Ensemencer des boîtes de Pétri automatiquement avec le

Ensemencer des boîtes de Pétri
automatiquement avec le WASP
Erik Briers
Keywords: bacteriology – petri-dish – inoculation automation – WASP
La microbiologie et la bactériologie sont les derniers départements qui s’automatisent.
Après des tentatives moins fructueuses, cela bouge enfin. Il existe maintenant un automate
pour l’ensemencement des échantillons, le WASP, dont nous traitons ci-dessous, et un autre
pour l’identification sur base de la spectrophotométrie de masse, le MALDI-TOF, dont nous
parlerons dans notre prochain numéro. Il s’avère ainsi que, temporairement, l’automati­sa­
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tion rien que par des techniques moléculaires doit encore attendre.
Introduction
Automatisation en microbiologie
Jusqu’il y a encore quelques années, Louis Pasteur se serait
Jusqu’à aujourd’hui, en matière d’automatisation, la micro­
rapidement senti chez lui en rendant visite à un laboratoire
biologie est un peu restée un petit enfant laissé-pour-compte.
moderne de microbiologie médicale. Il aurait encore trouvé
Il n’y avait d’offre que pour certaines tâches partielles.
‘becs bunsen’ familiers, öses d’ensemencement, boîtes de
Ainsi, nous connaissons depuis de nombreuses années des
Pétri, microscope, etc. Il aurait eu tort de penser que le
systèmes automatiques et surtout semi-automatiques pour
monde de la microbiologie n’avait pas tellement évolué. En
l’identification des bactéries isolées et pour la détermination
y regardant de plus près, il aurait en effet constaté qu’il y
des concentrations minimales inhibitrices (CMI). Dans ces
a eu pas mal d’évolutions technologiques. Il se serait, par
deux applications, on part toujours d’une colonie isolée
exemple, étonné devant les boîtes de Pétri faites en plastique
sur une boîte de Pétri. Une solution n’existait que pour les
et qu’une grande quantité des tubes qu’il utilisait soient
échantillons d’urine, mais depuis longtemps.
remplacés par des éditions miniatures en plastique.
Même l’automatisation de l’étude microscopique, qui
Par contre, il aurait eu raison de trouver que l’essence même
est pourtant déjà très automatisée dans le domaine de
de la microbiologie (cultiver, isoler et identifier sur base
l’hématologie, ne va pas de soi. Il y a naturellement une
de la prolifération des souches et de leur prolifération dans
raison à cela: en hématologie, le nombre d’objets ‘à attendre’
des conditions particulières) n’avait pas changé; elle n’a
est assez limité et ces objets assez bien connus et constants.
aujourd’hui pas plus changé.
Nous savons donc ce que nous pouvons nous attendre à
Il se serait cependant étonné de l’utilisation des antibiotiques
trouver. Si quelque chose d’inattendu survient, le biologiste
et de la présence de l’ADN et de l’ARN qui n’existaient pas
clinicien est averti. En microscopie du sédiment urinaire,
à son époque.
par exemple, la variation est beaucoup plus grande et la
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Figure 1: Le WASP, vue du dessus.
En bas à gauche, se trouve le bras de robot ‘Jane’ qui s’occupe de l’ensemencement des boîtes de Pétri qui arrivent du magasin situé juste à côté.
Au-dessus à droite, nous voyons l’imprimante à étiquettes qui imprimera une étiquette pour chacune des boîtes de Pétri utilisée. Le bras de robot
‘Tarzan’, qui manipule les échantillons et les boîtes de Pétri, se trouve à côté de l’imprimante. Les échantillons sont introduits en bas à droite.
grandeur des objets n’est pas toujours la même. Dans ce
Un important problème supplémentaire est le domaine de la
domaine également, il y a pourtant des avancées que nous
qualité. Dans un laboratoire médical moderne, on travaille en
détaillerons dans un numéro ultérieur.
suivant des procédures où la traçabilité n’est pas un concept
vide. A n’importe quel moment, même après que le patient soit
Tout commence avec un échantillon
déclaré guéri depuis longtemps, on doit pouvoir reconstruire
Comme toujours, tout commence avec un échantillon. Il
toutes les données concernant chaque étape. Cela va de la
peut être très diversifié. Le plus simple est un échantillon
température de l’incubateur aux numéros de lot des milieux
d’urine, par exemple. Fourni dans un petit pot stérile, bien
utilisés en passant par l’opérateur et le superviseur. Retrouver
liquide, prêt pour le traitement. Ou un échantillon de sang
les numéros de lot des milieux paraît évident, pourtant rien
prélevé dans un flacon avec un milieu de croissance prêt à
qu’identifier les boîtes utilisées pour les différents patients
être incubé. Mais il y a également les échantillons de selles
n’est pas une sinécure et demande de nombreuses écritures.
dans des présentations et des consistances très disparates,
Une conséquence en est que, parfois, des boîtes sont retrouvées
le liquide articulaire, les expectorations, les pus, etc.
sans que l’on sache à quel patient elles appartiennent. La même
Tous ces échantillons demandent un prétraitement et
chose vaut naturellement pour les bi-boîtes (boîtes doubles).
l’automatisation devient alors assez rapidement un travail
délicat.
Une solution de Copan
Au début de l’examen microbiologique de n’importe quel
Copan, une firme italienne qui est principalement active
échantillon, se trouvent toujours les deux mêmes éléments:
dans la production d’écouvillons à échantillons, propose
un examen microscopique après coloration de gram et
une solution pour l’ensemencement des échantillons. Elle
un ensemencement en boîte de Pétri sur des milieux de
appelle cette solution ‘WASP’, ‘Walk-Away Specimen Processor’.
culture sélectionnés en fonction de l’échantillon. Comme
En Belgique, le ‘WASP’ est distribué par MLS, qui nous a
les échantillons se trouvent dans des pots tous différents et
invité à voir un appareil en fonctionnement à l’AZ Sint-Jan
ont tous une consistance différente, l’automatisation n’est
à Bruges. Le docteur Bart Gordts était notre hôte et nous a
pas possible sans étapes intermédiaires.
donné toutes les explications nécessaires.
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Figure 2: Le WASP, vue de face.
La vue de face, avec la zone de chargement pour les nouvelles boîtes de Pétri dans le carrousel. Nous voyons, à gauche, le bras de robot et,
à droite, le chargement des échantillons. Un écran tactile permet de piloter l’appareil. L’appareil mesure 183cm en largeur et 81cm en
profondeur, pour une hauteur de 183cm.
Le laboratoire de l’AZ Sint-Jan
Le laboratoire médical de l’AZ Sint-Jan de Bruges est un
grand laboratoire où 8 médecins biologistes cliniciens
travaillent avec 7 collaborateurs universitaires et 113
technologues de laboratoire équivalents temps plein. Tous
ensemble, ils ne ‘traitent’ pas moins de 330.000 échantillons
par an, dont plus de 95% pour des patients hospitalisés. Le
budget du laboratoire dépasse les 18 millions d’euros par
an. Le laboratoire de microbiologie travaille sept jours sur
sept de 7 à 20 heures avec au moins 6 technologues par
pose. Les laboratoires sont actuellement en train d’exploser,
en ce sens que travailler facilement devient plus compliqué.
La construction d’un nouveau laboratoire est donc planifiée
pour bientôt.
Au sein des activités de microbiologie, on travaille en
suivant strictement des procédures convenues. Pour chacun
des types d’échantillon reçus, la manière dont il sera traité
est déterminée, ainsi que les milieux qui seront ensemencés
et ce qu’il arrivera aux résultats de ces boîtes primaires.
En bactériologie, cela signifie les examens suivants: une
identification, la détermination d’un antibiogramme, etc.
Figure 3: Une image détaillée du bras de robot ‘Tarzan’ pendant
la manipulation d’un tube à échantillon.
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Toutes ces étapes sont fixées. Même le protocolage des résul­tats
intermédiaires se fait au moyen d’un logiciel d’ordinateur. A
n’importe quel moment, un biologiste clinicien ou un techno­
logue vérifie l’endroit où se trouve une certaine demande et
quelles étapes sont encore en cours d’exécution.
Dans un passé récent, toutes ces procédures ont mené
à des étapes importantes. Ainsi, on a opté, pour tous les
échantillons, pour l’ESwab de Copan qui, sur base d’études
propres et d’études publiées, donnait de meilleurs résultats
pour retrouver des souches. En plus, des étiquettes porteuses
de code à barres sont utilisées à toutes les étapes, sur toutes
les boîtes de Pétri et sur tous les tubes qui se rapportent
à un certain échantillon. Ces étiquettes assurent la bonne
transparence du processus. Un lecteur de codes à barres
et un terminal d’ordinateur donnent explicitement pour
Figure 4: Une vue détaillée de l’ensemencement d’une boîte de Pétri.
une boîte de Pétri ‘trouvée’ l’identité de l’échantillon (du
patient) et l’objectif de cette boîte spécifique.
Subsidiairement, on a également remarqué que le WASP ne
demande pas d’écolage des technologues et que le nombre
Une difficulté classique reste que tous les échantillons doi­
d’échantillons traités par unité de temps est plus élevé.
vent être ensemencés manuellement sur une boîte et ensuite
être traités. Cela nécessite de nombreuses manipulations. Il
Aspects économiques
faut coller une étiquette avec un code à barres sur toutes
Cuisiner coûte de l’argent et ensemencer des échantillons sur
les boîtes, il faut ouvrir tous les tubes à échantillon et les
des boîtes de Pétri aussi. En Belgique, après la dernière révision
étiquettes doivent être comparées aux données du patient,
de la nomenclature de bactériologie, l’ensemencement des
la boîte, les boîtes doivent être ensemencées manuellement
échantillons est encore sous-payé. Les hôpitaux aiment donc
de manière identique.
que l’on travaille en diminuant les coûts. Le plus grand effet
En ce qui concerne ce dernier point, l’AZ Sint-Jan reçoit
de l’introduction d’un automate s’exerce sur les frais de
chaque semaine bien plus de 1.000 échantillons pour
personnel: l’opérateur place les échantillons et les milieux et
examen bactériologique. Si nous savons que, pour de
peut ensuite s’occuper d’autres tâches. Il y a encore les coûts
nombreux échantillons microbiologiques, 5 milieux de
des öses jetables et aussi un nombre plus petit de reprises dû
culture sont nécessaires pour le premier ensemencement,
à une meilleure standardisation, une meilleure traçabilité et
nous arrivons à plus de 3.000 boîtes par semaine.
une diminution du temps nécessaire à la lecture de boîtes
L’automatisation de ces ensemencements pourrait avoir des
ensemencées de manière standardisée. Tout cela représente
effets importants. En comparant l’utilisation du WASP et
beaucoup d’euros par an. Par contre, l’investissement dans
les schémas manuels habituels, les points forts et les points
un automate coûte également très cher.
faibles suivants ressortent: pour le traitement manuel, étaient
défavorables la haute probabilité de contamination croisée,
Le ‘Walk Away Specimen Processor’ – WASP
la faible traçabilité et le temps effectivement passé à la table
Le WASP est constitué d’unités essentielles. Il possède un
de travail. En faveur du WASP, il y avait au contraire un faible
robot d’ensemencement que les développeurs appellent
niveau de contamination croisée, un vrai ‘walk away’ et un
‘Jane’ et qui fait l’identification des échantillons. Un second
haut niveau de traçabilité. S’ajoute encore la standardisation
robot appelé ‘Tarzan’ manipule les boîtes de Pétri. Il y a
importante de l’ensemencement et la possibilité d’utiliser
enfin une plate-forme de chargement des échantillons, un
différents modèles (ce dernier point est également réalisable
carrousel sur lequel neuf boîtes de Pétri différentes peuvent
avec l’ensemencement manuel).
être chargées et une imprimante de codes à barres.
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A droite, se trouve la zone des échantillons. Il est possible
Ils n’en changent pas. L’opérateur peut adapter lui-même
d’y charger jusqu’à 72 tubes ESwab, des tubes d’autres
les procédures. Les öses sont stérilisées par la chaleur et,
applications LBM (‘Liquid Based Microbiology’), des tubes à urine
en changeant toujours d’öse, l’une peut refroidir pendant
sous vide ou 36 pots à selles Cary-Blair, grâce à des supports
que l’autre est utilisée. Une caméra est installée sur le
particuliers. Il existe une table tournante d’approvisionnement
WASP. Elle contrôle l’intégrité des öses et vérifie aussi que
pour d’autres récipients. Des échantillons peuvent toujours
l’échantillon a effectivement été prélevé avant le début de
être ajoutés. La seule limitation est qu’ils doivent être en
l’ensemencement.
phase liquide. Tous les récipients sont munis d’une étiquette
Le passage d’un échantillon sur le WASP se déroule de la
porteuse d’un code à barres. Le lecteur de codes à barres
manière suivante: le code à barres est lu et interprété. Le
lit l’étiquette et sait, par l’intermédiaire de la liaison avec
récipient est d’abord centrifugé ou mélangé au vortex
le LIS, ce qui doit se passer avec cet échantillon. Les boîtes
et est ensuite ouvert. L’imprimante imprime le nombre
nécessaires sont transportées à partir des magasins. Chacune
d’étiquettes nécessaires avec le code à barres du patient.
des boîtes de Pétri est pourvue d’un code à barres après son
Les milieux sont pris dans le carrousel, une étiquette y est
ensemencement. Les boîtes de Pétri se trouvent dans un
collée et la boîte est inoculée avec la bonne öse. Une caméra
carrousel dans lequel neuf milieux différents peuvent être
enregistre toujours si l’öse est remplie avant que le milieu
placés avec jusqu’à 42 boîtes dans chacune des piles. Les
soit ensemencé. Les boîtes sont ensuite retirées et entassées
piles peuvent être remplies à n’importe quel moment. Après
pour être transportées à un incubateur. Les récipients qui ne
l’ensemencement, les boîtes étiquetées et ensemencées sont
sont pas correctement étiquetés ou qui ne contiennent pas
emmenées et éventuellement triées par type d’incubation.
d’échantillon sont automatiquement retirés.
L’opérateur assure le transfert aux incubateurs.
En fonction de la charge de travail, un laboratoire peut
décider de remplir plus d’une position avec le même milieu.
Pour ensemencer, le WASP dispose d’un choix de trois
Si, par exemple, une grande série d’échantillons arrivent
öses: 1µL, 10µL et 30µL. Le logiciel détermine quelle öse
pour un dépistage SARM (Staphylococcus aureus résistant à la
sera utilisée pour une combinaison échantillon-boîte
méthicilline), toutes les positions peuvent être remplies avec
donnée. L’AZ St-Jan préfère utiliser une seule sorte d’öse.
le même milieu.
Dépistage des SARM
La Belgique, comme nos pays limitrophes, a une poli­
tique concernant les SARM. Dans la plupart des hôpitaux,
les patients répondant à certains critères de risque sont
systématiquement dépistés. Il est possible de le faire par
des techniques moléculaires ou au moyen de méthodes
de culture classiques qui utilisent généralement une boîte
chromogène. L’AZ Sint-Jan de Bruges a constaté depuis
des années que la majorité des patients chez qui l’on dé­
montrait la présence de SARM étaient arrivés à l’hôpital
avec le SARM et que seulement une minorité d’entre eux
avaient été contaminés au sein même de l’hôpital. Ce
nombre est d’ailleurs en diminution ces derniers mois.
On a récemment décidé de ne plus tester seulement les
patients à risque, mais bien tous les patients qui passent
une nuit à l’hôpital. Ce n’est cependant pas tenable du
point de vue financier si l’on veut faire des tests molécu­
laires. C’est pourquoi il a été décidé de travailler avec une
méthode microbiologique classique. Depuis le 1er janvier
2010, tous les patients sont échantillonnés à l’admission
avec trois écouvillons. Des petits sets à dépistage de SARM
sont préparés. Ils contiennent un milieu de transport (mi­
lieu d’enrichissement) et trois écouvillons, des Flocked Swabs
de Copan. Les deux Flocked Swabs roses sont utilisés pour
prendre un échantillon de la gorge (au niveau des amyg­
dales) et du nez. Ces écouvillons sont plongés dans le
milieu d’enrichissement et sont ensuite jetés. L’écouvillon
blanc est utilisé pour prendre un échantillon du périnée. Il
est ensuite plongé et puis cassé dans le milieu de transport.
Les deux tubes ensemencés et le tube avec l’écouvillon
blanc cassé, correctement étiquetés, vont au laboratoire.
En remplaçant le milieu de transport des tubes par un mi­
lieu d’enrichissement spécifique, à leur arrivée au labora­
toire, les tubes peuvent être incubés tels quels sans qu’il
faille d’abord faire un ensemencement.
Les tubes incubés sont ensemencés en une seule fois le
jour suivant sur une boîte de Pétri avec un milieu chromo­
gène. Pendant les trois premiers mois de cette année,
13.450 patients ont été admis, dont 5.805 (93% des pa­
tients qui étaient restés au moins une nuit à l’hôpital) ont
été dépistés pour le SARM. 104 patients ont donné un
résultat positif dont, finalement, seulement 2 (0,01%)
avaient développé l’infection à l’hôpital.
Il est clair que cette procédure est plus réalisable si le labo­
ratoire dispose d’un automate tel que le WASP.
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Le WASP, que nous avons vu en pleine action, répond aux
serait d’avoir deux positions supplémentaires pour les
attentes du laboratoire. Ils n’avaient que quelques petites
milieux. Onze positions au total permettraient de réaliser
remarques, dont une à laquelle il fallait s’attendre: l’idéal
presque toute la routine sans changement.
Après l’ensemencement, les boîtes de Pétri sont triées sur
Flocked Swab, what’s in a name
l’appareil en fonction de l’étuve dans laquelle elles seront
‘Flocked – to flock’ est un terme technique faisant allusion
à une technique d’application de fibres sur une surface
solide. Dans cette manière de travailler, le bout du bâ­
tonnet en plastique (tout matériel et toute forme sont
possibles) est d’abord recouvert d’une fine couche de
colle et le bâtonnet est ensuite amené dans un appareil
particulier à une charge positive élevée. Le matériel des
fibres standardisées (exactement la même longueur,
par exemple) est amené à une charge négative élevée,
ce qui fait que les fibres volent vers la charge positive
des bâtonnets. A cause des lois de l’attraction électro­
magnétique, l’extrémité des fibres atterrit dans la colle.
L’écouvillon ainsi formé a un tout autre aspect qu’un
écouvillon classique sur lequel les fibres sont enroulées.
L’écouvillon est floqué. Les fibres étant toutes exacte­
ment alignées, cet écouvillon possède des propriétés
tout autres en matière d’absorption et de libération. Ceci
explique que cette technique ‘simple’ donne cependant
d’autres résultats en microbiologie qu’un écouvillon en
ouate classique.
ensuite incubées: avec ou sans CO2. Les petits disques qui
sont utilisés pour identifier les bactéries, comme l’optochine,
doivent encore être posés manuellement.
Conclusion
Même si le WASP n’est pas le seul appareil capable
d’ensemencer automatiquement des boîtes de Pétri, il est
possible qu’il soit le premier qui le fait de telle manière que
le laboratoire ne doit que très peu adapter sa manière de
travailler. Les milieux, format et composition ne doivent
pas être modifiés. Les modèles d’ensemencement sont
comparables, mais beaucoup plus précis et reproductibles
que lors de l’ensemencement manuel. En fin de compte,
le laboratoire épargne non seulement du temps lors de
l’ensemencement des échantillons, mais aussi lors de
l’étiquetage et de la lecture. En faisant moins d’erreurs, on
gagne encore du temps et donc de l’argent.
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