La quantification en cytométrie en flux : méthodes, limites, précision

La quantification en cytométrie
en flux : méthodes, limites,
précision et applications
Thierry Bouvier1, Behzad Mostajir1,
Patrice Got1, Josep M. Gasol2
1.
2.
UMR5119 CNRS-UM2, Laboratoire ECOLAG, Université Montpellier2, case 093, 34095
Montpellier cedex 05
Departament de Biologia Marina i Oceanografia Institut de Ciències del Mar-CMIMA,
CSIC Pg Marítim de la Barceloneta 37-49, 08003 Barcelona, Catalunya, Spain
La cytométrie en flux en
microbiologie environnementale
Microorganismes: virus, bactéries, phytoplancton,
protozoaires, levures, parasites,
pathogènes
Flux de matière: e.g. broutage des bactéries par les
protozoaires
État physiologique: bactéries altérées ou très actives
Besoin des abondances
« Flow cytometry, in particular,
was envisioned as an ideal
method for counting and
eventually for classifying cells »
Howard M. Shapiro. 1995. Pratical Flow Cytometry, p.43
Comment peut-on correctement
énumérer les abondances par
cytométrie en flux ?
Cellule volume-1
!Cytomètre
(évènements)
!Méthodes directes
!Méthodes indirectes
Méthodes directes
•Mesure du volume de
l’échantillon par le cytomètre
en flux.
•Concentration instantanée
des cellules
Seringue
ACR
(Bruker Spectrospin)
Débit
PAS-III
(Partec AG)
Cytoron Absolute
(Ortho)
Débit machine " temps acquisition " volume ??
Flow rate
Moyenne journalière
60
Mesure du
flux
Flow rate µl min
-1
Vitesse HIGH
55
50
45
0
Variabilité totale: 0.4%
Variabilité journalière : 0.7%
20
40
60
80
Run ID#
100
120
140
Mesure du flux
Flow rate
Moyenne journalière
20
Flow rate µl min
-1
Vitesse LOW
15
10
5
0
Variabilité totale: 3%
Variabilité journalière : 4%
0
20
40
60
80
Run ID#
100
120
140
Méthodes indirectes
•Volume obtenu par :
•Pesée
•Pipette
•Standard interne
•Concentration des cellules
après calcul
FACS Calibur
BryteHS
FM50
Moflo
FACS Aria
Coulter HmX
FACS Scan
CAII Partec
AutoMacs
EpicsCyto-b
Pesée
Par pesée avant et après le passage de
l’échantillon
Volume de passage < 50 µl difficile
Perte de temps considérable (e.g. 6 min
pour phyto)
Volume
Par pipetage du volume restant
Perte de temps considérable (e.g. 7 min
pour phyto)
Variabilité entre manipulateurs ?
300
y = 0.9927x + 2.6175
2
R = 0.9976
Poids (µg)
250
200
150
100
50
0
0
50
100
150
200
250
300
Volume, µl
Pas de différence entre mesure du volume par pesée et pipetage
Erreur moyenne
200µL
100µL
5
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Individus
30μl " 3.33 106 cellules. ml-1
Ex: 10 000 évènements
30.6μl " 3.27 106 cellules. ml-1
2%
(0.4%-2%)
Mesure indirecte donne une très bonne estimation du
volume.
MAIS, décalage entre capacité analytique du cytomètre et la
mesure manuelle du volume analysé (pesée & pipetage).
Solution:
Standard interne
• Cellules types
• Particules synthétiques
standardisées
• Autres matériels biologiques
Les billes fluorescentes
en polystyrène
Nombreux distributeurs :
Coulter, FlowCyto Standard Corporation, Polysciences,
Sperotech, BD TrueCounts, DakoCytomation.
Calibrées:
Taille (0.1μm - 10μm)
Caractéristique spectrale
Luminosité
Uniformité
Colorée avec une grande variété de colorant:
Fluorescéine, phycoérythrine, colorant de l’ADN et ARN,
anticorps fluo, # d’anticorps connu (immunofluorescence
quantitative), au choix (pour un certain prix).
Les billes fluorescentes
en polystyrène
Ajout directement dans l’échantillon:
Simple, pas de perte de temps
Fluorescence étalonnée:
Alignement de la machine pour maximiser les signaux de
fluorescence et de diffusion de la lumière
Nombre calibré (concentration connue de billes):
Comptage des cellules d’intérêts.
Stabilité des solutions de billes
Cytomètre: FACS Calibur
Billes: Polysciences
Beads counted in 2 minutes
6000
Vitesse HIGH
5000
4000
3000
2000
1000
0
!Diminution du # de billes au
cours du temps (jours)
10
20
30
40
50
60
70
80
Run ID#
800
Beads counted in 2 minutes
!Stabilité apparente (journalière ?)
0
Vitesse LOW
700
600
500
400
300
200
100
0
0
20
40
60
Run ID#
80
100
Stabilité des solutions de billes
Cytomètre: FACS Calibur
Billes: TruCount
1800
1600
1min30 tous les 1/5h
B eads Counted
!Stabilité du # de billes au
cours du temps (jours)
1400
Vitesse HIGH
1200
1000
800
600
400
Vitesse LOW
200
0
0
5
10
Run ID#
15
20
Comparaison de billes (Polysc vs. TruCount)
80
Volume calculé ("Polyscience+jus
TruCount")
Volume calculé ("Polyscience")
80
60
40
20
60
40
y = 0.9725x + 0.2231
20
2
R = 0.805
y = 0.5625x - 1.9818
2
0
R = 0.4945
0
20
40
60
0
80
Volume calculé ("TruCount")
Mesure du volume différent
Réplications différentes
Variabilité (bille “TruCount”): 4.2 %
Variabilité (bille “Polyscience”): 20.8 %
0
20
40
60
Volume calculé ("TruCount")
Effets des tensio-actifs
Variabilité (bille “TruCount”): 4.5 %
Variabilité (bille “Polyscience”): 4.6 %
80
Effet du paramètre d’acquisition:
1200
Nombre de billes
1000
16%
800
600
400
200
0
FL3
FL2
Paramètre d'acquisition
!Détection des billes TruCount optimal dans le rouge (FL3) et le vert (FL1)
!Non recommandé dans l’orange (e.g. cyanobactérie)
Uniformité de la tailles:
Fluoresbrite® YG Polysciences 3.00µm
30
35
25
30
15
2
4
6
8
3.
3.
3.
3.
8
2.
3
6
6
4.
2.
4
4.
2
2
8
3.
4.
6
3.
µm
4
4
2.
3.
0
2
0
3.
5
3
5
4
10
2.
10
20
2
15
25
2.
Pourcentage
20
8
Pourcentage
TruCount® Becton Dickinson
µm
!Billes TruCount non recommandé pour l’alignement de la machine
!Billes Polysciences excellentes pour l’alignement
Conclusion
Moyen
Avantages
Inconvénients
Poids
Precision acceptable
Long … très long
<50μl, difficile
Volume
Précision acceptable
Long … très long
Dépendant de la pipette
Utilisateur
Billes
Précision acceptable
Très simple d’utilisation
Stabilité de la conc.
Prix (e.g. TruCount)
Seringues
Encore plus facile
Bonne précision
Nettoyage seringue
Débitmètre
Encore plus facile
Bonne précision
( ?)
• enumeration by measuring flow rate (9 yr-old FACSCalibur)
Flow rate / moyenne flow rate
Std speed HIGH
Std speed LOW
3
Standardized flow rate
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0
20
40
60
80
Run ID#
100
120
140
Dapi-counting variability in our lab: 5-20%