Dosage Protéines (BCA)

UMR 7052
B2OA
BCH02
Dosage protéines
Dosage Protéines (BCA)
Numéro de protocole
BCH02
Rédacteur
Warda / D. Logeart
Validé par
Date de validation
Nombre de pages du protocole complet
Jan 2014
2
Principe :
Ce dosage permet de quantifier la quantité de protéines présentes dans l’échantillon étudié.
La méthode BCA est un dosage colorimétrique des protéines, basé sur l'acide bicinchonique. Les
protéines réduisent l'ion cuivrique Cu(II) en Cu(I) en milieu alcalin. L'acide bicinchoninique est un réactif colorigène
hautement spécifique pour le Cu(I), qui forme un complexe pourpre ayant une absorption optique maximale à 562
nm (peut être lu entre 540 et 590nm). L'absorbance est proportionnelle à la concentration de protéines. Cette
méthode est une alternative à la méthode Lowry
Gamme de dosage linéaire: 20-2000µg/mL
Matériels + Fournisseurs :
Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific)
Plaque de 96 puits transparente
Film adhésif pour plaque
Pipette 20 et 200 µL
Four à 37°C ou 60°C
Protocole standard :37°C - 30 min : gamme de 20-2000 µg/ml
Protocole augmenté : 60°C – 30 min : gamme de 5-250 µg/ml
Mode opératoire :
1. Préparer une gamme étalon avec de l’albumine (de 0 à 2000 µg/ml) (100 µl /
concentration dans le même tampon que celui dans lequel sont vos échantillons à
doser)
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UMR 7052
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BCH02
Dosage protéines
Exemple de préparation
2. Introduire 25 µL de la gamme étalon (Albumine à 2000 µg/µL) et des échantillons dans puits
d’une plaque de 96 puits.
3. Préparer le BCA WR (Working Reagent) : Calculer à l’avance le volume dont vous aurez
besoin, sachant qu’il faut 200 µl de WR par échantillon ; NE PAS OUBLIER LES BLANCS
[# standards (blcs compris) + # échantillons inconnus] X [# replicats] X 0.2 = Vol de WR nécessaire en ml
50 volumes du reactif A + 1 volume de réactif B.
On obtient une jolie couleur verte après mélange ; stable qq jours à T° ambiante
4. Introduire 200 µL de WR dans chaque puits contenant les échantillons (ratio sample : WR =
1 :8)
Rmq : si volume échantillon limité, on peut descendre le ratio à 1 :20, mais la sensibilité sera moins bonne (gamme
de 125 à 2000 µg/ml)
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9.
Agiter un peu la plaque sur shaker (sans que ça déborde !)
Sceller la plaque avec un film adhésif
Incuber la plaque à 37 °C ou 60°C pendant 30 min.
Laisser refroidir
Mesurer la DO à l’aide du spectromètre µQUANT à 562 nm.
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