1 Exemple 1 : distribution spatiale de compartiments endo - gdr-Miv

Atelier MifoBio2016
Reconstruction et modélisation statistique de distributions
spatiales 3D avec le logiciel Free-D
Philippe Andrey et Eric Biot
Institut Jean Pierre Bourgin, INRA, Versailles
Introduction
L’imagerie biologique en trois dimensions est un outil privilégié pour modéliser la
structure et le fonctionnement des systèmes biologiques. Nous avons développé une approche pour traiter, analyser et modéliser ces données issues de l’imagerie biologique. Un
grand nombre d’échantillons doit être intégré afin de révéler une organisation spatiale et
d’établir des règles d’organisation.
L’ensemble de ces algorithmes a été intégré dans le logiciel de modélisation 3D Free-D
(Andrey and Maurin, 2005; Biot et al., 2016).
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Exemple 1 : distribution spatiale de compartiments
endo-membranaires dans des cellules de plante
Dans cet exemple, on se propose de reconstruire en 3D et de comparer la distribution
spatiale de deux protéines intra-cellulaires. Les données tirées de la publication Biot et al.
(2016) sont des séries de piles d’images confocales.
1.1
Reconstruction 3D
1. Créer une pile vierge à partir de la série d’images stockée dans mifobio_Free-D/
data1/images/serie059/fm4-corrected. Paramètres : pixel size = 0.072 µm,
slice spacing = 0.125 µm.
2. Déclarer un modèle pour l’enveloppe cellulaire : Edit/Edit models.../New [Paramètres : geometry = Polygon]. Sur une coupe, dessiner à la main le contour
de la cellule : Clic-droit/Draw/ Manual/.... Sur une autre coupe, dessiner de
façon approximative le contour de la cellule, puis l’affiner avec un contour actif
(Clic-droit/Edit/Run snake).
3. Créer une pile vierge à partir de la séries d’images stockée dans mifobio_Free-D/
data1/images/serie0059/gfp-corrected. Paramètres : pixel size = 0.072 µm,
slice spacing = 0.125 µm.
4. Déclarer un modèle pour les vésicules intra-cellulaires. Paramètres : geometry =
Polypoint.
5. Ouvrir l’outil d’extraction de spots Process/Find spots [Paramètres : Smoothing
filter = non, Top-Hat filter = flat et radius = 7, Isotropy filter radius = 5, Result
= Create one model per spot = non et Represent spots using equivalent sphere =
oui]
6. Ouvrir la fenêtre de rendu 3D : Process/Reconstruct. Tester différentes combinaisons de paramètres pour la visualisation 3D (Edit/Edit models...).
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1.2
Normalisation spatiale des modèles 3D
1. Charger les 20 piles d’images segmentées (mifobio_Free-D/data1/sdf/*.sdf). Deux
structures ont été segmentées dans ce jeu de données, cell pour le contour de la
cellule marquée avec du Fm4-64 et spots pour les vésicules marquées par la gfp.
2. Explorer les reconstructions 3D.
3. Extraire des données quantitatives en 2 et 3D avec la commande Analyze→Run.
4. Sélectionner Process/Normalize/Normalization, une fenêtre Spatial normalization configuration apparaît. Sélectionner toutes les piles dans la liste de gauche
et cocher cell dans la fenêtre Reference structures and resampling. Modifier les
paramètres height (50) et width (100). Valider.
5. Ouvrir une nouvelle fenêtre de normalisation (Normalize/New window). Cocher
l’étape de recalage (Registration) et valider.
6. Ouvrir une troisième fenêtre pour lancer la normalisation après avoir sélectionné
les étapes de recalage et de déformation (Warping). Paramètres : degree = 2.
7. Essayer d’autres combinaisons des paramètres (algorithme de recalage, degré des
déformations polynomiales).
1.3
Cartographie statistique des distributions spatiales
1. Créer une carte de densité pour l’ensemble des compartiments des deux conditions (onglet Density maps/New) [Paramètres : Method=Poisson, Resolution=0.5,
Neighbour rank=2].
2. Créer une carte de densité pour les compartiments ARA6-GFP, avec le même
paramétrage que la première carte (Configure as, limiter le calcul de la carte à
la cellule moyenne).
3. Créer une vue de cette carte sous la forme d’une isosurface de densité au 50ième
percentile (View) [Percentile = 50].
4. Procéder de même pour les compartiments KOR-GFP. Comparer les deux cartes.
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Exemple 2 : cartographie de populations de cellules
Dans cet exemple, on se propose de reconstruire en 3D et de comparer deux populations
de neurones fonctionnellement distinctes du noyau parasympathique sacré (NPS, une
structure située dans la moelle épinière lombo-sacrée) chez le rat. Les données, tirées de
la publication Banrezes et al. (2002), sont des séries d’images de coupes histologiques.
2.1
Reconstruction 3D à partir de coupes sériées
1. Créer une pile vierge à partir de la série d’images stockée dans mifobio_Free-D/
data2/images/ccv11. Paramètres : pixel size = 0.549 µm, slice spacing = 60 µm.
2. Déclarer un modèle pour l’enveloppe externe de la moelle épinière : Edit/Edit
models.../New [Paramètres : geometry = Polygon]. Sur une coupe, dessiner à
la main le contour de la moelle : Clic-droit/Draw/ Manual/.... Sur une autre
coupe, dessiner de façon approximative le contour de la moelle, puis l’affiner avec
un contour actif (Clic-droit/Edit/Run snake).
3. Déclarer un modèle pour les neurones du NPS. Paramètres : geometry = Polypoint.
Pointer ensuite les positions des neurones sur quelques coupes.
4. Ouvrir la fenêtre de recalage : Process/Register. Sélectionner une coupe et la
recaler manuellement. Clic-gauche: translation ; Clic-droit : rotation. Il est
également possible d’utiliser une méthode de recalage automatique (beta).
5. Ouvrir la fenêtre de rendu 3D : Process/Reconstruct. Tester différentes combinaisons de paramètres pour la visualisation 3D (Edit/Edit models...).
6. Itérer les étapes segmentation/recalage/rendu. La mise à jour de la reconstruction
3D à chaque action de segmentation ou de recalage est automatique.
2.2
Normalisation spatiale des modèles 3D
1. Charger les six piles disponibles (mifobio_Free-D/data2/sdf/*.sdf). Visualiser
les reconstructions 3D correspondantes (Process/Reconstruct).
2. Ouvrir une fenêtre de normalisation (Process/Normalize) et appeler le dialogue
de configuration (Normalize/Normalization...). Sélectionner toutes les piles et
cocher ME comme structure de référence. Paramètres : Height = 50, Width = 100.
Valider.
3. Ouvrir une nouvelle fenêtre de normalisation (Normalize/New window). Cocher
l’étape de recalage et valider.
4. Ouvrir une troisième fenêtre pour lancer la normalisation après avoir sélectionné
les étapes de recalage et de déformation. Paramètres : degree = 2.
5. Essayer d’autres combinaisons des paramètres (structures de référence, algorithme
de recalage, degré des déformations polynomiales).
2.3
Cartographie statistique des populations de neurones
1. Créer une carte de densité pour l’ensemble des neurones du NPS (onglet Density
maps/New) [Paramètres : shapes = CellSPN*, Method=Poisson, Resolution = 20,
Neighbour rank = 5]. Créer une vue de cette carte sous la forme d’une isosurface
de densité au 50ième percentile (View) [Percentile = 50].
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2. Créer ensuite une carte de densité de la population de neurones innervant la vessie
(bld ), avec le même paramétrage que la première carte (Configure as). Procéder
de même pour la population de neurones innervant les corps caverneux du pénis
(ccv ). Comparer les deux cartes.
Références
Andrey, P. and Maurin, Y. (2005). Free-D : an integrated environment for threedimensional reconstruction from serial sections. Journal of Neuroscience Methods, 145,
233–244.
Banrezes, B., Andrey, P., Maschino, E., Schirar, A., Peytevin, J., Rampin, O., and Maurin, Y. (2002). Spatial segregation within the sacral parasympathetic nucleus of neurons
innervating the bladder or the penis of the rat as revealed by three-dimensional reconstruction. Neuroscience, 115, 97–109.
Biot, E., Crowell, E., Burguet, J., Höfte, H., Vernhettes, S., and Andrey, P. (2016). Strategy and software for the statistical spatial analysis of 3d intracellular distributions.
Plant Journal, 87, 230–242.
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