these_nagalo ( PDF - 7.7 Mo)
Transcription
these_nagalo ( PDF - 7.7 Mo)
UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU --------------École Doctorale Sciences et Technologies --------------Laboratoire de Biologie et de génétique moléculaires (Labiogene) No d’ordre ………….... Thèse Présentée Par Bolni Marius NAGALO Pour obtenir le grade de Docteur de l’Université de Ouagadougou Option Sciences Biologiques Appliquées Spécialité : Biologie moléculaire Sécurité transfusionnelle au Burkina Faso: Séroprévalence et incidence des virus de l’immunodéficience humaine(VIH), des hépatites B & C (VHB et VHC) et de Treponema pallidum chez les donneurs de sang. Soutenue le 17 Décembre 2012 devant le jury composé de : Président : Jean Didier ZONGO, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou Membres : Nicolas BARRO, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou (Rapporteur) Jean Pierre ALLAIN, Professeur Titulaire, Université de Cambridge, UK (Rapporteur) Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou (Directeur de thèse) Idrissa SANOU, Professeur Agrégé, Université de Ouagadougou Mahamoudou SANOU, Assistant, Université de Ouagadougou (Invité) © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 1 Résumé de la thèse La présente thèse avait pour but d’évaluer la séroprévalence et l’incidence des virus de l’immunodéficience humaine, des hépatites B et C et de la syphilis chez les donneurs de sang d’une part ainsi que la mise en place des nouvelles stratégies pour recruter plus de donneurs réguliers, et d’autre part la faisabilité des tests moléculaires dans le dépistage du VIH-1 dans les dons de sang au centre régional de transfusion sanguine de Ouagadougou. A cet effet deux enquêtes rétrospectives et une étude pilote ont été conduites dans les différents centres régionaux de transfusion sanguine du pays. Les résultats de la première enquête épidémiologique chez les donneurs de sang de Koudougou montrent que dans ce centre de transfusion sur un total de 4520 donneurs de sang en 2009, 1348 (29,82%) étaient infectés par au moins un agent pathogène et 149 (3,30%) avaient contractés des multiples infections. Les séroprévalences du VIH, de l’AgHBs, du VHC et de la syphilis étaient respectivement de 2,21%, 14,96%, 8,69% et 3,96%. Chez les donneurs de sang infectés par plusieurs pathogènes, les doubles et triples infections les plus fréquentes étaient l’AgHBs-VHC (1,39%), AgHBs-syphilis (0,66%) et AgHBs-VHC-syphilis (0,11%). En 2009 sur 35.401 donneurs de sang bénévoles des centres régionaux de transfusion sanguine de Ouagadougou, Bobo-Dioulasso et Fada N’Gourma, 7524 (24,4%) étaient infectés par au moins un pathogène et 580 (1,9%) étaient positifs pour plusieurs marqueurs sérologiques. Chez 3981 donneurs de sang réguliers, les taux d'incidences ont été de 3270,2 ; 5874,1 et 6784,6 pour 100000 dons respectivement pour l'anti-VIH, l'AgHBs et l'anti-VHC. L’étude pilote a concerné 20 pools de plasmas de donneurs de sang du centre de transfusion de Ouagadougou (10 pools de négatifs, 8 pools de positifs et 2 pools de douteux au VIH-1). Tous les pools de positifs et de négatifs ont été confirmés positifs ou négatifs par RT-PCR. Pour les deux pools de douteux, un pool a été confirmé négatif et un autre positif par RT-PCR. Chaque don des pools de négatifs ou de positifs testé individuellement a été trouvé négatif ou positif par RT-PCR. Les virus responsables des hépatites B et C demeurent une préoccupation majeure pour la sécurité transfusionnelle au Burkina Faso. La disponibilité en poches de sang ainsi que le renforcement de la sécurité des produits sanguins passera d’une part, par le recrutement de nouveau type de donneurs de sang (donneurs familiaux/remplacements) et une sélection rigoureuse des donneurs et, d’autre part par l’utilisation de nouvelles techniques plus sensibles et spécifiques qui seraient en mesure de garantir une sécurité maximale en médecine transfusionnelle. Mots clés : VIH, VHB, VHC, Syphilis, incidence, transfusion sanguine, donneurs. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 2 Abstract This thesis aimed to assess the prevalence and incidence of human immunodeficiency virus, hepatitis B and C and syphilis among blood donors and to develop new strategies to recruit more regular donors. We also evaluated the feasibility of NAT in HIV-1 diagnosis among blood donation in the regional blood transfusion centre of Ouagadougou. Retrospective surveys study were conducted in the 4 regional blood transfusion centres in the country. The results of the first epidemiological survey among blood donors of Koudougou show that from the total of 4520 blood donors in 2009, 1348 (29.82%) were infected with at least one pathogen and 149 (3.30%) had serological evidence of multiple infections. The overall seroprevalence rate of HIV, HBV, HCV and syphilis was 2.21%, 14.96%, 8.69% and 3.96%. Among blood donors with multiples infections, the most common dual or triple combinations were HBsAg-HCV (1.39%), HBsAg-Syphilis (0.66%) and HBsAg-HCV-Syphilis (0.11%), respectively. In 2009, from the total of 31,405 first-time volunteer blood donors from regional blood transfusion centres of Ouagadougou, Bobo-Dioulasso and Fada N’gourma, 7,524 (24.0%) were infected with at least one pathogen and 580 (1.8%) had serological evidence of multiple infections. The seroprevalence of HIV, HBV, HCV and syphilis in first-time volunteer donors was 1.8%, 13.4%, 6.3% and 2.1%, respectively. In 3,981 repeat donors, the incidence rate was 3270.2, 5874.1 and 6784.6 per 100,000 donations for anti-HIV-1, HBsAg and anti-HCV, respectively. These numbers varied significantly according to populations where blood is collected and blood centers in Burkina Faso. The aim of the pilot study was to investigate the use of viral genome diagnosis of HIV-1 infection in blood donors in the regional blood transfusion center in Ouagadougou, Burkina Faso. All positive and negative ELISA tests were confirmed by RT-PCR. Findings of RT-PCR on individual samples confirmed those obtained on pooled plasma samples. For the two undeterminable pools, RT-PCR identified one as negative and the other as positive. HBV and HCV remain the greatest threats to blood safety in Burkina Faso. Strict selection and retention of voluntary, non-remunerated low-risk blood donors are recommended to improve blood safety. Keywords: HIV, HBV, HCV, syphilis, incidence, blood transfusion, donors. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 3 Sigles et abréviations ADN : Acide désoxyribonucléique ADNc : ADN complémentaire ADNccc : ADN circulaire fermé de façon covalente Ag : Antigène AgHBc : Antigène de la capside de l’hépatite B AgHBe : Antigène « e » de l’hépatite B AgHBs : Antigène de surface de l’hépatite B AgHD : Antigène du virus de l’hépatite D ARN : Acide ribonucléique AXSYM : Test immunoenzymatique (technologie MEIA) CERBA-LaBiogène: Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni- Laboratoire de biologie et de génétique. CMV : Cytomégalovirus CNLS-IST : Conseil national de lutte contre le VIH/SIDA et les IST CNTS: Centre National de Transfusion Sanguine CRTS : Centre Régional de Transfusion sanguine DO : Densité optique DGV : Dépistage génomique viral EBV : Epstein Barr- Virus ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay Env : Enveloppe Gag : Groupe antigène Gp: Glycoprotéine HTLV : Virus responsable de la leucémie(Herpesviridae) © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 4 Ig: Immunoglobuline INVS : Institut national de veille sanitaire NANB : Hépatite non A non B PSL : Produits sanguins labile QBD : Qualification biologique du don Real Time PCR : PCR en temps réel RT/PCR : Transcription inverse/Réaction en chaîne par polymérase VHA : Virus de l’hépatite A VHB : Virus de l’hépatite B VHC : Virus de l’hépatite C VHD : Virus de l’hépatite D VHE : Virus de l’hépatite E VHG : Virus de l’hépatite G VIH/SIDA : Virus de l’Immunodéficience Humaine/ Syndrome d’immunodéficience acquise © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 5 Dédicaces Cette œuvre est dédiée à mes parents, spécialement à ma défunte mère Dao Aminata, À papa Nagalo W Michel, à mes frères et sœurs, À toute ma famille, à mes ami(e)s, les présent(e)s comme les absent(e)s, À mon épouse Murielle Compaore Merci a tous pour votre soutien inconditionnel. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 6 Remerciements Ce travail de thèse a été réalisé dans les Laboratoires du centre national de transfusion sanguine du Burkina Faso (CNTS) et au Centre de recherche biomoléculaire Pietro Annigoni CERBA/LABIOGENE, Université de Ouagadougou. Je remercie le Professeur Jacques Simpore (Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou, Recteur de l’université Saint Thomas d’Aquin, USTA), Directeur de cette thèse, membre du jury et Directeur de plusieurs institutions académiques et caritatives : Laboratoire de Biologie moléculaire et de génétique (Labiogène, UFR/SVT, Université de Ouagadougou) ; Centre de recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA) ; Laboratoire du centre médical Saint Camille de Ouagadougou. Le Professeur Simpore est le principal promoteur de la présente thèse ; merci pour votre soutien moral et financier, pour la qualité de l’encadrement scientifique et votre disponibilité en dépit de vos multiples fonctions. J’exprime ma profonde reconnaissance au Professeur Jean Didier Zongo (Professeur Titulaire, Directeur du laboratoire de génétique et de biotechnologies, Université de Ouagadougou) codirecteur de cette thèse, pour son encadrement scientifique et sa disponibilité tout au long de ma formation doctorale. Je remercie le Professeur Jean Pierre Allain (Professeur Titulaire, Université de Cambridge) pour avoir bien voulu juger et corriger cette thèse, contribuant ainsi à l’amélioration de sa qualité ; je le remercie aussi pour sa précieuse contribution dans la rédaction de mes articles. Je tiens à remercier le Professeur Patrick Goubau (Professeur Titulaire, Université Catholique de Louvain, Belgique) qui a bien voulu lire et juger la présente thèse. Je voudrais aussi exprimer ma profonde gratitude au Professeur Nicolas Barro (Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou) qui a bien voulu juger la présente thèse. Je tiens aussi à remercier sincèrement le Professeur Idrissa Sanou qui a bien voulu consacrer de son temps pour juger ce travail. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 7 Mes remerciements s’adressent également au Docteur Mahamoudou Sanou, ancien Directeur général du CNTS sans qui la présente thèse n’aurait pas été possible. Je remercie le Docteur Cyrille Bisseye qui m’a apporté son expertise technique au laboratoire et une aide précieuse dans la préparation des articles de la présente thèse. Je remercie également les cadres du CNTS, les Docteurs Nebié Yacouba, Alice Kiba/Koumaré, Kisito Kienou ainsi que les directeurs régionaux des CRTS et toutes les équipes techniques qui ont contribué de façon significative à la réalisation de mes travaux. J’adresse mes remerciements au Professeur Sawadogo et aux Docteurs , Bationo, Nanema, Traoré, ainsi qu’à mes ainés et promotionnaires de DEA. J’adresse mes remerciements à l’ensemble de l’équipe du CERBA/Labiogene : Djénéba, Tani, Florencia, Moctar, Désiré, Thérèse, Zoenabo, Bazié et Laure. Je tiens également à exprimer ma plus profonde reconnaissance à mes parents, mes frères, ainsi qu’à tous les membres de ma famille pour m'avoir toujours soutenu dans toutes mes entreprises. Merci enfin à ma très chère et tendre épouse Murielle (Mumu), qui de tous a probablement accepté la plus lourde tâche, celle de me supporter au quotidien, toujours avec entrain, bienveillance, et amour, pendant toute la durée de ma thèse, et pour longtemps j’espère. À la Conférence Épiscopale Italienne (CEI), pour leur soutien financier dans la réalisation de nos travaux de recherches. Au « Programme d’Appui et de développement des Centres d’Excellence Régionaux (PACER2) » de l’UEMOA qui nous a soutenus au dernier moment pour que nous puissions terminer cette thèse de © Thèse de Doctorat Unique doctorat, nous leur BOLNI MARIUS NAGALO traduisons toute notre gratitude. Page 8 Sommaire Table des matières Résumé de la thèse ............................................................................................................................................................2 Remerciements ...................................................................................................................................................................7 Introduction ...................................................................................................................................................................... 17 Objectifs de la thèse........................................................................................................................................................ 20 PREMIERE PARTIE: RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre I : Sécurité transfusionnelle dans le monde. ..................................................................................... 22 I. Généralités................................................................................................................................................................. 22 I.1- Situation mondiale du don de sang. .......................................................................................................... 22 I.1.2- Systèmes de surveillance de l’utilisation du sang et des produits sanguins labiles (PSL). .......................................................................................................................................................................................... 24 I.1.3- La transfusion sanguine au Burkina Faso ........................................................................................... 26 I.1.4- Profil sanitaire de la population au Burkina Faso. .......................................................................... 27 I.1.5- Organisation des activités transfusionnelles au Burkina Faso ................................................. 27 I.1.6- Données sur la transfusion sanguine au Burkina Faso ................................................................. 28 Chapitre II : Maladies transmissibles par transfusion sanguine ................................................................. 29 II.1. Les principales causes des contaminations post-transfusionnelles ........................................... 29 II.2. Les hépatites virales ......................................................................................................................................... 29 II.2.1. L’hépatite virale C (VHC). ......................................................................................................................... 30 II.2.1.1. Caractéristiques du virus de l’hépatite C ....................................................................... 30 II.2.1.2. Organisation génomique. ............................................................................................... 30 II.2.1.3-Réplication du VHC et variabilité virale ........................................................................ 32 II.2.1.4. Le génotype viral ............................................................................................................ 35 II.2.2.1. Génome du virus de l’hépatite B (VHB) ......................................................................... 39 II.2.2.2. Cycle de réplication du VHB ........................................................................................... 41 II.2.2.3. Evolution des marqueurs virologiques au cours d’une infection au VHB ........................ 43 II.2.2.4 Epidémiologie et répartition géographique du virus de l’hépatite B (VHB) ................ 47 II.2.3. Facteur delta : agent de l'hépatite D.................................................................................................... 49 II.2.4. Le virus de l'hépatite A (VHA) ................................................................................................................ 50 II.3. Le virus de l'immunodéficience humaine acquise (VIH/SIDA) ...................................................... 51 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 9 II.3.1. Caractéristiques virologiques du VIH................................................................................................. 52 II.3.2. Génome et propriété structurale du VIH............................................................................................ 53 II.3.3. Variabilité génétique des VIH ................................................................................................................. 55 II.3.4. Infectiosité du VIH ....................................................................................................................................... 56 II.3.5. Phase clinique de l’infection au VIH ..................................................................................................... 57 II.3.6. Le VIH/SIDA dans le monde .................................................................................................................... 58 II.4. Le virus T-lymphotrope humain type I et type II (HTLV-1 et 2) ................................................... 61 II.5. Les Contaminations bactériennes ............................................................................................................. 61 II.5.1. Treponema pallidum agent causal de la syphilis. ............................................................................ 62 II.5.1.2.Épidémiologie de la syphilis dans le monde .................................................................................. 63 II.6. Paludisme et transfusion sanguine .......................................................................................................... 64 Chapitre III : Méthodes de diagnostic des agents transmissibles par transfusion sanguine ........... 66 III. Diagnostic des hépatites virales ......................................................................................................................... 66 III.1. Le virus de l’hépatite C (VHC) ..................................................................................................................... 66 III.1.1- Le diagnostic indirect ............................................................................................................................... 66 III.1.2. Le diagnostic direct ................................................................................................................................... 67 III.2. Le virus de l’hépatite B (VHB) .................................................................................................................... 69 III.2.1. Diagnostic virologique.............................................................................................................................. 69 III.2.1.1. Les marqueurs directs................................................................................................... 69 III.2.1.2. Les marqueurs indirects ............................................................................................... 70 III.3.1. Diagnostic indirect ..................................................................................................................................... 72 III.3.1.1. L’Immunofluorescence indirecte .................................................................................. 72 III.3.1.2. Les techniques immunoenzymatiques .......................................................................... 73 III.3.1.3. Les tests rapides ............................................................................................................ 74 III.3.1.4. Tests de confirmations .................................................................................................. 76 III. 4. Détection des infections bactériennes syphilitiques........................................................................ 78 Chapitre IV : Techniques d’amplifications moléculaires et sécurité transfusionnelle ....................... 80 IV.1. La transfusion sanguine ................................................................................................................................ 80 IV.2. Risques transfusionnels ............................................................................................................................... 81 IV.3. Mesure du risque transfusionnel............................................................................................................... 83 IV.3.1. Différents types de donneurs de sang................................................................................................ 83 IV.3.1.1. Donneurs de sang de premier don ................................................................................ 83 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 10 IV.3.1.2. Donneurs de sang régulier ............................................................................................ 83 IV.3.1.3. Donneur en séroconversion .......................................................................................... 83 IV.3.2. Calcul du taux d’incidence....................................................................................................................... 83 IV.3.3. Le risque résiduel ....................................................................................................................................... 84 IV.4. Biologie moléculaire et sécurité transfusionnelle .............................................................................. 85 IV.4.1. La Réaction en chaîne par polymérase et ses variantes (PCR) ................................................ 85 IV.4.1.1. Les étapes de la PCR ...................................................................................................... 86 IV.4.1.2. La transcription inverse par réaction en chaîne par polymérase (RT / PCR) ............ 86 IV.4.1.3. La RT/PCR quantitative : la charge virale ................................................................... 87 IV.4.1.4. La RT/PCR qualitative .................................................................................................. 89 IV.4.1.5. Réalisation d’une RT/PCR ............................................................................................ 89 IV.4.1.6. Synthèse de l'ADNc......................................................................................................... 89 IV.4.1.7. Efficacité de la PCR........................................................................................................ 91 IV.4.1.8. Autres techniques dérivées............................................................................................ 91 IV.4.1.8.1. La PCR multiplex ................................................................................................... 91 IV.4.1.8.2. La PCR en Temps réel (Real Time PCR) .............................................................. 92 DEUXIEME PARTIE: TRAVAUX EFFECTUES Chapitre V : Matériels et méthodes.......................................................................................................................... 95 V.1. L’étude rétrospective ....................................................................................................................................... 95 V.1.1 Les donneurs de sang .................................................................................................................................. 95 V.1.3. Procédure de sélection des donneurs de sang ................................................................................. 96 V.1.3.1. Catégorisation des donneurs de sang ................................................................................................. 96 V.1.3.2. Sérologie des donneurs de sang ..................................................................................... 96 V.1.3.3. Stratégies de confirmation des marqueurs infectieux........................................................................ 97 V.2. Présentation des techniques de dépistages utilisées au cours de l’étude....................................... 97 V.2.1.Tests sérologiques du VIH, VHB, VHC et de la syphilis .................................................................... 97 V.2.1.1.La sérologie VIH-1/2 chez les donneurs de sang en 2009 ............................................................ 97 V.2.1.2. La sérologie des hépatites virales B et C des donneurs de sang en 2009 ............................... 99 V.2.1.3. La sérologie syphilitique des donneurs de sang en 2009 .......................................................... 102 V.3. Amplification de l’ARN viral du VIH-1 ................................................................................................... 104 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 11 V.3.1. Constitution des pools de plasmas des donneurs de sang ....................................................... 104 V.3.2. Extraction de l’ARN viral (kit QIAamp viral ARN mini kit, Hilden, Allemagne) .............. 104 V.3.3. Obtention de L’ADNC ................................................................................................................................ 105 V.3.4. Préparation du gel d’agarose ............................................................................................................... 106 V.4. Analyses statistiques .......................................................................................................................................... 107 V.4.1. Le taux d’incidence ..................................................................................................................................... 107 Chapitre VI : Résultats et discussion ................................................................................................................... 110 VI. 1. Séroprévalences des maladies transmissibles par transfusion sanguine au Burkina Faso110 VI.1.1. Prévalence des marqueurs infectieux chez les donneurs de sang de Koudougou ......... 110 VI.1.1.1. Description de la cohorte du centre régional de transfusion sanguine de Koudougou 110 VI.1.1.2. Épidémiologie du VIH, du VHB, du VHC, de la syphilis chez les donneurs de premier don des zones urbaine et rurales du Burkina Faso en 2009 ............................................................................ 110 VI.1.2. Prévalence des agents infectieux chez les donneurs de sang de Ouagadougou, BoboDioulasso et de Fada N’gourma. ........................................................................................................................ 111 VI.1.2.1. Description de la population d’étude ............................................................................................. 111 VI.1.2.2. Prévalence des marqueurs infectieux chez les donneurs de sang volontaires de premier don ............................................................................................................................................................................... 115 VI.2. Incidence des marqueurs viraux infectieux chez les donneurs de sang de premier don et les donneurs réguliers de Ouagadougou, Bobo-Dioulasso et de Fada N’gourma................................... 118 VI.3. Contribution de la PCR à l’amélioration du diagnostic des agents infectieux au Burkina Faso : RT-PCR du VIH-1 au centre de transfusion de Ouagadougou.................................................................... 120 VI. 4. Discussion ....................................................................................................................................................... 123 VI.4.1. Prévalences des marqueurs infectieux chez les donneurs de sang au Burkina Faso ........ 123 VI.4.2. Incidence des marqueurs viraux infectieux chez les donneurs de sang volontaires, réguliers de trois centres régionaux de transfusion sanguine du Burkina....................................... 126 VI.4.3. Approvisionnement en sang sûr : Quel type de donneur recruter ? ....................................... 129 VI.4.4. Quel type de donneur pour quel coût ? .............................................................................................. 130 VI.4.5. Introduction du dépistage génomique viral en transfusion sanguine au CRTS de Ouagadougou : diagnostic moléculaire du VIH-1 sur les pools de plasmas de donneurs de sang ....................................................................................................................................................................................... 131 VI.4.6. Coordination des activités transfusionnelles : Quelle approche ? ........................................... 134 Conclusion et perspectives .................................................................................................................................... 135 Références Bibliographiques .................................................................................................................................. 137 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 12 Liste des figures FIGURE 1 : DONS DE SANG POUR 1000 HABITANTS EN 2007 (ONUSIDA, 2009) ................................................... 25 FIGURE 2 : CARTE DU BURKINA FASO ................................................................................................................................. 26 FIGURE 3 : EVOLUTION DU NOMBRE DE POCHES COLLECTEES DE 2006 A 2009 AU CNTS. ........................................ 28 FIGURE 4 : A. STRUCTURE DU VIRUS DE L’HEPATITE C (VHC) ; B. GENES DE STRUCTURE ET ORGANISATION GENOMIQUE DU VHC. .................................................................................................................................................... 32 FIGURE 5 : (A) CYCLE DE VIE DU VHC................................................................................................................................ 34 FIGURE 6 : ARBRE PHYLOGENETIQUE REPRESENTANT LES DIFFERENTS GENOTYPES ET SOUS-TYPES DU VHC ET DERIVE DE L’ANALYSE DES SEQUENCES D’UNE PARTIE DE LA REGION NS5B ......................................................... 36 FIGURE 7 : REPARTITION DE L'INFECTION PAR LE VHC DANS LE MONDE (OMS, 1997) ............................................. 38 FIGURE 8 : ORGANISATION DU GENOME DU VIRUS DE L’HEPATITE B (BLANCHET ,2007) ........................................... 40 FIGURE 9: ARBRE PHYLOGENETIQUE DES ORTHOHEPADNAVIRUS (KIDD-LJUNGGREN ET AL, 2002) ........................ 42 FIGURE 10 : VUE D’ENSEMBLE DU CYCLE DE REPLICATION VIRAL VHB (ADAPTE DE GANEM ET PRINCE, 2004) .... 43 FIGURE 11 : EVOLUTION DES MARQUEURS SEROLOGIQUES AU COURS DE L’INFECTION AU VHB (HTTP://T2.GSTATIC.COM/IMAGES) ........................................................................................................................... 46 FIGURE 12: REPARTITION GEOGRAPHIQUE DU RISQUE DE CONTAMINATION PAR L'HEPATITE B EN 2005(WWW.WIKIPEDIA.ORG/WIKI/FICHIER.HBV_PREVALENCE_2005.SVG) .................................................... 48 FIGURE 13: REPARTITION GEOGRAPHIQUE DU RISQUE DE CONTAMINATION PAR L'HEPATITE A EN 2005 : WWW.WIKIPEDIA.ORG/WIKI/FICHIER.HBA_PREVALENCE_2005.SVG) ................................................................ 51 FIGURE 14 : STRUCTURE DU VIH (HTTP://WWW.MUSEUM-GRENOBLE.FR) ................................................................. 53 FIGURE 15 : REPRESENTATION SCHEMATIQUE DU GENOME DU VIH-1 (PETERLIN ET TRONO, 2003).................... 54 FIGURE 16 : PHYLOGENIE DES DIFFERENTS TYPES ET SOUS TYPES DU VIH (WIKIPEDIA.ORG/WIKI/FICHIER:HIVSIV-PHYLOGENETIC-TREE.SVG ..................................................................................................................................... 55 FIGURE 17 : CYCLE DE REPLICATION DU VIH (WWW.WIKIPEDIA.FR) ............................................................................. 57 FIGURE 18 : DETECTION DES ANTICORPS ET ANTIGENE PENDANT LA PHASE AIGÜE DU VIH-1(ADAPTE DE MCMICHAEL ET AL, 2010) ........................................................................................................................................... 58 FIGURE 19 : REPARTITION MONDIALE A LA FIN 2005 DES ADULTES ET DES ENFANTS VIVANT AVEC LE VIH (ONUSIDA/OMS, 2005) ............................................................................................................................................ 59 FIGURE 20: WESTERN BLOT CONFIRMÉ POSITIF (SOURCE: WESTERN BLOT BANDELETTE VIH .PDF) ...................... 77 FIGURE 21: SCHEMA DE L’INTERPRETATION D’UNE IMMUNO-EMPREINTE ................................................................... 78 FIGURE 22 : SCHEMA SIMPLIFIE D'AIDE A L'INTERPRETATION DES SEROLOGIES DE LA SYPHILIS ............................... 79 FIGURE 23 : DIFFERENTES ETAPES DE LA PCR (WWW.CHUPS.JUSSIER.FR)................................................................... 88 FIGURE 24: A. SCHEMA SIMPLIFIE DU PRINCIPE DE LA REACTION DE TRANSCRIPTION INVERSE EN PRESENCE D'AMORCE POLYT ET B. LA SYNTHESE DU SECOND BRIN D'ADNC PAR LA TAQ POLYMERASE.............................. 90 FIGURE 25 : GEL D’AGAROSE A 2% DES POOLS DE PLASMAS ET DE QUELQUES ECHANTILLONS INDIVIDUELS ........ 122 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 13 Liste des photographies Photographie 1 A gauche spectrophotomètre lecteur de microplaques (Biorad, France) à droite appareillage de l’automate l’AXSYM (Abbott, USA)………………………………………………………………………103 Photographie 2 Thermocycleur 9700 (Applied Biosystems, USA)………………………………………………..106 Photographie 3 A gauche une Cuve d’électrophorèse couplée à un générateur (CERBA/Labiogene) à droite course électrophorétique des acides nucléiques du VIH-1 sur gel d’agarose à 2%...................107 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 14 Liste des tableaux TABLEAU I : CAS DE VIH PAR TRANCHE D’AGE EN 2007 COMPAREES AUX DONNEES DE 2008 (SOURCE PNM 2008 DU CNLS-IST, 2008) ................................................................................................................................................... 60 TABLEAU II: INTERPRETATION DES RESULTATS AVEC LE KIT AXSYM VIH AG/AB COMBO .................................. 99 TABLEAU III : CARACTERISTIQUES SOCIODEMOGRAPHIQUES DES DONNEURS DE SANG DE KOUDOUGOU EN 2009 112 TABLEAU IV : PREVALENCE DES MARQUEURS INFECTIEUX CHEZ LES DONNEURS DE SANG DE PREMIER DON EN ZONES URBAINE ET RURALE DES LES 4 CENTRES DE TRANSFUSION SANGUINE DU BURKINA FASO EN 2009 ............. 113 TABLEAU V : CARACTERISTIQUES SOCIODEMOGRAPHIQUES DES DONNEURS VOLONTAIRES NON REMUNERES ET INFECTIONS AU VIH, A LA SYPHILIS AU VHB, ET AU VHC A KOUDOUGOU........................................................ 114 TABLEAU VI : REPARTITION DES DONNEURS DE SANG PAR CENTRE DE TRANSFUSION SANGUINE ......................... 116 TABLEAU VII : PREVALENCE DES MARQUEURS INFECTIEUX CONFIRMES ET DES CO-INFECTIONS CHEZ LES DONNEURS VOLONTAIRES DE PREMIER DON ................................................................................................................................ 117 TABLEAU VIII : INCIDENCE DU VIH, DU VHB ET DU VHC CHEZ LES DONNEURS REGULIERS ET LES DONNEURS DE PREMIER DON DANS LES TROIS CENTRES REGIONAUX DE TRANSFUSION SANGUINE AU BURKINA FASO ......... 119 TABLEAU IX : RT-PCR SUR LES POOLS DE PLASMAS AU COURS DE L’ENQUETE PROSPECTIVE D’AOUT A DECEMBRE 2009 AU CRTS-O ....................................................................................................................................................... 121 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 15 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 16 Introduction La sécurité transfusionnelle est un problème de santé publique extrêmement préoccupant pour les autorités sanitaires des pays d’Afrique subsaharienne. Et de ce fait, beaucoup d'efforts ont été consentis à l’élaboration de mesures visant à réduire le risque de transmission d'agents infectieux par transfusion sanguine. La mise en évidence de l’agent causal du VIH/SIDA et de la transmissibilité du virus par le sang a vu émerger des tests de dépistage de plus en plus sensibles et efficaces. A l’heure actuelle, le dépistage systématique des virus de l’immunodéficience humaine acquise (VIH), des hépatites B et C (VHB et VHC) et du tréponème pâle de la syphilis est effectué dans la plupart des banques de sang du continent. En 2007, au Burkina Faso les prévalences des principaux marqueurs viraux infectieux dépistés en transfusion étaient respectivement de 1,7%, 14,3% et 2,2% pour le VIH et les virus des hépatites B et C (VHB et VHC). Ces prévalences sont comparables à celle trouvées dans la plupart des pays d’Afrique de l’ouest mais elles demeurent élevées comparativement à celles des pays développés (Nagalo et al, 2011). Cependant les prévalences élevées dans les populations Africaines des maladies transmissibles par le sang impliquent aussi l’existence d’un risque élevé de recruter des donneurs de sang en phase de séroconversion et de transfuser des malades avec du sang contaminé. Ces artéfacts transfusionnels sont imputables à un risque résiduel qui persiste malgré la grande sensibilité des tests de dépistage utilisés et la mise en place d’un système rigoureux de rétention et de fidélisation des donneurs. Le risque résiduel est représenté par des dons infectieux collectés pendant la fenêtre de silence sérologique qui correspond à la phase de séroconversion du donneur; période au cours de laquelle les anticorps témoins de l’infection ne sont pas détectables par les méthodes courantes de diagnostics biologiques. L’observation des séroprévalences élevées des principaux marqueurs dépistés en transfusion est essentiellement due au mode de recrutement des donneurs de sang. En effet plus de 2/3 des poches collectées dans les banques de sang d’Afrique subsaharienne proviennent des donneurs de sang de premier don. Les donneurs de sang sont recrutés au cours des cérémonies socioculturelles dans les villes et dans les campagnes et diverses © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 17 méthodes sont mises en place pour fidéliser ces donneurs occasionnels afin de promouvoir les dons réguliers (Mvere ,2002 ; Allain et al, 2009 ; Owusu-Ofori et al, 2010). Au Burkina Faso comme dans la plupart des pays de l’Afrique au sud du Sahara, les principaux problèmes rencontrés en transfusion sanguine sont : la pénurie chronique en poches de sang et le coût engendré par le recrutement de donneurs volontaires non rémunérés. La disponibilité en produits sanguins est encore plus critique pendant les périodes d’hivernages (paludisme), les vacances scolaires de Noël, Pâques car une grande partie des dons sont collectés en milieux scolaire et universitaire (Allain, 2011). Il ressort clairement à travers toutes ces analyses que seule l’augmentation du nombre de dons réguliers pourrait garantir une meilleure sécurité transfusionnelle. Des études ont prouvé de part le monde que les prévalences des infections dues au VIH, aux hépatites virales B et C et autres infections transmissibles par transfusion sont toujours plus faibles chez les donneurs réguliers. La faiblesse de l’effectif des donneurs dans les banques de sang d’Afrique subsaharienne engendre la nécessite de se tourner vers d’autres types de donneurs de sang potentiels. Longtemps exclus du processus de don de sang, les donneurs de sang familiaux/remplacements se rapprochent d’un point de vue épidémiologique des donneurs volontaires non rémunérés (Allain, 2011). Et, la prévalence des infections parmi les donneurs de sang pour la plupart de premier don et les donneurs familiaux/remplacements est similaire à celle présente dans la population en générale. De plus le recrutement des donneurs familiaux/remplacements ne nécessite pas la mobilisation de plus de ressources que les collectes chez les donneurs volontaires non rémunérés. La politique de collecte actuelle du centre national de transfusion sanguine du Burkina devrait prendre en compte les donneurs familiaux/remplacements pour répondre aux besoins grandissant en poches de sang chaque année. Mais également promouvoir diverses stratégies de rétention et de fidélisation des donneurs de sang familiaux/remplacements dans le but d’augmenter le nombre des donneurs réguliers afin de contribuer à garantir la sécurité transfusionnelle et à assurer pour chaque patient qui en a besoin, l’accès à du sang non infectieux. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 18 Cette étude, se propose d’une part d’établir des données épidémiologiques sur les prévalences, les incidences des principaux marqueurs infectieux dépistés en transfusion sanguine au Burkina Faso. Pour permettre l’identification des nouvelles voies d’infections, de connaître et de comprendre les modes de contaminations actuels de l’infection par le VIH, le VHB, le VHC et la syphilis chez les donneurs de sang des centres régionaux de transfusion sanguine du pays. D’autre part de proposer des mesures alternatives pour combler la pénurie en poches de sang dans les centres de santé du Burkina par la possibilité d’enrôlement des donneurs familiaux/remplacements puis de leur fidélisation (conversion en donneurs réguliers) pour assurer aux patients une meilleure disponibilité des produits sanguins en qualité et en quantité suffisante. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 19 Objectifs de la thèse L’objectif de cette thèse est : Objectif général : Contribution à l’amélioration de la sécurité transfusionnelle des produits sanguins labiles dans les différents centres régionaux de transfusion sanguine du Burkina Faso. Objectifs spécifiques : (i) Evaluer les prévalences des infections transmissibles par transfusion sanguine et l’impact des facteurs sociodémographiques sur le risque associé au don de sang chez les donneurs de sang. (ii) Déterminer l’incidence des virus du VIH, du VHB et du VHC chez les donneurs de sang réguliers des centres régionaux de transfusion sanguine de Ouagadougou, de Bobo-Dioulasso et de Fada N’gourma. (iii) Identifier des solutions alternatives pour palier aux difficultés d’approvisionnement en sang sécurisé dans les centres de transfusion sanguine du pays. (iv) Permettre une notification rapide du statut sérologique des donneurs de sang en particulier les indéterminés (douteux ou zone grise) pour le VIH au CRTS de Ouagadougou en utilisant les techniques d’amplifications moléculaires (RT-PCR). © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 20 PREMIERE PARTIE : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 21 Chapitre I : Sécurité transfusionnelle dans le monde. I. Généralités I.1- Situation mondiale du don de sang. Chaque année plus de 85 millions de dons de sang sont recueillis auprès de donneurs, tous types confondus (Castilla et al, 2005). La disponibilité et la sécurité du sang et des produits sanguins pour les transfusions continuent d’être préoccupantes, en particulier dans les pays à revenu faible ou intermédiaire, où demeure le risque de transmission du VIH et d’autres infections, par exemple l’hépatite B, l’hépatite C et la syphilis au cours d’une transfusion. Pour diminuer la charge du VIH due à des transfusions à risque, il faut appliquer une stratégie intégrée, avec un service de transfusion sanguine coordonné au niveau national ; mener une collecte de sang auprès de donneurs de sang sûr ; dépister les infections transmissibles par transfusion comme le VIH dans tous les dons de sang ; et dispenser une formation et un suivi appropriés aux soignants. Le niveau minimal de dons requis pour qu’un pays satisfasse ses besoins les plus essentiels en sang est estimé à 1% de la population. Ces besoins sont plus élevés dans les pays qui ont des systèmes de santé plus avancés. La disponibilité du sang mesurée par les dons pour 1000 habitants, varie beaucoup dans le monde, les niveaux les plus bas étant relevés dans les pays à revenu faible ou intermédiaire (3,1 pour 1000 habitants au Burkina Faso). Le taux moyen de don du sang dans les pays à revenu élevé est 16 fois plus important que dans les pays à faible revenu. Soixante-treize pays à revenu faible ou intermédiaire indiquent qu’ils ont recueilli moins de 10 dons pour 1000 habitants (Figure 1). En Afrique subsaharienne, les difficultés entravant la constitution des réserves en sang sûr sont d’une part dues aux recrutements exclusif des donneurs volontaires non rémunérés préconisé par l’OMS, au manque de donneurs sains ou à la présence de donneurs non sûr, à l’utilisation inappropriée du sang et d’autre part aux modestes ressources dont disposent les banques de sang. Cette pénurie en sang conduit non seulement à de graves conséquences sanitaires, comme les décès dus aux hémorragies © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 22 post-partum, mais contribue aussi au risque accru de transmission du VIH ou des hépatites virales car un stock insuffisant de produits sanguins entraine une baisse de vigilance, le recours aux donneurs à risque et incite à transfuser du sang sans l’avoir testé (OMS, 2009). Le recrutement de donneurs de sang ne peut être sûr, moins coûteux et pratique que si l’on recrute les donneurs au sein des groupes de population les moins exposés au risque d’infection. Il s’avère être nécessaire pour les pays pauvres que de nouvelles stratégies soient élaborées pour enrôler plus de donneurs de sang sûr et par la suite les encourager à revenir régulièrement pour des dons de sang. I.1.1- Les donneurs de sang en Afrique subsaharienne Dans la plupart des pays de cette partie du monde, les donneurs de sang sont repartis en 3 catégories. Nous avons d’abord les donneurs rémunérés ou professionnels qui sont essentiellement des personnes issus de milieux pauvres en Afrique, souvent en mauvaise santé, mal nourries et vulnérables à de nombreuses infections transmissibles par transfusion sanguine. Les prévalences des marqueurs infectieux (VIH, AgHBs et anti-VHC) sont plus élevées chez les donneurs rémunérés comparativement aux autres catégories de donneurs de sang (Ahmed et al, 2007). Ce type de donneurs est de plus en plus exclu de la politique du don de sang. Ensuite, il ya les donneurs de sang familiaux/remplacements. L’exclusion de ce groupe de donneurs de sang est intervenue en Afrique subsaharienne sur recommandation de l’OMS et des bailleurs de fond (Allain, 2011). De nombreuses études ont montré que cette catégorie de donneurs ne présentait pas plus de risque pour le don de sang que les donneurs volontaires non rémunérés (Allain et al, 2010 ; Loua et Nze Nkoure, 2010 ; Mbanya et al, 2010). Les donneurs familiaux/remplacements représentent une alternative à la pénurie en sang dans les régions reculées. En Afrique, ils font le plus souvent partie de la famille du malade ou de son entourage et font des dons volontaires rarement rémunérés qui peuvent être utilisés directement si le sang est compatible ou mis en réserve pour d’autres patients. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 23 Enfin, il ya les donneurs volontaires non rémunérés qui offrent leur sang par altruisme, de leur plein gré et sont fortement recommandés par l’OMS. Ce sont des individus à majorité jeunes , des étudiants ou scolaires qui font les dons soit directement au niveau des centres de transfusion sanguine ou soit au cours des collectes mobiles (manifestations socioculturelles etc.). Leur nombre ne suffit pas à satisfaire la demande en sang (9-11%) en Afrique de l’Ouest (Allain, 2011) et contrairement à ce qui était attendu, les donneurs volontaires non rémunérés ne garantissent pas une meilleure sécurité transfusionnelle. En effet, les prévalences des marqueurs infectieux transmissibles par le sang sont similaires chez les donneurs volontaires aussi bien que chez les donneurs familiaux/remplacements comparativement à celles de la population générale (Allain, 2011). De plus le recrutement des donneurs volontaires non rémunérés nécessite la mobilisation des moyens logistiques et matériels dont le coût est difficile à supporter par les centres de transfusion. Dans les pays à revenus limités où parfois la disponibilité continue en réactifs de dépistage, de personnels qualifiés et de ressources financières fait défaut, Il faudrait peut être recourir à d’autres stratégies pour satisfaire une demande en sang grandissante d’année en année. I.1.2- Systèmes de surveillance de l’utilisation du sang et des produits sanguins labiles (PSL). Selon l’OMS, les données transmises par 96 pays indiquent que seuls 39% des hôpitaux qui pratiquent des transfusions dans les pays à faible revenu, 62% dans les pays à revenu intermédiaire et 80% dans les pays à revenu élevé ont un comité de transfusion. De plus, 40% des hôpitaux dans les pays à faible revenu, 71% dans les pays à revenu intermédiaire et 92% dans les pays à revenu élevé comptent sur un système de notification des manifestations indésirables de la transfusion. Il est de toute évidence nécessaire de continuer à travailler pour garantir un approvisionnement sanguin sûr dans le monde entier (OMS, 2009). © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 24 Figure 1 : Dons de sang pour 1000 habitants en 2007 (ONUSIDA, 2009) © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 25 I.1.3- La transfusion sanguine au Burkina Faso Le Burkina Faso, est situé en Afrique de l’ouest. Il est limitrophe de six pays : le Mali au Nord, le Niger à l’Est, le Benin au sud-est, le Togo et le Ghana au sud et la cote d’ivoire au sud-ouest. Les habitants sont les Burkinabès et la capitale Ouagadougou est située au centre du pays avec une population d’environ 1.800.000 habitants. Figure 2 : Carte du Burkina Faso Le Burkina Faso est un pays ouest-africain, sahélien caractérisé par une fréquence élevée de maladies endémo-épidémiques (paludisme, VIH/SIDA, méningites, carences martiales etc.) responsables pour la plupart d’anémies. Le recours à la transfusion sanguine est souvent fréquent pour le traitement des malades. Avant 2005, il n’y avait pas une organisation bien structurée de la transfusion sanguine au Burkina Faso. Seuls les deux centres Hospitaliers Universitaires de Ouagadougou et de Bobo-Dioulasso disposaient chacun d’une banque de sang. Au niveau des centres © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 26 régionaux de santé (CHR), la transfusion sanguine était assurée de manière informelle et le laboratoire d’analyses biomédicales du CHR faisait office de banque de sang. Les donneurs de sang étaient le plus souvent des proches du receveur ou des amis de la famille du malade. Le dépistage des virus des hépatites B et C en transfusion sanguine au Burkina n’a été possible qu’après les années 2000. Et les banques de sang de l’époque utilisaient des tests rapides (TDR) pour le diagnostic des maladies transmissibles par transfusion sanguine. Dans l’ensemble le secteur de la transfusion sanguine était marqué par un manque de structures de coordination des activités transfusionnelles, avec des équipements modestes et un personnel peu qualifié. I.1.4- Profil sanitaire de la population au Burkina Faso. Le profil sanitaire du Burkina est caractéristique des pays d’Afrique subsaharienne où le système sanitaire est rudimentaire et ne possède que très peu de moyens : Un taux de mortalité générale : 11,8% (RGGPH 06) et infanto juvénile : 141,9/1000. Taux de mortalité maternelle : 307, 3 pour 100000 naissances vivantes Décès dus à l’accès palustre chez les enfants de moins de 5 ans : 12,9% Décès maternels imputables aux hémorragies 15% en 2007 et 26,1% en 2008. En 2007, l’anémie représentait 7,39% des causes de décès à l’hospitalisation (Annuaire stat 07). En 2007, la prévalence du VIH dans la population générale était de 1,6% (En 2008, le taux d’exclusion des poches de sang pour le VIH était de 2,5%). I.1.5- Organisation des activités transfusionnelles au Burkina Faso Le centre national de transfusion sanguine (CNTS) du Burkina Faso a vu le jour en septembre 2000 par décret ministériel autorisant son ouverture. Avec pour objectif général, assurer la couverture adéquate des besoins nationaux en produits sanguins dans le respect de la sécurité du donneur et du receveur. Depuis l’effectivité de ses activités en 2006, la collecte des poches de sang par le CNTS n’a cessez d’augmenter passant de plus © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 27 de 20.000 dons en 2006 à près de 50.000 dons en 2009 (Figure 3). Cependant, l’ensemble de ces dons ne couvre qu’une partie des besoins annuels en don de sang des zones couvertes par les centres régions régionaux de transfusion sanguine. Figure 3 : Evolution du nombre de poches collectées de 2006 à 2009 au CNTS. I.1.6- Données sur la transfusion sanguine au Burkina Faso En 2008, le CNTS comportait 4 centres régionaux de transfusion sanguine (CRTS) fonctionnels. Le nombre de poche de sang collecté dans les zones de couvertures des différents CRTS et hors de ces zones étaient respectivement de 37.761 soit 55,6 % et 30.207 soit 44,4% sur un total de 67.968 dons de sang. En cette même année le taux de satisfaction des besoins cliniques en zone CRTS était de 78,9% avec un taux d’exclusion pour marqueurs positifs de 25%, un taux de recrutement des donneurs bénévoles de 0,25% et un taux de fidélisation des donneurs de 18,06% (PS/CNTS-2011-2015). Globalement environ 40% du sang utilisé en clinique a été collecté en dehors du système de coordination national des CRTS directement dans les centres de santé. Ceci représente environ 3,1 unités pour 1000 habitants montrant bien le déficit considérable du pays en sang (Dahourou et al, 2010). © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 28 Chapitre II : Maladies transmissibles par transfusion sanguine II.1. Les principales causes des contaminations post-transfusionnelles Dans les pays développés les risques les plus importants pour les transfusés sont la surcharge volumique, les erreurs de transfusion et les contaminations bactériennes du produit sanguin. A l’opposé en Afrique subsaharienne le risque de transmission d’une maladie virale au cours d’une transfusion sanguine est relativement élevé au regard des prévalences élevées des maladies transmissibles par le sang dans la population de donneurs de sang (Vermeulen et al, 2009 ; Zou et al, 2011). La sécurité transfusionnelle est mise à mal en Afrique subsaharienne essentiellement à cause des virus du VIH et des hépatites B et C. II.2. Les hépatites virales Le terme d’hépatite virale est couramment utilisé pour désigner plusieurs maladies cliniquement similaires mais qui sont distinctes sur le plan étiologique et épidémiologique. Ce sont des maladies inflammatoires des tissus parenchymateux qui s’expriment essentiellement au niveau du foie. Six virus ont été identifiés comme responsables de la majorité des hépatites : il s'agit des virus A, B, C, D, E. Les modes de transmission diffèrent selon les types de virus. Les virus des hépatites pénètrent dans l’organisme soit par voie digestive (VHA), soit par voie sanguine (VHB et VHC), soit par voie sexuelle (VHB surtout) (Snon et al ,1992 ; Cohen, 1999). Les virus A et B ont été reconnus comme des entités entières depuis 1940, mais ils n’ont été formellement isolés qu’en 1968 et 1973 respectivement. Il existait une troisième catégorie de virus provoquant une forme d'hépatite qui n'était lié ni au virus A ni au virus B. Après une période d'étude sur les hépatites, le virus responsable de la plupart des hépatites non A non B (NANB) a été finalement identifié par Choo et al. (1989): il s’agit du virus de l'hépatite C ou de l'hépatite post-transfusionnelle. Dans notre étude l’accent sera mis sur les hépatites virales B et C (VHB et VHC). © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 29 II.2.1. L’hépatite virale C (VHC). Les virus responsables des hépatites A et B ont été décrits respectivement par Feinstone et al. (1973) et Dane et al. (1970). Certaines hépatites virales persistaient alors qu’aucun agent pathogène n'était identifié. Elles ne pouvaient être rattachées ni au virus A ni au virus B. Pendant de nombreuses années, toutes les tentatives d’identification utilisant les techniques conventionnelles de recherche des virus (culture, recherche d’effet cytopathogène, microscopie électronique) se sont soldées par des échecs. L’utilisation des techniques modernes de la biologie moléculaire a permis l’identification du virus C (Choo et al, 1989) responsable des hépatites NANB à transmission parentérale. En effet, la production d'une protéine virale PS5 (NS3/NS4a serine protéase) obtenue par recombinaison génétique à partir d'un chimpanzé préalablement inoculé a permis à la firme << Chiron >> de mettre au point un test pour la détection des anticorps sériques (Choo et al, 1989). Des contrôles d’hybridation ont permis d’affirmer que ces anticorps étaient dirigés contre une protéine codée par une autre partie du génome du virus de l’hépatite NANB à transmission parentérale désormais appelée virus de l'hépatite C. II.2.1.1. Caractéristiques du virus de l’hépatite C C'est un virus à ARN de 50-60 nm de diamètre, enveloppé, très résistant à la chaleur dont le génome est hautement variable. Il survit au moins deux jours à l’air libre. Son poids moléculaire est voisin de 4.106 Da avec une densité de 1,09 à 1,11 en gradient de saccharose. Par ses caractéristiques, il est apparenté à la famille des Flaviviridae dont les membres les plus connus sont les virus de la fièvre jaune et de la dengue (type 2). L’hépatite virale C, représente jusqu’à 85% de tous les cas d’hépatites posttransfusionnelles, et ne se propage, apparemment que par voie parentérale à partir de donneurs atteints de formes subcliniques de l’infection. II.2.1.2. Organisation génomique. Le VHC contient un ARN simple brin de polarité positive d’environ 9400 nucléotides. Le génome du virus peut être subdivisé schématiquement en 3 régions (région 5’ non © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 30 codante, région correspondant au précurseur polypeptidique et la région 3’ non-codante). La région 5’ non-codante mesure environ 329 à 341 nucléotides et contient les séquences les plus conservées qui jouent un rôle majeur dans la réplication du génome et la synthèse des protéines. En aval de la région 5', est situé le plus grand cadre de lecture ouvert contenant 9379 nucléotides. Cette région comporte : des gènes de structure : Le gène C code pour la protéine C (capside), qui est composée de 114 acides aminés avec une masse moléculaire de 13 000 Da et pourrait se lier à l’ARN génomique. Les gènes E1 et E2/NS1 codent pour les protéines d'enveloppe ; la protéine E comprendrait 198 acides aminés et aurait une masse moléculaire de 21 400 Da. Sa portion C terminale pourrait interagir avec la membrane de la cellule hôte. Les gènes non structuraux codent pour les protéines non structurales (NS2…NS5) : Le gène NS2 code pour une protéine très hydrophobe dont la fonction est Inconnue ; elle serait souvent trouvée associer aux membranes cellulaires. Le gène NS3 code pour la protéine NS3 ; celle-ci contient une hélicase qui interviendrait dans la réplication de l'ARN génomique et une protéase qui serait impliquée dans la fabrication des protéines non structurales à partir des polypeptides précurseurs. La protéine NS4 est très hydrophobe et serait liée à la membrane. Le gène NS5 coderait pour plusieurs fonctions pour la plupart inconnues en dehors d'une ARN polymérase ARN dépendante. C’est surtout dans la région 3' que le virus C présente des homologies de lecture avec les Flaviviridae notamment pour la région NS3 et NS5. En revanche, la région structurale 5' paraît très différente. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 31 Figure 4 : a. Structure du virus de l’hépatite C (VHC) ; b. Gènes de structure et organisation génomique du VHC. II.2.1.3-Réplication du VHC et variabilité virale Le VHC est difficile à cultiver mais quelques clones qui se répliquent in vitro ont été décrits par plusieurs études (Bartosch et al, 2003 ; Drummer et al, 2003 ; Hsu et al, 2003). Les systèmes de réplications in vitro du VHC ont été longuement présentés dans la minireview de Von Hahn et Rice (2008). Toutefois, des analogies avec d’autres virus à RNA permettent d’établir l’hypothèse suivante. Le VHC pénètre dans la cellule après s’être lié avec un récepteur de surface cellulaire. Dans ce cas, il semblerait que la protéine de l’enveloppe virale E2 se lie spécifiquement aux 7 protéines CD81, molécule de surface cellulaire largement exprimée à la surface des cellules de nombreux organes, dont le foie. Une fois lié, le virus est inclus par endocytose dans un endosome, à l’intérieur duquel le pH acide entraîne une altération © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 32 des protéines de l’enveloppe, responsable d’une fusion avec la membrane endosomiale. Le RNA viral est ainsi relâché dans le cytoplasme, jouant le rôle de RNA messager pour la réplication virale, cette dernière s’effectuant en association avec le réticulum endoplasmique à l’intérieur duquel la synthèse de la polyprotéine d'abord, et, ensuite, ses différents clivages protéolytiques décrits plus haut sont effectués. L'expression de la réplicase (codée par la région NS5B) permet la transcription de l'ARN génomique dans son complément (le brin négatif), de longueur unitaire, à partir duquel de nombreuses copies de l’ARN génomique seront synthétisées par le même enzyme viral. Ces multiples copies d'ARN viral génomique sont ensuite encapsidées et assemblées dans des nouvelles particules virales, libérées à l’intérieur de vésicules sécrétoires. Un grand nombre de variantes virales peut être retrouvé dans le plasma et dans le foie d’un seul et unique individu infecté, à chaque moment donné. Le VHC existe donc chez cet individu, comme pour la plupart des virus à ARN, sous forme de multiples variantes virales, dont l'ensemble est appelé "quasi-espèce"(Kato et al, 1994 ; Pawlotsky et al, 1999 ; Okuda et al, 1999 ; Löve et al, 2004) ne différant parfois les unes des autres que par un nucléotide sur l’ensemble du génome. Durant la réplication, les mutations du génome viral se font au hasard et la viabilité de ces nouvelles populations dépendra de la localisation de la mutation. En effet, une altération de la structure des protéines virales ou du RNA peut affecter la réplication virale et donc la transmission de l’information génétique aux molécules "filles". Il y aura donc des variantes majoritaires bien adaptées aux facteurs extérieurs (système immunitaire, facteurs intracellulaires, etc) et des variantes minoritaires plus ou moins défavorisées. Par exemple, une souche virale qui possède une mutation au sein du segment hypervariable (HVR-1) de la protéine de l’enveloppe E2, sera favorisée en terme de survie à l’intérieur de l’hôte, car cette mutation évite la liaison d’anticorps neutralisant préexistant, dirigés contre les protéines de l’enveloppe. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 33 A. Figure 5 : (A) Cycle de vie du VHC Attachement, internalisation, décapsidation, synthèse protéique/réplication, assemblage et libération des virions (Stephen J. Polyak, Université de Washington, www.document) (B) La protéine de capside du VHC entraine l’assemblage de gouttelettes lipidiques (LD). Les gouttelettes lipidiques se fixent à la capside puis au NS5a et autres protéines non structurales. (Nature Cell Biology, vol 9, No 9, sept 2007) © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 34 B. II.2.1.4. Le génotype viral En plus de la grande variabilité virale retrouvée au sein d’un même individu, il existe également une importante hétérogénéité génétique à travers une population d’individus. Une évaluation phylogénique, effectuée à travers de nombreuses zones géographiques, suggère la présence de 6 principaux génotypes numérotés de 1 à 6 (Simmonds et al, 1993). A l’intérieur même d’un génotype, une souche virale peut être regroupée en soustypes, lesquels ont en commun 75% à 85% de leurs séquences nucléotidiques. Les différents sous types identifiés par des lettres minuscules (environ 80 sous-types). La distribution des génotypes et des sous génotypes du VHC est variable selon les régions du globe et peut être utilisée comme marqueur épidémiologique de l'hépatite C. Les génotypes 1 à 3 ont une distribution mondiale (Simmonds, 1995), alors que les génotypes 5 et 6 sont communs aux pays d’Asie du Sud-est et à l’Afrique du Sud (PrabdialSing et al, 2011; Pybus et al, 2009). Le génotype 4 est prédominant en Afrique centrale (Ndong-Atome et al, 2008; Cantaloube et al, 2008) et septentrionale (Kamal, 2011; Antaki et al, 2010). Il a été montré une prédominance des géntoypes 1 et 2 en Afrique de l’Ouest et notamment au Burkina Faso (Jeannel et al, 1998; Candotti et al, 2003). Les génotypes du VHC seraient associés à certains modes de transmission. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Le génotype 1b serait Page 35 associé à la transfusion sanguine (Keskin et al, 2010) alors que les génotypes 1a et 3a seraient associés à la toxicomanie intraveineuse (Elasifer et al, 2010). Figure 6 : Arbre phylogénétique représentant les différents génotypes et sous-types du VHC et dérivé de l’analyse des séquences d’une partie de la région NS5B La longueur des branches est proportionnelle à la distance génétique. Les amplicons sont issus de sérums de patients donneurs de sang chroniquement infectés par le VHC de provenance géographiques diverses. Les six groupes numérotés de 1 à 6 correspondent à la classification actuelle. Chaque génotype, à l’exception du génotype 5, est subdivisé en de nombreux sous-types indiqués en lettres minuscules. Certaines souches sont numérotées de 7 à 11 : elles ont été classées lors de leur découverte comme de nouveaux génotypes mais ont été regroupées par la suite avec les génotypes 3 et 6. D’après Simmonds (J. Hepatol, 1999). © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 36 II.2.1.5. Répartition géographique Depuis la mise au point des moyens de dépistage du VHC, des études prospectives et même rétrospectives ont permis d’étudier le virus dans l’espace (Esteba et al, 1999 ; Kew et al, 1990). On sait aujourd’hui que le virus est ubiquitaire, (présent dans tous les continents) avec cependant une prédominance dans certains pays industrialisés comme le Japon (16%) (Snon et al, 1992).Ceci s’expliquerait par les habitudes de la modernité qui favoriseraient la propagation du virus dans la population : toxicomanie à la seringue, dialyse, greffes d’organes et transfusion. Environ 170 millions de personnes (3%) dans le monde sont infectées par le VHC (SIDA infos services). Au début des années 2000, il y avait environ 4 millions de porteurs chroniques aux Etats unis (Alter et al, 1999). En Europe, la proportion de sujets atteints varie de 0,5 à 2% en fonction des pays avec un gradient Nord-Sud. En Europe de l’Ouest, 5 millions de personnes sont touchées. En Europe de l’Est, certains pays sont particulièrement touchés jusqu’à 3 à 4% (OMS, 2000). L’infection est chronique chez 80% des personnes infectées. En Afrique les prévalences du VHC confirmées par l’utilisation des tests NAT ont permis de mettre en évidence des prévalences 5 fois inférieures à celles décrites par les tests sérologiques usuels. Par conséquent les prévalences confirmées du VHC se situent autour de 1% (Candotti et al, 2003 ; Vardas et al, 1999 ; Ampofo et al, 2002 ; Zeba et al, 2012). L’Egypte apparaît comme ayant la haute prévalence : les anticorps Anti-VHC ont été retrouvés chez 22% des nouvelles recrues de l’armée et chez 16,4 % des enfants avec hépatomégalie (Abdoul et al, 1994). Ces prévalences élevées du VHC en Egypte seraient associées aux traitements anti schistosomiases dispensés avec du matériel mal stérilisé (Frank et al, 2000). © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 37 Figure 7 : Répartition de l'infection par le VHC dans le monde (OMS, 1997) II.2.2. L’hépatite B (VHB) L'hépatite B est une hépatite virale due à une infection par le virus de l'hépatite B (VHB) et entrainant une inflammation du foie. Les symptômes de la maladie aiguë sont essentiellement une inflammation du foie, avec ou sans ictère et des troubles digestifs avec nausées et vomissements. A ce stade l’évolution est souvent bénigne même si l’hépatite B est la forme la plus grave des hépatites virales, il existe aussi des formes fulminantes rares à évolution mortelle. L'infection passe souvent inaperçue lors de l'infection aigue et chez le patient porteur du virus. Dans près d'un cas sur dix, et chez 90% des enfants infectés par leurs mères, l'hépatite B aiguë ne guérit pas et devient une infection chronique. Le porteur chronique n'a pas de symptôme apparent mais est susceptible de contaminer son entourage. En cas d'hépatite chronique active, les symptômes peuvent être une fièvre modérée, une grande fatigue, des troubles digestifs (nausées, vomissements, douleurs abdominales), une jaunisse, des urines foncées ou des selles décolorées. La Cirrhose du foie et le cancer du foie peuvent être la conséquence d’une Hépatite B. La gravité potentielle de l’hépatite B est constituée par le risque d’évolution vers une hépatite chronique B qui peut se compliquer d’une cirrhose du foie © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 38 et d’un cancer du foie, une maladie mortelle avec un taux de réponse très faible à la chimiothérapie actuelle. La transmission du virus se fait par l'intermédiaire des liquides et sécrétions biologiques. Les principaux modes de transmission sont les rapports sexuels, les injections chez les toxicomanes, les transfusions sanguines à risque, la transmission de la mère à l'enfant lors de l'accouchement et le contact étroit avec une personne infectée et particulièrement le contact entre petits enfants en Afrique. Une fois dans le sang, le virus atteint le foie et se multiplie dans ses cellules, les hépatocytes. Le système immunitaire détruit les cellules infectées, entrainant une inflammation du foie. II.2.2.1. Génome du virus de l’hépatite B (VHB) Le génome VHB (Figure 8) se présente sous la forme d’un ADN court circulaire partiellement bicaténaire de 3.2 kb (Robinson et al, 1974; Summers et al, 1975). Cette conformation circulaire est liée à la présence d’extrémités 5’ cohésives. (Sattler et Robinson, 1979). Le traitement de l’ADN à la nucléase S1, qui dégrade les extrémités monocaténaires, fait disparaître cette structure au profit d’une conformation linéaire. Les deux brins de l’ADN génomique ne sont pas symétriques. Le brin (-) est de longueur unitaire et lié de façon covalente à une protéine, la polymérase virale (Ganem et al, 1982; Gerlich et Robinson, 1980; Molnar-Kimber et al, 1983 ; Bartenschlager et Schaller, 1988). L’existence de ce lien a été démontrée indirectement par l’extraction organique d’un complexe ADN-protéine. Le traitement de ce complexe avec de la protéinase K avant l’extraction rendait l’ADN indétectable dans la phase organique. De plus, la migration sur gel d’électrophorèse de l’ADN avant traitement à la protéinase K était plus courte après digestion. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 39 Figure 8 : Organisation du génome du virus de l’hépatite B (Blanchet ,2007) Les trois quarts du génome sont impliqués dans deux ORF (Open reading frame), dans des phases de lecture différentes. Les ORF sont au nombre de quatre sur le génome et sont portées par le brin (+). Ils codent pour les protéines d’enveloppe, l’antigène du core (AgHBc), l’antigène e (AgHBe), la polymérase virale, et la protéine X (HBx). La plus grande ORF est celle codant pour la polymérase virale, présente à l’extrémité 5’ du brin (-) du génome (Bartenschlager et Schaller, 1988; Bosch et al, 1988). L’ORF preC/C possède deux codons d’initiations. Le plus interne sert à la synthèse de l’AgHBc (Pasek et al, 1979). Celui situé en amont permet la synthèse de l’AgHBe (Takahashi et al, 1980; Will et al, 1987) qui est un marqueur de la réplication virale (Rigg et Schaller, 1992). L’ORF X code pour l’HBx, une protéine de régulation complexe requise pour l’infection in vivo, et qui module l’expression de gènes viraux et cellulaires (Rossner, 1992). Cette protéine est également impliquée dans la pathogenèse liée au VHB (Bouchard et Schneider, 2004). L’ORF pre-S/S, code pour les protéines d’enveloppe et chevauche l’ORF P dans la phase +1 (Valenzuela et al, 1979). Les protéines d’enveloppe, nous le verrons plus tard, sont impliquées dans la morphogenèse et l’infectiosité des virions du VHB mais également des virions du virus de l’hépatite D. Comme mentionné plus haut, celles-ci sont au nombre de trois, la petite de 24 kd (S-AgHBs), la moyenne de 33 kd (M-AgHBs) (Machida et al, 1984; Persing et al, 1985; © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 40 Stibbe et Gerlich, 1983), et la grande de 39 kD (L-AgHBs). La séquence ADN codant pour les protéines d’enveloppe à été identifiée par alignement de la traduction de l’ADN du VHB avec la séquence de l’extrémité N-terminale de S-AgHBs obtenue par la technique de dégradation d’Edman (Valenzuela et al, 1979). Cet alignement a révélé que l’ORF codant pour S-AgHBs était ouverte 400 nucléotides en amont de l’AUG de S-AgHBs (AUG-S) et que cette région 5’, appelée pré-S, pouvait être divisée en deux sous-régions (pré-S1 et pré-S2), chacune possédant un codon d’initiation (AUG). Cette information sur l’organisation du génome a permis de comprendre l’origine de la présence des protéines M-AgHBs et L-AgHBs, détectées préalablement à l’aide d’anticorps anti-AgHBs (Gerin et al, 1969). Ces deux protéines sont présentes à des concentrations bien inférieures à celle de S-AgHBs dans un sérum infectieux (15% des AgHBs totaux pour M-AgHBs, 1 à 2% pour L-AgHBs). Malgré sa très faible concentration, L-AgHBs joue un rôle majeur dans la propagation du VHB. II.2.2.2. Cycle de réplication du VHB La première étape du cycle infectieux du virus commence par son attachement aux hépatocytes via la grande protéine d’enveloppe Pre-S/S (Figure 10). Le mode d’internalisation des virions reste à ce jour encore peu connu, mais il aboutit au relarguage de la capside dans le cytoplasme et à son adressage sous sa forme assemblée dans les paniers nucléaires de la cellule infectée (Rabe et al, 2003). Ces étapes d’attachement et d’entrée sont très spécifiques du tissu et de l’espèce ciblés et sont à l’origine du tropisme limité des Hepadnaviridae. La capside est démantelée dans le noyau, et l’ADN viral partiellement bicaténaire est relargué (Rabe et al, 2003) puis réparé en ADN circulaire fermé de façon covalente (ADNccc). Cet ADN est ensuite transcrit en différents ARN dont la traduction donne naissance aux composants nécessaires à l’assemblage de nouveaux virions. Ces composants sont : la polymérase virale, responsable de la synthèse de l’ADN génomique, la protéine de capside, et les protéines d’enveloppe virales. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 41 Figure 9: Arbre phylogénétique des Orthohepadnavirus (Kidd-Ljunggren et al, 2002) Les souches sont représentées par le numéro d’accession dans la base de données Genbank. Les souches appartenant aux différents génotypes du VHB (A à G) sont différenciées par des halos de couleur. Le WMVHB ne peut pas être montré à cette échelle du fait d’un éloignement phylogénétique trop important. Le plus grand des transcrits, l’ARN pré génomique, de taille supérieure à celle du génome (3.5 kb), est inclus dans les capsides lors de leur assemblage et sert de matrice à la synthèse du brin (-) du génome du VHB par transcription inverse. Le brin (+) est ensuite synthétisé à l’intérieur de la capside. Les nucléocapsides peuvent suivre deux voies différentes. Une partie d’entre elles sont réacheminées vers le noyau de manière à accroître la quantité d’ADNccc nucléaire. L’autre partie interagit avec les protéines d’enveloppe du VHB à la face cytosolique du réticulum endoplasmique (RE) et bourgeonne dans la lumière du RE sous forme de virions matures. Les virions sont ensuite sécrétés dans le milieu extracellulaire par la voie constitutive de transport vésiculaire (Ganem et Schneider, 2001). © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 42 Figure 10 : Vue d’ensemble du cycle de réplication viral VHB (adapté de Ganem et Prince, 2004) II.2.2.3. Evolution des marqueurs virologiques au cours d’une infection au VHB Les marqueurs directs spécifiques du VHB détectables dans le sérum sont les AgHBs et HBe et l’ADN viral. L’Ag HBc est indétectable dans le sérum, sa localisation étant intra hépatocytaire. Les marqueurs indirects de l’infection par le VHB sont les anticorps dirigés contre les Ag viraux, dont les Ac anti-HBs, les anti-HBc, et les Ac anti HBe. La cinétique des marqueurs virologiques détectables dans le sérum diffère selon qu’il s’agit d’une infection aiguë spontanément résolutive ou d’une infection évoluant vers une hépatite chronique. La connaissance des différents profils sérologiques permet de déterminer le stade de l’infection dans la plupart des cas. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 43 Marqueurs directs L’AgHBs L’AgHBs est le principal marqueur d’une infection actuelle par le VHB. Il est dosé dans le sérum à l’aide de tests sérologiques immunoenzymatiques de type ELISA. Le seuil de détection est de 1 à 5 ng/ml en fonction des trousses utilisées. Des réactions faussement négatives existent, du fait de mutants ou d’Ag masqués au sein de complexes. La capacité d’un test ELISA à détecter l’AgHBs dépend des epitopes cibles des Ac utilisés pour recouvrir la phase solide (Ac de capture) ou utilisés dans la phase liquide (Ac de détection). Tous les réactifs qui utilisent dans les phases solide ou liquide un seul Ac monoclonal peuvent théoriquement être mis en défaut par une mutation de la séquence cible de cet Anticorps (Gerlich, 2004 ; Coleman, 1999 ; Moerman, 2004) L’Ag HBc L’AgHBc n’est pas détecté dans le sérum par les tests ELISA classiques. En effet, il y est présent masqué au sein des particules virales et sous formes d’immuns complexes classiques du fait d’un large excès d’Ac anti-HBc. Sa détection nécessite une ultracentrifugation et une méthode d’immunocapture, mais n’est pas réalisée en pratique courante. Par ailleurs, l’AgHBc peut être mis en évidence dans les hépatocytes par immunofluorescence ou immunohistochimie. L’Ag HBe L’AgHBe est un marqueur de multiplication virale. Il est dosé dans le sérum à l’aide de tests sérologiques immunoenzymatiques de type ELISA. L’ADN du VHB L’ADN du VHB peut être quantifié dans le sérum, soit par des techniques d’hybridation moléculaire, éventuellement associées à une amplification du signal, soit par des techniques d’amplification par PCR classique ou en temps réel (Denis, 2004 ; Pawlotsky, 1997 ; 2000). Le seuil de détection des techniques d’hybridation se situe entre 1000 et 5000 copies de génome /ml de sérum, alors que les techniques les plus sensibles, qui font appel à la PCR en temps réel, ont des seuils de détection pouvant descendre à 21 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 44 copies/ml. L’OMS a établi un étalon international permettant de standardisé les tests de quantification de l’ADN du VHB (Saldanha, 2001). Le suivi régulier de la charge virale est utile pour évaluer le niveau de réplication virale et vérifier l’efficacité d’un traitement antiviral. Il est recommandé que le suivi virologique de la charge virale d’un patient soit fait si possible à l’aide du même test. En l’absence de réplication virale, L’ADN du VHB peut se maintenir sous la forme intégrée ou non dans le génome des cellules infectées ; il n’est pas détectable dans le sérum. Marqueurs indirects Ac anti-HBs Les Ac anti-HBs apparaissent progressivement au cours de l’élimination virale, 1 à 10 semaines après la disparition de l’AgHBs. Il s’agit d’Ac neutralisants. Leur apparition signe soit la résolution d’une hépatite B, soit une protection post-vaccinale. Ils sont recherchés dans le sérum par des techniques ELISA, avec un seuil de détection de 2 à 5 UI/L. Un titre d’anticorps supérieur à 10UI/L est considéré comme protecteur. Ac anti- HBc Les Ac anti-HBc apparaissent précocement dans le sérum, quelle que soit l’évolution de la maladie. Ce ne sont pas des Ac protecteurs mais seulement les témoins d’une infection par le VHB. Les Ac anti-HBc de classe IgM peuvent être spécifiquement recherchés. Leur présence dans le sérum témoigne généralement du caractère aigu de l’infection. Toutefois ils peuvent aussi être détectés, mais à des taux plus faibles, au cours de la phase de clairance immune d’une hépatite chronique (White, 2003). Ac anti-HBe L’apparition des Ac anti-HBe est généralement en faveur d’une évolution favorable. ils sont recherchés dans le sérum par des techniques ELISA. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 45 Profils sérologiques Le diagnostic de l’hépatite aigue est fondé sur la présence dans le sang des l’AgHBs et des Ac anti-HBc de type IgM dans un contexte cytolytique hépatique. L’AgHBs est le premier marqueur détecté dans le sérum, il apparait pendant la période d’incubation, en moyenne de deux semaines à trois mois après le contage. Cette phase d’incubation correspond à la fenêtre immunologique silencieuse dont la durée est estimée à 56 jours et pendant laquelle le VHB est indétectable par les tests sérologiques classiques. Les Ac anti-HBc totaux apparaissent 2 à 4 semaines après l’AgHBs, pendant la phase aigue de la maladie. L’AgHBe apparait peu de temps après l’AgHBs puis disparait rapidement (sa persistance au-delà de 3 semaines après début des manifestations cliniques serait un indicateur de passage à la chronicité). Lors de la phase aigue de l’hépatite, environ 1013 virions sont produits par jour et la charge virale peut atteindre 1010 copies de génome/ml de sérum. La recherche de ces deux marqueurs de multiplication virale n’est pas utile au cours de l’hépatite aigue. Figure 11 : Evolution des marqueurs sérologiques au cours de l’infection au VHB (http://t2.gstatic.com/images) © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 46 Convalescence d’hépatite B aiguë Dans le cas d’une hépatite B aigue spontanément résolutive, l’AgHBs persiste pendant 1 à 4 mois, puis disparait plusieurs semaines après normalisation des ALAT. Les IgM anti-HBc disparaissent ensuite. On note aussi une séroconversion dans le système HBe et le niveau d’ADN du VHB décroit progressivement jusqu'à devenir indétectable. Les Ac anti- HBs apparaissent 2 à 8 semaines après la disparition de l’Ag HBs. Pendant la fenêtre sérologique entre la disparition de l’AgHBs et l’apparition des Ac anti-HBs, les Ac anti-HBc peuvent apparaitre isolement positifs. Le profil classique à distance d’une hépatite résolue associe la présence des Ac anti-HBs et des Ac anti-HBc. Hépatite fulminante due au VHB La survenue d’une hépatite fulminante, lors d’une hépatite B aigue est marquée par la présence d’IgM anti-HBc à des titres élevés. En revanche, les autres marqueurs (Ag HBs, Ag HBe, Ac anti-HBs et ADN du VHB) sont inconstamment retrouvés dans le sérum. II.2.2.4 Epidémiologie et répartition géographique du virus de l’hépatite B (VHB) L'hépatite B est l'une des maladies humaines les plus fréquentes. Selon l'Organisation mondiale de la santé (OMS) il y aurait 350 millions de porteurs du virus dans le monde. Sa répartition s'explique par son mode de transmission et l'efficacité de la réduction des risques est variable suivant le niveau socio-économique du pays. La proportion de la population mondiale actuellement infectée par le virus est estimée, suivant les différentes évaluations entre 3 et 6%, mais jusqu'à un tiers de la population a déjà été exposé au virus. En 2005, environ 2 milliards de personnes étaient infectés avec plus de 350 millions de porteurs chroniques pouvant transmettre le virus pendant des années. Ces porteurs chroniques ont un risque élevé de décéder des suites d'une cirrhose du foie ou d'un cancer du foie, ces deux maladies faisant environ un million de morts chaque année. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 47 Figure 12: Répartition géographique du risque de contamination par l'hépatite B en 2005(www.wikipedia.org/wiki/Fichier.HBV_prevalence_2005.svg) Haute : prévalence supérieure à 8 %. Moyenne : entre 2 et 7 %. Basse : inférieure à 2 %. Epidémiologie de l’hépatite B au Burkina Faso Le Burkina Faso est situé dans une zone caractérisée par de fortes prévalences au VHB. Dans certaines régions du pays les prévalences atteignent 20%. Des études ont montré des prévalences de l’AgHBs située entre 7,9 et 12,1% respectivement chez les professionnelles de la santé à Nanoro et chez les femmes enceintes des grandes villes de Ouagadougou et de Bobo-Dioulasso (Pietra, 2008; Ilboudo et al, 2007; Nacro et al, 2000 ; Simpore et al, 2006). Chez les donneurs de sang , des prévalences de 14,3% et 17% ont été observées dans la zone rurale de Nouna et dans la ville de Ouagadougou (Collenberg et al, 2006). Dans ces deux zones, les mêmes auteurs ont rapporté des prévalences en Ac anti HBc de 69,6 % et de 76,4 % en zone rurale et urbaine. Ces prévalences sont supérieures à celle de 49,0% trouvée par Pietra et al. (2008). Les modes de vie des différentes communautés vivants au Burkina Faso pourraient expliquer les fortes prévalences trouvées (Animisme, circoncision, tatouages ethniques et vie communautaire). L’augmentation de la prévalence des marqueurs du VHB avec l’âge © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 48 peut s’expliquer avec le cumul des risques de contact avec le virus par transmission parentérale et sexuelle au cours de la vie adulte. Peu d’études se sont intéressées aux génotypes du VHB en circulation au Burkina Faso. Une seule a montré la prédominance du génotype E au Burkina Faso (Mulders et al, 2004). Ce génotype est aussi le plus prévalent en Afrique subsaharienne et dans la région ouest africaine (Candotti et al, 2007 ; Huy et al, 2006 ; Fujiwara et al, 2005). II.2.3. Facteur delta : agent de l'hépatite D L'agent de l'hépatite D est un virus défectif à ARN c’est-à-dire dépendant du virus B pour sa réplication et son expression. L'agent delta survient par coïnfection avec le VHB ou alors par surinfection d'un porteur du VHB. Ce nouveau virus est proche des viroïdes des plantes, c’est le plus petit virus humain identifié à ce jour. Le virus Delta est endémique dans certaines populations et notamment dans les forêts équatoriales de l’Afrique Centrale et de l’Amazonie au Brésil où il est responsable d’épidémies d’hépatites fulminantes. Il s’est également disséminé via la toxicomanie en Europe de l’Est et dans les pays occidentaux. L'agent delta, tout en diminuant la réplication du VHB, aggrave considérablement la maladie hépatique avec des formes fulminantes et de manière beaucoup plus fréquente une accélération de la fibrose hépatique et la survenue de cirrhoses et de carcinome hépatocellulaire. La détection de l'ARN delta permet de dépister les infections actives. L'hépatite D est en quelque sorte une surinfection d’un patient porteur chronique du VHB ou d’une co-infection au cours d’une hépatite aigüe. Cette maladie est négligée en raison de son faible impact dans les pays développés et il n’existe aucun vaccin. L'hépatite delta ne fait qu'incrémenter l'effet destructeur de l'hépatite B. Son temps d'incubation est donc le même que celui du virus dont elle dépend. Le facteur Delta se transmet de la même manière que l'hépatite B, par piqûre, transfusion, tatouage, piercing et contact sexuel non protégé. Les porteurs de l'hépatite B ainsi que les personnes souffrant d'une hépatite fulminante sont particulièrement sensibles au facteur delta. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 49 II.2.4. Le virus de l'hépatite A (VHA) Le virus de l'hépatite A (VHA) est un virus à ARN appartenant à la famille des Picornaviridae. C'est un virus nu (non enveloppé), donc très résistant dans le milieu extérieur et aux agressions physico-chimiques. Il se transmet par voie digestive orofécale soit directe (manuportée) soit indirectement par l'eau souillée, contaminée par des selles infectées par le virus d'où une plus forte incidence dans les pays où les réseaux d'eau potable et les stations d'épuration sont de qualité insuffisante. L’hépatite A est une importante maladie infectieuse qui peut être prévenue par la vaccination. Les éclosions d'hépatite A sont étroitement liées à la consommation d'eau contaminée par le VHA. Les contacts familiaux ou sexuels avec une personne infectée et les voyages dans les pays où l'hépatite A est endémique augmentent le risque de contracter la maladie. Parmi les cas d'infection, environ 70 % des adultes et 30 % des jeunes enfants présentent des symptômes cliniques tels que la fièvre, un malaise et la jaunisse. Le stade aigu de la maladie dure habituellement plusieurs semaines et il n'existe pas de porteur chronique du VHA. La transmission du VHA par transfusion sanguine n'a pas encore été démontrée; cependant, le VHA peut être transmis par l'injection de produits sanguins à des hémophiles. Comme on utilise des mélanges de plasma venant de donneurs multiples pour préparer les produits sanguins, et comme les solvants-détergents servant à l'inactivation virale ne sont pas efficaces contre le VHA, le risque de transmission du VHA par les produits sanguins, aussi faible soit-il, existe tout de même. Au Burkina Faso, les unités de sang ne sont pas systématiquement soumises à des tests de dépistage des anticorps anti-VHA. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 50 Figure 13: Répartition géographique du risque de contamination par l'hépatite A en 2005 : www.wikipedia.org/wiki/Fichier.HBA_prevalence_2005.svg) Haute : prévalence supérieure à 8 %. Moyenne : entre 2 et 7 %. Basse : inférieure à 2 %. II.3. Le virus de l'immunodéficience humaine acquise (VIH/SIDA) L'infection par les virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1 et 2) et le syndrome d'immunodéficience acquis (SIDA) causé par le VIH constituent d'importants problèmes de santé publique dans le monde et principalement en Afrique subsaharienne. En 2007, la prévalence du VIH (1 et 2) dans la population Burkinabé était de 1,7% (Collenberg et al, 2006). Des études ont montré des séroprévalences avoisinant 2% chez les donneurs de sang de premier don des centres de transfusion du pays (Nagalo et al, 2011).L'infection par le VIH cause une vaste gamme de maladies et son évolution clinique varie beaucoup, allant de symptômes grippaux bénins au sida, syndrome potentiellement mortel qui constitue le dernier stade de l'infection par le VIH. Le VIH est transmis par les contacts sexuels, le partage d'aiguilles ou de seringues contaminées, les transfusions de constituants sanguins et l'exposition nosocomiale à du sang ou à des liquides organiques contaminés. Il peut également être transmis de façon verticale de la mère à l'enfant. Parmi les facteurs qui peuvent contribuer à la transmission du VIH par transfusion sanguine, notons la période de latence sérologique (courte période virémique durant laquelle le donneur, à un stade très précoce de l'infection, obtient © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 51 souvent un résultat négatif à un test de sélection des donneurs), la mauvaise sélection des donneurs et les erreurs de diagnostic au laboratoire (problème de contrôle de qualité de la plupart des laboratoires en Afrique subsaharienne). Cependant, l’une des principales sources d’infections par transfusion sanguine demeure toutefois le sang recueilli durant la période de latence sérologique du donneur. Les techniques de laboratoire telles que les tests sérologiques détectant à la fois le VIH-1 et le VIH-2, le test de dépistage associant l'antigène p24 contre le VIH-1 et le test d'acide nucléique pour le VIH (PCR du VIH-1) ont considérablement réduit la période de latence sérologique. Cette période, qui était de 42 jours dans les années 80, alors qu'on avait recours au titrage des anticorps, n'est plus que de 15 jours avec le test de dépistage de l'antigène p24 contre le VIH-1/2 et de 11 jours avec le dépistage génomique viral (DGV). En Afrique du sud, le risque de transmission du VIH par transfusion sanguine était estimé à 1 pour 45.765 000 dons entre 2005 et 2009 (Vermeulen et al, 2009). Au Kenya il a été montré que le risque était de zéro pour 12.435 dons avec le test de dépistage de l'antigène p24 contre le VIH-1 (Basavaraju et al, 2010). L’introduction du DGV a permis une réduction drastique du risque résiduel de la transmission du VIH-1 et du VHC en Afrique du sud (Fang et al, 2003). II.3.1. Caractéristiques virologiques du VIH Le VIH est un virus à ARN enveloppé qui possède, une nucléocapside dense excentrée quelquefois en forme de trapèze ou de barreau. En microscopie électronique, les deux virus (VIH-1 et VIH-2) présentent une morphologie similaire. La nucléocapside est constituée par des protéines internes du virus, la transcriptase inverse et de l’ARN viral. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 52 Figure 14 : Structure du VIH (http://www.museum-grenoble.fr) II.3.2. Génome et propriété structurale du VIH Le génome du VIH est constitué uniquement de deux molécules d’ARN monocaténaires de 9,2 kb et de polarité positive, disposant à chaque extrémité d’une région R identique, indispensable à la transcription inverse. Les ARN génomiques viraux ont une structure d’ARNm (ils possèdent une coiffe en 5’ et sont polyadénylés en 3’). Il contient dans sa capside des enzymes, la transcriptase inverse, l’intégrase, la protéase et la ribonucléase ainsi que deux (2) molécules d’ARN identiques (enveloppées par la nucléocapside). Le noyau viral est entouré d’une coquille de forme conique appelée p24, qui est la protéine centrale majeure et est identique pour le VIH-1 et le VIH-2. Cet ensemble constitue la capside qui est recouverte par deux enveloppes : la coquille protéique ou p17 et la bicouche lipidique traversée par des protéines membranaires (gp 41 attachées à la matrice p17 et aux gp120) qui font saillie à la surface de la particule virale. Ce sont ces saillies et ces protéines d’enveloppe qui différencient le VIH-1 du VIH-2. Les protéines correspondantes du VIH-2 sont les gp110/130 et gp36. Comme tous les rétrovirus, les VIH-1 et VIH-2 sont produits par bourgeonnement à la surface des cellules infectées. Les VIH-1 et 2 se différencient par les gènes vpu et vpx. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 53 La structure du virus. La structure du VIH comprend de l’intérieur vers l’extérieur : Une enveloppe constituée de glycoprotéines gp120, gp41 et d’une double couche de phospholipides; Une matrice formée de glycoprotéines gp17; Une capside constituée de glycoprotéines gp24. Le virus possède trois gènes codants pour les différentes protéines virales: Gag (groupe antigène) qui code pour des protéines de la capside, Pol (polymérase) qui code pour des enzymes nécessaires à sa réplication, Env (enveloppe) qui code pour des glycoprotéines. Les gènes gag, pol, env sont régulés par des séquences terminales répétitives Long Terminal Repeat (LTR) qui sont crées lorsque la transcriptase reverse synthétise l’ADN proviral. Figure 15 : Représentation schématique du génome du VIH-1 (Peterlin et Trono, 2003) © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 54 II.3.3. Variabilité génétique des VIH L’organisation génétique des VIH-1, VIH-2 et du SIV est similaire. Cependant, on note l’absence du gène vpu au sein du génome des VIH-2 et SIV, et la présence d’un autre gène vpx. De plus l’analyse comparative précise de chaque élément génétique de ces virus a montré que le VIH-2 était proche du SIV macaque et du SIV mangabé qu’il ne l’était du VIH-1 et de son homologue chez le chimpanzé SIV cpz (Barre-Sinoussi, 1996). La structure antigénique du VIH-2 montre par rapport au VIH-1 des différences au niveau des glycoprotéines d'enveloppe, des protéines du core et de la polymérase. Cependant les homologies entre les protéines du core (p25, p18 et p55, p40 pour le VIH-1 et p26, p16 et peut-être p55 pour le VIH-2) sont suffisantes pour qu'existent des réactions croisées avec des réponses positives inconstantes par ELISA. En revanche, il n'a pas été trouvé de réactions croisées entre les glycoprotéines d'enveloppe (gp110/120 et gp41 pour le VIH1 ; gp130/140 et gp105 pour le VIH-2). Le génome du VIH-2 est sensiblement plus long que celui du VIH-1 (9600 protéines pour le VIH-2, contre 9200 pour le VIH-1 en ce qui concerne l’ARN) (Barre-Sinoussi, 2001). Ces variations sont prédominantes dans certaines régions du génome viral tel que le gène env. C’est le cas du domaine V3 de l’enveloppe du VIH-1 qui possède d’importantes fonctions biologiques et immunologique. Figure 16 : Phylogénie des différents types et sous types du VIH (wikipedia.org/wiki/Fichier:HIV-SIV-phylogenetic-tree.svg © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 55 II.3.4. Infectiosité du VIH Un contact infectieux avec le VIH se produit généralement au niveau des muqueuses gastro-intestinales ou génitales. Quoique les corécepteurs CXCR4 et CCR5 sont utilisés par le VIH pour infecter une cellule, les virus utilisent presque exclusivement le récepteur CCR5 lors de l’infection primaire (Leonard et Roy, 2006). Au fil de la progression de la maladie, l’utilisation du récepteur CXCR4 par les souches virales s’observe chez environ la moitié des individus (Wilkin et al, 2007). Or, la muqueuse gastro-intestinale est le plus grand organe lymphoïde du corps humain et environ 70% de la population de lymphocytes s’y trouve (Vossenkamper, 2011; Macdonald et al, 2011). Ces cellules expriment fortement CD4, CCR5 ainsi que les marqueurs d’activation HLA-DR et CD69 et sont donc très susceptibles à l’infection par le VIH (Biancotto et al, 2008; Dai et al, 2009). Ce sont les cellules de la muqueuse gastro-intestinale qui sont généralement les toutes premières cellules qui vont rencontrer les virus transmis. Il va s’ensuivre une infection massive et une réplication virale importante et, plus de 50% des cellules exprimant CD4 et CCR5 seront infectées et détruites dans les deux à trois premières semaines suivant l’infection. D’autres populations cellulaires sont présentes dans les muqueuses et sont susceptibles à l’infection. C’est le cas des cellules de Langerhans, qui sont des cellules dendritiques cutanées. Ces cellules sont très nombreuses dans les muqueuses cervicales et vaginales et expriment un fort niveau de récepteurs CD4 et de CCR5 (Hladik et McElrath, 2008). Les cellules dendritiques, quant à elles, sont des cellules présentatrices d’antigènes et le VIH peut s’y attacher via le récepteur cellulaire DC-SIGN (CD209) (Izquierdo-Useros et al, 2007). Les cellules dendritiques sont de grandes voyageuses de par leurs fonctions de présentation d’antigène et, vont malencontreusement propager l’infection vers d’autres organes lymphatiques comme les ganglions lymphatiques, le thymus et la rate. Suite à cette dissémination virale, la virémie devient alors très importante au niveau sanguin et le sujet infecté est fortement contagieux. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 56 Figure 17 : Cycle de réplication du VIH (www.wikipedia.fr) II.3.5. Phase clinique de l’infection au VIH Une étude récente chez les patients en primo-infection a révélée que les premières semaines suivant l’infection peuvent être réparties en phases cliniques qui sont définies par une augmentation progressive de la spécificité des tests de diagnostic pour la détection d’anticorps et d’antigènes dirigés contre le VIH-1 (Fiebig et al, 2003). La période qui sépare l'infection et la première détection de l'ARN viral dans le plasma est appelée phase éclipse (fenêtre silencieuse). La charge virale plasmatique augmente de manière exponentielle pour culminer entre le 21e et le 28e jour après l’infection. Puis Elle est suivie d’une lente diminution des taux plasmatiques d’ARN viral. La mise en évidence des anticorps et des antigènes du VIH-1 se fait par des tests spécifiques. L’ARN viral peut être mis en évidence dans les sérums des patients à partir du 10e jour de l’infection, en deçà l’ARN est indétectable. L’antigène p24 peut être mis en évidence par ELISA à partir du 15e jour suivant l’infection. Les anticorps dirigés contre le VIH-1 sont détectés par ELISA à partir du 20e © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 57 jour suivant l’infection. La détection des anticorps anti-VIH-1 par western-blot n’est pas très spécifique pendant les 3 premières semaines suivant l’infection, elle le devient à partir de la 4e semaine. Figure 18 : Détection des anticorps et antigène pendant la phase aigüe du VIH-1(Adapté de McMichael et al, 2010) II.3.6. Le VIH/SIDA dans le monde On estimait à 4,9 millions (fourchette : 4,3-6,6 millions) le nombre de personnes nouvellement infectées par le VIH en 2005 (10 personnes par minute), soit l’équivalent à l’année 2004. Cela reste néanmoins supérieur aux années précédentes. Parmi 14.000 nouveaux cas par jour, plus de 95% sont dans des pays à faibles et moyens revenus et sur les 12.000 cas apparaissant chez les adultes (15-49 ans), 50% environ sont chez les 15-24 ans (ONUSIDA, 2005). Aujourd’hui, ce sont environ 40,3 millions (fourchette : 36,7-45,3 millions) qui vivent avec le VIH, ce qui représente 1,2% de la population mondiale âgée de 15 à 49 ans. Comme le montre la figure 18, la répartition mondiale est la suivante : © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 58 25,8 millions en Afrique subsaharienne 8,3 millions en Asie 1,8 million en Amérique Latine 1,9 million en Amérique du Nord, Europe Occidentale et Centrale 1,6 million en Europe orientale et Asie centrale 510.000 en Afrique du Nord et Moyen-Orient 300.000 dans les Caraïbes 74.000 en Océanie. Figure 19 : Répartition mondiale à la fin 2005 des adultes et des enfants vivant avec le VIH (ONUSIDA/OMS, 2005) II.3.7. Épidémiologie du VIH/SIDA et des IST au Burkina Faso Au Burkina Faso le SIDA est une préoccupation nationale et dès 1986 un comité national de lutte contre le SIDA (CNLS/IST) à été mis en place pour combattre l’expansion de l’épidémie à VIH au sein de la population. En fin 1998, le Burkina Faso a notifié 13.518 cas de SIDA. En raison du faible accès aux services de santé, des difficultés de diagnostic et de © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 59 la sous-notification générale, ces cas de SIDA reflètent mal l’ampleur de l’épidémie à VIH dans le pays (SANOU, 1999). Selon le rapport ONUSIDA 2008, la prévalence moyenne de l’infection à VIH dans la population adulte burkinabé était de 1,6% en fin 2007, dans un intervalle (1,4-1,9), estimation faite à partir des logiciels EPP (Epidemiologic Projection Package) et le Spectrum recommandés par l’OMS et l’ONUSIDA et utilisé par la plupart des pays. L’estimation de la population du Burkina Faso en 2010 était de 15.730.977 habitants (INSD, 2010). Les autres données se présentent comme suit : • 130.000 personnes vivant avec le VIH ; • 120.000 adultes vivant avec le VIH, dont 61 000 sont des femmes ; • 9.000 décès dus au SIDA ; • 100.000 enfants estimés orphelins du fait du SIDA en 2007 au Burkina Faso. Toujours selon ce rapport, les données indiquent un changement en faveur de comportement propres à limiter la propagation du VIH. Le recours au préservatif au cours des rapports sexuels avec un partenaire occasionnel a beaucoup augmenté chez les femmes passant de 39% à 53% entre 1998-1999 et 2003. Tableau I : Cas de VIH par tranche d’âge en 2007 comparées aux données de 2008 (Source PNM 2008 du CNLS-IST, 2008) Tranche d’âge 2006 2007 Cas %* Cas % Moins d’1 an 41 0,8 44 0,7 1-4 ans 51 1 73 1,0 5-14 ans 58 1,1 91 1,3 15 ans et plus Total 4994 97,1 6804 97,0 5144 100 7012 100 *Pourcentage obtenu en divisant le total par tranche d’âge sur le total par année © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 60 Parmi les 6.804 cas adultes infectés au VIH enregistrés en 2007, on dénombre 2.283 hommes et 4.521 femmes soit respectivement 33,55% et 66,45% des cas. Le sexe ratio est de 0,5 (2.283/4521).Il faut noter également que la prévalence du VIH présente des disparités selon les tranches d’âge. En effet, la tranche d’âge 25-29 ans présente la prévalence la plus élevée tandis qu’entre 45 et 49 ans la prévalence s’annule. Par ailleurs, toutes les tranches d’âge à l’exception des 15-19 ans et des 40- 49 ans enregistrent des prévalences supérieures à la moyenne nationale qui est 2,3%. II.4. Le virus T-lymphotrope humain type I et type II (HTLV-1 et 2) Les infections par les virus T-lymphotropes humains de type I et II (HTLV-I et HTLV-II) sont associées à la leucémie à cellules T de l'adulte, aux lymphomes et à la paraparésie spastique tropicale. Cependant, la plupart des infections par le HTLV-I ou le HTLV-II sont asymptomatiques; seulement 5 % des personnes infectées développent des signes cliniques importants. L'infection par le HTLV-I est relativement courante dans certaines régions géographiques (Japon et Caraïbes), tandis que l'infection par le HTLV-II est prévalente dans certains segments de la population (p. ex., autochtones d'Amérique du Nord et utilisateurs de drogues injectables). Très peu d’étude au Burkina Faso ont été faites sur les HTLV. La seule étude disponible a trouvé une faible prévalence de HTLV-1 de l’ordre de 0,5 à 1,5% respectivement en zone urbaine et rurale (Collenberg et al, 2006). Au vu de la très faible prévalence de HTLV-1, son dépistage n’est pas primordial en transfusion sanguine au Burkina Faso. II.5. Les Contaminations bactériennes Les constituants du sang peuvent être contaminés par des bactéries durant l'une des nombreuses étapes de préparation, notamment la collecte, le traitement, le mélange et la transfusion. Les sources de contamination sont la bactériémie du donneur, l'exposition aux bactéries sur la peau du donneur par ponction veineuse, et la contamination des sacs et de l'environnement dans les banques de sang et les hôpitaux. Les bactéries impliquées dans les contaminations associées aux globules rouges sont habituellement des bacilles © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 61 gram-négatifs tels que Yersinia enterocolitica et Pseudomonas fluorescens (Klein et al, 1997 ; Zavizion et al, 2003). Les bactéries à l'origine des contaminations associées aux plaquettes, quant à elles, appartiennent principalement à des espèces telles que Streptococcus pyogenes, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli et Staphylococcus epidermidis (Störmer et al, 2011). L'importance clinique d'une contamination bactérienne par transfusion dépend en grande partie du type de bactérie, de la charge bactérienne et de l'état physique du receveur. Les agents gram-négatifs produisent habituellement des endotoxines et ils causent des réactions graves, tandis que les agents gram-positifs entraînent souvent des réactions mineures. La charge bactérienne varie selon le temps d'entreposage. Les unités de plaquettes entreposées plus de 3 jours et les unités de globules rouges entreposées plus de 21 jours sont fortement associées à un risque accru de contamination bactérienne. En outre, l'âge et les affections sous-jacentes des receveurs peuvent grandement influer sur la sévérité de la contamination bactérienne. Des mesures peuvent être entreprises pour prévenir et réduire la contamination bactérienne et les réactions aux transfusions qui en découlent. Au Burkina Faso, les contaminations bactériennes ne sont pas dépistées. Et peu de données existent sur les cas de transmission post-transfusionnelle des maladies bactériennes au Burkina Faso. Cependant, comme il n’est pas possible d’éliminer toutes les bactéries des constituants du sang, il serait important de reconnaître les symptômes cliniques précoces associés à la contamination bactérienne chez tous les donneurs potentiels afin de réduire les taux de morbidité et de mortalité. II.5.1. Treponema pallidum agent causal de la syphilis. L'infection par Treponema pallidum, l'agent de la syphilis, peut être classée en différents stades cliniques selon le pouvoir infectant et la progression de la maladie, à savoir : primaire, secondaire, latente précoce, latente tardive et tertiaire. La syphilis primaire est caractérisée par un ulcère génital indolore; environ le tiers des cas de syphilis primaire non traités se transforment en syphilis secondaire. À ce stade, une éruption maculopapuleuse symétrique apparaît sur la paume des mains et la plante des pieds; environ le tiers des cas de syphilis secondaire non traités se transforment en infection latente. En général, la syphilis latente est asymptomatique. Le tiers des cas latents non © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 62 traités se transforment en syphilis tertiaire. À ce stade, le cœur et le système nerveux central (SNC) sont habituellement touchés. Parmi les manifestations possibles, notons les troubles cardiovasculaires et neuropsychiatriques et la cécité. L'infection durant la grossesse peut causer un avortement spontané, la naissance d'un enfant mort-né ou prématuré et la syphilis congénitale. En outre, la syphilis augmente le risque de devenir infecté par le VIH et la syphilis tertiaire chez les personnes infectées par le VIH est difficile à traiter. La syphilis est principalement transmise par les contacts sexuels avec une personne infectée qui est au stade primaire, secondaire ou latent précoce de la maladie. T. pallidum peut également être transmis de la mère au fœtus et d'un donneur infecté à un receveur par du sang non testé ou une transfusion directe. La transmission de la syphilis par transfusion est très rare depuis qu'on a instauré le test sérologique de dépistage des anticorps dirigés contre T. pallidum, premier test de dépistage des marqueurs d'une maladie infectieuse administré aux donneurs de sang. Au Burkina, toutes les unités de sang sont soumises à un test de dépistage des marqueurs sérologiques de la syphilis. Cependant, les centres de transfusion disposent d’une chaine de froid appropriée qui permet la conservation des poches de sang à environ 4°C pendant quelques jours avant la distribution, ce qui a pour avantage l’élimination du tréponème. II.5.2.Épidémiologie de la syphilis dans le monde La syphilis vénérienne connaît une recrudescence mondiale après l’espoir de son éradication il y a un quart de siècle grâce à la pénicillothérapie. La syphilis reste l’une des maladies infectieuses les plus répandues dans le monde entier, atteignant surtout les sujets entre 15 et 30 ans (Traore, 2000). Selon l’OMS en 1999 il y avait 12,22 millions de cas de syphilis dans le monde (OMS, 2001). Cette affection est plus fréquente dans les villes qu’à la campagne, chez l’homme que chez la femme (Traore, 2000). En Europe : On observe ces dernières années une recrudescence des cas de syphilis, divisant l’Europe en deux blocs. A l’ouest La syphilis est devenue relativement rare, avec 0,20 millions de cas en 1999 (OMS, 2001). Deux raisons expliquent cela, la période de grande liberté sexuelle des années post 1968 est terminée, les grandes campagnes de lutte contre le SIDA, ont à © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 63 partir de 1985 réussi à imposer le préservatif comme moyen de prévention contre le VIH, servant de fait à la prévention de la syphilis. Ainsi, contracter aujourd’hui la syphilis témoigne d’une sexualité à haut risque (homosexualité masculine à partenaires multiples, usage de drogues dures) (Morel, 2001). A l’est Surtout les Etats ex-soviétiques ou l’augmentation des taux est exponentielle depuis les années 1990, les résultats dans certains pays de 1990 à 1996 sont les suivants: Estonie de 0 à 50 personnes pour 100.000 habitants ; Lituanie de 0 à 150 personnes pour 100.000 habitants ; Fédération de Russie de 0 à 250 personnes pour 100.000 habitants. En Asie : L’Asie a le plus grand nombre de nouveaux cas de syphilis dans la population adulte. En 1999 ; 5,79 millions de cas de syphilis étaient recensés dans cette région du monde (OMS, 2001). En Afrique: L’Afrique sub-saharienne est très touchée avec 3,5 millions de cas en 1999 (OMS, 2001). Les prévalences de la syphilis chez les femmes enceintes dans certains pays d’Afrique subsahariennes sont les suivantes: 2,5% au Burkina- Faso. 6,7% en république centrafricaine. 8,4% en Afrique du sud. 17,4% au Cameroun. 7,14% au Mali. II.6. Paludisme et transfusion sanguine En Afrique subsaharienne, le paludisme est l’une des causes les plus importantes de mortalité et de morbidité infantile. Dans les pays endémiques d’Afrique subsaharienne la mortalité palustre touche essentiellement les enfants et les femmes enceintes. Bien que la maladie soit très répandue dans cette région, elle est peu testée ou tout simplement ignorée en transfusion sanguine (Tagny et al, 2008). Les fortes prévalences parasitaires en saison de transmission palustre allant de 33,5% au Bénin (Kinde-Gazard et al, 2000) à 51,5% au Nigéria (Epidi et al, 2008) élimineraient la majorité des dons de sang si la © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 64 maladie était prise en compte dans la transfusion. D’autres difficultés résident dans le choix des tests de diagnostic. En effet, la détection des parasites est faite par microscopie dans la plupart des pays où le paludisme a été dépisté en transfusion sanguine (Lara et al, 2007 ; Ali et al, 2005). Cette technique présente le désavantage d’être peu sensible pour de faibles parasitémies (Achidi et al, 1995 ; Lara et al, 2007). Les tests de dépistage sérologiques ne sont pas appropriés en zone d’endémie car la majorité des donneurs sont adultes et semi-immuns (Akinboye et al, 1987 ; Achidi et al, 1995). Le paludisme demeure donc la maladie négligée en transfusion sanguine dans les pays d’Afrique subsaharienne (review par Owusu et al, 2010). Au Burkina Faso, il n’existe pas de données disponibles à l’heure actuelle sur la transmission du paludisme en transfusion sanguine. Cependant en saison de transmission palustre un traitement présomptif est associé à la distribution des composants sanguins comme préconiser par différentes études (Kinde-Gazard, 2000 ; Akinboye et al, 1987 ; Erhabor et al, 2007). © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 65 Chapitre III : Méthodes de diagnostic des agents transmissibles par transfusion sanguine III. Diagnostic des hépatites virales III.1. Le virus de l’hépatite C (VHC) Le diagnostic des infections par le VHC, comme celui de toute infection virale repose sur deux types de tests : les tests indirects qui mettent en évidence les anticorps dirigés spécifiquement contre le virus (tests sérologiques) et les tests directs qui mettent en évidence les constituants de la particule virale (PCR par exemple pour le VHC). Le prélèvement sanguin permet de rechercher la présence d’anticorps anti-VHC. La séroconversion a lieu dans 95 % des cas au cours du premier mois, dans 99% des cas au cours des 3 premiers mois. La positivité de ce test signifie seulement que la personne a été en contact avec le virus. Elle ne permet pas de savoir si le virus a été éliminé ou pas de l’organisme. De même ce test restera positif en cas de guérison. En cas de résultat positif, et si un doute persiste, un second test ELISA sera prescrit pour confirmation. Mais la plupart du temps, on s’aidera d’un dosage qualitatif de la charge virale plasmatique par PCR qui indique la présence de l’ARN du VHC sans en déterminer la quantité circulante. III.1.1- Le diagnostic indirect Il repose sur des tests qui utilisent les antigènes viraux permettant la détection spécifique d’anticorps anti-VHC. Deux types de tests sont actuellement utilisés : les tests de dépistage utilisés en première intention et les tests de validation (confirmation). Tests de dépistage. ELISA Les protéines recombinantes ou les peptides de synthèse viraux sont fixés soit sur des microplaques soit sur des billes de polystyrène. Les anticorps sont mis en évidence par immunocapture suivie d’une révélation enzymatique colorimétrique. Aujourd’hui les tests sérologiques de dépistage commercialisés sont des tests de troisième génération. Ils incluent des protéines recombinantes et ou des peptides synthétiques codés à la fois par © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 66 les régions structurales (capside et enveloppe) et les régions non structurales (NS3, NS4, NS5). Plusieurs tests sont disponibles sur le marché : ELISA 3.0 VHC (orthodiagnostic system), VHC 3.0 (abbott dignostic), Murex anti VHC (Murex diagnostic),Vironstika VHC , Microelisa VHC, et INNOTEST VHC ab IV (innogenetics). Antigène du core du VHC (VHCcAg) Des tests plus performants permettent le diagnostic du VHC en recherchant simultanément les anticorps anti-VHC et l’antigène de capside du virus (kit Monolisa HCV Ag–Ab Ultra, Biorad). Ces tests sont une combinaison d’un test Elisa indirect pour la détection des anticorps anti-VHC et d’un test sandwich pour la détection de l’antigène de la capside du VHC. En effet, les puits de la microplaque sont revêtus par deux protéines recombinantes correspondant à la région NS3 de génotype 1 et 3a, une protéine recombinante correspondant à la région NS4, un peptide modifié correspondant à la région de la capside et un anticorps monoclonal dirigé contre la capside de l’hépatite C. Les anticorps anti-VHC, s’ils existent dans l’échantillon, sont liés aux antigènes fixés sur la phase solide et détectés grâce au conjugué enzymatique C2 (un mélange d’anticorps antiIgG et de streptavidine marqués à la peroxydase) et la réaction est révélée par le TMB (substrat de l’enzyme). L’antigène de capside, s’il existe dans l’échantillon, est capturé par les anticorps monoclonaux de la phase solide et les anticorps monoclonaux biotinylés d’un conjugué C1 ajouté dès le début de la réaction, et détecté grâce à l’affinité de la biotine du C1 avec la streptavidine marquée à la peroxydase du C2. La manipulation est réalisée selon les recommandations du fabricant. III.1.2. Le diagnostic direct L’importance des hépatopathies NANB dans la pathologie virale hépatique et notamment post transfusionnelle a fortement stimulé la recherche de test de diagnostic sérologique et moléculaire afin de pouvoir les identifier et mieux comprendre leur evolution. L’amplification génomique par PCR introduite en 1985 par les chercheurs de la firme <<Cetus>>permettant d’obtenir des molécules de copies d’ADN spécifiques constitue à ce jour une véritable révolution dans ce diagnostic. Pour le VHC cette amplification nécessite une première étape dite transcriptase reverse qui consiste en une transformation de © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 67 l’ARN viral en ADN grâce à une transcriptase réverse. L’amplification génomique par PCR comporte 3 étapes : La première étape consiste en une détermination de l’ADN double brin par rupture des ponts d’hydrogène à température élevée aboutissant à la libération d’ADN simple brin. -La deuxième étape réalisée à basse température permet le couplage aux deux brins d’ADN issus de l’étape précédente, de deux amorces oligonucléotidiques complémentaires ; l’une de la région 5’ et l’autre de la région 3’ de la séquence cible. -Pendant la troisième étape, l’utilisation d’une polymérase permet la synthèse d’un brin complémentaire par extension à partir des amorces dans le sens 5’- 3’. Il en résulte un dédoublement de la séquence initiale puisque les deux brins issus de l’étape 1 sont copiés. L’opération est ensuite recommencer avec pour chaque cycle : • Un temps de dénaturation de l’acide nucléique à 95 °C pendant 1 mn • Un temps d’hybridation avec les amorces à 37 °C pendant 1 mn • Un temps d’extension des amorces à 72 °C pendant 2 mn L’amplification qui requiert environ 35 cycles est ensuite achevée par une extension de 10 mn à 72 °C. Stratégies de confirmation du VHC en transfusion sanguine Au Burkina Faso du fait du nombre élevé de faux positifs, le diagnostic du VHC requiert une confirmation des résultats. Les tests utilisés pour le dépistage du VHC sont les tests ELISA de 4ème génération. Si un échantillon est réactif aux anticorps ou antigènes du VHC, la confirmation de la positivité de ce dernier passe par un second test sur le même échantillon avec une technique alternative. Si l’échantillon est réactif au test alternatif, l’échantillon est considéré positif au VHC. Si par contre si la reprise est négative, l’échantillon est « accroché » (douteux au VHC), le donneur est appelé à revenir quelques semaines plus tard pour un nouveau test sérologique. Compte tenu des moyens limités dont disposent la banque de sang, les reprises sont souvent effectuées avec le test ELISA ayant donné les résultats initiaux. L’utilisation du DGV n’est pas encore à l’ordre du jour. Il permettrait de réduire de façon drastique le nombre de faux positifs chez les donneurs de sang. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 68 III.2. Le virus de l’hépatite B (VHB) Dans les pays développés comme la France, la recherche de l'antigène HBs et de l'anticorps anti-HBc total, ainsi que le dosage des transaminases font partie des dépistages obligatoires pour les sangs destinés à la transfusion sanguine. Actuellement au Burkina, seul la recherche de l’AgHBs est systématiquement effectuée sur les dons de sang. III.2.1. Diagnostic virologique Le diagnostic des différentes situations cliniques est effectué par la détection des marqueurs virologiques de l'infection. Il s'agit soit de méthodes immunoenzymatiques de type ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) réalisables dans des laboratoires non spécialisés, soit de techniques moléculaires détectant, quantifiant ou caractérisant la séquence de l'ADN du virus de l'hépatite B (VHB), et qui ne sont pratiquées pour le moment que dans des laboratoires spécialisés. Les éléments pouvant être mis en évidence dans le sérum sont soit des marqueurs directs de la présence virale, soit des marqueurs dits indirects liés à la réponse immunitaire. III.2.1.1. Les marqueurs directs • L'antigène HBs associé aux enveloppes virales est aisément mis en évidence dans le sérum des patients par des techniques immunoenzymatiques de type ELISA. • L'antigène HBc n'est pas retrouvé tel quel dans le sérum. Une protéine soluble, dérivée de la protéine de capside, porte un antigène appelé HBe qui est détecté dans le sérum en cas de multiplication virale, également par des techniques immunoenzymatiques de type ELISA. • L'ADN viral circulant associé aux particules virales infectieuses est mis en évidence par des techniques d'hybridation moléculaire. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 69 III.2.1.2. Les marqueurs indirects Ce sont les anticorps secrétés par le patient lorsqu'il rencontre les différents antigènes du virus de l’hépatite B : les IgG anti-HBs, anti-HBc, anti-HBe et les IgM anti-HBc. Ils sont aussi détectés par des méthodes immunoenzymatiques de type ELISA. Rappel sur la méthode ELISA. Elle repose sur l’utilisation d’un support solide (puits de microfiltration, billes, microparticules). Ce dernier est recouvert soit d’antigènes viraux pour la détection d’anticorps soit d’anticorps monoclonaux pour la détection des anticorps. Le sérum du patient est mis au contact du support ainsi revêtu. Un complexe antigène-anticorps se forme alors. La révélation de ce complexe est effectuée par une enzyme transformant un substrat en un composé coloré ou émettant un signal. La détection de ce composé coloré se fait grâce à un spectrophotomètre, un fluorimètre, ou un chimioluminomètre, selon le type de signal émis. Les résultats sont généralement exprimés par un ratio qui correspond au signal de l’échantillon sur le signal du seuil établi pour chaque trousse utilisée. Le ratio est proportionnel ou inversement proportionnel à la quantité de marqueur présent dans le sérum, selon qu’il s’agit de techniques dites directes ou de techniques par compétition. De nombreux réactifs aux performances sensiblement équivalentes, pouvant être utilisés sur des automates ou de façon manuelle (avec toutefois un minimum d’équipement et beaucoup de soin) sont aujourd’hui disponibles pour la détection des marqueurs du VHB. Les techniques sont décrites de façon précise dans chaque type de coffret. Tests moléculaires. La détection/quantification de l’ADN du virus de l’hépatite B est le meilleur marqueur de la réplication virale. Il peut être réalisé par hybridation de l’ADN viral à des sondes spécifiques éventuellement associé à une amplification du signal, ou par amplification génique du type Polymérase Chain Reaction (PCR). Ces techniques se classent de la façon suivante par ordre de sensibilité croissante : hybridation, amplification du signal, © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 70 amplification génique. La mise en évidence d’une réplication virale est utilisée pour poser l’indication thérapeutique au cours de l’hépatite chronique B. La quantification de l’ADN viral est également indispensable au suivi du traitement par l’interféron alpha. Prévalence de l’AgHBs. Dans les pays en développement, l’AgHBs est le seul marqueur recherché couramment, pour le diagnostic des infections et le dépistage des échantillons de sang à éliminer en transfusion sanguine. Cependant les tests sérologiques diffèrent par leur sensibilité et influent sur les prévalences de l’AgHBs. Des données concernant l’utilisation des techniques d’hémagglutination et de l’ELISA montrent que la prévalence de l’AgHBs est plus élevée lorsque le test sérologique est l’ELISA par rapport à l’hémagglutination (8% Vs 14%). Les tests ELISA sont aussi plus sensibles que les tests de détection rapide (TDR) pour la détection de l’AgHBs (Ola et al, 2009). Ces tests donnent des prévalences respectives de 14% et 12% pour l’AgHBs. En général les prévalences élevées de l’AgHBs en Afrique subsaharienne font qu’il n’apparait pas nécessaire de procéder à un test de confirmation pour considérer un échantillon positif en transfusion sanguine (Allain, 2011). Au CNTS, l’AgHBs est détecté par des ELISA de 4ème génération et les résultats sont confirmés en utilisant un second test ELISA de 4ème génération. Les tests rapides (TDR) A côté des méthodes ELISA, adaptées aux grandes séries, des tests individuels ont été développés. Simples, ne nécessitant ni matériel particulier, ni électricité, ils reposent sur des méthodes d’agglutination, d’immunofiltration, ou d’immunochromatographie. Un résultat positif est donné par un point ou un trait coloré, ou une agglutination visible à l’œil nu. Le temps de réalisation est de 10 min à deux heures selon les tests et le prix varie entre 2.000 et 12.000 FCFA. Ces réactifs sont adaptés aux structures ayant peu de moyens, et/ou recevant un nombre réduit de prélèvements. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 71 III. 3. Diagnostic biologique des virus responsables du VIH/SIDA On distingue deux types de méthodes pour le diagnostic biologique de l’infection à VIH : Le diagnostic indirect ou sérologique, fondé sur la détection des anticorps et reste dans la majorité des cas l’approche diagnostic la plus pertinente et la plus accessible. Les méthodes de référence pour la visualisation de la réaction antigène- anticorps sont actuellement les méthodes immunoenzymatiques de type ELISA. La méthode ELISA dure seulement quelques heures et donne des résultats reproductibles et est automatisable. Il existe aussi des tests rapides, facilement réalisables et qui ne demandent pas de moyens sophistiqués : les résultats sont obtenus plus rapidement que l’ELISA par simple lecture à l’œil. Cependant, aussi performants qu’ils sont pour les anticorps anti-VIH-1 et anti-VIH-2 au cours de la phase chronique de l’infection, ils n’offrent pas d’une manière générale le même niveau de sensibilité que les tests ELISA de troisième et quatrième génération au cours de la primo-infection. Leur avantage est leur usage dans les situations d’urgences et, à cause du fait qu’il différencie généralement les VIH-1 et VIH-2. La plupart des tests de dépistage comportent le risque de résultats faussement positifs, un risque qui persiste en dépit des progrès les plus récents. Cette limite impose, en cas de positivité ou de discordance, le recours à des tests de confirmations, notamment le Western blot. Et le diagnostic direct, fondé sur la mise en évidence du virus par multiplication en culture cellulaire par détection immunologique ou moléculaire. Il est surtout indiqué dans les cas d’échec du diagnostic indirect en particulier pendant la fenêtre sérologique de la primo infection. III.3.1. Diagnostic indirect III.3.1.1. L’Immunofluorescence indirecte Des cellules lymphocytaires infectées par le virus sont déposées et fixées sur des lames de microscope. Des cellules identiques non infectées servent de témoins et permettent d‘éliminer les fixations non spécifiques. Le sérum à étudier est mis à incuber. Les anticorps présents se fixent sur les cellules et sont révélés par une antiglobuline humaine marquée à l’isothiocyanate de fluorescéine. Une réaction positive se traduit par une © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 72 fluorescence observée également sur le témoin signe d’une fixation non spécifique d’anticorps reconnaissant les éléments cellulaires et non le virus. III.3.1.2. Les techniques immunoenzymatiques La technique actuellement la plus utilisée pour la recherche des anticorps anti-VIH-1/2 est une technique immunoenzymatiques : ELISA. C’est une méthode simple, destinée au dépistage de sérums. Dans cette réaction l’antigène viral est fixé par absorption physique à un support solide (microplaque ou bille de polystyrène). On distingue quatre grands groupes de techniques : L’ELISA indirect Le sérum à étudier est dilué au 1/50 puis incuber en présence du support sensibilisé : microplaque ou bille, des complexes anticorps se forment et leur présence est révélée dans un second temps, par l’adjonction d’un sérum antiglobuline humaine marqué par une enzyme. Après une phase de lavage minutieux, le substrat de cet enzyme donnera une réaction colorée d’autant plus intense que le sérum est riche en anticorps. Des témoins positifs et négatifs inclus dans chaque réaction permettent de déterminer la valeur seuil ou limite. Les sérums dont les densités optiques lues au spectrophotomètre sont supérieures à cette valeur sont considérés comme positifs. L’ELISA par compétition Les échantillons à tester sont dilués au préalable à 1/1000. Les anticorps anti-VIH-1/2 entrent en compétition avec les anticorps du conjugué (sérum anti-VIH marqué par une enzyme), vis à vis des antigènes viraux fixés sur le support solide. Plus la concentration d’anticorps dans l’échantillon est élevée, moins l’antigène conjugué se fixera. Le substrat chromogène donnera une réaction colorée qui sera inversement proportionnelle à la concentration en anticorps. Les témoins permettent de calculer une valeur seuil. Les sérums dont les densités optiques sont inférieures à cette valeur sont considérés comme positifs. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 73 ELISA combiné Ag/Ac Du fait de l’absence du dépistage moléculaire du VIH en transfusion sanguine au CNTS, la détection du VIH-1/2 se fait en utilisant des tests ELISA de 4ème génération qui ont la particularité de détecter à la fois les anticorps et les antigènes du VIH-1/2 et permettent ainsi de réduire la période de silence immunologique (Vironostika combo VIH-1/2 Ag/Ab, BIORAD etc.) L’ELISA par sandwich Les tests ELISA sandwich dits de 3ème génération ne nécessitent pas une dilution des échantillons. Les antigènes du VIH sont fixés sur une phase solide. Les anticorps anti-VIH1/2 du sérum se fixent sur les antigènes de la phase solide, ils forment un complexe antigène/anticorps. Un conjugué enzyme antigène est ajouté après lavage et il se lie à tout anticorps anti-VIH-1/2 présents. On procède ensuite à un lavage pour éliminer le conjugué non lié. On rajoute du substrat et une coloration apparaît proportionnellement au taux d’anticorps présents. L’ELISA Immunocapture La phase solide est revêtue d’anticorps anti- IgG humaines. Si les IgG sont présentes dans l’échantillon à tester, elles se lient aux anticorps. Après lavage, on rajoute un conjugué enzyme antigène VIH qui se lie spécifiquement aux IgG anti-VIH. Après un second lavage, on ajoute du substrat qui va se fixer sur le conjugué. Une coloration apparaît proportionnellement aux taux d’anticorps présents. III.3.1.3. Les tests rapides La technique d’agglutination Cette méthode est basée sur le principe d’agglutination passive des billes de polystyrène ou des hématies humaines servant de support aux protéines virales du VIH (naturelles ou produits de génie génétique). Mises en présence d’anticorps anti-VIH, elles forment un réseau d’agglutination visible à l’œil nu. Ces tests peuvent être effectués sur une lame (test au latex) ou sur plaque de micro-agglutination (hémagglutination passive avec © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 74 lecture de culot de sédimentation des hématies). Ils présentent un atout supplémentaire sur l’ELISA car leur exécution très simple ne nécessite aucun appareillage. L’amélioration de leur spécificité pourrait entraîner leur expansion. Technique d’immunofiltration ou DOT BLOT Elle utilise une membrane en papier ou de nitrocellulose comme support solide. L’antigène est fixé sur un support solide et prend la forme d’un petit cercle ; il s’agit le plus souvent d’un peptide synthétique ou recombinant. Une pièce en plastique soutient en général le support solide et contient des tampons hydrophiles sous le papier pour recueillir le sérum et les réactifs après addition. Il existe deux types d ‘« Immunodot » en phase solide : Immunodot sur carte Les cartes plastifiées ont la forme d’un peigne dont les dents sont sensibilisées par des antigènes peptidiques de synthèse du VIH-1 et VIH-2 au niveau de deux tâches séparées. Le principe du test consiste à introduire la carte successivement dans les échantillons du sérum (disposés dans les puits d’une plaque contenant tous les réactifs nécessaires déposés dans différents compartiments de la plaque) dans une solution de lavage, dans le conjugué marqué par une enzyme, une nouvelle fois dans une solution de lavage et enfin dans le substrat chromogène. Il se forme une réaction colorée caractéristique d ‘un résultat positif. L’Immunodot sur membrane Les antigènes du VIH-1 et VIH-2 immobilisés sur une membrane sont soit sous forme d’une tâche unique, soit sous forme de deux tâches distinctes. Le sérum dilué ou non dilué est ajouté directement sur la membrane. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 75 Les anticorps anti- VIH du sérum se lient aux antigènes présents sur la membrane. Le complexe immun formé est traité au moyen d’un conjugué marqué à une enzyme. Un substrat ajouté donne une tâche colorée caractéristique d’une réaction positive. III.3.1.4. Tests de confirmations Immunoprécipitation (RIPA) Cette technique utilise un virus marqué par un isotope radioactif (en général la cystéine 35). Le lysat viral contenant les antigènes à l’état natif est incubé avec le sérum à tester. Les complexes immuns formés sont alors captés sur un support d’affinité tel que des billes de protéine asepharose. Les antigènes viraux retenus par les anticorps spécifiques sont ensuite élués et séparés en fonction de leur poids moléculaire sur le gel de polyacrylamide. La révélation est effectuée par autoradiographie. Cette technique met en évidence préférentiellement des anticorps dirigés contre les protéines d’enveloppe et de ce fait elle constitue un apport complémentaire d’informations pour les échantillons sériques d’interprétation délicate en Western Blot. La RIPA est un test de confirmation très sensible, réservé à des laboratoires agrées. Le Western Blot Après fragmentation d'une culture de virus, les protéines virales sont séparées par électrophorèse en gel d'agarose dans lequel elles vont migrer en fonction de leur poids moléculaire : les grosses molécules (gp 160, gp 120) migrant moins facilement que les petites (gp 41, p 17). On transfère les protéines séparées en "buvardant" le gel (to blot = buvarder) avec une feuille de nitrocellulose. Cette feuille est découpée en bandelettes. On immerge une bandelette dans un petit bac contenant le sérum à contrôler : si ce sérum contient des anticorps spécifiques du VIH, ils se fixent aux antigènes. La fixation des anticorps est révélée par une technique ELISA identique à celle utilisée pour le test de dépistage : on ajoute un anticorps anti-Ig humain marqué par une enzyme puis le substrat de cette enzyme. Une bande colorée apparaît pour chaque protéine virale sur laquelle se fixe un anticorps. Cependant, il existe des algorithmes d’analyse alternatifs pour le sérodiagnostic du VIH. Ils sont basés sur une combinaison d’essais de dépistage sans WB, réputé pour être une technique difficile à réaliser et ne couvrant pas la fenêtre de silence sérologique très © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 76 critique en transfusion sanguine. Dans un algorithme de diagnostic en parallèle, les sérums sont testés simultanément avec deux tests ELISA. Dans l’algorithme en série, tous les échantillons sont testés avec un premier test hautement sensible. Les échantillons sont considérés comme des vrais négatifs s’ils réagissent négativement dans le premier test. Les échantillons réactifs dans cet essai sont soumis à un second EIA très spécifique. Les algorithmes d’analyse en parallèle sont souvent utilisés en milieu hospitalier et en transfusion sanguine. Les algorithmes en série sont probablement plus efficaces et pratiques lorsque la quantité d’échantillon est suffisante (prélèvement par ponction veineuse par exemple) pour pouvoir faire des tests complémentaires lorsque le test initial est positif. Ces algorithmes ont un haut niveau d’exactitude et minimisent les coûts. La plupart d’entre eux sont utilisés au Burkina Faso et se sont avérés très efficaces. Figure 20: Western blot confirmé positif (Source: western blot bandelette VIH .pdf) © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 77 Figure 21: Schéma de l’interprétation d’une immuno-empreinte III. 4. Détection des infections bactériennes syphilitiques Dans le cadre de la qualification biologique des dons, le dépistage obligatoire des anticorps anti-tréponémiques se fait par le TPHA uniquement, dans le but de prévenir une éventuelle transmission de Treponema pallidum par les produits sanguins transfusés et d’informer les donneurs dépistés. Les tests ELISA sont utilisés un peu partout et ont l’avantage d’être automatisables. Ils se positivent très précocement au cours de la syphilis (surtout les ELISA/IgM) (Schmidt et al, 2000) mais en cas de positivité, le recours à d’autres tests, non tréponémiques (VDRL/RPR) et tréponémiques (TPHA, FTA, éventuellement recherche des IgM), s’avère nécessaire pour faire le diagnostic (Egglestone et al, 2000). La présence d’IgM permet de confirmer un diagnostic de syphilis active. Cependant l’absence d’IgM ne permet pas d’exclure ce diagnostic avec certitude. La recherche des IgM est particulièrement utile pour confirmer le diagnostic de syphilis congénitale et de neurosyphilis. D’autres tests de diagnostic de la syphilis sont également © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 78 disponibles sur le marché : tests rapides de dépistage (tests immunochromatographiques), immunoblots. Figure 22 : Schéma simplifié d'aide à l'interprétation des sérologies de la syphilis (1) Ce groupe peut comporter également les patients ayant des réactions faussement positives en TPHA (moins fréquemment décrites que les réactions faussement positives en VDRL), les syphilis latentes tardives dont le diagnostic est parfois difficile, et les réactions croisées avec les tréponématoses non vénériennes (pian, béjel, pinta) chez les patients originaires des zones d’endémies. Enfin, ce profil a pu être observé aussi chez certains patients en phase primaire, bien que dans la majorité des cas le VDRL soit positif à ce stade. (2) Lorsque les taux d’anticorps sont élevés (ex : VDRL> 8 unités, TPHA > 5120), le diagnostic est aisé surtout si les signes cliniques sont évocateurs (syphilis secondaire par exemple). En l’absence de signes cliniques, lorsque les taux d’anticorps sont faibles (voisins du seuil des techniques utilisées), l’interprétation des sérologies est plus délicate. Le diagnostic reposera sur la notion de syphilis acquise antérieurement (< 1 an pour la syphilis latente précoce), de prise d’antibiotiques (ou non), la comparaison avec d’éventuelles sérologies antérieures. Remarque : chez les patients traités tardivement, les sérologies (tréponémiques et non tréponémiques) peuvent rester positives. Mais le suivi sérologique devra mettre en évidence une diminution significative du VDRL (il est admis qu’une baisse du titre du VDRL de 4 fois en 6 mois est significative, par exemple de 32 unités à 8 unités, soit 2 dilutions). (3) Le profil le plus fréquemment rencontré au stade de syphilis primaire est VDRL+ et TPHA+, mais au stade très précoce de la syphilis primaire, on peut observer, plus rarement, le profil VDRL+, TPHA- (le FTA est positif dans ce cas alors qu’il est négatif s’il s’agit d’anticorps anti-cardiolipidiques). Le diagnostic à ce stade sera basé d’abord sur la clinique (chancre) et éventuellement la mise en évidence de tréponèmes au fond noir. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 79 Chapitre IV : Techniques d’amplifications moléculaires et sécurité transfusionnelle IV.1. La transfusion sanguine Ces dernières années des progrès considérables ont été faits pour améliorer la qualité des produits sanguins labiles obtenus dans le processus de transfusion sanguine. En Afrique, ces améliorations se traduisent non seulement par l’introduction du dépistage sérologique systématique des virus du SIDA (VIH-1 et VIH-2) et des hépatites B et C sur les dons de sang, mais aussi par la recherche de la garantie d’une sécurité maximale en transfusion sanguine qui repose sur des bases suivantes : L’organisation des structures, des établissements de transfusion sanguine. L’hémovigilance, qui constitue un système de recueil des données, d’analyses et d’actions d’amélioration. Les bonnes pratiques transfusionnelles à appliquer de manière pragmatique. La formation des acteurs impliqués dans la chaine transfusionnelle. Le développement des activités de référence et de recherches etc. De nos jours, le risque de contamination par transfusion du virus du SIDA comme des virus des hépatites B (VHB) et C (VHC) a considérablement diminué grâce à l’application des mesures préventives et à l’amélioration de la sensibilité des réactifs de dépistage sérologique. Cependant, il subsiste un risque résiduel, très faible, mais qui persiste et ce, en dépit des mesures de sélection des donneurs et du dépistage des marqueurs biologiques. Ce risque résiduel post-transfusionnel est essentiellement lié à la fenêtre sérologique, période qui sépare l’infection de l’apparition des marqueurs sérologiques (anti-VIH, anti-VHC et VHB etc.). La sécurité transfusionnelle reste un problème de santé publique majeur dans le monde et demeure un élément clé de la lutte contre le VIH. En © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 80 2010, l’ONUSIDA estimait à 45 millions le nombre de nouvelles contaminations par le VIH si les mesures n’étaient pas prises pour contrer l’expansion de l’épidémie. Parmi ces nouveaux cas, 4 millions pourraient être imputables aux transfusions sanguines ou à d’autres injections médicales. De nos jours, la transmission du VIH par cette voie- là est toujours d’actualité pour la majorité des habitants de la planète. Chaque année selon l’OMS, 80 millions d’unités de sang sont recueillies dans le monde, or 38 % seulement le sont dans les pays en voie de développement où vit la quasi-totalité de la population mondiale. Et c’est justement dans ces pays en voie de développement que les épidémies à VIH et autres infections transmissibles par transfusion sont les plus importantes. Un autre problème en transfusion sanguine est l’émergence de nouveaux variants viraux qui peuvent s’avérer difficile voir même impossible à détecter par les tests dont disposent les unités de soins transfusionnelles. Récemment l’équipe du Professeur Plantier, du CHU de Rouen a mis en évidence un nouveau variant du VIH-1 du groupe P proche d’un virus identifié chez les gorilles (SIVgor) chez une femme d’origine camerounaise. Ce nouveau variant se distingue des trois groupes déjà répertoriés (M, N, O). Il a été admis que l’origine de ce nouveau groupe P est probablement liée à un passage de virus SIV du gorille à l’Homme comme cela a été décrit dans le cas des VIH-1 de groupe M et N à partir de contamination par manipulation de viande de chimpanzés infectés. IV.2. Risques transfusionnels La transmission sanguine du VIH se fait essentiellement par le contact avec le sang contaminé ce qui inclut la transfusion sanguine notamment les donneurs en seroconversion, les accidents d’exposition au sang, la toxicomanie par voie veineuse etc. Au début de l’épidémie le taux de transmission par transfusion sanguine était très élevé pratiquement 100%. En Afrique, les fortes prévalences du VIH font que ce risque est encore plus important et est sous estimé, car il existe peu ou pas de suivi des patients transfusés. Les dons de sang vont le plus souvent vont au bénéfice des femmes (peripartum) et des enfants (cas de paludisme). Le manque de coordination des services de transfusion sanguine dans plus de la moitié des pays Africains en est une des causes © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 81 (Kaba, 2004). Egalement font partie de ces causes, le fait que les tests de dépistage sérologique de maladies virales ne sont pas généralisés, la disponibilité du sang : la conservation, le recrutement de donneurs volontaires et bénévoles. Par ailleurs l’indication des transfusions n’est souvent pas codifiée. L’OMS prévoit pour l’horizon 2012 les objectifs suivants sur les dons de sang en Afrique : L’analyse de la sécurité transfusionnelle par tous les états. Un nombre supérieur ou égal à 75% des pays auront au moins formulés leur politique de sécurité transfusionnelle. 100% des poches de sang testées pour les principaux marqueurs infectieux. 80% de donneurs sûr et réguliers dans les systèmes de transfusion sanguine. La sécurité vis-à-vis des maladies transmissibles par les produits sanguins labiles est une préoccupation permanente dans beaucoup de pays. Quatre mesures ont été adoptées dans les pays développés comme la France en vue de réduire le risque de transmission des virus majeurs (VIH-1/2, VHB, VHC, et des leucémies). La première mesure repose sur une sélection clinique rigoureuse des candidats au don de sang au cours de l’entretien médical. La seconde est l’introduction progressive de nouveaux tests de dépistages dans la qualification biologique du don (QBD), qui a contribué à réduire le risque résiduel de façon significative (Courouce et al, 1997, Schreiber et al, 2000). Enfin l’introduction de la déleucocytation systématique des dérivés sanguins a permis d’éliminer le risque de transmission des virus leucotropes, tels que ceux appartenant à la famille des Herpesviridae et des HTLV. Par ailleurs la politique de transfusion a également été adaptée et a entrainée une diminution du risque par diminution du nombre de transfusions, particulièrement avec une indication incertaine. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 82 IV.3. Mesure du risque transfusionnel IV.3.1. Différents types de donneurs de sang IV.3.1.1. Donneurs de sang de premier don Ce sont généralement des donneurs de sang volontaires non rémunérés. La plupart d’entre eux sont connus et n’ont fait qu’un seul don de sang tout au long de l’année généralement lors des cérémonies socioculturelles organisés par des associations religieuses, de jeunes ou par des services publics et privés. IV.3.1.2. Donneurs de sang régulier Ces donneurs sont également des donneurs de sang connus volontaires non rémunères. Cependant ils différents des donneurs de sang de premier don dans le total des dons effectués au cours de l’année (supérieur ou égale à 2). IV.3.1.3. Donneur en séroconversion Le donneur en séroconversion est définit comme un donneur de sang connu qui durant la période couvrant l’étude à effectué initialement un don séronégatif aux différents marqueurs infectieux suivit d’un don dépisté positif à l’un des marqueurs recherchés en transfusion. La période de séroconversion est celle qui sépare le dernier don négatif du premier don infecté. Elle varie suivant l’agent responsable de l’infection. IV.3.2. Calcul du taux d’incidence Les taux d'incidences par centre pour les donneurs de sang réguliers ont été calculés à partir de la base de donné du CNTS en fonction des formules établies par Schreiber et al, (1996), Busch et al, (2005) et O'Brien et al, (2007). Pour chaque virus, les taux d’incidences bruts sont obtenus à partir du rapport du nombre de donneurs en séroconversion (cas d’incidences) sur le nombre total de personne-année à risque. Les personnes-années ont été calculées en additionnant les intervalles de temps entre les différents dons (inter-don) pour tous les donneurs de sang. Mais en ne considérant que la moitié de l'intervalle pour les cas d'incidences en supposant que l'infection a été © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 83 contractée par le donneur à la mi-période du temps qui sépare le dernier don négatif du premier don positif pour un des marqueurs viraux dépistés en transfusion sanguine (VIH,VHB,VHC). Le taux d'incidence pour les donneurs de sang de premier don a été calculé en multipliant l'incidence pour 100.000 dons par des facteurs de conversions déjà établis pour une pathologie donnée dans la population de donneurs de sang. Les facteurs de conversions pour le VIH et VHC ont été établis à partir des taux incidences trouvés dans la population générale au Burkina Faso qui sont comparativement plus élevés que ceux calculés dans d'autres pays ; où pour ces mêmes marqueurs les facteurs de séroconversions sont respectivement égales à 2,4 et 3,2 pour le VIH et le VHC (Janssen et al, 1998 ; Dodd et al, 2002 ; Stramer et al, 2004). Les facteurs de conversions ont été calculés en divisant séparément pour les donneurs réguliers et les donneurs de sang de premier don le nombre des dons positifs par le nombre total des dons. Ensuite le ratio obtenu pour les donneurs de sang de premier don est divisé à son tour par celui provenant des donneurs réguliers. IV.3.3. Le risque résiduel Pour chaque agent infectieux, l’estimation du risque est basée sur la durée du passage dans le sang du pathogène, la fréquence de l’infection dans la population et la fréquence des infections asymptomatiques. Le risque résiduel pour tous les donneurs de sang est calculé en multipliant les taux d'incidences pour 100.000 dons par les périodes couvrant la fenêtre immunologique silencieuse (Schreiber et al, 1996 ; Petersen et al, 1993) ; en admettant que les périodes de latences sérologiques sont égales à 21 jours pour le VIH, 55 jours et 70 jours respectivement pour le VHB et le VHC. Le risque résiduel du VIH peut être également calculé en prenant en compte les tests de diagnostic moléculaire (Dodd et al, 2002 ; O’Brien et al, 2007). Dans ce cas, on admettrait que la période d'éclipse du VIH est de 12 jours. Le nombre d’infections supplémentaires détectés par PCR est calculé en soustrayant le nombre d’infections non diagnostiquées par PCR du nombre d'infections non dépistées par les tests sérologiques ELISA. Le nombre d'infections non dépistées peut être calculé en divisant le nombre de cas non diagnostiqué/an par le risque résiduel/don. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 84 IV.4. Biologie moléculaire et sécurité transfusionnelle C’est la description en 1985 de la Polymérase Chain Reaction (PCR) par Mullis qui a permis d’appliquer les techniques biomoléculaires à de nombreux domaines de la biologie clinique. Ce sont des techniques puissantes qui ont émergé dans les années 1970 dans les laboratoires de recherches. Leur intérêt réside dans l’extraordinaire capacité qu’elles ont d’amplifier dans un temps très court, un million voire même un milliard de fois une séquence d’acide nucléique viral dont on ne disposait au départ que d’une infime quantité ; ce qui permet ensuite de les détecter par les procèdes courants de biologie moléculaire. En transfusion sanguine, le DGV ,a permis de réduire d’une manière conséquente la fenêtre sérologique environ 90% pour le VHC , 50% pour le VIH et 45% pour le VHB. La fenêtre sérologique peut être divisé en deux phases : <<l’éclipse >>comprise entre la contamination et l’apparition de l’ARN viral, au cours de laquelle la réplication virale peut être mise en évidence dans la cellule hôte mais non dans la circulation générale. Et la phase “virémique”, comprise entre l’apparition du marqueur moléculaire et du marqueur sérologique ; au cours de laquelle le génome viral devient détectable. On a ainsi pu préciser les charges virales pendant la phase virémique, pour le VIH les charges virales détectées vont de 102 à 107 copies/. La faisabilité du DGV en analyse de routine a été démontrée par Coste et al. (2000) et une étude a permis de démontrer l’absence de contamination des laboratoires par les produits d’amplification et ce malgré l’utilisation à grande échelle des techniques de biologie moléculaire (Cornillot et al, 2000). Cependant ces contaminations dépendent de la technique d’amplification utilisée. IV.4.1. La Réaction en chaîne par polymérase et ses variantes (PCR) La Réaction en chaîne par polymérise en Chaîne ou PCR pour « Polymerase Chain Reaction » a été mise au point vers les années 1980 par Kary Mullis (Watson et al, 1994). C’est une technique permettant d’amplifier une séquence recherchée. Son principe repose sur l’utilisation de l’ADN polymérase, il s’agit d’une réplication in vitro de séquences spécifiques d’ADN. Le matériel de départ est de l’ADN bicaténaire qui contient la séquence à amplifier. La réaction en chaine de la polymérase (PCR) est une technique puissante, © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 85 révolutionnaire, largement répandue et qui est utilisée pour amplifier l’ADN et produire in vitro de grandes quantités d’une séquence d’acide nucléique. Extraction de l’ARN Viral du VIH-1 L’ARN viral a été extrait à partir du Kit QIAGEN (QIAGEN, Hilden, Allemagne) en suivant les recommandations du fabricant. Le kit permet d’extraire 100 µg d’ARN à partir de 150 µl de plasma. La sensibilité du test dépend du nombre de copies/ml initial d’ARN viral dans le sang. La technique marche bien pour un nombre de copies/ml d’ARN ≥100 (Figure 18, McMichael et al, 2010, voire section matériels et méthode). IV.4.1.1. Les étapes de la PCR Pour faire la PCR, on utilise l’ADN polymérase d’une bactérie : Thermophilus aquaticus qui vit à 75°C dans les eaux thermales. Cette polymérase (Taq polymérase) est toujours active à 94-96°C. La réaction de la PCR comporte trois étapes qui constituent un cycle au cours duquel la quantité d’ADN à amplifier est doublée. Ces cycles sont renouvelés entre 20 et 50 fois en fonction de la quantité d’ADN initial de départ et du but recherché. C’est une succession d’étapes qui consistent à une : Dénaturation de l’ADN à amplifier à 94°C ; Hybridation avec une amorce, appariement des amorces, hybridation entre 56-64°C Extension de l’amorce à 70-72°C par la Taq polymérase. L’amplification est effectuée par la répétition des cycles qui assure une duplication exponentielle de chaque brin. IV.4.1.2. La transcription inverse par réaction en chaîne par polymérase (RT / PCR) Les techniques d’amplification génique et d’hybridation amplifiée peuvent également être utilisées à des fins quantitatives pour estimer le niveau de réplication virale du VIH dans l’organisme. Cette quantification peut concerner le virus libre plasmatique (mesure de l’ARN viral ou la charge virale) ou le virus intégré dans les cellules sanguines mononuclées (ADN proviral). Les techniques de quantification de l’ARN viral plasmatique © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 86 sont utilisées à grande échelle pour le suivi des personnes infectées depuis la mise sur le marché de trousses agrées. IV.4.1.3. La RT/PCR quantitative : la charge virale La PCR en temps réel permet de suivre cycle après cycle l’évolution de la réaction PCR et la quantité d’ADN cible synthétisé, et ce grâce à un marqueur fluorescent. Elle est utilisée pour mesurer la charge virale plasmatique du VIH. Celle-ci est exprimée en nombre de copies/ml et en log (base 10) ou en unité internationale (UI). C'est le log10 du nombre de copies/ml qui est utilisé pour évaluer la variation dans le temps de la charge virale. Une variation supérieure ou égale à 0,5 est significative. La charge virale est définie en mesurant la concentration de l'ARN virale dans le sang. La quantification de l'ARN plasmatique du VIH est, avec la quantification des lymphocytes T4 ou CD4, les principaux examens du suivi biologique de l’évolution de l’infection à VIH chez un patient (Hu et al, 2001; Schneider, 2003); Ils permettent de déterminer le moment où il devient nécessaire de débuter un traitement antirétroviral et de suivre son efficacité et sa tolérance (Chaplain et al, 2006 ; Belan et al, 2008). La charge virale, indique le nombre de virions dans l'organisme (Dehée, 2003), par voie de conséquence la vitesse de réplication du VIH dans l'organisme. Par ailleurs, dans la progression normale de l’infection à VIH constatée chez la plupart des patients, la charge virale augmente dès la contamination avant de régresser. Une charge virale est généralement détectable au bout des 15 premiers jours suivant la contamination. Ce test peut entrer dans le cadre du diagnostic et peut être utilisé dans certains cas pour une détection précoce d'une séropositivité. Si une valeur positive est significative, une charge virale indétectable n'est absolument pas significative. La différence entre deux mesures de charge virale espacées dans le temps permet d'évaluer la vitesse de réplication du VIH et par voie de conséquence la progression de l'infection (Hu et al, 2001). Il y a un lien direct entre la charge virale et le niveau du déficit immunitaire, occasionné principalement par la disparition des lymphocytes T CD4 (Frippiat et al, 1999). © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 87 Figure 23 : Différentes étapes de la PCR (www.chups.jussier.fr) Malheureusement, la RT/PCR quantitative a ses limites : de nombreux réactifs pour la charge virale ont une limite de détection située entre 50 à 30 copies de particules virales par millilitre. Cela signifie qu’une charge virale inférieure à 20 copies par millilitres donne un résultat : indétectable. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 88 IV.4.1.4. La RT/PCR qualitative La transcription inverse est un processus dans lequel l’ARN monocaténaire est transcrit en ADN complémentaire (ADNc). Le couplage de la PCR à une étape de transcription inverse constitue la RT/PCR. La RT/PCR est une technique qualitative adaptée à l’étude directe des génomes viraux et des ARNm présents dans le plasma (Reynier et al, 1996; Assal et al, 2003). Une autre technique, la PCR/ADN/VIH, permet la détection de l’ADN proviral intégré au génome cellulaire. Pour les virus à ARN comme le VIH, les échantillons d’ARN sont utilisés pour fabriquer un ADNc qui servira ensuite de matrice pour la PCR. Les ADNc monocaténaires sont alors répliqués par l’ADN polymérase au cours d’un premier cycle de température. D’autres cycles sont réitérés afin d’amplifier les ADNc bicaténaires en grande quantité. IV.4.1.5. Réalisation d’une RT/PCR Pour réaliser une RT-PCR, il faut d’abord commencer par extraire les ARN ensuite les recopier in vitro en ADNc simple brin. La synthèse du second brin d'ADNc ainsi que la PCR sont effectués dans un deuxième temps par la Taq polymérase (ou par une autre ADN polymérase thermorésistante). IV.4.1.6. Synthèse de l'ADNc La synthèse d'ADNc est catalysée par des transcriptases inverses (reverse transcriptase RT en anglais). Ces enzymes sont des ADN polymérases ARN dépendantes, capables d'utiliser un brin d'ARN comme matrice pour catalyser la synthèse du brin d'ADN complémentaire. Cela correspond effectivement à l'«inverse» d'une réaction de transcription de l'ADN en ARN. Les transcriptases inverses sont issues de rétrovirus dont elles sont une des principales caractéristiques (la transcriptase inverse du Virus du Myéloblastome Aviaire ou AMV, celle du Virus de la Leucémie Murine ou Mo-MLV). Comme toutes les ADN polymérases, © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 89 les transcriptases inverses ne peuvent pas initier seules la synthèse d'un brin d'ADN. Elles ont besoin d'une amorce possédant une extrémité 3'-OH libre. Lorsque les ARN à amplifier sont polyadénylés en 3' (ARNm eucaryotes par exemple), l'amorce choisie peut être simplement une séquence polyT constituée d'une succession de désoxythymidines. Dans ce cas, tous les ARNm sont a priori copiés en ADNc. il est aussi possible de réaliser l'étape de transcription inverse directement avec les amorces spécifiques de l'ARN d'intérêt, sans utiliser d'amorce polyT (non illustré). Dans ce cas, l'ADNc obtenu est complémentaire du seul ARN d'intérêt. Figure 24: a. Schéma simplifié du principe de la réaction de transcription inverse en présence d'amorce polyT et b. La synthèse du second brin d'ADNc par la Taq polymérase Selon les protocoles (nombreux et variés), il est recommandé d'inhiber la réaction de transcription inverse et de détruire ou dénaturer l'hybride ARN/ADNc. Dans un premier temps, la Taq polymérase catalyse la synthèse du second brin d'ADNc en utilisant le premier brin comme matrice. Ensuite, la PCR permet d'amplifier le fragment d'ADNc. Certaines ADN polymérases ADN dépendantes thermostables comme celle de Thermus thermophilus (Tth), ont naturellement une activité transcriptase inverse en présence d'ions manganèse. D'où l'idée d'effectuer la réaction de transcription inverse et la PCR dans le même tube. Le produit final est un ADN dont l'un des brins est complémentaire de © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 90 l'ARN d'intérêt et l'autre brin à la même séquence que cet ARN d'intérêt (à la substitution près de U par T). IV.4.1.7. Efficacité de la PCR La majorité des protocoles expérimentaux donne une efficacité de PCR entre 1,75 et 2. Deux tendances s’affrontent alors, avec des arguments expérimentaux à l’appui. L’une considère que cette efficacité est une constante par amplicon (fragment amplifié) dans un protocole expérimental donné. L’autre estime qu’elle varie toujours significativement et qu’elle nécessite d’être constamment remesurée. Le terme efficacité peut aussi avoir deux significations selon les auteurs : • les premiers désignent l’ordre de l’exponentielle. L’équation de la cinétique s’écrit donc : [ADN] n= [ADN] initiale×En • les seconds désignent la fraction de molécule d’ADN servant effectivement de matrice. L’équation devient alors : [ADN] n= [ADN] initiale× (1 + E) n Cette efficacité de la PCR est à prendre en compte car c’est un élément fondamental pour obtenir une mesure quantitative ou établir un protocole de PCR, mais elle est généralement négligeable pour un résultat qualitatif ou en PCR en point final. IV.4.1.8. Autres techniques dérivées IV.4.1.8.1. La PCR multiplex Cette technique permet de rechercher les virus de structure proche, en amplifiant une séquence commune aux virus recherchés à l’aide d’amorces. La révélation se fait avec des sondes spécifiques de chacun des virus recherchés. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 91 IV.4.1.8.2. La PCR en Temps réel (Real Time PCR) C’est une technique permettant de suivre, en temps réel, cycle par cycle, la formation des produits amplifiés grâce à des sondes fluorescentes, hybridées et activées simultanément à l’amplification. La PCR en temps réel est une technique de quantification de sensibilité excellente ; elle permet de déterminer le taux d’ADN ou d’ARN spécifiques dans un échantillon biologique. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 92 DEUXIEME PARTIE : TRAVAUX EFFECTUES © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 93 PREAMBULE Pour atteindre l’objectif principal et les objectifs spécifiques de la présente thèse qui est de contribuer à l’amélioration de la sécurité transfusionnelle des produits sanguins labiles au Burkina Faso. Deux enquêtes socio-épidémiologiques et une étude pilote ont été conduites chez les donneurs de sang des quatre principaux centres régionaux de transfusion sanguine du pays à l’aide des moyens et de la méthodologie ci-dessous décrits. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 94 Chapitre V : Matériels et méthodes L’étude s’est déroulée à Ouagadougou (BURKINA FASO) : Dans les centres régionaux de transfusion sanguine de Ouagadougou (CRTS-O), de Bobo-Dioulasso (CRTS-B), de Fada N’gourma (CRTS-F) et de Koudougou (CRTS-K). Les données relatives aux activités des 4 centres régionaux de transfusions sanguines ont été acheminées et analysées dans le service de la coordination scientifique du CNTS. Au Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni-Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique (CERBA-Labiogène) où toutes les étapes du diagnostic par RT/PCR ont été effectuées. V.1. L’étude rétrospective V.1.1 Les donneurs de sang De janvier à décembre 2009 ; 35.401 et 4.520 donneurs de sang ont été sélectionnés respectivement dans les 3 premiers centres de transfusion sanguine du Burkina Faso (Ouagadougou, Bobo-Dioulasso et Fada N’gourma) et dans le nouveau centre régional de transfusion sanguine de Koudougou. Les donneurs ont été recrutés après avoir répondu à un panel de questions visant à exclure les polytransfusés, les femmes enceintes, les personnes ayant eu un comportement à risque dans les deux semaines précédant le don etc. Les individus des deux sexes ayant un âge compris entre 17 et 65 ans et un poids supérieur à 50 kg, ont été retenus pour les dons de sang. Les informations sociodémographiques des donneurs ont été enregistrées dans une base de données adaptée à la transfusion sanguine (EDGEBLOOD, Inlog®, France). Le sang veineux des donneurs a été recueilli dans des poches adaptées en suivant les procédures standards. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 95 L’étude rétrospective a été approuvée par le comité d’éthique du centre médical SaintCamille/CERBA à Ouagadougou. V.1.2. Procédure de sélection des donneurs de sang V.1.2.1. Catégorisation des donneurs de sang Les informations sociodémographiques des donneurs de sang sélectionnés dans les 4 centres régionaux de transfusion sanguine du pays ont été centralisées dans la base de données (EDGEBLOOD, Inlog®, France) du centre national de transfusion sanguine (CNTS). Les donneurs ont été catégorisés en donneurs de premier don et en donneur régulier : Sont considérés comme donneurs de sang de premier don, les donneurs de sang volontaires ayant à leur actif moins de deux dons de sang au cours de l’année 2009. Les donneurs de sang réguliers sont ceux ayant faits un nombre de dons supérieur ou égale à 2 au cours de l’année 2009. Enfin les catégories de donneurs de sang ont été définies en fonction du lieu de don de sang. V.1.2.2. Sérologie des donneurs de sang Tous les dons de sang sans exception collectés par les 4 centres de transfusion sanguine du Burkina ont été dépistés pour la recherche de l’AgHBs et des anticorps anti-VIH, antiVHC et anti-treponema pallidum. Les tests utilisés sont des ELISA combo de 4ème génération qui sont utilisés chez les donneurs de sang des pays à faibles revenus comme le Burkina Faso pour palier à l’absence des tests moléculaires. Dans le cas du VIH-1/2, les © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 96 ELISA combo sont utiles dans la période de séroconversion quand seul l’antigène p24 peut être détecté par les tests sérologiques. V.1.2.3. Stratégies de confirmation des marqueurs infectieux Pour les anticorps anti-VIH, anti-VHC et l’AgHBs, la procédure consiste à utiliser d’abord un test ELISA de 4ème génération. En l’absence de réaction, le sérum est considéré comme négatif aux anticorps anti-VIH, anti-VHC et à l’AgHBs. En cas de réaction positive, le sérum est considéré comme initialement réactif pour les anticorps contre les dits marqueurs. Ensuite les échantillons positifs sont re-testés avec un second test ELISA différent du premier. Les échantillons à nouveau réactifs sont considérés positifs pour le (s) marqueur(s) concerné(s). Par contre si le second test ELISA est négatif (<<donneur accroché>>), on ne conclue pas à la non-infection car le donneur peut être en phase de séroconversion et un suivi de ce dernier est obligatoire. En cas de persistance d’une discordance (premier positif et second négatif ou vice versa), un second prélèvement est effectué après plus de 4 semaines de suivi et en l’absence de facteur de risque au VIH, VHC, le donneur peut être considéré comme faussement réactif au dépistage. V.2. Présentation des techniques de dépistages utilisées au cours de l’étude V.2.1.Tests sérologiques du VIH, VHB, VHC et de la syphilis V.2.1.1.La sérologie VIH-1/2 chez les donneurs de sang en 2009 La séropositivité du VIH a été testée sur les plasmas des donneurs de sang en utilisant le Kit ELISA Vironostika VIH Uni-Form II Ag/Ab (Biomérieux®, Boxtel, Hollande) et le kit AXSYM VIH Ag / Ab COMBO II (Abbott, USA) en suivant les instructions du fabricant. Principe du test Vironostika VIH Uni-Form II Ag/Ab Le kit ELISA Vironostika VIH Uni-Form II Ag/Ab, est un test immunoenzymatique basé sur le principe du « sandwich » en une étape. Un mélange d’antigène du VIH et d’anticorps © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 97 anti-VIH combiné à de la peroxydase de Raifort (HRP) sert de conjugué, le tétramethyl benzidine (TMB) et le peroxyde sont utilisés comme substrat. La coloration qui apparaît à la fin du test indique la présence d’anticorps anti-VIH-1/2 ou d’antigène du VIH. L’absence de coloration ou une coloration très claire indique l’absence d’anticorps ou d’antigène du VIH. Les cupules microelisa sont recouvertes de plusieurs antigènes du VIH : gp160 du VIH-1, de peptide ANT703 du VIH-1, de peptide d’env du VIH-2 (acides aminés 592 –603) ; et d’anticorps anti p24 VIH-1. Interprétation des résultats : Un résultat négatif signifie que l’échantillon testé ne contient pas d’anticorps anti-VIH1, anti-VIH2, anti-VIH-1 du groupe O ou d’antigène VIH-1 ou encore en dessous du seuil de détection du Vironostika VIH Uni- Form II Ag/Ab. Un résultat positif signifie que l’échantillon testé contient des anticorps anti-VIH-1, anti-VIH2, anti- VIH-1 du groupe O et/ou des antigènes VIH-1 ou un facteur non spécifique. Limite du test : Tous les tests immunoenzymatiques très sensibles peuvent donner des réactions non spécifiques. C’est pourquoi, la spécificité des échantillons positifs reproductibles doit être confirmée avec une méthode appropriée. Principe du dosage AXSYM VIH Ag / Ab COMBO II Le dosage AXSYM VIH Ag/Ab Combo est basé sur la technologie MEIA (Microparticle Enzyme Immunoassays) et utilise des microparticules recouvertes d’antigènes recombinants du VIH (E. coli) et d’anticorps (souris, monoclonaux) dirigés contre l’antigène p24 du VIH, afin de capturer les anti-VIH-1/VIH-2 et l’antigène p24 du VIH respectivement. Les anticorps / l’antigène capturés réagissent avec des antigènes recombinants, des peptides et des anticorps monoclonaux anti-p24, tous marqués à la biotine. Les complexes marqués à la biotine sont détectés par un complexe conjugué d’anticorps anti-biotine : phosphatase alcaline. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 98 Interprétation des Résultats Le protocole du dosage AXSYM VIH Ag/Ab Combo calcule la valeur seuil (CO) à partir de la valeur moyenne des 3 répliques du calibrateur indice et mémorise le résultat. La valeur seuil est déterminée en ajoutant 27,5 à la valeur moyenne du calibrateur indice. Tableau II: Interprétation des résultats avec le kit AXSYM VIH Ag/Ab Résultat Annotation Interprétation Procédure de Réanalyse ≥ 1,00 Réactive Réactif (positif) Réanalyse en double 0,90 à < 1 Grayzone Zone grise (réactive) Réanalyse en double < 0,90* Négatif Négatif Réanalyse inutile Initial (S/CO) *Si l’option 2 est sélectionnée pour le paramètre 80, négative se traduit par l’annotation“< 1.00 S/CO”. “Valeur seuil (CO) = Echantillon / Valeur seuil. “ V.2.1.2. La sérologie des hépatites virales B et C des donneurs de sang en 2009 L’antigène de surface de l’hépatite B (AgHBs), les anticorps dirigés contre le VHC ont été détectés en utilisant respectivement les tests suivants : Hepanostika HBsAg Ultra (Biomérieux®, Boxtel, Hollande), Monolisa® Ag HBs PLUS (Bio-Rad®, Marnes la Coquette, France), et Hepanostika VHC Ultra (Beijing United Biomedical Co®, Ltd). Tous les plasmas positifs pour le VIH, AgHBs et VHC ont été confirmés en utilisant un second test ELISA (Bio-Rad®, Marnes la Coquette, France). Principe du test Hepanostika HBsAg Ultra Le kit ELISA Hepanostika HBsAg Ultra, est un test immunoenzymatique basé sur le principe du « sandwich » en une étape utilisant trois anticorps monoclonaux sélectionnés pour leur capacité à se lier aux différents sous-types de l’AgHBs actuellement reconnu par l’OMS. La phase solide est constituée de 12 barrettes de 8 cupules en polystyrène © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 99 sensibilisées avec le premier anticorps monoclonal anti-HBs (murin, IgG2b). Les deux autres anticorps monoclonaux sont couplés à la peroxydase. Interprétation des résultats. Echantillons négatifs. Les échantillons dont la densité optique est inferieure à la valeur seuil sont considérés négatifs d’après le kit d’analyse. Echantillons indéterminés. Toutefois, les résultats situés juste au dessous de la valeur seuil (VS- 10%) doivent être interpréter avec prudence (il est conseillé de re-tester les échantillons correspondant en double lorsque les systèmes utilisés et les procédures du laboratoire le permettent). Echantillons positifs. Les échantillons dont la densité optique est supérieure ou égale à la valeur seuil sont considérer comme initialement positifs et doivent être re-tester en double avant l’interprétation finale. Apres répétition, l’échantillon est considérer positif d’après le test si au moins une des mesures est positive, c’est-à-dire supérieure ou égale a la valeur seuil. L’échantillon est considéré négatif selon le test si ces deux valeurs sont toujours inferieures à la valeur seuil. Les échantillons qui ont été ré-tester en double et trouvés négatifs selon le test, mais pour lesquels une des valeurs est proche de la valeur seuil (VS10%) doivent être considérés avec prudence (ces patients doivent être re-tester avec une autre méthode ou sur un autre prélèvement Valeur seuil : on fait la moyenne des DO des 4 contrôles négatifs (R3) + 0,040 D.O (R3) = 0.020+0.021+0.022+0.015 = 0.078/4 = 0.020 = DO (R3) Valeur seuil (V.S) = 0.020 + 0.040 = 0.060. Principe du test Hepanostika VHC Ultra Le kit ELISA, Hepanostika VHC Ultra utilise un immunoabsorbant tapissant les puits de la microplaque, composé de peptides synthétiques propres aux anticorps se fixant sur les © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 100 segments antigéniques de nucléocapside, des régions NS3, NS4, NS du virus de l’hépatite C. Pendant la réalisation du test, les contrôles et les échantillons sont ajoutés aux puits et incubés. S’ils sont présents, les anticorps anti-VHC se fixeront sur l’immunoabsorbant. Après une opération de rinçage pour éliminer les anticorps non fixés et les autres composants du sérum, une préparation standardisée de peroxydase de rainfort et d’anticorps de chèvre spécifiques pour les IgG humains sont ajoutées dans chaque puits. On laisse ensuite cette préparation réagir avec les anticorps fixés spécifiques aux déterminants antigéniques présents dans l’immunoabsorbant. Apres fixation une seconde opération de rinçage pour éliminer les anticorps couplés à la peroxydase de rainfort non fixés; une solution de substrat contenant du peroxyde d’hydrogène et du TMB (3,3’, 5,5’tétramethylbenzidine)est ajouté dans chaque puits . La solution vire au bleu proportionnellement au volume d’anticorps VHC présents dans les échantillons de sérum ou de plasma testés. La réaction enzymatique pour une concentration en substrat donnée est arrêtée par l’addition d’une solution d’acide sulfurique qui fait virer la couleur au jaune. Les changements de couleur observés dans chaque puits sont alors mesurés par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 450 nm. Les échantillons dont les valeurs d’absorbances sont égales ou supérieures à la valeur seuil sont initialement considérés comme réactifs. Les échantillons qui présentent la première fois un résultat positif doivent être soumis à un nouveau test en double. Si l’échantillon ne réagit pas à aucun des deux nouveaux tests, il est considérer comme non réactif aux anticorps ant-VHC. Si l’échantillon réagit à un ou aux deux nouveaux tests, il est considéré comme ayant une réaction reproductible aux anticorps anti-VHC. Interprétation des résultats. Echantillons négatifs. Les échantillons dont les valeurs d’absorbances sont inferieures à la valeur seuil sont considérés no réactifs (négatifs). © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 101 Echantillon positifs. Les échantillons dont les absorbances sont égales ou supérieures à la valeur seuil sont initialement considérés réactifs. Les échantillons considérés positifs à un premier test doivent être confirmés par une reprise. Si l’échantillon est positif au test de reprise, il est considéré contenant des anticorps VHC donc réactif. Si au test de reprise l’échantillon est considéré négatif alors le patient peut être considéré séronégatif au VHC. Valeur seuil = 0.27 x PCx Exemple : PCx = 1.345 + 1.362 + 1.391 = 4.098 / 3 = 1.366 V.S = 0.27 x 1.366 = 0.369 Avec PCx représentant la moyenne des contrôles positifs. V.2.1.3. La sérologie syphilitique des donneurs de sang en 2009 La sérologie syphilitique des donneurs de sang a été testée par Rapid Plasma Reagin test (RPR) (Cypress Diagnostics ®, Belgique). Les anticorps de la syphilis ont été confirmés par un test d’agglutination de Treponema pallidum (TPHA, Cypress Diagnostics®, Belgique). Principe du test RPR Le kit Rapid Plasma Reagin test (RPR) (Cypress Diagnostics ®, Belgique) est un test qualitatif qui fait appel à des particules de charbon enduites d’un mélange d’antigènes lipidiques qui se combinent aux anticorps de Treponema pallidum présents dans le sérum ou le plasma du patient. Ces particules sont en suspension dans un milieu contenant des substances destinées à éliminer les réactions non spécifiques. Les réactions positives sont indiquées par l’agrégation des particules. L’interprétation de l’agglutination se fait à l’œil nu. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 102 Principe du test d’agglutination de Treponema pallidum (TPHA-VDRL) C’est un test d’agglutination indirecte pour la détermination d’anticorps spécifique de Treponema pallidum. En présence d’anticorps anti-T. pallidum, les érythrocytes de volailles recouverts d’antigènes de T. pallidum réagissent dans les puits de la plaque de microtitration en formant des agglutinations d’aspects caractéristiques. Les anticorps dirigés contre des tréponèmes non pathogènes sont absorbés par un extrait de tréponème de Reiter contenus dans la suspension cellulaire. Interprétation des résultats. La présence d’une agglutination dans les puits indique un résultat positif à condition qu’aucune agglutination ne soit présente dans le puits de contrôle. Le titre se définit comme la dilution maximale où l’on observe encore une agglutination (puits 3,1 :80 ; puits 4,1 :160 etc.). Les échantillons réagissant avec les anticorps T. pallidum à des titres ≥ 1 :80 doivent être considérer comme positifs. Le TPHA-VDRL un test de dépistage, les échantillons positifs doivent être vérifiés par un test de confirmation. Photographie 1 : A gauche spectrophotomètre lecteur de microplaques (Biorad, France) à droite appareillage de l’automate l’AXSYM (Abbott, USA). © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 103 V.3. Amplification de l’ARN viral du VIH-1 V.3.1. Constitution des pools de plasmas des donneurs de sang Les échantillons inclus dans cette partie de l’étude ont été sélectionné au préalable en fonction de leurs réactivités à l’ELISA puis repartis en pools de 5 plasmas. Cent vingt (120) des 151 échantillons sélectionnés ont été répartis en 20 pools en tenant compte des densités optiques. Trente un (31) échantillons n’ayant pas été testés. Chaque pool était constitué de 200 μl du plasma de chaque donneur soit 1 ml de plasma au total par pool. Les pools étaient homogénéisés par agitation au vortex pendant 10 secondes. Le système de poolage est interdit par la législation française. Au Burkina Faso, aucune législation en la matière n’a encore été mise en place. V.3.2. Extraction de l’ARN viral (kit QIAamp viral ARN mini kit, Hilden, Allemagne) L’extraction se résume en quelques étapes principales qui sont : Transférer 150µl de plasma de chaque pool dans des tubes Eppendorf. Ajouter 450µl de RL dans chaque tube puis vortexer pendant quelques secondes et incuber 15mn à température ambiante. Ajouter 600µl de RBS dans chaque tube puis vortexer un moment. Transférer 650µl de l’ensemble dans des tubes colonnes. Centrifuger à 12000 rpm pendant 1mn. Mettre le restant de la solution dans les tubes colonnes et centrifuger à 12000rpm pendant 1mn. Jeter les tubes collecteurs et mettre les tubes colonnes dans de nouveaux tubes collecteurs. Ajouter 500µl de HS puis centrifuger à 12000rpm pendant 1mn, ensuite mettre les tubes colonnes dans de nouveaux tubes collecteurs. Ajouter 650µl de LS et centrifuger à 12000rpm pendant 1 mn et mettre les tubes colonnes dans de nouveaux tubes collecteurs. Centrifuger à 14000 rpm 2mix (2 fois). Mettre les colonnes dans de nouveaux tubes Eppendorf : ajouter 50µl RNase Free Water à 8000rpm pendant 1mn. L’ARN est ainsi élué des colonnes. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 104 V.3.3. Obtention de L’ADNC Rétrotranscription (VIH-1 RNA direct, Diatech, Italie) Le Master-Mix utilisé pour la rétrotranscription était composé de: - 1µl de H2Od-PCR - 2µl de Taq buffer 10X - 1µl de DNTP-Mix 110 - 5µl de Primer RT-K - 0,5µl de MoMuLV-RT26 (Reverse transcriptase) - 0,5µl de Rnasin 26 - 10µl d’ARN extrait La rétrotranscription a été réalisée dans le thermocycleur dans les conditions suivantes : - 42ºC pendant 25mn - 94ºC pendant 5mn (pour dénaturer la transcriptase inverse) Amplification L’amplification du VIH-1 est faite en utilisant le couple d’amorces VIH-1-For : 5’AGCAGTACAAATGGCAGTGTTCATTCACAATT-3’ et VIH-1-Rev : 5’- TTTATCTTGTATTACTACTGCCCCTT-3’ qui détecte la région pol du VIH-1 (HXB2, GenBank K03455). Le fragment d’ADN obtenu après amplification est de 233 paires de base. Le Master-Mix utilisé pour l’amplification était composé de : - 66,5µl de H2Od-PCR - 8µl de Taq buffer 10X - 5µl de Primers VIH AMP - 0,5µl de Taq polymerase (5U/ µl) (Diatech) Un volume de 80µl de ce Master-Mix a été ajouté à l’ARN préalablement rétrotranscrit en ADNc. L’amplification a consisté en 35 cycles de : - Dénaturation : 94ºC 40s - Hybridation : 60ºC 45s - Extension : 72ºC 60s Une extension finale à 72°C pendant 15mn et un hold à 4°C ont terminé la RT-PCR. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 105 Après la réalisation de la PCR, l’ADN amplifié (les amplicons), a été mis à migrer par électrophorèse sur gel d’agarose à 2%. La révélation sous UV et la photographie ont été faite à l’aide de l’appareil Gene Flash de Syngene Bio Imaging muni d’une imprimante Mitsubishi P93. Photographie 2: Thermocycleur 9700 (Applied Biosystems, USA) V.3.4. Préparation du gel d’agarose Préparation du TBE (solution tampon Tris/Borate/EDTA) 1X à partir du TBE 10X : tampon de course Dilution 1/10 : 100ml de TBE10X +900ml H2Od solution de 100ml de TBE 1X Préparation du gel d’agarose 2% 4g d’agarose +200ml de TBE 1X Cuisson à micro onde (2mn, 460W) Ajout de 16µl de Bromure d’Ethidium (10mg/ml) Le gel est coulé délicatement dans la cuve à électrophorèse (BIORAD) Dépôt des échantillons sur le gel en s’assurant que le tampon de migration préalablement versé dans la cuve couvre de quelques millimètres le gel. 3 µl de bleu de migration Par échantillon/puits 8 µl d’ADNc amplifié 3 µl du ladder dans le puits n°1 - Electrophorèse et Révélation sous UV : Course de l’électrophorèse : 120V pour 45minutes Révélation sous UV – Photo. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 106 Photographie 3 : A gauche une Cuve d’électrophorèse couplée à un générateur (CERBA/Labiogène) à droite course électrophorétique des acides nucléiques du VIH-1 sur gel d’agarose à 2% V.4. Analyses statistiques Les analyses statistiques ont été faites avec le logiciel Standard Statistical Package for Social Sciences (SPSS) version 17 pour Windows et par le logiciel EPI Info version 6.04 dfr (CDC, Atlanta, USA). Les odds ratios (OR) ont été calculés pour déterminer la prévalence du VIH, du VHB, du VHC et de la syphilis et l’impact des facteurs sociodémographiques sur le risque associé au don de sang dans les centres de transfusions sanguines au Burkina Faso. Le seuil de signification statistique a été fixé à p < 0,05. V.4.1. Le taux d’incidence Le taux d'incidence chez les donneurs de sang réguliers a été calculé en fonction des formules établies par Schreiber et al. (1996), Busch et al. (2005) et O'Brien et al. (2007). En divisant le nombre de cas d'incidence au cours de la période couvrant l'étude par le nombre total d'année/personne. Les années/personnes ont été calculées en additionnant les intervalles de temps entre les différents dons (inter-don) pour tous les donneurs de © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 107 sang. Mais en ne considérant que la moitié de l'intervalle pour les cas d'incidences en supposant que l'infection a été contractée par le donneur à la mi-période du temps qui s’est écoulé entre le dernier don négatif et le premier don positif pour un des marqueurs viraux dépistés en transfusion sanguine (VIH,VHB,VHC). Le taux d'incidence pour les donneurs de sang de premier don a été calculé en multipliant l'incidence pour 100.000 dons par des facteurs de conversions déjà établis pour chaque pathologie virale présente dans la population de donneurs de sang étudiée. Les facteurs de conversions pour le VIH et le VHC ont été établis à partir des taux incidences trouvés dans la population générale au Burkina Faso qui sont comparativement plus élevés que ceux calculés dans d'autres pays ; où pour ces mêmes marqueurs les facteurs de séroconversions sont respectivement égales à 2,4 et 3,2 pour le VIH et le VHC (Janssen et al, 1998, Dodd et al, 2002, Stramer et al, 2004). Les facteurs de conversions ont été calculés en divisant séparément pour les donneurs réguliers et les donneurs de sang de premier don le nombre des dons positifs par le nombre total des dons. Ensuite le ratio obtenu pour les donneurs de sang de premier don est divisé à son tour par celui provenant des donneurs réguliers. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 108 TROISIEME PARTIE : RESULTATS ET DISCUSSION © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 109 Chapitre VI : Résultats et discussion VI. 1. Séroprévalences des maladies transmissibles par transfusion sanguine au Burkina Faso VI.1.1. Prévalence des marqueurs infectieux chez les donneurs de sang de Koudougou VI.1.1.1. Description de la cohorte du centre régional de transfusion sanguine de Koudougou L’étude de Koudougou a concernée 4.520 donneurs de sang volontaires et non rémunérés. L’âge des donneurs était compris entre 17 et 64 ans avec une tranche d’âge majoritaire de 20 à 29 ans comprenant 2.730 (60,40 %) donneurs (tableau III). La cohorte de l’étude était composée de 3418 (75,62 %) hommes et de 1102 (24,38 %) femmes soit un sex ratio de 3/1 ; 419 (9,27%) individus étaient des donneurs réguliers, 1.944 (43,01%) étaient du groupe sanguin O et 4.179 (92,46%) étaient rhésus D (RH) positifs. La majorité des donneurs de sang ont été recrutés en zones urbaines 3.005 (66,48 %) ; et les donneurs de sang réguliers se retrouvaient dans la tranche d’âge de 20 à 29 ans soit 269 (9,85 %) donneurs (tableau III). VI.1.1.2. Épidémiologie du VIH, du VHB, du VHC, de la syphilis chez les donneurs de premier don des zones urbaine et rurales du Burkina Faso en 2009 Les prévalences des anticorps anti-VIH chez les donneurs de sang de premier don étaient presque similaires en zones urbaine et rurale dans les 4 centres de transfusion sanguine (Tableau IV). Les différences significatives des prévalences de l’AgHBs et des anticorps anti-VHC ont été trouvées chez les donneurs de sang de premier don des zones rurales comparativement aux zones urbaines dans les centres de Ouagadougou (p = 0,006 et p <0,001) et Bobo-Dioulasso (p < 0,001 et p = 0, 01). La syphilis, pathologie souvent associée à l’infection au VIH, était significative plus élevée chez les donneurs de sang de © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 110 premier don des zones rurales comparativement aux zones urbaines dans tous les centres de transfusion à l’exception de Koudougou (Tableau IV). Prévalence des marqueurs infectieux au centre de transfusion de Koudougou Les prévalences de l’AgHBs étaient élevées chez les donneurs de sang de premier don, de sexe masculin (P < 0,001) et des zones rurales (P < 0,001) comparativement aux donneurs réguliers, de sexe féminin et ceux provenant des zones urbaines (tableau VI). Des séroprévalences significatives du VHC ont été enregistrées chez les donneurs de la tranche d’âge >20 ans (P < 0,001) et > 40 ans (P = 0,005) comparativement au groupe d’âge de 30 a 40 ans (tableau V). Mille trois cent quarante huit donneurs de sang volontaires non rémunérés (1.348) soit 29,82% étaient infectés par au moins un agent pathogène et 149 (3,30%) avaient des infections multiples. La séroprévalence du VIH, AgHBs, VHC et de la syphilis était respectivement de 2,21%; 14,96%; 8,69% et 3,96%. Chez les donneurs de sang, les doubles ou triples infections les plus fréquentes étaient les suivantes : AgHBs-VHC (1,39%), AgHBs-syphilis (0,66%) et AgHBs -VHC-syphilis (0,11%) (Tableau IV). VI.1.2. Prévalence des agents infectieux chez les donneurs de sang de Ouagadougou, Bobo-Dioulasso et de Fada N’gourma. VI.1.2.1. Description de la population d’étude Comme le montre le tableau VII, sur un total de 35.401 donneurs de sang ; 56,6% étaient dans le groupe d'âge de 18 à 25 ans, l'âge médian des sujets de l'étude était de 24 ans (1767 ans). Parmi ceux-ci ; 74,9% des donneurs de sang étaient des hommes et 25,1% étaient des femmes. La cohorte d’étude comportait 31.405 donneurs de sang de premier don (88,7%) et 3.996 donneurs de sang réguliers (11,3%). Le pourcentage des donneurs de sang réguliers était compris entre 7,9 et 12,8% selon les centres. Parmi les donneurs © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 111 réguliers 70,4% ; 22,4% ; 7,2% avaient fait respectivement deux, trois et quatre dons de sang en 2009 (tableau VI). Les donneurs de sang ont été principalement recrutés dans les écoles (31,8%), les centres de transfusions sanguines (27,7%) et les provinces (10,4%). Tableau III : Caractéristiques sociodémographiques des donneurs de sang de Koudougou en 2009 Type de donneurs Caractéristiques Total Donneurs de sang Donneurs de premier don réguliers N (%) N (%) N (%) Homme 3.418 (75,62) 3.073 (89,91) 345 (10,09) Femme 1.102 (24,38) 1.028 (93,28) 74 (6,72) < 20 1.177 (26,04) 1.100 (26,82) 77 (18,38) 20-29 2.730 (60,40) 2.461 (60,01) 269 (64,20) 30-40 424 (9,38) 363 (8,85) 61 (15,56) > 40 189 (4,18) 177 (4,32) 12 (2 ,86) Zone urbaine 3.005 (66,48) 2.624 (64,00) 383 (91,40) Zone rurale 1.515 (33,52) 1.477 (36,02) 38 (9,01) O 1.944 (43,01) 1.737 (89,35) 207 (10,65) A 1.106 (24,47) 1.018 (92,04) 88 (7,96) B 1.206 (26,68) 1.103 (91,46) 103 (8,54) AB 264 (5,84) 243 (92,05) 21 (7,95) Positif 4.179(92,46) 3.795(90,81) 384(9,19) Négatif 341(7,54) 306(89,74) 35(10,26) Sexe Age Lieu du don de sang Groupe sanguin Rhésus © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 112 Tableau IV : Prévalence des marqueurs infectieux chez les donneurs de sang de premier don en zones urbaine et rurale des les 4 centres de transfusion sanguine du Burkina Faso en 2009 Marqueurs infectieux CRTS VIH AgHBs VHC Syphilis zone % Urbaine (N = 1.474) 2,4 Rurale (N = 2.522) 2,7 16,2 9,9 5,5 Urbaine (N = 7.757) 1,0 10,9 4,2 0,5 Rurale (N = 435) 0,7 11,5 6,7 1,4 Urbaine (N = 4.710) 1,2 17,9 9,1 2,0 Rurale (N = 625) 0,8 19,8 10,2 3,4 Urbaine (N = 1.931) 2,0 13,9 8,6 3,8 Rurale (N = 1.112) 2,9 Ouagadougou P* % 13,0 0,69 Fada P 5,9 <0,001 0,04 0,03 0,36 <0,001 20,1 0,7 9,0 0,3 4,6 * Valeur P : comparaison entre les prévalences des marqueurs en zones urbaine et rurale N= nombre de donneurs de premier don © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO P <0,001 0,01 0,24 0,13 % 2,4 0,70 0,37 Koudougou % 0,006 0,54 Bobo P Page 113 Tableau V : Caractéristiques sociodémographiques des donneurs volontaires non rémunérés et infections au VIH, à la Syphilis au VHB, et au VHC à Koudougou Total des donneurs de sang N VIH positif N (%) Homme 3.418 78 (2,28) 1,15 (0,70-1,90) 0,575 309 (9,04) 1,77 (1,16-2,73) 0,005 549(16,06) 1,47 (1,19-1,82) < 0,001 Femme 1.102 22 (2,00) 1,00 - 84 (7,62) 1,00 - 127(11,52) 1,00 < 20 1.177 23 (1,95) 1,67 (0,60-5,04) 0,297 124 (10,54) 1,15 (0,63-2,14) 0,622 168 (14,27) 20-29 2.730 65 (2,38) 2,04 (0,79-5,79) 0,118 176 (6,45) 1,01 (0,58-1,80) 0,971 30-40 424 5 (1,18) 1,00 - 21 (4,95) 1,00 > 40 189 7 (3,70) 3,22 (0,91-11,85) 0,037 21 (11,11) Zone urbaine 3.005 49 (1,63) 1,00 - Zone rurale 1.515 49 (3,23) 2,02 (1,33-3,07) 4.101 96 (2,34) 419 4 (0,95) OR (IC, 95%) P Syphilis positif N (%) AgHBs positif N (%) Caractéristiques OR (IC, 95%) P OR (IC, 95%) P VHC positif OR (IC, 95%) P 309 (9,04) 1,20 (0,93-1,56) 0,146 - 84 (7,62) 1,00 - 1,30 (0,91-1,86) 0,127 124 (10,54) 2,20 (1,37-3,75) < 0,001 434 (15,90) 1,48 (1,07-2,06) 0,015 176 (6,45) 1,32 (0,81-2,17) 0,237 - 48 (11,32) 1,00 - 21 (4,25) 1,00 - 1,13 (0,43-2,86) 0,787 26 (13,76) 1,25 (0,73-2,14) 0,393 21 (11,11) 2,40 (1,22-4,71) 0,005 259 (8,62) 1,00 - 392 (13,04) 1,00 - 259 (8,62) 1,00 - < 0,001 134 (8,84) 1,03 (0,82-1,29) 0,835 284 (18,75) 1,54 (1,30-1,82) < 0,001 134 (8,84) 1,03 (0,82-1,29) 0,835 2,49 (0,88-7,98) 0,066 366 (8,92) 1,76 (0,90-3,56) 0,083 653 (15,92) 3,26 (2,09-5,13) < 0,001 366 (8,92) 1,42 (0,93-2,18) 0,086 1,00 - 27 (6,44) 1,00 - 23 (5,49) 1,00 - 27(6,44) 1,00 - N (%) Sexe Age Lieu du don de sang Type de donneurs Donneurs de premier don Donneurs réguliers OR= Odds Ratio; IC= Intervalle de confiance ; Zone urbaine = Centre de transfusion, Communes urbaines, Ecoles et Universités, Les valeurs de P sont en gras, © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 114 VI.1.2.2. Prévalence des marqueurs infectieux chez les donneurs de sang volontaires de premier don Le pourcentage de donneurs de sang bénévoles de premier don était respectivement de 17% ; 23,1% et 23,9% à Bobo-Dioulasso, à Ouagadougou et à Fada N’gourma. Les prévalences des anticorps anti-VIH, l’AgHBs, les anticorps anti-VHC et l’anti-tréponème étaient respectivement de 1,8%, 13,4, 6.3 et 2,1%. Les prévalences des marqueurs infectieux dépistés en transfusion sanguine étaient nettement plus faibles dans le centre de transfusion de Bobo-Dioulasso (p <0.001). En revanche, au centre régional de transfusion de Ouagadougou on a retrouvé une prévalence significativement plus élevée d'anticorps anti-VIH. Des prévalences significativement plus élevées de l’AgHBs et des anticorps anti-VHC ont été trouvées chez les donneurs de sang de Fada N’gourma. Les comparaisons des prévalences des quatre marqueurs dépistés (VIH, VHC, AgHBs et Syphilis) étaient significatives avec des valeurs de p <0,001 entre les centres, sauf pour le VIH entre Bobo-Dioulasso et Fada N’gourma (tableau VII). Dans l'ensemble ; 1,7% (589/35.401) des donneurs de sang avaient des infections multiples. Dans une population à forte prévalence au VIH et à l’infection chronique de l’hépatite B, le VIH-AgHBs représentait prés de 15,9% des co-infections enregistrées. Les prévalences des co-infections VHC-AgHBs et VHC-VIH sont similaires et concordantes avec les prévalences globales respectives 0,1 et 0,9%. Dans le centre de transfusion de Fada N’gourma, la co-infection la plus fréquente rencontrée a été l’AgHBs-VHC. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 115 Tableau VI : Répartition des donneurs de sang par centre de transfusion sanguine Caractéristiques Ouagadougou Bobo-Dioulasso Fada N’gourma Total (%) (%) (%) (%) 19.582 9.434 6.385 35.401 17.294 8.231 5.880 31.405 Donneurs réguliersa 2.288 (11,7) 1.203 (12,8) 505 (7,9) 3.996 (11,3) 2 donsb 1.642 (71,8) 782 (65,0) 388 (76,8) 2.812 (70,4) 3 dons 501 (21,9) 290 (24,2) 105 (20,8) 896 (22,4) 4 dons 145 (6,3) 131 (10,8) 12 (2,4) 288 (7,2) Homme 1.815 (79,3) 1.024 (85,1) 391 (77,4) 3.230 (80,8) Femme 473 (20,7) 179 (14,9) Nombre total des donneurs Donneurs de premier don a. 114 (22,6) 766 (9,2) Pourcentage est obtenu à partir du nombre total des donneurs des centres de transfusion b. Pourcentage obtenu à partir du nombre total des donneurs réguliers © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 116 Tableau VII : Prévalence des marqueurs infectieux confirmés et des co-infections chez les donneurs volontaires de premier don Co-Infections Anti-VIH AgHBs Anti-VHC Antisyphilis Multiples infections2 Total (%) Anti-VIH AgHBs 4331 77 3.706 35 298 11 101 IBCS 1, IBC 6, IBS 2, ICS 2, BCS 12 1.566 44 491 567 (1,8) 4203 (13,4) 1964 (6,3) 664 (2,1) 28 158 10 75 IBCS 1, IBC 5,IBS 2, ICS 2, BCS 9 886 27 371 < 0,0001 5,0 (3,7-6,9) 425 (2,5) 2334 (13,5) 1.116 (6,5) 497 (2,9) Anti-VHC Anti-Syphilis Ouagadougou Anti-VIH AgHBs Anti-VHC Anti-Syphilis Valeur-P3 O vs B OR (IC,95% 321 < 0,0001 2,5 (2,0-3,2) 56 2.028 < 0,0001 1,3(1,2-1,4) < 0,0001 1,5 (1,4-1,7) Bobo-Dioulasso Anti-VIH AgHBs Anti-VHC Anti-Syphilis Valeur-P B vs F OR4 ( IC,95%) 70 8 839 3 43 300 0,75 1,1 (0,8-1,5) < 0,0001 1,6(1,4-1,8) < 0,0001 1,9 (1,6-2,2) 42 13 839 4 97 380 < 0,0001 2,4 (1,8-3,2) < 0,0001 1,3(1,2-1,4) 0,0003 1,2 (1,1-1,4) 0 9 5 32 < 0,0001 3,5 (2,5-5,0) BCS 2 81 (1,0) 901 (11,0) 353 (4,3) 48 (0,6) 1 17 12 88 0,0004 1,4 (1,2-1,8) IBC 1, BCS 1 61 (1,1) 968 (18,0) 495 (9,2) 119 (2,2) Fada N’gourma Anti-VIH AgHBs Anti-VHC Anti-Syphilis Valeur-P O vs F OR, (IC,95% ) 1. Les chiffres en gras indiquent le nombre de cas d’infections . Les autres chiffres indiquent le nombre de cas de plus de deux infections 2. Les échantillons ayant plusieurs marqueurs (plus de 2 marqueurs) sont indiqués dans la sixième colonne du tableau (I = anti-HIV, B =AgHBs, C= anti-VHC, S = anti-treponema) 3. O = Ouagadougou; B = Bobo-Dioulasso; F = Fada N’gourma 4. OR = Odds ratio, IC = Intervalle de confiance © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 117 VI.2. Incidence des marqueurs viraux infectieux chez les donneurs de sang de premier don et les donneurs réguliers de Ouagadougou, Bobo-Dioulasso et de Fada N’gourma Trois mille neuf cent quatre-vingt-seize (3.996) donneurs de sang ont faits entre 2 et 4 dons de sang en 2009. Les intervalles de temps entre ces dons (8.384) ont permis de calculer les infections incidentes pour les anti-VIH, anti-VHC et l’AgHBs dues à des dons effectués au cours de la période de fenêtre immunologique silencieuse du donneur (tableau VIII). Comme constaté chez les donneurs de sang de premier don, les prévalences des différents marqueurs viraux dépistés en transfusion sanguine variaient considérablement entre les centres. Le centre de transfusion de Bobo-Dioulasso a montré une baisse significative du taux d'incidence pour chaque marqueur par rapport aux deux autres centres. Cependant, des taux d'incidences relativement élevés ont été observés. Des différences significatives entre les prévalences des marqueurs viraux ont été également observées chez les donneurs de sang de premier don. Le taux d’incidence était environ trois fois plus élevé pour le VIH, 10 fois pour l’infection par le VHB et cinq fois pour le VHC (tableau VIII). Les infections incidentes ont été trouvés essentiellement chez les hommes (88,5%), quel que soit le marqueur. Les donneurs réguliers étaient recrutés pour la plus part dans les centres de transfusions (66,8%), les écoles (21,3%) et les provinces (5,8%) lors des collectes mobiles. Les séroprévalences des hépatites B (22,2%) et C (19,1%) étaient reparties de façon disproportionnée chez les donneurs recrutés en collecte mobile (provinces) ainsi que chez les donneurs du secondaire (respectivement 37,4 et 26,4%, pour les mêmes marqueurs). Dans l'ensemble ; 5,6% des donneurs de sang réguliers qui fréquentaient les centres de transfusions présentaient une séroconversion pour au moins un marqueur viral. Les donneurs de sang volontaires recrutés dans les écoles et au cours des collectes mobiles en provinces présentaient un taux de séroconversion élevé (respectivement 9,5 et 22,8%, p <0,0001 entre les centres de transfusion et les écoles ou les collectes en provinces et P = 0,0032 entre les écoles et les provinces). © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 118 Tableau VIII : Incidence du VIH, du VHB et du VHC chez les donneurs réguliers et les donneurs de premier don dans les trois centres régionaux de transfusion sanguine au Burkina Faso VIH VHB VHC VIH VHB VHC Ouagadou gou BoboDioulasso Fada2 Ouagadou gou BoboDioulasso Fada2 Ouagadou gou BoboDioulasso Fada2 total total total 22.214 11.180 6.512 22.214 11.180 6.512 22.214 11.180 6.512 39.906 39.906 39.906 4.446 2.859 1.046 4.446 2.859 1.046 4.446 2.859 1.046 8.351 8.351 8.351 36 9 8 75 9 12 73 19 22 53 96 114 3679,1 1336,5 3340,1 7567,9 1336,4 4986,0 7380,7 2812,4 9080,3 2802,2 5038,9 5978,2 Total des dons 17.292 8.246 5.379 17.292 8.246 5.379 17.292 8.246 5.379 30.917 30.917 30.917 Dons infectés 425 81 61 2.334 901 968 1.116 353 495 567 4.203 1.964 Facteur de conversion 3,04 3,12 1,48 8,00 34,71 15,69 3,93 6,44 4,38 2,89 11,83 4,65 IR/100.000 dons 11167,5 4170,6 4952,6 60553,3 46385,7 78213,0 29010,9 18116,2 39729,6 8097,4 59589,3 27819,3 Total des dons Dons réguliers Dons non infectés Dons infectés IR1/100.000 dons Dons faits par des donneurs de premier don 1. IR = Taux d’incidence 2. Fada N’gourma © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 119 VI.3. Contribution de la PCR à l’amélioration du diagnostic des agents infectieux au Burkina Faso : RT-PCR du VIH-1 au centre de transfusion de Ouagadougou Justification et contexte de l’étude La modestie des moyens alloués aux centres de transfusion sanguine du Burkina ne permet pas l’utilisation en routine des tests moléculaires bien que leur utilité ait été démontrée dans la réduction de la période fenêtre. Au CRTS de Ouagadougou, chaque année plus de 2000 donneurs de sang sont accrochés pour le dépistage des anticorps anti-VIH. Certes les donneurs accrochés sont éliminés du circuit de distribution des PSL. Cependant, le processus de confirmation du statut sérologique du donneur accroché (douteux) peut prendre plusieurs semaines voir des mois, pour cela le donneur de sang douteux doit revenir au CRTS-O pour un second prélèvement. Peu de donneurs accrochés reviennent pour le prélèvement de confirmation (perte d’un donneur éventuel). Ceci a un impact sur la disponibilité du sang et la fidélisation des donneurs car 1/3 des donneurs accrochés pour le VIH s’avèrent être de faux positifs pour ce marqueur et le risque qu’ils ne reviennent plus au CRTS-O est aussi à considérer. Le but de cette étude était d’évaluer la RT-PCR sur les pools de plasmas de donneurs sang. L’objectif étant de permettre une notification plus rapide du statut sérologique VIH lorsqu’il était douteux par ELISA afin de réduire la perte de vue des donneurs « accrochés » pour le VIH-1. Les pools étaient constitués d’échantillons sélectionnés dont la sérologie était connue. La stratégie du poolage est décrite plus en détail dans la section matériel et méthode. Pour valider la méthode, 20 pools de 5 échantillons chacun ont été testés en RT-PCR. 8 pools d’échantillons positifs au VIH, 10 pools de négatifs et 2 pools de douteux (tableau IX). Un fragment de 233 paires de base correspondant au VIH-1 a été amplifié par RT-PCR avec les pools de plasmas ou les échantillons individuels positifs (figure 25). Tous les échantillons des 8 pools de plasmas positifs ont tous été confirmés positifs à la RT-PCR. De même, les pools constitués d’échantillons négatifs (10 pools) au VIH-1 ont été confirmés négatifs par RT-PCR. En ce qui concerne les deux pools constitués d’échantillons dont le statut était douteux au VIH-1, un pool de ces plasmas a été © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 120 confirmé négatif au VIH-1 par RT-PCR. L’analyse de chaque échantillon de ce pool a confirmé son statut négatif au VIH-1. En déroulant le pool de douteux (5 plasmas) positif par RT-PCR, les 5 plasmas ont tous été confirmés positifs au VIH-1. Tableau IX : RT-PCR sur les pools de plasmas au cours de l’enquête prospective d’août à décembre 2009 au CRTS-O Pool de plasmas ELISA VIH-1 N (%) Positif Négatif Positif 8 (40) 8 (100) 0 (0) Négatif 10 (50) 0 (0) 10 (100) Douteux 2 (10) 1 (50) 1 (50) © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO RT-PCR Page 121 Figure 25 : Gel d’agarose à 2% des pools de plasmas et de quelques échantillons individuels Le fragment d’ADN attendu est de 233 paires de base (pb) et est situé sur la photographie entre 300 et 200 pb. M : Marqueur de masse moléculaire Hyper Ladder II (Bioline®) 1-6 : pools de plasmas positifs en ELISA, positifs en RT-PCR 7 : pool de plasmas douteux en ELISA, positif en RT-PCR 8 : pool de plasmas douteux en ELISA, négatif en RT-PCR 9 : pool de plasmas positifs en ELISA, positif en RT-PCR N : pool de plasmas négatifs en ELISA, négatif 10-12 : échantillons individuels positifs en RT-PCR 13 : Contrôle positif VIrH-1. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 122 VI. 4. Discussion VI.4.1. Prévalences des marqueurs infectieux chez les donneurs de sang au Burkina Faso Pour les pays d’Afrique subsaharienne à majorité pauvres où les ressources sont limitées, la disponibilité et la sécurité du sang et des produits sanguins dérivés pour les transfusions continuent d’être préoccupantes, surtout avec l’existence des prévalences élevées dans ces populations des marqueurs infectieux tels que le VIH/SIDA et d’autres infections comme l’hépatite B, l’hépatite C et la syphilis. Au Burkina, comme généralement en Afrique subsaharienne, il existe trois catégories de donneurs de sang : Les donneurs volontaires non rémunérés, les donneurs familiaux /remplacements, les donneurs rémunérés professionnels, moins nombreux et souvent des donneurs aux profils recherchés (facteurs rhésus négatifs) également rémunérés dont les dons sont coordonnés par des associations de dons de sang. Le centre national de transfusion sanguine (CNTS) coordonne les activités des centres régionaux (CRTS) de Ouagadougou, Bobo-Dioulasso, Fada N’gourma et de Koudougou. La politique nationale en matière de transfusion suit les recommandations de l’OMS et se base sur le recrutement de donneurs de sang volontaires non rémunérés, principalement des jeunes, de sexe masculin (80,8%) qui représentent souvent la majorité des donneurs réguliers. Cette politique de recrutement de donneurs de sang préconisée par l’OMS pose problème au Burkina Faso parce qu’à l’évidence, elle ne permet pas encore de satisfaire la forte demande en poches de sang. Il est nécessaire d’évaluer d’autres stratégies de dons de sang comme par exemple la prise en compte dans les collectes des donneurs familiaux/remplacements. En effet, au Burkina Faso comme dans d'autres pays ouest africains, le pourcentage de donneurs réguliers est faible (11,4%) et la plupart d'entre eux ne font pas plus de deux dons de sang par an (Owusu-Ofori et al, 2010; Diarra et al, 2009). D’une manière générale, les collectes de sang ont concerné les donneurs bénévoles volontaires non rémunérés. Dans tout les centres de transfusion du pays, le recrutement de donneurs s’est effectué principalement au cours des cérémonies culturelles, © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 123 religieuses, de distractions organisées par les scolaires (élèves, étudiants), les coopératives, les associations et dans quelques cas les services et les entreprises privées ou publiques. Les prévalences des marqueurs infectieux chez les donneurs bénévoles volontaires non rémunérés et de premier don dans tout le pays sont élevées et similaires à celles décrites dans la population par Collenberg et al. (Collenberg et al, 2006). Seul le centre de Bobo-Dioulasso a montré des prévalences plus faibles que celles des autres centres. Cependant les prévalences des marqueurs infectieux (VIH, VHB, VHC et syphilis) étaient plus élevées que les données fournies par d’autres auteurs (Dahourou et al, 2010; Lefrère et al, 2011). Les variations épidémiologiques entre les centres de transfusions sont considérables et significatives (tableaux V et VII). Les prévalences des anticorps anti-VIH et anti-VHB sont assez similaires à celles décrites dans les pays voisins comme le Mali, la Guinée et le Ghana chez les donneurs familiaux/remplacements (Loua et al, 2010; Diarra et al, 2009; Allain et al, 2008). La séropositivité au VIH était similaire chez les donneurs de sang de premier don (à majorité jeunes) par rapport aux donneurs réguliers. Ce constat est discordant avec les rapports publiés par d’autres études (UNIAIDS, 2010; Buseri et al ,2009; Petersen et al, 1993; Ampofo et al, 2002). Les pourcentages des donneurs réguliers et des donneurs de premier don sont similaires dans tous les centres. Ce sont majoritairement des jeunes (20-29 ans) sexuellement plus actifs et potentiellement plus exposés aux infections. Malgré les campagnes de sensibilisation sur les infections sexuellement transmissibles auprès des jeunes, il n’en demeure pas moins que beaucoup d’entre eux par leur vulnérabilité socio-économique continuent à adopter des comportements à risque. Une autre explication réside dans le fait que la majorité des donneurs réguliers ne font que 2 dons de sang par an et le temps séparant les deux dons est très variable (Jusqu'à 10 mois entre les deux dons). Pendant le temps qui sépare les dons, cette catégorie de donneurs réguliers peut s’exposer au risque de nouvelles infections. Cependant pour les pays d’Afrique subsaharienne comme le Burkina où le paludisme est endémique les causes des anémies sont nombreuses surtout chez les femmes (malnutrition, drépanocytose, menstrues, saignements divers etc.). L’effet d’un don de sang est donc plus long à réparer que dans d’autres populations. Pour éviter de rendre © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 124 les donneurs anémiques et d’éviter une éventuelle carence en fer (ferritine) deux dons de sang par an sont préconisés, trois dons ou plus serait pour la majorité des donneurs courir le risque d’être anémiés. Ceci limite la disponibilité en PSL puisque la grande partie de ces donneurs de sang volontaires sont des élèves et des étudiants difficiles à fidéliser et souvent en déplacement (vacances, congés scolaires). En revanche, les séroprévalences des anticorps anti-VHC comprises entre 4,3 et 9,2% selon les centres de transfusions sanguines au Burkina Faso étaient plus élevées que celles décrites dans d'autres pays ouest-africains (Candotti et al, 2003; Jeannel et al, 1998; Ruggieri et al, 1996). Dans les 3 centres de transfusion sanguine (Ouagadougou, Bobo-Dioulasso et Fada N’gourma), les anticorps anti-VHC ont été retrouvés majoritairement chez les donneurs jeunes (80,3% en dessous de 30 ans contre 75,4% < 30 chez les donneurs non infectés par le VHC). La séroconversion à l’anti-VHC a également été retrouvée à des fréquences élevées chez les donneurs réguliers (2,8% par an). Les prévalences du VHC observées chez les donneurs de sang du Burkina sont supérieures aux valeurs situées entre 0,07 % et 0,6% retrouvées aux Etats-Unis et en Europe (Murphy et al, 2010 ; Durro et al, 2010) et inférieures à la prévalence de 12,3% rapportée chez les donneurs de sang du Nigeria (Halim et al, 2000). Globalement les prévalences du VHC étaient pratiquement similaires chez les donneurs de sang de premier don des 4 centres de transfusion sanguine. Ceci est en discordance avec les résultats de Buseri et al. (2009). Ces variations drastiques des prévalences décrites dans la sous région par d’autres études, suggèrent que d’autres voies d'infections restent à élucider. En effet au Burkina, l’usage des drogues par voie intraveineuse n’est pas très répandu, l’explication la plus plausible résiderait dans l’utilisation en zone rurale d’objets tranchants qui peuvent être potentiellement infectieux dans les circoncisions, les tatouages ethniques, les scarifications et récemment le piercing chez les jeunes des grandes villes comme Ouagadougou et Bobo Dioulasso. Aussi, des études plus approfondies sont nécessaires pour mieux comprendre les modes de transmission actuelle du VHC au Burkina. Et comme rapporté au Ghana, l'efficacité de la reprise des analyses sur des échantillons initialement réactifs aux anti-VHC est insuffisante et des réactions de fausses positivités ne sont pas toutes éliminées (Allain, 2011). Des études ont rapporté une baisse © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 125 significative de la prévalence de l’anti-VHC (jusqu'à 5 fois) lorsque que les échantillons initialement réactifs étaient confirmés par des méthodes plus précises (Candotti et al, 2003; Vardas et al, 1999; Ampofo et al, 2002). Par conséquent la prévalence réelle de l’anti-VHC se situe en Afrique subsaharienne en moyenne autour de 1% sauf au Nigeria (Allain, 2011). Compte tenu des fréquences élevées de tous les marqueurs, les coinfections avec un ou plusieurs maladies infectieuses présentaient des prévalences également élevées (tableau V et VIII). La séroprévalence de la syphilis dans cette étude est inférieure à celle trouvée chez les donneurs de sang en Tanzanie (Matee et al, 1999). Cependant elle est plus élevée que celle observée au Nigéria (Ejele et al, 2005). Des prévalences plus élevées de 12,8% et 12,7% ont été rapportées respectivement en Ethiopie et en Tanzanie (Matee et al, 2006). La différence entre ces prévalences très élevées et les nôtres n’a pu être élucidée ; mais pourraient être attribuée à des variations géographiques qui probablement influent sur la prévalence de la syphilis (Tessema et al, 2010). Cette persistance des marqueurs infectieux dans la population de donneurs de sang au Burkina pourrait justifier une incidence également élevée de ces agents infectieux. Nous avons mené une étude d’estimation de l’incidence des marqueurs viraux chez les donneurs de sang réguliers des centres de transfusion du pays. Pour mieux apprécier les éventuels risques pour la sécurité transfusionnelle de ces fortes prévalences et trouver des alternatives pour un meilleur recrutement et une fidélisation de donneurs réguliers. VI.4.2. Incidence des marqueurs viraux infectieux chez les donneurs de sang volontaires, réguliers de trois centres régionaux de transfusion sanguine du Burkina En 2009, les centres de transfusion de Ouagadougou, de Bobo-Dioulasso et de Fada N’gourma comptaient 11,3% (3.981/35.401) de donneurs de sang réguliers. Les prévalences élevées des marqueurs viraux dépistés dans la population de donneurs de sang volontaires ont engendrés des taux d’incidences de 3270,2 ; 5874,1 et 6784,6 respectivement pour l’anti-VIH-1, l’AgHBs et l’anti-VHC pour 100.000 dons. Ces incidences également élevées n’étaient pas similaires dans tous les centres que nous avons étudiés. Comme les prévalences des agents infectieux observées à Bobo© Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 126 Dioulasso, l’incidence des marqueurs viraux chez les donneurs de sang réguliers de cette Ville était plus faible que celles des autres centres. Cependant les taux d’infections incidentes étaient élevés chez les donneurs de sang des 3 centres de transfusion réunis. La majorité des infections incidentes ont été retrouvées chez les hommes (88,5%), qui constitue l’essentiel de la population de donneurs en Afrique subsaharienne (Sarkodie et al, 2001 ; Matee et al, 2006 ; Cunha et al, 2007 ; Allain et al, 2009 ; Tounkara et al, 2009a ; Tessema et al, 2010 ; Nagalo et al, 2011b). La majorité des donneurs réguliers ont été recrutés directement dans les centres de transfusion (66,8%), dans les écoles (21,3%) et au cours des collectes mobiles en provinces (5,8%). Ces lieux de recrutements des donneurs de sang ont une influence sur l’épidémiologie de ces derniers. En effet, des prévalences élevées des marqueurs de l’hépatite B et C ont été trouvées respectivement chez les donneurs de sang de premier don en zone rurale (22,2 et 19,1%) et en zone urbaine (37,4 et 26,4%). Pour les donneurs de sang des provinces, les explications proviendraient du mode de vie de ces populations rurales (tatouages ethniques, mode de vie communautaire etc.) (Nagalo et al, 2011b). Les donneurs issus des écoles sont à majorité jeunes (adolescents) et l’infection au VHB se contracte en bas âge dans nos régions d’où une prévalence élevée de ce marqueur (Allain, 2011). Toutefois, la fréquence élevée de séroconversion au VHB chez les donneurs réguliers (2,5%/an) implique que la transmission sexuelle a lieu chez les adultes. En Afrique subsaharienne les prévalences de l’AgHBs sont généralement élevées. Deux études précédentes ont mis en évidence un faible portage de l’AgHBe (marqueur de la multiplication du virus) chez les donneurs de sang AgHBs positifs (Tsega et al, 1987 ; Ryder et al, 1984); ainsi que la forte présence de sérologies HBV positives chez les receveurs, pourrait avoir pour conséquence la réduction significative de la survenue des cas d’hépatites post-transfusionnelles dues au VHB. En effet, l’AgHBs est le principal marqueur recherché pour le diagnostic de VHB chez les donneurs de sang. Il est urgent d’associer d’autres marqueurs de l’infection à adjoindre au dépistage de l’AgHBs. Contrairement aux études de Tsega et al. (1987) et de Ryder et al. (1984) qui posaient la question de la nécessité du dépistage de l’AgHBs chez les donneurs de sang en Afrique subsaharienne ; ce dépistage est plus que nécessaire malgré les fortes prévalences © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 127 rencontrées dans cette zone. En effet, nous suggérons plutôt une plus grande couverture vaccinale des enfants et des femmes enceintes et une extension de la vaccination contre le VHB chez les donneurs réguliers de sang comme alternative à l’abandon du dépistage de VHB chez les donneurs de sang préconisé par Ryder et al. Les prévalences du VIH trouvées chez les donneurs volontaires de premier don et réguliers étaient presque similaires (respectivement 1,8 et 1,3%). Ces données confirment les résultats des comparaisons des prévalences de l’AgHBs et les anticorps VIH entre les donneurs volontaires de premier don et les donneurs familiaux/remplacements au Ghana (Allain et al, 2010), en Guinée (Loua et Nze Nkoure, 2010) et au Cameroun (Mbanya et al, 2010). Cependant, la prévalence des co-infections entre le VIH, le VHB et le VHC a été similaire aux prévalences des marqueurs pris séparément ce qui explique que les voies d’infections sont probablement les mêmes. En Afrique subsaharienne, l’hépatite B est contracté essentiellement en bas âge (transmission horizontale jusqu’à 5 ans) tandis que le VIH est contracté par voie sexuelle avec un pic entre 15 et 20 ans. Ceci pourrait expliquer les similitudes dans les prévalences des co-infections VIH-AgHBs positifs et l’AgHBs pris séparément chez les donneurs de sang de premier don comme dans la population en générale. La transmission du VHC étant liée au contact direct avec du sang aucune association entre l'infection au VIH et au VHB n’a été constatée. Il n’y avait pas de différence significative entre les prévalences du VIH et du VHC trouvées dans les deux catégories de donneurs de sang des différents centres de transfusion. Les prévalences des marqueurs infectieux chez les donneurs de sang de premier don semblent assez représentatives du profil épidémiologique de la population en générale. Cependant, ils représentent la principale source de dons de sang et assurent l'approvisionnement en sang du pays. fidélisation Ce qui implique que des donneurs réguliers serait l'essentiel de seule une meilleure en mesure d'améliorer la sécurité transfusionnelle dans les centres de transfusion du Burkina Faso. En outre, compte tenu de la pénurie chronique de sang dans le pays et le coût élevé qu’engendre le recrutement des donneurs bénévoles non rémunérés, l’orientation de la collecte de sang vers les donneurs familiaux /remplacements devrait être sérieusement envisagée. Dans © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 128 un contexte où les ressources du pays sont modestes cette nouvelle stratégie pourrait permettre de recruter plus de donneurs tout en les fidélisant pour un meilleur approvisionnement en sang et en composants sanguins pour une majorité de patients dont la survie dépend de la disponibilité en produits sanguins labiles. VI.4.3. Approvisionnement en sang sûr : Quel type de donneur recruter ? Les résultats précédents montrent que les donneurs de sang de premier don censés être une population susceptible d’héberger plus de donneurs en séroconversion que les réguliers ont les mêmes profils épidémiologiques que ces derniers. Finalement le choix de donneurs volontaires non rémunérés et leur fidélisation comme population cible pour les dons de sang ne garantie pas un apport suffisant en poches de sang ou une meilleure sécurité transfusionnelle. Puisque l’objectif est d’approvisionner régulièrement en quantité suffisante et en qualité les systèmes sanitaires du pays en sang, il faudrait donc se tourner vers d’autres types de donneurs potentiels puisque jusqu'à nos jours aucun produit de synthèse n’a pu remplacer convenablement les produits sanguins labiles. A l’exclusion des donneurs rémunérés les donneurs familiaux sont les plus présents dans les dons de sang. Les structures spécialisées dans le traitement du sang ne sont pas toujours présentes dans les régions reculées et le besoin immédiat de sang pour un patient hospitalisé se faisant pressant, on a recours le plus souvent aux donneurs familiaux/remplacements qui sont pour la plupart de la famille du malade ou de l’entourage de ce dernier (Bates et al, 2007 ; Tapko et al, 2007). Ce type de don généralement se fait par pure humanisme et le donneur ne s’attend pas dans la plupart des situations à une compensation. Cela revient beaucoup moins cher que si on mobilisait des équipes et du matériel pour des collectes mobiles (Allain, 2011). Une grande partie des dons bénévoles non rémunérés sont faits par des élèves de sexe masculins issus du secondaire âgés de 17-20 ans, or le constat dans nos résultats c’est que des marqueurs comme l’AgHBs sont assez élevés chez ces jeunes puisque cette pathologie est contractée en bas âge en Afrique subsaharienne. Contrairement à ce groupe majoritaire les donneurs familiaux /remplacement sont plus âgés avec un âge © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 129 médian de 30 ans contre 18 ans pour les donneurs volontaires non rémunérés (Allain, 2011). A cet âge en plus du fait que la prévalence de l’hépatite B diminue, les donneurs sont plus conscients de l’enjeu du don de sang et répondront aisément aux questions de sélection et le plus souvent la plupart ont a leur actif un don ou un statut sérologique à au moins un des marqueurs recherchés en transfusion. La persistance, dans notre région, des maladies transmissibles par le sang pose un réel problème vu les taux considérables de nouvelles contaminations. En plus de la volonté de garantir une meilleure disponibilité des produits sanguins, le Burkina devrait se tourner vers des techniques de dépistage plus adaptées (PCR) à nos réalités. Le dépistage génomique viral est déjà utilisé et maitrisé dans quelques centres de transfusion sanguine de la sous-région au Ghana (Allain JP, communication personnelle) et en Côte d’Ivoire. Nous avons tenté une étude pilote dans le but d’apprécier la faisabilité de la méthode et d’apporter des réponses au problème de diagnostic des agents infectieux transmissibles par le sang rencontré dans les centres de transfusion. VI.4.4. Quel type de donneur pour quel coût ? D’une manière générale, la sécurité transfusionnelle en Afrique subsaharienne est marquée par des prévalences élevées des marqueurs infectieux, une forte demande en poches de sang et la modestie des ressources allouées au secteur de la santé. Dans ce contexte, pour des pays à revenus limités comme le Burkina Faso, le meilleur donneur de sang est celui qui assure un approvisionnement continu en PSL à un coût raisonnable (Allain, 2011). Au Burkina, la disponibilité des poches de sang ne suffit pas à couvrir les besoins du pays. Et certains centres de santé en zones rurales dépendent le plus souvent des donneurs familiaux/remplacements pour les dons, lorsque ceux-ci accompagnent un membre de leur famille ou un proche malade. Ce type de don est presqu’une aubaine et constitue du sang immédiatement disponible pour l’hospitalisé et/ou un don complémentaire qui pourrait être mis en réserve pour d’autres malades. Cette stratégie est moins coûteuse, car elle ne nécessite pas un recrutement coûteux et un processus de collecte éprouvant (Allain, 2010). Comme le montre plusieurs auteurs le prix de revient d’une poche de sang est 2 à 3 fois moins élevé en Afrique subsaharienne pour les donneurs de sang familiaux/remplacements (6.000–9.000 FCFA) que pour les donneurs de sang volontaires non rémunérés (13.000-30.000 FCA) © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 130 (Allain et al, 2004, 2010; Bates et al, 2007; Bates et Hassall, 2010). La politique actuelle du recrutement des donneurs de sang devrait prendre en compte les donneurs familiaux/remplacements parce que différentes études montrent qu’ils ne constituent pas une population plus à risque pour le receveur que les donneurs volontaires non rémunérés de premier don dont le recrutement nécessite des moyens financiers et matériels 2 à 5 fois plus élevés (Allain, 2011). C’est la répétition du don qui améliore la sécurité transfusionnelle, encore qu’au Burkina, comme nous l’avons montré ici, l’incidence des infections chez les donneurs réguliers est remarquablement élevée, ce qui limite cet avantage escompté. Comme l’ont montré les études Sud Africaines (Vermeulen et al, 2009), les infections récentes se trouvent plus fréquemment chez les donneurs réguliers et, en conséquence, le nombre des périodes fenêtre pour le VIH. Au Burkina, ces périodes fenêtre semblent s’étendre non seulement au VIH mais aussi au VHC, augmentant d’autant le risque transfusionnel et le besoin urgent d’un dépistage génomique dont nous avons montré la faisabilité. VI.4.5. Introduction du dépistage génomique viral en transfusion sanguine au CRTS de Ouagadougou : diagnostic moléculaire du VIH-1 sur les pools de plasmas de donneurs de sang Longtemps réservée au domaine de la recherche en Afrique subsaharienne les techniques de biologie moléculaire contribuent qualitativement à l’amélioration du dépistage en transfusion sanguine. Nombreuses sont les variantes de la PCR qui ont prouvées leur efficacité partout dans le monde, du DGV (dépistage génomique viral) en passant par les méthodes multiplex pour un diagnostic en une seule étape du VIH, du VHB et du VHC. En transfusion sanguine, le risque de qualifier une poche infectée au VIH provient exclusivement des dons d’individus en période fenêtre où la présence des anticorps dirigés contre le virus est indétectable chez l’individu primo-infecté (Coste J, 2000). Au CRTS-O, la marge de sécurité est revue à la hausse pour le diagnostic sérologique des marqueurs viraux tel que le VIH. Ainsi la valeur seuil de chaque plaque analysée à l’ELISA de 4e génération est réduite de 20 %. Et tous les dons situés dans cette marge réduite sont considérés comme douteux (zone grise) et éliminés du circuit transfusionnel. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 131 Le donneur douteux est invité à revenir quelques semaines plus tard pour un second prélèvement de confirmation ; le premier don «accroché» pour un marqueur infectieux n’étant pas introduit dans le circuit de distribution des produits sanguins labiles (PSL). Pendant le processus de confirmation le donneur est dans une attente éprouvante et le risque qu’il ne revient pas au CRTSO pour le second prélèvement est aussi à considérer. Cela pourrait poser un problème de fidélisation des donneurs. Surtout si le don considéré douteux s’avère être non réactif pour le VIH au test de reprise ou si le statut du donneur est confirmé négatif dans une autre structure sanitaire. L’étude avait pour objectif d’améliorer la qualité du diagnostic du VIH-1 par l’introduction de la RT-PCR sur les dons de sang au CRTS-O. Pour minimiser le coût de la RT-PCR, et les effets dus à la dilution des plasmas (Le Corfec et al, 1999) nous avons choisi de travailler sur des pools de 5 plasmas. En effet, différentes tailles de pools (15 à 96), ont déjà été développés et testés (McMahon et al, 1995 ; Candotti et al, 2003). Ces pools d’effectifs restreints ont l’avantage de réduire le nombre de tests à effectuer tout en affectant que très peu la sensibilité de la méthode. Les échantillons ont été repartis en pools en fonction de leur réactivité préalable à l’ELISA de 4 ème génération. Sur les 20 pools de plasmas testés (10 pools de négatifs, 8 pools de positifs et 2 pools de douteux au VIH-1), le statut sérologique des 10 pools de négatifs et des 8 pools de positifs a été confirmé par RT-PCR. La totalité des pools de positifs et de négatifs ont été analysés individuellement et tous se sont révélées être soit des dons infectés pour les pools positifs ou des dons noninfectés pour les pools négatifs. Des 2 pools de plasmas de donneurs de sang douteux à l’ELISA, un pool a été confirmé positif et l’autre négatif à la RT-PCR du VIH-1. Nous avons ensuite recherché l’ARN du VIH-1 individuellement dans les dix dons des 2 pools douteux. Les résultats des tests individuels ont montré que les cinq dons du pool positif étaient tous des dons infectés au VIH-1, tandis que les cinq autres dons du pool testé négatif étaient non infectés. Les sérologies VIH effectuées quelques semaines plus tard, sur un second prélèvement issu des 5 dons douteux confirmés négatifs par RT-PCR, étaient négatives. Ce qui constitue un gain net de 5 poches de sang. Comparativement à l’ELISA de 4éme génération, la RT-PCR permet d’éviter le désagrément de l’attente des résultats en favorisant une notification rapide aux donneurs. Elle permet également dans notre cas © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 132 l’identification avec une plus grande sensibilité et spécificité des dons contaminés suivis de leur élimination. Nous avons mené une étude pilote sur les avantages de l’utilisation de la RT-PCR du VIH-1 en transfusion sanguine. La technique s’est avérée être très avantageuse pour le centre régional de transfusion sanguine de Ouagadougou. Cependant l’inconvénient est le coût élevé de sa réalisation et son usage nécessite aussi un personnel qualifié. Nous préconisons la réalisation de la RT-PCR du VIH-1 associée à l’ELISA de 4éme génération au CRTS-O. En testant uniquement les échantillons dont le statut est douteux au VIH par ELISA, un effectif réduit sera obtenu, et les dons pourraient être testés individuellement par RT-PCR. Cependant la modestie des moyens des banques de sang d’Afrique subsaharienne et le manque d’infrastructures sanitaires adéquates constituent une entrave à l’extension de la PCR et de la PCR en temps réel qui actuellement sont uniquement réservées au domaine de la recherche au niveau du dépistage. Au Burkina Faso comme dans d’autres pays ouest africains, le pourcentage de donneurs réguliers est faible (9 à 11 %) et la plupart d’entre eux ne font pas plus de deux dons de sang par an (Owusu-Ofori et al, 2010 ; Diarra et al, 2009). A cela s’ajoute la faiblesse des effectifs de donneurs (24.261 dons pour presque 1,5 millions d’habitants en 2009 au CRTS-O), le don du sang est souvent fait dans le cadre d’activités socioculturelles. Ce recrutement assez aléatoire de donneurs augmente le risque d’enrôler des donneurs en séroconversions ou en primo infection. D’où l’intérêt de l’introduction d’une technique aussi spécifique et sensible que la RT-PCR en transfusion sanguine. La RT-PCR présente aussi un avantage économique non négligeable. En effet, le coût engendré par la qualification biologique d’une poche de sang au CRTS-O est d’environ 25 000 F.CFA (38,11 €) et ce coût est revu à la hausse si le don provient d’une collecte mobile (30 000 F.CFA soit 45,73 €). En utilisant la technique RT-PCR de notre étude, le diagnostic reviendrait à 8 000 F.CFA (12,20 €) par poche pour le VIH-1. Une PCR multiplex détectant à la fois le VIH, VHB et VHC a été mise au point et elle ne coûterait que 10 € pour valider une poche de sang (JP Allain, Communication personnelle). En associant dans un premier temps au CRTS-O, la RT-PCR à l’ELISA de 4ème génération on obtient un algorithme qui pourrait réduire le coût de la technique dans un souci d’économie de la santé, tout en renforçant la sécurité transfusionnelle. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 133 VI.4.6. Coordination des activités transfusionnelles : Quelle approche ? La transfusion sanguine est une composante capitale des soins de santé modernes. Garantir une sécurité transfusionnelle convenable s’avère être d’une nécessité indéniable pour la santé du receveur notamment dans les circonstances où les prévalences des agents infectieux transmissibles par le sang sont élevées. Cela sous entend une bonne connaissance de l’épidémiologie de ces différents marqueurs suivi de leur dépistage systématique sur toutes les unités de sang collectées. En effet, les produits sanguins labiles doivent tous être sans danger, efficaces sur le plan clinique, et conformes à la qualité désirée. Pour cela une bonne politique transfusionnelle s’appuyant sur des stratégies rigoureuses doit être mise en place. Cette politique implique non seulement la création d’une structure nationale de transfusion sanguine bien organisée qui coordonne au plan national les collectes chez des donneurs de sang sûr issus de populations à faible risque ; mais aussi le dépistage systématique sur tous les dons de sang (incluant : recherche des agents infectieux transmissibles par transfusion, groupage sanguin, tests de compatibilités et une utilisation clinique appropriée du sang). Enfin une bonne politique de transfusion sanguine nécessite l’élaboration d’un système d’assurance qualité efficace qui est en mesure de garantir la traçabilité, depuis le recrutement et la sélection des donneurs jusqu’à la distribution des produits sanguins labiles. Cette traçabilité prend en compte non seulement les activités transfusionnelles mais aussi le contrôle et la bonne utilisation des réactifs et consommables utilisés en routine. La politique qualité doit également être adaptée à la structure, aux besoins et aux possibilités des centres de transfusion sanguine ainsi qu’aux besoins des hôpitaux et des patients desservis. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 134 Conclusion et perspectives Les précédentes études menées dans les centres de transfusion sanguine du Burkina ont montrées des prévalences élevées des principaux marqueurs infectieux dépistés dans les banques de sang du pays. Du fait de ces prévalences élevées dans les centres de transfusion sanguine la fréquence d’accidents transfusionnels représentée par le risque de transmission d’un virus au cours d’une transfusion sanguine pourrait être également élevée. En plus des prévalences, les incidences également élevées des marqueurs viraux qu’on retrouve dans la population de donneurs représente un véritable problème de santé publique pour les autorités sanitaires du pays. La problématique de l’approvisionnement en sang repose sur la disponibilité des donneurs notamment les réguliers qui sont en mesure de garantir une assez bonne sécurité des produits sanguins labiles. Le constat suivant est qu’une grande majorité des donneurs n’a effectué qu’un seul don au cours de l’année 2009. Cela traduit le faible taux de fidélisation des donneurs de sang qui ont le même profil épidémiologique dans les anciens centres de transfusions (Ouagadougou et Fada N’gourma) comme dans les plus récents (Koudougou). Les besoins en poches de sang augmentent chaque année et il s’avère être nécessaire de se tourner vers de nouvelles sources d’approvisionnement en PSL. Comme le montre plusieurs auteurs le recrutement des donneurs familiaux/remplacements longtemps exclus du processus transfusionnel en Afrique subsaharienne serait une solution palliative aux besoins en sang. Les prévalences des marqueurs infectieux dans cette catégorie de donneurs sont similaires à celles présentes chez les donneurs de sang de premier don. Il serait donc judicieux de mettre en place des stratégies pour enrôler les donneurs familiaux/remplacements et ensuite les fidéliser enfin de satisfaire la demande en sang et améliorer la sécurité transfusionnelle en Afrique subsaharienne. Au regard des résultats que nous avons obtenu ; les perspectives d’utilisation de la PCR en transfusion sanguine au Burkina sont remarquables et méritent d’être plus approfondies par des études de faisabilité à grande échelle. La recherche d’une sécurité maximale en transfusion sanguine passe d’une part par une meilleure sélection des © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 135 donneurs de sang par la mise en place d’une politique de fidélisation robuste. D’autre part par le diagnostic précoce des principales maladies transmissibles par le sang et susceptibles d’infecter le receveur. En utilisant des techniques comme le DGV qui ont la particularité d’allier une haute sensibilité à une grande spécificité on pourrait augmenter davantage les capacités de diagnostic des agents infectieux transmissibles par transfusion sanguine partant de là l’amélioration même de la sécurité des produits sanguins labiles au Burkina Faso. En perspectives nous souhaitons toujours dans l’optique d’améliorer les services offerts par le centre national de transfusion sanguine du Burkina Faso œuvrer à travers d’autres études afin de permettre : Le développement de nouvelles stratégies pour garantir aux patients un approvisionnement en sang tant dans la quantité que dans la qualité ; La vulgarisation et l’utilisation de la PCR comme outil de diagnostic précoce des infections transmissibles par le sang en transfusion sanguine dans les banques de sang du pays ; Et étendre nos investigations à d’autres types de virus potentiellement infectieux et présents chez les donneurs de sang comme le virus de l’hépatite G (VHG), les Herpesviridae. Une enquête sur l’impact sur la santé du receveur en l’occurrence les enfants et les femmes enceintes de la transmission du paludisme par la transfusion sanguine. Une étude approfondie sur les prévalences élevées du VHC observées chez les donneurs de sang au Burkina Faso. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 136 Références Bibliographiques Achidi EA, Perlmann, Berzins K. Asymptomatic malaria parasitaemia and seroreactivities to Plasmodium falciparum antigens in blood donors from Ibadan, southwestern Nigeria. Ann Trop Med Parasitol 1995; 89(6):601–610. Adjei AA, Armah HB, Gbagbo F, Boamah I, Adu-Gyamfi C, Asare I. Seroprevalence of HHV8, CMV, and EBV among the general population in Ghana, West Africa. BMC Infect Dis. 2008 Aug 18;8:111. Agence Française de sécurité sanitaire des produits de santé. Unité d’hémovigilance. Rapport annuel. Données nationales. www.afssaps.sante/fr. Agut H., V. Calvez., A. G-Dejean. Virologie médicale et infection VIH.IN : P.-M.Girard, Ch.Katlama, G.Pialoux VIH Edition 2001. Ahmed, S.G., Ibrahim, U.A. & Hassan, A.W. (2007) Adequacy and pattern of blood donations in north-eastern Nigeria: the implications for blood safety. Annals of Tropical Medicine and Parasitology, 101, 725–731. Akinboye DO, Ogunrinade AF. Malaria and loaisis among blood donors at Ibadan, Nigeria. Trans R Soc Trop Med Hyg 1987; 81(3):398 399. Allain JP, Sarkodie F, Asenso-Mensah K, Owusu-Ofori S. Relative safety of first-time volunteer and replacement donors in West Africa. Transfusion 2010; 50: 340-3. Allain JP, Sarkodie F, Boateng P, Asenso K, Kyeremateng E, Owusu-Ofori S. A pool of repeat blood donors can be generated with little expense to the blood center in SubSaharan Africa. Transfusion 2008; 48:735-41. Allain JP. Moving on from voluntary non-remunerated donors: who is the best blood donor? Br J Haematol. 2011 May 3. doi: 10.1111/j.1365-2141.2011. Allain, J.P., Opare-Sem, O., Sarkodie, F., Rahman, R. & Owusu-Ofori, S. (2009) Deferred donor care in a regional hospital blood center in Ghana. Transfusion, 49, 669–675. Ali MS, Yousif AG, Mustafa MS, Ibrahim MH. Evaluation of malaria parasite screening procedures among Sudanese blood donors. Clini Lab Sci 2005; 18(2):69–73. Alter M ,Kruszon- Moran D, Nainan OV et al. The prevalence of hepatitis C virus infection in the US, 1998 through 1994. Nengl J Med 1999; 341:556-62. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 137 Ampofo W, Nii-Trebi N, Ansah J, et al. Prevalence of blood-borne infectious diseases in blood donors in Ghana. J Clin Microbiol. 2002;40: 3523-3525. Antaki, N., Craxi, A., Kamal, S., Moucari, R., Van Der Merwe, S., Haffar, S., Gadano, A., Zein, N., Lai, C. L., Pawlotsky, J. M., Heathcote, E. J., Dusheiko, G. & Marcellin, P. (2010) The Neglected Hepatitis C Virus Genotypes 4, 5 And 6: An International Consensus Report. Liver Int, 30, 342-55. Assal A., Coste J., Barlet V., Laperche S., Cornillot C., Smilovici W., Pillonel J., Andreu G., 2003. Application de la biologie moléculaire à la sécurité virale transfusionnelle : le dépistage génomique viral. Transfusion Clinique et Biologique, vol.10, issue3, pp.217-226. Barre-sinoussi F. Virologie fondamentale de l’infection VIH IN : P.-M.Girard, Ch.Katlama,G.Pialoux VIH EDITION 2001.Doin ; Paris; 3-19. Barre-sinoussi F.VIH as the cause of AIDS. Lancet 1996 ; 348 :31-5. Bartenschlager, R., et Schaller, H. (1988). The amino-terminal domain of the hepadnaviral P gene encodes the terminal protein (genome-linked protein) believed to prime reverse transcription. Embo J 7, 4185-4192. Bartosch, B., Dubuisson, J., and Cosset, F.-L. Infectious hepatitis C virus-pseudoparticules containing functional E1-E2 envelope protein complexes (2003) J. Exp. Med. 197, 633–642. Basavaraju SV, Mwangi J, Nyamongo J, Zeh C, Kimani D, Shiraishi RW, Madoda R, Okonji JA, Sugut W, Ongwae S, Pitman JP, Marum LH. Reduced risk of transfusion-transmitted VIH in Kenya through centrally co-ordinated blood centres, stringent donor selection and effective p24 antigen-VIH antibody screening. Vox Sang 2010; 99: 212-9. Bates, I., Manyasi, G. & Medina Lara, A. (2007) Reducing replacement donors in SubSaharan Africa: challenges and affordability. Transfusion in Medicine, 17, 434–442. Belan A. G., Chaplain C., A. Boussairi, 2008. Suivi biologique de l’infection à VIH chez l’adulte Immuno-analyse & Biologie Spécialisée Volume 23, Issue 2, April 2008, Pages 95102. Biancotto A, Iglehart SJ, Vanpouille C, Condack CE, Lisco A, Ruecker E, Hirsch I, Margolis LB, Grivel JC (2008) HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo. Blood 111(2): 699-704. Blajchman MA, Goldman M, Baeza F. Improving the bacteriological safety of platelet transfusions. Transfus Med Rev 2004; 18 : 11-24. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 138 Blajchman MA. Reducing the risk of bacterial contamination of cellular blood components. Advances in Transfusion Safety. Dev Biol 1999;102: 183-93. Bosch, V., Bartenschlager, R., Radziwill, G., et Schaller, H. (1988). The duck hepatitis B virus P-gene codes for protein strongly associated with the 5'-end of the viral DNA minus strand. Virology 166, 475-485. Bouchard, M. J., et Schneider, R. J. (2004). The enigmatic X gene of hepatitis B virus. J Virol 78, 12725-12734. Bouvet E., Rouveix E. 2005. Transmission sanguine du VIH, (GERES). Busch MP, Glynn SA, Stramer SL, Strong DM, Caglioti S, Wright DJ, Pappalardo B, Kleinman SH; NHLBI-REDS NAT Study Group. A new strategy for estimating risks of transfusion-transmitted viral infections based on rates of detection of recently infected donors. Transfusion 2005; 45:254-264. Busch MP, Kleinman SH, Nemo GJ. Current and emerging infectious risks of blood transfusions. JAMA 2003;289: 959–62. Busch MP. Watanabe K.K., Smith J.W., Hermansen S.W., Thomson. 2000. RA for the Retrovirus Epidemiology Donor Study.False negative testing errors in routine viral marker screening of blood donors. Transfusion 2000; 40:585-9. Buseri FI, Muhibi MA, Jeremiah ZA. Sero-epidemiology of transfusion-transmissible infectious diseases among blood donors in Osogbo, south-west Nigeria. Blood Transfus. 2009;7:293-299. Candotti D, Danso K, Allain JP. Maternofetal transmission of hepatitis B virus genotype E in Ghana, west Africa.J Gen Virol. 2007 Oct; 88(Pt 10):2686-95. Candotti D, Richetin A, Cant B, Temple J, Sims C, Reeves I, Barbara JA & Allain JP (2003) Evaluation of a transcription-mediated amplification-based HCV and HIV-1 RNA duplex assay for screening individual blood donations: A comparison with a minipool testing system. Transfusion 43, 215-25. Candotti D, Sarkodie F, Allain JP. Residual risk of VIH and VHC transmission by transfusion in Ghana. Brit J Haemat 2001; 113: 37-39. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 139 Candotti, D., Temple, J., Sarkodie, F. & Allain, J. P. (2003) Frequent Recovery And Broad Genotype 2 Diversity Characterize Hepatitis C Virus Infection In Ghana, West Africa. J Virol, 77, 7914-23. Cantaloube, J. F., Gallian, P., Laperche, S., Elghouzzi, M. H., Piquet, Y., Bouchardeau, F., Jordier, F., Biagini, P., Attoui, H. & De Micco, P. (2008) Molecular Characterization Of Genotype 2 And 4 Hepatitis C Virus Isolates In French Blood Donors. J Med Virol, 80, 1732-9. Castilla J et al. Effectiveness of highly active antiretroviral therapy in reducing heterosexual transmission of VIH. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes, 2005, 40:96–101. Chaplain C., Belan A. G., 2006. Suivi biologique de l’infection VIH : intérêt du génotypage pour la résistance et du dosage des antirétroviraux. Spectra Biologie n°151, Avril 2006. Chikwem JO, Mohammed I, Okara GC,Ukwandu NC, Ola TO.Prevalence of transmissible blood infections among blood donors at the University of Maiducuri Teaching Hospital, Maiduguri, Nigeria. East Afr Med J. 1997; 74:213-216. Chin'ombe N, Chavhunduka E, Matarira HT. Seroprevalence of VHB and VHC in primary hepatocellular carcinoma patients in Zimbabwe. Infect Agent Cancer. 2009;4:15. Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, Overby LR, Bradley DW, Houghton M. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome.Science. 1989 Apr 21;244(4902):359-62. Cohen P. Les hépatites virales.Rev Press Médicale 1999; 28(27):280-305. Coleman PF, Chen YC, Mushahwar IK. Immunoassay detection of hepatitis B surface antigen mutants. J Med Virol. 1999 Sep;59(1):19-24. Collenberg, E., Ouedraogo, T., Ganame, J., Fickenscher, H., Kynast-Wolf, G., Becher, H., Kouyate, B., Krausslich, H.G., Sangare, L. & Tebit, D.M. Seroprevalence of six different viruses among pregnant women and blood donors in rural and urban Burkina Faso: A comparative analysis. Journal of Medical Virology 2006; 78: 683-692. Cornillot C., Mercier B., 2000.Etude Nationale de faisabilité. Etablissement Français du Sang. Rapport final, juin 2000. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 140 Coste J., Defer C., Saura C., 2000.Routine experience and future developments in virus NAT applications. Molecular Biology in Blood transfusion.Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 2000; 105-10. Coste J.Le dépistage des génomes viraux en transfusion sanguine. Transfus Clin Biol 2000 ; 7 : 11s-7. Courouce AM., Pillonel J et les groupes de travail rétrovirus et hépatites virales de la société française de transfusion sanguine , 1997.Risque de transmission d’infections virales par transfusion des dérivés sanguins labiles .Médecine thérapeutique 1997 ; 3 :858-62 Cunha, L., Plouzeau, C., Ingrand, P., Gudo, J.P.S., Ingrand, I., Mondlane, J., Beauchant, M. & Agius, G. (2007) Use of replacement blood donors to study the epidemiology of major blood-borne viruses in the general population of Maputo, Mozambique. Journal of Medical Virology, 79, 1832–1840. Dahourou H, Tapko JB, Kienou K, Nebie K, Sanou M. Recruitment of blood donors in Burkina Faso: how to avoid donations from family members. Biologicals 2010; 38: 3942. Dai J, Agosto LM, Baytop C, Yu JJ, Pace MJ, Liszewski MK, O'Doherty U (2009). Human immunodeficiency virus integrates directly into naive resting CD4+ T cells but enters naive cells less efficiently than memory cells." J Virol 83(9): 4528-37. Dane D, Cameron CN, Briggs M. Virus-like particles in serum of patients with australia antigen associated virus. Lancet 1970;1:695-698. Davidson T, Ekermo B, Gaines H, Lesko B, Akerlind B. The cost-effectiveness of introducing nucleic acid testing to test for hepatitis B, hepatitis C, and human immunodeficiency virus among blood donors in Sweden. Transfusion 2011 ; 51 : 421-9. Dehee A., 2003, Les différentes techniques de quantification des génomes viraux. Revue Française des Laboratoires Volume 2003, Issue 351, Pages 23-29 doi:10.1016/S03389898(03)733812. http://www.sciencedirect.com/science/journal/ 03389898. Denis F, Alain S, Loustaud-Ratti V : Diagnostic virologique de l’hépatite B , virus des hepatitis B et delta ( ed elsivier), 2004, p 91. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 141 Denis F, Aussel L, Ranger S , Martin P , Itona N’Gaporo A, Frommel D et al . Prevalence of antibodies to hepatitis C virus among patients with leprosy in several African countries and the Yemen. J Med Virol 1994; 43:1-4. Diarra A, Kouriba B, Baby M, Murphy E, Lefrere JJ. VIH, VHC, VHB ans syphilis rate of positive donations among blood donations in Mali. Tranfus Clin boil 2009; 16: 444-7. Division de la surveillance des maladies. Maladies à déclaration obligatoire en direct.(www.document).http://dsol-smed.phac-aspc.gc.ca/dsol smed/ndis/index_f.html. Dodd, RY, Notari, EP IV, Stramer SL. Current prevalence and incidence of infectious disease markers and estimated window-period risk in the American red Cross blood donor population. Transfusion 2002; 42:975-979. Drummer, H. E., Maerz, A., and Poumbourios, P. Cell surface expression of functional Hepatitis C virus E1 and E2 glycoproteins (2003) FEBS Lett. 546,385–390 Durro V, Koraqi A, Saliasi S. Trends in the prevalence of transfusion-transmissible infections among blood donors in Albania. Clin Lab 2010: 56: 591-5. Egglestone SI, Turner AJL. Serological diagnosis of syphilis. Commun Dis Public Health 2000 ; 3 :158-62. Ejele OA, Erhabor O, Nwauche CA. Trends in the prevalence of some Transfusiontransmissible infections among blood donors in Port Harcourt, Nigeria. Haema 2005;8:273-7. Elasifer HA, Agnnyia YM, Al-Alagi BA, Daw MA. Epidemiological manifestations of hepatitis C virus genotypes and its association with potential risk factors among Libyan patients. Virol J. 2010 Nov 13;7:317. Virol J. 2010 Nov 13;7:317. Engels EA, Eastman H, Ablashi DV, Wilks RJ, Braham J, Manns A. Risk of transfusionassociated transmission of human herpesvirus 8. J Natl Can Inst 1999;20:1773-75. Erhabor O, Ok O, Awah I, Uko KE, Charles AT. The prevalence of plasmodia parasitaemia among donors in the Niger delta of Nigeria. Trop Doct 2007; 37(1):32–34. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 142 Esteba JI, Gonzales A, Hernandez JM, Vilademin L, Sanches L et al. Evaluation of antibodies to VHC in a study of transfusion hepatitis associated Eng J Med 1990; 323:1107-11. Epidi TT, Nwani CD, Ugorji NP. Prevalence of malaria in blood donors in Abakaliki. Scientific Research and Essays 2008; 3(4):162–164. Fang CT, Field SP, Busch MP, Heyns Adu P. Human immunodeficiency virus-1 and hepatitis C virus RNA among South African blood donors: estimation of residual transfusion risk and yield of nucleic acid testing. Vox Sang. 2003 Jul;85(1):9-19. Fasola FA, Otegbayo IA. Post-transfusion hepatitis in sickle cell anemia; retrospectiveprospective analysis. Nigerian Journal of Clinical Practice 2002; 5: 16-19. Feinstone SM, Kapikian AZ, Purceli RH.Hepatitis A: detection by immune electron microscopy of a viruslike antigen associated with acute illness.Science. 1973 Dec 7;182(116):1026-8. Foster PR. Prions and blood products. Ann Med 2000;32:501-13. Frank, C., Mohamed, M.K., Strickland, G.T., Lavanchy, D., Arthur, R.R., Magder, L.S., El Khoby, T., Abdel-Wahab, Y., Aly Ohn, E.S., Anwar, W. & Sallam, I. (2000) The role of parenteral antishistosomal therapy in the spread of hepatitis C virus in Egypt. Lancet, 355, 887–891. Fujiwara K, Tanaka Y, Orito E, Ohno T, Kato T, Sugihara K, Hasegawa I, Sakurai M, Ito K, Ozasa A, Sakamoto Y, Arita I, El-Gohary A, Benoit A, Ogoundele-Akplogan SI, Yoshihara N, Ueda R, Mizokami M. Distribution of HBV genotypes among HBV carriers in Benin:phylogenetic analysis and virological characteristics of HBV genotype E.World J Gastroenterol. 2005 Nov 7;11(41):6410-5. Galibert, F., Mandart, E., Fitoussi, F., Tiollais, P., et Charnay, P. (1979). Nucleotide sequence of the hepatitis B virus genome (subtype ayw) cloned in E. coli. Nature 281, 646 650. Ganem, D., Greenbaum, L., et Varmus, H. E. (1982). Virion DNA of ground squirrel hepatitis virus: structural analysis and molecular cloning. J Virol 44, 374-383. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 143 Gerin, J. L., Purcell, R. H., Hoggan, M. D., Holland, P. V., et Chanock, R. M. (1969). Biophysical properties of Australia antigen. J Virol 4, 763-768. Gerlich WH. Diagnostic problems caused by HBsAg mutants-a consensus report of an expert meeting. Intervirology. 2004;47(6):310-3. Gerlich, W. H., et Robinson, W. S. (1980). Hepatitis B virus contains protein attached to the 5' terminus of its complete DNA strand. Cell 21, 801-809. Giulivi A, Slinger R, Tepper M, Sher G, Scali V, Kessler G, Gill P. Prevalence of GBVC/hepatitis G virus viremia and anti-E2 in Canadian blood donors. Vox Sang 2000; 79:201-05. Global prevalence and incidence of selected curable sexually transmitted infection World health organization 2001http://www.who.int/docstore/VIH/GRSTI/005.htm Halim NK, Ajayi OI. Risk factors and seroprevalence of hepatitis C antibody in blood donors in Nigeria. East Afr Med J. 2000; 77:410-412. Hladik F and McElrath MJ (2008). Setting the stage: host invasion by HIV. Nat Rev Immunol 8(6): 447-57. Hoofnagle, JH, Gerety RJ and Barker LF (1973). Antibody to hepatitis-B-virus core in man. Lancet 2, 869-873. Hourfar MK, Jork C, Schottstedt V, Weber-Schehl M, Brixner V, Busch MP et al. Experience of German Red Cross blood donor services with nucleic acid testing: results of screening more than 30 million blood donations for human immunodeficiency virus1, hepatitis C virus, and hepatitis B virus. Transfusion 2008; 48: 1558- 66. Hsu M, Zhang J, Flint M, Logvinoff C, Cheng-Mayer C, Rice CM, and McKeating JA. Hepatitis C virus glycoproteins mediate pH-depend cell entry of pseudotyped retroviral particles (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 7271–7276 Huy TT, Ishikawa K, Ampofo W, Izumi T, Nakajima A, Ansah J, Tetteh JO, Nii-Trebi N, Aidoo S, Ofori-Adjei D, Sata T, Ushijima H, Abe K. Characteristics of hepatitis B virus in Ghana: full length genome sequences indicate the endemicity of genotype E in West Africa.J Med Virol. 2006 Feb;78(2):178-84. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 144 Izquierdo-Useros N, Blanco J, Erkizia I, Fernández-Figueras MT, Borràs FE, NaranjoGómez M, Bofill M, Ruiz L, Clotet B, Martinez-Picado J. (2007). Maturation of bloodderived dendritic cells enhances human immunodeficiency virus type 1 capture and transmission. J Virol 81(14): 7559-70. Janot C, Botte C. Le virus de l’hépatite C.Rev . Fr.Transf. Hémobiol ; 1992;35(3):155-61. Janssen RS, Satten GA, Stramer SL, Rawal BD, O'Brien TR, Weiblen BJ, Hecht FM, Jack N, Cleghorn FR, Kahn JO, Chesney MA, Busch MP. New testing strategy to detect early VIH-1 infection for use in incidence estimates and for clinical and prevention purposes. JAMA 1998; 280:42-48. Jeannel, D., Fretz, C., Traore, Y., Kohdjo, N., Bigot, A., Gamy, E.P., Jourdan, G., Kourouma, K., Maertens, G., Fumoux, F., Fournel, J.J. & Stuyver, L. (1998) Evidence for high genetic diversity and long-term endemicity of hepatitis C virus genotypes 1 and 2 in West Africa. Journal of Medical Virology, 55, 92–97. Jombo GT, Egah DZ, Banwat EB. Hepatitis B virus infection in a rural settlement of northern Nigeria. Niger J Med. 2005;14:425-428. Kaba K., 2004. Sécurité transfusionnelle en Afrique. [www.document].2004 NG COM Santé Tropicale.com. Kania D, Sangare L, Sakande J, et al. A new strategy to improve the cost-effectiveness of human immunodeficiency virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, and syphilis testing of blood donations in sub-Saharan Africa: a pilot study in Burkina Faso. Transfusion. 2009; 49:2237-2240. Kato N, Ootsuyama Y, Sekiya H, Ohkoshi S, Nakazawa T, Hijikata M, Shimotohno K.Genetic drift in hypervariable region 1 of the viral genome in persistent hepatitis C virus infection. J Virol. 1994 Aug; 68(8):4776-84. Keskın F, Çıftçı S, Türkoğlu S, Badur S. Transmission routes of chronic hepatitis C and their relation to HCV genotypes. Turk J Gastroenterol. 2010 Dec; 21(4):396-400. Kew MC, Hougton M, Choo QL, Kwo G.Hepatitis C antibodies in southern african blacks with hepato-cellular carcinoma.Lancet 1990; 335:873-74. Kimani D, Mwangi J, Mwangi M, Bunnell R, Kellogg TA, Oluoch T, Gichangi A, Kaiser R, Mugo N, Odongo T, Oduor M, Marum L. Blood donors in Kenya: a comparison of © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 145 voluntary and family replacement donors based on a population-based survey. Vox Sang 2010 Epub Aug 25. Kinde-Gazard, Oke J, Gnahoui I, Massougbodji A. The risk of malaria transmission by blood transfusion at Cotonou, Benin. Cahiers Sante 2000; 10(6):389–392. Klein HG. Allogeneic transfusion risks in the surgical patient. Am J Surg. 1995;170: 21S26S. Klein HG, Dodd RY, Ness PM, Fratantoni JA and Nemo GJ (1997). Current status of microbial contamination of blood components: summary of a conference. Transfusion 37:95–101. Kleinman S. Le VHG et ses conséquences sur les politiques de sécurité du sang au Canada. RMTC 2001; 27S3:16-19. Lara AM, Kandulu J, Chisuwo L, Kashoti A, Mundy C, Bates I. Laboratory costs of a hospital-based blood transfusion service in Malawi. J Clin Pathol 2007; 60(10):1117– 1120. Larsen SA, Pope V, Johnson RE, Kennedy EJ jr, editors. A manual of tests for syphilis th (9 edition). Washington DC: American Public Health Association. 1998. Larsen SA, Steiner BM, Rudolph AH. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for syphilis. Clin. Microbiol. Rev. 1995; 8 :1-21. Laurent F, Li JS, Vitvitsky L, Berby F, Lamelin JP, Alonso C, Trepo C. Intérêt de la PCR dans le diagnostic des hépatites .Rev.Fr .Transf. Hemobiol : 1992 ; 35 (3) :211-24. Le Corfec E, Le Pont F, Tuckwell HC, Rouzioux C, Costagliola D. Direct VIH testing in blood donations: variation of the yield with detection threshold and pool size. Transfusion 1999; 39: 1141-4. Lefrère JJ, Dahourouh H, Dokekias AE, Kouao MD, Diarra A, Diop S, Tapko JB, Murphy EL, Laperche S, Pillonel J. Estimate of the residual risk of transfusion-transmitted human immunodeficiency virus infection in sub-Saharan Africa: a multinational collaborative study. Transfusion 2010 Epub Sep 28. Leonard JT and Roy K (2006). The HIV entry inhibitors revisited. Curr Med Chem 13(8): 911-34. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 146 Lodenyo H, Schoub B, Ally R, Kairu S, Segal I. Hepatitis B and C virus infections and liver function in AIDS patients at Chris Hani Baragwanath Hospital, Johannesburg. East Afr Med J. 2000;77: 13-15. Loua A, Nze Nkoure G. Relative safety of first-time volunteer and replacement donors in Guinea. Transfusion 2010;50:1850-1. Löve A, Molnegren V, Månsson AS, Smáradóttir A, Thorsteinsson SB, Widell A.Evolution of hepatitis C virus variants following blood transfusion from one infected donor to several recipients: a long-term follow-up. J Gen Virol. 2004 Feb;85(Pt 2):441-50. Machida, A., Kishimoto, S., Ohnuma, H., Baba, K., Ito, Y., Miyamoto, H., Funatsu, G., Oda, K., Usuda, S., Togami, S., et et al. (1984). A polypeptide containing 55 amino acid residues coded by the pre-S region of hepatitis B virus deoxyribonucleic acid bears the receptor for polymerized human as well as chimpanzee albumins. Gastroenterology 86, 910-918. Marques A, Torres S, Davis JM. The current infectious risks of transfusions. Surg Infect (Larchmt) 2005; 6: S23-31. Martinson FE , Weigle KA , Mushahwar IK , Weber DJ, Royce R et al. Seroepidemiologycal survey of hepatitis B and C virus infection in Ghanaian children.Jr Med Virol 1996 ;48(3):278-83. Matee MI, Lyamuya EF, Mbena EC, et al. Prevalence of transfusion-associated viral infections and syphilis among blood donors in Muhimbili Medical Centre, Dar es Salaam, Tanzania. East Afr Med J. 1999; 76:167-171. Matee MI, Magesa PM, Lyamuya EF. Seroprevalence of human immunodeficiency virus, hepatitis B and C viruses and syphilis infections among blood donors at the Muhimbili National Hospital in Dar es Salaam, Tanzania. BMC Public Health. 2006; 6: 21. Mbanya DN, Feunou F, Tayou TC. Volunteer or family/replacement donations: are the tides changing? Transfusion 2010;50:1849-50. Mbanya DN, Tayou C. Blood safety begins with safe donations: update among blood donors in Yaounde, Cameroon. Transfus Med. 2005;15:395-399. Mbanya, D.N., Feunou, F. & Tayou, T.C. (2010). Relative safety of first-time volunteer and replacement donors in Guinea. Transfusion, 50, 1850–1851. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 147 McMahon EJ, Fang C, Layug L, Sandler SG. Pooling blood donor samples to reduce the cost of VIH-1 antibody testing. Vox Sang 1995 ; 68 : 215-9. Mishra V, Vaessen M, Boerma JT, et al. VIH testing in national population-based surveys: experience from the Demographic and Health Surveys. Bull World Health Organ. 2006;84:537-545. Moerman B, Moons V, Sommer H, Schmitt Y, Stetter M. Evaluation of sensitivity for wild type and mutant forms of hepatitis B surface antigen by four commercial HBsAg assays. Clin Lab. 2004;50(3-4):159-62. Molnar-Kimber, K. L., Summers, J. W., et Mason, W. S. (1984). Mapping of the cohesive overlap of duck hepatitis B virus DNA and of the site of initiation of reverse transcription. J Virol 51, 181-191. Molnar-Kimber, K. L., Summers, J., Taylor, J. M., et Mason, W. S. (1983). Protein covalently bound to minus-strand DNA intermediates of duck hepatitis B virus. J Virol 45, 165-172. Moor AC, Dubbelman TM, VanSteveninck J, Brand A. Transfusion Transmitted diseases: risks, prevention and perspectives. Eur J Haematol 1999; 62:1-18. Moore A, Herrera G, Nyamongo J, Lackritz E, Granade T, Nahlen B, Oloo A, Opondo G, Muga R, Janssen R. Estimated risk of VIH transmission through blood transfusion in Kenya. Lancet 2001; 358: 657-60. Morel P. ; Laurent R. ; Revuz J. ; Blanc J.M.Annales de dermatologie 2002, 2569-2574. Mulders MN, Venard V, Njayou M, Edorh AP, Bola Oyefolu AO, Kehinde MO, Muyembe Tamfum JJ, Nebie YK, Maiga I, Ammerlaan W, Fack F, Omilabu SA, Le Faou A, Muller CP. Low genetic diversity despite hyperendemicity of hepatitis B virus genotype E throughout West Africa.J Infect Dis. 2004 Jul 15;190(2):400-8. Murphy EL, Fang J, Tu Y, Cable R, et al. Hepatitis C virus prevalence and clearance among US blood donors, 2006-2007: associations with birth cohort, multiple pregnancies, and body mass index. J Infect Dis 202(4): 576-84. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 148 Mvere, D.A. (2002) Evaluation of the Pledge 25 Club: A Youth Donor Recruitment Programme in Zimbabwe. 27th Int Congress of the ISBT. Vancouver 2002; A684. ISBT, Amsterdam, The Netherlands. Nagalo MB, Sanou M, Bisseye C, Kaboré MI, Nebie YK, Kienou K, Kiba A, Dahourou H, Oua ttara S, Zongo JD, Simporé J.Seroprevalence of human immunodeficiency virus (HIV), hepatitis B and C and syphilis among blood donors at Koudougou (Burkina Faso) in 2009. Blood Transfus. 2011b Jul 18;4(1):1-6. doi: 10.2450/2011.0112-10. Nagalo, B. M., C. Bisseye, M. Sanou, Y. K. Nebie, A. Kiba, K. Kienou, J. D. Zongo, and J. Simpore (2011a). [Molecular diagnosis of acquired human immunodeficiency virus (HIV) in pooled plasma from blood donors at the Regional Blood Transfusion Center in Ouagadougou, Burkina Faso]. Med Trop 2011 (Mars) 71: 137-41. Nantachit N, Thaikruea L, Thongsawat S, Leetrakool N, Fongsatikul L, Sompan P et al. Evaluation of a multiplex human immunodeficiency virus-1, hepatitis C virus, and hepatitis B virus nucleic acid testing assay to detect viremic blood donors in northern Thailand. Transfusion 2007 ; 47 : 1803-8. Ndong-Atome, G. R., Makuwa, M., Ouwe-Missi-Oukem-Boyer, O., Pybus, O. G., Branger, M., Le Hello, S., Boye-Cheik, S. B., Brun-Vezinet, F., Kazanji, M., Roques, P. & Bisser, S. (2008) High Prevalence Of Hepatitis C Virus Infection And Predominance Of Genotype 4 In Rural Gabon. J Med Virol, 80, 1581-7. Norder, H., Hammas, B., Lee, S. D., Bile, K., Courouce, A. M., Mushahwar, I. K., et Magnius, L. O. (1993). Genetic relatedness of hepatitis B viral strains of diverse geographical origin and natural variations in the primary structure of the surface antigen. J Gen Virol 74 (Pt 7),1341-1348. O'Brien SF, Yi QL, Fan W, Scalia V, Kleinman SH, Vamvakas EC. Current incidence and estimated residual risk of transfusion-transmitted infections in donations made to Canadian Blood Service. Transfusion 2007; 47:316-325. Okuda M, Hino K, Korenaga M, Yamaguchi Y, Katoh Y, Okita K. Differences in hypervariable region 1 quasispecies of hepatitis C virus in human serum, peripheral blood mononuclear cells, and liver. Hepatology. 1999 Jan;29(1):217-22. Ola SO, Otegbayo JA, Yakubu A, Aje AO, Odaibo GN, Shokunbi W. Pitfalls in diagnosis of hepatitis B virus infection among adults Nigerians. Niger J Clin Pract. 2009 Dec;12(4):350-4. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 149 OMS/ONUSIDA. Rapport de situation 2009.Vers un accès universel Étendre les interventions prioritaires liées au VIH/sida dans le secteur de la santé. ONUSIDA/OMS « Le point dur l’épidémie de SIDA », décembre 2005. Organisation Mondiale de la santé (OMS) .Aide-mémoire N°164, Révisé en Octobre 2000 [www.document].http:// www.Who. int/ inf-fs/ fv/ am 164.html. Oshitani H, Kasolo F, Tembo C, et al. Hepatitis B virus infection among pregnant women in Zambia. East Afr Med J. 1995;72:813-815. Owusu-Ofori S, Asenso-Mensah K, Boateng P, Sarkodie F, Allain JP. Fostering. Repeat donation in Ghana. Biologicals 2010;38:47-52. Pasek, M., Goto, T., Gilbert, W., Zink, B., Schaller, H., MacKay, P., Leadbetter, G., et Murray, K. (1979). Hepatitis B virus genes and their expression in E. coli. Nature 282, 575- 579. Pawlotsky JK, Lunel F: Le virus de l’hépatite C .In :les virus transmissibles par le sang; 1996 :23-52. Pawlotsky JM, Bastie A, Hézode C, Lonjon I, Darthuy F, Rémiré J, Dhumeaux D. Routine detection and quantification of hepatitis B virus DNA in clinical laboratories: performance of three commercial assays.J Virol Methods. 2000 Mar;85(1-2):11-21. Pawlotsky JM, Bastie A, Lonjon I, Rémiré J, Darthuy F, Soussy CJ, Dhumeaux D. What technique should be used for routine detection and quantification of HBV DNA in clinical samples?J Virol Methods. 1997 May;65(2): 245-53. Pawlotsky JM, Germanidis G, Frainais PO, Bouvier M, Soulier A, Pellerin M, Dhumeaux D.Evolution of the hepatitis C virus second envelope protein hypervariable region in chronically infected patients receiving alpha interferon therapy. J Virol. 1999 Aug;73(8):6490-9. Pellizzer G, Ble C, Zamperetti N, et al. Serological survey of hepatitis B infection in Tanzania. Public Health. 1994;108: 427-431. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 150 Persing, D. H., Varmus, H. E., et Ganem, D. (1985). A frameshift mutation in the pre-S region of the human hepatitis B virus genome allows production of surface antigen particles but eliminates binding to polymerized albumin. Proc Natl Acad Sci U S A 82, 3440-3444. Petersen LR, Doll LS, White CR, Johnson E, Williams A. Heterosexually acquired human immunodeficiency virus infection and the United States blood supply: considerations for screening of potential blood donors. VIH Blood Donor Study Group. Transfusion. 1993;33:552-55. Pillonel J, Saura C, Courouce AM. Prevalence du VIH, de l’HTLV et des virus des hépatites B and C chez les donneurs de sang en France 1992-1996. Transfus Clin Biol 1998 ; 5 : 305-12. Prabdial-Sing, N., Giangaspero, M., Puren, A. J., Mahlangu, J., Barrow, P. & Bowyer, S. M. (2011) Palindromic-Nucleotide Substitutions (Pns) Of Hepatitis C Virus Genotypes 1 And 5a From South Africa. J Virol Methods, 175, 272-7. Pybus, O. G., Barnes, E., Taggart, R., Lemey, P., Markov, P. V., Rasachak, B., Syhavong, B.,Phetsouvanah, R., Sheridan, I., Humphreys, I. S., Lu, L., Newton, P. N. & Klenerman, P. (2009) Genetic History Of Hepatitis C Virus In East Asia. J Virol, 83, 1071-82. Rabe, B., Vlachou, A., Pante, N., Helenius, A., et Kann, M. (2003). Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 9849-9854. Regamey N, Tamm M, Wernli M, Witschi A, Thiel G, Cathomas G et coll. Transmission of human herpesvirus 8 infection from renal-transplant donors to recipients. N Engl J Med 1998;339:1358-63. Réseau Hépatite C. www.hépatiteweb.com. Marseille-Province-Alpes du Sud-Corse(MPAC). Reynier P., Malthièry Y., 1996. PCR longue: progrès récents et application à l’étude des délétions de l’ADN mitochondrial. Médecine/sciences 12 :1011-6. Ricketts MN, Cashman NR, Stratton E, ElSaadany S. Is Creutzfeldt-Jakob disease transmitted in blood ? Emerg Infect Dis 1997;3:157-63. Rigg, R. J., et Schaller, H. (1992). Duck hepatitis B virus infection of hepatocytes is not dependent on low pH. J Virol 66, 2829-2836. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 151 Rios M, Bianco C. Human T-cell leukemia virus. Dans: Linden JV and Bianco C, éds. Blood Safety and Surveillance. New York: Marcel Dekker, Inc. 2001:295-313. Robinson, W. S., Clayton, D. A., et Greenman, R. L. (1974). DNA of a human hepatitis B virus candidate. J Virol 14, 384-391. Rossner, M. T. (1992). Review: hepatitis B virus X-gene product: a promiscuous transcriptional activator. J Med Virol 36, 101-117. Roth WK, Weber M, Seifried E. Feasibility and efficacy of routine PCR screening of blood donations for hepatitis C virus, hepatitis B virus, and VIH-1 in a blood-bank setting. Lancet 1999 ; 353 : 359-63. Ruggieri A, Argentini C, Kouruma F, Chionne P, D'ugo E, Spada E, Dettori S, Sabbatani S & Rapicetta M (1996) Heterogeneity of hepatitis C virus genotype 2 variants in West Central Africa (Guinea Conakry). Journal of General Virology, 77 ( Pt 9), 2073-6. Ryder RW, Whittle HC, Wojiecowsky T, Moffat WM, Baker BA, Sarr E, Oldfield F. Screening for hepatitis B virus markers is not justified in West African transfusion centres. Lancet. 1984 Aug 25;2(8400):449-52. Saldanha J. Validation and standardisation of nucleic acid amplification technology (NAT) assays for the detection of viral contamination of blood and blood products.J Clin Virol. 2001 Jan;20(1-2):7-13. Review Sanou P. T., 1999. Données Epidémiologiques et Luttes contre le SIDA au Burkina Faso. (CERBA). Sarkodie F, Adarkwa M, Adu-Sarkodie Y, Candotti D, Acheampong JW, Allain JP. Screening for viral markers in volunteer and replacement blood donors in West Africa. Vox Sanguinis 2001; 80: 142-147. Sarkodie, F., Adarkwa, M., Adu-Sarkodie, Y., Candotti, D., Acheampong, J.W. & Allain, J.P. (2001) Screening for viral markers in volunteer and replacement blood donors in West Africa. Vox Sanguinis, 80, 142–147. Schmidt BL, Ekijlalipour M, Luger A. Comparative evaluation of nine different enzyme linked immunosorbent assays for determination of antibodies against Treponema pallidum in patients with primary syphilis. J.Clin.Microbiol. 2000 ; 35-36 : 172-5. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 152 Schneider V., 2003. Quantification génomique: applications aux infections par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Revue Française des Laboratoires, Volume 2003,Issue351,Pages31-34.doi:10.1016/S0338-9898(03)73382-4 http://www.sciencedirect.com/science/journal/0338. Schreiber GB, Busch MP, Kleinman SH, Korelitz JJ. (1996) The risk of transfusiontransmitted viral infections. N Engl J Med 334(26):1685-1690. Seeger, C., Ganem, D., et Varmus, H. E. (1986). Biochemical and genetic evidence for the hepatitis B virus replication strategy. Science 232, 477-484. Serious Hazards of Transfusion Steering Group. Serious hazards of transfusion. www.shotuk.org. SIDA Infos Service. Qu’est-ce que l’hépatite C ? [www.document]. http://www.sida-infoservice.org/page hepatites/page hepatites.php3. Simmonds P, Holmes EC, Cha TA, Chan SW, McOmish F, Irvine B, Beall E, Yap PL, Kolberg J, Urdea MS. Classification of hepatitis C virus into six major genotypes and a series of subtypes by phylogenetic analysis of the NS-5 region.J Gen Virol. 1993 Nov;74 ( Pt 11):2391-9. Simmonds, P. (1995) Variability Of Hepatitis C Virus. Hepatology, 21, 570-83. Simmonds P. Viral heterogeneity of the hepatitis C virus.J Hepatol. 1999;31 Suppl 1:5460. Simpore J, Savadogo A, Ilboudo D, Nadambega MC, Esposito M, Yara J, Pignatelli S, Pietra V, Musumeci S. Toxoplasma gondii, HCV, and HBV seroprevalence and co-infection among HIV-positive and -negative pregnant women in Burkina Faso. J Med Virol. 2006 Jun;78(6):730-3. Simpore J. ,2006. Manipulation génétique de la vie et éthique de la recherche, via delle calanziane, 64.Rome 2006. Snon T, Ikuta Y, Hasegawa M et al. Prevalence of hepatitis C virus antibodies in Yatsuka town of Simane prefecture, Japan. Nippon Shokakihyo Gakkai Zasshi 1992; 89:1173-8. Société canadienne du sang (SCS). Test d'amplification de l'acide nucléique pour le dépistage du VIH. Mai 2001.http://www.bloodservices.ca/CentreApps/Internet/ UW_V502_MainEngine.nsf/resources/F_PDF/$file/scientific_document_f.pdf. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 153 Stevens, C.E., P.E. Taylor, J. Pindyck. Epidemiology of hepatitis C virus. J n Am Med Assoc 1997; 263: 49-53. Stibbe, W., et Gerlich, W. H. (1983). Structural relationships between minor and major proteins of hepatitis B surface antigen. J Virol 46, 626-628. Stramer SL, Glynn SA, Kleinman SH, Strong DM, Caglioti S, Wright DJ, Dodd RY, Busch MP; National Heart, Lung, and Blood Institute Nucleic Acid Test Study Group. Detection of VIH-1 and VHC infections among antibody-negative blood donors by nucleic acidamplification testing. N Engl J Med 2004; 351:760-768. Stratton E, Ricketts MN, Gull y PR. La maladie de Creutzfeldt-Jakob au Canada. RMTC 1996;22:57-61. Sullivan MT, Schonberger LB, Kessler D. Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) investigational lookback study. Transfusion 1997;37(Suppl.):2S. Tagny CT, Mbanya D, Tapko J, Lefre‘re J. Blood safety in sub-Saharan Africa: a multifactorial problem. Transfusion 2008; 48(6):1256–1261. Takahashi, K., Imai, M., Gotanda, T., Sano, T., Oinuma, A., Mishiro, S., Miyakawa, Y., et Mayumi, M. (1980). Hepatitis B e antigen polypeptides isolated from sera of individuals infected with hepatitis B virus: comparison with HBeAg polypeptide derived from Dane particles. J Gen Virol 50, 49-57. Tapko, J.B., Mainuka, P. & Diarra-Nama, A.J. (2007) Status of Blood Safety in the WHO African Region. Report of the 2006 Survey. World Health Organization Regional Office for Africa (AFRO) Brazzaville, Republic of Congo. Tapko, JB, Sam O, A.J. Diarra-Nama. Status of blood safety in the WHO African Region: report on the 2004 survey. AFRO WHO. 2007. Tessema B, Yismaw G, Kassu A, et al. Seroprevalence of VIH, VHB, VHC and syphilis infections among blood donors at Gondar University Teaching Hospital, Northwest Ethiopia: declining trends over a period of five years. BMC Infect Dis 2010; 10 :111. Tounkara, A., Sarro, Y.S., Kirstensen, S., Dao, S., Diallo, H., Diarra, B., Noumsi, T.G. & Guindo, O. (2009a) Seroprevalence of HIV/HBV coinfection in Malian blood donors. International Association of Physicians in AIDS Care (Chicago), 8, 47–51. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 154 Traore Z. Séroprévalence de la syphilis au centre de santé de référence V et au CNTS. Thèse de médecine Bamako 2000 n° 8. Tsega E, Mengesha B, Nordenfelt E, Hansson BG, Lindberg J. Prevalence of hepatitis B virus markers among Ethiopian blood donors: is HBsAg screening necessary? Trop Geogr Med. 1987 Oct;39(4):336-40. UNAIDS (2010b) http://data.unaids.org/pub/Outlook/2010/20100713_outlook_youngpeople_en.pdf. UNAIDS (2010a).www.unaids.org/documents/20101123_2010_HIV_Prevalence_Map Valenzuela, P., Gray, P., Quiroga, M., Zaldivar, J., Goodman, H. M., et Rutter, W. J. (1979). Nucleotide sequence of the gene coding for the major protein of hepatitis B virus surface antigen. Nature 280, 815-819. Vardas, E., Sitas, F., Seidel, K., Casteling, A. & Sim, J. (1999) Prevalence of hepatitis C virus antibodies and genotypes in asymptomatic, first-time blood donors in Namibia. Bulletin of the World Health Organization, 77, 965–972. Vermeulen M, Lelie N, Sykes W, Crookes R, Swanevelder J, Gaggia L, Le Roux M, Kuun E, Gulube S, Reddy R. Impact of individual-donation nucleic acid testing on risk of human immunodeficiency virus, hepatitis B virus, and hepatitis C virus transmission by blood transfusion in South Africa. Transfusion. 2009 Jun;49 (6):1115-25. Von Hahn, T and Rice, CM. Hepatitis C Virus Entry (2008). J Biol Chem. 15; 283(7):368993. Vossenkämper A, Macdonald TT, Marchès O (2011). Always one step ahead: How pathogenic bacteria use the type III secretion system to manipulate the intestinal mucosal immune system. J Inflamm (Lond) 8: 11. Weinberger KM, Wiedenmann E, Bohm S, and Jilg W (2000). Sensitive and accurate quantitation of hepatitis B virus DNA using a kinetic fluorescence detection system (TaqMan PCR). J Virol Methods 85, 75-82. Wilkin TJ, Su Z, Kuritzkes DR, Hughes M, Flexner C, Gross R, Coakley E, Greaves W, Godfrey C, Skolnik PR, Timpone J, Rodriguez B, Gulick RM (2007). "HIV type 1 chemokine coreceptor use among antiretroviral-experienced patients screened for a © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 155 clinical trial of a CCR5 inhibitor: AIDS Clinical Trial Group A5211." Clin Infect Dis 44(4): 591-5. WHO. Global Report on AIDS Epidemic: Treatment and care. WHO 2008; pp48. World Health Organization. Global Report on AIDS Epidemic: Treatment and care. World Health Organization, p48. 2008. World Health Organization. Status of blood safety in the WHO African region: report of the 2004 survey WHO Regional Office for Africa, Brazzaville: 1-25. 2007. World Health Organization. Global Database on Blood safety report 2001-2. [www.document].URLhttp://www.who.int./bloodsafety/GDBS_Report_2001-2002.pdf. 2004. Yerly S, Pedrocchi M, Perrin L. The use of polymerase chain reaction in plasma pools for the concomitant detection of hepatitis C virus and VIH type 1 RNA. Transfusion 1998 ; 38 : 908-14. Young H. 1992. Syphilis: new diagnostic directions. Int J STD AIDS. 3 (6) : 391413[www.document].Young people are leading the VIH prevention revolution. Zeba MT, Sanou M, Bisseye C, Kiba A, Nagalo BM, Djigma FW, Compaoré TR, Nebié YK, Kienou K, Sagna T, Pietra V, Moret R, Simporé J. Characterisation of hepatitis C virus genotype among blood donors at the regional blood transfusion centre of Ouagadougou, Burkina Faso. Blood Transfus. 2012 Sep 12:1-5. doi: 10.2450/2012.0089-12. Zou S, Musavi F, Notari EP, Stramer SL, Dodd RY. Prevalence, incidence, and residual risk of major blood-borne infections among apheresis collections to the American Red Cross Blood Services, 2004 through 2008. Transfusion 2010 ; 50 :1487-94. Zou S,Dorsey KA, Notari EP, Foster GA, Krysztof DE, Musavi F et al. Prevalence, incidence, and residual risk of human immunodeficiency virus and hepatitis C virus infections among United States blood donors since the introduction of nucleic acid testing. Transfusion 2010 ; 50 : 1495-504. Zou S, Stramer SL, Dodd RY. Donor Testing and Risk: Current Prevalence, Incidence, and Residual Risk of Transfusion-Transmissible Agents in US Allogeneic Donations. Transfus Med Rev. 2011 Aug 24. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 156 Liste des articles de la présente thèse Article I. Nagalo MB, Sanou M, Bisseye C, Kaboré MI, Nebie YK, Kienou K, Kiba A, Dahourou H, Ouattara S, Zongo JD, Simporé J. Seroprevalence of human immunodeficiency virus (HIV), hepatitis B and C and syphilis among blood donors at Koudougou (Burkina Faso) in 2009. Blood Transfusion. 2011 Oct ; 9 (4) : 419-24. Article II. Nagalo MB, Sanou M, Bisseye C, Kaboré MI, Nebie YK, Kienou K, Kiba A, Dahourou H, Oua ttara S, Jean Baptiste Nikiema, Rémy Moret, Jean Didier Zongo and Jacques Simpore. Seroprevalence and incidence of transfusion-transmitted infectious diseases among blood donors from regional blood transfusion centers in Burkina Faso, West Africa. Tropical Medicine and International Health 2012 Feb; 17 (2):247-53. Article III. Nagalo, B. M., C. Bisseye, M. Sanou, Y. K. Nebie, A. Kiba, K. Kienou, J. D. Zongo, and J. Simpore (2011a). [Molecular diagnosis of acquired human immunodeficiency virus (HIV) in pooled plasma from blood donors at the Regional Blood Transfusion Center in Ouagadougou, Burkina Faso]. Med Trop 2011 (Mars) 71: 137-41. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 157 Autres articles non inclus dans la présente thèse 1-Linguissi LS, Nagalo BM, Bisseye C, Kagoné TS, Sanou M, Tao I, Benao V, Simporé J, Koné B. Seroprevalence of toxoplasmosis and rubella in pregnant women attending antenatal private clinic at Ouagadougou, Burkina Faso. Asian Pac J Trop Med. 2012 Oct;5(10):810-3. doi: 10.1016/S1995-7645(12)60148-5. 2-Laure Stella Ghoma Linguissi, Cyrille Bisseye, Tani Sagna, Bolni Marius Nagalo, Djeneba Ouermi, Florencia W. Djigma, Salvatore Pignatelli, Joseph D. Sia, Virginio Pietra, Remy Moret, Jean Baptiste Nikiema, Jacques Simpore. Efficiency of HAART in the prevention of mother to children HIV-1 transmission at Saint Camille medical centre in Burkina Faso, West Africa. Asian Pac J Trop Med. 2012 Dec;5(12):991-4. doi: 10.1016/S1995-7645(12)60188-6. 3 -Moctar Tokèda Abdoul Zeba, Mahamoudou Sanou, Cyrille Bisseye, Alice Kiba, Bolni Marius Nagalo, Florencia Wendkuuni Djigma, Tegwindé Rebecca Compaoré, Yacouba Koumpingnin Nebié, Kisito Kienou, Tani Sagna, Virginio Pietra, Rémy Moret, Jacques Simporé. Characterisation of hepatitis C virus genotype among blood donors at the regional blood transfusion centre of Ouagadougou, Burkina Faso. Blood Transfus. 2012 Sep 12:1-5. doi: 10.2450/2012.0089-12. 4-Mahamoudou Sanou, Marius Bolni Nagalo, Cyrille Bisseye, Dapla Palenfo, Jacques Simporé, Rasmata Traoré, Lassana Sangaré. Efficacité du diagnostic moléculaire par PCR en temps réel d’agents bactériens responsables des méningites purulentes au Burkina Faso. Médecine et Santé Tropicales ; Sous presse. © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 158 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 159 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 160 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 161 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 162 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 163 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 164 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 165 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 166 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 167 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 168 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 169 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 170 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 171 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 172 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 173 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 174 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 175 © Thèse de Doctorat Unique BOLNI MARIUS NAGALO Page 176