ELISA for the detection of IgG antibodies to Chlamydia trachomatis

Transcription

ELISA for the detection of IgG antibodies to Chlamydia
trachomatis in human serum
ELISA Zum Nachweis von IgG antikörpern gegen
Chlamydia trachomatis aus menschlichem serum
Test ELISA pour la détection des anticorps IgG antiChlamydia trachomatis dans le sérum humain
Test ELISA para la detección de anticuerpos IgG anti
Chlamydia trachomatis en suero humano
ELISA per la determinazione di anticorpi IgG specifici
per Chlamydia trachomatis nel siero umano
E
Intended Use
The SeroCT™ - IgG kit is intended for the detection of IgG antibodies specific to C.
trachomatis in human serum.
The Savyon® SeroCT™ - IgG kit is a new generation qualitative ELISA test which is
based on Chlamydia trachomatis specific synthetic peptides.
SeroCT™ is used as an aid in the diagnosis of C. trachomatis specific infection.
SeroCT™ - IgG is intended to be run and interpreted in conjunction with the Savyon®
SeroCT™ - IgA kit.
For In Vitro Diagnostic Use.
Introduction
Chlamydia is a gram negative obligate intracellular bacteria that causes acute and
chronic disease in mammalian and avian species. The genus Chlamydia is comprised of
four species: C. trachomatis, C. pneumoniae,C. psittaci and C. pecorum (1- 4).
C. trachomatis is divided into 15 serovars (5-8). Serovars A, B, Ba and C are agents of
trachoma(9), the leading cause of preventable blindness, endemic in third world
countries. Serovars L1-L3 are the agents of lymphogranuloma venereum. Serovars D-K
are the common cause of sexually transmitted genital infection worldwide: cervicitis,
endometritis/salpingitis(10) in females and urethritis(11) in both males and females.
Endometritis/salpingitis can lead to tubal occlusion with a higher risk of extrauterine
pregnancy and infertility. Genital infection may cause an acute and persistent infection
occasionally without any clinical signs. Generally, these infections are treatable once
they are diagnosed. However, without any treatment the infection may progress to a
severe chronic inflammation leading to infertility, ectopic pregnancy, induced abortion or
child delivery. Moreover, infants to infected mothers can be infected during birth leading
to conjunctivitis or pneumonia (12-14).
The serology of C. trachomatis is more interesting in cases of chronic infections than in
acute infections.
C. pneumoniae is an important respiratory pathogen in humans and causes up to 10%
of community-acquired pneumonia cases. It has been associated with acute respiratory
diseases, pneumonia, asthma, bronchitis, pharyngitis, acute chest syndrome of sickle
cell disease, coronary heart disease and Gullain-Barré syndrome (15-17).
C. psittaci infects a diverse range of host species from molluscs to birds to mammals and
also causes severe pneumonia. In animals, C. psittaci and C. pecorum are capable of
inducing diverse disease syndromes, like pneumonia, enteritis, polyserositis,
encephalitis and conjunctivitis.
Serological testing, now an established approach in many countries, has been shown to
provide a comprehensive answer for the detection of C. trachomatis infection. In
suspected deep-seated infections, serum sampling reduces the necessity for invasive
procedures which are required for direct antigen detection. In cases of lower urogenital
infections, collection limitations such as effectiveness of scrape sampling procedure,
-3-
specimen handling and transportation difficulties have to be weighted. Above all, there
remains the issue that most Chlamydial infections are asymptomatic. Therefore, an
infection may persist for a long time, ascend the upper genital tract causing deep and
chronic infection, and increase the probability of false negative results in direct antigen
detection.
Serological testing for C. trachomatis, through the detection of various specific
antibodies, is today an effective and highly accepted method option(10,11,18,19). New
and accurate technologies apply the immuno markers IgM, IgA and IgG to characterize
the presence and stage of the infection.
Specific IgM is indicative of acute Chlamydial infection. Absence does not, however,
preclude the presence of on-going infection, especially in recurrent and chronic cases.
The use of specific IgA as a marker for active Chlamydial infection has been shown to
have an important role because of its short half life time, while persisting as long as
antigenic stimulation exists. IgA, however, is more suitable for post therapy follow-up.
IgG is a marker for Chlamydial positive immune-response in either current, chronic or
past infections.
Serological cross reactions occur between the three different species of Chlamydia.
Most of the serological diagnostic assays for Chlamydia use either purified elementary
bodies: microimmunofluorecence (MIF) and ELISA tests, lipopolysaccharide (LPS), or
purified major outer membrane protein, (MOMP) as antigens. Genus specific epitopes
are present in all the above antigens, therefore, low species specificity is observed.
Moreover, a large proportion of the population has been exposed to C. pneumoniae (with
no clinical signs), the prevalence of anti-Chlamydia antibodies is very high. Therefore,
the differentiation between C. pneumoniae and C. trachomatis specific antibodies using
conventional serological screening tests (MIF, ELISA, EIA etc.) is insufficient.
Savyon® Diagnostics has developed an assay in which C. trachomatis species specific
epitopes, derived from different serotypes, are used in an Enzyme - Linked
Immunosorbent Assay (ELISA). The test excludes cross-species reactive epitopes and
enables more accurate and more specific determination of C. trachomatis IgG and IgA
antibodies.
Principle of the Test
•
SeroCT™ plates are coated with C. trachomatis specific peptides.
•
Serum to be tested is diluted and incubated with the precoated SeroCT™ plate 1h at
37°C. In this step C. trachomatis specific antibodies are bound to the immobilized C.
trachomatis specific peptides.
•
Non specific antibodies are removed by washing.
•
Anti-human IgG conjugated to horseradish peroxidase (HRP) is added and
incubated 1h at 37°C. In this step the HRP-conjugate is bound to the prebound
antigen-antibody complex.
-4-
E
•
Unbound conjugate is removed by washing.
•
Upon the addition of TMB-substrate, the substrate is hydrolyzed by the peroxidase,
yielding a blue solution of the reduced substrate.
•
Upon the addition of the stop solution, the blue color turns yellow and should be read
by an ELISA reader at a wavelength of 450nm.
•
The absorbance is proportional to the amount of the specific antibodies which are
bound to the immobilized peptides.
Summary of Procedure
Wells of microtiter plate coated with C. trachomatis specific antigens
↓
Add 2 x 50µl of Negative Control
Add 1 x 50µl of Positive Control and diluted specimens
↓
Cover plate and incubate 1h at 37°C at 100% humidity
↓
Wash 3 times with Wash Buffer
↓
Add 50µl of 1/300 diluted HRP - Conjugate
↓
Cover plate and incubate 1h at 37°C at 100% humidity
↓
Wash 3 times with Wash Buffer
↓
Add 100µl of TMB-Substrate
↓
Cover plate and incubate 15min at room temperature
↓
Add 100µl of Stop Solution
↓
Read absorbance at 450nm
↓
Calculate and interpret results
-5-
Kit contents:
Test Kit for 96 determinations
Catalog No.: A181-01M
1. C. trachomatis antigen - coated microtiter plate 96 break-apart wells (8x12)
coated with C. trachomatis specific peptides, packed in an aluminum pouch
containing a desiccant card.
1 plate
2. Concentrated Wash Buffer (20x): A PBS -Tween buffer.
1 bottle, 100 ml
3. Serum Diluent (Blue): A ready to use buffer solution. Contains less than 0.05%
proclin as preservative.
1 bottle, 30 ml
4. Conjugate Diluent (Green): A ready to use buffer solution. Contains less than
0.05% proclin as preservative.
1 bottle, 40 ml
5. Negative Control: A ready to use C. trachomatis IgG negative human serum.
Contains less than 0.05% proclin and less than 0.1% Sodium Azide as preservatives.
1 vial, 1.25 ml
6. Positive Control: A ready to use C. trachomatis IgG positive human serum.
1 vial, 0.75 ml
7. Concentrated HRP-Conjugate (300x): Horseradish peroxidase (HRP) conjugated
anti-human IgG (Gamma chain specific). Contains less than 0.05% proclin as
preservative.
1 vial, 0.2 ml
8. TMB-Substrate: A ready to use solution contains 3,3'5,5' tetramethylbenzidine as a
chromogen and peroxide as a substrate.
1 bottle, 14 ml
9. Stop Solution: A ready to use solution. Contains 1M H2SO4.
1 bottle, 15 ml
10. Plate cover:
1 unit
11. Instruction Manual:
1
Test Kit for 192 determinations
Catalog No.: B181-01M
1. C. trachomatis antigen - coated microtiter plate 96 break-apart wells (8x12)
coated with C. trachomatis specific peptides, packed in an aluminum pouch
containing a desiccant card.
2 plates
2. Concentrated Wash Buffer (20x): A PBS -Tween buffer.
2 bottles, 100 ml each
3. Serum Diluent (Blue): A ready to use buffer solution. Contains less than 0.05%
proclin as preservative.
1 bottle, 60 ml
-6-
E
4. Conjugate Diluent (Green): A ready to use buffer solution. Contains less than
0.05% proclin as preservative.
1 bottle, 80 ml
5. Negative Control: A ready to use C. trachomatis IgG negative human serum.
1 vial, 2.4 ml
6. Positive Control: A ready to use C. trachomatis IgG positive human serum.
1 vial, 1.25 ml
7. Concentrated HRP-Conjugate (300x): Horseradish peroxidase (HRP) conjugated
anti-human IgG (Gamma chain specific). Contains less than 0.05% proclin, as
preservative.
1 vial, 0.2 ml
8. TMB-Substrate: A ready to use solution contains 3,3'5,5' tetramethylbenzidine as a
chromogen and peroxide as a substrate.
1 bottle, 24 ml
9. Stop Solution: A ready to use solution. Contains 1M H2SO4.
1 bottle, 30 ml
10. Plate cover:
2 units
11. Instruction Manual:
1
Materials Required But Not Supplied:
1. Clean test tubes for dilution of patients sera.
2. Disposable plastic vial for dilution of the concentrated HRP- conjugated anti human
IgG.
3. Adjustable micropipettes, or multichannel pipettes (5-50, 50-200 and 200-1000µl
ranges) and disposable tips.
4. One liter volumetric flask.
5. One 50ml volumetric cylinder.
6. Wash bottle.
7. Absorbent paper.
8. Vortex mixer.
9. A 37°C water bath with a lid, or a moisture chamber placed in an incubator at 37°C.
10. ELISA-reader with 450nm filter.
11. Distilled or double deionized water.
Warning and Precautions
For In Vitro Diagnostic Use
1. This kit contains human sera which have been tested by FDA and CE approved
techniques, and found to be negative for HBV antigen and for HCV and HIV 1&2
antibodies. Since no known method can offer complete assurance that products
derived from human blood do not transmit infection, all human blood components
supplied in this kit must be handled as potentially infectious serum or blood,
-7-
according to the recommendations published in the CDC/NIH manual "Biosafety in
Micro Biological and Biomedical Laboratories", 1988.
2. TMB-Substrate solution is an irritant material to skin and mucous membranes. Avoid
direct contact.
3. Diluted Sulfuric acid (1M) is an irritant agent for the eyes and skin. In case of contact
with eyes, immediatley flush area with water and consult a physician. Do not pour
water into this product. In case of an accident or discomfort consult a physician (if
possible present the label).
4. All the components of this kit have been calibrated and tested by lot.
It is not recommended to mix components from different lots since it might affect the
results.
Storage and Shelf-Life of Reagents
1. All the reagents supplied should be stored at 2-8°C. The unopened reagent vials are
stable until the expiration date indicated on the kit pack. Exposure of originally
stoppered or sealed components to ambient temperature for a few hours will not
cause damage to the reagents. DO NOT FREEZE !
2. Once the kit is opened, it’s shelf life is 90 days.
3. Unused strips must be resealed in the aluminum pouch with the desiccant card, by
rolling the open end and sealing tightly with tape over the entire length of the
opening.
4. Crystals may form in the 20x concentrated Wash Buffer during cold storage, this is
perfectly normal. Redissolve the crystals by warming the buffer to 37°C before
diluting.
Once diluted, the solution may be stored at 2-8°C for up to 21 days.
Serum Collection
Prepare sera from aseptically collected samples using standard techniques. Heat
inactivated sera should not be used. The use of lipemic, turbidor contaminated sera is
not recommended. Particulate material and precipitates in sera may cause erroneous
results. Such specimens should be clarified by centrifugation or filtration prior to the test.
Storage:
Specimens should be stored at 2-8°C and tested within 7 days (adding of 0.1% Sodium
Azide is highly recommended). If a longer storage period is anticipated, aliquot and store
the specimens below -20°C. Avoid repeated thawing and freezing.
Test Procedure
A. Preparation of Reagents
1. Bring all components and clinical specimens to be tested to room temperature. Mix
well the Positive Control, Negative Control and the clinical specimens before use.
2. Determine the total number of specimens to be tested. In addition to the specimens,
the following must be included in each test: two wells of Negative Control and one
well of Positive Control.
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E
3. Withdraw the microtiter plate from its aluminum pouch by cutting one end near the
seal. Leave the required number of strips (according to the number of specimens to
be tested) in the 96 well frame.
4. Dilute the Concentrated Wash Buffer 1/20 with double-deionized or distilled water.
For example, in order to prepare one liter of Wash Buffer, add 50ml of the
Concentrated Wash Buffer to 950ml of double-deionized or distilled water.
B. Incubation of sera samples and controls
5. Dilute each patient serum 1/21 with the supplied Serum Diluent as follows: Add 10µl
of patient serum to 200µl of Serum Diluent.
6. Pipette 50µl of Positive Control, Negative Control and 1/21 diluted sera into separate
wells of the test strip.
The Negative Control should be pipetted into two separate wells.
7. Cover the strips with a plate cover and incubate for 1h at 37°C in a moisture
chamber.
8. Discard the liquid content of the wells.
9. Washing step: Fill each well with wash buffer (300-350µl) up to the end of the well
and discard the liquid, repeat this step two times, for a total of three washing steps.
10. Dry the strips and frame by gently tapping them over clean absorbent paper.
C. Incubation with Conjugate
11. Concentrated HRP-Conjugate anti-human IgG should be diluted to working solution
shortly before use.
Dilute the concentrated HRP-conjugated 1/300 with Conjugate Diluent.
For example, for two strips prepare a minimum of 3 ml of diluted HRP-Conjugate(10µl of Concentrated HRP-conjugate is mixed with 3ml of Conjugate Diluent).
12. Pipette 50µl of diluted conjugate into each well .
13. Cover the strips with a plate cover and incubate for 1h at 37°C in a moisture
chamber.
14. Discard the liquid content and wash as described in steps 9-10.
D. Incubation with TMB - Substrate
15. Pipette 100µl TMB-Substrate into each well, cover the strips with a plate cover and
incubate at room temperature for 15 minutes.
16. Stop the reaction by adding 100µl of Stop Solution (1M H2SO4) to each well.
E. Determination of Results
17. Determine the absorbance at 450nm and record the results. Determination should
not exceed 30 minutes following stopping of chromogenic reaction.
-9-
Note: Any air bubbles should be removed before reading.
The bottom of the ELISA plate should be carefully wiped.
Test Validation
For the test to be valid the following criteria must be met. If these criteria are not met the
test should be considered invalid and should be repeated.
1. Positive Control: The absorbance value should be ≥ 0.8 at 450nm.
2. Negative Control: The average absorbance value of the Negative Control
performed in duplicate should be 0.1< NC ≤ 0.4 at 450nm.
Calculation of Cut-Off Value (COV) and Cut-Off Index (COI)
The cut-off value is calculated according to the following formula: COV = NC x 2
NC = The average absorbance at 450nm of the Negative Control run in duplicate.
In order to normalize the results obtained in different tests, the cut-off index (COI) is
calculated according to the following formula:
COI = absorbance of the serum sample at 450nm
COV
Interpretation of Results
Table 1: Correlation between the absorbance at 450nm and the presence of C.
trachomatis IgG Antibodies
Absorbance at 450nm
O.D
O.D < COV
COI
Result
< 1.0
Negative
No detectable IgG antibodies to C.
trachomatis.
COV≤ O.D ≤ COV x 1.1 1-1.1 Borderline Presence or absence of detectable
(Borderline) levels of IgG antibodies to C.
trachomatis cannot be determined. A second
serum sample should be obtained after 14-21
days and tested.
(When second sample is borderline the result
should be considered as negative).
O.D >COV x 1.1
>1.1 Positive Detectable levels of IgG antibodies to C.
trachomatis.
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E
Table 2: Interpretation of results based on IgG and IgA antibodies determination
Levels of C. trachomatis specific antibodies
IgG
IgA
Negative
Negative
Negative (or beyond the sensitivity of this test).
Positive Negative or Borderline May indicate past or current infection.
Borderline
Borderline
Second sample testing is required after 14-21
days. Repeated borderline results should be
considered negative.
Positive
Positive
May indicate acute or chronic infection.
Negative
Positive
May indicate acute or chronic infection.
Test Limitations
1. No single serological test should be used for a final diagnosis. All clinical and
laboratory data should be taken into account.
2. Samples obtained too early during primary infection may not contain detectable
antibodies. If Chlamydial infection is suspected, a second sample should be obtained
14-21 days later and tested in parallel with the original sample.
Performance Characteristics of SeroCT™-IgG
Table 3: Sensitivity of SeroCT™-IgG compared to culture.
The study was carried out in a reference laboratory on patients with a positive C.
trachomatis culture.
SeroCT™-IgG
Culture Positive
45
Positive
Negative
35
10
Sensitivity: 35/45 x 100 = 78%
Table 4: Sensitivity and Specificity of SeroCT™ - IgG compared to
microimmunofluorescence (MIF)
The study was carried out on patients suspected of having a C. trachomatis infection.
SeroCT™ - IgG was compared to a commercial MIF test kit.
SeroCT™ - IgG
MIF
Positive
Negative
Positive
58
55
3
Negative
50
5
45
Total
108
60
48
- 11 -
Sensitivity: 55/58 x 100 = 95%
Specificity: 45/50 x 100 = 90%
Overall Agreement: 100/108 x 100 = 93%
Table 5: Specificity of SeroCT™-IgG on different control groups
Group Tested
No. of
Sera
Negative on
SeroCT™ - IgG
Specificity of
SeroCT™ - IgG(%)
Blood Donors
250
230
92
Individuals Negative fo C. trachomatis
and Positive for C. pneumoniae (MIF)
35
33
94
Healthy Children
30
29
97
Healthy Pregnant Women
30
28
93
Table 6: Specificity of SeroCT™-IgG compared to two different MIF tests
Specificity of SeroCT™-IgG was determined in comparison to MIF in two independent
studies, each using a different MIF test. The serum samples used in each study were
defined by MIF as either negative for both C. trachomatis and C. pneumoniae antibodies
(MIF Ct-/Cp-) or as negative for C. trachomatis, positive for C. pneumoniae (MIF Ct/Cp+).
MIF
Ct-/Cp-
MIF
Ct-/Cp+
SeroCT™-IgG
Negative
Specificity of
SeroCT™-IgG(%)
Study #1
(In house MIF)
0
64
58
91
Study #2
(SeroFIA™
Savyon)
30
100
117
90
Conclusion: SeroCT™-IgG demonstrates a specificity higher than 90% for C.
trachomatis .
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E
Precision
Intra-assay (within-run) precision of the SeroCT™ - IgG test is shown below:
Sample
No. of
Replicates
Mean Value
CV %
Positive
10
0.835
2.5
Negative
10
0.149
8.8
Inter-assay (between-run) precision of the SeroCT™-IgG is shown below:
Sample
No. of
Replicates
Mean Value
CV %
Positive
10
0.902
2.9
Negative
10
0.167
5.5
- 13 -
G
SeroCT® - IgG
Verwendungszweck
Der SeroCT®-IgG Kit dient zum Nachweis von IgG Antikörpern spezifisch für C.
trachomatis im Humanserum.
Der SeroCT®- IgG Kit gehört zu einer neuen Generation qualitativer ELISA Tests, der auf
Chlamydia trachomatis spezifischen, synthetischen Peptiden basiert.
Der SeroCT®- IgG Kit ist zur Durchführung und Interpretation zusammen mit dem
Savyon® SeroCT®- IgA Kit vorgesehen.
Nur zur in vitro Diagnostik
Einführung
Chlamydia sind gram-negative, obligat intrazelluläre Bakterien, die akute und chronische
Krankheiten in Säugern und Vögeln verursachen. Die Gattung Chlamydia beinhaltet
vier Spezies: C. trachomatis, C. pneumoniae, C. psittaci und C. pecorum (1-4).
C. trachomatis ist in 15 Serovare unterteilt (5-8). Die Serovare A, B, Ba und C
verursachen Trachoma (9), eine unbehandelt zur Erblindung führende Infektion,
besonders häufig in tropischen und subtropischen Regionen mit niedrigem
Hygienestandard. Die Serovare L1-L3 sind Erreger des Lymphogranuloma venereum
(LGV, Lymphopathia venerea). Die Serovare D-K sind weltweit häufig die Ursache von
sexuell übertragenen Genitalinfektionen: Zervizitis, Endometritis/Salpingitis (10) bei
Frauen und Urethritis (11) bei Männern als auch bei Frauen. Die Genitalinfektion kann
als akute und bisweilen chronische Infektion ohne klinische Symptomatik verlaufen. Im
allgemeinen sind diese Infektionen, wenn diagnostiziert, kurabel. Ohne Behandlung
können sie sich zu schweren chronischen Entzündungen entwickeln, die zu
Unfruchtbarkeit durch Tubenverschluss, ektopisher Schwangerschaft, Aborten oder
Frühgeburten führen. Des weiteren können Neugeborene von infizierten Müttern
während der Geburt infiziert werden, was zu Konjunktivitis und Pneumonie führen kann
(12-14).
Die Serologie von C. trachomatis ist bei chronischen Infektionen von höherem Interesse
als bei akuten Entzündungen.
C. pneumoniae ist ein wichtiges Pathogen der Atemwege bei Menschen und verursacht
bis zu 10% der Fälle von Lungenentzündung. Es wurde akuten Krankheiten der
Atemwege zugeordnet, wie Pneumonie, Asthma, Bronchitis, Pharingitis, akutes
Brustsyndrom der Sichelzellkrankheit, Koronarherzleiden und Guillain-Barré Syndrom
(15-17).
C. psittaci infiziert eine Reihe verschiedenartiger Spezies von Weichtieren, Vögeln und
Säugetieren und verursacht u.a.. schwere Pneumonien in Tieren. C. psittaci und C.
pecorum können verschiedene Krankheitsbilder wie Lungenentzündung, Polyserositis,
Enzephalitis und Konjunktivitis hervorrufen.
- 15 -
Infektionen des Menschen kommen vor, sind aber offenbar nicht häufig.
Serologische Tests auf Chlamydia trachomatis AK sind heute eine akzeptierte Methode
in vielen Ländern und haben gezeigt, daß sie für den Nachweis von Chlamydia
trachomatis - Infektionen wertvolle Informationen liefern. Beim Verdacht auf tiefsitzende
Infektionen vermindert die Serumentnahme die Notwendigkeit invasiver Prozeduren,
die für den direkten Antigen-Nachweis erforderlich sind. In Fällen von
Urogenitalinfektionen sind die Unsicherheit der Abstrichprozedur, sowie die
Schwierigkeiten beim Handhaben und dem Transport der Proben in Betracht zu ziehen.
Es ist seit langem bekannt, daß viele Chlamydia - Infektionen asymptomatisch verlaufen
können. Eine Infektion kann daher lange Zeit bestehen, in den oberen Genitaltrakt
aufsteigen und schwerwiegende, evtl. chronische Entzündungen verursachen und die
Wahrscheinlichkeit falsch negativer Resultate beim direkten Antigen-Nachweis erhöhen.
Serologische Tests zum Nachweis verschiedener spezifischer Antikörper sind eine
effektive und häufig angewandte Methode zur Feststellung von C. trachomatisInfektionen (10,11,18,19), Neue Technologien nutzen die Immunomarker IgM, IgA und
IgG, um Bestehen und Stadium einer solchen Infektion zu charakterisieren.
Spezifisches IgM ist ein Hinweis auf akute Chlamydia-Infektionen. Sein Fehlen schliesst
jedoch - besonders in rezidivierenden und chronischen Fällen - eine Infektion nicht aus.
Der Einsatz von spezifischem IgA als Marker für aktive Chlamydia-Infektionen erwies
sich als wichtig wegen der kurzen Halbwertzeit, wohingegen es wohl erhalten bleibt,
solange eine ausreichende antigene Stimulation vorhanden ist. IgA ist darüber hinaus
wichtig als posttherapeutische Kontrolle. IgG ist ein Marker für Chlamydia-positive
Immunantworten bei akuten, chronischen oder früheren Infektionen.
Serologische Kreuzreaktionen zwischen den drei verschiedenen Spezies von
Chlamydia treten auf. Die meisten serologischen Tests auf Chlamydia-AK benützen
entweder gereinigte (MIF) Elementarteilchen, Lipopolysaccharide (LPS), oder
gereinigtes Protein der Aussenmembran (MOMP) als Antigene.
Genus-spezifische Epitope sind in all diesen Antigenen vorhanden, geringe SpeziesSpezifität ist daher die Folge. Des weiteren ist ein Grossteil der Bevölkerung mit C.
pneumoniae (ohne klinisches Erscheinungsbild) durchseucht und das Vorkommen von
anti-Chlamydia Antikörpern ist sehr häufig. Daher ist die Differenzierung zwischen C.
pneumoniae und C. trachomatis-spezifischen Antikörpern mit Hilfe der üblichen
serologischen Screeningverfahren (MIF, ELISA, EIA usw.) noch mangelhaft.
Savyon® Diagnostics hat einen Test entwickelt, in welchem C. trachomatis Speziesspezifische Epitope, aus verschiedenen Serotypen stammend, in einem Enzyme Linked
Immunosorbent Assay (ELISA) verwendet werden. Der Test schliesst Speziesüberkreuzende, reaktive Epitope aus und ermöglicht so die spezifische Bestimmung von
C. trachomatis IgA und IgG-Antikörpern.
- 16 -
G
Grundprinzip des Tests
• SeroCT® platten sind mit C. trachomatis spezifischen Peptiden beschichtet.
• Das zu untersuchende Serum wird verdünnt und in der vorbeschichteten SeroCT®
Platte bei 37°C inkubiert. In diesem Durchgang werden C. trachomatis-spezifische
Antikörper an die immobilisierten C. trachomatis-spezifischen Peptide gebunden.
• Nicht spezifische Antikörper werden durch waschen entfernt.
• Anti-Human IgG konjugiert mit Meerrettich Peroxidase „MRP“ (Horseradish P.
„HRP“) wird zugesetzt und 1 Stunde bei 37°C inkubiert. In diesem Durchgang wird
das MRP-Konjugat an den vorher gebildeten Antigen/Antikörper-Komplex gebunden.
• Nicht gebundenes Konjugat wird durch waschen entfernt.
• Nach zufügen des TMB Substrats wird das Substrat durch die Peroxidase
hydrolysiert, was eine blaue Farbe des reduzierten Substrats ergibt.
• Nach zufügen der Stoplösung erfolgt ein Farbumschlag nach gelb. Mit einem ELISA
Photometer wird bei einer Wellenlänge von 450nm die Absorption gemessen.
• Die Absorption ist proportional zur Menge der spezifischen Antikörper, die an die
immobilisierten Peptide gebunden sind.
Zusammenfassung der Vorgänge
Vertiefungen in einer Mikrotiterplatte, mit C. trachomatis spezifischen Antigenen
beschichtet.
↓
2 x 50µl Negativ Kontrolle hinzufügen.
1 x 50µl Positiv Kontrolle und verdünnte Proben hinzufügen.
↓
Platte abdecken und 1 St. bei 37°C und 100% Feuchtigkeit inkubieren.
↓
3 mal mit dem Waschpuffer waschen.
↓
50µl 1/300 verdünntes MRP-Konjugat zufügen.
↓
Platte abdecken und 1 St. bei 37°C und 100% Feuchtigkeit inkubieren.
↓
3 mal mit dem Waschpuffer waschen.
↓
100µl TMB-Substrat zufügen.
↓
Platte abdecken und genau 15 Min. bei Raumtemperatur inkubieren.
↓
100µl Stoplösung zufügen.
↓
Absorption bei 450nm messen.
↓
Resultate berechnen und interpretieren.
- 17 -
Inhalt des Kits:
Testkit für 96 Bestimmungen
Katalog Nr.: A181-01M
1. C. trachomatis Antigen beschichtete Mikrotiterplatte: (96 Vertiefungen pro
Rahmen), bestehend aus 8 x 12 abbrechbaren Vertiefungen, in einer Alutasche mit
Exsikkatorkarte.
1 Platte
2. Waschpuffer, konzentriert (20x): Ein PBS-Tween Puffer.
1 Flasche, 100 ml
3. Serumverdünnung (blau): Eine gebrauchsfertige Pufferlösung. Enthält weniger als
0.05% proclin als Konservierungsmittel.
1 Flasche, 30 ml
4. Konjugatverdünnung (grün): Eine gebrauchsfertige Pufferlösung.
Enthält weniger als 0.05% proclin als Konservierungsmittel.
1 Flasche, 40 ml
5. Negativ Kontrolle: Ein gebrauchsfertiges C. trachomatis IgG negatives
Humanserum. Enthält weniger als 0.05% proclin und weniger als 0.1% Natriumazid
als Konservierungsmittel.
1 Fläschchen, 1.25 ml
6. Positiv Kontrolle: Ein gebrauchsfertiges C. trachomatis IgG positives
7. MRP-Konjugat, konzentriert (300x): Mit Meerrettich-Peroxidase konjugiertes AntiHuman IgG (gamma-chain spezifisch). Enthält weniger als 0.05% proclin als
Konservierungsmittel.
8. TMB-Substrat: Die gebrauchsfertige Lösung enthält 3,3'5,5'Tetramethylbenzidin als
Chromogen und Peroxid als Substrat.
1 Flasche, 14 ml
9. Stoplösung: Gebrauchsfertige Lösung. Enthält 1M H2SO4.
1 Flasche, 15 ml.
10. Plattendeckel:
1 Stück
11. Packungsbeilage:
1 Stück
Testkit für 192 Bestimmungen
Katalog Nr.: B181-01M
1. C. trachomatis Antigen - beschichtete Mikrotiterplatte: (96 Vertiefungen pro
Rahmen), bestehend aus 8 x 12 abbrechbaren Vertiefungen, in einer Alutasche mit
Exsikkatorkarte.
2 Platten
2. Waschpuffer, konzentriert (20x): Ein PBS-Tween Puffer.
2 Flaschen, 100 ml je
3. Serumverdünnung (blau): Eine gebrauchsfertige Pufferlösung. Enthält weniger als
0.05% proclin als Konservierungsmittel.
1 Flasche, 60 ml
- 18 -
G
4. Konjugatverdünnung (grün): Eine gebrauchsfertige Pufferlösung. Enthält weniger
als 0.05% proclin als Konservierungsmittel.
1 Flasche, 80 ml
5. Negativ Kontrolle: Ein gebrauchsfertiges C. trachomatis IgG negatives
6. Positiv Kontrolle: Ein gebrauchsfertiges C. trachomatis IgG positives
7. MRP-Konjugat, konzentriert (300x): Mit Meerrettich-Peroxidase konjugiertes AntiHuman IgG (gamma-chain spezifisch). Enthält weniger als 0.05% proclin als
Konservierungsmittel.
8. TMB-Substrat: Die gebrauchsfertige Lösung enthält 3,3'5,5' Tetramethylbenzidin als
Chromogen und Peroxid als Substrat.
1 Flasche, 24 ml
9. Stoplösung: Gebrauchsfertige Lösung. Enthält 1M H2SO4.
1 Flasche, 30 ml
10. Plattendeckel:
2 Stück
11. Packungsbeilage:
1 Stück
Material benötigt - nicht mitgeliefert:
1. Saubere Gefässe zur Verdünnung des Patientenserums.
2. Saubere Gefässe zur Verdünnung des konzentrierten MRP-konjugierten Anti-Human
IgG.
3. Einstellbare Mikropipetten, oder Multikanalpipetten (5-50, 50-200 und 200-1000µl
Bereich) und Pipettenspitzen.
4. 1 Liter Messflasche.
5. 1 50ml Messzylinder.
6. 1 Waschflasche.
7. Papierhandtücher oder Absorbierpapier.
8. Vortex Mischgerät.
9. Wasserbad für 37°C mit Deckel, oder feuchte Kammer in einem 37°C Inkubator.
10. ELISA für Mikrotiterplatten mit 450nm.
11. Aqua dest.oder doppelt entionisiertes Wasser zur Verdünnung des
Waschpufferkonzentrats.
Warnhinweise und Vorsichtsmassnahmen
Nur zur in vitro Diagnostik
1. Menschliche Seren, die in diesem Testkit enthalten sind wurden nach FDA- und CE
genehmigten Methoden geprüft und als negativ für HBsAg-, HCV- und HIV- 1 & 2
Antikörper befunden. Dennoch ist bei Produkten menschlichen Ursprungs mit
keinem der derzeit verfügbaren analytischen Verfahren mit letzter Sicherheit
- 19 -
auszuschließen, dass diese Krankheiten übertragen können. Daher müssen alle in
diesem Testkit enthaltenen Reagenzien menschlichen Ursprungs nach den
Empfehlungen, veröffentlicht in der CDC/NIH Anleitung „Biosafety in Micro Biological
and Biomedical Laboratories 1988", grundsätzlich als potenziell infektiöses Serum
oder Blut angesehen und entsprechend behandelt werden.
2. TMB Substratlösung ist ein Stoff, der Haut und Schleimhäute reizt.
Direkter Kontakt ist zu vermeiden.
3. Verdünnte Schwefelsäure (1M) ist ein Reizmittel für Augen und Haut. Im Fall eines
Kontaktes mit den Augen, spülen Sie sofort mit viel Wasser, und konsultieren Sie
einen Arzt. Gießen Sie kein Wasser in das Produkt.
4. Alle Bestandteile dieses Kits wurden in der Lieferserie kalibriert und getestet. Es wird
empfohlen, keine Bestandteile aus verschiedenen Chargen zu vermischen, da es die
Ergebnisse beeinträchtigen könnte.
Lagerung und Lagerfrist der Reagenzien
1. Alle gelieferten Reagenzien sollten bei 2-8°C gelagert werden.Ungeöffnete
Reagenzfläschchen sind bis zu der auf der Verpackung angegebenen Verfallszeit
stabil. Reagenzien die noch original verschlossen sind und die für einige Stunden
der Aussentemperatur ausgesetzt waren, werden keinen Schaden erleiden. NICHT
EINFRIEREN !
2. Einmal geöffnet, hat der Kit eine Lagerfrist von 90 Tagen.
3. Nicht verwendete Streifen müssen in der Alutasche mit der Exsikkatorkarte erneut
versiegelt werden, indem das offene Ende gefaltet und dicht mit Klebeband über die
ganze Länge der Öffnung verschlossen wird.
4. Kristalle können sich in dem 20x konzentrierten Waschpuffer während der
Kühllagerung bilden. Das ist nicht ungewöhnlich. Lösen Sie die Kristalle durch
erwärmen des Puffers auf 37°C vor dem Verdünnen auf.
Wenn bereits verdünnt, kann die Lösung bei 2-8°C bis zu 21 Tage gelagert werden.
Gewinnung der Seren
Der vorliegende Test wurde zur Untersuchung Serum konzipiert, Hyperlipämische,
hämolysische, kontaminierte oder hitzeinaktivierte Seren können zu falschen
Ergebnissen führen, Solches Material sollte mit diesem Test möglichst nicht untersucht
werden. Die Gewinnung der Seren sollte fachgerecht erfolgen.
Lagerung
Serumproben sollten bei einer Temperatur von 2-8°C gelagert und innerhalb von
höchstens 7 Tagen untersucht werden.
Für längere Lagerung sollte 0.1% Natriumazid zugefügt werden und die Proben sollten
bei einer Temperatur unter -20°C eingefroren werden.
Grössere Volumina sollten in praktikable Aliquots geteilt werden.
Häufigeres einfrieren und auftauen sollte vermieden werden. Nach auftauen der Proben
sollten diese gut gemischt werden.
Testablauf
A. Vorbereitung der Reagenzien
1. Alle Bestandteile und klinischen Proben, die zu prüfen sind, müssen auf
- 20 -
G
Zimmertemperatur gebracht werden. Die Positiv Kontrolle, Negativ Kontrolle und die
klinischen Proben vor Verwendung gründlich mischen.
2. Die Gesamtzahl der zu testenden Proben feststellen. Ausser den zu testenden
Proben, müssen in jedem Test zwei Vertiefungen für die Negativ Kontrolle und eine
Vertiefung für die Positiv Kontrolle vorgesehen werden.
3. Entnehmen Sie die Mikrotiterplatte aus ihrer Alutasche indem Sie ein Ende nahe
dem Verschluss abschneiden. Fixieren Sie die benötigte Anzahl von Streifen
(gemäss der Zahl der zu testenden Proben) im Rahmen.
4. Verdünnen Sie das Waschpufferkonzentrat 1/20 mit doppelt entionisiertem Wasser
oder aqua dest. Zum Beispiel, um 1 Liter Waschpuffer zuzubereiten, fügen sie 50 ml
des Waschpufferkonzentrats zu 950ml von doppelt entionisiertem Wasser oder aqua
dest.
B. Inkubation der Serumproben und Kontrollen
5. Verdünnen Sie jedes Patientenserum 1/21 mit der mitgelieferten Serumverdünnung
wie folgt: 10µl Patientenserum zu 200µl Serumverdünnung hinzufügen.
6. 50µl der Positiv Kontrolle, Negativ Kontrolle und der 1/21 verdünnten Seren in
separate Vertiefungen des Teststreifens pipettieren. Die Negativ Kontrolle soll in zwei
separate Vertiefungen pipettiert werden. In den Vertiefungen sollten keine Luftblasen
sein!
7. Plattendeckel auflegen und für eine Stunde bei 37°C in einer feuchten Kammer
inkubieren.
8. Flüssigkeitsinhalt aus den Vertiefungen entfernen.
9. Waschschritt: jede Vertiefung bis unter den Rand (300-350µl) mit Waschpuffer
füllen und dann Flüssigkeit verwerfen. Wiederholen sie diesen Schritt noch zwei
weitere Mal, also insgesamt sollte der Waschschritt dreimal erfolgen.
10. Die Streifen im Rahmen durch leichtes abklopfen auf sauberem Absorbierpapier
trocknen.
C. Inkubation mit Konjugat
11. Konzentriertes MRP-konjugiertes Anti-Human IgG soll kurz vor der Verwendung zur
einer Arbeitslösung verdünnt werden. Verdünnen Sie das konzentrierte MRPkonjugierte Anti-Human IgG 1/300 mit Konjugatverdünnung. Zum Beispiel: Für zwei
Streifen bereiten Sie 3ml verdünntes MRP-konjugiertes Anti-human IgG (10µl des
konzentrierten MRP-konjugierten Anti-Human IgG werden mit 3ml
Konjugatverdünnung gemischt).
12. 50µl des verdünnten Konjugats in jede Vertiefung pipettieren. Luftblasen vermeiden!
13. Plattendeckel auflegen und für eine Stunde bei 37°C in einer feuchten Kammer
inkubieren.
- 21 -
14. Flüssigkeitsinhalt entfernen und waschen, wie unter Ziffer 9 beschrieben.
15. Die Streifen im Rahmen durch leichtes abklopfen auf sauberem Absorbierpapier
trocknen.
D. Inkubation mit TMB-Substrat
Anmerkung: Das TMB-Substrat ist in gebrauchsfertiger Form.
16. 100µl TMB-Substrat in jede Vertiefung pipettieren, Plattendeckel auflegen und 15
Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
17. Reaktion durch zufügen von 100µl Stoplösung in (1µ H2SO4) jede Vertiefung
unterbrechen.
E. Bewertung der Ergebnisse
18. Absorption bei 450nm messen und Ergebnisse aufzeichnen. Die Messung
sollte innerhalb von 30 Minuten nach stoppen der chromogenen Reaktion erfolgen.
Anmerkung: Vor dem Ablesen sind Luftblasen aus den Vertiefungen zu entfernen.
Der Boden der Reaktionsstreifen sollte vorsichtig von Kondenswasser und eventuellen
Verunreinigungen befreit werden.
Testbewertung
Für die Gültigkeit des Tests müssen folgende Kriterien erfüllt sein. Falls diese nicht erfüllt
sind, ist der Test als ungültig anzusehen und sollte wiederholt werden.
1. Positiv Kontrolle: Der Absorptionswert soll ≥ 0.8 bei 450nm.
2. Negativ Kontrolle: Der durchschnittliche Absorptionswert der Negativ Kontrolle,
zweifach durchgeführt, soll 0.1< NC ≤0.4 bei 450nm sein.
Berechnung des Cut-Off-Wertes (COV) und des Cut-Off-Index (COI)
Der Cut-Off-Wert wird laut folgender Formel berechnet: COV = NC x 2
NC = die durchscnittliche Absorption der zwei Negativ Kontrollen bei 450nm.
Um die in verschiedenen Testen erzielten Ergebnisse zu normen, wird der Cut-Off-Index
laut folgender Formel berechnet:
COI =
Absorption der Serumprobe bei 450nm
COV
- 22 -
G
Auswertung der Ergebnisse
Tab. 1: Korrelation zwischen Absorption bei 450nm und dem Vorhandensein von
IgG Antikörpern
Absorption bei 450nm
O.D
COI
Ergebnis
Ergebnisauswertung
O.D < COV
< 1.0
Negativ
COV≤ O.D≤ COV x 1.1
1-1.1
Zweideutig
Nach 14-21 Tagen sollte eine
zweite Serumprobe untersucht
werden.
Bei gleichem/ähnlichem Ergebnis
liegt eine.
Chlamydien-Infektion u.U. lange
Zeit zurück.
O.D > COV x 1.1
>1.1
Positiv
Nachweisbare Spiegel von IgG
Antikörpern gegen C. trachomatis.
Keine IgG Antikörper gegen C.
trachomatis nachweisbar.
Tab. 2: Bedeutung der Ergebnisse bei gleichzeitiger Bestimmung von IgG und IgA
Testergebnis
Bedeutung der Ergebnisse
IgG
IgA
Negativ
Negativ
Negativ (evtl, unter der Sensitivitätsgrenze)
schwach positiv/
hoch positiv
Negativ
IgG Antikörper sind nachweisbar. Hinweis
auf eine akute oder abgelaufene Infektion.
/grenzwertig bis
schwach positiv
grenzwertig
grenzwertig bis
schwach positiv
schwach positiv/
hoch positiv
IgA und IgG Antikörpesind nachweisbar,
Hinweis auf eine akute oder chronische
Infektion.
Negativ
schwach positiv/
hoch positiv
IgA Antikörper können auf eine akute oder
chronische Infektion hinweisen.
Neue Probe nach 14-21 Tagen testen.
- 23 -
Testeinschränkungen
1. Kein einzelner serologischer Test sollte für eine endgültige Diagnose herangezogen
werden. Alle klinischen und Laborbefunde sollten in Betracht gezogen werden.
2. Proben, die zu früh während einer Erstinfektion entnommen wurden, enthalten
möglicherweise keine nachweisbaren Antikörper. Falls Verdacht auf eine
Chlamydia-Infektion besteht, sollte eine weitere Probe 14-21 Tage später
entnommen und parallel mit der Originalprobe getestet werden.
Leistungscharakteristiken des SeroCT-IgG®
Tab. 3: Sensitivität des SeroCT-IgG®, verglichen mit einer Kultur.
Untersuchung durchgeführt von einem Referenz-Labor an Patienten mit positiver C.
trachomatis Kultur.
SeroCT®-IgG
Positive Kultur
45
Positiv
Negativ
35
10
Sensitivität :35/45 x 100 = 78%
Tab. 4: Sensitivität und Spezifität des SeroCT®-IgG im Vergleich zur
Mikroimmunofluoreszens (MIF)
Untersuchung durchgeführt bei Patienten mit Verdacht auf eine C. trachomatisInfektion. Der SeroCT®-IgG wurde mit einem handelsüblichen MIF Kit verglichen.
SeroCT® - IgG
MIF
Positiv
Negativ
Positiv
58
55
3
Negativ
50
5
45
Total
108
60
48
Sensitivität: 55/58 x 100 = 95%
Spezifität: 45/50 x 100 = 90%
Übereinstimmung insgesamt: 100/108 x 100 = 93%
- 24 -
G
Tab. 5: Spezifität des SeroCT®-IgG bei verschiedenen Kontrollgruppen
Getestete Gruppe
Anzahl
der Seren
Negativ bei
SeroCT® - IgG
Spezifität von
SeroCT®- IgG(%)
Blutspender
250
230
92
Personen negativ auf C. trachomatis
und positiv auf C. pneumoniae (MIF)
35
33
94
Gesunde Kinder
30
29
97
Gesunde schwangere Frauen
30
28
93
Tab 6: Spezifität des SeroCT®-IgG im Vergleich mit zwei verschiedenen MIF Tests
Die Seren waren durch MIF entweder als „Antikörper negativ“ für C. trachomatis und C.
pneumoniae (MIF Ct-/Cp-) oder als „Antikörper negativ“ für C. trachomatis/ „Antikörper
positiv“ für C. pneumoniae (MIF Ct-/Cp+) definiert.
MIF
Ct-/Cp-
MIF
Ct-/Cp+
SeroCT®-IgG
Negativ
Spezifität des
SeroCT®-IgG(%)
Studie No. 1
(MIF hausintern)
0
64
58
91
Studie No. 2
SeroFIA® Savyon
30
100
117
90
Präzision
Intra-assay (in der Testreihe) Genauigkeit des SeroCT®-IgG Tests, wie im
Nachfolgenden gezeigt:
Probe
Anzahl der
Repliken
Durchschnitts
wert
CV %
Positiv
10
0.835
2.5
Negativ
10
0.149
8.8
Inter-assay (zwischen Testreihen) Genauigkeit des SeroCT® -IgG Tests, wie im
Nachfolgenden gezeigt:
Probe
Anzahl der
Repliken
Durchschnitts
wert
CV %
Positiv
10
0.902
2.9
Negativ
10
0.167
5.5
- 25 -
F
SeroCT™ - IgG
Utilisation
SeroCT™- IgG permet de détecter les anticorps spécifiques anti-Chlamydia trachomatis
de type IgG dans le sérum humain.
Le coffret SeroCT™- IgG est une technique ELISA de nouvelle génération, utilisant des
peptides de synthèse spécifiques de C. trachomatis.
Le coffret SeroCT™- IgG peut être utilisé avec le coffret SeroCT™- IgA de Savyon® pour
une meilleure interprétation de la sérologie.
Usage Diagnostique IN VITRO
Introduction
Les chlamydiae sont des bactéries intracellulaires essentielles à gram négatif qui
provoquent des affections aiguës et chroniques chez les mammifères et les oiseaux. Le
genre Chlamydiae se compose de quatre espèces: C. trachomatis, C. pneumoniae, C.
psittaci et C. pecorum (1-4).
C. trachomatis se divise en 15 serovars (5-8). Les serovars A, B, Ba et C sont les agents
infectieux à l'origine du trachome (9), la première cause de cécité évitable dans le tiers
monde. Les serovars L1-L3 sont les agents infectieux à l'origine de la
lymphogranulomatose vénérienne. Les serovars D-K sont couramment en cause dans
les infections génitales sexuellement transmissibles dans le monde entier, infections
telles que cervicite, endométrite, salpingite (10) chez les femmes, et urétrite (11) chez
les hommes et les femmes. L'endométrite ou la salpingite peuvent mener à l'oblitération
des trompes, entraînant une élévation du risque de grossesse extra utérine et de
stérilité. Les infections génitales peuvent aussi apparaître sous forme d'infections
persistantes sans symptômes cliniques. En général, ces infections sont traitées une fois
diagnostiquées. Lorsqu'aucun traitement n'intervient, elles peuvent évoluer vers une
grave inflammation chronique et aboutir à la stérilité à une grossesse ectopique, à des
avortements à répétition et à des naissances prématurées. De plus, les nourrissons nés
d'une mère infectée peuvent être infectés à leur tour durant l'accouchement et contracter
une conjonctivite ou une pneumonie (12-14). La sérologie de C. trachomatis est plus
intéressante dans les infections chroniques que dans les infections aiguës.
C. pneumoniae est un agent pathogène important chez l'être humain, à l'origine de 10%
des pneumonies contractées en communauté. Il est associé à des affections
respiratoires aiguës, à la pneumonie, à l'asthme, à la bronchite, la pharyngite, au
syndrome pulmonaire aigu de la drépanocytose, aux maladies coronariennes et au
syndrome de Gullain-Barre (15-17).
C. psittaci affecte un large éventail d'espèces, des mollusques aux oiseaux et aux
mammifères et provoque également de graves pneumonies. Chez les animaux, C.
- 27 -
psittaci et C. pecorum peuvent induire divers syndromes tels que la pneumonie,
l'entérite, la polysérite, l'encéphalite et la conjonctivite.
Les analyses sérologiques ont abouti à une réponse fiable au problème posé par la
détection des infections à C. trachomatis. Lorsque l'on soupçonne une infection
déclarée, le prélèvement d'échantillon de serum limite le besoin de procéder à des
techniques agressives, nécessaires au diagnostic direct des agents pathogènes. En cas
d'infection de la partie inférieure des voies uro-génitales, il faut tenir compte des limites
propres aux techniques de prélèvement, telles que l'efficacité du prélèvement par frottis
et les difficultés de manipulation et de transport des échantillons. Le problème reste
avant tout que la plupart des infections à Chlamydia sont asymptomatiques. Une telle
infection peut donc durer longtemps, progresser le long des voies génitales supérieures
et y causer une infection profonde et chronique et, de ce fait, augmenter la probabilité
de résultats faussement négatifs au diagnostic direct des agents pathogènes.
Le diagnostic sérologique de C .trachomatis par la détection de divers anticorps
spécifiques représente désormais une technique efficace et souvent mise en œuvre (10,
11, 18, 19). Des technologies nouvelles et affinées utilisent les marqueurs de
l'immunoglobuline IgM, IgA et IgG afin de déceler la présence de l'agent pathogène et la
phase de l'infection.
L'IgM spécifique indique une infection aiguë à Chlamydiae. Cependant, l'absence d'IgM
n'exclut pas la présence d'une infection continue, surtout dans les cas d'affection
récurrente et chronique. On a pu prouver que l'IgA spécifique est un marqueur indiquant
une affection active à Chlamydiae, étant donné la brièveté de sa durée de vie et le fait
que l'IgA n'est présente que tant qu'elle est stimulée par un antigène. De plus, l'IgA
permet également un suivi post thérapeutique. Un taux d'IgG élevé marque une réponse
immunitaire positive provenant d'une infection à Chlamydiae en cours, chronique ou
passée.
Les réactions croisées sérologiques sont fréquentes entre les différentes espèces de
Chlamydiae. La plupart des analyses sérologiques destinées au diagnostic des
Chlamydiae utilisent soit des corps élémentaires purifiés (analyses par microimmunofluorescence (MIF) et analyses (ELISA), soit des lipo-polysaccharides (LPS) ou
des protéines purifiées des membranes externes (MOMP) comme antigènes: puisque
les épitopes spécifiques de genre sont présents dans tous les antigènes ci-dessus, la
spécificité des espèces est généralement faible. De plus, puisqu'une forte proportion de
la population a subi une exposition à C. pneumoniae sans toutefois présenter de
symptômes cliniques, les anticorps spécifiques des Chlamydiae sont très largement
répandus. La différenciation entre les anticorps spécifiques de C. pneumoniae et ceux
spécifiques de C. trachomatis à l'aide de tests de dépistage sérologiques conventionnels
(MIF, ELISA, EIA etc.) s'avère donc déficiente.
Savyon Diagnostics Ltd. a mis au point un test permettant le dépistage spécifique de C.
trachomatis à l'aide d'une méthode immunoenzymatique (ELISA), capable de distinguer
entre les différents anticorps des infections aux Chlamydiae décrits. Ce test utilise
comme antigène des peptides spécifiques de C. trachomatis, ce qui exclut les épitopes
des réactions croisées entre les espèces et permet donc de déceler de façon plus
précise et plus spécifique les anticorps IgG et des IgA des infections à C. trachomatis.
- 28 -
F
Principe du test
•
•
•
•
•
•
•
•
Des plaques de micro-titration SeroCT™ sont enduites de peptides spécifiques de
C. trachomatis.
Le sérum à tester est dilué puis mis à incuber à 37°C dans les plaques pré-enduites
du test SeroCT™.
Lors de cette étape, les anticorps spécifiques de C. trachomatis de l'échantillon de
sérum vont se fixer aux peptides spécifiques de C. trachomatis immobilisées.
Les anticorps non spécifiques sont éliminés par lavage.
On introduit une IgG anti-humaine conjuguée à de la peroxydase de raifort (HRP).
Durant cette étape, le conjugué HRP va se fixer au complexe antigène-anticorps fixé
auparavant.
Le conjugué non fixé est éliminé par lavage.
L'introduction de substrat de TMB provoque l'hydrolyse du substrat par la
peroxydase, ce qui donne une solution bleue de substrat réduit.
On introduit la solution d'arrêt, la couleur bleue vire au jaune, puis on la lit à l'aide
d'un lecteur ELISA à une longueur d'onde de 450nm.
L'absorbance est proportionnelle à la quantité d'anticorps spécifiques fixés par les
peptides immobilisées.
Résumé des étapes
Puits de plaque de micro-titration enduits d'antigènes de C. trachomatis
↓
Introduction de 2 x 50µl de contrôle négatif
Introduction de 1 x 50µl de contrôle positif et de sérum dilués
↓
Couvrir la plaque et laisser incuber 1h à 37°C dans 100% d'humidité
↓
Laver 3 fois avec le tampon de lavage
↓
Introduire 50µl de conjugué HRP dilué à 1/300
↓
Couvrir la plaque et laisser incuber 1h à 37°C dans 100% d'humidité
↓
Laver 3 fois avec le tampon de lavage
↓
Introduire 100µl de substrat TMB
↓
Couvrir la plaque et laisser incuber 15 min à température ambiante
↓
Ajouter 100µl de solution d'arrêt
↓
Lire l'absorbance à 450nm
↓
Calculer et interpréter les résultats
- 29 -
Composition des coffrets:
Coffret de 96 déterminations
Référence: A 181- 01M Réf. en France: SAV 181 096
1. 1 plaque de 12 barrettes de 8 puits sécables recouverts de peptides de synthèse
spécifique de C. trachomatis. Chaque plaque est conditionnée dans un sachet
aluminium contenant un agent déshydratant.
1 plaque
2. Tampon de lavage concentré (20x): Un PBS-Tween Tampon.
1 flacon, 100 ml
3. Diluant sérum (Bleu): Prêt à l'emploi. Contient du proclin <0.05% comme agent
conservateur.
1 flacon, 30 ml
4. Diluant du conjugué (Vert). Prêt à l'emploi. Contient du proclin <0.05% comme
agent conservateur.
1 flacon, 40 ml
5. Contrôle négatif: Sérum humain négatif pour l'anticorps IgG anti-Chlamydia
trachomatis. Prêt à l'emploi. Contient de l’azide de sodium <0.1% et du procli
<0.05% comme agent conservateur.
1 flacon, 1.25 ml
6. Contrôle positif: Sérum humain positif pour l'anticorps IgG anti-Chlamydia
trachomatis., Prêt à l'emploi. Contient de l’azide de sodium <0.1% et du proclin
1 flacon, 0.75 ml
7. HRP-Conjugué concentré (300x): anti-IgG humaine (spécifique de la chaine
gamma) couplée à la péroxydase. Contient du proclin <0.05% comme agent
conservateur.
1 flacon, 0.2 ml
8. Substrat/Chromogène: 3,3',5,5', Tétraméthylbenzidine comme chromogène et
peroxide comme substrat. Prêt à l'emploi.
1 flacon, 14 ml
9. Solution d'arrêt: Prête à l'emploi. Contient de l’acide sulfurique 1M.
1 flacon, 15 ml
10. couvercle de plaque:
1 unité
11. Notice d'emploi:
1
Coffret de 192 déterminations
Référence: B 181- 01M Réf. en France: SAV 181 192
1. 2 plaques de 12 barrettes de 8 puits sécables recouverts de peptides de synthèse
spécifique de C. trachomatis. Chaque plaque est conditionnée dans un sachet
aluminium contenant un agent déshydratant.
2 plaques
2. Tampon de lavage concentré (20x): Un PBS-Tween Tampon.
2 flacons, 100 ml chacun
- 30 -
F
3. Diluant des sérum (Bleu): Prêt à l'emploi. Contient du proclin <0.05% comme agent
conservateur.
1 flacon, 60 ml
4. Diluant du conjugué (Vert): Prêt à l'emploi. Contient du proclin <0.05% comme
agent conservateur.
1 flacon, 80 ml
5. Contrôle négatif: Sérum humain négatif pour l'anticorps IgG anti-Chlamydia
trachomatis.
Prêt à l'emploi. Contient de l’azide de sodium <0.1% et du proclin <0.05% comme
agent conservateur.
1 flacon, 2.4 ml
6. Contrôle positif: Sérum humain positif pour l'anticorps IgG anti-Chlamydia
trachomatis., Prêt à l'emploi. Contient de l’azide de sodium <0.1% et du proclin
1 flacon, 1.25 ml
7. HRP-Conjugué concentré (300x): anti-IgG humaine (spécifique de la chaîne χ)
couplée à la péroxydase. Contient du proclin <0.05% comme agent conservateur.
1 flacon, 0.2 ml
8. Substrat/Chromogène: 3,3',5,5', Tétraméthylbenzidine comme chromogène et
peroxide comme substrat. Prêt à l'emploi.
1 flacon, 24 ml
9. Solution d'arrêt: Prête à l'emploi. Contient de l’acide sulfurique 1M.
1 flacon, 30 ml
10. couvercle de plaque:
2 unités
11. Notice d'emploi:
1
Matériel nécessaire mais non fourni:
1. Tubes à essais et portoirs pour préparer les dilutions des sérums de patients.
2. Flacon en plastique pour la dilution du HRP-conjugué anti-humaine IgG.
3. Micropipettes ou pipettes multi-canaux (5-50, 50-200 et 200-1000µl) avec embouts
jetables.
4. Tube volumétrique de 1 litre.
5. Une fiole jaugée de 50ml.
6. Bouteille pour la solution de lavage.
7. Papier absorbant
8. Agitateur vortex.
9. Bain-Marie à 37°C, ou une chambre humide placée dans un incubateur à 37°C.
10. Lecteur ELISA équipé d'un filtre à 450nm.
11. Eau distillée en bouteille.
Précautions D'emploi
Usage Diagnostique IN VITRO
1. Ce kit contient des sérums humains qui ont été testés par des techniques
approuvées par la FDA, et CE –Ils ont été trouvés dépourvus d’antigène HBs,d’ac
- 31 -
VIH 1 et 2, et anti HCV ,comme aucune technique ne peux garantir l’innocuité
absolue des matériels testés ,ceux-ci doivent donc être manipulés comme
potentiellement infectieux- selon les recommandations publiées dans le manuel
“Sécurité biologique dans les laboratoires de microbiologie et de biologie médicale,
1988” de CDC/NIH (National Institute of Health - Institut National de la Santé
américain).
2. La solution de substrat TMB est une substance irritante pour la peau et les
muqueuses. Eviter tout contact direct.
3. L’acide sulfrique dilué (1M) est un agent irritant pour les yeux et la peau. En cas de
contact avec les yeux, laver immédiatement et abandamment avec de l’eau et
consulter un spécialiste. Ne jamais verser de l’eau dans ce produit. En cas
d’accident ou de malaise consulter immédiatement un médecin (si possible lui
montrer l’etiquette).
4. Tous les composants de la trousse ont été testés par lot. Ne pas mélanger les
composants de différents lots et ne pas utiliser d'éléments provenant d'autres
fournisseurs.
Conservation et Stabilité des Réactifs
1. Tous les composants de la trousse doivent être conservés entre 2- 8°C. Dans ces
conditions, les réactifs non ouverts sont stables jusqu' à la date de péremption
indiquée sur l'étiquette. L’exposition des composants, munis de leur bouchon
d’origine ou scéllés, à la température ambiante durant quelques heures, ne peut pas
endommager les réactifs. NE PAS CONGELER!
2. Une fois le coffret ouvert, les éléments se conservent pendant 90 jours.
3. Le sachet d'aluminium contenant les barrettes doit être soigneusement refermé sans
oublier le sachet déshydratant.
4. Diluer le tampon de lavage concentré au 1/20 dans l'eau distillée.
Exemple: pour une barrette, préparer 100ml de tampon de lavage (5ml de tampon
de lavage concentré + 95ml d'eau distillée). La solution reconstituée est stable 21
jours à 2-8°C.
Prélèvement des échantillons
Recueillir les échantillons de sérum en respectant l'asepsie. Ne pas utiliser de sérums
inactivés par la chaleur.
Il est recommandé de ne pas utiliser de sérums présentant une lipémie ou troubles. Les
particules et les précipités contenus dans le sérum peuvent fausser les résultats. De tels
échantillons doivent être clarifiés par centrifugation ou filtrage avant analyse.
Conservation:
Les échantillons à tester peuvent être conserver 7 jours à 2-8°C (rajouter de de l’azide
de sodium 0.1%). Si le dosage est prévu dans un délai plus long, conserver les
prélèvements à -20°C. Il est recommandé de ne pas effectuer des décongélations
successives, pour cela fractionner le sérum en plusieurs aliquots.
Réalisation du test
A. Préparation des Réactifs
1. Ramener tous les réactifs à température ambiante avant utilisation. Bien mélanger
le contrôle positif, contrôle négatif et les échantillons à tester.
- 32 -
F
2. Déterminer le nombre total d’échantillons à analyser. Outre les échantillons, inclure
les réactifs suivants dans chaque analyse: deux puits de contrôle négatif et un puits
de contrôle positif.
3. Retirer la plaque de micro-titration de son sachet d’aluminium en coupant l’extrémité
du sachet près de la partie scellée. Laisser le nombre de barrettes voulues dans le
portoir de 96 puits.
4. Diluer le tampon de lavage concentré au 1/20 dans l'eau distillée.
Exemple : pour une barrette, préparer 100 ml de tampon de lavage (5ml de tampon
de lavage concentré + 95ml d'eau distillée).
B. Incubation des échantillons et des contrôles
5. Diluer les sérums de patients au 1/21 de la manière suivante: ajouter 10µl de sérum
de patient à 200µl de diluant des sérums.
6. Déposer 50µl de contrôle positif, 2 contrôles négatifs et les échantillons dilués au
1/21 selon le schéma de dépôt. Le contrôle négatif doit être déposé dans deux
puits separés.
7. Recouvrir les barrettes avec le couvercle de plaque et incuber pendant 1 heure à
37°C en chambre humide.
8. Vider les puits.
9. Etapes de lavage: remplir,à ras-bord, chaque puit avec du liquide de lavage (300350µl) puis éliminer ce liquide. Répéter encore deux fois, pour un total de trois
étapes de lavage.
10. Sécher les plaques et le portoir en les tampotant sur du papier absorbant.
Répéter cette opération trois fois.
C. Incubation du Conjugué
11. HRP- conjugué anti-human IgG doit être dilué juste avant l'utilisation. Diluer le
conjugué au 1/300 avec le diluant du conjugué. Exemple: pour deux barrettes, diluer
10µl de HRP-conjugué anti-human IgG concentré dans 3ml de diluant du conjugué.
12. Déposer 50µl de conjugué dilué par puits.
13. Recouvrir les barrettes avec le couvercle de plaque et incuber pendant 1 heure à
37°C en chambre humide.
14. Vider les puits, les laver 3 fois et les sécher comme indiquer précédemment: étapes
9-10.
D. Incubation du TMB-Substrat/Chromogène
15. Déposer 100µl de TMB-Substrat/Chromogène par puits. Recouvrir les barrettes avec
le couvercle de plaque et incuber pendant 15 minutes à température ambiante.
16. Arrêter la réaction en ajoutant 100µl de solution d’arrêt (H2SO4) 1M par puits..
- 33 -
E. Lecture
17. Essuyer soigneusement le dessous de la plaque et lire à 450nm dans les 30 minutes
qui suivent l'arrêt de la réaction.
Note: Eliminer les éventuelles bulles d’air présentes dans les cupules et essuyer
soigneusement le dessous de la microplaque avant la lecture au spectrophotomètre.
Critères d’acceptabilite du test
Le test peut être validé d’après les conditions suivantes; Si ces conditions ne sont pas
remplies, le test doit être refait.
1. Contrôle Positif: La valeur d’absorbance du contrôle positif doit être ≥ 0.8 à 450 nm.
2. Contrôle Négatif: La valeur d’absorbance du contrôle négatif effectué en double
doit être êntre 0.1< NC ≤0.4 à 450nm.
Calcul de la valeur seuil (COV) et de l‘index (COI)
La valeur seuil (COV) est calculée selon la formule suivante: COV = NC x 2
NC = Moyenne des absorbances du contrôle négatif passé en double exemplaire à
450nm.
Pour normaliser les résultats obtenus, nous vous conseillons de rendre les résultats en
index (COI) en calculant tout simplement un ratio:
COI = Absorbance de l’ échantillon à 450nm
COV
Interprétation des Résultats
Table 1: Correlation entre l’absorbance à 450nm et la présence des anticorps IgG
C. trachomatis
Absorbance à 450nm
D.O
COI Résultat
Interprétation des Résultats
D.O < COV
< 1.0
Nègatif
COV ≤ D.O ≤ COV x 1.1
1-1.1
Limite
D.O > COV x 1.1
>1.1
Positif
Absence d’anticorps IgG anti-C.
trachomatis
Résultats limites - Il est nécessaire
d’efféctuer l’analyse d’un deuxième
échantillon après 14-21 jours (Si le
deuxième échantillon est à nouveau
limite, le resultat est considéré comme
négatif).
Presence d’anticorps IgG-anti C.
trachomatis.
- 34 -
F
Table 2: Interprétation des résultats en fonction de la combinaison des anticorps
IgG et IgA
Taux d'anticorps
spécifiques de C. trachomatis
Interprétation des résultats
IgG
IgA
Négatif
Négatif
Positif
Négatif ou limite
Limite
Limite
Il est nécessaire d'effectuer l'analyse d'un deuxième
échantillon après 14 -21 jours. Résultats limites
répétés doivent être considerés comme résultats
négatifs.
Positif
Positif
Peut indiquer une infection en cours, récente ou
chronique
Négatif
Positif
Effectuer l’analyse d’un deuxiéme échantillon aprés
14-21 jours.L'obtention de résultats similaires peut
indiquer une infection chronique ou aiguë.
Négatif (ou au-delà de la sensibilité de ce test)
Peut indiquer une infection passée ou en cours.
Limites du Test
1. Un test sérologique seul, ne peut être utilisé comme unique critère de diagnostic.
Toutes les données cliniques et biologiques, doivent être prises en considération.
2. Les échantillons prélevés trop tôt lors d’une primo-infection peuvent ne pas contenir
d’anticorps décelables.
Si l’on soupçonne une infection à Chlamydiae, effectuer un deuxième prélèvement
14 à 21 jours plus tard et procéder à une nouvelle analyse.
Performances Caractéristiques du SeroCT™-IgG
Table 3: Sensibilité du SeroCT™ -IgG par rapport à la culture.
L'étude a été menée par un laboratoire de référence sur des patients chez qui la culture
de C. trachomatis s'est avérée positive.
SeroCT™-IgG
Culture Positive
45
Positif
Negative
35
10
Sensibilité: 35/45 x 100 = 78%
- 35 -
Table 4: Sensibilité et spécificité du test SeroCT™ - IgG comparé au test
Microimmunofluorescence (MIF)
La population étudiée comprenait des patients avec des infections suspectées à C.
trachomatis. SeroCT™ - IgG a été comparé au test Microimmunofluorescence (MIF)
commércial.
SeroCT™ - IgG
MIF
Positif
Négatif
Positif
58
55
3
Négatif
50
5
45
Total
108
60
48
Sensibilité: 55/58 x 100 =95%
Spécificité:45/50 x 100 = 90%
Concordance: 100/108 x 100 = 93%
Table 5: Spécificité du SeroCT™ IgG Chlamydia trachomatis pour différents
groupes contrôles
Groupe testé
Nombre
de sérum
SeroCT™- IgG
négatif
Spécificité du
SeroCT™- IgG-(%)
Donneurs de sang
250
230
92
Patients connus négatifs
pour C. trachomatis et
positif pour C. pneumoniae par MIF
35
33
94
Enfants sans pathologie
30
29
97
Femmes enceintes sans pathologie
30
28
93
Table 6: Spécificité du test SeroCT™ - IgG comparé à deux tests MIF différents.
La spécificité du test SeroCT™ - IgG a été déterminée en comparaison au test MIF dans
deux études indépendantes, chacune d'entre elle utilisant un test MIF différent. Les
échantillons de sérum employés pour chaque étude ont donné un résultat négatif au test
de détection par la méthode MIF des anticorps spécifiques de C. trachomatis et de C.
pneumoniae (MIF Ct- / Cp-) ou un résultat négatif concernant C. trachomatis et positif
concernant C. pneumoniae ( MIF Ct- / Cp+).
- 36 -
F
MIF
Ct- / Cp-
MIF
Nég. au test
Ct- / Cp+ SeroCT™ IgG
Spécificité du
test SeroCT™ (%)
ETUDE 1
(Test MIF en interne)
0
64
58
91
ETUDE 2
SeroFIA (Savyon)
30
100
117
90
Précision
Intra- essai précision du SeroCT™ - IgG est montrée ci-dessous:
Echantillon
No. de détermination
en double
Valeur
moyennes
CV %
Positif
10
0.835
2.5
Négatif
10
0.149
8.8
Inter-essai précision du SeroCT™ - IgG est montrée ci-dessous:
Echantillon
No. de détermination
en double
Valeur
moyennes
CV %
Positif
10
0.902
2.9
Négatif
10
0.167
5.5
- 37 -
S
SeroCTMR - IgG
Uso:.
El kit SeroCTMR IgG es una nueva generación de Ensayo Inmunoenzimático (ELISA)
cualitativo, basado en péptidos sintéticos específicos de Chlamydia trachomatis, para la
detección de anticuerpos IgG contra C. trachomatis en suero humano.
SeroCTMR se utiliza como auxiliar en el diagnóstico de una infección específica por C.
trachomatis.
SeroCTMR IgG debe usarse e interpretarse en conjunto con el ensayo SeroCTMR IgA.
Para uso en diagnóstico In Vitro.
Introducción
Las Chlamydia son bacterias intracelulares obligadas gram negativas, que causan
enfermedades crónicas y agudas. El género de Chlamydia comprende cuatro especies:
C. trachomatis, C. pneumoniae, C. psittaci y C. pecorum (1-4).
C. trachomatis incluye 15 serotipos (5-8). Los serotipos A, B, Ba y C están asociados
con tracoma (9), la principal causa de cegueras tratables, siendo endémicos en el tercer
mundo. Los serotipos L1-L3 se asocian con el linfogranuloma venéreo. Serotipos del D
al K son la causa común de infecciones por transmisión sexual como: cervicitis,
endometritis\salpingitis (10) en mujeres y uretritis (11) tanto en hombres como en
mujeres. Endometritis\salpingitis puden causar oclusión de las trompas con un alto
riesgo de embarazo extrauterino e infertilidad.
Infecciones en los genitales pueden ser agudas y persistentes sin presentar en muchas
ocasiones ningún síntoma. Generalmente estas infecciones son tratables una vez que
se diagnostican. Sin embargo sin tratamiento, la infeccion puede progresar a
inflamaciones severas y crónicas causando infertilidad, embarazos extrauterinos,
inducción de abortos o nacimientos anticipados. Además, bebés de madres infectadas
pueden contagiarse al nacer, causando conjuntivitis o neumonía (12-14).
La serología de C. trachomatis es especialmente interesante en casos de infecciones
crónicas.
C. pneumoniae es un patógeno importante en infecciones respiratiorias humanas
siendo el causante de hasta un 10% de los casos de neumonia adquirida por la
comunidad. Se asocia con enfermedades respiratorias agudas. neumonía, asma,
bronquitis, faringitis, síndrome agudo de pecho en anemia de células falcifornes,
enfermedades coronarias y síndrome de Gullain-Barré (15-17).
C. psittaci infecta un diverso rango de hospederos desde moluscos, aves y hasta
mamíferos y también es la causa de severas neumonías. En animales, C. psittaci y C.
pecorum son capaces de inducir diversos síndromes como neumonía, enteritis,
poliserrositis, encefalitis y conjuntivitis.
Ensayos serológicos, establecidos en muchos paises, han demostrado proveer una
respuesta comprensiva en la detección de infecciones por C. Trachomatis. Cuando hay
sospecha de infección arraigada, muestras de suero reducen la necesidad de
procedimientos invasivos, requeridos para la detección directa de antígeno. En casos
de infecciones urogenitales, limitaciones en el muestreo tales como la efectividad en el
proceso de raspado, manipulación de la muestra y dificultades de transporte, deben ser
- 39 -
considerados. Sobre todo, debe recordarse que la mayoría de las infecciones
clamidiales son asintomáticas. Por lo tanto, una infección puede persistir por un largo
período y ascender al tracto urinario superior, causando infecciones profundas y
crónicas, e incrementar la posibilidad de resultados negativos falsos en detección
directa de antígeno. El ensayo serológico para C. trachomatis, mediante la detección de
varios anticuerpos específicos, es hoy en día un método efectivo muy aceptado
(10,11,18,19). Tecnologías nuevas y precisas se aplican a los inmunomarcadores IgM,
IgA e IgG para caracterizar la presencia y el estado de la infección.
Anticuerpos IgM específicos son un indicativo de infección aguda por Chlamydia. Sin
embargo, su ausencia no excluye la presencia de una infección en curso, especialmente
en casos recurrentes y crónicos. Se ha demostrado que el uso de IgA específica como
marcador de infección clamidial activa tiene un papel importante debido a su limitada
vida media, que persiste mientras exista la estimulación antigénica. Sin embargo, IgA es
más adecuada para el seguimiento después de terapia. IgG es un marcador en
respuestas inmunes positivas frente a Chlamydia en infecciones actuales, crónicas o
pasadas.
Reacciones serológicas cruzadas ocurren entre las tres especies diferentes de
Chlamydia. La mayoría de los diagnósticos serológicos para Chlamydia utilizan como
antígenos, cuerpos elementales purificados (microinmunofluorescencia (MIF) y ensayos
de ELISA), lipopolisacáridos (LPS), o proteína principal purificada de la membrana
exterior (MOMP). Epítopos específicos para todo el género estan presentes en todos los
antígenos mencionados; es por ello que se observa muy baja especificidad. Además, ya
que una larga proporción de la población ha estado expuesta a C. pneumoniae (sin
signos clínicos), la prevalencia de anticuerpos para Chlamydia es muy alta. Es por ésto,
que para la diferenciación de anticuerpos específicos frente a C. pneumoniae y C.
trachomatis, el uso de métodos serólogicos convencionales, (MIF, ELISA, EIA, etc.) es
insuficiente.
Savyon® Diagnostics ha desarrollado un ensayo inmunoenzimático (ELISA) en el cual
diferentes epítopos específicos de C. trachomatis , son usados como antígenos, para
detectar respustas inmunes en humanos. El ensayo excluye reacciones cruzadas de
otras especies y permite una detección precisa y específica de anticuerpos IgG e IgA
contra C. trachomatis.
Principio del ensayo
*
*
*
*
*
*
Las placas de SeroCTMR están recubiertas con péptidos específicos de C.
trachomatis.
El suero a probar es diluido e incubado en las placas de SeroCTMR por 1h a 37ºC.
En este paso los anticuerpos contra C. trachomatis se adhieren a los péptidos
inmobilizados de C. trachomatis.
Anticuerpos no especifícos se remuven con lavados.
Anticuerpo anti-IgG humano conjugado con peroxidasa (HRP) se agrega e incuba
1h a 37ºC. En este paso la peroxidasa conjugada se une al complejo antígenoanticuerpo previamente formado.
Conjugado no unido se remueve con lavados.
Una vez agregado el substrato-TMB, el substrato es hidrolizado por la peroxidasa
y rinde una solución azul por el cromógeno reducido.
- 40 -
S
*
*
Al agregar la solución final (stop solution), el color azul se torna en amarillo y debe
ser leído en lectora de placas para ELISA a una longitud de onda de 450nm.
La absorbancia es proporcional a la cantidad de anticuerpo específico unido a los
péptidos inmobilizados.
Procedimiento del Ensayo
Pocillos de microplaca recubiertos con antígenos específicos de C. trachomatis.
↓
Agregar 2x50µl de Control Negativo, 1x50µl de Control Positivo y muestras diluidas
↓
Cubrir la placa e incubar 1h a 37ºC con una humedad del 100%
↓
Lavar 3 veces con la solución de lavado (Wash Buffer)
↓
Agregar 50µl de peroxidasa conjugada (HRP Conjugate) diluida 1/300
↓
Cubrir la placa e incubar 1h a 37ºC con una humedad del 100%
↓
Lavar 3 veces con la solución de lavado (Wash Buffer)
↓
Agregar 100µl de substrato TMB (TMB-Substrate)
↓
Cubrir la placa e incubar 15min a temperatura ambiente
↓
Agregar 100µl de la solución final (Stop Solution)
↓
Leer la absorbancia a 450nm
↓
Calcular e interpretar los resultados
Contenido del Kit
Kit para 96 determinaciones
Referencia A181-01M
1. Microplaca recubierta con antígeno de C. trachomatis: 96 pocillos desarmables
(8x12) recubiertos con péptidos específicos de C. trachomatis, empacados en una
bolsa de aluminio que contiene una tarjeta desecativa.
1 Placa
2. Solución de lavado concentrada (20x): Solución de PBS y Tween.
1 Botella, 100 ml
3. Diluyente de Suero (azul): Solución lista para usar. Contiene menos de 0.05%
ProClin como preservante.
1 Botella, 30 ml
- 41 -
4. Diluyente de conjugado (verde): Solución lista para usar. Contiene menos de
0.05% ProClin como preservante.
1 Botella, 40 ml
5. Control negativo: Suero humano negativo a IgG de C. trachomatis, solución lista
para usar. Contiene menos de 0.05% ProClin y menos de 0.1% azida sódica como
preservantes.
1 Frasco, 1.25 ml
6. Control positivo: Suero humano positivo a IgG de C. trachomatis, solución lista
preservantes.
1 Frasco, 0.75 ml
7. Conjugado HRP concentrado (300X): Anticuerpo anti IgG humano (específico de
cadena gama) conjugado con peroxidasa de rábano (HRP). Contiene menos de
1 Frasco, 0.2 ml
8. Substrato-TMB: Solución lista para usar. Contiene 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina
como cromógeno y peróxido como substrato.
1 Botella, 14 ml
9. Solución final (Stop Solution): Solución lista para usar. Contiene H2SO4 1M.
1 Botella, 15 ml
10. Cubierta de placa:
1 Unidad
11. Instructivo:
1
Kit para 192 determinaciones
Referencia B181-01M
1. Microplaca recubierta con antígeno de C. trachomatis: 96 pocillos desarmables
(8x12) recubiertos con péptidos específicos de C. trachomatis, empacado en una
bolsa de aluminio que contiene una tarjeta desecativa.
2 Placas
2. Solución de lavado concentrada (20x): Solución de PBS-Tween.
2 Botellas, 100 ml cada una
3. Diluyente de Suero (azul): Solución lista para usar. Contiene menos de 0.05%
ProClin como preservante.
1 Botella, 60 ml
4. Diluyente de Conjugado (verde): Solución lista para usar. Contiene menos de
1 Botella, 80 ml
5. Control negativo: Suero humano negativo a IgG de C. trachomatis, solución lista
preservantes.
1 Frasco, 2.4 ml
6. Control positivo: Suero humano positivo a IgG de C. trachomatis, solución lista
preservantes.
1 Frasco, 1.25 ml
- 42 -
S
7. Conjugado-HRP concentrado (300X): Anticuerpo anti IgG humano (específico de
cadena gama) conjugado con peroxidasa de rábano (HRP). Contiene menos de
0.05% ProClin 300 como preservante.
1 Frasco, 0.2 ml
8. Substrato-TMB: Solución lista para usar. Contiene 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina
como cromógeno y peroxidasa como substrato.
1 Botella, 24 ml
9. Solución final (Stop Solution): Solución lista para usar. Contiene H2SO4 1M.
1 Botella, 30 ml
10. Cubierta de placa:
2 Unidades
11. Instructivo:
1
Materiales Requeridos que no se Proporcionan
1. Tubos de ensayo limpios para la dilución de los sueros de los pacientes.
2. Frascos de plástico desechables para la dilución del conjugado-HRP concentrado.
3. Micropipetas ajustables o pipetas multicanal (rangos de 5-50, 50-200 y 2001000µl) y puntas desechables.
4. Vaso de precipitados (1 litro).
5. Probeta (50ml).
6. Lavador de microplacas, o piseta (frasco lavador) de plástico.
7. Papel absorbente.
8. Vortex
9. Baño a 37ºC con tapa, o cámara de incubación húmeda a 37ºC.
10. Lectora de placas para ELISA con filtro para 450nm.
11. Agua destilada o doblemente desionizada.
Advertencias y Precauciones
Para Diagnóstico In Vitro.
1. Este kit contiene suero humano que ha sido analizado por técnicas aprobadas por
la FDA y CE, y se ha encontrado que es negativo para AgsHB, y para anticuerpos
frente a VHC y VIH 1 y 2. Sin embargo, ya que no se conoce ningún método capaz
de ofrecer una garantía absoluta de que productos derivados de sangre humana no
transmiten infección, todos los componentes de sangre humana que se
proporcionan en el kit deben manipularse como muestras de suero o sangre
potencialmente infecciosas, de acuerdo con las recomendaciones publicadas en el
manual CDC/NIH de "Biosafety in Micro Biological and Biomedical Laboratories"
(Bioseguridad en laboratorios Microbiológicos y Biomédicos), 1988.
2. El substrato-TMB es un material irritante a la piel y membranas mucosas. Evite el
contacto directo.
3. Acido sulfúrico diluido (H2SO4 1M) es un agente irritante de la piel y los ojos. En
caso de contacto con los ojos, lavar inmediatamente con agua corriente y consultar
un médico. No agregar agua a este producto. En caso de accidente o molestia
consulte a un médico (y si es posible presentarle la etiqueta).
- 43 -
4. Todos los componentes del kit han sido calibrados y probados por lote. No se
recomienda utilizar componentes de distintos lotes puesto que se pueden afectar
los resultados.
Almacenamiento y Vida Media de los Reactivos
1. Todos los materiales que se proporcionan deben almacenarse de 2-8ºC. Los
reactivos en los frascos cerrados son estables hasta la fecha de caducidad indicada
en ellos. La exposición a temperatura ambiente durante unas pocas horas, de los
componentes del kit aún cerrados de origen, no produce ningún daño. NO
CONGELAR LOS REACTIVOS.
2. El kit caduca a los 90 días de haber sido abierto.
3. Las tiras de la placa no utilizadas, deben guardarse selladas en su bolsa de
aluminio con la tarjeta desecativa, enrollando la bolsa a todo lo largo de la apertura
y sellando con cinta adhesiva a todo lo largo.
4. Es possible que haya formación de cristales en la solución de lavado concentrada
(20X) durante su almacenamiento en frío; ésto es perfectamente normal.
Redisuelva los cristales calentando la solución a 37ºC antes de diluir. Una vez
diluida, la solución puede almacenarse de 2-8ºC hasta por 21 días.
Extracción del Suero
El suero deberá prepararse de muestras colectadas asépticamente utilizando las
técnicas estándar. Muestras inactivadas con calor no deben utilizarse. El uso de suero
lipémico, túrbido o contaminado no es recomendado. Partículas o precipitados en el
suero pueden causar resultados erróneos. Estas muestras deberán clarearse
centrifugando o filtrando antes de someterlas al ensayo.
Almacenamiento de las muestras
Las muestran deben almacenarse de 2-8ºC hasta por 7 días (se recomienda agregar
0.1% de azida sódica). Si se prevé almacenamiento por largos periodos, las muestras
deberán almacenarse a –20ºC en alícuotas. Evite descongelar y congelar
repetidamente.
Procedimiento del Ensayo
A. Preparación de los reactivos
1. Permita que todos los reactivos y especímenes clínicos alcancen la temperatura
ambiente. Mezcle bien las muestras y los controles positivo y negativo antes de
usarlos.
2. Determine el número de muestras a probar. Además de las muestras, debe
agregarse en cada prueba dos pocillos con Control Negativo y un pocillo con
Control Positivo.
- 44 -
S
3. Saque la microplaca de su bolsa de aluminio cortándola cerca del cierre de la orilla
sellada. Deje el número de tiras requerido (de acuerdo con el número de muestras
a probar) en el marco de la microplaca.
4. Diluya la solución de lavado concentrada 1/20 con agua destilada o doblemente
desionizada. Por ejemplo, para preparar un litro de solución de lavado, agregue
50ml de la solución de lavado concentrada a 950ml de agua destilada o
doblemente desionizada.
B. Incubación de las muestras y controles
5. Diluya el suero de cada paciente 1/21 con Diluyente de Suero, de la siguiente
manera: Agregue 10µl del suero del paciente a 200µl del Diluyente de Suero.
6. Agregue en pocillos separados, 50µl del Control Positivo, del Control Negativo y
del suero diluido 1/21. El Control Negativo debe ser agregado a dos pocillos
separados.
7. Cubra las tiras con la cubierta de placa e incube 1h a 37ºC en una cámara húmeda.
8. Descarte el líquido contenido en los pocillos.
9. Lavado: Llene completamente cada pocillo con solución de lavado (300-350µl) y
descarte el líquido; repita este paso dos veces más, para un total de tres lavados.
10. Seque el marco y las tiras golpeando suavemente sobre papel absorbente.
C. Incubación con el Conjugado
11. El Conjugado-HRP concentrado debe diluirse inmediatamente antes de usarse.
Diluya el Conjugado-HRP concentrado 1/300 con Diluyente de Conjugado. Por
ejemplo, para dos tiras prepare un mínimo de 3ml de conjugado-HRP diluido (10µl
de Conjugado-HRP concentrado mezclado con 3ml de Diluyente de Conjugado).
12. Administre 50µl del conjugado diluido en cada pocillo.
13. Cubra las tiras con la cubierta de placa e incube 1h a 37ºC en una cámara húmeda.
14. Descarte el líquido contenido en los pocillos y lave como se describe en los pasos
9 y 10.
D. Incubación con el Substrato-TMB
15. Administre 100µl del Substrato-TMB en cada pocillo, cubra las tiras con la cubierta
de placa e incube a temperatura ambiente por 15 minutos.
16. Pare la reacción agregando a cada pocillo 100µl de solución final (H2SO4 1M).
E. Determinación de los Resultados
17. Determine la absorbancia a 450nm y guarde los resultados. La lectura no debe
ejecutarse después de 30 minutos de haber parado la reacción cromogénica.
Nota: Toda burbuja de aire debe ser removida antes de la lectura. La base de la placa
de ELISA debe limpiarse con cuidado.
- 45 -
Validacion Del Ensayo
Para que el ensayo sea válido debe cumplir con los siguientes criterios. En caso de no
cumplirse estos criterios, el ensayo debe considerarse inválido y deberá repetirse.
1. Control Positivo: La absorbancia deberá ser ≥ 0.8 a 450nm.
2. Control Negativo: El promedio de la absorbancia del Control Negativo (CN)
efectuado en duplicado deberá ser 0.1<CN≤ 0.4 a 450nm.
Cálculo del valor del punto de corte (VPC) y del índice
del punto de corte (IPC)
El valor del punto de corte se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula:
VPC=CN x 2
CN= Absorbancia promedio del Control Negativo a 450nm ensayado en duplicado.
Para normalizar el resultado obtenido en diferentes ensayos, el índice del punto de corte
es calculado de acuerdo con la siguiente formula:
IPC = Absorbancia a 450nm del suero probado
VPC
Interpretación de Resultados
Tabla 1: Correlación entre la absorbancia a 450nm y la presencia de anticuerpos
IgG frente a C. Trachomatis
O.D a 450nm
IPC
Resultado
Interpretación de los resultados
O.D < VPC
<1.0
Negativo
No hay anticuerpos IgG detectables
contra C. trachomatis
Límite
No puede determinarse la presencia
o ausencia de de anticuerpos IgG
detectables frente a C. trachomatis.
Una segunda muestra de suero
deberá ser obtenida después de 2-3
semanas Si se obtiene nuevamente
un nivel límite, la muestra deberá
considerarse negativa.
Positivo
Niveles detectables de anticuerpos
IgG frente a C. trachomatis
VPC≤O.D≤1.1xVPC 1-1.1
O.D >1.1xVPC
>1.1
- 46 -
S
Tabla 2: Interpretación de resultados basados en la determinación de anticuerpos
IgG e IgA
Níveles de anticuerpos
específicos frente a
C. trachomatis
IgG
IgA
Interpretación de los resultados
Negativo
Negativo
Negativo (o debajo de la sensibilidad del ensayo)
Positivo
Negativo
o
Límite
Puede indicar infección pasada o actual.
Límite
Límite
Se requiere probar una segunda muestra
después de 2-3 semanas. Resultado límite por
segunda vez deberá considerarse negativo.
Positivo
Positivo
Puede indicar una infección aguda o crónica.
Negativo
Positivo
Puede indicar una infección aguda o crónica.
Limitaciones del Ensayo
1. No debe utilizarse únicamente un ensayo serológico para realizar un diagnóstico
final. Deben tenerse en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.
2. Las muestras extraídas al inicio de una infección primaria, pueden contener
cantidades no detectables de anticuerpos. Si se sospecha de una infección por
Chlamydia, deberá obtenerse una segunda muestra transcurridas 2-3 semanas, y
ensayarse en paralelo con la muestra original.
Caracteristicas del Ensayo
Tabla 3: Sensibilidad de SeroCTMR IgG comparada con cultivo
El estudio fue efectuado en un laboratorio de referencia con pacientes con cultivo
positivo de C. trachomatis
SeroCTMR IgG
Cultivo Positivo
Positivos
Negativos
35
10
45
Sensibilidad: 35/45 x 100 = 78%
- 47 -
Table 4: Sensibilidad y Especificidad de SeroCTMR IgG comparado con
microinmunofluorescencia (MIF)
El estudio fue realizado con pacientes con sospecha de infección por C. trachomatis.
SeroCTMR IgA fue comparado con un ensayo de MIF commercial.
SeroCTMR IgG
Positivo
Negativo
55
3
5
45
60
48
MIF
Positive
Negative
Total
58
50
108
Sensibilidad: 55/58 x 100 = 95%
Especificidad: 45/50 x 100 = 90%
Concordancia entre ambos métodos: 100/108 x 100 = 93%
Tabla 5: Especificidad de SeroCTMR IgG en diferentes grupos de control
Groupo Analizado
No. de Suero
Negativo en
SeroCTMR IgG
Especificidad de
SeroCTMR IgG (%)
Donadores de sangre
250
230
92
Individuos negativos
para C.trachomatis y
positivos para
C.pneumoniae (MIF)
35
33
94
Niños sanos
30
29
97
Mujeres embarazadas
sanas
30
28
93
- 48 -
S
Tabla 6: Especificidad de SeroCTMR IgG en comparación con dos diferentes
ensayos MIF
La especificidad de SeroCTMR IgG fue determinada en comparación con dos estudios
independientes que utilizaron diferentes ensayos de MIF. Las muestras utilizadas en
cada estudio fueron determinadas negativas para anticuerpos frente a C. trachomatis y
C. pneumoniae (MIF Ct-/Cp-) o negativas para C. trachomatis y positivas para C.
pneumoniae (MIF Ct-/Cp+)
MIF
Ct-/Cp-
MIF
Ct+/CP+
SeroCTMR IgG
Negativos
Especificidad
of SeroCTMR IgG
Estudio #1
(MIF casero)
0
64
58
91
Estudio #2
(SeroFIAMR Savyon)
30
100
117
90
Conclusión: SeroCTMR IgG demuestra una especificidad mayor de 90% para
C.trachomatis.
Precisión
La precisión intra-ensayo de SeroCTMR IgG se muestra en la siguiente tabla:
Muestra
No. de réplicas
Valor Medio
CV%
Positiva
10
0.835
2.5
Negativa
10
0.149
8.8
La precisión inter-ensayo de SeroCT IgG se muestra en la siguiente tabla:
MR
Muestra
No. de Réplicas
Valor Medio
CV%
Positive
10
0.902
2.9
Negative
10
0.167
5.5
- 49 -
I
SeroCTTM - IgG
Applicazioni
Il kit SeroCT™ è progettato per la determinazione di anticorpi IgG specifici per
C.trachomatis nel siero umano. Il kit Savyon® SeroCT™ – IgG appartiene a una nuova
generazione di test ELISA qualitativi basata su peptidi sintetici specifici di C.trachomatis.
SeroCT™ è da usarsi come aiuto nella diagnosi di infezione da C.trachomatis.
SeroCT™– IgG è progettato per essere eseguito e interpretato in congiunzione con il kit
Savyon® SeroCT™ – IgA.
Per uso Diagnostico in Vitro
Introduzione
Chlamydia è un batterio gram negativo intracellulare obbligato che causa malattie acute
e croniche nei mammiferi negli uccelli. Il genere Chlamydia comprende quattro specie
C.trachomatis, C.pneumoniae, C.psittaci e C.pecorum (1- 4). C.trachomatis si divide in
15 serotipi (5-8). I serotipi A, B, Ba e C sono agenti del tracoma (9), la maggiore causa
di cecità prevenibile, endemica nei paesi del terzo mondo. I serotipi L1-L3 sono agenti
di linfogranuloma venereo. I serotipi D-K sono causa comune in tutto il mondo di
infezioni genitali sessualmente trasmesse: cervicite, endometrite/salpingite (10) nelle
donne e uretrite (11) in uomini e donne. L’endometrite/salpingite può portare a
occlusione tubarica con aumentato rischio di gravidanza extrauterina e infertilità.
L’infezione genitale può causare un’infezione acuta e persistente occasionalmente
senza alcun segnale clinico. Generalmente, queste infezioni sono trattabili una volta
diagnosticate. Senza trattamento l’infezione può progredire fino a infiammazione cronica
grave che porta a infertilità, gravidanza ectopica, aborto indotto o parto prematuro.
Inoltre, i neonati di madri infette possono essersi infettati durante il parto con rischio di
sviluppare congiuntivite o polmonite (12-14). La serologia di C.trachomatis è più
interessante nei casi di infezioni croniche che nelle infezioni acute.
C.pneumoniae è un patogeno importante delle vie respiratorie nell’uomo e causa fino al
10% dei casi di polmonite acquisita in comunità. È stata associata a malattie respiratorie
acute: polmonite, asma, bronchite, faringite, ma anche a sindrome toracica acuta
dell’anemia falciforme, malattia coronaria e Sindrome di Gullain-Barré (15-17).
C.psittaci infetta una diversa gamma di specie ospiti dai molluschi agli uccelli ai
mammiferi e causa anche polmoniti gravi. Negli animali, C.psittaci e C.pecorum possono
indurre sindromi diverse, come polmonite, enterite, poliserosite, encefalite e
congiuntivite. I test serologici, ora un approccio consolidato in molti paesi, si sono
dimostrati capaci di fornire una risposta globale per la determinazione di infezione da
C.trachomatis. Nel sospetto di infezioni profonde, il siero come cam-pione riduce la
necessità di procedure invasive che sono richieste per il rilevamento diretto
dell’antigene. In caso di infezioni del tratto urogenitale inferiore, vanno valutate le
limitazioni al prelievo come la procedura di raschiatura del campione, e le difficoltà di
manipolazione e di trasporto del campione stesso. Soprattutto, rimane il fatto che la
maggioranza delle infezioni da clamidia sono asintomatiche. Quindi, un’infezione può
- 51 -
persistere per lungo tempo, può risalire il tratto genitale superiore causando infezioni
profonde e croniche e aumentare la probabilità di risultati falsamente negativi nei test di
rilevazione diretta dell’antigene. I test serologici per C.trachomatis, con la ricerca di vari
anticorpi specifici, sono oggi una metodologia efficace e largamente accettata (10, 11,
18, 19). Nuove e accurate tecnologie impieganoi marker immunologici IgM, IgA e IgG
per caratterizzare la presenza e lo stadio dell’infezione. Le IgM specifiche sono indice di
infezione acuta da clamidia. L’assenza tuttavia non esclude un’infezione in atto
specialmente nei casi ricorrenti e cronici. L’uso delle IgA specifiche come marker per le
infezioni attive da clamidia si è rivelato svolgere un ruolo importante per la breve emivita
delle IgA stesse, che persistono finchè esiste una stimolazione antigenica. Le IgA sono,
comunque, più adatte per il controllo post terapia. Le IgG sono un marker di risposta
immune positiva sia nelle infezioni correnti sia in quelle croniche o pregresse.
Crossreazioni serologiche avvengono fra le tre specie di clamidia. La maggior parte dei
test diagnostici serologici per clamidia usa ELISA o MicroImmunoFluorescenza (MIF)
con corpi elementari purificati, lipopolisaccaridi (LPS), o proteine di membrana purificate
(major outer membrane protein, MOMP) quali antigeni. Epitopi genere specifici sono
presenti in tutti gli antigeni sopra menzionati, quindi, si osserva una bassa specie
specificità. Inoltre una larga parte della popolazione è stata esposta a C.pneumoniae
(senza evidenza clinica), quindi la prevalenza di anticorpi anti-clamidia è molto alta.
Quindi la differenziazione tra anticorpi specifici per C.pneumoniae e per C.trachomatis
usando test serologici tradizionali di screening (MIF, ELISA, EIA ecc.) risulta insufficente.
Savyon® Diagnostics Ltd ha sviluppato un test in cui epitopi specie specifici per
C.trachomatis , derivati da diversi serotipi sono impiegati in un saggio
immunoenzimatico (ELISA). Questo test esclude epitopi con reattività specie-crociata e
permettono una determinazione di anticorpi IgA anti-C.trachomatis più specifica e
accurata.
Principio del Test
*
*
*
*
*
*
*
Le piastre di SeroCT™ sono rivestite con peptidi C.trachomatis specifici.
Il siero da analizzare viene diluito e incubato con le piastre rivestite 1h a 37°C. In
questo passaggio gli anticorpi specifici per C.trachomatis si legano ai peptidi di
C.trachomatis immobilizzati.
Gli anticorpi non specifici vengono rimossi con un lavaggio. Si aggiungono Anti-IgG
umane coniugate con perossidasi di rafano (HRP) e si incuba 1 h a 37°C. In questo
passaggio il coniugato HRP si lega al complesso antigene-anticorpo preformatosi.
Il coniugato non legato viene rimosso con dei lavaggi.
Si aggiunge il substrato TMB che viene idrolizzato dalla perossidasi producendo
una soluzione blu di substrato ridotto.
Dopo aggiunta di soluzione d’arresto,il colore blu vira al giallo e deve essere letto in
un lettore per ELISA a 450nm.
L’assorbanza è proporzionale alla quantità di anticorpi specifici legati ai peptidi
immobilizzati.
- 52 -
I
Procedura del Test
Pozzetti di micropiastra rivestiti conantigeni specifici di C.trachomatis.
↓
Aggiungere 2 x 50µl di Controllo Negativo. Aggiungere 1 x 50µl di Controllo Positivo e
campioni diluiti.
↓
Coprire la piastra e incubare 1h a 37°C al 100% di umidità.
↓
Lavare 3 volte con Tampone di Lavaggio.
↓
Aggiungere 50µl di coniugato-HRP di-luito 1/300.
↓
Coprire la piastra e incubare 1h a 37°C al 100% di umidità.
↓
Lavare 3 volte con Tampone di Lavaggio.
↓
Aggiungere 100µl di Substrato TMB.
↓
Coprire la piastra e incubare 15min a temperatura ambiente.
↓
Aggiungere 100µl di Soluzione d’Arresto.
↓
Leggere l’assorbanza a 450nm.
↓
Calcolare e interpretare I risultati.
Contenuto del kit
Kit per 96 determinazioni
Catalogo No.: A181-01M
1. Micropiastra rivestita con antigene C.trachomatis: 96 pozzetti separabili (8x12)
rivestiti con peptidi specifici di C.trachomatis, confezionata in busta di alluminio
contenente un dessiccante.
1 piastra
2. Tampone di Lavaggio Concentrato (20x): Un tampone PBS –Tween.
1 flacone, 100ml
3. Diluente del Siero (Blu): Una soluzione pronta per l’uso. Contiene meno dello
0,05% di Proclin quale conservante.
1 flacone, 30ml
4. Diluente del Coniugato (Verde): Una soluzione tampone pronta per l’uso.
Contiene meno dello 0,05% di Proclin quale conservante.
1 flacone, 40ml
5. Controllo Negativo: Siero umano negativo per C.trachomatis IgG pronto per l’uso.
Contiene meno dello 0,05% di Proclin e meno dello 0,1% di sodio azide quale
conservante.
1 flacone, 1,25ml
- 53 -
6. Controllo Positivo: Siero umano pronto per l’uso, positivo per IgG per
C.trachomatis. Contiene meno dello 0,05% di Proclin e meno dello 0,1% di sodio
azide quale conservante.
1 flacone, 0,75ml
7. Coniugato-HRP Concentrato (300x): Anti IgG umane coniugate con perossidasi
di rafano (HRP). Contiene meno dello 0,05% di Proclin quale conservante.
1 flacone, 0,2ml
8. Substrato-TMB: Una soluzione pronta per l’uso 3,3’,5,5'tetrametilbenzidina come
cromogeno e perossido di idrogeno come substrato.
1 flacone, 14ml
9. Soluzione d’Arresto: Una soluzione pronta per l’uso. Contiene H2SO4 1M.
1 flacone, 15ml
10. Copripiastra
1 unità
11. Istruzioni per l’Uso
1 unità
Kit per 192 determinazioni
Catalogo No.: B181-01M
1. Micropiastra rivestita con antigene di C.trachomatis: 96 pozzetti separabili
(8x12) rivestiti con peptidi specifici di C.trachomatis, confezionata in busta di
alluminio contenente un dessiccante.
2 piastre
2. Tampone di Lavaggio Concentrato (20x): Un tampone PBS –Tween.
2 flaconi, 100ml ciascuno
3. Diluente del Siero (Blu): Una soluzione pronta per l’uso. Contiene meno dello
0,05% di Proclin quale conservante.
1 flacone, 60ml
4. Diluente del Coniugato (Verde): Una soluzione tampone pronta per l’uso.
Contiene meno dello 0,05% di Proclin quale conservante.
1 flacone, 80ml
5. Controllo Negativo: Siero umano negativo per C.trachomatis IgG pronto per l’uso.
Contiene meno dello 0,05% di Proclin e meno dello 0,1% di sodio azide quale
conservante.
1 flacone, 2,4ml
6. Controllo Positivo: Siero umano pronto per l’uso, positivo per IgG per
C.trachomatis. Contiene meno dello 0,05% di Proclin e meno dello 0,1% di sodio
azide quale conservante.
1 flacone, 1,25ml
7. Coniugato-HRP Concentrato (300x): Anti IgG umane coniugate con perossidasi
di rafano (HRP). Contiene meno dello 0,05% di Proclin quale conservante.
1 flacone, 0,2ml
8. Substrato-TMB: Una soluzione pronta per l’uso 3,3’,5,5'tetrametilbenzidina come
cromogeno e perossido di idrogeno come substrato.
1 flacone, 24ml
9. Soluzione d’Arresto: Una soluzione pronta per l’uso. Contiene H2SO4 1M.
1 flacone, 30ml
10. Copripiastra
2 unità
11. Istruzioni per l’Uso
1 unità
- 54 -
I
Materiali richiesti ma non forniti
1. Provette pulite per la diluizione dei sieri dei pazienti.
2. Provette di plastica monouso per la diluizione del coniugato-HRP anti IgG umane.
3. Micropipette regolabili, o pipette multicanale (5-50, 50-200 e 200-1000µl) e puntali
monouso.
4. Contenitore graduato da un litro.
5. Un cilindro graduato da 50ml.
6. Spruzzetta.
7. Carta assorbente.
8. Vortex mixer.
9. Bagnomaria a 37°C con coperchio, o una camera umida in un termostato a 37°C.
10. Lettore ELISA con filtro a 450nm.
11. Acqua distillata o bi-deionizzata.
Avvertenze e Precauzioni
Per Uso Diagnostico in Vitro
1. Questo kit contiene siero umano che è stato testato con metodiche approvate
dall’FDA e CE, ed è risultato negativo per HBsAg, e per anticorpi anti-HCV e antiHIV 1 & 2. Poiché nessun metodo conociuto può dare assicurazione totale che i
prodotti derivati da sangue umano non trasmettano infezioni, tutte le componenti
derivate da sangue umano fornite in questo kit devono essere maneggiate come
siero o sangue potenzialmente infettante, secondo le raccoman-dazioni pubblicate
nel manuale del CDC/NIH "Biosafety in Micro Biological and Biomedical
Laboratories", 1988.
2. Alcuni reagenti contengono sodio azide la cui quantità risulta all'interno dei limiti di
concentrazione consentiti. Tuttavia, a causa dell'alta tossicità di questa sostanza,
manipolare con estrema cautela, evitando ogni contatto di-retto.
3. La soluzione Substrato-TMB è irritante per la pelle e per le membrane mucose.
Evitare il contatto diretto.
4. La soluzione di acido solforico (H2SO4 1M) è irritante per gli occhi e per la pelle. In
caso di contatto con gli occhi, sciacquare immediatamente e abbondantemente con
acqua e consultare un medico.
5. Tutte le componenti di questo kit sono state calibrate e testate per lotto. Non è
raccomandabile mescolare componenti da lotti diversi in quanto potrebbe
influenzare i risultati.
- 55 -
Conservazione e durata dei reagenti
1. Tutti i reagenti forniti devono essere conservati a 2-8°C. I flaconi non aperti sono
stabili fino alla scadenza indicata in etichetta. L’esposizione di componenti ancora
sigillate a temperatura ambiente per alcune ore non causa danno ai reagenti
contenuti. NON CONGELARE!
2. Una volta aperto il kit ha una scadenza di 90 giorni.
3. Le strisce di pozzetti non utilizzate vanno risigillate nella busta di alluminio con il
dessiccante, arrotolando l’estremità aperta e sigillando l’intera larghezza
dell’apertura con nastro adesivo.
4. Cristalli possono formarsi nel Tampone di Lavaggio concentrato (20X) durante la
conservazione refrigerata, ciò è perfettamente normale. Ridisciogliere i cristalli
riscaldando il tampone a 37°C prima di diluire. La soluzione può essere conservata
a 2-8°C fino a 21 giorni.
Raccolta dei campioni di siero
Preparare i sieri da campioni raccolti asetticamente usando metodiche standard. Non
usare siero inattivato al calore. L’uso di siero lipemico, torbido o contaminato non è
raccomandabile. Materiali particolati e precipitati nel siero possono causare risultati
erronei. Tali campioni dovrebbero essere chiarificati per centrifugazione o filtrazione
prima del test.
Conservazione
I campioni devono essere conservati a 2-8°C e saggiati entro 7 giorni (si raccomanda di
aggiungere sodio azide 0,1%). Se si prevede una conservazione più lunga, aliquotare e
conservare i campioni sotto -20°C. Evitare di congelare e scongelare ripetutamente.
Procedimento del test
A. Preparazione dei Reagenti
1. Portare tutte le componenti e i campioni a temperatura ambiente. Mescolare bene
il Controllo Positivo, il Controllo Negativo e i campioni prima dell’uso.
2. Determinare il numero totale di campioni da analizzare. In aggiunta ai campioni,
includere ogni volta due pozzetti per il Controllo Negativo e uno per il Controllo
Positivo.
3. Estrarre la micropiastra dalla sua busta di allumino tagliando un’estremità vicino al
sigillo. Lasciare le strisce necessarie (secondo il numero di campioni da ana-lizzare)
nel portastrisce da 96 pozzetti.
4. Diluire il Tampone di Lavaggio Concentrato 1/20 con acqua bi-deionizzata o
distillata. Ad esempio, per preparare un litro di Soluzione di Lavaggio, aggiungere
50 ml del Tampone di Lavaggio Concentrato a 950 ml di acqua distillata o bideionizzata.
- 56 -
I
B. Incubazione dei sieri campione e dei controlli
5. Diluire ogni campione 1/21 con il Diluente del Siero fornito aggiungendo 10µl di
siero del paziente a 200µl di Diluente del Siero.
6. Dispensare 50µl di Controllo Positivo, Controllo Negativo e sieri diluiti 1/21 in
pozzetti separati. I controlli negativi vanno dispensati in doppio.
7. Coprire le strisce con un copripiastre e incubare 1h a 37°C in una camera umida.
8. Eliminare il liquido contenuto nei pozzetti.
9. Lavaggio: Riempire ciascun pozzetto con tampone di lavaggio (300-350µl) ed
eliminare il liquido, Ripetere questo passaggio due volte per un totale di tre lavaggi.
10. Asciugare strisce e portastrisce sbattendole con attenzione su carta assorbente
pulita.
C. Incubazione con il coniugato
11. Il Coniugato-HRP Concentrato deve essere diluito a soluzione di lavoro subito prima
dell’uso. Diluire 1/300 il coniugato-HRP concentrato anti-IgG con diluente del
coniugato.
Per esempio, per due strisce preparare un minimo di 3ml di coniugato-HRP diluito
(10µl di Coniugato-HRP Concentrato mescolato con 3ml di Diluente del Coniugato).
12. Dispensare 50µl di coniugato diluito in ciascun pozzetto.
13. Coprire le strisce con un copripiastre e incubare 1h a 37°C in una camera umida.
14. Eliminare il liquido e lavare come descritto ai punti 9-10.
D. Incubazione con il Substrato-TMB
15. Dispensare 100µl di Substrato-TMB in ogni pozzetto coprire le strisce e incubarea
temperatura ambiente per 15 minuti.
16. Fermare la reazione aggiungendo 100µl di Soluzione d’Arresto (H2SO4 1M) in ogni
pozzetto.
E. Determinazione dei Risultati
17. Determinare l’assorbanza a 450nm e registrare i risultati. La lettura non dovrebbe
protrarsi oltre i 30 minuti dall’arresto della reazione cromogena.
Nota: Qualsiasi bolla d’aria deve essere rimossa prima della lettura. Il fondo della
piastra ELISA deve essere pulito con cura.
Validazione del Test
Perchè il test sia valido devono essere rispettati i seguenti criteri. Se i seguenti criteri
non sono rispettati il test va considerato non valido e dovrebbe essere ripetuto.
1. Controllo Positivo
Il valore dell’assorbanza dovrebbe essere ≥0,8 a 450nm.
2. Controllo Negativo
La media delle assorbanze dei controlli negativi dovrebbe essere 0,1<NC≤0,4 a
450nm.
- 57 -
Calcolo del Cut-Off (COV) e del Cut-Off Index (COI)
Il valore di cut-off è calcolato in base alla formula seguente: COV = NC x 2
NC = La media delle assorbanze del Controllo Negativo a 450nm usato in duplicato. Per
normalizzare I risultati ottenuti in sedute analitiche diverse, si calcola il cut-off index
secondo la seguente formula:
COI = Assorbanza del campione a 450nm
COV.
Interpretazione dei Risultati
Tabella 1: Correlazione tra l’assorbanza a 450 nm e la presenza di anticorpi IgG
anti-C.trachomatis
Assorbanza a 450nm
COI
Risultato
Interpretazione del Risultato
O.D < COV
<1.0
Negativo
Anticorpi specifici non rilevabili
COV≤ O.D≤ 1.1xCOV
1-1.1
Borderline
Basso livello di anticorpi specifici
Si richede l’analisi di un secondo
campione dopo 14-21 giorni.
Se anche il secondo campione risulta
borderline il risultato è da considerarsi
negativo
O.D>1.1 x COV
>1.1
Positivo
Livelli significativi di IgG specifiche
Tabella 2: Interpretazione dei risultati basata sulla determinazione di IgG e IgA
Livelli degli anticorpi
anti-C.trachomatis
IgG
Negativo
Positivo
Borderline
Positivo o
Negativo
IgA
Negativo
Negativo
o Borderline
Borderline
Positivo
Interpretazione dei Risultati
Negativo o sotto la sensibilità del test.
Può indicare i infezione corrente o pregressa
Si richede l’analisi di un secondo campione
dopo 14-21 giorni. Se anche il secondo
campione risulta borderline il risultato è da
considerarsi negativo
Indicazione di infezione acuta o cronica
- 58 -
I
Limitazioni
1. Non usare un singolo test serologico per formulare diagnosi. Tutti i dati clinici e di
laboratorio dovrebbero essere considerati.
2. I campioni ottenuti troppo precocemente durante un’infezione primaria possono non
contenere anticorpi rilevabili. Se si sospetta infezione da clamidia, si dovrebbe fare
un secondo prelievo 14-21 giorni più tardi per analizzarlo in parallelo al campione
originale.
Caratteristiche di SeroCT™-IgG
Tabella 3: Sensibilità di SeroCT™-IgG in confronto alla coltura.
Lo studio è stato eseguito in un laboratorio di riferimento su pazienti con coltura positiva
per C.trachomatis.
Coltura
SeroCT™-IgG
Positiva
Positivo
Negativo
45
35
10
Sensibilità: 35/45x100 = 78%
Tabella 4: Sensibilità e Specificità di SeroCT™-IgG in confronto alla
microimmunofluorescenza (MIF)
SeroCT™-IgG
MIF
Positivo
Negativo
Positivo
58
55
3
Negativo
50
5
45
Totale
108
60
48
Sensibilità: 55/58x100 = 95%
Specificità: 45/50x100 = 90%
Concordanza: 100/108x100 = 93%
- 59 -
Tabella 5: Specificità di SeroCT™-IgG su diversi gruppi di controllo
Gruppo analizzato
No. di Sieri
Negativi su
SeroCT™-IgG
Specificità di
SeroCT™-IgG
Donatori di sangue
250
230
92
Soggetti negativi
a C.trachomatis e
positivi per
C.pneumoniae (MIF)
35
33
94
Bambini sani
30
29
97
Donne sane in
gravidanza
30
28
93
Tabella 6: Specificità di SeroCT™-IgG su inconfronto a due diverse MIF
La specificità di SeroCT™-IgG è stata determinata in confronto alla MIF in due studi
indipendenti che impiegavano MIF diverse. I campioni di siero usati in ciascuno studio
erano definiti dall MIF o come negativi per anticorpi contro C.trachomatis e C.
pneumoniae (MIF Ct-/Cp-) o come negativi per C. trachomatis, positivi per
C.pneumoniae (MIF Ct-/Cp+)
MIF
Ct-/Cp-
MIF
Ct-/Cp+
SeroCT™
-IgG Negativo
Specificità
di SeroCT™
-IgG (%)
Studio #1 MIF in casa
0
64
58
91
Studio #2 SeroFIA
Savyon
30
100
117
90
Conclusione: SeroCT™-IgG dimostra una specificità superiore al 90% per
C.trachomatis.
- 60 -
I
Precisione
La precisione intra-assay (intra-serie) di SeroCT™-IgG test è riportata nella tabella
seguente:
Campione
No. di replicati
Valor
CV%
Positivo
10
0,835
2,5
Negativo
10
0,149
8,8
La precisione inter-assay (inter-serie) di SeroCT™-IgG test è riportata nella tabella
seguente:
Campione
No. di replicati
Valor
CV%
Positivo
10
0,902
2,9
Negativo
10
0,167
5,5
- 61 -
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- 63 -
ELISA for the detection of IgG antibodies to Chlamydia
trachomatis in human serum
ELISA Zum Nachweis von IgG antikörpern gegen
Chlamydia trachomatis aus menschlichem serum
Test ELISA pour la détection des anticorps IgG antiChlamydia trachomatis dans le sérum humain
Test ELISA para la detección de anticuerpos IgG anti
Chlamydia trachomatis en suero humano
ELISA per la determinazione di anticorpi IgG specifici
per Chlamydia trachomatis nel siero umano

ELISA for the detection of IgG antibodies to Chlamydia trachomatis

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