MODE OPERATOIRE Réhydratation et démasquage coupes
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MODE OPERATOIRE Réhydratation et démasquage coupes
Version : 2 Date d'application : 08/04/2011 Page 1 sur 3 Référence du document : MO_IMAG_07 CNRS-UPR 9021 MODE OPERATOIRE Réhydratation et démasquage coupes à paraffine 1. OBJET ET DOMAINE D'APPLICATION Ce mode opératoire décrit les différentes étapes de réhydratation et de démasquages antigéniques des coupes incluent en paraffine pour immunomarquage en microscopie optique. 2. MATERIEL / EQUIPEMENT Appareil Etuve à 37°C Marque N° d’inventaire MEMMERT ICT-BIOXX006 FAR ICT-BIOXX014 Micro-onde 3. Pièce Laboratoire 137 Laboratoire 137 REACTIFS ET CONSOMMABLES 3.1. Liste des réactifs et consommables Dénomination Acide citrique Citrate de sodium (tri-sodium citrate) Tris-Base EDTA108 Glycine HCl (1N) Tween-20 Lieu de stockage Laboratoire 138 (labo poudres chimiques) Laboratoire 138 (labo poudres chimiques) Laboratoire 138 (labo poudres chimiques) Laboratoire 137 armoire µscopie Laboratoire 138 (labo poudres chimiques) Laboratoire 138 (labo poudres chimiques) Laboratoire 137 armoire µscopie Fournisseur Réf. Fournisseur Caractéristique SIGMA C2404 C6H8O7, H2O SIGMA C3434 C6H5O7Na3, 2H2O SIGMA T1503 PM = 121,1 g/mol SIGMA E5134 PM = 372.24 g/mol SIGMA G7403 PM = 75,07g/mol Préparation interne SIGMA P1379 SIGNATAIRES Rédacteur Date et Signature Vérificateur Date et Signature Approbateur Date et Signature Application par Service Qualité Support : Date : Mode opératoire(MO)_modèle_v5 du 13/11/09 Version : 2 Date d'application : XX/XX/XX Page 2 sur 3 Référence de la procédure : PT_ Référence du document : MO_IMAG_07 CNRS-UPR 9021 Laboratoire 137 Réfrigérateur µscopie NaOH (10N ou 4N) Cuve avec couvercle pour boite à coloration en verre Anse pour panier boite de coloration Laboratoire 137 Tiroirs µscopie Laboratoire 137 Paillasse µscopie Laboratoire 137 Panier boite de coloration Tiroirs µscopie 3.2. Préparation interne Dutscher 068506 Dutscher 068508 Dutscher 068507 Préparation des réactifs Tampon citrate 10 mM, pH 6.0 Solution A : acide citrique (C6H8O7, H2O) 0,1 M 2,1 g/100 ml H2O Solution B : citrate de sodium (C6H5O7Na3, 2H2O) 0,1 M 2,94 g/100 ml H2O Mélanger 9 ml de solution A et 41 ml de solution B Compléter à 500 ml avec H2O milliQ Tampon Tris 100 mM, pH 10 Tris-Base 12 g H2O milliQ ~ 800 ml Ajuster le pH à 10 avec de l'HCl H2O milliQ q.s.p. : 1 litre EDTA 10 mM, pH 8.0 EDTA108 3.72 g H2O milliQ ~ 800 ml pH ajusté à 8.0 avec de la soude H2O milliQ q.s.p. 1 litre Tampon glycine-HCl 0,05M, pH 3,6 Glycine 3,8 g H2O milliQ ~ 800 ml Ajuster le pH avec de l'HCl H2O milliQ q.s.p. 1 litre Tampon citrate- tween20 (10mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0) Tri-sodium citrate (dihydrate) 2.94 g H2O milliQ 1000 ml Ajuster le pH à 6.0 avec 1N HCl Ajouter 0.5 ml de Tween 20 et bien mélanger. Stocker à température ambiante 4. MODE OPERATOIRE - Avant immunomarquage : placer les lames 2h à O/N à l’étuve 37°C pour une meilleure adhésion des coupes sur les lames - Déparaffinage (ou suppression de la résine) et hydratation des coupes Mode opératoire(MO)_modèle_v5 du 13/11/09 Référence de la procédure : PT_ CNRS-UPR 9021 Référence du document : MO_IMAG_07 Version : 2 Date d'application : XX/XX/XX Page 3 sur 3 10 min toluène. 2 min éthanol absolu. 1 min éthanol 95°. 5 min H2O milliQ. - Les coupes sont traitées au four à micro-ondes (mettre le panier dans un récipient résistant au micro-onde, les cuves de coloration Hellendal ne résistent pas) : Placer les lames dans récipient thermorésistante(porcelaine, plastique, Pyrex) pour four à micro-ondes, contenant du tampon souhaité (bien recouvrir les lames en cas d’évaporation). Chauffer par les micro-ondes à 750 W pendant 5min, laisser 5min puis remettre en marche 15min (attention à ce que les coupes ne sèchent pas). Laisser les lames refroidir dans la cuve hors du micro-ondes pendant 20 min à température ambiante. Rincer ensuite les lames dans du TBS. Les coupes sont prêtes pour l'immunoréaction. Remarques : Le four à micro-ondes est le système de chauffage le plus couramment utilisé. Il peu être remplacé par un bain-marie bouillant, ce qui évite d'avoir à contrôler l'ébullition, ou mieux une cocotte-minute qui permet d'atteindre une température plus élevée (120°C) en principe plus efficace. 5. NETTOYAGE ET TRAITEMENT DES DECHETS Evacuer les solvants dans des containers en plastique qui sont évacués selon les procédures de l’UdS. 6. SECURITE Le toluène est à manipuler sous la hotte Mode opératoire(MO)_modèle_v5 du 13/11/09