavonoïdes des différents extraits de l'E.alata alenda classés par ordre
décroissant
Figure 27: Chromatogrammes des extraits alcaloïdiques avec la PSE sous forme de base libre
(A) et sous forme de sel (B)
Figure 28: Chromatogramme de l'extrait alcaloïdique de l'E.alata alenda obtenu par GC/MS
Figure 29: Spectre de référence de la pseudoéphédrine
Figure 30: Spectre correspondant au pic de tR= 16.05 min.
Figure 31: Image montrant le précipité rouge pour les tanins catéchiques dans la partie aérienne
et une teinte bleue noire pour les tanins galliques dans la partie souterraine.
Figure 32: Mise en évidence de la présence des O- hétérosides à génine réduite dans la partie
aérienne et leur absence dans la partie souterraine.
Liste des tableaux
Tableau 1: Principaux alcaloïdes isolés du genre Ephedra autres que l'éphédrine
Tableau 2: Liste de quelques espèces réactives.
Tableau 3: Les principales classes de composés phénoliques.
Tableau 4: Données climatiques de la région d’Ouargla de 1958 à 2014.
Tableau 5: Conditions chromatographiques de séparation des alcaloïdes.
Tableau 6: Mise en évidence de la présence ou de l'absence de certaines familles de métabolites
secondaires dans l'E.alata alenda.
Tableau 7: Rendement et aspect des extraits.
Tableau 8: Effet des différents extraits de l'Ephedra alata alenda sur les trois souches
bactériennes (zone d'inhibition en cm)
Tableau 9 : Effet des deux parties de la plante dans l'activité antibactérienne.
Tableau 10: Valeurs de l’IC50 exprimée dans différentes unités
Tableau 11: Extraits à faible pouvoir réducteur du radical DPPH.
Tableau 12: Pouvoir antioxydant des différents extraits de l'E.alata alenda selon le test FRAP.
Tableau 13: Contribution des parties aérienne et souterraine à l'activité antioxydante.
Tableau 14: Teneur en polyphénols totaux des différents extraits de l'E.alata alenda obtenus par
macération dans des solvants de polarité croissante
Tableau 15: Teneur en polyphénols totaux dans les parties aérienne et souterraine de l'Ephedra
alata alenda
Tableau 16: Teneur en flavonoïdes dans les différents extraits de l'E.alata alenda obtenus par
Tableau 17: Teneur en flavonoïdes dans les parties aérienne et souterraine de l'Ephedra alata
alenda
Tableau 18: Résultats de CCM des extraits alcaloïdiques de l'E.alata alenda
Tableau 19: Résultats de CCM des extraits alcaloïdiques de l'E.alata alenda et de
pseudoéphédrine
Tableau 20: Résultats de CCM de quelques composés phénoliques
Tableau 21: Résultats de CCM de quelques composés terpéniques
Liste des abréviations
Abs: absorbance
AcOEt: acétate d'éthyle
ATB: antibiotique
CAT: Catalase
CCM : Chromatographie sur couche mince
C-Hex: Cyclohexane
CP: Chromatographie sur papier
CPG-SM ou GC-MS: chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse
CPT: Composés phénoliques totaux (Total Phenolic Contents)
DCM: Dichlorométhane
DEA: Diéthylamine
DMSO: diméthylsulfoxyde
E.coli: Escherichia coli
ERO: espèces réactives de l'oxygène
ERN: espèces réactives du nitrogène
EtOH: éthanol
GPx: Glutathion peroxydase
GR: Glutathion réductase
GSH: Glutathion
MeOH: méthanol
MCV: Maladie cardiovasculaire
n-ButOH: n-butanol
P. aeruginosa: Pseudomonas aeruginosa
PAL: phényl ammonia lyase
PSE: pseudoéphédrine
SAM: S-Adénosyl-méthionine
S. aureus : Staphylococcus aureus
SNC: système nerveux central
SOD: Superoxide dismutase
UFC: Unités formant colonies (Colony forming units)
V.S: vanilline sulfurique
SOMMAIRE
Introduction………………………………………………...………………………………………….….1
Chapitre I: Etude bibliographique
I-1-Généralités sur la plante……………..……..…………………………………………………….…..3
I-1-1-Genre Ephedra…………………………..…….………………………………………………….....3
I-1-2-Sous espèce Ephedra alata alenda…………...………….…………………………………………..4
I-1-2-1-Position systématique………………………………………………………………………..........4
I-1-2-2-Description botanique…………………………………………………………………………….4
I-1-2-3-Répartition géographique…………………..……………………………………...………..........5
I-1-2-4-Utilisation ………………………………...…………………………………………………….....5
I-1-2-5-Pharmacologie …………………...………………………………………………………...….….6
I-1-2-6-Toxicologie………………...……………………………....………………………………….…...7
I-1-2-7-Travaux antérieurs…………………...…………………………………………………………..7
I-1-2-7-1- Activités biologiques de la plante…………………......………………………………………7
I-1-2-7-2-Chimie de la plante …………………………...……………………………………………..…8
I-2- Activité antibactérienne………...………………………………………………………………......11
I-2-1- Antibiotiques………...…………………………………………………………………………….11
I-2- 2- Méthodes de détermination de l’activité antibactérienne………………...……………………12
I-2- 2-1- Aromatogramme………………...…………………………………………………………..…12
I-2- 2-2-Méthode de diffusion en puits…………………………...……………………………………..13
I-2- 2-3-Technique de micro-atmosphères……………...………………………………………………13
I-2- 2-4-Méthodes de dilutions en bouillon et gélose……………………...……………………………14
I-2- 3- Association d'antimicrobiens …………………………...……………………………...………..14
I-3- Activité antioxydante…………...………………………………………………………………...…15
I-3-1-Radicaux libres…………………...…………………………………………………..……………16
I-3-2-Stress oxydatif- effets et conséquences…………...………………………………………………17
I-3-3-Défense antioxydante…………………………………………………………………...................18
I-3-4-Principaux tests d’activité antioxydante…………...………………………………...…..………20
I-4- Métabolites secondaires………………………………………………………...…………………..21
I-4-1-Alcaloïdes………………...……………………………………….……………...………………...21
I-4-1-1-Définition……………...…………………………………………………………………………21
I-4-1-2-Nomenclature…………………………………………………………………………................21
I-4-1-3-Classification…………………………………………………………………………………….21
I-4-1-4-Propriétés physico-chimiques…………………………………………………..………………22
I-4-1-5-Distribution….……………………………………………………………………..…................22
I-4-1-6-Localisation…….…………………………………………………………………..………...….23
I-4-1-7-Origine biosynthétique…….…………………………………………….…………………...…23
I-4-1-8- Intérêts des alcaloïdes………………………………………………………..……………....…25
I-4-2-Polyphénols: Flavonoïdes …………….………....……………………...……………................…26
I-4-2-1-Structure et classification………………………………………………………………...…......27
I-4-2-2-Extraction, séparation et identification………………………………………………...………29
I-4-2-3-Distribution et localisation……………………………………………………………...….…...30
I-4-2-4-Biosynthèse des Flavonoïdes…………………………………………………….……...…........31
I-4-2-5-Intérêts des flavonoïdes………………………………………………………………...….……33
Chapitre II: Matériels et méthodes
II-1-Matériel végétal……………………………………….………………………………….…….…...35
II-2-Présentation du site de récolte………………………………………………….………...……..…35
II-3-Enquête ethnobotanique ……………………………….…………...……………….………..…....37
II-4- Tests phytochimiques préliminaires……………………………………………………………....37
II-5-Extractions………………………………...…………………..………………………...……….….41
II-5-1-Extraction des alcaloïdes………………………………...…………..……………………….…..41
II-5-1-1-Principe de l'extraction des alcaloïdes……………………………….……..........…..………..41
II-5-1-2-Extraction des alcaloïdes totaux……………………………….……………….…….……….42
II-5-1-3-Extraction sélective de l'Ephédrine………………………………..…..………………….….42
II-5-2-Extraction des composés phénoliques ………………………………………………………......43
II.6-Activités biologiques…………………………………………………………………………..…….44
II-6-1-Activité antibactérienne…..……………………………………………………………………...44
II-6-1-1-Souches ciblées………………..……………………………………………………………...…44
II-6-1-2-Méthode de détermination de l’activité antibactérienne…..………………………………...45
II-6-2-Activité antioxydante………..……………………………………………….………………..….45
II-6-2-1-Test du piégeage du radical libre DPPH…………………….…………………………….….45
II-6-2-1-1-Principe du test………………..……………………………………………………………...45
II-6-2-1-2-Protocole de l'activité anti-radicalaire par le test DPPH……………………………….…46
II-6-2-2-Test de FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power)………………………….…….............47
II-6-2-2-1-Principe du test ………………………………..…………………….………………...…..…47
II-6-2-2-2-Protocole du test de l'activité antioxydante via le test FRAP………………………..……47
II-7-Dosage quantitatif des composés phénoliques……………………………………………............48
II-7-1-Détermination de la teneur en composés phénoliques totaux (CTP)......................................…48
II-7-2-Dosage des flavonoïdes…………………………………………………………….......................48
II-8-Analyses statistiques………...………………………………………………………………………49
II-9-Analyses chromatographiques...……………………………………………………………...........49
II-9-1-Chromatographie sur couche mince de gel de silice………………………………………..…..49
II-9-1-1-Mise en œuvre de l’analyse par CCM…………………………………………………………50
II-9-2-Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse, GC-MS.................51
II-9-2-1-Conditions expérimentales utilisées en GC-MS…………………...………………………….51
Chapitre III: Résultats et discussions
III-1-Enquête ethnobotanique……………………..…………………………........................................53
III-2-Tests phytochimiques préliminaires………...……..………………………………………..……56
III-3-Extractions………..………………………………………………………………………………..57
III-4- Activités biologiques……………………………………………………………………..….….…58
III-4-1- Activité antibactérienne ……………………………….……………………………………….58
III-4-2-Activité antioxydante……………………..…………………………………………...………...65
III-4-2-1-Pouvoir de piégeage du radical libre DPPH.………………….……………………...….......65
III-4-2-2-Pouvoir antioxydant estimé par le Test de FRAP...................................................................68
III-5-Dosage quantitatif des composées phénoliques..…...…………..…………………….…………..71
III-5-1-Teneur en composés polyphénoliques totaux (CPT)….……………...………..………………71
III-5-2-Teneur en flavonoïdes…………...……………………………………………….……………...74
III-6-Corrélations entre les activités biologiques et les dosages chimiques…………...……………...77
III-6-1-Activité antioxydante et teneur en polyphénols totaux et en flavonoïdes………...……….....77
III-6-2-Activité antibactérienne et teneur en polyphénols totaux et en flavonoïdes............................78
III-6-3-Relation entre l'activité antioxydante et l'activité antibactérienne………...……..……..…...79
III-7-Analyses chromatographiques.…………………..…………………………………………..........79
III-7-1- Chromatographie sur couche mince…………………………………..………………….........79
III-7-1-1-Analyse par CCM des extraits alcaloïdiques…..………………………………………….…79
III-7-1-2-Analyse par CCM des extraits phénoliques…..………………………………………….…..82
III-7-1-3-Analyse par CCM des extraits apolaires………..…………………………………………...85
III-7-2-Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse, GC-MS…..........85
Conclusion…………………………………...…………………………………………………..……….88
Références bibliographiques…………………………...……………………………….……………….90
Annexe……………………………………………………...……………………………………………102
Introduction
Durant des siècles et même des millénaires, nos ancêtres ont utilisé les plantes pour
soulager leurs douleurs, guérir leurs maux et panser leurs blessures. De génération en génération,
ils ont transmis leur savoir et leurs expériences en s’efforçant quand ils le pouvaient de les
consigner par écrit. Ainsi, même actuellement, malgré le progrès de la pharmacologie, l’usage
thérapeutique des plantes médicinales est très présent dans certains pays du monde et surtout les
pays en voie de développement, en l’absence d’un système médical moderne (Tabuti et al.,
2003). En effet, il existe environ 500.000 espèces de plantes sur terre, dont 80.000 possèdent des
propriétés médicinales (Benkhnigue, 2010).
En Afrique, où les médicaments à base de plantes sont toujours utilisés par de nombreuses
populations pour des soins sanitaires, le pouvoir thérapeutique des plantes était connu de façon
empirique (Koffi et al., 2009).
La flore algérienne, avec ses différentes espèces appartenant à plusieurs familles botaniques,
reste très peu explorée tant sur le plan phytochimique que sur le plan pharmacologique
(Merzoug, 2009).
L'abondance en principes actifs confère à la plante des propriétés pharmacologiques
remarquables, ce qui pourrait justifier ses multiples indications thérapeutiques et pour lesquelles
elle est utilisée en tradithérapie (Konkon et al., 2006). En effet, les métabolites secondaires font
l’objet de nombreuses recherches. A titre indicatif, les alcaloïdes font partie de ces composés et
sont, à faibles doses, dotés de propriétés pharmacologiques et toxicologiques remarquables. De
même, les polyphénols, forment un groupe très diversifié de molécules dont plusieurs sont
largement utilisées en thérapeutique comme antioxydants pour lutter contre les effets néfastes de
l’oxygène à l’origine d’un grand nombre de maladies (Bruneton, 2009).
Au début des années 1970, les médecins ont finalement été contraints d'abandonner leur
croyance que les infections bactériennes étaient pratiquement toutes traitables. Leur optimisme a
été ébranlé par l'émergence de la résistance à plusieurs antibiotiques chez les agents pathogènes
tels que Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa et
Mycobacterium tuberculosis (Lowy, 2003). En plus de ce problème, les antibiotiques sont
parfois associés à des effets indésirables sur l'hôte telle que l'hypersensibilité allergique. Par
conséquent, il existe un besoin de développer des médicaments antimicrobiens alternatifs pour le
traitement des maladies infectieuses à partir des plantes médicinales qui semblent moins
agressifs (Arshad et al., 2010).
1
Introduction
D'autre part, Les antioxydants jouent un rôle important dans la prévention des maladies, et
parce que certains antioxydants synthétiques ont montré un risque potentiel pour la santé,
notamment un effet cancérigène possible (Safer et Al-Nughamish, 1999); il y'a lieu de trouver
de nouvelles sources d'antioxydants peu dangereuses et peu coûteuses naturelles pour les utiliser
dans les aliments et les préparations pharmaceutiques et remplacer ainsi les antioxydants
synthétiques.
Les membres de la famille des Ephedraceae, représentés par un seul genre «Ephedra», sont
connus pour leurs nombreux usages en médecine traditionnelle dans le monde. La présente étude
vise à contribuer à la valorisation de l'une de ces sous espèces, Ephedra alata alenda qui pousse
dans la région d’Ouargla, et qui est réputée par sa tolérance élevée à la carence en eau.
Néanmoins; elle reste peu étudiée dans la littérature sur le plan local. Et tout en sachant que le
milieu désertique peut être un facteur favorable pour la production de métabolites secondaires
dotés de nombreuses activités biologiques (Timmermann et al., 1984), notre choix s'est porté sur
l'investigation de cette plante
Notre étude est échelonnée à travers la mémoire sur trois parties:
-
la première, est consacrée à une synthèse bibliographique sur les aspects botaniques et
phytochimiques de la plante. Des généralités, sur les activités antibactérienne et
antioxydante, ainsi que sur les alcaloïdes et les composés phénoliques et notamment les
flavonoïdes, y sont aussi développées.
-
la deuxième partie illustre le matériel et les méthodes utilisés dans les différentes étapes
de notre travail expérimental : Nous avons entamé cette partie par une enquête
ethnobotanique, en vue d'évaluer l'intérêt et l'usage de cette plante chez la population
ciblée. Des tests phytochimiques préliminaires sont ensuite effectués sur les parties
aérienne et souterraine de la plante, justifiant notre choix porté sur les alcaloïdes et les
composés phénoliques de cette plante, en vue de leur extraction et de leur analyse. En
application, les extraits de l'Ephedra alata alenda sont testés pour leurs activités
antibactériennes et leur pouvoir antioxydant. Et enfin, des dosages des composés
phénoliques et des tests de corrélations entre les activités biologiques et les teneurs en
composés phénoliques sont réalisés.
-
La troisième partie est consacrée à la présentation, la discussion et l’interprétation des
résultats obtenus.
Enfin, notre manuscrit est ponctué d’une conclusion générale et de perspectives envisageables.
2
Etude bibliographique
I-1-
Généralités sur la plante
I-1-1-Genre Ephedra
L'origine de l'Ephedra a parfois été considérée comme ancienne, peut-être dès ou avant
l'éclatement de la Pangée (environ 200 millions d'années passant dans le Trias moyen) (Huang et
Price, 2003).
La famille des Ephedraceae représentée par le seul genre Ephedra inclue environ 40 espèces
dans le monde (Evans, 2009) est représentée par des arbustes dioïques vivaces à rameaux
articulés, qui peuvent atteindre 1 à 3 mètre de haut, avec de minces tiges dressées, verts
jaunâtres, intersectées et légèrement nervurées, à canalicules de 1,5 mm de diamètre et qui se
termine par une pointe souvent acérée. Au niveau des nœuds, qui sont écarté de 4 à 6 cm, les
feuilles réduites en écailles apparaissent triangulaires qui se développent en paires opposées ou
en verticilles de trois, donnant à la plante l’aspect d’un arbuste sans feuille. De petites fleurs
apparaissent en été (Limberger et al., 2013; Ozenda, 1991; Abourashed et al., 2003).
Les espèces de ce genre peuvent pousser dans des conditions semi-arides et désertiques, ce
qui rend les six continents appropriés pour la croissance de ce genre. Ce dernier se développe
habituellement dans des sols sableux, des pentes sèches et des côtés secs de montagnes
(Limberger et al., 2013; Qingbiao, 2006) et qui poussent surtout dans la Chine, l'Inde, l'Egypte,
le Moyen-Orient, en Europe et dans les Amériques (Hegazi et El-Lamey, 2011). La figure 1
montre la répartition du genre Ephedra dans le monde.
Sites de répartition des
espèces du genre Ephedra
Figure1: Répartition géographique de l'Ephedra dans le monde (Caveney et al., 2001).
3
I-1-2- Sous espèce Ephedra alata alenda
I-1-2-1-Position systématique
Embranchement : Spermaphytes
Sous embranchement: Gymnospermes
Classe : Gnetopsida
Ordre : Ephedrales
Famille : Ephedraceae
Genre : Ephedra
Espèce : Ephedra alata
Sous espèce: Ephedra alata alenda (Ozenda, 1991)
I-1-2-2-Description botanique
Cette espèce, qui est réputée pour sa tolérance élevée à la carence en eau dans les régions
sahariennes, est un arbuste de 1 à 3 mètres de haut, à rameaux articulés et très ramifiés d'une
couleur vert-jaunâtre, portant au niveau des nœuds de petites feuilles opposées, alternant d'un
nœud à l'autre. Les fleurs sont en petits cônes blanchâtres, dioïques (fleurs mâles et femelles sur
des pieds différents) et les fruits entourés de bractées largement membraneuses. Elle présente un
système de racines latérales extrêmement puissant (Ozenda, 1991; Derbel et al., 2010).
Figure 2: Ephedra alata alenda (N'Goussa "Novembre 2014") (originale)
4
I-1-2-3-Répartition géographique
L'espèce Ephedra alata est une plante médicinale appartenant au genre Ephedra originaire
d'Asie, y compris l'Arabie Saoudite (Al-Qarawi et al., 2011). Elle est commune dans le Sahara
du Maroc à la Libye jusqu'à l'Egypte et l'Arabie (Ozenda, 1991).
En Algérie, E. alata se trouve dans le Sahara septentrional et occidental au niveau des
terrains sableux, des regs et les lits sablonneux des oueds. Elle est même rencontrée dans le sable
de l'étage tropical et la Hamada de Tinghert (Ozenda, 1991).
I-1-2-4-Utilisation
Les espèces du genre Ephedra sont parmi les plus anciennes herbes médicinales connues de
l'humanité. E. sinica est l'espèce principale qui a été utilisée en Chine depuis plus de 5000 ans.
E. gerardiana a aussi été utilisée dans la médecine traditionnelle indienne depuis l'ancien temps.
Même durant le temps de l’empire Romain, l’Ephedra était bien connue (Abourashed et al.,
2003).
Ma-huang est le terme spécifique donné, par les chinoises, à la partie aérienne des espèces :
E.sinica, E.equisietina, E.intermedia, E.distachya, E.gerardiana, E.minuta ainsi qu'autres
espèces contenant de l’éphédrine (Abourashed et al., 2003). Ma-huang a été traditionnellement
utilisé en Chine pour lutter contre l’asthme bronchiale, rhume, grippe, fièvre, frissons, rhinite,
congestion nasale, œdème, maux de tête, arthralgies et comme diaphorétique, antiallergique et
antitussif (Abourashed et al., 2003; Soni et al., 2004; Konno et al., 1979; Ma et al., 2007).
Les espèces Ephedra d’Asie ont été récemment utilisée dans la fabrication clandestine d'une
drogue de rue, de la méthamphétamine (d-desoxy-éphédrine) (Caveney et al., 2001).
En Egypte, E.alata est utilisée en médecine traditionnelle comme dépurative, hypotensive,
antiasthmatique et agent astringent (Nawwar et al., 1984). En Arabie Saoudite, Ephedra est
l'une des plantes de parcours les plus répandues. Elle a été utilisée comme pâturage pour de
nombreux animaux attirés par son arôme acceptable (AL-Qarawi et al., 2012). Au Maroc,
l’Ephedra alata est utilisée pour lutter contre le diabète (Ghourri et al., 2013). En Algérie, E.
alata s’utilise contre la grippe, la coqueluche et la faiblesse générale en tisane et par inhalation
ainsi que sous forme de gouttes nasales contre les rhumes (Ould El Hadj et al., 2003). Elle est
très appréciée par le dromadaire.
5
Les organes utilisés dans la médecine traditionnelle sont les tiges vertes séchées, qui sont
usuellement bouillies dans de l’eau pendant environ trente minutes et administrées comme thé
chaud (Abourashed et al., 2003).
En dépit de sa longue histoire et sa promesse agronomique, l’utilisation de l’herbe a
diminué au fil des ans, mais au début du vingtième siècle, l’importance de l’herbe a
graduellement revécu comme il est démontré par son large utilisation aux Etats Unis dont
beaucoup de produits contenant de l’Ephedra vendus sous des noms tels que ̎ Herbal Ecstasy
and Escalation" sont supposés être efficaces pour la perte de poids et l'amélioration des
performances physiques (Abourashed et al., 2003; Caveney et al., 2001).
I-1-2-5-Pharmacologie
Les effets pharmacologiques et toxicologique de cet arbuste semble être attribuable à ses
alcaloïdes de types éphédrine, principalement (-)-éphédrine et (+)- pseudoéphédrine.
L’Ephédrine, malgré l’absence de groupement phénolique caractéristique des catécholamines, est
un sympathomimétique, agoniste à la fois des récepteurs adrénergiques α et β. Elle présente aussi
un effet indirecte sur le système sympathique via l’augmentation de la
libération de
noradrénaline à partir des vésicules de stockage dans les neurones sympathiques vers la zone
synaptique où il se fixe sur les récepteur post-synaptiques α et β (Limberger et al., 2013; Chen et
al., 2010; Ma et al., 2007).
L’effet principal de la stimulation des récepteurs adrénergiques α et β inclue
l’augmentation de la fréquence cardiaque et la contractilité. Elle favorise également la
vasoconstriction périphérique due à la fraction pseudoéphédrine, la bronchodilatation, ce qui
explique son utilisation traditionnelle comme décongestionnant nasal et antiasthmatique, ainsi
que la stimulation du SNC (Abourashed et al., 2003) (Phinney et al., 2005). Cependant, les
effets hypertenseurs et vasoconstricteurs liés à l’éphédrine, sont moins rapides et moins
puissants, mais plus durables et plus stables dans les conditions du métabolisme contrairement à
l'adrénaline (Chopra et al., 1960). C’est pour cela que l’administration de l’éphédrine, qui semble
le majeur principe actif de la plupart des espèces Ephedra, est contre indiqué chez les patients
atteint d'hypertension ou toute autre MCV, de glaucome, ou de l’hyperthyroïdie (Soni et al.,
2004; Chen et al., 2010).
6
I-1-2-6-Toxicologie
Les espèces de l'Ephedra ont des effets bénéfiques et néfastes (Ma et al., 2007).
Cliniquement, il peut en résulter une tachycardie, une hypertension, une hypersudation, une
bronchodilatation, une agitation et une mydriase. L'utilisation de l'Ephedra est également connue
pour être associée avec des manifestations gastro-intestinales et psychiatriques (Peters et al.,
2005). Ces effets peuvent être les raisons pour lesquelles l'utilisation de l'Ephedra est
recommandée uniquement pour les situations aiguës en médecine traditionnelle chinoise et
contre-indiqué pour une utilisation à long terme (Chen et al., 2010).
I-1-2-7-Travaux antérieurs
I-1-2-7-1- Activités biologiques de la plante
-
Activité antimicrobienne
Ephedra alata s’est révélée avoir une activité antivirale élevée contre le HSV (Herpes
simplex virus) (Mohamed Soltan et Kamal Zaki, 2009).
L'extrait aqueux de E. alata égyptienne présente un potentiel d'inhibition significatif in vitro et in
vivo contre la croissance et la production d'aflatoxines par Aspergillus flavus (Al-Qarawi et al.,
2011).
Ghanem et El-Magly (2008) ont montré que l’extrait acétonitrile de l'E. alata de l'Egypte
présente simultanément, une forte activité contre des bactéries à GRAM+ et à GRAM- ainsi que
des champignons et champignons de type levure. L'E.alata de la région de Ouargla testé par
Kessal et Bouafia (2003) et Chebouat et al. (2014) s'est révélée avoir des activités plus ou moins
importantes sur la croissance de bactéries à GRAM positif et à GRAM négatif selon la souche
ciblée.
-
Effet sur la masse corporelle
Une étude réalisée par (Boozer et al., 2001) a montré qu’un mélange d’Ephedra et de
guarana favorise efficacement et à court terme (8 semaines) la perte de poids chez des sujets en
surpoids. Un tel effet a été principalement attribué à une augmentation de la tonicité
sympathomimétique entraînant une augmentation de la lipolyse et la glycogénolyse, avec la
stimulation sympathique du centre de la satiété central conduisant à la suppression de l'appétit.
7
-
Effet hypoglycémiant
Cinq glycanes actifs isolés de E.distachya : Ephedranes A, B, C, D et E ont réduit
significativement le taux de glucose sanguin chez des souris normales et diabétiques (Konno et
al., 1985). Ainsi que l’extrait alcoolique de l’E.alata a présenté un abaissement persistant du
taux de glucose sanguin une heure après son administration à des rats à jeun (Shabana, 1990).
-
Effet anti-inflammatoire
L’extrait aqueux de l’E.sinica présente une propriété inhibitrice de complément à la fois
dans le sérum animal et humain. Ceci pourrait expliquer l’utilisation de la plante dans la
médecine chinoise traditionnelle dans le cas de néphrite aigue (Ling et al., 1995). Par ailleurs,
Hikino et al. (1980) ont suggéré que la pseudoéphédrine est le principe actif responsable de
l'activité anti-inflammatoire montrée par l'E.intermedia. Konno et al. (1979) ont rapporté que la
partie aérienne des espèces d'Ephedra contient de l’Ephedroxane qui s’est révélée également
posséder une activité anti-inflammatoire.
-
Action sur la pression artérielle
Les croyances chinoises prétendent que la partie aérienne et souterraine de l’Ephedra ont
des effets opposés. Cela a été confirmé, pour l'action sur la pression artérielle, par des tests sur
des animaux. Un polyphénol nommé l’Ephedrannine A isolé à partir des racines de la plante
(Hikino et al., 1982) ainsi qu'un type mineure d’alcaloïdes dans la plante isolé de ses racines,
nommé l’Ephedradine, présentaient un effet hypotensif (Tamada et al., 1979). Par contre,
l’éphédrine présente une action hypertensive (Ehab A et al, 2003).
I-1-2-7-2-Chimie de la plante
Les espèces de l'Ephedra sont des sources naturelles de nombreux phytoconstituants
incluant des alcaloïdes, des tanins, des saponines, des proanthocyanidines, des acides
phénoliques, des flavonoïdes et des huiles essentielles (Hegazi et El-Lamey, 2011).
Il est bien connu dans la littérature que les propriétés biologiques traditionnelles de
l'Ephedra sont attribuables en grande partie aux alcaloïdes de type éphédrine, proto-alcaloïdes
dérivés de la phénylalanine (Caveney et al, 2001). Notons que la (-) éphédrine et
l’(+) pseudoéphédrine sont généralement les plus abondantes, ils représentent environ 80% de la
teneur en alcaloïdes dans la plante séchée (Phinney et al., 2005; Soni et al., 2004; Caveney et
al., 2001).
8
Plus de 50 espèces d'éphédra sont originaires de deux hémisphères, mais la détection des
alcaloïdes de la série de l'éphédrine a été limitée à des espèces en Eurasie dont l’Ephedra sinica
est la principale source, tandis que les espèces américaines telle que E. nevadensis connue
comme Mormon ou le thé de désert sont considérées comme dépourvues de ces métabolites
(Limberger et al., 2013; Abourashed et al., 2003).
Néanmoins, ce type d’alcaloïdes ne représente pas les seuls alcaloïdes identifiés dans la plante.
Le tableau 1 montre d'autres types d'alcaloïdes mineurs isolés à partir de différents espèces
d'Ephedra.
Tableau 1: Principaux alcaloïdes isolés du genre Ephedra autres que l'éphédrine
Alcaloïde
Structure chimique
Ephedroxane
Source
Référence
Ephedra
Konno
et
al.,
1979
Transtorine
Ephedra transitoria
Al-Khalil et al.,
1998
Ephedralone
même structure précédente Ephedra alata
Nawwar et al.,
avec O-CH3 en C7
1985
Tétraméthylpyrazine
Ephedra sinica
Li et al., 2001
Ephedradines
Ephedra aphylla
Abdel-Kader et
al., 2003
Hordenine
Ephedra aphylla
Abdel-Kader et
al., 2003
9
Flavonoïdes
Les flavonoïdes des espèces de l’Ephedra comprennent principalement des di-Cglycosylflavones, flavonol-3-O-glycosides et proanthocyanidines (Nawwar et al., 1984).
Le flavonoïde glycosylé, herbacetin 7-O-neohesperidoside ainsi que plusieurs autres
flavonoïdes tels que le symplocoside, la pollenitine B, le kaempferol 3-O-rhamnoside 7-Oglucoside et l’isovitexine 2-O-rhamnoside ont été identifiés à partir de l'extrait de l'espèce
Ephedra sinica par Amakura et al. (2013).
L’herbacetine
8-methyl
ether
3-O-glucoside-7-O-rutinoside,
l’herbacetine
7-O-(6”-
quinylglucoside), la vicenine II, la lucenine III, le kaempferol 3-rhamnoside, la quercétine 3rhamnoside et l’herbacetine 7-O-glucoside sont les flavonoides qui ont été isolés et identifiés de
l’Ephedra alata (la plante entière). Aussi, l'herbacetin 7-O-glucoside a été rapporté dans l'espèce
E. lomatolepis et l'herbacetine 8 methyl ether 3-O-glucoside de E. equisetina (Nawwar et al.,
1984).
Tanins
Les tanins, principalement les proanthocyanidines, ont été caractérisés par des réactions
colorimétriques. Ces composés sont produits en grande quantité dans les tiges de nombreuses
espèces Ephedra appartenant aux deux continents, eurasien (tels que : E. intermedia, E.
przewalskii, E. alata, E. distachya et E. fragilis) et américains tels que E. californica, E.
nevadensiset E. torreyana (Zang et al., 2013). Ces molécules contribuent au goût astringent de
l'Ephedra (Soni et al ,2004).
Huiles essentielles
Les principaux constituants de l’huile essentielle de E. sinica signalés par Miyazawa et al.
(1997) et Wang et al. (2006) sont l’α-terpinéol, le terpinen-4-ol, le linalool, le 2,3-dihydro-2méthylbenzo-furanne, le cis-p-menth-2-ène-7-ol., le p-vinylanisole, le 3-méthyl-2-butén-1-ol, le
phytol et le γ-eudesmol. En plus du tétraméthylpyrazine, qui a été approuvé ultérieurement
comme alcaloïde (Hong-Xia Li et al., 2001).
10
I-2- Activité antibactérienne
Les infections microbiennes ont été la principale cause de maladies tout au long de
l'histoire de l'humanité. Avec l'introduction des antibiotiques, on pensait que ce problème devait
disparaître. Alors que l'utilisation répandue et parfois inappropriée de ces agents , ainsi que leur
utilisation extensive comme activateurs de croissance dans l'alimentation animale ont poussé les
bactéries à développer des mécanismes de résistance leur permettant de survivre avec succès au
cours des 50 dernières années en face d'un assaut continu d’antimicrobiens (Davies, 1994; Dzidic
et al., 2008; Lowy , 2003).
L'émergence de bactéries multirésistantes est un phénomène de préoccupation pour le
clinicien et l'industrie pharmaceutique, car il est la principale cause de défaillance dans le
traitement des maladies infectieuses (Davies, 1994). Cette situation incite de chercher de
nouvelles sources de substances antimicrobiennes.
Les antimicrobiens d'origine végétale ont un énorme potentiel thérapeutique. Ils sont
efficaces dans le traitement des maladies infectieuses, tout en atténuant ou en évitant un grand
nombre d'effets secondaires qui sont souvent associés aux agents synthétiques (Arshad et al.,
2010).
I-2-1- Antibiotiques
Un antibiotique est une substance antibactérienne naturelle, semi-synthétique ou
synthétique, capable à faible dose de tuer ou d'inhiber spécifiquement la croissance du germe par
un mécanisme particulier jouant sur ses mécanismes vitaux (Okusa Ndjolo., 2012). Pour qu'il
soit actif, un antibiotique doit pénétrer dans la bactérie sans être détruit ni être modifié, se fixer
sur une cible et perturber la physiologie bactérienne (Benabbou, 2012).
Selon la structure chimique, les antibiotiques peuvent exercer leurs effets selon différents
modes:
-
Antibiotiques inhibant la synthèse de la paroi: β-lactamines, glycopeptides,
-
Antibiotiques altérant la membrane plasmique: polymixines, daptomycine,
-
Antibiotiques inhibant la synthèse protéique (généralement par fixation sur les
ribosomes): tetracyclines, chloramphenicol,
-
Antibiotiques inhibant la synthèse des acides nucléiques: rifampicine, etc. (Dzidic et al.,
2008).
11
I-2- 2- Méthodes de détermination de l’activité antibactérienne
L'activité biologique d'un extrait est liée à sa composition chimique. Lorsque l'on parle
d'activité antimicrobienne, on distingue deux sortes d'effets : une activité létale ou biocide et une
inhibition de la croissance ou activité biostatique (Attou, 2011). La sensibilité des
microorganismes peut varier selon le germe testé car un antimicrobien peut être biocide vis-à-vis
de certaines souches, biostatique vis-à-vis d’autres ou n’avoir aucun effet (Pibiri, 2006).
L’examen des données bibliographiques fait apparaître la diversité des méthodologies utilisées
pour mettre en évidence l’activité antimicrobienne des extraits.
Les différents protocoles peuvent être classés
1. selon le milieu dans lequel se fait la diffusion de l'extrait, soit liquide soit solide.
2.selon la nature du contact avec le germe : diffusion sur disque, ou dispersion dans un
émulsionnant (Pibiri, 2006).
I-2- 2-1- Aromatogramme
L’aromatogramme est basée sur une technique utilisée en bactériologie médicale, appelée
antibiogramme ou méthode par diffusion en milieu gélosé ou encore méthode des disques. Cette
méthode a l’avantage de s’appliquer à un très grand nombre d’espèces bactériennes et d’avoir été
largement évaluée par 50 ans d’utilisation mondiale (Pibiri, 2006).
L’aromatogramme se réfère à la diffusion d'un agent antimicrobien d'une concentration
spécifique à partir de disques dans le milieu de culture solide, qui a été ensemencé avec
l'inoculum. La méthode est basée sur la détermination d'une zone d'inhibition proportionnelle à la
sensibilité bactérienne à l'antimicrobien présent dans le disque. La diffusion de l'agent
antimicrobien dans le milieu de culture ensemencé résulte d'un gradient de l'antimicrobien.
Quand la concentration de l'antimicrobien devient si diluée qu'il ne peut plus inhiber la
croissance de la bactérie testée, la zone d'inhibition est démarquée (Manuel terrestre de l'OIE,
2008). Plus le diamètre de cette zone est grand, plus la souche est sensible à l’antibiotique. Plus
il est petit, plus la bactérie est résistante (Pibiri, 2006) (Figure 3).
Les disques devraient être distribués de sorte que les zones d’inhibition autour des disques ne se
chevauchent pas et qu'ainsi la zone d'inhibition puisse être déterminée.
La méthode des disques est facile à mettre en œuvre, reproductible et ne nécessite pas
d'équipement onéreux (Manuel terrestre de l'OIE, 2008)
12
Figure 3: Illustration de la méthode des aromatogrammes sur boîte de Pétri (Zaika, 1988).
I-2- 2-2-Méthode de diffusion en puits
Proposé par Cooper et Woodman en 1946, reprise par Shroder et Messing (1949), elle
mesure une diffusion radiale de l'extrait à partir d'un puits en donnant une zone d'inhibition clair
et facilement mesurable à la surface de la gélose préalablement ensemencée avec la suspension
bactérienne. Elle consiste à découper un tronc circulaire vertical dans la gélose et d'y verser une
solution d'extrait de concentration connu (Hellal, 2011).
I-2- 2-3-Technique de micro-atmosphères
Le
protocole
des
microatmosphères
est
techniquement
proche
de
celui
des
aromatogrammes. La différence réside principalement dans la position du disque imprégné. Dans
cette technique, le disque imprégné est déposé au centre du couvercle de la boîte de Pétri,
renversée pendant la durée de l’expérience. Celui-ci n’est donc plus en contact avec le milieu
gélosé. Cette technique permet de mettre en évidence la diffusion des composants volatils des
huiles essentielles à l’intérieur d’une boîte de Pétri (Pibiri, 2006).
13
I-2- 2-4-Méthodes de dilutions en bouillon et en gélose
Le but des méthodes de dilution en bouillon et en gélose est de déterminer la concentration
la plus faible de l'antimicrobien testé qui inhibe la croissance de la bactérie testée (la CMI,
habituellement exprimée en mg/ml ou mg/litre) (Manuel terrestre de l'OIE, 2008).
-
Dilution en bouillon
La dilution en bouillon est une technique dans laquelle une suspension bactérienne, à une
concentration déterminée, est testée contre des concentrations variables d’un agent antimicrobien
dans un milieu de culture liquide. La méthode de dilution en bouillon peut être effectuée dans
des tubes contenant un volume minimum de 2 ml (macrodilution) ou dans de plus petits volumes
à l’aide de plaques de microtitration (microdilution) (Manuel terrestre de l'OIE, 2008). La lecture
peut être visuelle ou à l'aide d'un spectrophotomètre car le degré d'inhibition est en rapport avec
la turbidité du milieu (Hellal, 2011).
-
Dilution en gélose
La dilution en gélose implique l’incorporation d’un agent antimicrobien dans un milieu
gélosé à des concentrations variables, suivie de l’ensemencement d’un inoculum bactérien défini
à la surface de la gélose de la boîte.
La Dilution en gélose présente comme avantage la capacité de tester plusieurs bactéries sur le
même ensemble de boîtes de gélose en même temps (Manuel terrestre de l'OIE, 2008).
I-2- 3- Association d'antimicrobiens
Les effets antimicrobiens des associations des produits à tester, comme pour les associations
d’antibiotiques, sont définis selon quatre interactions possibles :
-
Indifférence : l’activité d’un composé n’est pas affectée par l’autre.
-
Addition : l’effet de l’association est égal à la somme des effets de chaque composé
étudiée isolément, à la même concentration que dans l’association.
-
Synergie : l’effet est significativement supérieur à la somme de l'effet de chaque composé
étudiée isolément, à la même concentration.
-
Antagonisme : l’association diminue l’activité, elle est inférieure à la somme des effets de
chaque composé pris séparément.
(Pibiri, 2005).
14
I-3- Activité antioxydante
Les radicaux libres sont produits dans le cadre de processus métaboliques normaux. Sous
les conditions physiologiques, la production de ces radicaux au niveau cellulaire est étroitement
contrôlée par un énorme système de défense dit système antioxydant (Sies, 1997). Cependant,
une surproduction de radicaux libres d'un côté et (ou) une déficience du système antioxydant de
l'autre côté, conduira à une augmentation significative de la production de ces radicaux, qui
submergent la défense antioxydante et imposent un stress oxydatif
pour le système
physiologique (Martínez-Cayuela, 1995).
Le stress oxydatif peut causer des dommages aux lipides, protéines ou l'ADN cellulaires,
inhibant leurs fonctions normales. Le stress oxydatif est donc impliqué dans de nombreuses
maladies dégénératives telles que l'athérosclérose, les maladies coronariennes, le vieillissement
et le cancer (Valko et al., 2007).
Par conséquent, la réduction du stress oxydatif va promouvoir nos conditions physiologiques et
prévenir certaines maladies dégénératives dans laquelle les radicaux libres sont impliqués. En
outre, les antioxydants ont été largement utilisés dans l'industrie alimentaire afin de prolonger la
durée de conservation. Des antioxydants synthétiques, tels que le butylhydroxytoluène (BHT) et
le butylhydroxyanisole (BHA) sont couramment utilisés dans l'industrie alimentaire. Cependant,
il y a un large accord que les antioxydants synthétiques doivent être remplacés par des
antioxydants naturels parce que certains antioxydants synthétiques ont montré de potentiels
risques pour la santé, et plus particulièrement des effets cancérogènes possibles (Safer et AlNughamish, 1999). Par conséquent, il est d'une grande importance de trouver de nouvelles
sources d'antioxydants sains et peu coûteux d'origine naturelle dans le but de les utiliser dans les
aliments et les préparations pharmaceutiques pour remplacer les antioxydants synthétiques.
L'intérêt croissant pour la substitution des antioxydants alimentaires synthétiques par des
matières naturelles favorise le dépistage de nouveaux antioxydants à identifier dans les sources
végétales (Moure et al., 2001).
15
I-3-1-Radicaux libres
Un radical libre est une espèce chimique contenant un ou plusieurs électrons non appariés.
Extrêmement instable, ce composé peut réagir avec les molécules les plus stables pour apparier
son électron. L’appellation « espèces réactives d'oxygène (ERO) » inclut les radicaux libres de
l’oxygène qui représentent la classe la plus importante d'espèces radicalaires générées dans les
systèmes vivants: anion superoxyde (O2•-), radical hydroxyle (OH•) mais aussi certains dérivés
oxygénés non radicalaires dont la toxicité est importante tels que le peroxyde d’hydrogène
(H2O2). L'anion superoxyde (O2•-) et le peroxyde d’hydrogène (H2O2) sont des oxydants moins
réactif que OH•, mais ils ont une durée de vie plus longue leur permettant de se déplacer à partir
du site de génération et de réagir avec des molécules dans divers tissus (Valko et al., 2007;
Martínez-Cayuela, 1995).
A côté des ERO, il existe des ERN (espèces réactives du nitrogène) dont le représentant majeur
est l'oxyde nitrique NO•. C'est un radical peu réactif impliqué dans la neurotransmission et
produit lors de métabolisme de l'arginine en citrulline par les oxyde nitrique synthases (NOS). Le
NO• peut se lier aux radicaux libres oxygénés pour former des molécules plus toxiques comme
l'anion peroxynitrite (ONOO−), un puissant oxydant qui peut provoquer la fragmentation de
l'ADN et l'oxydation des lipides (Valko et al., 2007). Le tableau 2 montre une liste de quelques
espèces chimiques réactives.
Tableau 2: Liste de quelques espèces réactives (Halliwell, 2006).
Espèces radicalaires
Espèces non radicalaires
O2•-
Superoxyde
H2O2
Peroxyde d'hydrogène
OH•
Hydroxyle
ROOH
Peroxyde Organique
ROO•
Peroxyle
ONOO-
Peroxynitrite
RO•
Alkoxyle
O2NOO-
Peroxynitrate
NO•
Oxyde nitrique
NO2Cl
NOO
•
NO3•
CO3•-
Dioxyde de nitrogène
Nitrate
HNO2
ClO2
Chlorure de nitrile
Acide nitreux
Dioxyde de chlore
Carbonate
16
I-3-2-Stress oxydatif- effets et conséquences
Le métabolisme cellulaire normal de l’oxygène produit de manière continue de faibles
quantités de dérivés réactifs de l’oxygène et de l'azote. Les effets bénéfiques des ERO et ERN,
tels que la défense contre les agents infectieux, se produisent à des concentrations faibles à
modérés. Dans certaines situations, cette production augmente fortement, entraînant un stress
oxydatif que l’on définit comme un déséquilibre entre la production et la destruction de ces
molécules. En revanche, le stress oxydatif est susceptible d’entraîner des dégâts cellulaires qui
pourraient être à l’origine de certaines pathologies: cancer, maladies cardiovasculaires, diabète
maladies neurodégénératives telle que la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer, La
polyarthrite rhumatoïde et le vieillissement accéléré (Valko et al., 2007; Martínez-Cayuela,
1995).
La plupart des maladies induites par le stress oxydant apparaissent avec l'âge car le
vieillissement diminue les défenses antioxydantes et augmente la production mitochondriale de
radicaux (Mohammedi, 2013).
Oxydation de l'ADN
Le radical hydroxyle est connu pour réagir avec tous les composants de la molécule
d'ADN, d'endommager à la fois les bases puriques et pyrimidiques et aussi le squelette
désoxyribose. Les modifications permanentes du matériel génétique résultant de ces incidents de
"dommages oxydatifs" représentent la première étape impliquée dans la mutagenèse et la
cancérogenèse (Valko et al., 2007; Martínez-Cayuela, 1995).
L’ADN mitochondrial est la cible privilégiée des oxydations par les ERO car il est dépourvu
d'histones et ne semble pas avoir de systèmes de réparation aussi efficaces que celui de l'ADN
nucléaire, mais aussi du fait de sa proximité directe de l’une des principales sources d’ERO
cellulaire : la chaine respiratoire mitochondriale (Servais, 2004).
Oxydation des protéines
Les radicaux libres peuvent réagir avec les acides aminés contenant des groupes insaturés
ou de soufre tels que la phénylalanine et la cystéine. C'est le cas de nombreuses enzymes
cellulaires et protéines de transport. Ces réactions donnent lieu à des perturbations structurelles
dans les protéines, tels que les phénomènes d'agrégation qui sont favorisées par la formation de
liaisons disulfures inter et intramoléculaire. L'oxydation des protéines ainsi, inactive les
protéines, augmentent leur hydrophobicité et leur sensibilité à la protéolyse (Martínez-Cayuela,
1995).
17
Oxydation des lipides
Les radicaux, hydroxyle et hydroperoxyle, sont capables d'attaquer les acides gras
insaturés des phospholipides et d'autres molécules lipidiques de la membrane, initiant de cette
façon, la peroxydation lipidique. Dans ce processus, le radical libre primaire arrache un atome
d'hydrogène à partir d'une liaison méthylène de la chaîne de carbone. Le radical produit réagit
facilement avec l'oxygène moléculaire pour former un radical peroxyle, qui peut à son tour
enlever un atome d'hydrogène d'une autre molécule de lipide permettant la propagation de la
chaîne de peroxydation.
La peroxydation lipidique provoque de graves dommages à la structure membranaire et, par
conséquent, modifie sa fluidité et sa capacité de fonctionner correctement (Martínez-Cayuela,
1995).
Oxydation des glucides
Les radicaux peuvent oxyder les monosaccharides, mais ils peuvent également réagir avec
des polysaccharides et induire leur dépolymérisation (Martínez-Cayuela, 1995).
.
Le radical OH est capable de couper les molécules de sucres (désoxyribose, mannose, glucose)
et de susciter ainsi des liaisons entre sucres et protéines provoquant des épaississements
membranaires. La cataracte diabétique serait une conséquence de cette liaison.
Les radicaux libres de l'oxygène provoquent aussi une fragmentation des polymères comme
l'acide hyaluronique, glycosaminoglycane constitué de répétitions d'unités d'acide glucuroniqueN-acetylglucosamine et qui maintient la viscosité élevée du liquide synovial. Cependant, dans la
polyarthrite rhumatoïde, il est dépolymérisé, sous l'effet des ERO générés par les neutrophiles.
(Pasquier, 1995).
I-3-3-Défense antioxydante
Un antioxydant est une substance qui inhibe ou retarde significativement l’oxydation d’un
substrat, alors qu’elle présente une concentration très faible dans le milieu où elle intervient
(Halliwell et Gutteridge, 1990). Les composés antioxydants peuvent être recyclés dans la cellule
ou bien ils sont irréversiblement endommagés, mais leurs produits d'oxydation sont moins
nuisibles, ou peuvent être en outre convertis en substances inoffensives (Matkowski, 2008).
Notre organisme est équipé de tout un système complexe de défenses antioxydante enzymatiques
et non enzymatiques, localisé dans les compartiments intra- et extracellulaires. (MartínezCayuela, 1995).
18
-
Système enzymatique
Toutes les cellules dans les organismes eucaryotes contiennent de puissantes enzymes
antioxydantes. On en compte trois principales, Superoxyde dismutase, Catalase et Glutathion
peroxydase (Sies, 1997). Toutes trois présentes dans le cytoplasme, la mitochondrie et le milieu
extracellulaire (Mohammedi, 2013).
-Superoxide dismutase (SOD): Catalyse la dismutation de l'anion superoxyde (O2.-) en peroxyde
d'hydrogène et en oxygène moléculaire:
.-
O2 + O2.- + 2H + → H2O2 + O2
-Catalase (CAT): Catalyse la transformation du peroxyde d’hydrogène en eau et en oxygène
moléculaire lorsque la concentration intracellulaire de celui-ci est très élevée:
2 H2O2 → 2 H2O + O 2
- Glutathion peroxydase (GPx): Joue un rôle très important dans la détoxification de l'organisme
du peroxyde d'hydrogène et des hydroperoxydes organiques résultants de l'oxydation du
cholestérol ou des acides gras en couplant la réduction de ces dérivés réactifs avec l'oxydation de
substrats réducteurs comme le glutathion (GSH):
H2O2 + 2 GSH →
ROOH + 2 GSH →
GSSG + 2 H2O
GSSG + ROH + H2O
Comparativement à la catalase, la glutathion peroxydase présente une forte affinité pour le
substrat H2O2.
La glutathion réductase (GR), quant à elle, a pour rôle de régénérer le GSH à partir du GSSG
tout en utilisant le NADPH comme un cofacteur (Martínez-Cayuela, 1995):
GSSG + NADPH, H+ → 2 GSH + NADP+
Ces enzymes ont une action complémentaire sur la cascade radicalaire au niveau de l'anion
superoxyde O2.- et du H2O2, conduisant finalement à la formation de l'eau et de l'oxygène
moléculaire (Figure 4).
Figure 4: Schéma du mécanisme réactionnel invoqué dans la détoxification enzymatique
(Piquet et Hebuterne, 2007).
19
-
Système non enzymatique
Il existe un certain nombre de petites molécules, largement distribué dans les systèmes
biologiques, qui peut piéger les radicaux libres (Martínez-Cayuela, 1995). Ce groupe renferme
de nombreuses substances hydro- ou liposolubles endogènes synthétisées par les cellules, parmi
lesquelles on peut citer le glutathion (GSH), l'acide urique, la taurine et l'hypotaurine (Pincemail
et al., 2002).
D’autres composés exogènes apportés par l'alimentation peuvent aussi jouent le rôle des
antioxydants, tels que la vitamine E (tocophérol), la vitamine C (acide ascorbique), les
caroténoïdes et les flavonoïdes (Valko et al., 2007).
De plus, la prévention de l'initiation de réactions en chaîne comprend la fixation d'ions
métalliques, des ions de fer et de cuivre en particulier. Ainsi les protéines (ferritine, transferrine
et céruloplasmine) sont d'une importance centrale dans le contrôle de l'état rédox de l'organisme
(Sies, 1997).
I-3-4-Principaux tests d’activité antioxydante
Il y a une augmentation parallèle de l’intérêt des antioxydants et de l'application des
méthodes pour estimer l'efficacité de ces substances (Gioti et al., 2007).
De nombreuses méthodes sont utilisées pour l’évaluation de l’activité antioxydante d'un produit
pur ou d'un mélange. La plupart de ces méthodes sont basées sur la coloration ou la décoloration
d’un réactif dans le milieu réactionnel.
Les propriétés antioxydantes des extraits peuvent être évaluées in vitro grâce à plusieurs
méthodes telles que; ORAC (oxygen radical absorbance capacity), ABTS (acide 2,2’-azinobis (3
éthylbenzothiazoline-6- sulfonique)), FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) et DPPH (2,2diphenyl-1-picrylhydrazyl) (Thaipong et al., 2006).
Récemment, les mesures de l’activité antioxydante peuvent être aussi effectuées grâce aux
modèles basés sur les cultures cellulaires (Wolfe et al., 2008).
20
I-4-Métabolites secondaires
I-4-1-Alcaloïdes
Le terme d'alcaloïde a été introduit par W. Meissner au début de XIX e siècle pour désigner
des substances naturelles réagissant comme des bases, comme des alcalis (de l'arabe al-qali, la
soude et du grec eidos, l'aspect). Plus de 12000 alcaloïdes ont été isolés depuis la découverte de
la morphine (Croteau et al., 2000).
I-4-1-1-Définition
Un alcaloïde est un composé organique d'origine naturelle (le plus souvent végétale), azoté,
plus ou moins basique, de distribution restreinte et doté, à faible dose de propriétés
pharmacologiques marquées. Le regroupement d'un tel ensemble est par ailleurs confirmé par
des réactions communes de précipitation avec les « réactifs généraux des alcaloïdes» (Bruneton,
2009).
I-4-1-2-Nomenclature
Dans ce groupe de composés, la nomenclature systématique est peu utilisée. L'utilisation des
noms triviaux est dominante. Ce dernier, se termine typiquement par "ine" (Popl et al., 1990) ; il
dérive du nom du genre ou de l'espèce, du nom vulgaire, de l'effet physiologique, de l'aspect
physique de l'alcaloïde ou du nom de celui qui l’a découvert (Abed, 2003).
I-4-1-3-Classification
Les alcaloïdes sont généralement classés selon leurs précurseurs biogénétique communs et
la position de l'atome d'azote, en:
-
alcaloïdes vrais:
Les alcaloïdes vrais contiennent ordinairement un azote hétérocyclique dans leurs
structures qui dérivent des acides aminés.
-
Pseudo- alcaloïdes
Les pseudo-alcaloïdes présentent le plus souvent toutes les caractéristiques des
a1ca1oïdes vrais mais ce ne sont pas des dérivés des acides aminés. Il s'agit dans la majorité des
cas connus d'isoprénoïdes et l'on parle alors d'alcaloïdes terpéniques: monoterpéniques,
sesquiterpéniques, ou diterpéniques. Dans ce groupe on connait également des substances
issues du métabolisme de l'acétate, c'est le cas de la coniine, principe toxique de la ciguë.
21
-
Proto- alcaloïdes
Les proto-alcaloïdes sont des amines simples dont l'atome d'azote n'est pas inclut dans un
système hétérocyclique mais forme plutôt des groupements aminés latéraux.
Ils sont
biosynthétisés à partir des acides aminés (Aniszewski, 2007).
I-4-1-4-Propriétés physico-chimiques
Les alcaloïdes se caractérisent principalement par:
-
Masse moléculaire variant de 100 à 900 Dalton.
-
La quasi-totalité des structures connues comprenant dans leur formule de l'oxygène, sont
des solides cristallisables, rarement colorés. Les autres, non oxygénés, sont liquides à la
température ordinaire.
-
Presque toujours capables de dévier la lumière polarisée.
-
Les bases sont très peu ou insolubles dans l'eau, solubles dans les solvants organiques
apolaires et dans les alcools à titre élevé.
-
La basicité est un caractère très variable, elle dépend de la disponibilité du doublet libre
de l'azote. Des groupements électro-attracteurs adjacents à l'atome d'azote diminuent la
basicité alors que des groupements électro-donneurs l'exaltent.
-
La basicité des alcaloïdes permet la formation des sels avec des acides minéraux ou
organiques, et qui sont plus stables à la chaleur, la lumière et à l'oxygène que les formes
de bases libres.
-
Grâce à la capacité qu'ont les alcaloïdes de se combiner avec des métaux et des
métalloïdes, la caractérisation des alcaloïdes est possible avec des réactions de
précipitation par des réactifs généraux des alcaloïdes (Bruneton, 2009).
I-4-1-5-Distribution
Les alcaloïdes sont présents essentiellement chez les Angiospermes dont la plupart sont des
Dicotylédones. Cependant, de nombreux alcaloïdes ont également été trouvés chez des
Monocotylédones (Liliacées, Poacées) et même chez des Gymnospermes (Ephedra). Les
Ptérydophytes sont rarement alcaloïdifères (Bruneton, 2009).
Les plantes à alcaloïdes ne renferment que très rarement un seul alcaloïde, même si elles
contiennent parfois un composé très majoritaire (ex.; hyoscyamine de la feuille de belladone)
mais, il n'est pas rare que plusieurs dizaines d'alcaloïdes soient présents dans une même drogue,
voir des centaines (cas de la pervenche de Madagascar).
22
Généralement, tous les alcaloïdes d'une même plante ont une origine biogénétique commune, et
ils existent généralement sous la forme, soluble, de sels d'acides végétaux (citrate, malate,
tartrate, benzoate…etc.) ou sous celle d'une combinaison avec les tanins (Bruneton, 2009).
Les alcaloïdes sont exceptionnels chez les bactéries et assez rares chez les champignons
(Bruneton, 2009). Les structures alcaloïdiques existent aussi rarement chez les animaux. Dans
certains cas, ce sont des produits formés à partir des alcaloïdes contenus dans les végétaux inclus
dans la ration alimentaire de l'animal (ex.; castoramine de castor) et dans d'autres cas, ils
semblent être des produits du métabolisme de l'animal, c'est en particulier le cas chez des
Amphibiens Urodèles ou Anoures (Krief, 2003; Bruneton, 2009).
I-4-1-6-Localisation
La synthèse des alcaloïdes s'effectue généralement dans des sites précis (racines en
croissance, cellules spécialisés de laticifère… etc.). Ils sont ensuite transportés dans leurs sites de
stockage.
Les alcaloïdes sont le plus souvent localisés dans les tissus périphériques; assises externes des
écorces de tige et de racine, téguments des graine, etc. et rarement dans les tissus morts. Au
niveau cellulaire, la synthèse des alcaloïdes a lieu au niveau du réticulum endoplasmique et le
stockage dans les vacuoles (Krief, 2003).
La nature et la teneur en alcaloïdes peut être très inégale selon les organes d'une même
plante; certains pouvant en être dépourvus (Bruneton, 2009).
I-4-1-7-Origine biosynthétique
Pour les alcaloïdes vrais, le précurseur est un acide aminé; ornithine, lysine, phénylalanine,
tyrosine, tryptophane, histidine, acide anthranilique (Figure 5). La formation de l'alcaloïde peut
nécessiter l'intervention d'une seule molécule d'acide aminé (hygrine), de deux molécules de
même acide aminé (quinolizidines), plus rarement de deux acides aminés différents (tubulosine)
ou de plusieurs molécules du même acide aminé (spartéine).
Les réactions d’oxydation, d’alkylation, d’estérification, d’éthérifications, etc., justifient la
diversité structurale des alcaloïdes.
Dans le cas particulier des alcaloïdes terpéniques, les précurseurs ont une origine strictement
terpénique (Bruneton, 2009).
La figure 6 montre un exemple de biosynthèse de certains dérivés de phénylalanine.
23
Figure 5: Principaux hétérocycles de base et leurs précurseurs (Bruneton, 2009).
24
Figure 6: Exemple de biosynthèse de certains dérivés de phénylalanine (Dewick, 2002).
I-4-1-8-Intérêts des alcaloïdes
-
Fonctions au niveau du producteur:
Comme pour beaucoup d'autres métabolites secondaires, on ne sait pratiquement rien du rôle des
alcaloïdes dans les végétaux. La toxicité de certaines, laisse supposer des rôles de protection
contre les prédateurs (Krief, 2003). Certains auteurs estiment que ce sont des métabolites
terminaux «déchets inutiles». D'autres les désignent comme des métabolites intermédiaires
(Bruneton, 2009).
-
Actions pharmacologiques:
Leurs propriétés pharmacologiques concernent des domaines variés;
-
Dépresseurs (morphine, scopolamine) ou stimulants (caféine, strychnine) au niveau du
système nerveux central
-
Sympathomimétiques (éphédrine), parasympathomimétique (pilocarpine) au niveau de
système nerveux autonome
-
Anesthésiques locaux (cocaïne), antipyrétique (quinidine), anti-tumoraux (ellipticine),
anti-paludiques (quinine)…etc. (Bruneton, 2009).
25
I-4-2- Polyphénols: Flavonoïdes
Sous la désignation de composés phénoliques, on désigne un vaste ensemble de substances
qui possèdent un noyau benzénique auquel est directement lié au moins un groupement
hydroxyle, libre ou engagé dans une autre fonction, éther, ester, hétéroside. Leur définition prend
aussi en compte, l'origine biogénétique du noyau aromatique. Par conséquent, un composé
phénolique est un dérivé non azoté dont le ou les cycles aromatiques sont principalement issus de
l’acide shikimique ou/et de celui d'un polyacétate (Bruneton, 2009).
Les composés phénoliques sont fort répandus dans le règne végétal ; on les rencontre dans
les racines, les feuilles, les fleurs, les fruits et l'écorce. Ces composés représentent 2 à 3% de la
matière organique des plantes et dans certains cas même plus (Attou, 2011). Différents facteurs
externes et internes (lumière, rayonnement U.V., température, hormones, agents pathogènes
...etc.) sont fortement impliqués dans la régulation spatio-temporelle de l'expression du
métabolisme phénolique, se traduisant par des différences qualitatives et quantitatives
considérables entre les espèces, les organes et les stades physiologiques. Dans la vacuole, ils se
trouvent sous formes simples et solubles ainsi que les formes polymérisées plus ou moins
solubles (tannins). Par contre, les formes insolubles (lignines, formes liées à la subérine, la cutine
et à des macromolécules glucidiques) sont directement associées à la paroi (Macheix, 1996).
Au niveau de la plante, ils participent à des structures essentielles comme la lignine, à
l'arôme et la coloration de certains tissus, à la germination, la croissance et la floraison ou encore
à la protection de la plante vis-à-vis de son environnement biologique (agents pathogènes,
prédation) ou physique (rayonnement U.V.). Par ailleurs, ce sont des paramètres importants de la
qualité organoleptique des produits végétaux consommés par l'homme (Macheix, 1996). Les
composés phénoliques sont également dotés de nombreuses activités pharmacologiques; antiinflammatoire, antifongique, antimicrobienne, antioxydante…etc. (Bruneton, 2009).
Cette famille de composés chimiques correspond à une très large gamme de structures
chimiques et ils peuvent être classés selon plusieurs paramètres. Une classification tenant compte
du nombre d’atomes de carbone (consignée dans le tableau 3 ci-dessous) a été proposée par
Harbonne et Simmonds en 1964 (Chebrouk, 2009).
26
Tableau 3: Les principales classes de composés phénoliques.
Parmi toutes ces structures polyphénoliques, les flavonoïdes constituent une classe
importante dans le domaine pharmacologique.
Le terme « flavonoïde » désigne une très large gamme de composés naturels appartenant à la
famille des polyphénols. Ce sont des pigments quasiment universels des végétaux et qui sont
responsables de la coloration des fleurs, des fruits et parfois des feuilles. Tous les flavonoïdes
(plusieurs milliers) possèdent le même élément structural de base, à savoir l’enchaînement 2phénylchromane (Bruneton, 2009).
I-4-2-1-Structure et classification
Les flavonoïdes possèdent un squelette de base à quinze atomes de carbone constitué de
deux cycles en C6 (A et B) reliés par une chaîne en C3 (Grotewold, 2006). L'enchaînement
propanique est le plus souvent sous forme d'hétérocycle pyranique, à l'exception de deux
groupes; les chalcones et les aurones (Attou, 2011). (Figure 7)
27
Figure 7: Squelette de base et numérotation adoptée des flavonoïdes
Les diverses classes de flavonoïdes diffèrent en fonction de la cyclisation et du degré
d’insaturation et d’oxydation du cycle C alors que les composés individuels au sein d’une même
classe diffèrent par la substitution des cycles A et B (Balasundram et al., 2006). Les principales
classes de flavonoïdes sont représentées sur la figure 8.
Les flavonoïdes sont souvent hydroxylés en position 3, 5, 7, 3', 4' et / ou 5'. Fréquemment, une
ou plusieurs de ces groupes hydroxyles sont méthylés, acétylés, sulfatés ou prénylés. Dans les
plantes, les flavonoïdes sont souvent présents sous forme d’O- ou C-glycosides. Les formes
libres, sans sucres attachés, sont appelées génines. Les O-glycosides sont de loin les plus
fréquents. Ils portent leurs substituants sur les groupements hydroxyles de la génine,
généralement situé à la position 3 ou 7. Alors que pour les C-glycosides, la liaison se fait
directement avec un carbone de la génine, généralement les C-6 ou C-8. Les sucres les plus
rencontrés sont le rhamnose, le glucose, le galactose et l'arabinose. Deux disaccharides très
courants sont aussi fréquemment trouvés, le néohespéridose et le rutinose. Les sucres sont
souvent en outre substitués par des résidus d'acyles tel que l’acétate et le malonate (Rijke et
al.,2006).
28
Figure 8: Les diverses classes de flavonoïdes d’après Buneton (2009).
I-4-2-2-Extraction, séparation et identification
Les flavonoïdes sont des solides cristallisés dont la teinte varie du blanc ivoire au jaune vif
(Bouhadjer, 2005).
Dans la nature, les flavonoïdes sont généralement glycosylés. Ces sucres ainsi que les
groupements hydroxyles augmentent leur solubilité dans l’eau et les alcools, la méthylation et
l'estérification rendent les flavonoïdes lipophiles (Attou, 2011). Les génines sont pour la plupart,
solubles dans les solvants organiques apolaires; lorsqu'elles ont au moins un groupe phénolique
libre, elles se dissolvent dans les solutions d'hydroxydes alcalins (Bruneton, 2009).
L’extraction peut s'effectuer par des mélanges hydro-alcooliques, les solutions obtenues sont
évaporées sous vides et, lorsque le milieu ne contient que de l'eau, on précède à une série
d'extractions liquide-liquide par de l'éther de pétrole qui élimine la chlorophylle et les lipides, par
29
du diéthyléther qui extrait les génines libres et puis par l’acétate d’éthyle qui entraine la majorité
des hétérosides. Les sucres libres restent dans la phase aqueuse avec, les hétérosides les plus
polaires (Bruneton, 2009).
La séparation et la purification des différents flavonoïdes sont fondées sur les techniques
chromatographiques (CP, CCM, HPLC, CPG). L’identification se fait par différentes méthodes
telles que la chromatographie couplées aux techniques spectroscopiques, la spectrophotométrie
UV/Visible, la spectrométrie de masse et la spectroscopie RMN (Bruneton, 2009).
Tous les flavonoïdes contiennent au moins un cycle aromatique et, par conséquent, absorbent
efficacement la lumière UV. Le premier maximum, qui se trouve dans la plage de 240 à 285 nm,
est dû au cycle A et le second maximum, qui est dans la plage de 300 à 550 nm, est due au cycle
C. Le maximum d'absorption est influencé par la substitution de ces cycles (Rijke et al., 2006).
I-4-2-3-Distribution et localisation
A l'exception de quelques flavonoïdes qui ont été isolés d’un corail marin, Fchinophora
lamellosa et d’un petit nombre de champignons y compris Aspergillus candidus, seules les
plantes ont la capacité de biosynthétiser les flavonoïdes (Iwashina, 2000). Ils sont fréquents chez
les
Bryophytes, les Ptéridophytes et les Gymnospermes, mais la diversité structurelle est
maximale chez les Angiosperme (Bruneton, 2009).
Les formes hétérosidiques des flavonoïdes, hydrosolubles, s'accumulent dans les vacuoles
et, selon les espèces, se rencontrent dans les cellules épidermiques des fleurs, les parenchymes
des tiges et des racines, l'épiderme ou répartis entre la mésophylle et l'épiderme des feuilles. Les
génines seules, en particulier les flavonoïdes simples et polyméthylés, sont présentes dans les
exsudats farineuss de certaines plantes, dans les cuticules des feuilles, écorces et bourgeons, ou
sous forme de cristaux dans les cellules de cactus, espèce Asptrophytum (Bruneton, 2009;
Iwashina, 2000).
La forte tendance des plantes taxonomiquement proches à produire les mêmes types de
flavonoïdes, ont fait des flavonoïdes des marqueurs chimiotaxonomiques de choix pour la
classification végétale (Bruneton, 2009).
30
I-4-2-4- Biosynthèse des Flavonoïdes
Les différentes classes de flavonoïdes sont biogénétiquement et structurellement
apparentées (Manach et al., 2004). Le cycle A est formé à partir de trois molécules de malonylcoenzyme A (malonyl-CoA), issues du métabolisme du glucose. Les cycles B et C proviennent
eux aussi du métabolisme du glucose mais par la voie du shikimate (Balasundram et al., 2006).
Après désamination d’un acide aminé essentiel, la phénylalanine par la phényl ammonia lyase
(PAL) qui conduit à la formation du cinnamate, ce dernier est ensuite transformé en acide
coumarique puis en 4-coumaroyl-coenzyme A, respectivement sous l'action de l’enzyme
cinnamate-4-hydroxylase (C4H) et la CoA-ligase (4CL) (Bensegueni, 2007). L’étape clé de la
formation des flavonoïdes est la condensation, catalysée par la chalcone synthase, de trois
molécules de malonylcoenzyme A avec le 4- coumaroyl- coenzyme A, aboutissant à la
formation de 4,2',4',6' tétrahydroxychalcone. Sous l'action de la chalcone isomérase, la fermeture
stéréospécifique du cycle C conduit à la seule (2-S)-flavanone: la naringénine. Cette chalcone
peut également se cycliser en aurone. Il est le précurseur commun de toutes les classes de
flavonoïdes (Bruneton, 2009; Manach et al., 2004).
Des étapes ultérieures, surtout de réarrangement, oxydation, alkylation, glycosylation et
d'acylation, amènent les flavonoïdes à la forme définitive dans laquelle ils se trouvent in vivo
(Chebrouk, 2009).
Le cas particulier des flavonoides C-méthylés s’expliquerait par la présence d’une
méthylchalcone synthase qui catalyserait la réaction de condensation entre méthymalonyl-CoA
et le 4-coumaroyl-CoA pour donner la chalcone méthylée correspondante qui par suite des
réactions conduirait aux autres flavonoides C-méthylés (Portet, 2007).
La figure 9 ci-dessous présente un schéma de biosynthèse des flavonoïdes.
31
AS
Figure 9: Biosynthèse des flavonoïdes (Portet, 2007).
CS : chalcone synthase; CI : chalcone isomérase; F3H : Flavanone 3-hydroxylase;
IFS: isoflavone synthase; DFR: dihydroflavonol réductase; AS: anthocyanine synthase.
R=-H, -OH ou -OCH3
OG= -O-sucre
32
I-4-2-5-Intérêts des flavonoïdes
Fonctions au niveau du producteur
Les flavonoïdes jouent un rôle important dans les plantes:
- Pigmentation des tissus végétaux, fleurs, fruits et parfois des feuilles,
- Grâce à la coloration des fleurs, ils exercent un effet attracteur sur les insectes et les oiseaux
pollinisateurs, assurant par ce biais une étape fondamentale de la reproduction,
- Composés de défense en repoussant certains insectes et prédateurs par leur goût désagréable,
- Protection contre les rayonnements UV,
- Impliqués dans la production de nodules racinaires comme un système de fixation de l'azote
après l'infection par le Rhizobium chez les Fabacées (Rijke et al., 2006).
- Impliqués dans les processus de germination, floraison, tuberisation et croissance racinaire
(Macheix, 1996).
Actions pharmacologiques
Les flavonoïdes reçoivent une attention considérable à cause de leur importance
thérapeutique.
Les flavonoïdes peuvent
jouer un rôle important dans la prévention de nombreuses
maladies associées au stress oxydatif tels que le cancer, les maladies cardiovasculaires et les
maladies neurodégénératives. En général, parce que l'atome d'hydrogène phénolique est
beaucoup plus facilement prélevable, les composés phénoliques, sont capables de concurrencer
très efficacement avec un substrat oxydable pour les radicaux libres. Le radical flavonoïde ainsi
formé est stable et interrompt les évènements de dégradation cellulaire initiés par l’attaque
radicalaire (Bruneton, 2009; Manach et al., 2004; Rustaiyan et al., 2011).
Les isoflavones présentent une similitude structurale avec les oestrogènes. Bien qu'ils ne
soient pas de nature stéroïdienne, ils ont des groupes hydroxyle en positions 7 et 4' dans une
configuration analogue à celle des groupes hydroxyle dans la molécule d'œstradiol. Ce qui leur
confère des propriétés pseudohormonales, grâce à la capacité de se lier aux récepteurs
d'oestrogène, et ils sont par conséquent classés comme phyto-oestrogènes (Manach et al., 2004;
Rijke et al., 2006)
En règle générale, les flavonoïdes sont, in vitro, des inhibiteurs enzymatiques: inhibition
de la hyaluronidase, par les flavones et surtout par les proanthocyanidols ce qui permettrait de
conserver l’intégrité de la substance fondamentale de la gaine vasculaire; Inhibition de la
catéchol-O-méthyltransférase, ce qui augmenterait la quantité de catécholamines disponibles et
33
donc provoquerait une élévation de la résistance vasculaire; inhibition de l’aldose-réductase,
impliquée dans la pathogénie de la catarate, par le quercitroside et méthoxyflavones; inhibition
de la protéine- kinase, notamment par le lutéolol; inhibition de la 5-lipoxygénase et donc de la
production des leucotriènes médiateurs de l'inflammation et des manifestations allergiques
(Bruneton, 2009).
Plus rarement par contre, les flavonoïdes peuvent stimulés une activité enzymatique, c'est le cas
de la proline-hydroxylase. Cette stimulation favorise l'établissement de pontages entre les fibres
de collagène, renforçant ainsi leur solidité et leur stabilité, s'opposant à leur dénaturation
(Bruneton, 2009).
Autres propriétés pharmacologiques sont aussi attribués aux flavonoïdes; vasculoprotecteurs en
diminuant la perméabilité des capillaires et en renforçant leur résistance. Ils sont hépatoprotecteurs, antispasmodiques, hypocholestérolémiants, diurétiques, antibactériens, antiviraux,
anticancérigènes et antimutagènes (Bruneton, 2009).
34
II-1-Matériel végétal
Matériel et méthodes
La reconnaissance botanique de la plante a été faite par Monsieur Eddoud Amar du
département des sciences biologiques de l'université Kasdi Merbah de Ouargla.
Le matériel végétal utilisé correspond à la partie aérienne composée des rameaux et des feuilles
de l’espèce Ephedra alata alenda réduites en écailles et la partie souterraine. La récolte s'est
effectuée le 7/11/ 2014 au niveau de la localité de N'Goussa (wilaya de Ouargla).
Le séchage s'est fait à la température ambiante, à l'abri de la lumière et de l’humidité afin d'éviter
la dégradation des principes actifs et le développement des moisissures (Catier et Roux, 2007).
Après séchage, les deux parties de la plante ont été broyées séparément et stockées
soigneusement dans un endroit sec en vue de leurs analyses.
II-2-Présentation du site de récolte
Ouargla est située dans le sud-est de l'Algérie, à 800 km de la capitale Alger , de l'État n° 30
dans la division administrative de l'Algérie. Elle s'étend sur une superficie de 163 230 km2, et
compte actuellement 21 communes regroupées en 10 Daïras. Limitée au nord par Djelfa, el-Oued
et Biskra, à l'est par la Tunisie, au sud par les wilayas de Tamanrasset et Illizi et à l'ouest par
Ghardaïa (annuaire statistique pluri-annulaire-1998, 2004,2008-, 2009), elle demeure l'une des
collectivités administratives les plus étendues: les coordonnées géographiques sont 31° 57' 10"
Nord latitude et 5° 19' 54" Est longitude; avec une altitude 157 m (Benameur-Saggou, 2009).
Les données climatiques sont présentés dans le tableau 4.
35
Tableau 4: Données climatiques de la région d’Ouargla de 1958 à 2014 (Tutiempo, 2015).
Année
T
TM
Tm
PP
V
RA SN TS FG TN GR
1958
22.2 29.1 15.8 -
13.3 28
0
1
3
0
0
1966
22.2 29.6 15.1 -
10.0 18
0
2
0
0
0
1983
22.9 30.4 -
102.87
-
5
0
1
1
0
0
2000
23.2 30.5 15.9 163.04
-
9
0
7
0
0
0
2001
24.5 31.7 16.8 -
13.9 8
0
4
0
0
0
2003
23.9 30.5 16.7 42.40
13.7 13
0
4
2
0
0
2004
23.6 30.2 16.8 114.29
13.7 27
0
10 1
0
0
2006
24.0 30.9 16.8 26.42
13.6 23
0
4
3
0
0
2007
23.7 30.8 16.4 12.94
14.5 14
0
7
0
0
0
2008
23.8 30.9 16.6 49.04
14.2 16
0
6
3
0
0
2009
23.6 30.8 16.0 123.44
-
25
0
7
1
0
0
2010
24.5 32.0 16.9 24.13
14.1 19
0
10 0
0
0
2011
23.6 30.8 15.8 337.83
14.3 10
0
10 2
0
0
2012
24.1 31.3 16.0 54.63
13.1 17
0
6
0
0
1
2013
24.1 31.2 16.5 33.52
14.1 14
0
8
0
0
0
2014
24.5 31.7 16.9 31.74
13.7 9
0
5
0
0
1
T:
Température moyenne annuelle
TM:
Température maximale moyenne annuelle
Tm:
Température minimale moyenne annuelle
PP:
Précipitation totale annuelle de pluie et/ou neige fondue (mm)
V:
Vitesse moyenne annuelle du vent (Km/h)
RA:
Total jours de pluie durant l’année
SN:
Total jours de neige durant l’année
TS:
Total jours de tempête durant l’année
FG:
Total jours de brouillard durant l’année
TN:
Total jours de tornades ou nuages en entonnoir durant l’année
GR:
Total jours de grêle durant l’année
36
II-3-Enquête ethnobotanique
D'après la littérature, l'Ephedra est une plantes de grande importance à l'échelle mondiale.
Elle est connue depuis des milliers d'années et occupe une place importante dans la médecine
traditionnelle surtout chinoise. A l'époque contemporaine, elle a reçu un intérêt supplémentaire
comme plante efficace pour la perte de poids et l'amélioration des performances physiques
(Abourashed et al. 2003; Caveney et al., 2001).
En vue de rendre compte de la valeur de cette plante, représentée dans la région de Ouargla
par l'espèce E.alata, une enquête ethnobotanique est lancée auprès de la population. Au cours de
cette enquête 137 personnes de 26 à 90 ans (38 hommes et 98 femmes) de différentes régions,
Ouargla, Touggourt, El-oued, Ghardaïa et Adrar ont été questionnées. (La fiche d'enquête est
présentée en Annexe 1).
II-4-Tests phytochimiques préliminaires
La partie aérienne ainsi que la partie souterraine de l'Ephedra alata alenda réduites en
poudre ont subi différentes tests chimique afin de mettre en évidence la présence ou l'absence des
principales familles de métabolites secondaires. Mais avant cela, différents extraits ont été
préparés selon Daniel (2013).
Préparation des extraits
Différents extraits sont préparés à partir de la poudre de la plante selon la solubilité des
métabolites à mettre en évidence:
-Un extrait éthéré; préparé par macération pendant 3 h dans un flacon bouché et bien protégé de
la lumière d’1g de la poudre dans 10 ml d'éther diéthylique. Après filtration cet extrait est destiné
à la détection des composés de faible polarité tels les stéroïdes et les terpénoïdes, les triterpènes
en l'occurrence (Daniel, 2013).
- Un extrait hydroéthanolique; préparé par macération pendant 3 h dans un flacon bouché et bien
protégé de la lumière, de 1 g de la poudre dans 10 ml d'éthanol à 50%. Après filtration cet extrait
est destiné à la détection des composés polaires tels les sels d'alcaloïdes, les hétérosides
cardiotoniques et les polyphénols y compris les tanins et les flavonoïdes (Daniel, 2013).
-Une décoction à 1%, préparée par ébullition dans l'eau pendant 30 minutes, est destinée à la
détection des saponosides (Daniel, 2013).
-Une infusion à 10 % destinée à la mise en évidence des sucres réducteurs (Daniel, 2013).
37
1-Caractérisation des alcaloïdes
On met 3 ml d'extrait éthanolique dans deux tubes à essai, auxquels on ajoute 1 goutte d'HCl
concentré, et puis 2 gouttes de réactif de Dragendorff pour le premier tube et 2 gouttes de réactif
de Bouchardat pour le deuxième.
La présence des alcaloïdes est révélée par l'apparition de précipité orangé avec le réactif de
Dragendorff et brun rougeâtre avec le test de Bouchardat (Koffi et al., 2009) (Hammoudi, 2009
2-Caractérisation des polyphénols
La réaction au chlorure ferrique (FeCl3) permet de caractériser les polyphénols. A 2 ml de
l'extrait éthanolique, une goutte de solution aqueuse de chlorure ferrique à 5% est ajoutée.
L’apparition d’une coloration bleu-noirâtre ou verte plus ou moins foncée, indique la présence de
polyphénols. (Koffi et al, 2009)
3-Caractérisation des tanins
La caractérisation des tanins était faite par la réaction au chlorure ferrique.
A 30 ml de l'extrait éthanolique nous avons ajouté 15 ml du réactif de Stiasny (10 ml de formol à
40% plus 5 ml d'HCl concentré), puis chauffé au bain-marie à 90°C pendant 15 mn. L'obtention
d'un précipité montre la présence de tanins catéchiques.
Nous avons filtré et saturé le filtrat avec 5 g d'acétate de sodium pulvérisé. Le développement
d’une teinte bleu noire après l'addition de 1 ml d’une solution de FeCl3 à 1% indique la présence
de tanins galliques (Togola, 2002).
4-Caractérisation des flavonoïdes
Deux tests pour la confirmation du résultat ont été réalisés:
1-A partir d'1 g de la plante réduite en poudre, on prépare un macérât de 24h dans 15 ml
d'HCl 1%. À 10 ml de filtrat, on ajoute du NH4OH jusqu'à basicité. L'apparition d'une coloration
jaune indique la présence des flavonoïdes (Abed, 2009).
2-Trois ml de macérât alcoolique sont versés dans un tube à essai. Quelques gouttes d'alcool
chlorhydrique sont additionnées à cette solution ainsi que quelques copeaux de magnésium
(Réaction dite à la cyanidine). Les colorations suivantes se développent en présence des
flavonoïdes:
*Rouge cerise pour les noyaux de type flavonol;
*Orangé pour les noyaux de type flavone;
*violet pour les noyaux de type flavanone (Daniel, 2013).
38
5-Caractérisation des dérivés anthracéniques
Les dérivés anthracéniques se trouvent dans les plantes soit sous forme de génine libre ou
sous forme combinée d'hétérosides anthracéniques. Le résidu de la poudre épuisé par l'éther
servira à la mise en évidence des dérivés hétéro-osidiques, alors que le filtrat s'utilisera pour la
détection des formes libres. (Togola, 2002)
-Anthraquinones libres
A 1 ml de l'extrait éthéré est ajouté 1 ml de NH4OH à 10 %, après agitation, le
développement d’une couleur rouge indique la présence des dérivés anthracéniques libres.
-O-hétérosides
A la poudre épuisée (1 g dans 10 ml d'éther diéthylique) sont ajoutés 10 ml d'H2O plus 1 ml
d'HCl concentré. L'ensemble est chauffé à 90C° au bain marie pendant 15 minutes. Après
refroidissement sous un courant d'eau froide et une filtration, 5 ml de CHCl3 sont ajouté à 5 ml
de filtrat. A la phase organique séparée, on ajout 1 ml de NH4OH à 25%. L'apparition d'une
coloration rouge plus ou moins intense indique la présence des O- hétérosides.
-O-hétérosides à génine réduite
A 5 ml de filtrat aqueuse précédent sont ajouté 2 à 3 gouttes de FeCl3 à 10 %. Chauffer au
bain marie pendant 5 minutes. Après refroidissement sous courant d'eau froide, extraire ensuite
avec 5 ml de CHCl3. Ajouter 1 ml de NH4OH à 25% à la phase organique. L'apparition d'une
coloration rouge plus intense qu'au départ indique la présence des anthranols ou anthrones.
-C-hétérosides
La solution aqueuse, épuisée par le dichlorométhane (DCM) dans le test des O-hétérosides,
est ajoutée à 5 ml d'eau et 1 ml de FeCl3 à 10%. Après chauffage au bain marie pendant 30
minutes, on extrait avec 5 ml de CHCl3, on récupère la phase organique et on lui ajoute 1 ml de
NH4OH à 25%. L'apparition de coloration rouge indique la présence des C-hétérosides.
39
6-Caractérisation des hétérosides cardiotoniques
Test de Tedrose
10 ml du macérat alcoolique est extrait avec 10 ml d'un mélange de CHCl3/C2H5OH, la phase
organique est séparée pour subir une évaporation dont le précipité est dissout dans 3 ml d'acides
acétique glacial, après l'ajout de quelques gouttes de FeCl3 puis de 1 ml d'H2SO4, l'absence de la
couleur vert-bleue dans la phase acide indique l'absence des cardénolides (Abed, 2009;
Hammoudi, 2009).
Test de trichlorure d'antimoine
Un extrait de l'alcool éthylique 70 % est évaporé à basse pression, au précipité obtenu on
ajoute le réactif de trichlorure d'antimoine (préparé dans le chloroforme), l'absence d'une
coloration violette indique l'absence des cardénolides (Abed, 2009).
7-Caractérisation des stérols et triterpènes
Réaction de Liebermann-Burchard
5 ml de l'extrait éthéré sont évaporés à sec, le résidu est repris par 5 ml de chloroforme, la
solution est transférée dans 2 tubes à essai, puis 1 ml de l'anhydride acétique est ajouté à l'un des
tubes. Ensuite 1 ml d'acide sulfurique est ajouté au fond de chaque tube avec précaution et sans
agitation. L'absence d'une coloration mauve tirant au vert après quelques minutes dans le premier
tube indique l'absence des stéroïdes, l'apparition à l'interface d'un anneau rouge brunâtre dans le
deuxième tube indique la présence des noyaux terpéniques. (Daniel, 2013; Saeed et al., 2012;
Bruneton, 1999).
8-Caractérisation des composés réducteurs
Introduire 2 ml d’extrait (infusé à 10%) dans un tube, ajouter 2 ml de liqueur de Fehling
(1ml réactif A et 1ml réactif B) et incuber l’ensemble 8 min. dans un bain marie bouillant.
L’apparition d’un précipité rouge brique indique la présence des composés réducteurs (Azzi,
2013).
9-Caractérisation des saponosides: Indice de mousse
L'indice de mousse est fourni par le degré de dilution d'un décocté aqueux de la drogue qui,
dans des conditions déterminées, donne une mousse persistante.
40
A 1 g de poudre grossière, on ajoute 100 ml d'eau bouillante. Porter à l'ébullition pendant 30
min et filtrer.
Dans une série de 10 tubes à essai de 1,3 cm de diamètre, introduire successivement 1, 2, 3..., 10
ml de décocté et ajuster le volume de chaque tube à 10 ml avec de l'eau distillée. Agiter chaque
tube dans le sens de la longueur pendant 15 s à raison de deux agitations par seconde, après
l'avoir bouché avec le pouce. Laisser reposer pendant 15 min et mesurer la hauteur de la mousse
produite dans chaque tube.
Líndice de mousse (I) est calculée par la formule suivante : I = 1000 /N
N est le numéro du tube à partir duquel la hauteur de mousse est égale à 1 cm.
La présence de saponines dans la plante est confirmée avec un indice supérieur à 100 (Azzi,
2013; Pharmacopée française, 1989)
II-5-Extractions
II-5-1-Extraction des alcaloïdes
Puisque le genre de la plante porte le nom d'un alcaloïde, l'éphédrine, qui semble être le
responsable de la plupart des activités pharmacologiques de la plante (Abourashed et al., 2003),
un intérêt supplémentaire a été donné à l'étude des alcaloïdes surtout de point de vue analytique
(CCM et GC-MS) en vue de la mise en évidence de cet alcaloïde ou de l'un de ses dérivés.
II-5-1-1-Principe de l'extraction des alcaloïdes
Les alcaloïdes sont des composés organiques à caractère basique qui existent habituellement
dans les plantes à l'état de combinaisons salines et dont l’extraction est basée sur la différence de
leurs solubilités en milieu acide et en milieu alcalin:
*-Les alcaloïdes, à pH basique, sont sous forme de bases insolubles ou peu solubles dans l'eau,
et solubles dans les solvants organiques apolaires et les alcools à titre élevés.
*- En milieu acide, les alcaloïdes sont à l'état de sels fortement solubles dans l'eau et les
alcools dilués, ils sont par contre insolubles dans les solvants organiques apolaires (Bruneton,
2009).
41
II-5-1-2-Extraction des alcaloïdes totaux
La méthode d'extraction préférentiellement employée pour l'extraction des alcaloïdes est
celle qui se déroule dans un milieu alcalin, appelée aussi la méthode (Stas–Otto) (Bruneton,
1999). Les étapes suivies sont citées ci-dessous :
-
la plante réduite en poudre est délipidée par macération dans de l’éther de pétrole à
température ambiante pendant 24h.
-
le marc est humecté avec NH4OH 5% aussi pendant 24h à température ambiante.
L'addition de la base a pour but de déplacer les alcaloïdes de leurs combinaisons salines;
les bases alcaloïdiques ainsi libérées peuvent être extraites par un solvant organique.
-
les alcaloïdes sont extraits à chaud sous reflux au Soxhlet par le dichlorométhane (5
cycles).
-
concentration de la phase organique sous pression réduite.
-
extraction liquide-liquide avec de l'eau acidulée (H2SO4 à 2%) jusqu’à épuisement total.
L'épuisement est vérifié par le réactif de Mayer,
-
ajustement du pH de la phase aqueuse à 9 avec de l'NH4OH,
-
extraction liquide-liquide par le DCM jusqu’à épuisement total,
-
les fractions organiques sont récupérées dans un erlenmeyer, déshydratées avec du sulfate
de sodium anhydre puis filtrées.
-
évaporation de la phase organique sous pression réduite à 40 °C et récupération des
alcaloïdes basiques totaux
II-5-1-3-Extraction sélective de l'Ephédrine
En se basant sur les informations fournies par la littérature concernant l’éphédrine qui est
un alcaloïde volatil, ces composés peuvent être extraits par entrainement à la vapeur d’eau après
alcalinisation du milieu avec une base fixe (chaux, soude, magnésie) (Manske et Holmes, 1969;
Javillier, 1959). Contrairement à la règle générale de la solubilité des alcaloïdes, l’éphédrine sous
forme de base libre présente une solubilité dans l’eau, en plus de sa solubilité dans l’alcool, le
CHCl3 et l’éther (Manske et Holmes, 1969).
Nous avons donc tenté de l'extraire sélectivement par hydrodistillation en utilisant un appareil
de type Clevenger et ce après sa libération de ses combinaisons salines par une base forte (pKa
de l'éphédrine=9.96). Pour diminuer sa solubilité dans l'eau de façon importante lors de
l’extraction liquide -liquide, nous avons saturé la phase aqueuse avec du NaCl. Le protocole
adopté pour cette extraction est comme suit :
42
-
la partie aérienne réduite en poudre (350 g) est délipidée avec de l'éther de pétrole à la
température ambiante pendant 24h;
-
le marc, après séchage à l'air libre, est alcalinisé avec une base forte, nous avons utilisé le
NaOH à 5% pendant 24h à la température ambiante dans un récipient bien fermé pour
empêcher l’évaporation des composés volatils.
-
le mélange contenant les alcaloïdes sous forme de bases libres a subit une
hydrodistillation afin de ne récupérer que les alcaloïdes volatils.
-
ensuite, le distillat saturé avec de le NaCl, est soumit à une extraction liquide-liquide
avec le DCM jusqu'à épuisement totale vérifié par le réactif de Mayer.
-
La phase organique contenant la forme libre des alcaloïdes est évaporée l’évaporateur
rotatif à 40 C° après séchage par Na2SO4.
II-5-2-Extraction des composés phénoliques
La méthode utilisée est celle de l'extraction par macération avec un gradient de polarité
croissante, en utilisant des solvants de plus en plus polaires. Les systèmes de solvants de polarité
croissante utilisés sont : le cyclohexane (C-Hex), le dichlorométhane (DCM), l'acétate d'éthyle
(AcOEt) et le méthanol(MeOH). Les extractions sont répétées pour chaque solvant trois fois
après macération pendant 24h à chaque fois.
Les extraits organiques subissent en suite une évaporation sous pression réduite à une
température de 40 °C. Après séchage total à l'air libre, les extraits sont pesés afin de déterminer
les rendements (Diallo et al., 2004).
43
II-6- Activités biologiques
II-6-1-Activité antibactérienne
Plusieurs études dans le monde ont signalé l’Ephedra comme une plante antimicrobienne
(Yan et al., 2012; AL-Qarawi et al., 2013; Shahidi Bonjar, 2004; Mohamed Soltan et Kamal
Zaki , 2009; Bussmanna et al., 2008; Bussmanna et al., 2010; Parsaeimehr et al., 2010). Alors
que Peu d’étude sur le plan local (Chebouat et al., 2014) (Kessal et Bouafia., 2003) et surtout
aucune recherche n’a ciblé l’effet des parties aérienne (rameaux et feuilles réduites en écailles) et
souterraine séparément. Nous avons donc décidé de l'étudier en testant l'activité de différents
extraits de l'Ephedra alata alenda sur deux souches à GRAM négatif et une souche à GRAM
positif.
II-6-1-1-Souches ciblées
Staphylococcus aureus
Cocci, à GRAM positif, de la famille des Micrococcaceæ, immobile et disposées en grappe
de raisins, présente sur le corps et les muqueuses, et souvent responsable d’infections graves
communautaires et nosocomiales (20 % des cas). Cette bactérie est responsable d’infections des
plaies, de la peau et du sang. Elle peut entraîner aussi des abcès, des ostéites, des endocardites,
des gastro-entérites et des infections pulmonaires. L'espèce Staphylocoque doré acquiert
facilement des résistances aux antibiotiques (Perry et al., 2004; Lowy, 1998).
Pseudomonas aeruginosa
Bacille à GRAM négatif mobile, opportuniste, fréquemment incriminée dans les infections
nosocomiales grâce à sa capacité de persister dans les milieux hospitaliers, sa résistance naturelle
et son pouvoir dácquisition de multiples mécanismes de résistance aux antibiotiques. Au cours
des deux dernières décennies, láugmentation de la prévalence des infections à P. aeruginosa
multirésistants (PAMR) a été rapportée par plusieurs centres hospitaliers à travers le monde
(Chinbo et al., 2014). P. aeruginosa est impliquée dans les infections des plaies et de l’appareil
respiratoire, infections des voies urinaires et les septicémies (Perry et al., 2004).
Escherichia coli
Bacille à GRAM négatif, appartient à la famille des Enterobacteriaceae, largement impliqué
dans les infections des voies urinaires, dans la péritonite, septicémies, cholangite et d'autres
gastro-entérites (Paterson, 2006).
44
II-6-1-2-Méthode de détermination de l’activité antibactérienne
L'activité antibactérienne de nos extraits s'est testée en utilisant la méthode de diffusion sur
disques en milieu gélosé.
La gélose Mueller-Hinton stérile est coulée dans des boites Pétrie stériles à 4 mm d'épaisseur
et laissée se gélifier. A partir d'une culture jeune de 24 h, un inoculum de turbidité d'environ 0.5
McFarland (108 UFC/ml) est préparé à partir des colonies bien isolées dans de l'eau
physiologique stérile. L’ensemencement de l’inoculum est réalisé en surface (ensemencement en
nappe). Des disques stériles en papier Whatman N°3 de 5 mm de diamètre sont imprégnés avec
l'extrait à tester, préparé dans le DSMO à 30 µg d'extrait/disque (10µL d'une préparation de 3
mg/ml), afin d'obtenir des résultats comparables avec celui du témoin positif (Nitroxaline 30
µg/disque). Le témoin négatif était un disque imprégné avec le DMSO. Ensuite, les disques sont
appliqués avec une légère pression à l’aide d'une pince stérile afin d'assurer le contact avec la
surface de la gélose. Les boites sont incubées à l'étuve à 37°C en position inversée durant 24 h
(Parsaeimehr et al., 2010).
L’absence de croissance bactérienne se traduit par un halo translucide autour du disque dont
le diamètre est mesuré et exprimé en centimètre. Les écart-types ont été calculés à partir de trois
séries d'expériences.
II-6-2-Activité antioxydante
De multiples études antérieures ont ciblé l'activité antioxydante de différentes espèces de
l'Ephedra, alors qu'aucune étude n'a évalué le potentiel antioxydant des extraits de l'E.alata
alenda de la région d'Ouargla. Nous avons donc choisi d'investiguer son pouvoir antioxydant en
utilisant deux tests différents.
II-6-2-1-Test du piégeage du radical libre DPPH
II-6-2-1-1-Principe du test
D'un point de vue méthodologique, le test au radical libre DPPH• est recommandé pour des
composés contenant des groupes -SH, -NH et –OH. Le 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyle possède
un électron non apparié sur un atome d’azote. Ce radical ne forment pas des dimères, il reste
donc sous sa forme monomère qui est relativement stable (Popovici et al., 2009).
45
La réduction du DPPH• par un agent antioxydant en DPPH-H induit une perte de sa couleur
violette foncée qui va se transformer en jaune pâle (Molyneux, 2004) (figure 10). Cette réaction
qui s’effectue à température ambiante pour éliminer tout risque de dégradation thermique des
molécules thermolabiles (Popovici et al., 2009) peut être suivie spectrophotométriquement en
mesurant la diminution de son absorbance entre 515-518 nm. (Molyneux, 2004)
Figure 10: Mécanisme réactionnel intervenant lors du test DPPH•entre l'espèce radicalaire
DPPH• et un antioxydant (AH)
II-6-2-1-2-Protocole de l'activité anti-radicalaire par le test DPPH
L’activité anti-radicalaire des différents extraits a été testée par la méthode du radical libre
DPPH. Pour chaque extrait et pour chaque concentration, 100 μL d'extrait préparé dans le
méthanol est additionné à 3.9 ml de solution DPPH préparée à 63.4 µM dans de méthanol.
L’absorbance est mesurée au spectrophotomètre après 30min à la longueur d’onde de 515 nm. Le
pourcentage d'inhibition du DPPH est déterminé par la formule suivante :
Pourcentage d’inhibition= [(Absorbance du contrôle -Absorbance du test)/Absorbance du contrôle] x100
Où le contrôle est préparé, en parallèle, en mélangeant 100μL de méthanol avec 3.9 ml de la
solution méthanolique de DPPH.
Pour pouvoir valoriser le pouvoir anti-radicalaire de nos extraits, l'activité antioxydante de
l'acide ascorbique est mesurée de la même façon que l’échantillon (Gramza-Michałowska et
Człapka-Matyasik, 2011).
Pour mieux caractériser le pouvoir antioxydant de nous extraits, nous avons introduit le
paramètre IC50.
46
L’indice IC50 montre les concentrations de l’antioxydant qui sont nécessaires pour faire
décroitre la concentration initiale du DPPH• avec 50%. La capacité antioxydante d'un composé
est d'autant plus élevée que son IC50 est petite (Popovici et al., 2009).
Les résultats sont exprimés en g/L et les écart-types ont été calculés à partir de trois séries
d’expériences.
II-6-2-2-Test de FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power)
II-6-2-2-1-Principe du test
Ce test est basé sur la réduction d'un complexe tripyridyltriazine ferrique] en un complexe
tripyridyltriazine ferreux par un antioxydant (AH), à un pH de 3.6 qui maintient la solubilité du
fer. Lors de la réduction du complexe ferrique en complexe ferreux une coloration bleue intense
apparaît, ce qui permet de suivre la réaction en mesurant l’absorbance du produit à 593 nm
(Figure 11).
Figure 11: Mécanisme réactionnel intervenant lors du test FRAP entre
le complexe tripyridyltriazine ferrique Fe(III)-TPTZ et un antioxydant (AH).
II-6-2-2-2-Protocole du test de l'activité antioxydante via le test FRAP
Le réactif de FRAP est constitué du mélange suivant : 25 ml de Tampon acétate (pH 3.6),
2.5 ml TPTZ (10 mM) préparé dans l'HCl à 40 mM, et 2.5 m FeCl3-3H2O (20 mM).
150 μL d’extrait de différentes concentrations préparé dans le méthanol, sont ajouté à 2850 μl de
la solution du FRAP. La lecture est réalisée après 30 min à 593 nm contre un blanc constitué de
150 µL de méthanol et 2850 µL de solution de FRAP (Thaipong et al., 2006).
47
Des courbes d’étalonnage de l’acide ascorbique et de la quercétine sont utilisées pour calculer le
potentiel antioxydant. Les résultats sont exprimés en mg équivalent en acide ascorbique/ g
d'extrait (mg EQ/ g d'extrait) et mg équivalent en quercétine/ g d'extrait (EAA/ g d'extrait). Tous
les dosages ont été répétés trois fois.
II-7-Dosage quantitatif des composées phénoliques
Cette analyse permet d’avoir une idée de la teneur en polyphénols de la plante. Le dosage
des phénols totaux a été effectué par une méthode adaptée par Singleton et Rossi en 1965 avec le
réactif de Folin-Ciocalteu, tandis que les flavonoïdes ont été quantifiés par le dosage avec le
trichlorure d’aluminium (Ayoola et al., 2008).
II-7-1-Détermination de la teneur en composés phénoliques totaux (CPT)
Le réactif de Folin- Ciocalteu est composé d’un mélange d’acide phosphotungstique
(H3PW12O40) et d’acide phosphomolybdique (H3PMo12O40). Ce dernier quand il réagit avec les
composées phénoliques, se réduit en oxyde bleu de tungstène (W8O23) et de molybdène
(Mo8O23) qui absorbe fortement à une longueur d'onde de 765 nm.
200 μL de chaque extrait préparé dans le méthanol, sont introduits dans des tubes à essais.
Puis, 1 ml du réactif Folin-Ciocalteu, dilué dans l'eau à 10 %, sont ajoutés. Après 2 minutes, on
ajoute 4 ml de carbonate de sodium (Na2CO3) à 2 % (m/v) (favoriser un milieu alcalin pour
déclencher la réaction d'oxydoréduction). Les solutions sont maintenues à l'obscurité pendant 2
heures à température ambiante. La lecture de l'absorbance de chaque solution est effectuée à une
longueur d'onde de 765 nm contre un blanc constitué de 1 ml du réactif de Folin-Ciocalteu et 4
ml de Na2CO3.
Les courbes d’étalonnage des références, l’acide ascorbique et de la catéchine sont réalisées
avec la même méthode et utilisées pour quantifier le contenu phénolique total (CPT). Les
résultats sont exprimés en mg EAG/g d’extrait et en mg EC/g d’extrait (Ozkan G et al. 2010).
Tous les dosages ont été répétés trois fois.
II-7-2-Dosage des Flavonoïdes
La quantification des flavonoïdes a été effectuée avec la méthode du trichlorure d'aluminium.
L'AlCl3 forme un complexe jaune avec les flavonoïdes qui absorbe dans le visible à 420 nm. Le
flavonoïde utilisé comme référence dans cette méthode est la rutine.
48
2 ml de chaque solution fille de la rutine ou de l'extrait, est ajouté à 2 ml de trichlorure
d'aluminium (AlCl3) à 2% (m/v) dans le méthanol. Après incubation à l'obscurité pendant 1heure
à température ambiante, le dosage s’effectue par spectrophotométrie UV/Visible à 420 nm
(Ayoola et al., 2008). Tous les dosages ont été répétés trois fois.
Le contenu total en flavonoïdes a été obtenu à partir de l'équation de régression de la courbe
d'étalonnage de la rutine, réalisé avec la même méthode, et exprimée en mg d'équivalents de
rutine/ g d'extrait (mg ER/ g d'extrait).
II-8-Analyses statistiques
Toutes les analyses statistiques ont été faites avec le logiciel R. les données sont analysées
avec le test paramétrique ANOVA suivi du test de multi-comparaison Tukey.
Les analyses de corrélations sont effectuées avec le test de Pearson, une valeur de P supérieure à
0.05 signifie l'absence de corrélation, par contre une valeur de P inferieure à 0.05 signifie la
présence de corrélation dont le sens est déterminé par le coefficient de corrélation (r) qui varie
dans l'intervalle [-1, +1]. Une valeur positive de r signifie une corrélation positive, une valeur
négative avec une valeur de P<0.05 signifie que les deux paramètres sont inversement corrélés.
Les écart-types ont été calculés à partir de trois séries d’expériences.
II-9-Analyses chromatographiques
II-9-1-Chromatographie sur couche mince
En dépit du développement des techniques d'analyse plus fines et plus sensibles, cette
méthode demeure une technique de routine largement utilisée dans les laboratoires vu son faible
coût de revient. La simplicité de sa réalisation, la valeur des informations apportées ainsi que son
utilisation aussi bien à l'échelle analytique qu'à l'échelle préparative sont des facteurs qui la
rendent reste très intéressante.
Il s’agit d’une méthode physique de séparation, dans laquelle les composés à séparer sont
distribués différemment, selon leurs caractéristiques particulières entre deux phases,
l’une
stationnaire et l'autre mobile. Cette dernière se déplace à travers la première phase dans une
direction définie (Popl et al., 1990).
49
II-9-1-1-Mise en œuvre de l’analyse par CCM
Un volume de 10µl de chaque extrait solubilisé dans le DCM est déposé.
Les extraits contenant des sels d'alcaloïdes sont solubilisés dans le MeOH.
Le développement des chromatogrammes s’effectue en phase normale sur des plaques
d’aluminium Silica gel 60 F254 (Merck) dans des cuves en verre saturées avec l’éluant
approprié.
En vue d’avoir une idée sur la composition de nos extraits alcaloïdiques ainsi que de
comparer leur compositions, les extraits alcaloïdiques de partie aérienne obtenus par les deux
protocoles d'extraction ainsi que celui des racines sont séparés sur CCM en se basant sur les
conditions opératoires de séparation décrits dans la littérature Randerath (1971), Baerheim
Svendsen et Verpoorte (1983), Flieger (2000) et Komsta et al. (2014) (tableau 5).
Tableau 5: Conditions chromatographiques de séparation des alcaloïdes
Phase stationnaire
Phase mobile
Gel de Silice
MeOH
Gel de Silice
MeOH-DCM (5:5)
Gel de Silice
CHCl3-DEA (9:1)
Gel de Silice
C-Hex-DEA (9:1)
Gel de Silice
C-Hex-CHCl3-DEA (5:4:1)
Gel de Silice
CHCl3-Acétone-DEA (5:4:1)
Gel de Silice
n-BuOH-eau-Acide formique (7:2:1)
Gel de Silice
Toluène-AcOEt-DEA (7:2:1)
Gel de Silice
Toluène-CHCl3-EtOH (28,5:57:14,4)
Gel de Silice
CHCl3-Dioxane-MeOH-NH4OH-Acétonitrile
(3,5:15:2:1,5:15)
Pour la mise en évidence de la pseudoéphédrine, l'isomère le plus probable dans l’espèce
étudiée selon Sievers (1938, in Henry A.T., 1949), la pseudoéphédrine a été extraite à partir du
médicament Humex, sous deux formes : chlorhydrate de pseudoéphédrine et base libre. Les deux
formes sont éluées ainsi que les extraits issus d’Ephedra alata avec les deux phases mobiles
proposées respectivement par Wagner et Bladt (1996) et Al-khateeb et al. (2014): AcOEt-
50
Cyclohex-MeOH-NH4OH (70:15:10:5) et n-BuOH-Acide acétique-eau (4:1:5). Le gel de silice
60 F254 a été utilisée comme phase stationnaire.
Pour mettre en évidence les composés phénoliques dans les extraits obtenus par des solvants
de polarité croissante ainsi que les composés terpéniques soit dans les extraits apolaires ou dans
celui obtenu par hydrodistillation, deux phases mobiles ont été utilisées respectivement:
1-AcOEt-Acide formique-acide acétique glacial-Eau (100:11:11:26)
2-C-Hex-AcOEt (7:3)
L’observation des plaques CCM s’effectue sous UV (254 et 356 nm), et en lumière visible
après pulvérisation des réactifs : Dragendorff, ninhydrine ou vanilline sulfurique selon la nature
de constituants à révéler.
II-9-2-Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de mass, GC-MS
La chromatographie en phase gazeuse est plus appropriée pour la séparation des composés
volatils. Elle permet aussi l'analyse des mélanges complexes dont les constituants peuvent
différer par leur nature et leur volatilité (Rouessac et Rouessac, 2004).
Le couplage de cette méthode de séparation à la technique spectrométrique SM (spectroscopie de
masse) sert à toutes sortes d’analyses dans le but de déterminer la nature, la composition et
même la structure éventuellement d’échantillons divers (JACOB, 2010).
Dans le but d'analyser la composition de l'extrait des alcaloïdes totaux de l'E.alata alenda,
nous avons procédé à une analyse GC-MS dont les conditions expérimentales sont présentées cidessous;
II-9-2-1-Conditions expérimentales utilisés en GC-MS
- Programmation de température: 60°C; puis élévation à raison de 25°C/mn jusqu'à 100°C,
puis élévation à raison de 0.5°C/mn jusqu'à 110°C, puis élévation à raison de 1°C/mn
jusqu'à 120°C.
- Température d'injection : 280°C
-Température de la source: 250°C
-Energie d'ionisation (impact électronique): 70 eV
-Gaz vecteur: Hélium (He)
- Débit du gaz vecteur: 1.0 ml/min
-intervalle de masse (m/z): 40.0 : 550.0
51
Les spectres de masse obtenus sont ensuite comparés avec ceux des produits de référence
contenus dans les bibliothèques informatisées disponibles (Bibliothèques de spectres NIST 2002,
WILEY 7) en utilisant le logiciel Chemstation, AMDIS, NIST MS search 2002.
52
Résultats et discussions
III-1-Enquête ethnobotanique
Peu d'informations par rapport aux questions posées sont recueillies à l’issue de cette
enquête, dont la fiche est présentée en annexe.
Selon les résultats de l'enquête ethnobotanique (figure 12), l'importance de la plante semble être
ignorée par la population, dont 57.66 % ignorent totalement la plante et 16.79 % même s'ils
connaissent le nom de la plante, ils n’ont aucune idée de son utilisation
en médecine
traditionnelle. Parmi les 25.55 % qui connaissent au moins une ou plusieurs des utilisations de la
plantes, 25.71 % l'utilisent soit comme pâturage ou pour le chauffage et la cuisson.
En Arabie Saoudite, l’Ephedra est l'une des plantes de parcours les plus répandues. Elle a été
utilisée comme pâturage pour de nombreux animaux attirés notamment par l’arôme acceptable
de cette espèce (AL-Qarawi et al., 2012).
Ignorent la plante
Ignorent l'utilisation
connaissent une ou plusieurs utilisations de la plante
25.55 %
16.79 %
57.66 %
Figure 12: Répartition en pourcentage de l'échantillon enquêté selon la connaissance de la plante
et de ses utilisations.
53
La minorité des personnes qui connaissent l'une ou plusieurs des utilisations médicinales de
la plante présentent une moyenne d'âge de 52.71 ans (figure 13). Celle-ci est plus élevée par
rapport aux deux autres groupes. Benkhnigue et al., (2011) ont noté effectivement que les
personnes les plus âgées ont plus de connaissances sur les plantes médicinales par rapport aux
autres classes d'âges. Aussi, dans l’étude de Hammoudi (2015), les personnes âgées de 41-60 ans
sont celles qui utilisent le plus les plantes. La connaissance des usages des plantes médicinales
et leurs propriétés sont généralement acquises suite à une longue expérience accumulée et
transmise d’une génération à l’autre. Mais dans notre cas, où la plante et ses utilisations ne sont
pas bien connues, son ethnopharmacologie risque de disparaitre avec cette moyenne d'âge
élevée.
Moyenne d'age
(ans) 60
39.97
48.61
52.71
40
20
0
Ignorent la plante
Ignorent
l'utilisation
connaissent une
ou plusieurs
utilisations de la
plante
Figure 13: Répartition en moyenne d'âge de l'échantillon selon la connaissance de la plante et de
ses utilisations.
54
La plupart de ces utilisations de l'E.alata selon l'échantillon de notre enquête est en accord
par rapport à celles de l'Ephedra dans le monde, et surtout dans le cas des problèmes de l'appareil
respiratoire et l'atténuation des douleurs.
L’Ephedra est traditionnellement utilisée en Chine pour l’asthme bronchique, le rhume, la
grippe, la fièvre, la congestion nasale, l’œdème, les maux de tête, diaphorétique, antiallergique,
antitussif, ….etc (Ling et al., 1995; Abourashed et al., 2003; Limberger et al., 2013; Ma et al.,
2007; Soni et al., 2004).
Au Maroc, l’Ephedra alata Dec. est utilisée pour lutter contre le diabète (Ghourri et al., 2013).
En Egypte, E.alata est utilisée en médecine traditionnelle comme dépurative, antiasthmatique et
agent astringent (Nawwar et al., 1984). Selon l'enquête ethnobotanique de Ould El Hadj et al.
(2003) en Algérie, E. alata s’utilise contre la grippe, la coqueluche et la faiblesse.
Nous regroupons dans la figure 14, les quelques applications de cette plante en fonction du
taux d’utilisation, selon notre enquête.
Rhume,
Rhume, asthme,
asthme, toux
taux et autres
problèmes
respiratoires
problèmes
respiratoires
analgésique
et antipyrétique
anti douloureux
et antipyrétique
Fréquence %
40
35.29
35
anti-inflammaoire
Cancers
Antimicrobienne
30
25
20
23.53
14.71
15
Diabète
Diarrhées
Diarrhée
Maladies rénales
10
5
0
8.82
5.88
5.88
2.94 2.94
les maladies traitables par l'E.alata
Figure 14: Fréquences de différentes utilisations de l'E.alata selon l'enquête ethnobotanique
55
III-2- Tests phytochimiques préliminaires
Les résultats des tests phytochimiques préliminaires sont présentés dans le tableau 6
ci-dessous;
Tableau 6: Mise en évidence de la présence ou de l'absence de certaines familles de métabolites
secondaires dans l'E.alata alenda
Partie de plante
Partie aérienne
Partie souterraine
Alcaloïdes
+
+
Polyphénols
+
+
*Tannins catéchiques
+
-
*Tannins galliques
-
+
Flavonoïdes
+
-
*Anthraquinones libres
-
-
*O-hétérosides
+
-
*O-hétérosides à génine réduite
+
-
*C-hétérosides
-
-
Stérols
-
-
Triterpènes
+
+
composés réducteurs
+
+
Hétérosides cardiotoniques
-
-
+ (indice de mousse=500)
+ (indice de mousse=167)
Métabolites
Tannins
Dérivés Anthracéniques
Saponosides
Le screening phytochimique a mis en évidence divers métabolites secondaires dans les
deux parties de la plante: alcaloïdes, polyphénols, tanins (catéchiques dans la partie aérienne et
galliques dans la partie souterraine), composés réducteurs, saponosides et terpènes. Les
56
flavonoïdes et les dérivés anthracéniques O-hétérosides à génine réduite sont caractérisés selon
les tests phytochimiques comme étant présents uniquement dans la partie aérienne.
La sous espèce E.alata alenda de la région de Ouargla est donc riches en métabolites
secondaires, la plupart de ces résultats sont conformes à ceux de Kessal et Bouafia (2003) sur la
même espèce de la région de Ouargla. L'abondance en principes actifs confère à la plante des
propriétés pharmacologiques remarquables (Konkon et al., 2006). Ce qui pourrait justifier ses
multiples indications thérapeutiques et pour lesquelles elle est utilisée en tradithérapie.
Une note à signaler c'est que les deux partie de la plante se différent dans leur composition en
certains métabolites secondaires à savoir, les tannins galliques et catéchiques, les flavonoïdes et
les dérivés anthracéniques. Les croyances chinoises prétendent que la partie aérienne et
souterraine de l’Ephedra ont des effets opposés (Hikino et al., 1982), cela est peut être du à la
différence en leur composition chimique signalée par ces tests. Il est néanmoins nécessaire de
confirmer ces résultats par des études phytochimiques approfondies. En effet
ces tests
préliminaires manquent souvent de spécificité.
III-3- Extractions
Les tests préliminaires réalisés au préalable ont permis de mettre en évidence la présence des
alcaloïdes et des composés phénoliques dans les deux parties de la plante (aérienne et
souterraine). Les deux classes précédentes de métabolites secondaires sont connues pour leur
importance biologique. Les alcaloïdes (à faibles doses) sont dotés de propriétés
pharmacologiques et toxicologiques marquées alors que les composés phénoliques présentent
une large gamme d'activités biologiques (Bruneton, 2009; Ikan, 1991). Notre choix s’est donc
porté sur ces deux familles de composés
qui ont été obtenus par
différentes
méthodes
d'extraction spécifiques en vue d’évaluer certaines activités biologiques. Les résultats sont
reportés sur le tableau 7.
La partie aérienne présente des rendements d'extraction plus importants que la partie
souterraine. En ce qui concerne les alcaloïdes, le rendement en alcaloïdes totaux des deux
parties, nous a dirigé à choisir la partie aérienne pour tenter d'extraire sélectivement l'éphédrine
ou ses dérivés. Pour les extractions par macération dans des solvants de polarité croissante, les
rendements augmentent avec la polarité du solvant.
57
Tableau 7: Rendement et aspect des extraits.
Partie aérienne
Mode d’extraction
Partie souterraine
Rendement (%)
aspect
rendement(%)
aspect
0.96
Cristallisé
0.14
Huileuse
Alcaloïdes totaux
Cristaux bien
Extraction sélective de
l'éphédrine
0.91
isolés d'un
extrait
huileux
Cyclohexane
0.53
pâteuse
0.13
pâteuse
Dichlorométhane
0.66
pâteuse
0.27
pâteuse
Acétate d'éthyle
1.02
Poudreuse
0.36
Poudreuse
Méthanol
16.21
Poudreuse
3.24
Poudreuse
Les extraits apolaires qui contiennent la chlorophylle et d'autre composés apolaires présentent un
aspect pâteux, celui polaire (MeOH) ou à polarité moyenne (AcOEt) sont poudreux. Les
alcaloïdes extraits par la méthode Stas-Otto qui permet une purification successive en jouant sur
le pH et la polarité des solvants, sont généralement à l'état de cristaux. L'extrait obtenu par le
protocole suivi pour l’extraction sélective des alcaloïdes volatils notamment l’éphédrine est bien
cristallisé et son rendement est comparable avec celui obtenu par la méthode Stas-Otto. Le
succès de la méthode pour l'extraction sélective de l'éphédrine ou ses dérivés ne peut être vérifié
qu'après des analyses chromatographiques.
III-4-Activités biologiques
III-4-1-Activité antibactérienne
Les résultats de l'activité antibactérienne testée par la méthode de diffusion sur disques en
milieu gélosé a permis d'obtenir les résultats consignés dans le tableau 8.
Pour faciliter la discussion des résulats, l'analyse statistique des données présentés dans ce
tableau s’est faite par le test ANOVA suivi par le test Tukey.
58
Tableau 8: Effet des différents extraits de l'Ephedra alata alenda sur les trois souches
bactériennes (zone d'inhibition en cm)
Souche
Escherichia coli
ATCC 27923
ATCC 25853
ATCC 25922
C-Hex-T
2.5±0.42
0.73±0.06
0.83 ±0.12
DCM-T
2.1±0.57
0.77±0.12
0.7±0.1
AcOEt-T
1.9±0
1.03±0.12
0.73±0.15
MeOH-T
1.35±0.07
0.97±0.15
0.88±0.29
Alc-T
1.9±0
0.87±0.06
0.73±0.06
Alc-Vol-T
1.95±0.07
0.9±0.17
0.80±0
C-Hex-R
1.75±0.21
0.7±0.1
0.77±0.06
DCM-R
1.5±0.14
0.73±0.12
0.72±0.03
AcOEt-R
2±0.42
0.7±0
0.58±0.03
MeOH-R
1.3±0
0.73±0.06
0.8±0.17
Alc-R
2.5±0.42
0.77±0.06
0.7±0.1
Nitroxaline
1.5±0.14
1.95±0.071
1.5±0.14
Extrait
59
Diamètre de zone
d'inhibition
2.5
2
1.89
***
1.5
1
1.06
0.63
0.5
0
S. aureus
E.coli
***: Différence très hautement significative par rapport à S. aureus;
p-value <0.001
P. aeruginosa
les trois souches testées
Figure 15: Sensibilité des trois souches envers les différents extraits de l'Ephedra alata alenda.
Nos résultats illustrés par les figures 15 à 18, montrent que : Staphylococcus aureus, bactérie à
GRAM positif, est plus sensible de façon très hautement significative par rapport aux deux
autres souches P.aeruginosa et E.coli, bactéries à GRAM négatif, qui présentent le même niveau
de sensibilité.
Pour Pseudomonas aeruginosa (Figure 16), les différents extraits forment entre eux un groupe
homogène du point de vue pouvoir inhibiteur, c'est-à-dire qu'ils inhibent la croissance de
Pseudomonas aeruginosa avec la même puissance, sauf que l'extrait AcOEt de la partie aérienne
est significativement plus actif que les deux extraits de la partie souterraine; AcOEt et C-Hex.
Comparativement au témoin positif, les extraits montrent un faible pouvoir inhibiteur.
On constate aussi un faible pouvoir inhibiteur des extraits contre la croissance de Escherichia
coli comparativement au témoin positif (Différence très hautement significative). Les différents
extraits forment là aussi, un groupe homogène du point de vue pouvoir inhibiteur. Ce qui signifie
qu'ils inhibent la croissance de Escherichia coli avec la même puissance (figure 17).
60
Diamètre de zone
d'inhibition 2.5
1.95
2
1.5
1.03 0.97 0.87 0.90 0.70
0.73
0.73 0.77
1
***
0.70
0.73 0.77
0.5
0
***: Différance très hautement significative par rapport au témoin Nitroxaline;
p-value <0.001
Les différents extraits de
l'Ephedra alata alena
de Pseudomonas aeruginosa
Diamètre de zone
d'inhibition
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
Escherichia coli
1.50
***
0.88
0.83 0.70 0.73
0.80
0.73
0.80
0.77
0.72
***: Différance très hautement significative par rapport au témoin Nitroxaline;
p-value <0.001
0.70
0.58
Les différents extraits de
l'Ephedra alata alenda
Figure 17: Pouvoir inhibiteur des différents extraits de l'Ephedra alata alenda sur
la croissance de Escherichia coli
61
Diamètre de
zone d'inhibition
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
2.5
2.5
2.1
1.95
1.9
1.9
1.75 1.5
1.35
2
1.5
1.3
Les différents extraits de l'ephedra alata alanda
de Staphylococcus aureus
C-Hex-T: Extrait cyclohexane de la partie aérienne/
C-Hex-R: Extrait cyclohexane de la partie souterraine
DCM-T: Extrait dichlorométhane de la partie aérienne/ DCM-R: Extrait dichlorométhane de la partie souterraine
AcOEt-T: Extrait acétate d'éthyle de la partie aérienne/ AcOEt-R: Extrait acétate d'éthyle de la partie souterraine
MeOH-T: Extrait méthanolique de la partie aérienne/
Alc-T: Alcaloïdes totaux de la partie aérienne/
MeOH-R: Extrait méthanolique de la partie souterraine
Alc-R: Alcaloïdes totaux de la partie souterraine
Alc-Vol-T: Alcaloïdes volatils de la partie aérienne
Les résultats de la figure 18 montrent un important pouvoir inhibiteur pour tous les extraits,
aucune différence significative comparativement au témoin positif n’est constatée. Du point de
vue pouvoir inhibiteur, les différents extraits forment, entre eux, un groupe homogène. C'est-àdire qu'ils inhibent tous la croissance de Staphylococcus aureus avec la même puissance.
Les alcaloïdes ont donnés des activités comparables à celles des autres extraits et parfois même
supérieures, comme c'est le cas pour l'extrait alcaloïdiques de la partie souterraine (Alc-R=2.5
cm) et les extraits alcaloïdiques de la partie aérienne (Alc-Vol-T=1.95 cm et Alc-T=1.9 cm) qui
présentent des zones d'inhibitions plus importantes que celles du témoin positif (1.5 cm) même si
sur le plan statistique cette différence reste non significative.
Les résultats montrent donc la résistance des bactéries à GRAM négatif à nos extraits par
rapport à la bactérie à GRAM positif ciblée.
62
Selon Kessal et Bouafia (2003), l'extrait méthanolique de la plante entière de l'E. alata de la
région de Ouargla, a montré des zones d'inhibition de 9.63 mm, 7.31mm et de 15.32mm contre
E.coli, P. aeruginosa et S. aureus respectivement. Les extraits AcOEt et DCM des fleurs et des
feuilles toujours de l'E. alata de la région de Ouargla, ont montré que le meilleur pouvoir
d'inhibition a été contre S. aureus comparativement à E.coli et P. aeruginosa (Chebouat et al.,
2014)
L'extrait éthanolique d’E. americana du nord du Pérou a donné des zones d'inhibition de 22mm,
8mm et des MIC de 32 et 64 mg/ml contre la croissance de S.aureus et E.coli respectivement
(Bussmanna et al., 2008; Bussmanna et al., 2010). Dans les travaux de Parsaeimehr et al. (2010),
le meilleur pouvoir inhibiteur de l'extrait méthanolique de la partie aérienne de trois espèces
iraniennes d'Ephedra; E. procera, E. strobilacea, E. pachyclada étaient contre P. aeruginosa.
En effet, la plus grande résistance des bactéries à GRAM négatif par rapport aux bactéries à
GRAM positif est un phénomène connu (Gupta, 2011) car en plus des mécanismes de résistance
communs entre les deux groupes (l'inactivation directe de la molécule active par l'action de
différentes enzymes, l'expulsion active des antibiotiques par les pompes à efflux et l'altération de
la sensibilité à l'antibiotique par modification de cible (Dzidic et al., 2008)) la membrane
externe de l'enveloppe cellulaire des bactéries à GRAM négatif semble constituer une barrière
efficace à haut niveau de résistance (Nikaido, 1989). Au niveau de cette barrière, à la place de
glycérophospholipide habituel des membranes biologiques ordinaires, on trouve le LPS
(Lipopolysaccharide). Ce dernier forme grâce à sa fraction polysaccharidique un réseau polaire
autour de la bactérie empêchant ainsi la pénétration des molécules hydrophobes. De même, grâce
à sa fraction lipidique (le lipide A) constituée de 6 à 7 molécules d'acides gras saturés, lui
conférant ainsi une certaine rigidité, les composés hydrophiles ne peuvent donc passer cette
barrière qu'à travers des protéines canaliculaires de très petite taille remplies d'eau appelées les
porines (Nikaido, 1994; Nikaido, 1989; Dzidic et al., 2008). Cette voie utilisée par la cellule
essentiellement pour apporter les nutriments du milieu extérieur, peut être exploité aussi par les
antibiotiques, pour cela des mutations génétiques portées sur les chromosomes ou les plasmides
diminuant le nombre de copies ou la taille de porines se produisent en vue d'augmenter le niveau
de résistance (Nikaido, 1989; Dzidic et al., 2008; Carattoli, 2009).
Malgré qu'à GRAM posititve, Staphylococcus aureus est peut être la bactérie pathogène de
la plus grande préoccupation en raison de sa virulence intrinsèque, sa capacité à provoquer une
large éventail d'infections menaçant la vie, et sa capacité à s'adapter à différentes conditions
63
environnementales (Lowy, 2003). Aussi rapidement que de nouveaux antibiotiques sont
introduits, les staphylocoques sont capables de devenir efficacement résistantes (Herman et
Dewulf, 2011).
Des rapports récents sur des isolats de Staphylococcus aureus présentant une résistance
intermédiaire ou complète à la vancomycine présagent une époque chimiothérapeutique dans
lequel des antibiotiques bactéricides efficaces contre cet organisme ne peuvent plus être
facilement accessibles (Centers for Disease Control and Prevention (CDC), 2002)
Alors que les agents anti-staphylocoques efficaces existent encore, leur durée de vie est
susceptible d'être limitée. Donc, de nouvelles approches à la thérapie et la prévention vont
devenir de plus en plus importantes. Notons que nos résultats contre cette souche sont très
importants; tout les extraits de l'Ephedra alata alenda de la région de Ouargla ont donné de trés
forte effet contre cet agent pathogène (figure 17).
En cherchant la partie de la plante la plus impliquée dans cette activité, l’analyse statistique
par le test ANOVA suivi du test Tukye montre que la partie aérienne est, de façon très hautement
significative (p=0.0004301), la plus active contre les trois souches ciblées. (tableau 9)
Tableau 9: Effet des deux parties de la plante dans l'activité antibactérienne.
Moyenne de zone d'inhibition
en cm
Partie aérienne
Partie souterraine
1.20
1.08
La partie aérienne est significativement dotée d'une activité antibactérienne plus importante par
rapport à la partie souterraine. La composition chimique ainsi que la physiologie des deux parties
sont très différentes, ce qui peut expliquer cette différence en activité contre les bactéries ciblées.
64
III-4-2-Activité antioxydante
III-4-2-1-Pouvoir de piégeage du radical libre DPPH
.
.
L'évaluation de l'activité anti-radicalaire de nos extraits via le test DPPH a conduit aux
résultats illustrés par les figures 19 (a-f).
Figure 19 (a-f): Courbes d'étalonnage de l'acide ascorbique et des différents extraits de l'E.alata
alenda.
65
L'IC50 de chaque extrait est déduit à partir de l'équation de régression correspondant à sa
courbe d'étalonnage et exprimé en g/L. En réalité, l'expression de l'IC50 en g/L pose un problème
de difficulté de comparaison entre les études. Pour s'affranchir de l'influence de différentes
conditions opératoires (volumes et concentration de DPPH utilisés) nous avons exprimé nos
résultats et ceux de la littérature dans l'unité standard (mg/g de DPPH) (Popovici et al., 2009).
De plus, pour déterminer une relation de corrélation entre les résultats fournis par les deux tests
DPPH et FRAP, les résultats (tableau 10) sont exprimés en mg équivalent en acide ascorbique/ g
d'extrait (mg EAA/ g d'extrait).
Tableau 10: Valeurs de l’IC50 exprimée dans différentes unités
IC50
mg EAA/g
g/L
mg/g de DPPH
/
0.088±0.003
89.95±3.39
MeOH-T
333.37±15.76
0.26±0.013
271.14±13.00
MeOH-R
279.26±12.31
0.32±0.014
323.62±14.48
AcOEt-R
192.42±2.54
0.46±0.006
469.12±6.24
AcOEt-T
35.23±1.38
2.5±0.099
2564.84±102.16
Alcaloïdes-R
11.55±0.16
7.62±0.107
7814.23±110.40
Extrait
d'extrait
Acide ascorbique
Pour les autres extraits apolaires et ceux d’alcaloïdes de la partie aérienne (tableau 11), nous
n’avons pas déterminé l'IC50. La concentration maximale utilisée (10 mg/ml) n'a pas suffit
d’atteindre l’IC50, ce qui reflète bien leur faible pouvoir réducteur du radical DPPH.
Tableau 11: Extraits à faible pouvoir réducteur du radical DPPH.
Extraits
% d'inhibition
avec 10 mg/ml
Alcaloïdes-T
C-Hex-T
C-Hex-R
DCM-T
DCM-R
2.18
34.8
26.23
46.75
35.5
66
L'analyse statistique des valeurs de l’IC50 des différents extraits avec le test ANOVA suivi
par le test Tukey, a permis de classer leur pouvoir anti-radicalaire par ordre décroissant. Les
données brutes du tableau 10 sont donc illustrées graphiquement sur la figure 20 ci-dessous
pour faciliter leur discussion.
L'extrait MeOH-T et MeOH-R forment statistiquement un groupe homogène, c'est-à-dire qu'ils
ne diffèrent pas significativement. Ils ont donc le même pouvoir inhibiteur de DPPH.
IC50 en g/l
9
7.62
8
7
6
5
4
2.50
3
2
1
0.09
0.26
0.32
0.46
Vit-C
MeOH-T
MeOH-R
AcoEt-R
0
AcoEt-T
Alcaloides-R
Les différentes extraits de l'E.alata alenda
***: Différence très hautement significative avec l'extrait suivant; p-value <0.001
Figure 20: Comparaison de l'IC50 de différents extraits avec celui de l’acide ascorbique.
La vitamine C présente un pouvoir anti-radicalaire très puissant par rapport à nos extraits. De
toute façon, selon Moure et al. (2001), Les antioxydants naturels indiquent souvent un pouvoir
antioxydant inférieur à celui des antioxydants synthétiques.
Les extraits méthanoliques et l'extrait AcOEt des racines présentent les valeurs les plus faibles de
l'IC50 et donc une activité anti-radicalaire plus importante comparativement aux autres extraits.
Nous notons que l'activité de l'acide ascorbique,
qui est un puissant antioxydant, est très
importante comparée à celles de nos extraits, qui demeurent tout de même modérément actifs
par rapport aux extraits des autres espèces du même genre, c’est le cas notamment des extraits
polaires.
L'IC50 de l’extrait aqueux des tiges de l'E.pachyclada iranienne est de 693.75 mg/g de
.
DPPH (Ghasemi et al., 2014), alors que l'extrait éthanolique des feuilles de l'E.gerardiana du
désert froid de l'Himalaya dans la région de Ladakh, a montré une activité de piégeage du DPPH
67
.
avec une IC50 997.5 mg/g de DPPH (Kumar et Singh, 2011). Les deux valeurs précédentes
reflètent une activité anti-radicalaire très faible comparativement à celle obtenue pour les extraits
méthanoliques de l'E.alata alenda de la région de Ouargla (tableau 9).
Par ailleurs, l'activité anti-radicalaire de l'extrait méthanolique (MeOH à 80%) de l'E.sinica
.
chinoise testée par le test ABTS + s’est révélée être très faible, sa valeur était de 49.5 mg E.
Trolox /g d'extrait.
III-4-2-2-Pouvoir antioxydant estimé par le Test de FRAP
L'analyse de l'activité antioxydante des extraits de l'E.alata alenda via le test FRAP (figures
21 (a-b) nous a permis de déduire le pouvoir antioxydant des différents extraits exprimé en
mgEAA/g et mgEQ/g d'extrait, à partir de l'équation de régression correspondante.
Figure 21 (a-b): Courbes d'étalonnage de l'acide ascorbique et de la quercétine
L'analyse statistique de ces données (tableau 12), avec le test ANOVA suivi par le test Tukey, a
permis de classer le pouvoir antioxydant des extraits par ordre décroissant ainsi que de
déterminer la partie de la plante la plus active en terme de pouvoir antioxydant. Les données
brutes de ce tableau sont illustrées graphiquement (figure 22).
68
Tableau 12: Pouvoir antioxydant des différents extraits de l'E.alata alenda selon le test FRAP
mgEAA/g d'extrait
mgEQ/g d'extrait
MeOH-T
419.12±6.02
225.52±3.10
AcOEt-T
67.62±4.32
35.82±2.23
DCM-T
11.28±0.95
6.01±0.49
C-Hex-T
3.84±0.20
2.17±0.10
MeOH-R
276.29±20.26
147.18±10.45
AcOEt-R
131.46±1.54
69.68±0.80
DCM-R
9.95±1.01
5.32±0.52
C-Hex-R
4.77±0.62
2.65±0.32
Alcaloïdes -Volatils-T
0.30±0.02
0.25±0.01
Alcaloïdes-T
3.31±0.65
1.8±0.34
Alcaloïdes-R
78.25±2.43
42.23±1.25
mg EAA/g
d'extrait
450
419.12
400
350
300
276.29
250
200
150
100
131.46
78.25 67.62
50
11.28 9.95
0
4.77
**: Différence très significative avec l'extrait suivant; p-value <0.01
***: Différence très hautement significatif avec l'extrait suivant p-value <0.001
3.84
3.31
0.30
Différents extraits de
l'E.alata alenda
Figure 22: Pouvoir antioxydant de différents extraits de l'E.alata alenda classés par ordre
décroissant
69
Les extraits de même couleur forment un groupe homogène, c'est-à-dire qu'ils ne diffèrent pas
significativement. Ils présentent le même niveau de pouvoir antioxydant estimé par le test FRAP.
Les extraits polaires présentent l'activité la plus importante, alors que les extraits apolaires ainsi
que ceux des alcaloïdes de la partie aérienne présentent des activités très faibles. A noter que les
alcaloïdes ne sont pas réputés pour être de bons antioxydants.
Selon Parsaeimehr et al. (2010), l’activité antioxydante des extraits méthanoliques (90%) des
parties aériennes obtenus de 3 espèces d'Ephedra iranienne : E. procera, E. pachyclada et
E.strobilacea testée par la méthode de FRAP était de 464.43, 452.82 et 467.33 mg EQ/ g
d'extrait respectivement. Ces valeurs
sont plus importantes par rapport à celle de l'extrait
méthanolique de la partie aérienne de l'E.alata alenda, 225.52±3.10 mg EQ/ g d'extrait.
La partie souterraine est de façon très hautement significative la plus responsable de
l'activité antioxydante de l'E.alata alenda (tableau 13).
Tableau 13: Contribution des parties aérienne et souterraine à l'activité antioxydante.
Moyenne en mg EAA/g
Partie aérienne
Partie souterraine
84.245
100.146
d'extrait
Il est important de noter que l’analyse par le test de Pearson a montré une relation de
corrélation positive entre les résultats fournis par les différents extraits par les deux tests DPPH
et FRAP (P<0.05, r = 0.92).
Song et al. (2010) en travaillant sur des plantes chinoises, parmi elles l'Ephedra, ont aussi
trouvé cette corrélation entre les capacités antioxydantes mesurées par le test FRAP et le test
.
anti-radicalaire ABTS +
.
L'effet antioxydant en piégeant le radical DPPH est attribué soit à la capacité de libération
d'hydrogène ou au transfert d'électrons par les composés antioxydants. (Ghasemi et al.,2014;
Popovici et al., 2009). La corrélation constatée entre les résultats fournis par les deux tests
.
DPPH et FRAP pour nos extrait signifie probablement que nos extraits exercent leurs effets
.
antioxydants, en réduisant le DPPH et le TPTZ selon le même mécanisme en l’occurrence le
transfert d'électrons.
70
Comme l'activité antioxydante des plantes est en grande partie attribuée à leur
composition phénolique (Moure et al., 2001), nous avons évalué ultérieurement les teneurs en
polyphénols et en flavonoïdes dans nos extraits pour vérifier si ces teneurs corrèlent avec
l’activité antioxydante évaluée.
III-5-Dosage quantitatif des composées phénoliques
III-5-1-Teneur en composés polyphénoliques totaux (CPT)
La quantification des polyphénols des extraits de l'E.alata alenda, obtenus par
macération par des solvants de polarité croissante, avec la méthode de Folin-Ciocalteu a conduit
aux résultats illustrés par la figure 23(a-b); d'où l'on déduit les teneurs en CPT des différents
extraits exprimées en mg EAG/g d'extrait et mg EC/g d'extrait à partir de l'équation de régression
correspondante.
Figure 23 (a-b): Courbes d'étalonnage de l'acide gallique et de la catéchine.
71
Tableau 14: Teneur en polyphénols totaux des différents extraits de l'E.alata alenda obtenus par
mg EAG/g d'extrait
mg EC/g d'extrait
MeOH-T
291.45±4.37
214.66±3.23
AcOEt-T
114.79±0.83
84.29±0.61
DCM-T
14.02±0.28
10.27±0.21
C-Hex-T
4.11±0.32
2.95±0.23
MeOH-R
276.08±4.00
203.32±2.95
AcOEt-R
300.67±20.17
221.47±14.89
DCM-R
12.43±0.53
9.09±0.39
C-Hex-R
2.69±0.07
1.90±0.05
permis de classer ces extraits par ordre décroissant de leur richesse en polyphénols, ainsi que de
constater la partie de la plante la plus riche en polyphénols. Les données brutes ainsi analysées
sont illustrées graphiquement dans la figure 24.
significativement, ils ont donc le même niveau de teneur en CPT.
Les extraits polaires sont les plus riches en composés phénolique totaux. Ce résultat est à
l'instar d'autres plusieurs études. Par exemple; Moure et al. (2001) dans leurs travaux sur
Gevuina avellana hulls trouvent que le rendement de l'extraction des polyphénols était plus élevé
pour les solvants les plus polaires.
72
350
mg EAG/ g
d'extrait
300.67
291.45
300
276.08
250
200
150
114.79
100
50
14.02
12.43
4.11
2.69
DCM-T
DCM-R
C-Hex-T
C-Hex-R
0
AcoEt-R
MeOH-T
MeOH-R
AcoEt-T
*: Différence significativeavec l'extrait suivant; p-value <0.05
***: Différence trés hautement significatif avec l'extrait suivant; p-value <0.001 Les extraits de l'E.alata alenda
Figure 24: Teneur en polyphénols totaux des différents extraits de l'E.alata alenda classés par
ordre décroissant
Les extraits méthanolique (MeOH à 90%) de la partie aérienne de 3 espèces d'Ephedra
iranienne; E. procera, E. pachyclada et E.strobilacea ont montré une teneur plus faible que
celle estimée dans notre étude. Ces valeurs était de 126.68, 131.93 et 146.56 mg EC/ g d'extrait
respectivement par rapport à 214.66±3.23 mg EC/ g d'extrait méthanolique de la partie
aérienne de notre plante (Parsaeimehr et al., 2010). Par ailleurs, l'extrait méthanolique (MeOH
80%) de l'Ephedra sinica chinoise a montré une teneur très faible en polyphénols totaux 27.70 ±
0.89 mg EAG/g d'extrait par rapport à 291.45±4.37 mg EAG/g d'extrait obtenus pour notre
plante (Song et al., 2010).
Le stress environnemental, sécheresse, pauvreté de sol en nutriments ainsi que le fort
ensoleillement, peuvent contribuent à l'augmentation du nivaux de la production des composés
phénoliques dans certaines plantes (Timmermannet al., 1984). Ce qui peut expliquer la richesse
de l'Ephedra alata alenda de notre région saharienne en composés phénoliques par rapport aux
autres espèces d'Ephedra dans le monde.
Les racines sont très hautement significativement les plus riches en CPT, comme elles
sont aussi les plus actives du point de vue pouvoir antioxydant (tableau 15).
73
Tableau 15: Teneur en polyphénols totaux dans les parties aérienne et souterraine
de l'Ephedra alata alenda
Moyenne en mg EAG/g
Partie aérienne
Partie souterraine
106.095
147.968
d'extarit
III-5-2-Teneur en flavonoïdes
La quantification des flavonoïdes des extraits de l'E.alata alenda, obtenus par macération
dans les solvants de polarité croissante, avec la méthode du trichlorure d'aluminium a conduit
aux résultats illustrés par la figure 25. Nous avons pu quantifier ainsi les flavonoïdes des
différents extraits exprimés en mg ER/g d'extrait à partir de l'équation de régression.
Figure 25: Courbe d'étalonnage de la rutine
74
Tableau 16: Teneur en flavonoïdes dans les différents extraits de l'E.alata alenda obtenus par
mg ER/g d'extrait
MeOH-T
11.29±0.12
AcOEt-T
143.38±5.49
DCM-T
128.69±2.38
C-Hex-T
29.53±0.94
MeOH-R
11.54±0.99
AcOEt-R
10.7±0.13
DCM-R
102.13±1.67
C-Hex-R
3.74±0.62
permis de classer ces extraits par ordre décroissant en fonction de leur richesse en flavonoïdes,
ainsi que de déterminer la partie de la plante la plus riche. Ces données brutes sont illustrées
graphiquement pour faciliter leur discussion sur la figure 26 ci-dessous.
mgERut/g
d'extrait
160
140
120
100
80
60
40
20
0
143.38
128.69
102.13
29.53
11.54
AcoEt-T
DCM-T
DCM-R
11.29
10.70
C-Hex-T MeOH-R MeOH-T AcoEt-R
3.74
C-Hex-R
Les extraits de l'E.alata alenda obtenus par macération aux solvants à polarité
croissante
Figure 26: Teneur en flavonoïdes des différents extraits de l'E.alata alenda classés par ordre
décroissant
75
significativement, ils ont le même niveau de teneur en flavonoïdes.
Les extraits apolaires se sont avéré les plus riches en flavonoïdes. Un résultat similaire
est obtenu par Hammoudi (2015) pour l'extrait d'hexane de Salvia chudaei et l'extrait
chloroformique de Tecrium polium qui ont présenté des teneurs plus élevées en flavonoïdes
comparativement aux extrait plus polaires. L'extrait moyennement polaire AcOEt de la partie
aérienne a quant à lui présenté une teneur comparable à celle de l'extrait DCM de la partie
aérienne. Selon Bruneton (1999), les génines sont, pour la plupart, solubles dans les solvants
organiques apolaires. Les lipophiles des tissus superficiels des feuilles (ou des frondes) sont
directement extraits par des solvants moyennement polaires (dichlorométhane). Les flavonoïdes
glycosylés et les aglycones plus polaires sont extraits avec les alcools ou avec un mélange
alcool/eau. Cela pourrait expliquer que les flavonoïdes extraits de l'E.alata alenda par cette
méthode, et qui se concentrent surtout dans les extraits apolaires, sont probablement surtout des
formes libres, aglycones.
La partie aérienne est très hautement significativement la plus riche en polyphénols de
type flavonoïdes (tableau 17). Mais les racines aussi présentent une teneur en flavonoïdes, ce
résultats n'est pas confirmé par les tests préliminaires, cela peut être expliqué par la faible
sensibilité de ces tests. En plus, les flavonoïdes dosés ici se concentrent surtout dans les extraits
apolaires, alors qu'on a essayé de les révélé, préalablement avec les tests préliminaires, à partir
d'un extraits alcoolique.
Tableau 17: Teneur en flavonoïdes dans les parties aérienne et souterraine de l'Ephedra alata
alenda
Moyenne en mg ER/g
Partie aérienne
Partie souterraine
78.22
32.025
d'extarit
Les résultats montrent donc une répartition contradictoire entre les flavonoïdes et les
polyphénols totaux; les premiers se concentrent surtout dans les extraits apolaires de la partie
aérienne alors que les seconds bien qu’ils soient présents dans toute la plante, ils sont rencontrés
majoritairement dans les extraits polaires de la partie souterraine. Selon le test Pearson, il n’y a
pas de corrélation constatée entre la répartition de CPT et des flavonoïdes (P>0.05, r = -0.46).
76
Vundać et al. (2007) ont constatée l'absence de corrélation entre la teneur des polyphénols totaux
et celle des flavonoïdes des différents extraits de 7 espèces de Stachys. Aussi Athamena et al.
(2010) n'ont pas trouvé une corrélation entre les teneurs des polyphénols et des flavonoïdes des
extraits du cumin. Dans la littérature, il n’est pas rare de trouver des teneurs en flavonoïdes
supérieures à celles
des polyphénols totaux (Ayoola et al., 2008; Athamena et al., 2010;
Hammoudi, 2015).
Cela peut s’expliquer probablement par le fait que les deux méthodes de dosage utilisées
Folin-Ciocalteu et trichlorure d'aluminium ne sont pas spécifiques et qu'ils peuvent donner des
résultats peu exacts en réagissant avec d'autres composés y compris les protéines, sucres, amines
aromatiques,..etc (Prior et al., 2005; Chebrouk, 2009) en plus de la différence des unités
d'expression des résultats.
III-6-Corrélations entre les activités biologiques et les dosages chimiques
Selon Bruneton (2009) la famille de composés phénoliques est dotée de nombreuses activités
biologiques y compris anti-inflammatoires, antifongique, antimicrobienne, antioxydante…etc.
Nous avons donc cherché des relations de corrélations positives entre ces composés et les
activités biologiques testées.
III-6-1-Activité antioxydante et teneur en polyphénols totaux et en flavonoïdes
Comme les extrais polaires de la partie souterraine de la plante ont montré l’activité
antioxydante la plus importante, ils étaient également les plus riches en CPT, nous avons donc
voulu vérifier s’il y’a une corrélation positive entre l'activité antioxydante et la teneur en
composés phénoliques totaux de notre plante.
Une corrélation positive est trouvée entre la teneur en CPT et l'activité antioxydante via le test
FRAP (p<0.05, r = 0.85) et le test DPPH. (p<0.05, r = 0.86).
Dans la littérature plusieurs études ont constaté cette corrélation, Song et al. (2010) Popovici et
al. (2009) Athamena et al. (2010)…etc.
La forte corrélation positive constatée entre la capacité antioxydante et le contenu phénolique
suggère que les composés phénoliques de cette plante sont les constituants qui contribuent
majoritairement à son activité antioxydante.
77
Par contre une absence de corrélation a été signalée entre la teneur en flavonoïdes, qui se
concentrent surtout dans les extraits apolaires de la partie aérienne, et l'activité antioxydant testée
par les deux méthodes DPPH. (P> 0.05, r =-0.89) et FRAP (P>0.05, r = -0.4581).
Ayoola et al. (2008) ainsi que Vundać et al. (2007) rapportent une faible corrélation entre les
flavonoïdes et l'activité antioxydante via le test DPPH.
Des études sur la relation entre la structure chimique des composés phénoliques et leur
pouvoir piégeur des radicaux libres ont montré que l'activité anti-radicalaire est dépendante du
nombre, de la position et de la nature des substituants notamment de types : groupements
hydroxyles, méthoxyles, glycosylés ainsi que le degré de polymérisation (Popovici et al., 2009).
Par exemple, les flavonoïdes les plus hydroxylés sont les plus facilement oxydés (Hagerman et
al., 1998)
Nous pouvons suggérer d’après nos résultats, que les flavonoïdes présents dans nos extraits
ne sont pas dotés d’un important pouvoir antioxydant. Cette activité est peut être due à d'autres
classes de composés phénoliques y compris les tanins mis en évidence dans nos tests
préliminaires réalisés sur notre plante. D’ailleurs, l'Ephedra en général est connue pour sa
richesse en tanins qui sont les responsable de son gout astringent (Zang et al., 2013; Soni et al.,
2004).
Hagerman et al. (1998) ont démontré la capacité antioxydante la plus élevée de tanins condensés
et hydrolysables en piégeant les radicaux péroxyle par rapport aux composés phénoliques
simples.
III-6-2-Activité antibactérienne et teneur en polyphénols totaux et en flavonoïdes
La partie aérienne s'est présenté comme la partie la plus riche en flavonoïdes et dont les
extraits étaient les plus actifs sur les souches bactériennes ciblées, nous avons donc cherché une
éventuelle corrélation entre ces deux paramètres. Le test de Pearson a montré l'absence de cette
corrélation (P>0.05, r = 0.20), (P>0.05, r = 0.409) (P>0.05, r = -0.27) envers S. aureus, P.
aeruginosa et E. coli respectivement.
Le test de Pearson entre les polyphénols totaux et l'activité antibactérienne montre aussi
l'absence de corrélation; (P>0.05, r = -0.48), (P>0.05, r = 0.23) (P>0.05, r = -0.02) envers S.
aureus P. aeruginosa et E. coli respectivement. Ce qui implique qu'il existe d'autres molécules
dans nos extrais, autres que les composés phénoliques, incriminés dans cette activité.
78
III-6-3-Relation entre l'activité antioxydante et l'activité antibactérienne
Les antioxydants naturels ou de synthèse, sont connus pour avoir une large gamme
d'activités biologiques, antiallergique, antitumorale, antifongique, antimicrobienne….etc (Moure
et al. 2001). Nous avons donc cherché s'il y a une corrélation entre l'activité antioxydante et
l'activité antibactérienne. Le test de Pearson confirme l'absence de cette corrélation (P>0.05, r =
0.44). Ce qui signifie que l'activité antibactérienne de nos extraits n'a pas de relation avec
l'activité antioxydante, par conséquent, nous pouvons dire que les composés à haut potentiel
antioxydant ne sont pas les mêmes composés directement impliqués à l’activité antibactérienne.
III-7-Analyses chromatographiques
III-7-1- Chromatographie sur couche mince
III-7-1-1-Analyse par CCM des extraits alcaloïdiques
Le tableau 18 ci-dessous montre les résultats de la CCM des extraits alcaloïdiques de
partie aérienne obtenus par les deux protocoles d'extraction (Stas-Otto et hydrodistillation) ainsi
que celui de la partie souterraine obtenus par la méthode Stas-Otto.
D'après ces résultats, les extraits alcaloïdiques semblent peu complexes, il révèle au maximum 3
taches pour la partie aérienne avec répétition d'une tache de forte intensité révélée toujours avec
la ninhydrine, dont les valeurs de Rf sont montrées en gras dans le tableau. Une forte similitude
en composition est révélée entre les extraits d’alcaloïdes obtenus par les deux protocoles
d'extraction.
Pour les racines, avec ces systèmes de séparation, l'extrait alcaloïdiques semble contenir une
seule tache révélée avec le réactif de Dragendorff.
79
Extrait
Eluant
MeOH
MeOH-DCM (5:5)
CHCl3-DEA (9:1)
C-Hex-DEA (9:1)
C-Hex-CHCl3-DEA (5:4:1)
CHCl3-Acétone-DEA (5:4:1)
n-ButOH-eau-Acide formique
Alcaloïdes volatils de
Alcaloïdes totaux de
Alcaloïdes totaux de
la partie aérienne
la partie aérienne
la partie souterraine
Rf
Rf
Rf
0.26**
0.26**
0.78**
0.78**
0.89*
0.92*
0.25**
0.25**
0.90*
0.94*
0.96**
0.96**
0.47*
0.47*
0.34**
0.34**
0.87*
0.91*
0.37**
0.37**
0.93***
0.93***
0.41*
0.41*
0.91*
0.91*
0.5*
0.5*
(7:2:1)
0.59*
0.24*
Toluène-AcOEt-DEA (7:2:1)
0.88*
0.94*
Toluène-CHCl3-EtOH
0.9*
(28,5:57:14,4)
0.75*
CHCl3-Dioxane-MeOH-
0.27**
NH4OH-Acétonitrile
0.93*
(3,5:15:2:1,5:15)
0.95*
0.24*
0.94*
0.9*
0.27**
0.025*
0.05*
0.14*
0*
0*
0.14*
0.087*
0*
0*
0.0125*
0.95*
*: fluorescence sous UV à 356 nm et/ou extinction de la lumière UV à 254 nm et réaction
positive avec Dragendorff
**: Extinction de la lumière UV à 254 nm et réaction positive avec la ninhydrine
***: Extinction de la lumière UV à 254 nm et réaction positive avec la ninhydrine et avec
Dragendorff
80
Le tableau 19 ci-dessous montre les résultats de l’analyse par CCM de la pseudoéphédrine
(extraite à partir du médicament) et des extraits obtenus à partir d’Ephedra alata alenda;
et de la pseudoéphédrine
Extrait
Alcaloïdes volatils
Alcaloïdes totaux
Alcaloïdes totaux
de la partie
de la partie
de la partie
aérienne
aérienne
souterraine
Rf
Rf
Rf
Rf
0.43**
0.43**
0.43**
0.43**
PSE
Eluant
AcOEt-C-Hex-MeOHNH4OH (70:15:10:5)
0.19*
n-BuOH-Acide
acétique-Eau (4:1:5)
0.33***
0.33***
0.33***
(alcaloïdes bases libres)
0.38***
n-BuOH-Acide
acétique-Eau (4:1:5)
(sels d'alcaloïdes)
0.33***
0.58***
0.58***
0.58***
0.66**
0.66**
PSE: Pseudoéphédrine
*: fluorescence sous UV à 356 nm et/ou extinction de la lumière UV à 254 nm et réaction positive avec
Dragendorff
**: Extinction de la lumière UV à 254 nm et réaction positive avec la ninhydrine
***: Extinction de la lumière UV à 254 nm et réaction positive avec la ninhydrine et avec Dragendorff
Remarque: La faible quantité de l'extrait racinaire n’a pas permis l'obtention de la forme sel de
ses alcaloïdes.
Les résultats montrent clairement la possibilité de présence de l'isomère PSE dans les
deux parties de notre plante (figure 27 A). Nous avons noté une intensité des taches nettement
plus importante pour les extraits de partie aérienne. Selon Caveney et al. (2001) les racines des
espèces chinoises sont connues pour être très pauvre en éphédrine et ses isomères.
81
Selon Wagner et Bladt (1996) le Rf, de l'éphédrine ou ses dérivés, doit être compris entre 0.4 et
0.5 en utilisant la phase mobile AcOEt-C-Hex-MeOH-NH4OH (70:15:10:5), dans notre cas cette
valeur était bien comprise dans cet intervalle, elle était de 0.43.
Selon Al-khateeb et al. (2014); la phase mobile n-BuOH-Acide acétique-Eau (4:1:5) permet la
séparation de la forme sel des deux énantiomères (chlorhydrate d'éphédrine et chlorhydrate de
pseudoéphédrine). Pour nos extraits, deux taches mal résolues ont été révélées à la ninhydrine,
l'une migre au même niveau que la PSE et l'autre juste en dessus (figure 27 B).
Figure 27: chromatogrammes des extraits alcaloïdiques avec la PSE sous forme de base libre (A)
et sous forme de sels (B)
III-7-1-2-Analyse par CCM des extraits phénoliques
Le tableau 20 montre les résultats de l’analyse CCM des extraits phénoliques.
Selon
Wagner et Bladt (1996), les couleurs que nous avons obtenus sous UV sont des couleurs
caractéristiques des composés phénoliques. D'après Lamnaouer (2002) et Lhuillier (2007), les
composés phénoliques révélés sont probablement:
Pour la couleur violette: C5-OH flavanols, flavanones, 5, 6, 7
tri-OH flavonols, flavones,
chalcones;
82
Pour la couleur bleu: C5-OH flavanones, flavonols substitués en C3 et sans -OH en C5, acides
phénoliques.
Et probablement les tanins, révélés en rouge à la vanilline sulfurique (V.S).
La majorité de ces composés ont été identifiés dans le genre Ephedra par Nawwar et al. (1984),
Amakura et al. (2013), Zang et al. (2013).
83
Tableau 20: Résultats de CCM de quelques composés phénoliques
Phase stationnaire: gel de silice
Phase mobile: AcOEt-Acide formique-Acide acétique glacial-Eau (100:11:11:26)
c-Hex-T
Rf
V.S
c-Hex-R
Rf
V.S
0.0 Orange 0.0 Orange
DCM-T
DCM-R
AcOEt-T
AcOEt-R
Couleur
sous
UV
V.S
Rf
0.0
Verte
-
0.0
0.45
Verte
-
-
0.82
Orange
0.89
Rf
Couleur
sous
UV
V.S
Rf
Couleur
sous
UV
0.0
Bleu
-
0.49
Violette
0.22
Violette
-
0.64
Bleu
0.75
-
Couleur
sous
UV
Rf
0.18
Violette
0.69
Verte
Rf
MeOH-T
MeOH-R
Couleur
sous
UV
Couleur
sous
UV
V.S
Rf
-
Rouge
0.0
Verte
Rouge
0.27
Bleu
-
0.15
Bleu
-
-
Orange 0.54
Verte
-
0.27
-
-
-
Orange 0.71
Verte
-
0.82
-
Orange
0.89
-
Orange 0.89
V.S
Orange
84
III-6-1-3-Analyse par CCM des extraits apolaires
Plusieurs couleurs révélées à la vanilline sulfurique (V.S) caractéristiques des terpènes sont
observées pour nos extraits (tableau 21). Il s’agit des extraits apolaires des parties aérienne et
souterraine ainsi que celui obtenu par hydrodistillation. Notons que selon Wagner et Bladt
(1996), ces couleurs sont le bleu, le vert, le jaune brun, le marron et le rouge.
Tableau 21: Résultats de CCM de quelques composés terpéniques.
Phase stationnaire: gel de silice
Phase mobile: C-Hex-AcOEt (7:3)
C-Hex-T
C-Hex-R
DCM-T
DCM-R
Extrait
d'hydrodistillation
Rf
Couleur à
Rf
la V.S
0.0
B.Violette
Couleur à
Rf
la V.S
0.0
0.32 B.Violette 0.19
B.Violette
J-Brune
Couleur à
Rf
la V.S
0.0
Verte
Verte
0.91
Verte
Rf
la V.S
0.0
B.Violette
J-Brune
Couleur à la
V.S
0.0
0.09 B.Violette 0.06 B.Violette 0.33
0.62 B.Violette 0.45 B.Violette 0.22 B.Violette 0.22
0.93
Couleur à
0.48
Rouge
Bleu
Marron
0.32 B.Violette
0.38 B.Violette
0.62 B.Violette
0.87
Verte
B.Violette: Bleu- Violette/ J-Brune: Jaune- Brune
Les résultats de l’analyse par CCM des différents extraits de la plante étudiée ont permis de
confirmer ceux des tests chimiques préliminaires, notamment la présence des composées
phénoliques et terpéniques dans l’espèce. Ils ont également montré la présence de la
pseudoéphédrine de façon majoritaire dans les extraits de la partie aérienne comparativement à
celui de la partie souterraine.
III-7-2-Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de mass, GC-MS
L'analyse de l'extrait d’alcaloïdes totaux de la partie aérienne par chromatographie en
phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse, a donné le chromatogramme représenté par
la figure 28 ci-dessous.
85
Abundance
TIC: 2.D
16.05
6500000
6000000
5500000
5000000
4500000
4000000
3500000
15.72
3000000
2500000
2000000
1500000
16.41
1000000
15.14
500000
20.22
18.64
21.58
4.00 6.00 8.0010.00
12.00
14.00
16.00
18.00
20.00
22.00
24.00
26.00
28.00
30.00
Time-->
Figure 28: Chromatogramme de l'extrait alcaloïdique de l'E.alata alenda obtenu par GC/MS.
A cause de la mauvaise séparation des pics, l'identification des composés de notre extrait est
difficile. Néanmoins, le pic majoritaire au temps de rétention 16.05 min est identifié à la
pseudoéphédrine et ce à l'aide du logiciel Chemstation, AMDIS, NIST MS search 2002, en
utilisant les bases de données des bibliothèques de spectres NIST 2002, WILEY 7. La formule
moléculaire de la pseudoéphédrine est C10H15NO et sa structure est représentée sur le spectre de
référence (figures 29 et 30).
58
100
HN
HO
50
42
0
77
63
91
105 117
40
60
80
100
(replib) Pseudoephedrine, (+)-
120
131
146
140
160
180
Figure 29: spectre de référence de la pseudoéphédrine
58
100
50
42
77 85
105 117
0
120
100
80
40
60
(Text File) Scan 2224 (16.050 min): 2.D
132
148
140
176
160
180
Figure 30: Spectre correspondant au pic de tR 16.05 min
86
Selon Al-khateeb et al. (2014), les alcaloïdes majoritaires de l’Ephedra alata de l'Iraq sont les
deux isomères (-) éphédrine et (+) pseudoéphédrine avec une prédominance de la (+)
pseudoéphédrine. Alors que selon Sievers (1938) seule la pseudoéphédrine a été identifiée dans
l’E.alata alenda de Maroc (HENRY T.A., 1949).
87
Conclusion
Ce travail dont l’objectif était de contribuer à la valorisation de l'une des espèces de la
famille des Ephedraceae, Ephedra alata alenda de la région d’Ouargla, nous a permis d’aboutir à
des résultats intéressants qu’on peut résumer comme suit :
Selon l'enquête ethnobotanique, cette plante semble peu utilisée par la population, dont
57.66 % ignorent totalement la plante et 16.79 % connaissent la plante mais ignorent ses
utilisations et seulement 25.55% connaissent au moins l'une de ses utilisations. Cette dernière
tranche représente une moyenne d'âge d’environs 53 ans. La plupart des utilisations citées est en
accord avec celles rapportées dans la littérature comme pour les problèmes de l'appareil
respiratoire et l'atténuation des douleurs avec des fréquences d'utilisation de 35.29 % et 23.53 %
respectivement. Cette plante est prescrite aussi pour les affections inflammatoires (14.71%),
microbienne (5.88 %), cancer (8.82 %), diabète (5.88 %), diarrhée (2.94 %) et les maladies
rénales (2.94%).
Le screening phytochimique a mis en évidence diverses classes de
métabolites
secondaires dans les deux parties de la plante: alcaloïdes, polyphénols, tanins (catéchiques dans
la partie aérienne et galliques dans la partie souterraine), composés réducteurs, saponosides et
terpènes. Les flavonoïdes et les anthraquinones O-hétérosides à génine réduite sont caractérisés
selon les tests phytochimiques uniquement dans la partie aérienne. Les polyphénols et les
alcaloïdes se sont révélés être présents dans les deux parties de la plante.
Chaque extrait a été caractérisé par son aspect et son rendement par rapport à la drogue
sèche. Les rendements de l'extraction sélective de l'éphédrine et des alcaloïdes totaux de la partie
aérienne étaient de 0.91 % et 0.96 % respectivement. Celui des alcaloïdes totaux des racines était
plus faible (0.14%). L'extraction des composés phénoliques par macération dans des solvants de
polarité croissante à montré des rendements plus importants pour la partie aérienne.
Les résultats de l'activité antibactérienne ont montré la forte sensibilité de Staphylococcus
aureus aux différents extraits (moyenne de zone d'inhibition de 1.89±0.088 cm) et la faible
sensibilité des bactéries à GRAM négatif ciblées dont Escherichia coli et Pseudomonas
aeruginosa (moyenne de zone d'inhibition de 0.63± 0.044 cm et 1.06±0.28 cm respectivement).
Les résultats sont évalués comparativement à un témoin positif, le nitroxaline. La partie aérienne
s’est révélé significativement la plus active contre les bactéries ciblées par rapport à la partie
souterraine.
Cette plante s’est montrée riche en composés phénoliques (291.45±4.37 mg EAG/ g
d'extrait) et dotée d’un pouvoir antioxydant (271.14±13.0 mg/g de DPPH, et 225.52±3.10
88
Conclusion
mgEQ/g d'extrait (pour l'extrait méthanolique de la partie aérienne). Cet effet est plus important
par rapport à celui de plusieurs espèces d'Ephedra, cité dans la littérature.
L'activité antioxydante ainsi que la teneur en composés phénoliques, augmentent avec la polarité
des solvants, où la partie souterraine est la plus riche en CPT et a la plus importante activité
antioxydante. Ces deux variables sont statistiquement corrélées (p<0.05) ce qui montre que les
polyphénols sont les composés les plus impliqués dans l'activité antioxydante de la plante. Par
contre les flavonoïdes, qui sont concentrés essentiellement dans les extraits apolaires de la partie
aérienne, sont dotés de faible pouvoir antioxydant (P> 0.05). Cette activité est peut être dû à
d'autres classes de composés phénoliques comme les tanins mis en évidence dans notre plante
par les tests préliminaires.
.
La corrélation constatée entre les résultats fournis par les deux tests DPPH et FRAP pour
nos extrait suggère que nos extraits exercent leurs effets antioxydants, en réduisant le DPPH. et
le TPTZ selon le même mécanisme en l’occurrence le transfert d'électrons.
L'absence de corrélations entre l'activité antibactérienne présentée au préalable, et la teneur
en CPT ainsi que la teneur en flavonoïdes implique qu'il existe d'autres molécules dans nos
extraits, incriminées dans cette activité. D'autre part, nous avons relevé l'absence de corrélation
entre les activités antibactérienne et antioxydante.
La partie aérienne, selon les deux protocoles d'extraction, est plus riche en alcaloïdes
totaux et contient de la (+) pseudoéphédrine comme alcaloïde majoritaire. Les racines aussi sont
supposées contenir la (-) éphédrine et la (+) pseudoéphédrine, d’après les analyses par CCM
mais avec de faibles quantités par rapport à la partie aérienne.
Les tests biologiques réalisés dans cette étude n’ont pas permis de
montrer toute
l’importance de cette plante, mais l’identification de la pseudoéphédrine comme composé
majoritaire permettra de signalé l'importance de la plante qui semble ignorée par la population.
L'isolement de ce composé et la confirmation d’une part de sa responsabilité dans l’activité
antibactérienne et d’autre part l'évaluation des extraits alcaloïdiques dans un spectre d’activités
biologiques plus large rentre parmi les perspectives qui peuvent être envisagées dans la
continuité des travaux entamés.
Par ailleurs l'analyse chromatographique et la caractérisation par les méthodes
spectroscopiques plus poussées des constituants des extraits alcaloïdiques permettraient de
comparer la composition chimique.
89
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‫دراﺳﺔ اﻟﻔﻌﺎﻟﯿﺔ اﻟﻤﻀﺎدة ﻟﻠﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺎ و اﻟﻤﻀﺎدة ﻟﻸﻛﺴﺪة ﻟﻤﺴﺘﺨﻠﺺ اﻟﻘﻠﻮﯾﺪات اﻟﺨﺎم ﻟﻨﺒﺎت‬-2009 ،‫اﻟﻌﺎﺑﺪ إﺑﺮاھﯿﻢ‬
-‫ ﺟﺎﻣﻌﺔ ﻗﺎﺻﺪي ﻣﺮﺑﺎح‬.‫"ﺗﺨﺼﺺ ﻛﯿﻤﯿﺎء ﻋﻀﻮﯾﺔ ﺗﻄﺒﯿﻘﯿﺔ‬.‫ ﻣﺬﻛﺮة ﻣﺎﺟﺴﺘﯿﺮ‬.Traganum nudatum ‫اﻟﻀﻤﺮان‬
145- Référence électronique: Tutiempo, 2010- http://www.tutiempo.net
101
Annexe
Annexe 1
Fiche d'enquête
Nom et prénom:
Age:
Sexe:
Résidence:
Nom de la plante : Alenda :
Parties utilisées :
Plante fraîche :
plante sèche :
Période de cueillette :
Traitement :
Administration :
Mode de préparation traditionnelle :
Poids de drogues :
Quantité d'eau :
Plante ou produits ajoutés:
Doses (adulte, enfant) :
Durée du traitement :
Prévention :
Toxicité :
102
Annexe
Annexe 2
Figure 31: Image montrant le précipité rouge pour les tanins catéchiques dans la partie aérienne
et une teinte bleue noire pour les tanins galliques dans la partie souterraine.
Figure 32: Mise en évidence de la présence des O- hétérosides à génine réduite dans la partie
aérienne (extrait à droit) et leur absence dans la partie souterraine (extrait à gauche).
103
Contribution à l’étude de quelques activités biologiques des extraits de
Ephedra alata de la région de Ouargla
Résumé:
La présente étude s’inscrit dans le cadre de la contribution à la valorisation d'une plante
médicinale de la région de Ouargla, Ephedra alata alenda, dotée d’une grande importance
pharmacologique dans le monde et réputée par sa résistance à la sécheresse.
Selon l'enquête ethnobotanique, l'importance pharmacologique de la plante semble être
ignorée par une grande partie de la population, mais les quelques utilisations citées par les sujets
questionnés, ayant une moyenne d'âge élevé, sont en accord avec celles de l'Ephedra citées dans
la littérature.
L’étude phytochimique a montré la présence de divers métabolites secondaires dans les
deux parties de la plante tels que les alcaloïdes, les polyphénols, les tanins, les saponosides et les
terpènes.
La méthode de diffusion sur disques en milieu gélosé, a montré une forte activité des
extraits de la plante contre la croissance de Staphylococcus aureus, et une faible activité
inhibitrice de la croissance de Pseudomonas aeruginosa et Escherichia coli ; la partie aérienne
étant la plus active.
L'évaluation du potentiel antioxydant des extraits par deux méthodes différentes : le test
de DPPH et le test FRAP, ont révélé une activité anti-radicalaire plus importante de cette plante
par rapport aux autres espèces de ce genre dans le monde. La teneur en composés phénoliques
totaux (CPT) est plus importante dans les extraits polaires de la partie souterraine.
Le test de Pearson a montré l'existence d'une corrélation positive entre la teneur en CPT et
l'activité antioxydante via les deux tests. Par contre, il n'y a pas de corrélation entre la teneur en
flavonoïdes et celle des CPT, ni entre la teneur en flavonoïdes et l'activité antioxydante des
différents extraits. Ces trois dernières, ne sont pas corrélées avec l'activité antibactérienne des
extraits de la plante.
La partie aérienne, selon les deux protocoles d'extraction, est plus riche en alcaloïdes et
contient de la (+) pseudoéphédrine comme alcaloïde majoritaire.
Mots clés: Ephedra alata alenda, enquête ethnobotanique, activité antibactérienne, DPPH, CPT,
corrélation positive, (+) pseudoéphédrine, alcaloïdes.
Contribution to the study of some biological activities of extracts of
Ephedra alata from Ouargla region
Abstract:
This study is part of the contribution to the valorization of a medicinal plant of Ouargla
region, Ephedra alata alenda, endowed with great pharmacological importance around the world
and renowned for its high tolerance to water deficiency.
According to the ethnobotanical survey, the pharmacological importance of the plant seems
ignored by the population, but few uses cited by the surveyed subjects which have a higher
average age, come match those of Ephedra around the world.
The phytochemical screening had identified various secondary metabolites in both parts of
plant; alkaloids, polyphenols, tannins (catechin in the aerial part and gallic in the underground
part), reducing compounds, saponosides and terpenes.
The disk diffusion method in agar medium showed strong activity of plant extracts against the
growth of Staphylococcus aureus, and low inhibitory activity of Pseudomonas aeruginosa and
Escherichia coli growth. The aerial part was the most active.
The evaluation of the antioxidant potential of extracts by two different methods: DPPH and
FRAP tests, revealed a higher antiradical activity of the plant compared to other species of this
genus around the world. The TPC content was higher in the polar extracts of the underground
part. Pearson's test showed the existence of a positive correlation between the content of TPC
and antioxidant activity via the two tests. For against, flavonoids do not exhibit a correlation
relationship nor with the content of TPC or with the antioxidant activity of different extracts.
These last three are not correlated with the antibacterial activity of the plant extracts.
The aerial part, according to the two extraction protocols, is richer in alkaloids and contains
the (+) pseudoephedrine as the major alkaloid.
Keywords: Ephedra alata alenda, ethnobotanical survey, antibacterial activity, DPPH, TPC,
positive correlation, (+) pseudoephedrine, alkaloids.
‫اﻟﻤﺴﺎھﻤﺔ ﻓﻲ دراﺳﺔ ﺑﻌﺾ اﻟﻨﺸﺎطﺎت اﻟﺒﯿﻮﻟﻮﺟﯿﺔ ﻟﻤﺴﺘﺨﻠﺼﺎت ‪ Ephedra alata‬ﻣﻦ ﻣﻨﻄﻘﺔ ورﻗﻠﺔ‬
‫ﻣﻠﺨﺺ‪:‬‬
‫ﺗﻨﺪرج ھﺬه اﻟﺪراﺳﺔ ﻓﻲ إطﺎر اﻟﻤﺴﺎھﻤﺔ ﻓﻲ ﺗﺜﻤﯿﻦ ﻧﺒﺘﺔ طﺒﯿﺔ ﻣﻦ ﻣﻨﻄﻘﺔ ورﻗﻠﺔ ‪ ،Ephedra alata alenda ،‬اﻟﻤﻌﺮوﻓﺔ‬
‫ﺑﺨﺼﺎﺋﺼﮭﺎ اﻟﺼﯿﺪﻻﻧﯿﺔ ﻋﺒﺮ أﻧﺤﺎء اﻟﻌﺎﻟﻢ و اﻟﻤﺸﮭﻮرة ﺑﺘﺤﻤﻠﮭﺎ ﻟﻨﻘﺺ اﻟﻤﯿﺎه‪.‬‬
‫ﺣﺴﺐ اﻟﺪراﺳﺔ اﻻﺳﺘﻘﺼﺎﺋﯿﺔ اﻻﺛﻨﻮﻧﺒﺎﺗﯿﺔ‪ ،‬ﺗﺒﺪو اﻷھﻤﯿﺔ اﻟﺼﯿﺪﻻﻧﯿﺔ ﻟﻠﻨﺒﺘﺔ ﻣﺠﮭﻮﻟﺔ ﻋﻨﺪ اﻷھﺎﻟﻲ‪ ،‬ﻟﻜﻦ اﻻﺳﺘﻌﻤﺎﻻت اﻟﻘﻠﯿﻠﺔ‬
‫اﻟﻤﺬﻛﻮرة ﻣﻦ طﺮف اﻷﺷﺨﺎص اﻟﻤﺴﺘﺠﻮﺑﯿﻦ و اﻟﻠﺬﯾﻦ ﯾﻤﺜﻠﻮن ﻣﺘﻮﺳﻂ ﻋﻤﺮ ﻋﺎﻟﻲ‪ ،‬ﺗﻮاﻓﻖ اﺳﺘﻌﻤﺎﻻت اﻟﻨﺒﺘﺔ ﺣﻮل اﻟﻌﺎﻟﻢ‪.‬‬
‫اﻟﻔﺤﺺ اﻟﻜﯿﻤﯿﺎﺋﻲ ﺳﻤﺢ ﺑﺘﺤﺪﯾﺪ ﻋﺪة ﻣﺮﻛﺒﺎت ﺛﺎﻧﻮﯾﺔ ﻓﻲ اﻟﺠﺰﺋﯿﻦ اﻟﺘﺮاﺑﻲ و اﻟﮭﻮاﺋﻲ ﻟﻠﻨﺒﺘﺔ‬
‫‪ .‬اﻟﻘﻠﻮﯾﺪات‪ ،‬اﻟﺒﻮﻟﯿﻔﯿﻨﻮﻻت‪،‬‬
‫الﻋﻔﺺ‪ ،‬اﻟﺼﺎﺑﻮﻧﯿﻦ واﻟﺘﺮﺑﯿﻨﺎت ‪.‬‬
‫طﺮﯾﻘﺔ اﻻﻧﺘﺸﺎر ﻋﻠﻰ اﻟﻘﺮص ﻓﻲ وﺳﻂ ﺟﯿﻠﻮزي أظﮭﺮت ﻓﻌﺎﻟﯿﺔ ﻗﻮﯾﺔ ﻟﻤﺴﺘﺨﻠﺼﺎت اﻟﻨﺒﺘﺔ ﺿﺪ ﻧﻤﻮ‬
‫ﺑﻜﺘﯿﺮﯾﺎ‪ Staphylococcus ;aureus‬و ﻓﻌﺎﻟﯿﺔ ﺿﻌﯿﻔﺔ ﺿﺪ ﻧﻤﻮ ﺑﻜﺘﯿﺮﯾﺎ ‪ Pseudomonas aeruginosa‬و ‪Escherichia‬‬
‫‪ . coli‬اﻟﺠﺰء اﻟﮭﻮاﺋﻲ ھﻮ اﻷﻛﺜﺮ ﻓﻌﺎﻟﯿﺔ ﺿﺪ ﻧﻤﻮ اﻟﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺎ‪.‬‬
‫ﺗﻘﯿﯿﻢ اﻹﻣﻜﺎﻧﯿﺔ اﻟﻤﻀﺎدة ﻟﻸﻛﺴﺪة ﺑﻄﺮﯾﻘﺘﯿﻦ ﻣﺨﺘﻠﻔﺘﯿﻦ‪ ،‬اﺧﺘﺒﺎر ‪ DPPH‬و اﺧﺘﺒﺎر ‪ ,FRAP‬أظﮭﺮ ﻧﺸﺎط ﻣﻀﺎد ﻟﻠﺠﺬور‬
‫اﻟﺤﺮة ﻋﺎﻟﻲ ﻟﻠﻨﺒﺘﺔ ﻣﻘﺎرﻧﺔ ﺑﺄﻧﻮاع أﺧﺮى ﺣﻮل اﻟﻌﺎﻟﻢ‪ .‬اﻟﻤﺴﺘﺨﻠﺼﺎت اﻟﻘﻄﺒﯿﺔ ﻟﻠﺠﺰء اﻟﺘﺮاﺑﻲ ﻣﻦ اﻟﻨﺒﺘﺔ ھﻲ اﻷﻏﻨﻰ ﺑﺎﻟﻤﺮﻛﺒﺎت‬
‫اﻟﻔﯿﻨﻮﻟﯿﺔ اﻟﻜﻠﯿﺔ )‪ . (CPT‬أظﮭﺮ اﺧﺘﺒﺎر ﺑﯿﺮﺳﻮن وﺟﻮد ﻋﻼﻗﺔ طﺮدﯾﺔ ﺑﯿﻦ ﻣﺤﺘﻮى ‪ CPT‬واﻟﻨﺸﺎط اﻟﻤﻀﺎد ﻟﻸﻛﺴﺪة ﻋﻦ طﺮﯾﻖ‬
‫اﻻﺧﺘﺒﺎرﯾﻦ‪ .‬ﻋﻠﻰ اﻟﻌﻜﺲ‪ ،‬اﻟﻔﻼﻓوﻧﯾدات ﻟﯿﺴﺖ ﻣﺮﺗﺒﻄﺔ طﺮدا ﻻ ﻣﻊ ﻧﺴﺒﺔ‬
‫‪ CPT‬وﻻ ﻣﻊ اﻟﻨﺸﺎط اﻟﻤﻀﺎد ﻟﻸﻛﺴﺪة ﻟﻤﺨﺘﻠﻒ‬
‫اﻟﻤﺴﺘﺨﻠﺼﺎت‪ .‬ھﺬه اﻟﺜﻼث اﻷﺧﯿﺮة ﻻ ﺗﺮﺗﺒﻂ ﻣﻊ اﻟﻨﺸﺎط اﻟﻤﻀﺎد ﻟﻠﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺎ‪.‬‬
‫اﻟﺠﺰء اﻟﮭﻮاﺋﻲ‪ ،‬وﻓﻘﺎ ﻟﺒﺮوﺗﻮﻛﻮﻟﻲ اﻻﺳﺘﺨﻼص اﻟﻤﺴﺘﻌﻤﻠﯿﻦ‪ ،‬ھﻮ اﻷﻏﻨﻰ ﺑﻤﺮﻛﺒﺎت اﻟﻘﻠﻮﯾﺪات و ﯾﺤﺘﻮي ﻋﻠﻰ‬
‫)‪(+‬‬
‫‪ pseudoéphédrine‬ﻛﻘﻠﻮﯾﺪ رﺋﯿﺴﻲ‪.‬‬
‫اﻟﻜﻠﻤﺎت اﻟﻤﻔﺘﺎﺣﯿﺔ‪’Ephedra alata alenda :‬دراﺳﺔ اﺳﺘﻘﺼﺎﺋﯿﺔ اﺛﻨﻮﻧﺒﺎﺗﯿﺔ‪ ،‬اﻟﻨﺸﺎط اﻟﻤﻀﺎد ﻟﻠﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺎ‪, CPT ،DPPH ،‬ﻋﻼﻗﺔ‬
‫طﺮدﯾﺔ’ ‪ ’(+) pseudoéphédrine‬ﻗﻠﻮﯾﺪ‬

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