THESE DE DOCTORAT DE L`UNIVERSITE PARIS XII Caroline

Transcription

THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PARIS XII
Spécialité Neurosciences
Présentée par
Caroline BOUVRAIS-VERET
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR EN SCIENCES de L’UNIVERSITE PARIS XII
Sujet de la thèse :
Etude des partenaires protéiques du transporteur de la dopamine
et
Caractérisation des phénotypes nicotinique et dopaminergique des
souris invalidées pour le gène de la protéine STOP
Soutenue le 14 Novembre 2006 devant la commission d’examen :
Pr Josette CADUSSEAU
Pr Philip GORWOOD
Dr Denis HERVE
Pr Jean-Marie LAUNAY
Dr Philippe VERNIER
Dr Marie-Pascale MARTRES
Dr Bruno GIROS
Présidente
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Examinateur
Directrice de thèse
Invité
REMERCIEMENTS
Ce travail de thèse a été effectué au sein de l’unité INSERM U513, « Neurobiologie et
Psychiatrie » dirigée par Bruno Giros, qui a également supervisé la première partie de mes
travaux. Je tiens à le remercier de m’avoir donné la chance d’expérimenter la recherche et
de m’avoir fait partager sa grande connaissance scientifique.
Marie-Pascale Martres a dirigé la deuxième partie de ma thèse. Je la remercie sincèrement
d’avoir pris la relève afin que je sois en mesure de soutenir cette thèse. Merci pour ses
encouragements, sa disponibilité et les relectures attentives de ce manuscrit.
Mes vifs remerciements à Denis Hervé, Philip Gorwood, Philippe Vernier et Jean-Marie
Launay qui ont accepté de prendre le temps de juger ce travail.
Je suis reconnaissante à Salah El Mestikawy de m’avoir initiée à la microscopie à
fluorescence et aux logiciels de mise en forme d’images. Merci à Marika Nosten-Bertrand
pour ses précieux conseils concernant le comportement et à Stéphane Jamain, qui a un jour
sauvé mon ordinateur…
Merci à Jacqueline Gilchrist pour ses conseils et à Marie-Aude Plamont, qui a participé avec
rigueur à une partie de ce travail. Merci aux animaliers Laurent et Béatrice de s’être occupés
avec douceur de mes petites souris.
Ces cinq années passées au laboratoire m’ont permis de faire la connaissance et de lier
amitié avec Stéphanie Weiss et Cécile Denis. Steph, merci pour tous ces échanges, ces
moments de complicité entre thésardes et ces discussions pseudo-philosophiques
interminables. Merci Cécile pour ta bonne humeur, ton dynamisme et tes petites histoires de
nana. Un vrai grand merci les filles pour votre soutien et nos fou-rires ; vous m’avez rendu
cette thèse plus agréable.
Je pense également à tous les membres du laboratoire avec qui j’ai partagé des discussions
scientifiques ou extra-scientifiques, composant des moments instructifs et agréables. Merci à
Anne Amphoux, Vincent Vialou et Fabien Chevalier pour les bons moments passés
ensemble. Merci à la patiente Laure Balasse pour son aide sur photoshop/illustrator, et merci
à Odile Poirel pour sa gentillesse et ses délicieux renforts diététiques… !
J’ai également effectué ce travail de thèse grâce aux encouragements et au soutien constant
de mon petit groupe d’amis scientifiques. Un immense merci à Christelle, Shirley et
Annabelle pour leur présence, ainsi qu’à Margot, Mathilde et Roland. Merci à Quentin d’être
là.
Je remercie mon père pour ses encouragements quasi-quotidiens !
A ma maman
BOUVRAIS-VERET – Thèse de Doctorat en Sciences – 2006
1
PREAMBULE
Cette thèse se compose de deux parties.
La première concerne l’étude des partenaires moléculaires du transporteur de la
dopamine. A mon arrivée au laboratoire, un crible double-hybride avait été réalisé pour
plusieurs transporteurs, dont le transporteur de la dopamine (DAT). J’ai choisi plusieurs
clones d’intérêt et tenté de valider et de caractériser leur interaction avec le DAT par
différentes méthodes. Des difficultés techniques, discutées dans la première partie de cette
thèse, ont empêché la bonne progression de mon travail, qui n’a pu aboutir à une
publication.
Je me suis donc tournée vers la caractérisation des souris invalidées pour la protéine
associée aux microtubules STOP (STOP KO ; Andrieux et al., 2002). Plus précisément, j’ai
étudié divers aspects des phénotypes nicotinique et dopaminergique de ces souris. Les
résultats de cette recherche font l’objet de la deuxième partie de cette thèse. Ces travaux ont
donné lieu à deux manuscrits, actuellement soumis pour publication ou en préparation.
L’introduction de la première partie présentera le système dopaminergique et le DAT,
son implication dans divers troubles mentaux et ses partenaires déjà identifiés. Suivront les
chapitres matériels et méthodes et résultats qui seront présentés et discutés en parallèle,
suivis d’une conclusion.
La deuxième partie est présentée sous forme d’articles, avec une introduction
définissant en premier lieu la schizophrénie ainsi que les données liant le système
nicotinique à cette maladie, puis présentant le modèle d’étude des souris STOP KO. Les
résultats seront présentés sous forme de deux articles et analysés dans un chapitre
discussion.
2
TABLE DES MATIERES
Remerciements___________________________________________________________ 1
Préambule _______________________________________________________________ 2
Table des matières ________________________________________________________ 3
Liste des figures__________________________________________________________ 7
Liste des abreviations _____________________________________________________ 9
PARTIE 1 _________________________________________________________ 11
INTRODUCTION _________________________________________________________ 12
A/ La neurotransmission dopaminergique ___________________________________ 13
1/ Les voies dopaminergiques centrales ___________________________________ 13
2/ Le métabolisme de la dopamine ________________________________________ 14
3/ Les récepteurs dopaminergiques _______________________________________ 16
a/ Propriétés et structure ______________________________________________________ 16
b/ Localisation ______________________________________________________________ 17
B/ Le transporteur de la dopamine (DAT) ____________________________________ 18
1/ Les transporteurs plasmiques neuronaux : aspects généraux _______________ 18
a/ Classification _____________________________________________________________ 18
b/ Fonction_________________________________________________________________ 20
2/ Clonage et propriétés structurales du transporteur de la dopamine __________ 21
a/ Clonage _________________________________________________________________
b/ Structure ________________________________________________________________
c/ Relation structure/fonction ___________________________________________________
d/ Oligomérisation du DAT ____________________________________________________
21
21
23
25
3/ Distribution tissulaire ________________________________________________ 26
a/ Localisation des ARNm _____________________________________________________ 26
b/ Localisation de la protéine___________________________________________________ 27
c/ Localisation ultrastructurale __________________________________________________ 27
4/ Mode de fonctionnement/électrophysiologie _____________________________ 27
a/ Stoechiométrie____________________________________________________________ 27
b/ Différents états de conductance ______________________________________________ 28
c/ Fonctionnement en mode inverse _____________________________________________ 28
5/ Pharmacologie ______________________________________________________ 29
a/ Liaison aux catécholamines _________________________________________________
b/ Modèles cellulaires versus synaptosomes ______________________________________
c/ Le DAT comme cible des psychostimulants _____________________________________
d/ Le DAT comme cible de toxines ______________________________________________
29
31
32
32
3
Table des matières
6/ Processus de régulation ______________________________________________ 33
a/ Régulation par glycosylation _________________________________________________
b/ Régulation par phosphorylation _______________________________________________
c/ Régulation par les substrats et les inhibiteurs ____________________________________
d/ Régulation par les récepteurs dopaminergiques __________________________________
e/ Régulation par interaction directe avec des protéines partenaires ____________________
33
33
34
35
36
7/ Implication du DAT dans différentes pathologies psychiatriques ____________ 36
a/ La dépendance aux drogues : exemple de la cocaïnomanie ________________________ 36
b/ Le désordre de l’hyperactivité et du déficit d’attention (ADHD) _______________________ 40
8/ Les souris invalidées pour le DAT : modèle animal pour la schizophrénie et
l’ADHD ? _____________________________________________________________ 43
a/ Phénotype _______________________________________________________________ 43
b/ Un modèle pour la schizophrénie ? ____________________________________________ 46
c/ Un modèle pour l’ADHD ? ___________________________________________________ 46
C/ DAT et protéines partenaires ____________________________________________ 47
1/ La protéomique : définition et intérêt ____________________________________ 47
2/ Principe du double-hybride ____________________________________________ 47
3/ Avantages et limites _________________________________________________ 50
4/ Les partenaires identifiés du DAT ______________________________________ 50
a/ Interaction directe avec l’extrémité carboxy-terminale du DAT _______________________ 51
b/ Interaction directe avec l’extrémité amino-terminale du DAT ________________________ 53
c/ Autres interactions _________________________________________________________ 54
MATERIELS ET METHODES _______________________________________________ 56
RESULTATS ____________________________________________________________ 61
A/ Etude de partenaires potentiels du DAT ___________________________________ 62
1/ Crible double-hybride ________________________________________________ 62
2/ Clones sélectionnés__________________________________________________ 63
a/ Sh2bp1 _________________________________________________________________ 63
b/ ACIII____________________________________________________________________ 64
3/ Etude anatomique ___________________________________________________ 64
4/ Co-expression avec le DAT ____________________________________________ 65
a/ Capture de [3H]-dopamine ___________________________________________________ 65
b/ Immuno-fluorescence ______________________________________________________ 69
5/ Interaction en double-hybride __________________________________________ 71
a/ Résultats ________________________________________________________________ 72
b/ Difficultés rencontrées ______________________________________________________ 73
c/ Discussion _______________________________________________________________ 75
B/ Expression de la synucléine 1 chez les souris DAT KO ______________________ 76
1/ Expression des ARNm ________________________________________________ 76
2/ Expression de la protéine _____________________________________________ 78
3/ Discussion _________________________________________________________ 79
4
Table des matières
CONCLUSION ___________________________________________________________ 81
A/ Etude de l’interaction DAT-partenaire _____________________________________ 82
B/ Etude du rôle fonctionnel de l’interaction DAT-partenaire ____________________ 83
C/ Etude de l’expression de la synucléine 1 chez les souris DAT KO _____________ 84
PARTIE 2 _________________________________________________________ 86
INTRODUCTION _________________________________________________________ 87
A/ La schizophrénie ______________________________________________________ 88
1/ Définition et évolution ________________________________________________ 88
2/ Etiologie : deux composantes _________________________________________ 89
a/ Aspects génétiques ________________________________________________________ 90
b/ Aspects environnementaux __________________________________________________ 91
3/ Etiologie : les différentes hypothèses ___________________________________ 91
a/ L’hypothèse dopaminergique ________________________________________________
b/ L’hypothèse glutamatergique ________________________________________________
c/ La théorie neuro-développementale ___________________________________________
d/ Une maladie de la synapse ? ________________________________________________
91
93
95
96
4/ Le traitement de la schizophrénie ______________________________________ 98
5/ Les modèles animaux pour la schizophrénie _____________________________ 98
a/ Modèles pharmacologiques__________________________________________________ 99
b/ Modèles neuro-développementaux ____________________________________________ 99
c/ Modèles génétiques_______________________________________________________ 101
B/ Nicotine et schizophrénie ______________________________________________ 102
1/ Le système cholinergique ____________________________________________ 102
a/ Voies cholinergiques centrales ______________________________________________ 102
b/ Métabolisme de l’acétylcholine ______________________________________________ 103
2/ La transmission cholinergique ________________________________________ 104
a/ Les récepteurs muscariniques_______________________________________________ 104
b/ Les récepteurs nicotiniques neuronaux ________________________________________ 105
3/ Relation entre nicotine et schizophrénie ________________________________ 111
a/ Etudes épidémiologiques __________________________________________________ 111
b/ Expression des récepteurs nicotiniques chez les schizophrènes ____________________ 112
4/ La nicotine comme forme d’auto-médication ____________________________ 113
a/ Amélioration des symptômes et des effets secondaires ___________________________ 113
b/ Amélioration des déficits sensoriels___________________________________________ 113
c/ Amélioration des déficits cognitifs ____________________________________________ 116
5
Table des matières
C/ La protéine STOP_____________________________________________________ 117
1/ Microtubules et protéines associées ___________________________________ 117
a/ Les microtubules _________________________________________________________ 117
b/ Les protéines associées aux microtubules _____________________________________ 118
2/ La protéine STOP ___________________________________________________ 118
3/ Les souris STOP KO ________________________________________________ 121
a/ Caractérisation anatomique et physiologique ___________________________________
b/ Caractérisation biochimique ________________________________________________
c/ Caractérisation comportementale ____________________________________________
d/ Un modèle pour la schizophrénie ? ___________________________________________
121
122
123
124
RESULTATS ___________________________________________________________ 125
ARTICLE I : Augmentation de la densité des récepteurs nicotiniques alpha7 chez les
souris STOP KO et amélioration par la choline d’un déficit d’apprentissage de type
associatif____________________________________________________________ 126
ARTICLE II : Altérations préférentielles du système dopaminergique limbique des
souris STOP KO ______________________________________________________ 154
RESULTATS COMPLEMENTAIRES ______________________________________ 183
DISCUSSION ___________________________________________________________ 186
A/ Altérations biochimiques des souris STOP KO ____________________________ 187
1/ Marqueurs nicotiniques/cholinergiques et dopaminergiques _______________ 187
2/ Altérations biochimiques ____________________________________________ 188
B/ Altérations comportementales des souris STOP KO________________________ 191
1/ Sensibilité aux psychostimulants______________________________________ 191
2/ Performances mnésiques ____________________________________________ 195
C/ Effets localisés de l’inactivation de STOP ________________________________ 197
D/ Validité du modèle d’étude STOP KO pour la schizophrénie _________________ 198
1/ Modélisation animale des maladies psychiatriques _______________________ 198
2/ Pertinence du modèle STOP KO : un modèle pour la schizophrénie ? _______ 199
REFERENCES__________________________________________________________ 202
6
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Schéma illustrant les principaux corps cellulaires dopaminergiques et leurs projections dans
le cerveau de rat________________________________________________________________________ 14
Figure 2 : Schéma représentant les voies anabolique et catabolique de la dopamine_____________ 15
Figure 3 : Schéma d’une synapse dopaminergique__________________________________________ 17
Figure 4 : Tableau représentant les deux classes de transporteurs plasmiques neuronaux________ 19
Figure 5 : Représentation schématique d’une terminaison neuronale contenant les différents types de
transporteurs neuronaux. ________________________________________________________________ 20
Figure 6 : Représentation schématique de la structure secondaire prédite du transporteur de la
dopamine humain_______________________________________________________________________ 22
Figure 7 : Représentation schématique des différents domaines fonctionnels du DAT ____________ 24
Figure 8 : Constantes d’inhibition de différentes molécules pour le transporteur de la dopamine.___ 30
Figure 9 : Tableau présentant les affinités et les capacités de transport du DAT et du NET pour la
dopamine et la noradrénaline _____________________________________________________________ 31
Figure 10 : Représentation schématique des adaptations moléculaires touchant les synapses des
souris DAT KO _________________________________________________________________________ 44
Figure 11 : Le système du double-hybride en levure_________________________________________ 48
Figure 12 : Stratégie de double-hybride à grande échelle ____________________________________ 49
Figure 13 : Schéma des interactions démontrées entre le DAT et différentes protéines ___________ 55
Figure 14 : Clones sélectionnés, issus du crible double-hybride en levure dirigé contre le rDAT ___ 62
Figure 15 : Répartition des ARNm du DAT et de Sh2bp1_____________________________________ 65
Figure 16 : Capacité de transport moyenne de [3H]-dopamine par le DATco-exprimé avec la
synucléine 1 ou Sh2bp1 _________________________________________________________________ 66
Figure 17: Constante d’affinité moyenne du DAT pour la [3H]-dopamine co-exprimé avec la synucléine
1 ou Sh2bp1 ___________________________________________________________________________ 67
Figure 18 : Observation de la morphologie des cellules transfectées. __________________________ 70
Figure 19 : Marquage du DAT par immuno-fluorescence dans des cellules HEK293 _____________ 70
Figure 20 : Immuno-fluorescence du DAT, de la synucléine 1 sur des coupes de striatum de rat___ 71
Figure 21 : Tableau représentant les résultats des interactions étudiées par double-hybride en levure
______________________________________________________________________________________ 73
Figure 22 : Détection par western-blot de protéines de fusion pLEX sur différents extraits protéiques
de levures transformées _________________________________________________________________ 75
Figure 23 : Marquage des ARNm de la synucléine 1 par hybridation in situ de souris sauvages et DAT
KO____________________________________________________________________________________ 77
Figure 24 : Quantification des ARNm et de la protéine synucléine 1 chez des souris sauvages et DAT
KO____________________________________________________________________________________ 78
7
Liste des figures
Figure 25 : Expression de la protéine synucléine 1 au niveau du striatum et de la substance noire de
souris sauvages et DAT KO ______________________________________________________________ 79
Figure 26 : Evolution clinique et pathophysiologique de la schizophrénie _______________________ 89
Figure 27 : Modulations opposées de la transmission glutamatergique NMDA par les récepteurs
dopaminergiques D1 et D2 sur les neurones GABA « medium spiny » du striatum _______________ 94
Figure 28 : Etapes de l’hypothèse neuro-développementale conduisant à la schizophrénie _______ 95
Figure 29 : Schéma illustrant les principaux noyaux cholinergiques et leurs projections dans le
cerveau de rat _________________________________________________________________________ 103
Figure 30 : Représentation schématique des voies de signalisation médiées par les deux types de
récepteurs muscariniques _______________________________________________________________ 105
Figure 31 : Représentation schématique d’un récepteur nicotinique ancré dans la membrane
plasmique ____________________________________________________________________________ 106
Figure 32 : Représentation des sites allostériques d’un récepteur nicotinique __________________ 107
Figure 33 : Distribution différentielle des ARNm de différentes sous-unités des récepteurs nicotiniques
dans le cerveau de rat __________________________________________________________________ 109
Figure 34 : Représentation schématique de la localisation des récepteurs nicotiniques au niveau
terminal du neurone ou préterminal_______________________________________________________ 110
Figure 35 : Représentation schématique de récepteurs nicotiniques postsynaptiques ___________ 111
Figure 36 : Représentation du paradigme de l’inhibition du réflexe de sursaut __________________ 114
Figure 37 : Représentation du paradigme de la suppression de l’onde P50 ____________________ 115
Figure 38 : Représentation schématique d’un microtubule___________________________________ 117
Figure 39 : Structure du gène et protéines STOP __________________________________________ 120
Figure 40 : Analyse de la stabilité au froid de microtubules dans des cultures primaires neuronales de
souris sauvages et invalidées pour la protéine STOP _______________________________________ 121
8
LISTE DES ABREVIATIONS
3-AT :
5-HT :
AC :
AD:
ADHD:
ADNc :
AMPA :
AMPc :
ARNm :
ATP :
ATV:
CaMKII:
COMT :
DAT :
DBD:
DTT:
GABA:
GTP :
HEK293 :
HPLC:
Km:
LTD:
LTP:
MAO :
MAP :
MDCK :
MPP+ :
MPTP :
nAChR:
NET :
NMDA:
PBS :
PCP :
PCR:
PICK1:
PKA :
PKC :
PPI:
RACK1:
SERT :
Sh2bp1 :
SNAP:
SNARE:
SNc
:
STOP :
TH:
TM:
TPR:
3-amino-1,2,4-triazole
5-hydroxytryptophane (sérotonine)
Adénylate Cyclase
Activator Domain
Attention Deficit Hyperactivity Disorder
Acide DéoxyriboNucléique complémentaire
alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid
Adénosine Mono-Phosphate cyclique
Adénosine RiboNucléique messager
Adénosine Tri-Phosphate
Aire Tegmentale Ventrale
Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II
Catéchol-O-Méthyltransférase
Dopamine Transporter
DNA Binding Domain
Dithiothréitol
Gamma-AminoButyric Acid
Guanosine Tri-Phosphate
Human Embryonic Kidney 293
High Pressure Liquid Chromatography
constante de Michaelis-Menten
Long Term Depression
Long Term Potentiation
Mono-Amine Oxidase
Microtubule-Associated Protein
Madin-Darby canine kidney
1-Méthyl-4-Phénylpiridinium
1-Méthyl-4-Phényl-1,2,3,6-Tétrahydropyridine
nicotinic Acetylcholine Receptor
Norepinephrine Transporter
N-Méthyl-D-Aspartate
Phosphate Buffered Saline
Phencyclidine
Polymerase Chain Reaction
Protein Interacting with C Kinase 1
Protéine Kinase A
Protéine Kinase C
Pre-Pulse Inhibition
Receptor for Activated C-Kinase 1
Serotonin Transporter
SH2 binding protein 1
Synaptosomal Associated Protein
SNAP Receptor
Substance Noire compacte
Stable Tubule Only Polypeptide
Tyrosine Hydroxylase
Transmembrane Domain
Tetratricopeptide Repeat
9
Liste des abreviations
VAChT :
VGLUT1:
VMAT2:
Vmax:
Vesicular Acetylcholine Transporter
Vesicular Glutamate Transporter 1
Vesicular Monoamine Transporter 2
Vitesse maximale de transport
10
PARTIE 1
11
INTRODUCTION
12
Partie 1 - Introduction
Avant les travaux de Carlsson en 1958, la dopamine n’était connue qu’en tant
qu’intermédiaire métabolique de la voie de biosynthèse de la noradrénaline. Depuis, une
multitude de travaux a démontré son rôle de neuromédiateur à part entière et sa participation
essentielle à un grand nombre de fonctions du système nerveux telles que l’activité motrice,
l’éveil, les fonctions d’apprentissage et de mémoire, les émotions et les processus de
récompense. Des perturbations du système dopaminergique sont à l’origine de la maladie de
Parkinson et ont également été observées ou présumées dans des maladies psychiatriques
telles que la schizophrénie, le désordre de l’hyperactivité et du déficit d’attention (ADHD), le
syndrome Gilles de la Tourette et la dépendance aux drogues.
A/ La neurotransmission dopaminergique
1/ Les voies dopaminergiques centrales
Par
différentes
techniques
d’anatomie
(histofluorescence
de
la
dopamine,
immunofluorescence de son enzyme de synthèse, anticorps anti-dopamine ; Lindvall et al.,
1984), une cartographie des voies neuronales dopaminergiques a été établie. Le système
dopaminergique central se compose de plusieurs noyaux constituant des systèmes
anatomiques distincts, dont le système tubéro-infundibulaire et le système mésencéphalique
(figure1).
Le premier, qui régule la sécrétion des hormones hypophysaires, comprend de
nombreux noyaux hypothalamiques (A11 à A14) dont les axones se projettent au niveau de
l’éminence médiane et dans le système porte au niveau du lobe intermédiaire de l’hypophyse
(Lindvall et al., 1984).
Le second, qui contient la majorité des neurones dopaminergiques, est un système à
projections longues et se divise en trois noyaux :
A8 : ou extension postéro-latérale de la substance noire, envoyant ses projections dans
la partie ventrale du striatum ;
A9 : ou substance noire compacte (SNc), projetant majoritairement dans le striatum
dorsal (Anden et al., 1965), constituant la voie nigro-striée, impliquée dans le contrôle de
l’activité motrice (pour revue, voir Amalric and Koob, 1993). La dégénérescence de ces
neurones est à l’origine de la maladie de Parkinson (Hornykiewicz, 1966) ;
13
A10 : ou aire tegmentale ventrale (ATV), se projetant, d’une part, dans les aires frontale,
cingulaire et entorhinale du cortex (Emson and Koob, 1978; Swanson, 1982) constituant la voie
méso-corticale; d’autre part, dans le noyau accumbens et les tubercules olfactifs, ainsi que
d’autres structures limbiques comme le septum, l’amygdale, l’hippocampe et le cortex piriforme
(Swanson, 1982), formant ainsi la voie méso-limbique. Ces deux voies interviennent dans le
contrôle des fonctions cognitives, des émotions et des processus de dépendance aux drogues
(pour revue, voir Hyman, 1996; Koob, 1996).
Pituitary
ARC
Figure 1 : Schéma illustrant les principaux corps cellulaires dopaminergiques et leurs
projections dans le cerveau de rat. ARC : noyau arqué
2/ Le métabolisme de la dopamine
La dopamine appartient à la famille des catécholamines, comprenant également la
noradrénaline et l’adrénaline et, comme tous les neuromédiateurs ne franchit pas la barrière
hémato-encéphalique. En revanche, ses précurseurs, les acides aminés phénylalanine et
tyrosine, la traversent. La synthèse neuronale de dopamine se déroule dans le cytoplasme,
essentiellement au niveau des terminaisons axonales, mais aussi au niveau des corps
cellulaires et des dendrites. La L-tyrosine captée par le neurone est transformée en L-DOPA
par la tyrosine hydroxylase (TH), enzyme limitante de cette voie de synthèse, puis en dopamine
par la DOPA décarboxylase (figure 2). La dopamine synthétisée est alors concentrée dans des
vésicules présynaptiques au niveau des terminaisons neuronales grâce au transporteur
vésiculaire des monoamines VMAT-2. Ce stockage protège la dopamine de la dégradation
enzymatique intracellulaire réalisée par les monoamine-oxydases (MAO), au sein des
mitochondries, de l‘oxydation et de la génération de radicaux libres, toxiques pour la cellule. La
14
dopamine libérée dans l’espace synaptique est catabolisée par une enzyme gliale, la catécholO-méthyltransférase (COMT) et par la MAO, aboutissant aux métabolites finaux : acide 3,4dihydrophénylacétique (DOPAC), 3-méthoxytyramine (3-MT) et acide homovanillique (HVA).
Sous l’influence d’un potentiel d’action, la dopamine est libérée par exocytose dans
l’espace synaptique et se lie à des récepteurs spécifiques pré- ou post-synaptiques afin
d’exercer son action.
La fin du signal se fait par l’élimination physique du neurotransmetteur de l’espace
synaptique. Plusieurs mécanismes entrent en jeu : diffusion ; recapture de la dopamine par les
terminaisons qui l’ont libérée via son transporteur spécifique, le transporteur de la dopamine
(DAT) ; capture par les cellules gliales avoisinantes ou encore dégradation enzymatique, au
niveau extracellulaire, par la COMT.
Figure 2 : Schéma représentant les voies anabolique et catabolique de la dopamine.
COMT : catéchol-O-méthyltransférase ; DA : dopamine ; DOPAC : acide 3,4dihydrophénylacétique ; DOPA DEC : dopa-décarboxylase; HVA : acide homovanillique;
MAO : monoamine-oxydase; TH : tyrosine hydroxylase; 3-MT : 3-méthoxytyramine
15
3/ Les récepteurs dopaminergiques
a/ Propriétés et structure
Contrairement aux acides aminés excitateurs (glutamate, aspartate) et inhibiteurs
(GABA, glycine) qui activent des récepteurs-canaux, engendrant une variation immédiate du
potentiel membranaire, la dopamine est plutôt considérée comme un neuromodulateur car elle
agit via des récepteurs métabotropiques, aboutissant à une réponse cellulaire plus lente.
Historiquement, les récepteurs dopaminergiques D1 et D2 ont été différenciés par leurs
propriétés pharmacologiques et biochimiques, en fonction de leur capacité à lier différents
ligands et de leur couplage à l’adénylate cyclase (Kebabian and Calne, 1979). Depuis, par des
techniques de biologie moléculaire, cinq gènes codant pour cinq récepteurs dopaminergiques
ont été clonés (voir Sibley and Monsma, 1992; Sokoloff et al., 1995; Jaber et al., 1996). Ces
récepteurs à sept domaines transmembranaires sont classés en deux sous-familles : ceux
appartenant à la famille D1 (D1, D5), couplés à une protéine Gs ou Golf, stimulant l’activité de
l’adénylate cyclase et donc la synthèse d’AMPc et les autres, constituant la famille D2 (D2, D3,
D4), couplés à une protéine Gi ou Go, inhibant l’activité de l’adénylate cyclase (figure 3). On
peut également mentionner que les récepteurs dopaminergiques peuvent être couplés à
d’autres voies de transduction, telles que la régulation de l’activité de canaux calcium et
potassium et la libération d’acide arachidonique.
Au niveau structurel, on peut distinguer les récepteurs de la famille D1, qui possèdent
une longue extrémité C-terminale cytoplasmique et une troisième boucle cytoplasmique courte
tandis que les récepteurs de la famille D2 ont une extrémité C-terminale très courte mais une
troisième boucle cytoplasmique beaucoup plus longue (pour revue, voir Sibley and Monsma,
1992). D’autre part, contrairement aux récepteurs de la famille D1, les récepteurs de la famille
D2 possèdent un certain nombre d’introns qui interrompent la séquence codante de leur gène.
L’existence de ces introns est à l’origine d’isoformes dont les plus connues et étudiées sont les
formes courte (D2-S) et longue (D2-L) du récepteur D2 (Giros et al., 1989).
Il existe également des différences d’affinité de la dopamine pour ses récepteurs : de
l’ordre du micromolaire pour les récepteurs D1 et D2, submicromolaire pour les récepteurs D4
et D5 et nanomolaire pour le D3.
16
Figure 3 : Schéma d’une synapse dopaminergique
AC : adénylate cyclase ; AMPc : adénosine monophosphate cyclique ; DA : dopamine ;
DAT : transporteur de la dopamine
Les récepteurs D2 et D3 sont également présents au niveau présynaptique en tant
qu’autorécepteurs où ils exercent un rétrocontrôle négatif sur la libération finale de dopamine.
En effet, leur activation au niveau terminal provoque l’inhibition de l’activité de la TH et/ou
réprime la libération de dopamine suscitée par la dépolarisation des terminaisons ; au niveau
somatodendritique, leur stimulation par la dopamine, libérée par les varicosités dendritiques,
engendre une hyperpolarisation membranaire, conduisant à l’inhibition de l’activité électrique du
neurone.
b/ Localisation
Il y a une quinzaine d’années, il n’existait pas ou peu de radioligand sélectif, capable de
discriminer un seul sous-type de récepteur dopaminergique, rendant les expériences de
radioliaison difficiles. On s’est donc tourné majoritairement vers des techniques d’hybridation in
situ, afin de localiser les ARNm des différents récepteurs.
Le récepteur D1 est le plus abondant ; son ARNm est retrouvé au niveau d’aires
régulées par la dopamine (striatum, noyau accumbens, tubercules olfactifs) et au niveau
17
limbique, thalamique et hypothalamique. Dans certaines régions, l’ARNm du D1 n’est pas
exprimé, bien que la protéine le soit (globus pallidus, substance noire réticulée) : cela signifie
que le récepteur est porté par des neurones de projection. L’expression du récepteur D5 est
réduite à quelques régions comme l’hippocampe et à deux noyaux : le noyau mamillaire latéral
et le noyau parafasciculaire du thalamus (Meador-Woodruff et al., 1991; Tiberi et al., 1991).
Le récepteur D2 est retrouvé au niveau pré-et post-synaptique : il est majoritairement
exprimé dans le striatum, les tubercules olfactifs, le noyau accumbens et porté par les neurones
dopaminergiques de la SNc et de l’ATV. Il est également exprimé dans l’hypophyse où il régule
la production et sécrétion de prolactine et de l’hormone de croissance (Caron et al., 1978).
Dans le striatum, le récepteur D1 est exprimé par les neurones GABA/substanceP/dynorphine
tandis que le récepteur D2 est lui exprimé par une population distincte de neurones GABA, colibérant les enképhalines (Le Moine and Bloch, 1995). Le récepteur D3 est plus faiblement
exprimé et restreint au niveau d’aires limbiques telles que le noyau accumbens (« core » et
« shell »), les tubercules olfactifs, les ilots de Calleja et également au niveau de la SNc et de
l’ATV (en tant qu’autorécepteur) et du cervelet (Sokoloff et al., 1990; Bouthenet et al., 1991;
Diaz et al., 1995). Enfin, l’ARNm du récepteur D4 est exprimé au niveau du cortex frontal, de
l’amygdale, de l’hippocampe, de l’hypothalamus, du mésencéphale et très faiblement au niveau
du striatum.
Dans le système nerveux central de rat, l’abondance relative des différents récepteurs
dopaminergiques serait : D1≥D2>>D3≥D5≥D4.
B/ Le transporteur de la dopamine (DAT)
1/ Les transporteurs plasmiques neuronaux : aspects généraux
a/ Classification
Il existe deux familles de transporteurs plasmiques neuronaux à haute affinité, classées
selon leur dépendance ionique : les transporteurs Na/Cl dépendants et les transporteurs Na/K
dépendants (figure 4; pour revue, Masson et al., 1999).
18
Dépendance
Na+/Cl-
Na+/K+
Nom
DAT
NET
SERT
GAT1-3
GLYT1-2
Substrat
dopamine
noradrénaline
sérotonine
GABA
glycine
Référence
(Giros et al., 1991)
(Pacholczyk et al., 1991)
(Blakely et al., 1991)
(Guastella et al., 1990)
(Guastella et al., 1992)
EAAT1
EAAT2
EAAT3
EAAT4
EAAT5
L-Glu/ L-Asp
L-Glu
L-Glu
L-Glu
L-Glu
(Storck et al., 1992)
(Pines et al., 1992)
(Kanai and Hediger, 1992)
(Fairman et al., 1995)
(Arriza et al., 1997)
Figure 4 : Tableau représentant les deux classes de transporteurs plasmiques neuronaux
L-Asp : L-aspartate ; DAT: transporteur de la dopamine; EAAT1-5: transporteurs des acides
aminés excitateurs de type 1-5 ; GAT1 : transporteur de l’acide gamma-amino butyrique ; LGlu : L-glutamate ; GLYT1 : transporteur de la glycine ; NET : transporteur de la
noradrénaline ; PROT : transporteur de la proline ; SERT : transporteur de la sérotonine
•
Les transporteurs Na/Cl dépendants
Cette famille comprend les transporteurs des monoamines (dopamine, noradrénaline,
sérotonine), les transporteurs des acides aminés (GABA, glycine, proline et taurine) et les
transporteurs d’osmolites (bétaïne, créatine). Ces transporteurs sont 40 à 60% homologues et
partagent la même topologie prédite, c'est-à-dire une structure à douze domaines
transmembranaires, des extrémités N- et C-terminales intracellulaires et une deuxième boucle
intracytoplasmique contenant des sites potentiels de N-glycosylation.
Ils utilisent comme source d’énergie le gradient électrochimique de sodium créé et
maintenu de part et d’autre de la membrane par la pompe (Na/K)-ATPase (figure 5). Ces
transporteurs sont électrogéniques puisque, pour chaque molécule de substrat transportée, il y
a génération d’une charge positive. Pour le DAT, la stoechiométrie prédite est : 2Na+/1Cl-/1
zwitterion.
19
Figure 5 : Représentation schématique d’une terminaison neuronale contenant les
différents types de transporteurs neuronaux.
Les transporteurs plasmiques et vésiculaires n’utilisent pas directement l’ATP comme
source d’énergie, mais le gradient électrochimique généré par des pompes ATPase
membranaire
et
vacuolaire,
permettant,
respectivement,
l’accumulation
du
neurotransmetteur dans la terminaison et le remplissage des vésicules.
Nt : neurotransmetteur ; T : transporteur plasmique ; VT : transporteur vésiculaire
•
Les transporteurs Na/K dépendants
Cette famille regroupe les transporteurs des acides aminés excitateurs (glutamate et
aspartate). Ils possèdent six à dix domaines transmembranaires, utilisent également l’énergie
générée par la pompe Na/K et contiennent des sites putatifs de régulation par les protéines
kinases A et C.
b/ Fonction
Afin d’assurer une neurotransmission correcte, il est essentiel que le signal cellulaire soit
bref : après une libération massive de neurotransmetteur, la concentration synaptique doit
rapidement retourner à son niveau de base. Pour une majeure partie, le neurotransmetteur est
ainsi chassé de l’espace extracellulaire par un transporteur plasmique présynaptique ou glial
qui régule donc l’amplitude et la durée de la transmission. Ces transporteurs permettent aussi le
recyclage du neurotransmetteur, qui, une fois recapté peut à nouveau être internalisé au sein
de vésicules grâce à l’action du transporteur vésiculaire, entretenant ainsi le stock de
20
neurotransmetteur libérable. Dans certains cas, les transporteurs plasmiques neuronaux et
gliaux maintiennent l’intégrité du tissu neuronal. Ainsi, il n’existe pas d’enzyme dégradant le
glutamate dans l’espace synaptique. Les transporteurs plasmiques empêchent alors une
excitotoxicité due à une trop grande concentration extracellulaire de glutamate.
Le rôle essentiel des transporteurs plasmiques des monoamines dans la régulation de la
neurotransmission est illustré par le fait que toute substance qui modifie leur activité a des
effets psychotropes majeurs. Ces transporteurs constituent ainsi la cible primaire des
psychostimulants (cocaïne, amphétamine, ecstasy), de neurotoxines (MPP+, 6-OHDA) et
d’agents thérapeutiques comme les antidépresseurs et le méthylphénidate (Ritalin ; Amara and
Sonders, 1998).
2/ Clonage et propriétés structurales du transporteur de la dopamine
a/ Clonage
Le clonage du transporteur du GABA au début des années 1990 (Guastella et al., 1990)
et celui du transporteur de la noradrénaline (Pacholczyk et al., 1991) ont rapidement permis le
clonage par homologie ou par expression des autres transporteurs Na/Cl dépendants. Le
transporteur de la dopamine a tout d’abord été cloné chez le rat (rDAT, Giros et al., 1991; Kilty
et al., 1991; Shimada et al., 1991), le bœuf (bDAT, Usdin et al., 1991) puis chez l’homme
(hDAT, Giros et al., 1992) et la souris (mDAT, Donovan et al., 1995), mais aussi chez le
nématode C. elegans (CeDAT, Jayanthi et al., 1998).
Le hDAT est composé de 620 acides aminés (rDAT : 619 acides aminés) et partage
92% d’identité en acides aminés avec la séquence de rat. Le gène du hDAT (SLC6A3) est
localisé sur le chromosome 5p15.3 (Giros et al., 1992).
b/ Structure
Comme les autres transporteurs de sa famille, le DAT, selon l’étude de son profil
d’hydrophobicité, est composé de douze segments transmembranaires et possède une longue
boucle extra-cytoplasmique (50-65 résidus) entre le troisième et quatrième domaine
transmembranaire. Les extrémités N- et C-terminales sont intra-cytoplasmiques (figure 6).
21
DAT humain
Résidu différant du DAT de rat
Site de glycosylation
Figure 6 : Représentation schématique de la structure secondaire prédite du transporteur
de la dopamine humain (hDAT).
Les extrémités N- et C-terminales du DAT sont cytoplasmiques. Il est formé de 12 domaines
transmembranaires et contient une longue deuxième boucle extracytoplasmique. Les sites
putatifs de liaison à la PKA, PKC, CaMKII, les motifs leucine zippers et les sites de
glycosylation sont indiqués.
CaMKII: calcium/calmodulin dependent protein kinase II; PKA : protéine kinase A ; PKC :
protéine kinase C
Des études d’immunocytochimie en microscopie électronique assurent la localisation
intracellulaire des extrémités (Nirenberg et al., 1997), la localisation extracellulaire de résidus
asparagine impliqués dans la glycosylation (Vandenbergh et al., 1992) et la localisation
intracellulaire de résidus sérine et thréonine impliqués dans la phosphorylation du DAT (Povlock
and Amara, 1998). De plus, un homologue bactérien des transporteurs plasmiques Na/Cl
dépendants a récemment été cristallisé et confirme la structure à douze domaines
transmembranaires et la localisation des extrémités protéiques (Yamashita et al., 2005).
22
L’analyse de la séquence primaire du DAT, ainsi que des résultats de mutagenèse et de
biochimie, ont révélé l’existence de plusieurs sites de N-glycosylation au sein de la deuxième
boucle extracellulaire. Des études de marquage par photoaffinité montrent que 20 à 25% de la
masse du DAT mature serait composé de sucres (Vaughan et al., 1996). La séquence du DAT
montre également des sites potentiels de phosphorylation par les protéines kinases PKA, PKC
et CaMKII. L’importance de ces sites sera discutée plus loin dans le paragraphe 6/ Régulations.
La présence de résidus cystéine au niveau de la deuxième boucle extracellulaire suggère
l’existence de ponts disulfure intra- ou extra-moléculaires. De même, deux motifs « leucinezipper », impliqués dans les interactions protéine-protéine, ont été détectés dans les deuxième
et neuvième domaines transmembranaires (Giros et al., 1992).
c/ Relation structure/fonction
De précieuses informations sur le lien entre la structure du DAT et sa fonction ont été
obtenues soit par modifications chimiques, soit en jouant sur la séquence primaire, par
mutagenèse dirigée ou par construction de chimères entre DAT et NET. Après transfection
transitoire ou stable des ADN recombinants du DAT (principalement rDAT ou hDAT) dans
différentes lignées cellulaires ou synaptosomes, des expériences de transport de [3H]-dopamine
ou d’autres substrats ont permis de déterminer les paramètres biochimiques (Vmax : vitesse
maximale de transport et Km : constante d’affinité) caractérisant le transporteur mutant et ainsi
de mesurer l’effet fonctionnel de la mutation.
•
Expériences de mutagénèse dirigée
Les acides aminés les plus souvent substitués sont les résidus aromatiques, chargés ou
polaires (fonctions amine et hydroxyle), phénylalanine (F), proline (P), tyrosine (Y) et
tryptophane (W). De par leur nature chimique, ces résidus peuvent jouer un rôle déterminant
dans la structure et l’interaction du ligand et de son transporteur. Pour une liste exhaustive des
multiples travaux réalisés jusqu’à présent, se reporter aux revues de Chen and Reith, 2000; Uhl
and Lin, 2003.
La plupart des mutations affectant les résidus localisés dans les régions reliant les TM 1
à 8 ont pour effet de diminuer la vitesse de transport de la dopamine. Au contraire, les
mutations portant sur les acides aminés des régions extracellulaires n’induisent pas ou peu de
réduction du transport (Norregaard et al., 1998; Loland et al., 1999). Des études se sont
également intéressées au transport de la neurotoxine dopaminergique MPP+ et montrent que
certains résidus sérine (S) sont spécifiques du transport de ce produit. Ainsi, les mutations
S350A, S352A S527A, Y533F et S538A affectent la capacité de transport ou l’affinité du DAT
23
pour le MPP+ (Kitayama et al., 1993; Mitsuhata et al., 1998) sans forcément affecter celles pour
la dopamine.
•
Construction de chimères
Des transporteurs chimériques DAT-NET, dans lesquels une partie du transporteur natif a été
échangée symétriquement avec la séquence de l’autre transporteur, ont permis de dégager
trois principaux domaines fonctionnels du DAT (Buck and Amara, 1994; Giros et al., 1994; Buck
and Amara, 1995 ; figure 7) :
Figure 7 : Représentation schématique des différents domaines fonctionnels du DAT.
la partie N-terminale jusqu’au TM5 serait impliquée dans le mécanisme de capture et
la dépendance vis-à-vis des ions (Giros et al., 1994; Syringas et al., 2000). Cette région
est la plus conservée au sein des transporteurs de monoamines, il parait donc probable
qu’elle soit responsable d’une fonction commune à ces trois transporteurs.
Les régions TM5-TM8 gouverneraient les interactions avec les inhibiteurs (cocaïne,
amphétamines et dérivés,..) et l’efficacité de translocation du substrat. La région TM1TM3 a également été identifiée comme impliquée dans la reconnaissance des
inhibiteurs (Buck and Amara, 1995).
24
L’extrémité C-terminale serait engagée dans la stéréosélectivité des substrats. Cette
partie jouerait également un rôle déterminant dans l’adressage du DAT à la membrane
(Torres et al., 2003). En effet, des troncations progressives engendrent des réductions
progressives de la capacité de transport, résultant en l’incapacité de ces mutants à
atteindre la membrane plasmique.
D’autres expériences de chimères entre hDAT et bDAT ont montré que le TM3 était
important pour le transport de la dopamine et la liaison au radioligand [3H]-CFT, un analogue de
la cocaïne (Lee et al., 1998).
Un des buts importants de ces recherches est la lutte contre la pharmacodépendance.
En identifiant les régions distinctes du DAT responsables de la reconnaissance de la cocaïne et
du transport de la dopamine, on peut envisager de synthétiser un composé qui empêcherait la
liaison de la drogue sans pour autant affecter la reconnaissance et le transport de dopamine
(Uhl and Lin, 2003; voir paragraphe 7/ a/).
d/ Oligomérisation du DAT
On s’est assez récemment intéressé à l’oligomérisation potentielle des transporteurs
plasmiques. En 2000, celle du transporteur de la sérotonine (Kilic and Rudnick, 2000) a été
démontrée, suivie de celle du transporteur du GABA (Schmid et al., 2001).
Torres et collaborateurs se sont penchés sur le cas du DAT en choisissant une analyse
mutationnelle, combinée à des approches biochimique, immunologique et fonctionnelle (Torres
et al., 2003). L’expression en système cellulaire de protéines DAT étiquetées a permis, par coimmunoprécipitation, de montrer l’association physique du DAT avec lui-même. La coexpression de mutants perte de fonction Y335A ou D79G (ayant perdu leur activité de transport
mais correctement adressés à la membrane) avec un DAT sauvage empêche le
fonctionnement correct de ce dernier. De même, la co-expression de mutants tronqués en Nou C- terminal, ayant un adressage membranaire déficient, réduit la fonction du transporteur
sauvage. Ces expériences établissent l’oligomérisation fonctionnelle du DAT : ces deux types
de mutants tronqués, dominants négatifs, diminuent l’activité du DAT sauvage, soit en formant
un complexe oligomérique à la membrane cellulaire, soit en interférant avec les mécanismes
normaux de maturation et de trafic du DAT sauvage (Torres et al., 2003). Cette étude a
également révélé l’importance des motifs d’interaction protéique leucine-zippers, suspectée lors
du clonage moléculaire. La substitution de ce motif contenu dans le TM2 engendre un
transporteur ayant perdu son activité de transport du fait de son incapacité à être adressé à la
25
membrane. De plus, si l’on supprime le motif leucine-zipper dans les mutants Y335A et D79G,
l’effet de dominance négative est perdu, suggérant la participation de cette séquence à une
interaction monomère-monomère. Le deuxième motif leucine-zipper contenu dans le TM9 ne
semble pas avoir les mêmes propriétés. En conclusion, ces travaux montrent que le DAT forme
un complexe oligomérique au sein de cellules, dont l’assemblage est requis pour l’adressage
correct du complexe à la membrane.
Par une approche de pontage de résidus cystéine, Hastrup et collaborateurs ont montré
que le DAT formait au moins un homodimère (Hastrup et al., 2001), puis un dimère de dimère
(tétramère) au sein de la membrane plasmique, faisant intervenir des acides aminés présents
au niveau des TM4 et TM6 (Hastrup et al., 2003). De façon intéressante, des inhibiteurs du
DAT, benztropine, mazindol et l’analogue de la cocaïne MFZ 2-12, inhibent le pontage,
suggérant qu’un inhibiteur de transport ne serait pas un simple bloqueur mais pourrait de luimême engendrer un réarrangement conformationnel du DAT.
Enfin, l’oligomérisation du DAT a également été illustrée par la technique de FRET
(Fluorescence Resonance Energy Transfer Microscopy) au sein de cellules vivantes, entre
deux protéines de fusion exprimant hDAT en phase avec des molécules fluorescentes YFP
(Yellow Fluorescent Protein) et CFP (Cyan Fluorescent Protein; Sorkina et al., 2003). Les
oligomères seraient formés au sein du réticulum endoplasmique et maintenus à la membrane
cellulaire ainsi que lors de leur internalisation éventuelle au sein d’endosomes.
3/ Distribution tissulaire
Le DAT est exclusivement retrouvé dans les neurones synthétisant et libérant de la
dopamine, et non dans les neurones catécholaminergiques utilisant la dopamine comme
précurseur.
a/ Localisation des ARNm
Des travaux d’hybridation in situ ont permis de localiser les transcrits du DAT en majorité
au niveau de la substance noire compacte (SNc ; A9), l’extension postéro-latérale de la
substance noire (A8), l’aire tegmentale ventrale (ATV ; A10), mais également au niveau du
noyau arqué dorsal (A12) et de la substance noire réticulée (SNr ; Lorang et al., 1994; Hoffman
et al., 1998).
26
b/ Localisation de la protéine
Au niveau protéique, le DAT est exprimé aussi bien dans les terminaisons que dans les
corps cellulaires, dendrites et axones des neurones dopaminergiques issus du mésencéphale
(Ciliax et al., 1995; Ciliax et al., 1999). Ainsi, on le retrouve sur l’ensemble des voies nigro-striée
et méso-cortico-limbique et de façon plus intense, au niveau des régions à terminaisons :
striatum et noyau accumbens. De façon intéressante, beaucoup de dendrites issues de la SNc
et descendant vers la SNr réagissent avec un anticorps anti-DAT, en faveur d’un mécanisme de
recapture de la dopamine par les dendrites de cette région. En revanche, un niveau faible de
DAT a été détecté dans l’hypothalamus (Ciliax et al., 1995). Le système dopaminergique
hypothalamique semble donc indépendant du système mésencéphalique.
c/ Localisation ultrastructurale
Au niveau subcellulaire accessible par microscopie électronique, il a été montré que le
DAT est exprimé intensément au niveau du péricaryon et des dendrites proximales des
neurones dopaminergiques (Nirenberg et al., 1996; Nirenberg et al., 1997), suggérant que ces
régions sont les sites de synthèse, recyclage et/ou du trafic vers ou à partir de la surface
cellulaire.
Dans l’ATV et la SNc, le DAT semble associé à des membranes intracellulaires
d’organelles (tubulo-vésicules) exprimant VMAT2. Ces organelles pourraient constituer des
sites de stockage somato-dendritiques potentiellement capables de libération par le
fonctionnement en mode inverse du DAT (voir paragraphe 4/ c). Le DAT jouerait alors un rôle
dans la régulation du pool de stockage de la dopamine intracellulaire (Nirenberg et al., 1996;
Nirenberg et al., 1997). Des expériences menées in vitro (culture neuronale, expression en
système hétéroloque) ont également montré que le DAT se trouvait dans des pools
intracellulaires d’endosomes (Melikian and Buckley, 1999; Sorkina et al., 2003). Une
localisation membranaire du DAT a été détectée majoritairement au niveau des axones et des
dendrites plus distales, permettant la régulation de la concentration extracellulaire en dopamine.
4/ Mode de fonctionnement/électrophysiologie
a/ Stoechiométrie
Le transport de dopamine est un processus complexe, composé de plusieurs étapes
que sont la liaison du ligand, sa translocation, sa libération à l’intérieur du neurone et la
réorientation du transporteur (Rudnick and Clark, 1993). Afin de transloquer le substrat à
l’intérieur de la cellule contre son gradient de concentration, le transporteur utilise l’énergie
27
provenant du gradient transmembranaire d’ions Na+ ([Na+]e=120mM, [Na+]i=5mM), maintenu
par la pompe Na/K ATPase. Le DAT co-transporte ainsi la dopamine et les ions sodium et
chlore, avec une stoechiométrie prédite de une molécule de dopamine (chargée positivement
au pH physiologique), deux ions Na+ et un ion Cl- (Gu et al., 1994). Ces données prédisent donc
que chaque molécule de dopamine est accompagnée d’un mouvement de deux charges
positives, à l’origine d’un courant entrant.
b/ Différents états de conductance
En plus du courant associé au transport de substrat, diverses études ont montré que les
transporteurs pouvaient médier des courants ioniques macroscopiques, qui ne sont pas liés de
façon stoechiométrique au mouvement du substrat. Cette découverte suggère que les
transporteurs partageraient des propriétés communes avec les canaux ioniques. Ainsi, quand le
DAT est exprimé dans des ovocytes de Xénope, on peut observer un courant cationique
tonique, dit « courant de fuite », qui n’est pas couplé au transport de substrat mais qui peut être
bloqué par des analogues de la cocaïne et des substrats (Sonders et al., 1997). Ce type de
courant a également été retrouvé pour d’autres transporteurs Na/Cl dépendants (NET et SERT)
exprimés en ovocyte de Xénope et lignées cellulaires (Mager et al., 1994; Galli et al., 1995).
Cependant, ce courant de fuite n’a pas été retrouvé ex vivo dans une culture de neurones
dopaminergiques de rat (Ingram et al., 2002), suggérant que l’existence de ce type de courant
peut varier avec l’environnement cellulaire. Ainsi, la liaison de la protéine neuronale syntaxine
1A à l’extrémité N-terminale du transporteur de la sérotonine inhibe le courant de fuite (Quick,
2003).
D’autre part, des mesures électrophysiologiques réalisées sur des neurones en culture
ont montré que de faibles concentrations de substrat provoquaient des courants entrants, Na+dépendants, bloqués par la cocaïne (Ingram et al., 2002). De façon inhabituelle, ces courants
anioniques, généralement inhibiteurs, seraient capables d’exciter le neurone, même quand les
récepteurs dopaminergiques D1 et D2 sont bloqués. Ce même résultat a été retrouvé dans des
cultures neuronales de nématode C. elegans (Carvelli et al., 2004). Le DAT pourrait alors jouer
un rôle dans la modulation de libération de dopamine.
c/ Fonctionnement en mode inverse
Comme d’autres transporteurs de neurotransmetteurs, le DAT présente la capacité de
fonctionner en mode inverse, c'est-à-dire de pomper le neurotransmetteur intra-cytoplasmique
et de l’expulser vers le milieu extracellulaire. Ce mécanisme de libération est indépendant de
l’exocytose. Cet efflux de neurotransmetteur peut être obtenu expérimentalement en changeant
28
le gradient ionique membranaire : en diminuant les concentrations extracellulaires de sodium et
de chlore (Pifl et al., 1997). Physiologiquement, cette situation est observée dans l’ischémie du
myocarde, conduisant à la libération de noradrénaline par le NET (Schomig et al., 1988). De
même, l’efflux de dopamine via son transporteur peut être induit par l’amphétamine. Ce
mécanisme serait voltage-dépendant et régulé par la concentration intracellulaire de Na+
(Khoshbouei et al., 2003). Il a été montré que l’amphétamine pouvait provoquer une libération
de Ca2+ du réticulum endoplasmique, qui régulerait l’efflux et les courants médiés par le DAT
(Gnegy et al., 2004). De plus, cet efflux induit par l’amphétamine est aboli par l’administration
d’antagonistes de la protéine kinase C, tandis que des agonistes induisent un efflux
dopaminergique en absence d’amphétamine, suggérant l’implication de la protéine kinase C
dans ce processus (Gnegy, 2003).
La pertinence physiologique de ce mode de transport inversé n’est pas encore bien
comprise. Néanmoins, ceci pourrait constituer le mécanisme de libération dendritique de
dopamine par les neurones dopaminergiques de la substance noire compacte (Falkenburger et
al., 2001) et jouerait un rôle fondamental dans les effets pharmacologiques des amphétamines.
5/ Pharmacologie
La mesure de l’affinité du DAT pour ses différents substrats ou inhibiteurs fut d’abord
réalisée sur des préparations synaptosomales de rat. Le clonage du transporteur a ensuite
permis d’élargir les connaissances pharmacologiques grâce à l’expression des différentes
formes de DAT au sein de cultures cellulaires.
a/ Liaison aux catécholamines
Le DAT transporte la dopamine avec une affinité environ 10 fois meilleure que la
noradrénaline
et
la
sérotonine
et
60
fois
meilleure
que
l’adrénaline
(figure
29
8).
Figure 8 : Constantes d’inhibition (Ki en nM) de différentes molécules pour le transporteur
de la dopamine.
Les valeurs ont été obtenues pour le DAT humain (hDAT) ou de rat (rDAT), exprimé en
cellules ou en synaptosomes de rat.
D’après : a, Giros et al., 1992; b, Kilty et al., 1991; c, Shimada et al., 1991; d, Horn, 1990.
Paradoxalement, le NET, qui partage 70% d’identité de sa séquence en acides aminés
avec le DAT a une meilleure affinité pour la dopamine que pour son propre substrat et une
meilleure affinité pour la dopamine que le DAT lui-même, bien que sa capacité de transport soit
légèrement moindre que celle du DAT (figure 9; Giros et al., 1994).
30
DAT
NET
Km (μM)
Vmax (%)
Km (μM)
Vmax (%)
DA
2,54
270
0,67
230
NA
20,1
69
2,6
100
Figure 9 : Tableau présentant les affinités (Km en μM) et les capacités de transport (Vmax
en % de la Vmax du NET pour la NA) du DAT et du NET pour la dopamine et la
noradrénaline, mesurées dans des cellules COS7 transfectées.
DA : dopamine ; DAT : transporteur de la dopamine ; NA : noradrénaline ; NET :
transporteur de la noradrénaline. D’après Giros et al., 1994.
b/ Modèles cellulaires versus synaptosomes
La plupart de nos connaissances sur les propriétés pharmacologiques, la régulation et le
trafic des transporteurs plasmiques proviennent d’expériences réalisées par transfection de
cellules non neuronales. Les cellules forment un modèle in vitro facile à obtenir, extrêmement
pratique pour effectuer toutes sortes de tests de pharmacologie et de détection très ciblés
puisque l’on peut choisir les protéines neuronales à exprimer. Au contraire, les synaptosomes
sont des préparations de terminaisons neuronales refermées sur elles-mêmes après
homogénéisation des tissus cérébraux dans des conditions strictes. Ils contiennent toutes les
protéines exprimées à la terminaison, dont les transporteurs plasmiques natifs, constituant un
modèle physiologique « ex vivo ».
Concernant les données pharmacologiques de la figure 8, on peut noter que les
mesures réalisées sur cellules et synaptosomes sont globalement concordantes, mise à part
l’affinité du DAT pour la dopamine, qui est 3 à 10 fois plus faible lorsque celui-ci se trouve
exprimé en cellules eucaryotes (Giros and Caron, 1993). Cette différence significative d’affinité
entre le DAT natif et le DAT recombinant pour son substrat naturel pourrait être la conséquence
d’une différence de processus de maturation traductionnelle (glycosylation par exemple) entre
une cellule fibroblastique et un neurone dopaminergique. Il se peut également qu’il existe une
(ou plusieurs) protéines chaperonnes associée au DAT régulant l’affinité pour son substrat, qui
ne soit pas exprimée par les cellules utilisées pour les transfections.
31
c/ Le DAT comme cible des psychostimulants
Les transporteurs des monoamines, DAT, NET et SERT, constituent les cibles de
psychotropes comme les psychostimulants (cocaïne, amphétamines, méthylphénidate, ecstasy)
et les antidépresseurs tricycliques.
La cocaïne se lie aux trois transporteurs plasmiques avec le même ordre d’affinité (Ritz
and Kuhar, 1993) mais ses propriétés renforçantes semblent être médiées plus particulièrement
par son inhibition du DAT (Ritz and Kuhar, 1993). Dès lors, un nombre important de composés
chimiques a été synthétisé en vue de développer une pharmacothérapie contre la dépendance
à la cocaïne (Singh, 2000). Ces molécules peuvent être classées en six catégories : tropane,
benztropine, analogues de la pipérazine, méthylphénidate, mazindol et analogues de la
phencyclidine (pour revue, voir Dutta et al., 2003). Parmi les dérivés du tropane, les composés
WIN
35428
(12β-carbométhoxy-3-(4-fluorophényl)-tropane
ou
CFT)
et
RTI-55
(22β-
carbométhoxy-3β-[4-iodophényl]-tropane ou CIT) ont souvent été utilisés dans des études
neuropharmacologiques. Ils ne sont pas très sélectifs puisqu’ils se lient également au NET
(Kuhar et al., 1999), contrairement aux différents composés GBR (voir figure 8) qui possèdent
une haute affinité et sélectivité pour le DAT. La benztropine est un inhibiteur du transport de
dopamine, mais aussi un puissant agent anticholinergique utilisé en clinique dans le traitement
de la maladie de Parkinson. Le méthylphénidate est utilisé cliniquement pour traiter les enfants
hyperactifs et la phencyclidine se lie au DAT mais également aux récepteurs-canaux
glutamatergiques de type NMDA.
d/ Le DAT comme cible de toxines
Deux
toxines,
la
6-OHDA
(6-hydroxydopamine)
et
le
MPP+
(1-méthyl-4-
phenylpyridinium), sont transportées de manière spécifique par le DAT et sont largement
utilisées en expérimentation animale pour l’obtention de modèles animaux de la maladie de
Parkinson.
La 6-OHDA ne passe pas la barrière hémato-encéphalique et doit donc être administrée
par voie intracérébrale. Elle conduit à la mort des neurones dopaminergiques, probablement en
augmentant la production de radicaux libres. Par ailleurs, différents travaux suggèrent une
production physiologique de 6-OHDA par la substance noire, ce qui renforce l’intérêt de ce
modèle.
Le MPTP (1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine) est une neurotoxine synthétique
capable d’induire une dégénérescence des neurones dopaminergiques dans plusieurs espèces
animales. Après injection périphérique, le composé traverse la barrière hémato-encéphalique,
est métabolisé par les monoamine-oxydases en MPP+, qui inhibe le complexe mitochondrial I,
32
aboutissant à la mort des cellules. Il convient de noter que, contrairement à la 6-OHDA, la
production de cette neurotoxine n’est pas endogène même si certaines hypothèses étiologiques
suggèrent l’implication de composés chimiquement ou fonctionnellement proches du MPTP
(isoquinolines, roténone, substances végétales présentes dans les pesticides) dans le
déclenchement de la maladie de Parkinson humaine.
6/ Processus de régulation
Depuis une quinzaine d’années, beaucoup de travaux se sont intéressés à la régulation
des transporteurs plasmiques que l’on avait tendance à considérer dans le passé comme des
constituants relativement stables de la membrane plasmique et qui se sont finalement révélés
extrêmement dynamiques (pour revue, voir Gulley and Zahniser, 2003).
a/ Régulation par glycosylation
Le DAT nouvellement synthétisé dans le réticulum endoplamisque est transporté vers
l’appareil de Golgi où il est glycosylé sur des résidus asparagine de la boucle extracellulaire,
puis inséré dans la membrane plasmique. Ce processus n’est pas essentiel pour l’expression
du DAT, puisque les transporteurs non glycosylés et matures atteignent tous deux la surface
cellulaire, bien que la mutation des sites glycosylés réduise de manière significative l’expression
membranaire du transporteur (Torres et al., 2003; Li et al., 2004). Le mécanisme mis en jeu
reste inconnu : le DAT non glycosylé serait peut être plus accessible à la protéolyse ou alors
moins stable à la surface cellulaire. Du côté fonctionnel, la substitution des trois sites de
glycosylation entraîne une importante baisse de la vitesse maximale de transport (Vmax),
corrélée ou non avec une augmentation de l’affinité, selon les études (Torres et al., 2003; Li et
al., 2004).
b/ Régulation par phosphorylation
D’après la séquence primaire du DAT, on compte plusieurs sites consensus potentiels
de phosphorylation par les protéines kinases. On a supposé que leur activation pouvait altérer
l’affinité du transporteur pour ses substrats/inhibiteurs, ou mener à une diminution de l’activité
du transporteur. Beaucoup d’études ont montré qu’un activateur de protéine kinase C, comme
les esters de phorbol, engendrait une diminution de l’activité du transporteur et ce dans divers
systèmes cellulaires exprimant le DAT : synaptosomes striataux (Vaughan et al., 1997), cellules
COS (Pristupa et al., 1998), cellules PC12 (Melikian and Buckley, 1999), cellules MDCK
(Daniels and Amara, 1999), cellules d’insectes (Pristupa et al., 1998) et ovocytes de Xénope
33
(Zhu et al., 1997). Par microscopie à fluorescence ou fractionnement subcellulaire de cellules
transfectées avec hDAT, Melikian et Buckley (1999) et Daniels et Amara (1999) ont montré que
cette baisse d’activité était due à une internalisation des transporteurs au sein d’endosomes,
qui pouvaient ensuite être recyclés à la surface ou dégradés, suivant les systèmes utilisés.
L’activation de la protéine kinase C provoque une augmentation de la phosphorylation du DAT
(Vaughan et al., 1997), majoritairement au niveau de son extrémité N-terminale (Foster et al.,
2002). On a donc supposé que la phosphorylation de sites sérine/thréonine du transporteur
était à l’origine du processus d’internalisation. Cependant, la mutation de ces sites (Chang et
al., 2001), de même que la délétion de l’extrémité N-terminale du DAT (Granas et al., 2003)
préviennent la phosphorylation du DAT par la protéine kinase C mais n’empêchent pas son
internalisation. Ces deux mécanismes ne semblent donc pas directement liés et l’on peut
supposer qu’il existe d’autres phosphoprotéines chargées de réguler l’activité du transporteur.
L’inhibition de la phosphoinositide 3-kinase (PI3K ; Carvelli et al., 2002) et celle de la
MAPK kinase (mitogen-activated protein kinase kinase ; Lin et al., 2003) conduisent également
à une diminution de l’activité de transport, due à une redistribution du DAT de la surface
cellulaire vers le cytosol (voir aussi chapitre C, paragraphe 4/ c).
c/ Régulation par les substrats et les inhibiteurs
•
Dopamine
Dans un modèle d’ovocyte de Xénope, il a été démontré qu’une exposition courte mais
répétée de dopamine provoquait une baisse des courants associés au transport (Gulley et al.,
2002). Dans des cellules HEK293, Saunders et collaborateurs ont montré qu’une exposition de
60 min à 10 μM de dopamine engendrait une diminution de la capacité de transport du DAT
(Saunders et al., 2000). En revanche, ce résultat n’a pas été retrouvé avec des cellules MDCK
(Daniels and Amara, 1999). La baisse de transport est là aussi associée à une localisation
cytosolique accrue du transporteur, au détriment de son expression membranaire (Saunders et
al., 2000).
•
Amphétamines
La modulation du trafic du DAT n’a pas seulement lieu par des substrats endogènes,
mais aussi par des psychostimulants, suggérant que ce processus serait impliqué dans le
mécanisme d’addiction. Ainsi, dans des synaptosomes de rats, sacrifiés 1h après administration
systémique de metamphétamine, on observe une diminution de la Vmax (Fleckenstein et al.,
1997), sans modification d’affinité. Il en est de même pour des cellules HEK193 exprimant
34
hDAT et exposées à l’amphétamine (Saunders et al., 2000). Par microscopie confocale, on a pu
suivre le mouvement des transporteurs associés à une protéine fluorescente et conclure que
l’inhibition fonctionnelle était due à une internalisation cellulaire. Par ailleurs, il a été précisé que
l’activité intrinsèque du DAT n’était pas altérée et que le transporteur était pleinement actif juste
avant sa redistribution cellulaire en réponse à l’amphétamine (Kahlig et al., 2004). Enfin, c’est
l’amphétamine intracellulaire et non extracellulaire qui semble responsable de ce processus
(Kahlig et al., 2006). Ajoutons que l’internalisation du DAT induite pas les différents substrats
est atténuée en présence d’inhibiteurs sélectifs de la protéine kinase C (Sandoval et al., 2001;
Gulley et al., 2002) ou de l’activation de la PI3K (Carvelli et al., 2002).
•
Cocaïne
Chez l’homme et l’animal, de nombreuses études ont montré que l’administration
répétée de cocaïne engendrait une augmentation du nombre de transporteurs de la dopamine
(voir Zahniser and Doolen, 2001). Sur des préparations de synaptosomes striataux issues de
cerveaux de cocaïnomanes décédés, la capacité de transport de dopamine est multipliée par
deux par rapport aux contrôles (Mash et al., 2002), suggérant que cette augmentation de
densité a également un effet fonctionnel in vivo. De même, sur des cellules HEK293 ou des
synaptosomes de rats exposés à la cocaïne, la Vmax du DAT est accrue de 30 à plus de 50%
(Daws et al., 2002). Une exposition à la cocaïne est également capable de bloquer
l’internalisation du DAT induite par l’amphétamine (Saunders et al., 2000).
d/ Régulation par les récepteurs dopaminergiques
Bien que les résultats de certains travaux soient contradictoires (pour revue, voir Gulley
and Zahniser, 2003), la plupart montre que l’activation des autorécepteurs D2 augmente le
transport de dopamine, favorisant la diminution de concentration de dopamine extracellulaire,
donc de la transmission dopaminergique, en accord avec le rôle inhibiteur de ces
autorécepteurs. Des expériences de transport réalisées chez l’ovocyte de Xénope co-exprimant
le DAT et le récepteur D2, démontrent que l’activation de ces récepteurs accroit la densité des
sites de liaison du DAT (Mayfield and Zahniser, 2001). Cet effet est bloqué par un prétraitement
à la toxine pertussique, qui inhibe l’activité des protéines Gi, suggérant que la fonctionnalité du
récepteur D2 est nécessaire à ce type de régulation. Chez la souris invalidée pour le récepteur
D2, la clairance de dopamine est réduite d’environ 50% (Dickinson et al., 1999). La dopamine
pourrait donc réguler la fonction de son transporteur soit directement en tant que substrat
(favorisant l’internalisation du DAT), soit par l’intermédiaire de ses récepteurs (augmentant la
recapture de la dopamine extracellulaire).
35
e/ Régulation par interaction directe avec des protéines partenaires
Il a été montré récemment que le DAT interagissait directement avec diverses protéines,
capables de moduler sa fonction. Ce sujet fera l’objet d’un chapitre à part entière (voir chapitre
C, paragraphe 4).
7/ Implication du DAT dans différentes pathologies psychiatriques
Comme mentionné plus haut, il a été démontré que le DAT était impliqué dans divers
troubles mentaux, principalement l’addiction aux drogues, le désordre de l’hyperactivité et du
déficit d’attention, la schizophrénie et dans une moindre mesure, la dépression. Dans les
paragraphes suivants ne seront traitées que les deux premières pathologies.
a/ La dépendance aux drogues : exemple de la cocaïnomanie
Quelque soit leur site d’action primaire, toutes les drogues jouent sur la transmission
dopaminergique en augmentant la libération de dopamine dans le shell du noyau accumbens
(Di Chiara and Imperato, 1988).
•
La cocaïne et ses effets physiologiques
La cocaïne est un alcaloïde naturel extrait d'un arbuste d'Amérique du Sud : le cocaïer.
Depuis plus de 3000 ans, les feuilles de coca (0,1% à 1,8% de cocaïne) sont utilisées par les
Indiens des Andes pour leurs vertus thérapeutiques. Mâcher les feuilles de coca procure une
légère euphorie, augmente l'endurance physique et réduit les effets du mal des montagnes et
de la privation d'oxygène.
La cocaïne (chlorhydrate de cocaïne) se présente le plus souvent sous la forme d'une
poudre blanche floconneuse, hydrophile, qui peut être solubilisée dans l'eau et donc injectée,
inhalée (sniffée) ou ingérée. Elle ne peut être fumée, car elle se décompose et devient donc
inactive à une température proche de sa température de vaporisation (198°C). Au contraire, le
« crack », cocaïne mélangée à du bicarbonate de soude ou de l’ammoniaque, présenté sous
forme de petits cailloux, est chauffé pour en inhaler la fumée.
L'usage de cocaïne provoque une euphorie immédiate, un sentiment de puissance
intellectuelle et physique et une indifférence à la douleur, à la fatigue et à la faim (état de
« high »). La prise répétée de cocaïne peut provoquer des troubles psychiques tels que des
psychoses ou des hallucinations, une grande instabilité d'humeur, des délires paranoïdes ou
des attaques de panique. La prise de cocaïne entraîne également une augmentation de
36
l'activité psychique ainsi que des insomnies, des amnésies et des phases d'excitation. Pendant
la phase de « descente », l'euphorie laisse place à une anxiété et un état dépressif, souvent
comblé par une prise de drogue. Au niveau périphérique, cette drogue se comporte comme un
vasoconstricteur puissant.
Selon le dernier rapport de l’OFDT (Observatoire Français des Drogues et des
Toxicomanies), la cocaïne est la substance illicite la plus consommée en France après le
cannabis et sa consommation est à la hausse sur la dernière décennie.
•
Cibles de la cocaïne et effets addictifs
Comme mentionné plus haut, la cocaïne se lie aux trois transporteurs des monoamines
avec une affinité décroissante telle que : SERT> DAT>NET (Ritz and Kuhar, 1989). Néanmoins,
la dopamine serait le neurotransmetteur le plus impliqué dans les propriétés renforçantes de
cette drogue (Ritz and Kuhar, 1993). La liaison de la cocaïne au DAT engendre un changement
de sa conformation, le rendant incapable de transporter la dopamine (Hastrup et al., 2003;
Wang et al., 2003b). Cette inhibition aboutit à une augmentation de la concentration
extracellulaire de dopamine libérée par les varicosités axonales et les dendrites, prolongeant
son interaction avec ses récepteurs pré- et post-synaptiques et donc sa réponse cellulaire et
comportementale. Récemment, il a été montré ex vivo que la cocaïne pouvait également
augmenter la libération de dopamine (Lee et al., 2001b). Ce mécanisme passerait par la
mobilisation de vésicules synaptiques dopaminergiques issues du pool de réserve et liées à
une protéine synaptique, la synapsine (Venton et al., 2006). Néanmoins, la manière dont la
cocaïne interagit avec la synapsine n’est pas encore établie.
De nombreuses équipes ont cherché à déterminer le site de liaison de la cocaïne. Celleci et la dopamine ayant une structure assez différente, il est probable que les résidus
nécessaires à leurs liaisons puissent se chevaucher sans être complètement identiques. Des
analyses menées sur des chimères DAT-NET suggèrent que les sites de liaison résideraient
dans des régions encadrant les TM5-8 et TM1-3 (Giros et al., 1994; Buck and Amara, 1995).
Récemment, le résidu phénylalanine F105 du TM2 a été identifié comme fortement impliqué
dans la liaison à la cocaïne puisque sa substitution en méthionine ou cystéine (F105M et
F105C) décroît fortement la sensibilité à la cocaïne (de 4 à 15 fois), sans pour autant altérer le
transport de dopamine de façon significative (Wu and Gu, 2003). Chen et collaborateurs
(2005a) ont ensuite montré que d’autres mutations de résidus proches de F105C diminuaient
encore plus la sensibilité à la cocaïne et notamment que la triple mutation L104V, F105C,
A109V aboutissait à une affinité pour la cocaïne 69 fois moindre que celle du DAT sauvage de
37
souris. Cette triple mutation affecte également la liaison du méthylphénidate, confirmant que
son site de liaison au DAT chevauche celui de la cocaïne, mais, de façon remarquable, n’a pas
d’effet sur l’affinité de l’amphétamine, la metamphétamine et la dopamine. La capacité
maximale de transport du DAT muté est plus faible que celle du DAT sauvage, mais les
expériences de biotinylation indiquent que l’expression du transporteur à la surface cellulaire
n’est que marginalement affectée, suggérant une vitesse de renouvellement diminuée du DAT
mutant.
Contrairement aux opiacés, le sevrage à la cocaïne n’induit pas de dépendance
physique, mais conduit à une forte dépendance psychique. Les effets renforçants de cette
drogue proviennent de l’augmentation de la concentration en dopamine au niveau des
structures limbiques, principalement le noyau accumbens. Une consommation chronique de
cocaïne provoque une augmentation du nombre de molécules du DAT, à l’origine d’une
clairance plus rapide de la dopamine synaptique (Staley et al., 1994; Mash et al., 2002). Ceci
pourrait expliquer le phénomène de tolérance, qui se traduit par une réponse comportementale
d’intensité moindre pour une même dose de drogue. Après sevrage, l’expression du DAT
(ARNm et protéine) est diminuée, notamment dans les régions limbiques. Cela pourrait
partiellement expliquer pourquoi, suite à une longue période d’abstinence de plusieurs
semaines à plusieurs mois, une dose challenge de cocaïne serait capable d’induire une
accumulation de dopamine extracellulaire ainsi que des comportements associés de plus forte
amplitude, comparés à l’injection initiale de la drogue. Ce processus de « sensibilisation
comportementale » pourrait contribuer au besoin obsédant de la drogue et au fort taux de
rechute des toxicomanes (Zahniser and Sorkin, 2004).
Ces données montrent que la dopamine et le DAT jouent un rôle essentiel dans la
dépendance à la cocaïne. Néanmoins, les souris invalidées pour le DAT (DAT KO ; Giros et al.,
1996) sont toujours capables de s’auto-administrer de la cocaïne (Rocha et al., 1998). Celle-ci a
encore la capacité d’élever la dopamine extracellulaire au niveau du noyau accumbens mais
pas au niveau du striatum (Carboni et al., 2001). L’ensemble de ces résultats suggère que
d’autres cibles de la cocaïne entrent en jeu dans le processus addictif. Ainsi, la cocaïne pourrait
bloquer le NET, capable de transporter la dopamine au niveau du noyau accumbens,
augmentant par conséquent sa concentration extracellulaire (Yamamoto and Novotney, 1998).
Toutefois, la participation du NET dans le noyau accumbens est assez mineure et son inhibition
chez les souris DAT KO ne modifie pas les taux extracellulaires de dopamine (Budygin et al.,
2002). Par contre, il a été montré que le SERT jouait un rôle fondamental puisque des souris
doublement invalidées pour le DAT et le SERT ne présentent plus de comportement de
préférence de place conditionné à la cocaïne (Sora et al., 2001), contrairement aux souris NETBOUVRAIS-VERET – Thèse de Doctorat en Sciences – 2006
38
SERT double KO (Hall et al., 2002). L’interaction de la cocaïne avec le SERT et potentiellement
le NET, semble donc nécessaire à l’initiation et au maintien des effets renforçants de cette
drogue.
•
Lutte contre la cocaïnomanie
Jusqu’à présent, il n’existe pas de traitement effectif de la dépendance à la cocaïne.
Plusieurs stratégies pharmaco-thérapeutiques ont été développées, à savoir la recherche 1/ de
molécules de substitution, n’ayant pas d’effets addictifs, 2/ de molécules « antagonistes » qui
bloqueraient la liaison de la cocaïne aux transporteurs, 3/ de composés agissant à un site
différent de celui de la cocaïne qui empêcheraient les effets fonctionnels de la drogue (voir
(Dickerson and Janda, 2005).
La thérapie de substitution a donné d’excellents résultats dans la dépendance à
l’héroïne, remplacée par la méthadone et des résultats plus mitigés dans la tabaccodépendance, la nicotine pure remplaçant le tabac. La plupart des composés testés sont des
dérivés de la cocaïne cités précédemment (voir paragraphe 5/b). Des études d’imagerie
médicale par PET (Positron Emission Tomography) ont montré que l’occupation du DAT par la
cocaïne était importante pour l’induction des effets renforçants. Des doses de 0,1 à 1 mg/kg de
cocaïne occupent, respectivement, entre 53 et 87% des transporteurs chez le singe rhésus,
confirmant le parallélisme entre un taux élevé d’occupation du DAT et l’efficacité de la cocaïne
(Volkow et al., 1996). De la même manière, un fort taux d’occupation du DAT par les inhibiteurs
est nécessaire à leur efficacité. Le RTI-113 est capable de diminuer l’auto-administration de
cocaïne chez les singes lorsqu’il occupe entre 72 et 84% du nombre total de DAT (Wilcox et al.,
2002). Toutefois, l’usage des ligands actuels reste limité puisque beaucoup d’entre eux
provoquent une dépendance.
Une autre approche intéressante consiste à créer des protéines conçues pour lier la
cocaïne afin de bloquer ses effets ou de la dégrader, la rendant moins psychoactive. Ainsi,
l’immunisation de rongeurs avec des anticorps anti-cocaïne a permis l’inhibition efficace de
l’effet du psychostimulant, car les anticorps développés sont capables de lier la drogue dans la
circulation sanguine (Kantak et al., 2000; Carrera et al., 2001). Néanmoins, ils ont une action
uniquement périphérique et la cocaïne non liée par ces anticorps entre dans le cerveau et peut
alors exercer ses effets psychoactifs. Plus récemment, la technique du « phage display » a été
adaptée au traitement contre la cocaïnomanie. Dans cette technique, un bactériophage exprime
des anticorps anti-cocaïne par milliers à sa surface, capables de séquestrer la cocaïne et peut
se multiplier au sein du cerveau. Administré par voie intra-nasale, le virus pénètre dans le
39
cerveau par les terminaisons nerveuses olfactives, offrant un traitement rapide et restreint au
système nerveux central (Dickerson and Janda, 2005).
Par rapport aux stratégies de développement d’antagonistes, les anticorps bloquants
présentent deux avantages. Premièrement, ils bloquent la cocaïne « à la source », ce qui est
plus facile que de bloquer les effets de la cocaïne, qui agit sur plusieurs transporteurs différents.
Deuxièmement, les anticorps bloquants sont « en veille », ils ne risquent pas d’affecter la
fonction normale de neurotransmission et n’interviennent qu’en présence de cocaïne.
Une dernière approche consiste à injecter des anticorps catalytiques, dégradant
spécifiquement le groupement ester-benzoyl de la cocaïne. Cette technique, qui accélère la
clairance de la cocaïne, a été efficace sur des modèles d’overdose chez les rongeurs mais les
constantes cinétiques de catalyse doivent être améliorées avant de lancer un développement
clinique (Meijler et al., 2004). De plus, on peut s’interroger sur l’efficacité de ce type de
traitement chez l’homme, qui peut être contrecarré par l’augmentation des prises de cocaïne
par le toxicomane.
Ces différentes techniques semblent prometteuses, mais ne prennent pas en compte
l’effet de dépendance psychologique, le besoin que ressentent les toxicomanes de prendre de
la drogue. Un traitement pharmaco-thérapeutique devra donc toujours être associé à un suivi
psychologique, notamment basé sur la désensibilisation des indices comportementaux, comme
c’est le cas actuellement pour d’autres types de dépendance.
b/ Le désordre de l’hyperactivité et du déficit d’attention (ADHD)
•
Définition et bases biologiques
Le désordre de l’hyperactivité et du déficit d’attention (ADHD) touche 5-10% des enfants
scolarisés et 3-5% des adultes aux Etats-Unis. Il se caractérise cliniquement chez le jeune
enfant par une impulsivité, des troubles de l’attention et une hyperactivité motrice (voir Madras
et al., 2005). Jusqu'à récemment, on croyait que ces symptômes disparaissaient à
l'adolescence avec les changements hormonaux et développementaux. Or, il est maintenant
reconnu que plusieurs des symptômes persistent chez une majorité d’adultes. En fait,
l'hyperactivité se résorbe à l'adolescence, mais les déficits d'attention peuvent persister dans 30
à 70% des cas. D’autre part, on trouve une forte co-morbidité avec d’autres maladies, telles que
des troubles de l’humeur, les troubles bipolaires et anxieux, le syndrome Gilles de la Tourette
aisi que les troubles addictifs.
40
Plusieurs études d’imagerie par résonance magnétique (IRM) ont rapporté des
altérations morphologiques et fonctionnelles cérébrales telles qu’une réduction de la taille des
ganglions de la base, du corps calleux, du cortex préfrontal et du cervelet (voir Durston, 2003;
Sowell et al., 2003). Par imagerie fonctionnelle (IRMf), une étude a montré une activation
striatale réduite chez des enfants souffrant d’ADHD lors de tâches cognitives faisant intervenir
une réponse inhibitrice (Vaidya et al., 1998).
Des études de jumeaux et d’adoption ont montré que des facteurs génétiques
intervenaient pour 70% de l’étiologie (Biederman and Faraone, 2002). Certains gènes de la
transmission dopaminergique, sérotoninergique et noradrénergique ont été impliqués dans
l’étiologie de la maladie comme les récepteurs dopaminergiques D4 et D5, sérotoninergiques,
les transporteurs DAT, SERT et NET ainsi que la protéine synaptique SNAP 25 (Yang et al.,
2004; Faraone et al., 2005).
•
Rôle du DAT étudié par génétique et neuroimagerie
En 1995, Cook et collaborateurs montrent pour la première fois une association entre
l’ADHD et un polymorphisme allélique du DAT situé dans la partie 3’ non traduite du gène.
Toutefois, ce résultat n’a pas toujours été confirmé par d’autres équipes : des méta-analyses
réalisées récemment ont soit trouvé un effet significatif mais faible (Faraone et al., 2005), soit
aucune association (Purper-Ouakil et al., 2005; Li et al., 2006). Néanmoins, les souris
invalidées pour le DAT (DAT KO, Giros et al., 1996) reproduisent certains symptômes de
l’ADHD (Gainetdinov et al., 2001a ; voir paragraphe 8/c}.
Chez l’homme, et
plus particulièrement l’enfant, de nombreuses études de
neuroimagerie ont cherché à déterminer une altération potentielle de la densité de DAT, à l’aide
de différents ligands radioactifs (voir Spencer et al., 2005). Ainsi, des travaux de SPECT (Single
Photon Emission Computed Tomography) réalisés en 1999 avec le ligand altropane indiquaient
que la densité du DAT était augmentée d’environ 70% dans le striatum de patients atteints
d’ADHD (Dougherty et al., 1999). Avec un autre ligand, le TRODAT-1, Dresel et collaborateurs
(2000) ont trouvé une liaison au DAT augmentée de 17%. Une étude plus poussée a distingué
des sous-populations de patients ADHD et démontré que l’augmentation de liaison au DAT ne
concernait que les patients hyperactifs comparés aux patients inattentifs (Krause et al., 2003).
De plus, ce résultat n’était valable que pour les sujets non fumeurs. Une autre étude utilisant
l’altropane a détecté une augmentation de 30% de densité du DAT chez les malades. Cheon et
collaborateurs (2003) ont trouvé un effet de latéralisation, avec une densité de liaison au DAT
accrue de 40% dans le striatum gauche et de 51% dans le striatum droit d’enfants atteints
d’ADHD. Cependant, une autre étude n’a pas trouvé d’altération de liaison au DAT (van Dyck et
41
al., 2002). Une autre technique plus résolutive utilisée en imagerie est la tomographie par
émission de positrons (PET), mais peu de travaux ont été publiés à l’heure actuelle. Des
premiers résultats confirment une hausse de 30% de liaison dans le striatum de patients
atteints (Spencer et al., 2005) alors qu’une autre étude ne trouve pas de différence significative
(Jucaite et al., 2005).
En résumé, les résultats de ces études d’imagerie penchent en faveur d’une
augmentation de la liaison au DAT chez les patients souffrant d’ADHD. Toutefois, les taux ne
sont pas toujours concordants, suivant les caractéristiques cliniques des échantillons de
patients étudiés (comorbidité, consommation antérieure de cigarettes ou de drogues, ethnie,
âge,..), la spécificité et la lipophilie du ligand utilisé.
•
Traitement thérapeutique et mécanismes d’action potentiels
Paradoxalement, le traitement thérapeutique de l’ADHD consiste en l’administration de
faibles doses de psychostimulants : amphétamine et méthylphénidate (Ritalin), ciblant le DAT
et, plus récemment, l’atomoxétine, inhibiteur sélectif du NET. Néanmoins, les mécanismes
d’action thérapeutique de ces drogues ne sont pas encore bien connus. Comme mentionné
précédemment, le méthylphénidate est un inhibiteur du DAT, qui se fixe sur un autre site que la
dopamine et qui empêche l’activité de transport de la dopamine. L’amphétamine est un substrat
du DAT et un inhibiteur compétitif : elle se fixe sur le même site que la dopamine et une fois
entrée dans le neurone, elle est séquestrée dans les vésicules synaptiques par VMAT2,
favorisant la libération de dopamine des vésicules vers le cytoplasme, puis vers le milieu
extérieur par transport inverse du DAT (Sulzer et al., 2005).
L’effet pharmacologique de ces drogues est probablement dû en partie aux densités
relatives du DAT et du NET dans différentes régions du cerveau, ainsi que les affinités pour
chacun des deux transporteurs (Madras et al., 2005). Il a été montré que le méthylphénidate,
l’amphétamine et l’atomoxétine augmentent les concentrations extracellulaires de dopamine et
noradrénaline au niveau du cortex préfrontal. Ces concentrations élevées pourraient
notamment amplifier l’activité des récepteurs dopaminergiques D4 et D5, remédiant à
l’hypofrontalité supposée dans cette maladie. Dans le cortex frontal, la densité du DAT est
faible, tandis que celle du NET est importante et le NET a une meilleure affinité pour la
dopamine que le DAT lui même. L’atomoxétine empêcherait donc sélectivement la capture de
dopamine via le NET.
Au niveau du
striatum, l’élévation de la concentration extracellulaire de dopamine
induite par le méthylphénidate a été confirmée par PET (Volkow et al., 2002a; 2002b). Cette
augmentation de dopamine pourrait amplifier l’activation des autorécepteurs, réduisant ainsi la
42
transmission dopaminergique. Ceci résulterait en une diminution d’activité des récepteurs
postsynaptiques responsables de l’activité locomotrice (Seeman and Madras, 1998; 2002).
Cependant, cette hypothèse n’est pas étayée par des résultats électrophysiologiques montrant
qu’il n’y a pas de doses de méthylphénidate et d’amphétamine activant les autorécepteurs de
façon préférentielle par rapport aux autres récepteurs (Ruskin et al., 2001).
Quelques équipes ont étudié l’action du méthylphénidate par imagerie et ont reporté une
diminution des sites du DAT après traitement (Krause et al., 2003; Vles et al., 2003). On serait
tenté de croire à une normalisation des sites augmentés chez les patients ADHD, cependant,
l’interprétation de la liaison dépend à la fois de la cinétique d’administration du traitement et de
l’imagerie. En effet, dans les travaux de Krause, la dernière dose de méthylphénidate a été
donnée 90 mn avant la prise d’images, il est donc probable qu’une large proportion de la baisse
de liaison soit due à l’occupation des sites du DAT et non à une réelle diminution de densité des
sites.
8/ Les souris invalidées pour le DAT : modèle animal pour la schizophrénie et l’ADHD ?
Dans le but de mieux comprendre le rôle du DAT au sein du système nerveux central,
Giros et collaborateurs (1996) ont généré des souris invalidées pour le DAT ou DAT KO.
a/ Phénotype
•
Caractérisation biochimique
Chez ces souris DAT KO, des expériences de voltamétrie cyclique et de microdialyse
ont révélé que la dopamine restait 300 fois plus longtemps à la synapse, aboutissant à une
concentration de dopamine extracellulaire 5 fois plus grande (figure 10 ; Giros et al., 1996).
Ceci démontre bien le rôle capital du DAT dans l’élimination physique de la dopamine
synaptique puisque aucun autre mécanisme n’est capable de compenser l’absence du DAT :
ainsi, la clairance de dopamine n’est pas modifiée par des inhibiteurs des transporteurs de
sérotonine et de noradrénaline ou par l’inhibition sélective des enzymes catalytiques MAO et
COMT (Giros et al., 1996; Jones et al., 1998).
43
Figure 10 : Représentation schématique des adaptations moléculaires touchant les
synapses des souris DAT KO.
Chez les souris DAT KO, l’excès de dopamine extracellulaire tend à être compensé par
une diminution des taux intracellulaires de TH et de dopamine, ainsi que des récepteurs
dopaminergiques D1 et D2 tandis que le récepteur D3 est augmenté. L’expression de la
dynorphine (Dyn), qui est sous contrôle activateur de la dopamine via le récepteur D1,
augmente alors que le niveau d’expression de la préproenképhaline (PPA), sous contrôle
inhibiteur de la dopamine via le récepteur D2 baisse.
Chez ces mutants, la tyrosine hydroxylase striatale est abaissée de 90%, mais son
activité de synthèse est multipliée par 2, néanmoins la dopamine intracellulaire et sa libération
sont réduites de 95% et 75% respectivement. En réponse à la hausse de dopamine
extracellulaire, la densité des récepteurs dopaminergiques D1 et D2 est diminuée d’environ
50% dans le striatum (Giros et al., 1996; Fauchey et al., 2000). En revanche la densité des
récepteurs D3 est augmentée (Fauchey et al., 2000; Weiss et al., soumis). Des travaux
électrophysiologiques et biochimiques ont démontré que le couplage fonctionnel des
autorécepteurs D2/D3 était perdu dans la substance noire et l’aire tegmentale des souris KO
(Jones et al., 1999). Par ailleurs, il a été montré que les transcrits de la préproenképhaline A,
44
sous le contrôle inhibiteur de la dopamine via le récepteur D2 sont réduits, alors que ceux de la
dynorphine, régulés positivement par la dopamine via le récepteur D1 sont augmentés, ceci
malgré la baisse de densité observée pour ces deux récepteurs (Gainetdinov et al., 1999a). Par
conséquent, l’ensemble de ces données est en faveur d’une hyperdopaminergie, tout au moins
dans le striatum des souris DAT KO.
•
Caractérisation comportementale
D’un point du vue physiologique, la délétion du DAT entraîne un changement de
libération des hormones hypophysaires (hormone de croissance et prolactine ; Bosse et al.,
1997) qui pourrait être responsable de la croissance altérée des souris, inférieures de 30% en
taille et en poids comparées aux sauvages, de l’incapacité des femelles homozygotes à allaiter
leurs petits et de la perturbation du comportement maternel (Giros et al., 1996). On note
également un fort taux de mortalité péri-sevrage chez les KO, probablement dû à un défaut de
motilité intestinale.
Au point de vue comportemental, ces souris présentent une importante hyperlocomotion
spontanée accompagnée de stéréotypies marquées, ainsi qu’une hyperlocomotion en réponse
à la nouveauté (Giros et al., 1996; Gainetdinov et al., 1999a; Spielewoy et al., 2000). Aucune
habituation locomotrice n’est observée chez ces souris après exposition journalière au même
environnement (Spielewoy et al., 2000). L’hyperlocomotion peut être réversée par inhibition de
la synthèse de dopamine ou blocage des récepteurs dopaminergiques (halopéridol et
clozapine). Ces mutants sont toujours capables de s’auto-administrer de la cocaïne (Rocha et
al., 1998), qui induit une augmentation de libération de dopamine au niveau du noyau
accumbens mais pas au niveau du striatum (Carboni et al., 2001).
D’un point de vue cognitif, les souris mutantes révèlent des déficits dans un test de
labyrinthe à 8 bras avec augmentation des erreurs de persévération (Gainetdinov et al., 1999b),
mais pas de déficit d’apprentissage de type associatif dans des tests de discrimination olfactive
(Rodriguiz et al., 2004). En revanche, elles présentent un fort déficit d’apprentissage associatif
dans le test du labyrinthe aquatique de Morris et des performances quasi-normales dans la
version spatiale de ce test, avec toutefois un important retard d’apprentissage (Morice et al.,
soumis). D’autre part, les animaux DAT KO présentent une altération de l’inhibition du réflexe
de sursaut (PPI), utilisé comme marqueur d’un déficit d’intégration sensorimotrice (Ralph et al.,
2001), ainsi qu’une diminution de la latéralisation « pattuelle » (Morice et al., 2005), reflétant
probablement des déficits cognitifs. Enfin, ces souris sont plus réactives et montrent plus de
comportements agressifs envers leurs congénères (Rodriguiz et al., 2004).
45
b/ Un modèle pour la schizophrénie ?
La schizophrénie se manifeste par des symptômes productifs (délires, hallucinations) et
déficitaires (retrait social, anhédonie), ainsi que des déficits cognitifs. L’étiologie de cette
pathologie est complexe, incluant des composantes génétique et environnementale, et peu
connue encore à l’heure actuelle (pour une description plus détaillée de la schizophrénie, voir
Partie II). Plusieurs hypothèses ont été proposées, dont l’hypothèse dopaminergique, selon
laquelle l’hyperactivité du système dopaminergique ou une sensibilité accrue à la dopamine
serait responsable des symptômes des schizophrènes. Une diminution de la transmission
glutamatergique est également suspectée dans cette maladie.
Les souris DAT KO, à l’instar d’autres modèles animaux, reproduisent certains traits de
la schizophrénie, à savoir une hyperactivité, des stéréotypies, un déficit du filtrage sensorimoteur et des déficits cognitifs, améliorés par des neuroleptiques (Giros et al., 1996;
Gainetdinov et al., 1999a; Ralph et al., 2001 ; Morice et al, soumis). L’hyperactivité des souris
peut être augmentée par l’administration d’antagonistes des récepteurs glutamatergiques
NMDA (Gainetdinov et al., 2001b), reflet d’une hypoglutamatergie probable et inhibée par des
neuroleptiques (Spielewoy et al., 2000). Ces animaux présentent également un défaut de
latéralisation pattuelle (Morice et al., 2005) qui pourrait être mis en relation avec une
augmentation probable de l’ambidextrie chez les schizophrènes, bien que celle-ci soit discutée
(Dragovic and Hammond, 2005). Par imagerie, il a également été montré une perte de
l’asymétrie hémisphérique de la liaison au DAT au niveau du striatum des schizophrènes non
traités (Hsiao et al., 2003). Toutefois, d’autres comportements ne corrèlent pas avec ceux
retrouvés chez les patients schizophrènes. Ainsi, ces souris ne présentent pas de
comportements reproduisant la symptomatologie négative de la schizophrénie comme un
déficit d’interactions sociales (Spielewoy et al., 2000). D’autre part, l’administration de
psychostimulants, qui exacerbe les réactions psychotiques chez les patients, provoque un effet
calmant paradoxal chez les souris DAT KO (Gainetdinov et al., 1999b).
En résumé, les souris DAT KO peuvent représenter un modèle suffisamment pertinent
pour étudier certains aspects de la schizophrénie (Gainetdinov et al., 2001a) même si aucune
étude clinique n’a réussi à montrer une association entre les marqueurs du gène du DAT et la
schizophrénie (Bodeau-Pean et al., 1995; Persico and Macciardi, 1997; Gamma et al., 2005).
c/ Un modèle pour l’ADHD ?
Comme mentionné précédemment, des études de méta-analyse ont conclu à une
association non significative entre un polymorphisme du gène du DAT et l’ADHD (Li et al.,
2006). Cependant, les souris DAT KO montrent plusieurs comportements caractéristiques de
46
l’ADHD comme l’hyperactivité spontanée et liée à la nouveauté, des déficits cognitifs et une
réponse calmante paradoxale des psychostimulants, amphétamine et méthylphénidate. Ces
souris constitueraient donc un très bon modèle pour reproduire certains symptômes de l’ADHD,
même si l’étiologie, à savoir le dysfonctionnement du DAT, n’est peut être pas la cause primaire
de cette pathologie.
C/ DAT et protéines partenaires
1/ La protéomique : définition et intérêt
Le séquençage systématique des génomes ainsi, que le développement d’outils
analytiques ont permis de faire émerger la « protéomique », domaine qui regroupe plusieurs
technologies ayant pour objectif d’étudier la nature, la fonction et les interactions protéiques à
l’échelle d’une cellule entière, voire d’un organisme entier. Les protéines forment des réseaux
d’interaction dynamiques, au sein desquels elles interagissent et se régulent entre elles. La
protéomique envisage l’étude à grande échelle des interactions protéine-protéine ou de
complexes afin d’établir une carte d’interactions protéiques (« interactome »). En effet, une
seule protéine peut interagir avec différents partenaires sous différentes conditions, ce qui
résulte en diverses réponses biologiques, dépendant du partenaire. Ainsi, la connaissance d’un
interactome est d’un intérêt capital pour la compréhension des mécanismes moléculaires
intervenant dans le fonctionnement cellulaire normal et pathologique.
2/ Principe du double-hybride
En 1989, Fields et Song introduisent une nouvelle technique, nommée double-hybride,
permettant d’étudier les interactions directes entre deux protéines. Cette méthode génétique est
basée sur la structure modulaire des facteurs de transcription eucaryotes. Généralement, ces
facteurs ont deux domaines fonctionnels distincts : le domaine liant l’ADN (DBD : DNA Binding
Domain), qui se lie à des séquences spécifiques d’ADN et le domaine activateur (AD : Activator
Domain), qui active la transcription. Ces deux modules peuvent être séparés et échangés d’un
facteur de transcription à un autre sans altérer leurs fonctions. Le système du double-hybride
47
en levure repose sur trois composants de base (figure 11) : 1/ un vecteur appât, exprimant
une protéine connue en fusion avec le DBD, comme GAL 4 ou LexA ; 2/ un vecteur proie,
exprimant l’ADNc d’une protéine, souvent issu d’une banque génomique, en phase avec AD ; 3/
des vecteurs rapporteurs permettant l’expression de gènes rapporteurs (gènes dont
l’expression peut être facilement détectable ou mesurable) en aval des séquences liant le DBD.
Ces vecteurs, le plus souvent intégrés au génome de la levure, portent les gènes lacZ pour une
sélection par la couleur et/ou des marqueurs d’auxotrophie, LEU2, HIS3, ou ADE2 (la levure est
alors incapable de métaboliser ces acides aminés essentiels pour sa survie) pour une sélection
par la croissance.
Figure 11 : Le système du double-hybride en levure
D’après Cho et al., 2004.
La protéine appât (X), fusionnée au domaine de liaison à l’ADN (DBD) et la protéine
proie (Y), en fusion avec le domaine activateur de la transcription (AD) sont co-exprimées dans
le noyau d’une cellule de levure contenant des gènes rapporteurs. (A) Lorsqu’il y a interaction
entre les protéines proie et appât, le facteur de transcription est reformé, permettant la
transcription des gènes rapporteurs, ce qui engendre une coloration ou la pousse de la levure
sur milieu sélectif. (B) Si la proie n’interagit pas avec l’appât, il n’y a pas de transcription des
gènes rapporteurs et la levure est incapable de se colorer ou de croître sur milieu sélectif.
48
Les vecteurs contenant l’appât et la proie peuvent être transformés (introduits) dans des
levures haploïdes de signe sexuel différent, qui vont par la suite être conjuguées, ou bien cotransformées dans la même cellule de levure. L’activation de la transcription d’un gène
rapporteur n’intervient que lorsqu’il y a interaction directe entre les protéines proie et appât dans
le noyau de la levure.
Deux méthodes existent : la méthode à « puce » (« array ») et la méthode « criblage de
banque » (figure 12, voir Cho et al., 2004). Dans la première, une souche de levure haploïde
exprimant la protéine appât est conjuguée individuellement avec une puce contenant des
cellules de signe sexuel opposé, portant de nombreuses proies différentes. Les interactions
sont analysées par croissance sur milieu sélectif en plaque de 96 puits. Dans la deuxième
méthode, plusieurs souches de protéines proies sont réunies pour créer une banque et
conjuguées avec un jeu de souches appâts. Les colonies positives sur milieu sélectif sont
sélectionnées et les vecteurs proies sont séquencés afin de déterminer la séquence codante de
chaque insert d’ADNc.
Figure 12 : Stratégie de double-hybride à grande échelle.
D’après Cho et al., 2004.
49
3/ Avantages et limites
Le double-hybride présente l’avantage de pouvoir étudier, relativement facilement et de
façon peu onéreuse, l’interaction de protéines inconnues, à partir d’une banque d’ADNc, qui
peuvent ensuite être facilement extraits et séquencés. L’expérience d’interaction a lieu in vivo,
au sein de levures vivantes, et l’interaction entre des protéines peu abondantes ou ayant un
degré d’interaction faible ou transitoire peut néanmoins être détectée. Cette technique à grande
échelle a permis d’analyser les interactions protéiques au sein de plusieurs organismes comme
Saccharomyces cerevisiae (Uetz et al., 2000; Ito et al., 2001), Caenorhabditis elegans (Walhout
et al., 2000; Boulton et al., 2002), Helicobacter pylori (Rain et al., 2001) et Vaccina virus
(McCraith et al., 2000).
Toutefois, cette technique est également connue pour donner une grande proportion
(environ 50%) de clones faux positifs, dont l’interaction n’est pas retrouvée avec d’autres
techniques ou n’a pas lieu physiologiquement. Ceci est dû aux propriétés intrinsèques de la
technique du double-hybride, qui force les protéines appâts et proies à être localisées ensemble
au sein du noyau de la levure. Une autre contrainte de cette technique est que les protéines de
fusion doivent rester solubles. Les protéines à domaines transmembranaires hydrophobes sont
donc généralement sous-représentées puisqu’elles ont tendance à précipiter. D’autre part, il
peut y avoir un mauvais arrangement protéique, entraînant une instabilité de la protéine de
fusion. Des interactions protéiques peuvent ne pas être détectées lorsqu’elles requièrent des
modifications post-traductionnelles (glycosylations ou phosphorylations). Il arrive également que
des protéines appât soient auto-activatrices, activant directement la transcription du gène
rapporteur, ou bien que certaines protéines se lient de manière non spécifique avec plusieurs
autres.
Il s’avère donc essentiel de confirmer l’interaction trouvée par d’autres techniques (coimmunoprécipitation, pull-down, immunofluorescence, hybridation in situ,...).
4/ Les partenaires identifiés du DAT
Etant donnée l’implication des transporteurs plasmiques dans la fonction de
neurotransmission, la réponse aux drogues et les maladies psychiatriques, la protéomique a
rapidement été appliquée à l’identification de leurs nombreux partenaires moléculaires. Depuis
six ans, principalement par double-hybride, plusieurs protéines ont été identifiées comme
50
interagissant directement avec les extrémités cytoplasmiques du DAT et régulant sa fonction
(pour revue, voir Torres, 2006).
a/ Interaction directe avec l’extrémité carboxy-terminale du DAT
•
PICK1 (protein interacting with C kinase 1)
En choisissant comme appât la partie C-terminale du DAT humain (Glu578-Val620),
Torres et collaborateurs (2001) ont criblé une banque d’ADNc de cerveau humain et ont obtenu
environ 20 millions de transformants, dont 3 clones positifs codant pour la phase ouverte de
lecture entière de la protéine PICK1. Cette protéine contient un domaine PDZ (Post synaptic
density 95/ Discs large/ Zona occludens-1) dans sa partie amino-terminale, qui est essentiel
pour la liaison, la co-localisation synaptique et l’agrégation des récepteurs glutamatergiques
AMPA (Xia et al., 1999) et de canaux ioniques à la synapse (Kim and Sheng, 2004). La
mutation de ce domaine PDZ abolit l’interaction avec le DAT, révélant que ce domaine est
également nécessaire à l’interaction avec le transporteur. La séquence responsable de
l’interaction au niveau du hDAT a été localisée à son extrémité C-terminale (résidus lysineleucine-valine 618 à 620), constituant un site de liaison au domaine PDZ. Transfecté dans des
neurones dopaminergiques, un mutant de ce site est incapable d’avoir une localisation correcte,
suggérant que PICK1 pourrait être important pour l’adressage du DAT au niveau des
terminaisons synaptiques (Torres et al., 2001). D’autres séquences semblent aussi nécessaires
(Bjerggaard et al., 2004). La co-transfection de DAT et de PICK1 dans des cellules HEK-293 a
permis de montrer que les deux protéines co-localisaient en agrégats à la membrane
plasmique. Par des expériences de biotinylation de surface, Torres et collaborateurs (2001) ont
démontré que l’expression du DAT à la membrane était augmentée, ce qui se traduisait par une
plus forte capacité de transport de la dopamine (Vmax multipliée par 2). Etant donné que PICK1
a initialement été identifiée comme une protéine liant la protéine kinase C, il est probable que
l’internalisation du DAT due à cette protéine kinase puisse être régulée par PICK1.
Notons que PICK1 interagit également avec le NET et, au vu de la grande homologie de
séquence avec le DAT, PICK1 a probablement les mêmes fonctions avec cet autre transporteur
(Torres et al., 2001).
•
Hic 5
En 2002, une deuxième protéine interagissant avec l’extrémité C-terminale du DAT a été
identifiée (Carneiro et al., 2002). Il s’agit de la protéine Hic 5 qui appartient à la famille des
protéines d’adhésion focales, protéines adaptatrices contenant des domaines LIM (Lin-11, Isl-1,
51
Mec-3 ; Thomas et al., 1999). L’interaction est médiée par la portion amino-terminale de
l’extrémité C-terminale du DAT (571-580) et la région à domaines multiples LIM de Hic 5.
Exprimée en cellules, Hic 5 réduit l’activité de transport du DAT (30%) en diminuant son
expression à la membrane. Les auteurs ont vérifié que Hic 5 et DAT sont co-localisés dans des
neurones dopaminergiques en culture et ont co-immunoprécipité les deux protéines à partir de
lysats striataux (Carneiro et al., 2002). A ce jour, la signification physiologique de cette
interaction n’est pas encore élucidée, mais il a été montré que Hic 5 interagissait également
avec le NET et, dans une moindre mesure, avec le SERT.
•
Alpha-synucléine
Lee et collaborateurs (2001a) ont utilisé la technique du double-hybride pour tester
l’interaction hDAT-alpha-synucléine. Cette protéine, enrichie au niveau des terminaisons, est
retrouvée dans les plaques amyloïdes de la maladie d’Alzheimer et se trouve être le principal
composant des corps de Lewy, corps d’inclusions intraneuronaux caractéristiques de la maladie
de Parkinson. Des formes mutées de l’alpha-synucléine ont également été liées à des cas
familiaux de cette dernière maladie. Cette protéine largement étudiée, qui appartient à la famille
du gène synucléine (comprenant également les formes β et γ), est composée de trois domaines
modulaires : une extrémité N-terminale en hélice alpha, un domaine β-amyloïde codant pour le
composant non-Aβ (NAC) des plaques amyloïdes de la maladie d’Alzheimer et une extrémité Cterminale acide. Cette structure lui permet d’exister sous une forme native non repliée ou sous
une forme d’hélice alpha en présence de phospholipides, impliquant une régulation dynamique
selon le milieu cellulaire local (Davidson et al., 1998). La fonction de cette protéine est encore
inconnue à ce jour, mais plusieurs études suggèrent qu’elle joue un rôle dans la maturation et la
maintenance des synapses (George, 2002), ainsi que dans l’organisation des composants
membranaires, où elle interviendrait dans les processus de synthèse, maintenance et fusion
des vésicules présynaptiques (Madine et al., 2006).
L’interaction a lieu entre le domaine NAC (résidus 58-107) de l’alpha-synucléine et les
22 derniers acides aminés de l’extrémité C-terminale du DAT (Glu598-Val620 ; Lee et al.,
2001a; Wersinger and Sidhu, 2003). Cette interaction a été confirmée par des expériences de
co-immunoprécipitation (Wersinger and Sidhu, 2003; Wersinger et al., 2003). En revanche, ces
auteurs observent une inhibition du transport de dopamine (35%) associée à une diminution
d’expression à la surface du DAT, après co-transfection du transporteur et de l’alpha-synucléine
dans diverses lignées cellulaires, contrairement à ce qui avait initialement été décrit par Lee et
son équipe (2001). Récemment, Wersinger et Sidhu (2005) ont démontré qu’une dissociation
du réseau de microtubules, au sein de cellules co-transfectées ou de neurones
52
mésencéphaliques, reversait l’inhibition de transport du DAT induite par l’alpha-synucléine,
entraînant une augmentation de l’activité du transporteur. Toutefois, des souris invalidées pour
les deux formes de synucléine, α- et β-, ont des niveaux normaux de capacité de transport de
dopamine, indiquant que peut être l’isoforme γ serait capable d’interagir avec le DAT et de
compenser la perte de la forme α (Chandra et al., 2004).
Ajoutons qu’il a été montré récemment, par co-immunoprécipitation, que l’alphasynucléine était aussi capable d’interagir avec le SERT par son domaine NAC, ce qui conduit,
tout comme l’interaction avec le DAT, à une diminution de l’activité et de l’expression
membranaire du transporteur (Wersinger et al., 2006).
b/ Interaction directe avec l’extrémité amino-terminale du DAT
•
RACK1 et syntaxine 1A
Par la technique de double-hybride, Lee et collaborateurs (Lee et al., 2004) ont identifié
une interaction entre l’extrémité N-terminale du hDAT (résidus 1-65) et les protéines RACK1
(Receptor for Activated C Kinases) et syntaxine 1A.
RACK1 a été décrite comme une protéine intervenant dans les signaux médiés par la
protéine kinase C, facilitant l’ancrage de molécules de protéine kinase C activées à la
membrane près de leurs substrats (Ron et al., 1994). Cependant, RACK1 interagit avec de
nombreuses autres protéines (voir Schechtman and Mochly-Rosen, 2001; McCahill et al.,
2002). Toutes ces interactions ne dépendent pas de la stimulation de la protéine kinase C,
suggérant que RACK1 pourrait faciliter la formation de signaux complexes en réponse à des
stimuli distincts.
La syntaxine 1A est un membre de la famille des protéines SNARE (soluble Nethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor), impliquées dans la fusion des
vésicules synaptiques à la membrane plasmique engendrant la libération du neurotransmetteur.
Il a été montré que la syntaxine 1A inhibait le transport de GABA et de noradrénaline (Horton
and Quick, 2001; Sung et al., 2003; Wang et al., 2003a). Dans les deux cas, l’interaction de la
syntaxine 1A avec le transporteur semble être un régulateur positif de l’expression du
transporteur à la membrane et un régulateur négatif de son activité. Etant donnée la grande
homologie de séquence entre le DAT et le NET, on peut supposer que la syntaxine 1A a des
effets similaires sur la régulation du DAT. La syntaxine 1A interagit également avec le
transporteur de la glycine GLYT-2 et contrôlerait spécifiquement l’arrivée du transporteur à la
surface membranaire (Geerlings et al., 2001). D’autre part, l’immunoprécipitation de lysats de
synaptosomes de cerveau de rat, à l’aide d’un anticorps anti-DAT, résulte en la co-précipitation
53
de la syntaxine 1A et de RACK1, suggérant que ces trois protéines forment un complexe qui
pourrait médier la phosphorylation du DAT par la protéine kinase C et ainsi réguler son trafic.
c/ Autres interactions
•
Protéine kinase C (PKC)
Comme décrit plus haut (voir chapitre 6/ Processus de régulation), de nombreuses
études ont montré que l’activation de la PKC provoquait la redistribution membranaire du DAT
et jouait un rôle dans l’efflux de dopamine induit par l’amphétamine. Johnson et collaborateurs
(2005) ont démontré qu’un complexe DAT-PKC était nécessaire pour maintenir cet efflux.
Certaines isoformes de PKC (PKC-βI et PKC-βII) co-immunoprécipitent avec la partie Nterminale du DAT à partir de membranes striatales de rat. Toutefois, à l’heure actuelle, on
ignore si cette interaction est directe ou nécessite la présence d’une autre protéine.
•
Protéine phosphatase 2A (PP2A)
De même que la PKC, l’incubation de cultures cellulaires avec l’acide okadaique et la
calyculine A, inhibiteurs des protéines phosphatases PP1 et PP2A, provoque la diminution de la
quantité des transporteurs des monoamines, dont le DAT (Huff et al., 1997; Vaughan et al.,
1997). Par immunoprécipitation de synaptosomes de rat, Bauman et collaborateurs (Bauman et
al., 2000) ont montré que hDAT et la sous-unité catalytique de la PP2A formaient un complexe
protéique. En contrôlant l’état de phosphorylation du transporteur, cette phosphatase pourrait
jouer un rôle dans le trafic du DAT, bien que l’on on ne sache pas si cette protéine interagit de
façon directe avec le DAT.
•
Autres protéines
Récemment, Maiya et Mayfield (2004) ont développé une stratégie différente du doublehybride, basée sur l’immunoprécipitation sélective de protéines interagissant avec le DAT, en
utilisant un anticorps dirigé contre la partie N-terminale du transporteur. Les protéines coprécipitées à partir de striatum de souris sont ensuite identifiées par spectrométrie de masse.
Vingt protéines ont été identifiées, dont 5 validées par des expériences d’immunoprécipitation et
de western-blot (synapsine I, dynamine I, canal potassium Kv2.1, Brca2 et neurocam).
54
En conclusion, ces différentes études ont permis d’identifier les premières molécules
interagissant avec le DAT (figure 13). A terme, l’objectif de ces études est d’identifier toutes les
protéines interagissant de près ou de loin avec le DAT, susceptibles de réguler sa synthèse,
son assemblage, son adressage, son trafic et ses propriétés fonctionnelles. Ensuite, il faudra
s’attacher à comprendre la régulation spatiale et temporelle de ces interactions et voir si
certains défauts d’interaction peuvent être responsables de dysfonctions du système
dopaminergique retrouvées dans diverses pathologies.
Figure 13 : Schéma des interactions démontrées entre le DAT et différentes protéines.
La syntaxine 1A (Syt) et RACK1 se lient à l’extrémité N-terminale du DAT tandis que l’alphasynucléine (Syn), PICK1 et Hic 5 lient l’extrémité C-terminale. Les interactions entre DAT et
PKC ou PP2A peuvent être directes ou nécessitent d’autres protéines. Vingt autres
protéines partenaires du DAT ont été décrites (Maiya and Mayfield, 2004). D’après Torres,
2006.
55
MATERIELS ET METHODES
56
Partie 1- Matériels et Méthodes
1/ Double-hybride
•
Crible initial Hybrigenics
Fabrication de banques de proies d’ADNc
Cette étape a été réalisée par la société Hybrigenics (contrat de collaboration de
recherche 01 015A10 INSERM/Hybrigenics). Deux banques d’ADN complémentaires (ADNc)
ont été construites à partir d’ARN totaux extraits de cerveaux de rats adultes : une banque
d’hippocampe et une banque de cerveau postérieur comprenant les noyaux monoaminergiques (substance noire, aire tegmentale ventrale, raphé, locus coeruleus). Il s’agit de
banques de type « random-primed », dont la synthèse est réalisée à partir d’amorces
dégénérées aléatoires. Ces ADNc sont sous-clonés dans un vecteur navette pP6, en fusion
avec le domaine d’activation du facteur de transcription de levure LexA.
Fabrication du vecteur appât
Cette étape a été réalisée avant mon arrivée au laboratoire. Brièvement, les
extrémités N-terminale (1-66) et C-terminale (574-619) de l’ADNc du rDAT ont été amplifiées
par PCR à l’aide d’amorces spécifiques contenant les sites de restriction SpeI et PacI. Le
fragment SpeI-EcoRI a été sous-cloné dans le vecteur pB6, en fusion avec le domaine de
liaison à l’ADN GAL4 et vérifié par séquençage.
Crible double-hybride
Le crible a été réalisé par la société Hybrigenics, selon le protocole établi par Rain et
collaborateurs (Rain et al., 2001). L’appât et la banque sont transformés dans deux souches
haploïdes de signe sexuel opposé qui sont ensuite conjuguées dans des conditions
permettant une couverture exhaustive de la banque (5x107 d’interactions testées). Le gène
rapporteur utilisé étant HIS3, les diploïdes obtenus sont sélectionnés sur milieu déplété en
histidine. L’ADN des clones positifs est isolé des colonies de levure, transformé en bactéries
et analysé par restriction enzymatique et séquencé. Les séquences sont alignées pour
construire des contigs (clones chevauchant ou identiques) et soumises à une recherche sur
des banques de données (BLAST).
•
Validation des interactions
Construction des vecteurs
Les appâts et les proies clonés en vecteurs pB6 et pP6 ont été sous-clonés en
vecteurs pLEX12 et pGAD3S2X, entre les sites d’insertion EcoRI et XhoI.
L’ADNc de l’alpha-synucléine de rat (rsyn1) a été obtenu par PCR à partir d’une banque
d’ADNc d’hippocampe de rat, à l’aide des amorces suivantes :
rSYN1-EcoRI-S : GAATTCGAGCCGTGTGGAGCAAAGATA
rSYN1-HdIII-AS : AAGCTTTGCAACGACATTCTTAGGCTT
Ce fragment a ensuite été cloné entre les sites EcoRI et HindIII des différents vecteurs pB6,
pP6, pLEX12 et pGAD3S2X.
Transformation des levures
Les levures utilisées sont de souches L40 et AMR70 (système LEXA) ou CG1945 et
YHGX13 (système GAL4) et sont cultivées en milieu YPDA (2% glucose, 1% extrait de
levure, 2% polypeptone et 20 mg/mL adénine hémisulfate). Les levures sont rendues
compétentes par traitement à l’acétate de lithium (LiAc), puis transformées avec l’ADN
plasmidique par incubation avec du polyéthylène glycol (PEG3350) et choc thermique. Après
transformation, les levures sont étalées sur milieu sélectif et cultivées à 30°C pendant 2-3
jours.
57
Conjugaison et tests d’activité
Les levures de chaque souche sont conjuguées durant la nuit à 30°C en milieu liquide
YPDA, puis étalées sur milieu sélectif le lendemain et cultivées pendant 1 à 3 jours.
Les levures sont testées pour leur activité β-galactosidase (β-gal) : après lyse à l’azote
liquide, les levures sont incubées dans un tampon Z (β-mercaptoéthanol 0,3% ; X-Gal 1%)
4h à 30°C, la réaction étant arrêtée par addition de carbonate de sodium 1M. Les colonies
exprimant la β-gal donnent une coloration plus ou moins bleue.
Parallèlement, les levures sont testées pour leur croissance sur milieu solide dépourvu
d’histidine en présence ou non de 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT ; 2 mM).
Les couples pLEX Ras/pGAD RBD et pGBKT7-53/pGADT7-T (Clontech) ont été utilisés
comme témoins positifs.
2/ Western Blot
Extraction des protéines de levure
Les culots de colonies fraîches de levures sont resuspendus dans 300 μl de tampon
Laemmli (SDS 2%, DTT 100mM, Tris HCl 60 mM pH 6,8, glycérol 10%) et 400 μl de billes
de verre (0,5 mm ; Sigma-Aldrich). Les levures sont vortexées et chauffées à ébullition, puis
centrifugées 10 min à vitesse maximale pour conserver le surnageant.
Western Blot
Les extraits protéiques (25 μl) sont déposés sur gel NuPAGE 10% Bis-Tris
(Invitrogen). Après migration (1h à 200V), les protéines sont transférées sur membrane de
nitrocellulose (Invitrogen) et colorées au rouge ponceau afin de vérifier le transfert. Après 1h
de blocage des sites non spécifiques dans une solution de PBS-tween 0,1%-lait en poudre
5%, la membrane est incubée avec l’anticorps anti-LexA de lapin (Invitrogen, 1/5000) 1h à
température ambiante, rincée par du PBS-tween 0,1%-lait 5%, puis incubée 1h à
température ambiante avec un anticorps IgG anti-lapin couplé à la péroxydase HRP (Sigma).
La révélation s’effectue à l’aide du kit ECL Plus (GE Healthcare).
3/ Culture cellulaire
Des cellules HEK293 (Human Embryonic Kidney 293) ont été cultivées en flasque
T75, dans un milieu DMEM (Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium ; Invitrogen) contenant
10% de FBS (Fetal bovine Serum) préalablement inactivé à la chaleur et 2mM de Lglutamine dans une étuve maintenue à 37°C sous atmosphère 95% O2/ 5% CO2.
Transfection cellulaire
Le jour précédant la transfection, les cellules HEK293 sont repiquées dans des boîtes
de 10 cm de diamètre. Les cellules sont transfectées à l’aide du Fugene 6 (Roche), avec 18
à 24 μg d’ADN total de plasmide. Le jour suivant, les cellules sont réparties en plaque de 24
puits à raison de 200 000-250 000 cellules par puits.
Transport de [3H]-dopamine
Les expériences de capture de [3H]-dopamine sur cellules ont été réalisées comme
décrit précédemment (Giros et al., 1992). 48h après transfection, le milieu est aspiré et les
puits sont rincés avec 0,4 ml de tampon de transport (Tris Base 5 mM, HEPES 7,5 mM, NaCl
120 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 1,2 mM, MgSO4 1,2 mM, acide ascorbique 1 mM, glucose 5
mM, pH 7,4). Les cellules sont préincubées en triplicats avec des concentrations croissantes
de dopamine froide (0,09 à 300 μM) avant addition de 15 nM [3H]-dopamine (50 μl ; 41-52
58
Ci/mmol ; GE Healthcare) et incubées 10 mn à 37°C dans un volume final de 0,6 ml. Le
transport non spécifique de [3H]-dopamine est défini en présence de 10 μM de nomifensine.
Les puits sont rincés trois fois avec 0,5 ml de tampon de transport à 4°C, les cellules sont
solubilisées avec 0,5 ml de NaOH 0,1M et collectées pour mesurer la radioactivité
incorporée à l’aide d’un compteur à scintillation liquide. La détermination de la cosntance de
Michaelis (Km) et de la vitesse maximale de transport (Vmax) est réalisée à l’aide du logiciel
GraphPad Prism.
4/ Animaux
Des rats Sprague Dawley (Charles River) et des souris C57BL/6 sauvages ou DAT
KO (Giros et al., 1996) âgés d’environ 3 mois ont été utilisés pour l’ensemble des
expériences décrites ci-dessous.
Coupes au cryostat
Les animaux sont sacrifiés par guillotine ou dislocation cervicale, leur cerveau
rapidement extrait et congelé dans de l’isopentane à -30°C, puis conservé à -80°C. Pour
l’immunofluorescence, les animaux sont perfusés avec du paraformaldéhyde (PAF) 4% et
leurs cerveaux cryoprotégés dans du sucrose puis enrobés de gélatine et congelés comme
mentionné ci-dessus. Des coupes frontales ou horizontales (10 μm) sont ensuite réalisées à
l’aide d’un cryostat Leica CM3050S, montées sur lames SuperFrost Plus et conservées à 80°C. Le jour de l’utilisation, les coupes sont fixées dans du formaldéhyde 3,7% pendant 1h
à température ambiante, lavées 2 x 5 mn dans du PBS1X, rinçées rapidement dans de l’eau
ultra-filtrée, puis déshydratées dans des bains successifs d’éthanol à 50%, 70% et 100%.
5/ Hybridation in situ
Marquage des sondes
Des oligonucléotides antisens complémentaires des gènes d’intérêt (DAT, Sh2bp1,
synucléine 1) d’environ 45 paires de bases sont rendues radioactives à leur extrémité 3’ par
du [γ-35S]-dATP (1000 Ci/mmol-20uCi ; GE Healthcare) dans les conditions suivantes : 30 ng
d’ADN, tampon TdT Proméga (1X), enzyme terminal déoxytransférase (TdT ;10U), [γ-35S]dATP (1 μl ;10mCi/ml) dans un volume final de 20 μl sont incubés à 37°C pendant 45 mn. La
réaction est arrêtée par l’addition de 5 μl d’EDTA à 0,5 M et purification sur colonnes P10
Biogel (résine Biogel P10, Biorad). Du DTT (100mM) est ajouté comme antioxydant.
L’activité spécifique finale des oligonucléotides marqués est d’environ 5x106 cpm/μg.
Nom
DAT
Sh2bp1-1
Sh2bp1-2
Msyn1
Msyn2
Msyn3
Séquence
5’-GCTGTTGTGAGGTGGCCCAGCTGGCAGCTGTCTCCTTCCACTTTA-3’
5’-GCCAGCATAGAGTAGGTGTCACTCTGTGTGGCTGGCTGTTTTAAT-3’
5’-TGACTGCACAGACTCATTGTCCGACTGCTCAGAGCCGGAGCGCCT-3’
5’-GGAACCTACATAGAGGACTCCCTCTTTTGTC-3’
5’-CTGCTGTCACACCAGTCACCACTGCTCCTCC-3’
5’-CATAAGCCTCACTGCCAGGATCCACAGGC-3’
59
Hybridation in situ
100 μl de milieu d’hybridation (tampon InSitu Hybridization Buffer, GE Healthcare,
contenant du formamide à 40%, DTT (50mM), polyA (0,5 mg/ml)) mélagés à environ 5x106
cpm de sonde sont déposés sur chaque lame et recouverts de Nescofilm. L’hybridation se
fait à 50°C pendant 15 à 18h. Les lames sont ensuite lavées 2 x 15 mn dans du SSC1X +
DTT 10 mM à 53°C, 2 x 15 mn dans du SSC 0.5X + DTT 10 mM à 53°C, puis rincées à
l’eau, déshydratées à l’éthanol 95% et exposées sur un film Biomax (GE Healthcare)
pendant 8-15 jours selon l’intensité du marquage radioactif.
6/ Immuno-autoradiographie
Les coupes de cerveau sont fixées 15 mn dans du paraformaldéhyde (PAF) 4%,
incubées 1h à température ambiante dans un tampon de blocage (BSA 3%, sérum de
chèvre 1%, NaI 0.015%, PBS 1X), puis incubés 1h avec l’anticorps anti-synucléine 1 de lapin
(α90 ; Totterdell et al., 2004). Après rinçage au PBS, les coupes sont incubées 2h avec
des [125I]-IgG purifiés (10-20 µCi/100 ml, GE Healthcare), puis rincées par du PBS, séchées
et exposées sur un film Biomax MR.
Pour les expériences d’hybridation in situ et d’immuno-autoradiographie, la
quantification du marquage radioactif est réalisée à l’aide du logiciel d’analyse MCID. Une
gamme de standards radioactifs (GE Healthcare) a été exposée sur chaque film afin de
s’assurer que les densités des différents marquages se situaient bien dans la partie linéaire
de la gamme. Les données obtenues sont ensuite soumises à une analyse de variance
(ANOVA, logiciel Statview).
7/ Immuno-fluorescence
Les coupes de cerveau de rat (10 µm) sont fixées pendant 15 mn dans du PAF 4%,
incubées 1h dans un tampon de blocage PGT (PBS, gélatine (2g/L), triton 0,25%), puis 1h
en présence d’anticorps anti-DAT (anticorps polyclonal de lapin, dirigé contre l’extrémité Nterminale du rDAT) dilué au 1/10000, ou d’anticorps anti-synucléine 1 (anticorps monoclonal
de souris, BD Biosciences Pharmingen ; dilution 1/2500). Les lames sont ensuite lavées
dans du tampon PGT et incubées 1h avec un anticorps secondaire Alexa A488 Fluor (antilapin ; dilution 1/1600 ; Molecular Probes) ou Alexa A555 (anti-souris ; dilution 1/1600 ;
Molecular Probes), puis lavées dans du PBS et recouvertes d’une lamelle avec du milieu de
montage Fluoromount G (Southern Biotech).
Pour l’immuno-fluorescence sur cellules, le tampon de blocage est composé de : BSA
1%, sérum de chèvre 1%, triton 0,1%, PBS 1X et les rinçages se font dans du PBS 1X.
Les images des coupes sont saisies par la caméra Axiocam du microscope à
fluorescence Axioscop 2 Plus (Zeiss), aux objectifs 40X et 63X.
60
RESULTATS
61
Partie 1 - Résultats
A/ Etude de partenaires potentiels du DAT
1/ Crible double-hybride
L’appât utilisé pour l’expérience de double-hybride en levure contenait l’extrémité Cterminale du rDAT (résidus 574-619) fusionnée au facteur de transcription GAL4. Le crible
réalisé par la société Hybrigenics a fourni environ 160 clones positifs. Ces clones ont été
séquencés à partir de leurs extrémités 5’ et 3’, puis alignés en vue de construire des contigs
(alignements de clones chevauchants ou identiques), dont la séquence consensus résultante
a été confrontée à une banque de données. 90 contigs ont été identifiés, chacun comprenant
un à vingt clones différents, c'est-à-dire ayant une extrémité 5’ ou 3’ distincte. Dans un
premier temps, six séquences candidates ont été sélectionnées, du fait de la présence d‘au
moins deux clones individuels différents. Finalement, à la suite d’expériences préliminaires,
seuls deux clones ont été retenus et seront abordés dans ce chapitre : il s’agit des gènes
Sh2bp1 et ACIII (figure 14).
Gène
Mus musculus
SH2 domain
binding protein 1
(tetratricopeptide
repeat
containing)
(Sh2bp1)
Rattus
norvegicus type
III adenylyl
cyclase (ACIII)
Mus musculus
SNAPassociated
protein (Snapap)
Numéro
d’accession
Nombre
de clones
Interaction
avec NET
NM_009431
18
oui
M55075
2
oui
16
oui
NM_133854
Caractéristiques
Expression ubiquitaire.
Contient des domaines
« tetratricopeptide
repeat » et SH2
Expression ubiquitaire.
Stimulée par le Ca2+;
inhibée par la CaMKII
Exprimée par les
membranes des
vésicules synaptiques.
S’associe à SNAP25.
Figure 14 : Clones sélectionnés, issus du crible double-hybride en levure dirigé contre le
rDAT.
CaMKII : Calcium Modulated Kinase II ; NET : transporteur de la noradrénaline ; SH2 :
Sarc Homology 2; SNAP25 : Synaptosome Associated Protein 25 kDa.
62
Ces séquences ont également été retrouvées dans le crible double-hybride dirigé
contre le rNET, initié au laboratoire.
On peut également noter la présence du gène Snapap, largement représenté dans
les résultats du crible (également dans celui du NET), qui s’associe à la protéine SNAP25,
appartenant elle-même au complexe SNARE, responsable de la fusion des vésicules
synaptiques à la membrane cellulaire. L’interaction DAT-SNAP25 étant en cours d’étude
dans d’autres laboratoires (Marc Caron et Michael Quick, communication personnelle), nous
avons fait le choix de ne pas l’étudier.
2/ Clones sélectionnés
a/ Sh2bp1
La protéine Sh2bp1, initialement nommée p150TSP, a été identifiée en 1996 (Malek
et al., 1996) et comprend 1173 acides aminés. Elle fait partie d’une famille de protéines
adaptatrices contenant des motifs « tetratricopeptide repeat » (TPR), composés d’une
répétition dégénérée de 34 acides aminés arrangés en tandem. Ces motifs forment des
structures en hélices α, avec peu ou pas de feuillets β. Les protéines à domaines TPR sont
impliquées dans un large spectre de fonctions cellulaires, participant notamment au contrôle
du cycle cellulaire, à la transcription, au transport des protéines et au repliement protéique.
Elles sont retrouvées dans différents organismes, incluant les bactéries, cyanobactéries,
levures, insectes, plantes et animaux (Blatch and Lassle, 1999), indiquant un très haut degré
de conservation dans l’évolution.
La protéine Sh2bp1 peut être divisée en deux régions : la partie N-terminale
contenant quinze motifs TPR et la partie C-terminale contenant un domaine SH2 (Src
homology 2). Les domaines SH2 sont des modules conservés d’environ 100 acides aminés,
liant avec une haute affinité les peptides contenant des phosphotyrosines ou des
phosphosérines/thréonine. D’après l’alignement des différents clones ressortis en doublehybride, Sh2bp1 interagit avec le DAT par cinq domaines TPR situés à son extrémité aminoterminale. Notons que cette interaction a été retrouvée par Hybrigenics dans deux types de
cribles de stringence différente : un premier crible réalisé avec l’appât DAT fusionné à un
domaine de liaison à l’ADN de type LexA, qui n’avait donné qu’une dizaine de clones au total
et le deuxième crible réalisé avec un domaine Gal4, précédemment décrit, à l’origine de 160
clones. La protéine Sh2bp1 est exprimée dans divers tissus, dont le cerveau, et notamment
retrouvée au niveau ultrastructural dans le noyau (Malek et al., 1996). Chez les eucaryotes
63
supérieurs, le rôle précis de cette protéine demeure inconnu mais sa séquence et ses
propriétés de liaison suggèrent qu’elle pourrait médier les interactions entre protéines,
notamment celles contenant des domaines TPR et/ ou SH2.
b/ ACIII
L’adénylate cyclase de type III appartient à la grande famille des adénylates cyclases
(AC),
comptant
neuf
isoformes
membranaires,
constituées
de
douze
domaines
transmembranaires et une isoforme soluble. Ces protéines jouent un rôle primordial dans la
transduction du signal cellulaire puisqu’elles transforment l’ATP (adénosine triphosphate) en
AMPc (adénosine monophosphate), sous la régulation de l’activation d’une protéine G.
L’ACIII, isolée en 1990, est constituée de 1144 acides aminés et est exprimée
majoritairement au niveau de l’épithélium olfactif (Bakalyar and Reed, 1990). D’ailleurs, les
souris invalidées pour l’ACIII (Wong et al., 2000) montrent d’importants déficits au niveau
olfactif, malgré la présence d’autres isoformes d’AC. L’ACIII est également présente dans le
cerveau, particulièrement au niveau de la substance noire, comme le montrent des
expériences de western-blot (Lane-Ladd et al., 1997). De façon intéressante, l’ACIII fait
partie des gènes dont l’expression est fortement diminuée après dégénérescence des
neurones dopaminergiques induite par la métamphétamine (Xie et al., 2002), indiquant que
cette protéine est bien exprimée par les neurones dopaminergiques. D’après le crible
double-hybride, l’extrémité N-terminale intracellulaire de l’ACIII est responsable de
l’interaction avec l’extrémité C-terminale du DAT.
3/ Etude anatomique
Pour que les interactions identifiées en double-hybride entre le DAT et les deux
clones sélectionnés puissent avoir un rôle physiologique potentiel, la première condition est
qu’elles soient co-localisées in vivo. Le crible a été effectué sur une banque de cerveau
postérieur de rat, contenant les corps cellulaires des neurones dopaminergiques, mais il est
important de vérifier si elles sont réellement exprimées par les neurones portant le DAT.
Concernant la protéine ACIII, son expression a été démontrée au niveau de la substance
noire et de l’aire tegmentale ventrale (Lane-Ladd et al., 1997). Ces données n’étant pas
disponibles pour la protéine Sh2bp1, nous avons réalisé une hybridation in situ sur coupes
de cerveau de rat à l’aide d’oligonucléotides radiomarqués, complémentaires de la séquence
de l’ARNm (figure 15). Le témoin positif a été réalisé avec une sonde spécifique du DAT.
64
DAT
Sh2bp1
SNc
ATV
SNc
ATV
Figure 15 : Répartition des ARNm du DAT et de Sh2bp1
Une expérience d’hybridation in situ des transcrits du DAT et de Sh2bp1 a été réalisée à
l’aide de sondes oligonucléotidiques marquées au 35S, sur des coupes de cerveau de rat
au niveau de la substance noire compacte (SNc) et de l’aire tegmentale ventrale (ATV).
Comme décrit précédemment, le marquage du DAT est fortement présent au niveau
de la substance noire compacte et de l’aire tegmentale ventrale, avec quelques cellules
marquées dans la substance noire réticulée. Le marquage des transcrits de Sh2bp1 apparaît
ubiquitaire, avec une expression plus dense au niveau de l’hippocampe. On peut noter la
présence des ARNm de Sh2bp1 au niveau de la SNc et de l’ATV, démontrant l’expression
de ce gène dans les régions contenant les corps cellulaires dopaminergiques et ainsi la
potentialité d’une interaction physiologique de cette protéine avec le DAT.
4/ Co-expression avec le DAT
Dans le but d’étudier un éventuel rôle fonctionnel de l’interaction DAT-Sh2bp1, nous
avons co-exprimé le transporteur et ce partenaire potentiel en système cellulaire.
a/ Capture de [3H]-dopamine
•
Résultats
Afin de savoir si l’interaction DAT-Sh2bp1 provoque un changement fonctionnel de
l’activité de transport et/ou d’affinité du DAT, nous avons effectué des expériences de
capture de [3H]-dopamine par des cellules exprimant de façon transitoire le DAT avec un
plasmide β-galactosidase (contrôle négatif) et par des cellules co-exprimant DAT et le
partenaire d’intérêt, la synucléine 1 ou Sh2bp1 (qsp β-galactosidase). Comme contrôle
positif, nous avons choisi et cloné la synucléine 1, homologue de l’alpha-synucléine humaine
65
chez le rat. Cette protéine n’est pas apparue dans notre crible, mais a été décrite comme
partenaire direct du DAT humain (Lee et al., 2001a) et engendre une diminution de sa
capacité de transport maximale (Vmax ; Wersinger and Sidhu, 2003).
Les résultats ci-dessous représentent la moyenne de la Vmax du transport par le
DAT co-exprimé avec la synucléine 1 ou Sh2bp1 (5 à 7 expériences indépendantes),
exprimée en % de la Vmax du transport de DAT seul (figure 16). On observe que
l’expression de la synucléine 1 au sein des cellules entraîne une diminution de la capacité de
transport du DAT d’environ 20%, en accord avec la baisse d’activité observée par Wersinger
et Sidhu (-35%, p<0,05 ; Wersinger and Sidhu, 2003). Cependant, cette baisse d’activité
n’est pas significative. L’expression de Sh2bp1 engendre une augmentation de la Vmax du
DAT de l’ordre de 60%, qui n’est pas significative, du fait d’une grande variabilité interexpériences.
A
B
160
-20%
140
200
120
% Vmax
+60%
250
100
150
80
100
60
40
20
0
50
DAT
DAT+ rsyn 1
0
DAT
DAT+Sh2bp1
Figure 16 : Capacité de transport moyenne de [3H]-dopamine par le DAT transfecté dans
des cellules HEK 293, co-exprimé avec la synucléine 1 (A ; rsyn1 ; n=7 expériences ;
valeur du 100% : 12120+/-4160 fmol/min/mg protéine) ou Sh2bp1 (B ; n=6 expériences ;
valeur du 100% : 15624+/-3277 fmol/min/mg protéine).
Concernant l’affinité du DAT pour la dopamine (Km ; figure 17), on observe
également des modifications non significatives, allant dans le même sens que la Vmax
lorsque le DAT est co-exprimé avec la synucléine 1 (-35%) ou Sh2bp1 (+38%). Notons que
ni la co-expression de l’alpha-synucléine (Lee et al., 2001a; Wersinger and Sidhu, 2003), ni
celle d’aucun autre partenaire du DAT rapportée dans la littérature (Torres et al., 2001;
Carneiro et al., 2002) n’affecte le Km du transporteur de manière significative.
66
A
B
+ 38%
200
% Km
160
160
120
-35%
120
60
80
40
40
0
DAT
DAT+rsyn1
0
DAT
DAT+Sh2bp1
Figure 17: Constante d’affinité moyenne du DAT pour la [3H]-dopamine co-exprimé avec
la synucléine 1 (A ; n=7 expériences ; valeur du 100% : 2,19+/-1 μM) ou Sh2bp1 (B ; n=6
expériences ; valeur du 100% : 2,72+/-0,7 μM).
•
Discussion
Nous avons obtenu une grande variabilité entre nos différentes expériences de
transport de [3H]-dopamine, ce qui se traduit par de grands écarts-types à la moyenne,
masquant des différences potentiellement significatives entre les valeurs de Vmax et de Km
testées et les valeurs contrôles.
Ceci peut être dû à plusieurs facteurs expérimentaux, intervenant à différentes étapes
expérimentales :
1/ au niveau du système cellulaire : type de cellules utilisé, nombre de passages et
état de confluence des cellules ;
2/ au niveau de la transfection transitoire : nature, qualité et quantité des plasmides
transfectés, nature et technique de transfection ;
3/ au niveau de la capture : nombre de cellules par puits, protocole de transport
(temps d’incubation,…).
A chaque étape, des précautions ont été prises afin de minimiser les risques de
fluctuation : après essai de différents types cellulaires (COS7, HEK293) et lipofectants
(Lipofectamine®, Fugene 6®), la transfection de cellules HEK293 avec le Fugene 6 a été
sélectionnée. Le nombre de passages, la confluence des cellules ont été contrôlés et les
plasmides utilisés au cours des différentes manipulations provenaient du même stock. La
transfection s’effectuait en flasque avant de répartir les cellules dans chaque puits de façon
67
homogène. Enfin, le nombre de cellules par puits ainsi que le protocole de transport utilisé
étaient les mêmes d’une expérience à l’autre.
Malgré ces précautions, il peut y avoir une grande hétérogénéité au sein des résultats
des expériences de transport. Un exemple pertinent concerne l’alpha-synucléine qui, suite à
des expériences de capture de [3H]-dopamine, a initialement été décrite comme augmentant
significativement l’activité du DAT (Lee et al., 2001a). Ce résultat a ensuite été infirmé deux
ans plus tard par Wersinger et son équipe, qui ont trouvé une baisse de la Vmax,
reproductible dans différents systèmes cellulaires, avec différents lipofectants et différentes
quantités relatives de plasmides transfectés (Wersinger et al., 2003; Wersinger and Sidhu,
2003). L’origine de ces résultats contradictoires proviendrait du type de transfection utilisé :
transfection en « bain » (« batch »), c’est-à-dire lorsque les cellules sont cultivées et
transfectées en flasque, puis subissent un traitement à la trypsine (détruisant l’adhésion
cellulaire) pour être réparties en puits, versus transfection in situ, lorsque les cellules sont
cultivées en puits et sont transfectées puits par puits (Wersinger et al., 2003). La première
méthode, expérimentée par Lee, conduirait à une augmentation de la Vmax du DAT,
contrairement à la deuxième, employée par Wersinger, qui aboutirait à une baisse de la
Vmax (Wersinger et al., 2003). En fait, il a récemment été montré que ce phénomène mettait
en jeu des éléments du cytosquelette : le traitement de cellules avec des agents
dépolymérisant les microtubules ou affectant leur dynamique engendre une augmentation
systématique de la Vmax du DAT, corrélée avec une hausse du nombre de sites du
transporteur à la surface cellulaire (Wersinger and Sidhu, 2005).
Dans notre protocole, nous avons utilisé une transfection en bain mais le décollement
des cellules a été fait par dissociation mécanique et non chimique par la trypsine. D’autre
part, sur sept expériences réalisées avec la synucléine, trois montraient une augmentation et
quatre une diminution de la Vmax du DAT. De même, sur six expériences réalisées avec
Sh2bp1, quatre montraient une augmentation de la Vmax du DAT et deux une diminution. Il
est donc possible que ce mode de transfection soit responsable de l’hétérogénéité de nos
résultats, mais seulement en partie puisque nous n’avons pas trouvé d’augmentation de la
Vmax pour la totalité de nos expériences avec la synucléine 1, par exemple. Wersinger et
son équipe ont également comparé par western-blot les quantités de protéines exprimées
par les cellules après chaque type de transfection (Wersinger et al., 2003). Il en résulte que
les cellules issues de la transfection en « bain » contiendraient beaucoup moins d’alphasynucléine alors que la densité du DAT ne serait pas altérée dans ces mêmes cellules. De
plus, la Vmax du DAT transfecté seul dans des cellules n’est pas significativement différente
68
entre les deux méthodes de transfection (bain versus puits par puits), suggérant que la
trypsine affecte spécifiquement l’expression de l’alpha- synucléine.
Dans la même logique, soulignons que la co-transfection transitoire reste une étape
difficile à maîtriser, puisque l’on ne peut être sûr de la reproductibilité de la quantité d’ADN
totale et relative (DAT/gène d’intérêt) introduite en fonction du cycle et du métabolisme
cellulaire. Une solution envisageable pour tenter de limiter ces fluctuations serait peut être
d’utiliser des lignées cellulaires exprimant le DAT de façon stable et de ne transfecter
transitoirement que le gêne d’intérêt. Cependant, il est nécessaire de bien sélectionner la
lignée stable puisque dans ce type de transfection, on ne maîtrise pas le nombre de copies
d’ADN intégré au génome et une trop forte expression du DAT pourrait masquer l’effet
fonctionnel de la molécule interactante. Ajoutons que l’endroit dans le génome où s’effectue
cette insertion n’est pas contrôlable, ce qui peut également poser problème. Enfin, tandis
que 30 à 40% des cellules sont transfectées par une technique de transfection transitoire,
toutes les cellules le sont lors de la génération des clones. Ainsi, si l’on transfecte 30% des
cellules exprimant le DAT avec un clone d’intérêt, il y aura une forte dilution de l’effet
fonctionnel, qui pourrait alors ne pas être détectable. La situation est également complexe si
l’on effectue une double transfection stable (DAT + partenaire), car, pour les raisons
énoncées ci-dessus, il sera difficile de trouver le contrôle parfaitement adapté. Enfin, pour
améliorer le taux de transfection, l’utilisation de vecteurs viraux peut être envisagée.
b/ Immuno-fluorescence
Dans le but de détecter d’éventuels changements de localisation du DAT à la
membrane, nous avons effectué des expériences d’immuno-fluorescence, à l’aide d’un
anticorps dirigé contre le DAT, sur les mêmes cultures de cellules ayant servi aux
expériences de capture.
La morphologie des cellules a tout d’abord été observée en contraste de phase afin
de vérifier la bonne intégrité des cellules transfectées (figure 18).
69
Figure 18 : Observation de la morphologie des cellules transfectées.
(A) Amas de cellules HEK293 observé en contraste de phase. (B) Cellule transfectée
par le DAT. (C) Superposition des images A et B. La cellule transfectée par le DAT
(B) fait partie de cet amas de cellules vivantes (C). Observation en microscopie à
contraste de phase (A, C) et en fluorescence (B), à l’objectif 40X. La barre d’échelle
insérée en A correspond à 10 μm.
•
Sh2bp1
Lorsque le DAT est co-transfecté avec le plasmide contrôle exprimant la ßgalactosidase, on obtient un marquage du transporteur à la fois membranaire et
cytoplasmique (figure 19). Dans des cellules co-exprimant le transporteur et Sh2bp1, le
marquage observé apparaît similaire en microscopie à fluorescence. Nous n’avons pas
décelé de différence claire de la localisation subcellulaire du DAT dans les deux conditions.
Figure 19 : Marquage du DAT par immuno-fluorescence dans des cellules HEK293 non
transfectées (A), co-transfectées avec le DAT et un plasmide ß-galactosidase (B) et cotransfectées avec le DAT et Sh2bp1 (C).
Observation au microscope à fluorescence, à l’objectif 63X ; la barre d’échelle insérée en
A représente une distance de 5 μm.
Notons que le vecteur exprimant Sh2bp1 n’exprime que le fragment cloné en doublehybride, contenant les domaines TPR et non la protéine entière, qui est peut-être nécessaire
pour exercer son effet. Des mises au point et des observations en microscopie confocale
s’avèrent nécessaires pour tirer une conclusion quant à une potentielle relocalisation du DAT
en présence de Sh2bp1. D’autre part, ne disposant pas d’anticorps dirigé contre Sh2bp1
nous n’étions pas en mesure de vérifier l’expression de cette protéine et étudier sa
70
localisation au sein de la cellule. Il serait donc utile d’exprimer cette protéine en fusion avec
un épitope, par exemple un motif FLAG, détectable par un anticorps anti-FLAG, comme nous
avons commencé à le faire dans le laboratoire.
•
Synucléine 1
Comme pour Sh2bp1, nous n’avons pas été en mesure de détecter une localisation
du DAT particulière lorsqu’il est co-exprimé avec la synucléine 1 (non montré). Disposant
d’un anticorps anti-synucléine 1, nous avons voulu tester sa spécificité sur des coupes de
cerveau de rat et tester la co-localisation de cette protéine avec le DAT. Au niveau du
striatum, le marquage du DAT (figure 20, A) est diffus au niveau des terminaisons
dopaminergiques et des varicosités le long de l’axone. Le marquage de la synucléine 1 (B)
apparaît punctiforme, en accord avec la littérature (Totterdell et al., 2004). La superposition
des deux images (C), montre une absence de co-localisation des deux protéines dans les
mêmes structures. Jusqu’à présent, l’expression de la synucléine 1 par les neurones
dopaminergiques du striatum n’a pas été formellement démontrée (Totterdell and Meredith,
2005).
Figure 20 : Immuno-fluorescence du DAT (A), de la synucléine 1 (B) sur des coupes de
striatum de rat. (C)
Superposition des deux images. Observation au microscope à fluorescence à l’objectif
63X.
5/ Interaction en double-hybride
Notre objectif était de valider les données obtenues par le crible double-hybride
réalisé par Hybrigenics avec l’extrémité C-terminale du DAT de rat. Pour cela, nous avons
testé les interactions choisies dans deux systèmes différents. Dans un premier temps, nous
avons utilisé un autre système qu’Hybrigenics (LEXA), qui ne s’est pas révélé concluant,
71
puis nous avons repris les mêmes plasmides et levures (système GAL4) afin de retrouver les
interactions.
a/ Résultats
Les différentes souches de levures L40 et AMR70 (système LEXA) ou CG1945 et
YHGX13 (système GAL4) ont été rendues compétentes puis transformées séparément avec
les plasmides appropriés (couple pLEX12/pGAD3S2X ou pB6/pP6) et ont été conjuguées
entre elles. Les levures diploïdes obtenues ont alors été testées pour leur expression de
l’enzyme β-galactosidase (β-gal), capable de métaboliser le substrat X-Gal en un composé
de couleur bleue. En parallèle, elles ont été testées pour leur croissance sur milieu dépourvu
d’histidine, en présence ou non de 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT), qui inhibe de façon
compétitive le produit du gène HIS3, de manière à sélectionner des interactions plus
stringentes. Dans les deux cas, s’il y a interaction entre les deux protéines, les résultats de
ces tests sont positifs.
La figure 21 présente une synthèse des résultats obtenus au cours de ces
différentes manipulations.
Dans la première série d’expériences, la conjugaison pLEX DAT–pGAD RBD sert de
témoin négatif puisque le DAT n’interagit pas avec le domaine liant la protéine Ras. La
conjugaison pLEX Ras–pGAD RBD sert au contraire de contrôle positif. Excepté ce contrôle
positif et malgré vérification de la qualité et de la séquence des différents plasmides, aucune
interaction n’a pu être retrouvée dans ce système. Nous avons alors interverti les séquences
d’intérêt et les plasmides, c’est-à-dire exprimé les séquences proies dans les vecteurs appât
et la séquence appât dans le vecteur proie (non montré). Mais là aussi, aucune interaction
n’est ressortie positive, ce qui nous a conduits à revenir au système ayant servi à réaliser le
crible initial.
Dans cette deuxième série de manipulations, nous avons utilisé différents contrôles
négatifs : le plasmide proie pP6 vide, le plasmide pGAD RBD et le plasmide pP6 exprimant
la protéine ribeye, qui a été retrouvée dans le crible double-hybride réalisé par le laboratoire
contre le transporteur vésiculaire des monoamines (VMAT2). Les résultats observés sont
ceux attendus, sauf pour la conjugaison du DAT avec la protéine ribeye qui a souvent donné
des colonies sur milieu dépourvu d’histidine, sans toutefois résister à l’ajout de 3-AT. Le test
β-gal est également resté négatif pour cette conjugaison. Le contrôle positif choisi pour ce
système est la conjugaison pGBKT7-53/pGADT7-T (Clontech). Dans ces expériences,
aucune interaction n’a pu être démontrée entre DAT et ACIII et DAT et synucléine 1. En
72
revanche, l’interaction directe entre DAT et la protéine Sh2bp1 a été vérifiée de manière
robuste.
Conjugaisons
Test ß-gal
milieu –HIS
milieu-HIS +3AT
pLEX DAT–pGAD RBD
_
_
NT
pLEX Ras–pGAD RBD
+
+
NT
pLEX DAT–pGAD rsyn1
_
_
NT
pLEX DAT–pGAD Sh2bp1
_
_
NT
pLEX DAT–pGAD ACIII
_
_
NT
pB6 DAT-pP6 vide
_
_
_
pB6 DAT- pGAD RBD
_
_
_
pB6 DAT-pP6 ribeye
_
+/_
_
pGBKT7-53-pGADT7-T
+
+
+
pB6 DAT-pP6 rsyn1
_
_
_
pB6 DAT-pP6 Sh2bp1
+
+
+
pB6 DAT-pP6 ACIII
_
_
_
Figure 21: Tableau représentant les résultats des interactions étudiées par doublehybride en levure.
Le signe + symbolise une coloration bleue pour le test β-gal et une croissance des
colonies sur milieu dépourvu d’histidine +/- 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT). Le signe signifie une absence de coloration bleue ou de croissance.
rsyn1 : synucléine 1 ; RBD : Ras Binding Domain. NT : Non Testé.
b/ Difficultés rencontrées
•
Choix des contrôles
- Contrôles négatifs
Nous voulions trouver une protéine n’interagissant pas avec le DAT qui soit exprimée
dans les mêmes conditions qu’une protéine partenaire. Nous avons donc choisi la protéine
ribeye, uniquement retrouvée dans le crible de VMAT2, transporteur assez différent du DAT
par sa séquence. Cependant, dans certaines expériences, une interaction a été retrouvée
entre cette protéine et le DAT. Ainsi, nous pouvons nous poser la question de savoir si cette
73
protéine peut interagir avec le DAT même si elle n’est pas ressortie dans le crible doublehybride. Pour plus de fiabilité, nous avons donc choisi de nous servir du plasmide exprimant
un domaine liant la protéine Ras (RBD) ainsi qu’un plasmide vide du système GAL4 (pP6).
- Contrôles positifs
Dans le même souci de se trouver dans des conditions expérimentales similaires et
dans le but de valider notre plasmide appât, nous avions initialement choisi la synucléine 1
comme contrôle positif. L’interaction hDAT-alpha-synucléine a en effet été démontrée par
deux groupes différents (Lee et al., 2001a; Wersinger and Sidhu, 2003). Cependant, nous
n’avons pas réussi à établir cette interaction dans les deux systèmes étudiés. Afin de valider
notre protocole, nous avons donc utilisé deux couples de plasmides pLEX Ras/pGAD RBD
et pGBKT7-53/pGADT7-T correspondant aux systèmes LEXA et GAL4, respectivement.
•
Croissance des levures
Une des difficultés rencontrées lors de ces expériences était l’hétérogénéité de
croissance observée pour les différentes conjugaisons. Les levures diploïdes ne croissaient
pas toutes avec la même densité et le même aspect. Ainsi, les levures co-exprimant DAT et
Sh2bp1 formaient de grosses colonies rosées, tandis que celles co-exprimant DAT et
synucléine 1 étaient petites et blanches. Il s’avérait donc délicat de comparer la pousse des
levures sur milieu dépourvu d’histidine et la coloration bleue après test β-gal. En vue de
mieux contrôler et de standardiser la taille des colonies, nous avons mesuré et ajusté la
densité optique de chaque colonie de levure transformée avant de procéder à l’étape de
conjugaison. Malgré ce protocole, des difficultés d’interprétation des résultats de croissance
ont persisté.
•
Gènes rapporteurs
L’utilisation de deux gènes rapporteurs différents, sous le contrôle de promoteurs
distincts permet d’éliminer beaucoup de clones faux-positifs. Les colonies qui se multiplient
le plus rapidement sur milieu dépourvu d’histidine sont souvent les interactants les plus forts.
Cependant, beaucoup de plasmides rapporteurs HIS3 montrent une expression constitutive
significative. Ceci peut être contrôlé en ajoutant au milieu du 3-AT, un inhibiteur chimique qui
supprime le niveau basal d’expression du gène. L’activité du gène LacZ est mesurée en
utilisant le substrat chromogène X-Gal, aboutissant à un produit bleu. Le test réalisé sur filtre
étant plus sensible que celui réalisé sur agar, nous avons donc choisi le premier. La densité
de la couleur permet d’estimer le niveau d’expression du gène dans une souche de levure
74
donnée. Dans nos expériences, ces deux tests se sont révélés positifs uniquement pour nos
contrôles positifs Ras/RBD et T7-53/T7-T et l’interaction DAT-Sh2bp1, validant cette dernière
dans ce système.
c/ Discussion
L’interaction DAT-Sh2bp1, clairement démontrée en système pP6/pB6 (GAL4), n’a
cependant pas pu être établie en système pLEX/pGAD (LEXA), quel que soit le vecteur
appât ou proie exprimant la séquence du gène. Bien que la séquence des plasmides
exprimant le gène d’intérêt fusionné avec le domaine activateur de la transcription soit
correcte, nous avons émis l’hypothèse que la protéine de fusion était peut-être mal
exprimée. Nous avons donc vérifié la présence et la taille de cette protéine par des
expériences de western-blot, avec un anticorps anti-LexA visant à détecter la protéine de
fusion sur différents extraits protéiques de levures transformées (figure 22). Dans la majorité
des expériences effectuées, la bande protéique était présente et avait la taille attendue.
Cependant, l’intensité de cette bande, notamment celle de la protéine pLEX DAT était
variable (comparer les puits 2 et 4, figure 22). Ceci pourrait refléter la quantité d’appât DAT,
suggérant qu’une faible expression ou qu’une mauvaise stabilité du transporteur pourrait
expliquer la non-détection des interactions avec les protéines proies. Toutefois, le protocole
d’extraction
protéique
à
partir
des
levures
ne
permettait
pas
un
dosage
spectrophotométrique des protéines, rendant la densité des produits révélés par western-blot
non quantitative. On peut également envisager un mauvais repliement de la protéine de
fusion LexA, indétectable en western-blot, qui pourrait être à l’origine de cette absence
d’interaction.
Figure 22 : Détection par western-blot de protéines de fusion pLEX sur différents extraits
protéiques de levures transformées.
1 : pLEX A (vecteur vide) ; 2 : pLEX DAT issu d’une première transformation; 3 : pLEX
ACIII ; 4 : pLEX DAT issu d’une autre transformation. Les poids moléculaires sont
indiqués à droite et exprimés en kDa.
75
Dans les deux systèmes utilisés, nous n’avons pas retrouvé l’interaction DATsynucléine décrite pour les formes humaines par deux équipes (Lee et al., 2001 ; Wersinger
and Sidhu, 2003). Cette interaction existe aussi chez le rongeur (communication personnelle
de C. Wersinger). Emettant l’hypothèse que cette interaction était peut-être trop faible pour
être détectée dans nos expériences, nous avons changé notre protocole de conjugaison et
testé un protocole de co-transformation où une seule souche de levure (L40 ou CG1945) est
transformée simultanément avec les plasmides appât et proie. Ce protocole, décrit comme
plus sensible, évite l’étape de conjugaison mais n’a toutefois pas permis de retrouver
l’interaction DAT-synucléine 1. La cause de cette non-interaction n’a pas été établie et
pourrait impliquer la mauvaise croissance globale des levures transformées par la synucléine
1.
Ces données illustrent la complexité de la technique du double-hybride en levure et
soulignent
l’importance
d’étudier
une
interaction
protéique
par
des
techniques
complémentaires.
B/ Expression de la synucléine 1 chez les souris DAT KO
Nous appuyant sur les résultats d’interaction publiés dans la littérature entre hDAT et
alpha-synucléine, nous avons décidé d’étudier l’expression de la synucléine 1 au niveau
transcriptionnel et protéique chez les souris invalidées pour le DAT (DAT KO).
1/ Expression des ARNm
Nous avons détecté les transcrits de la synucléine 1 à l’aide de trois sondes
oligonucléotidiques radiomarquées. L’hybridation in situ a été réalisée sur des coupes de
cerveaux de souris sauvages et de souris DAT KO, au niveau des corps cellulaires et des
terminaisons dopaminergiques (figure 23).
76
Figure 23 : Marquage des ARNm de la synucléine 1 par hybridation in situ au niveau du
striatum et de la substance noire (SN) de souris sauvages (WT) et DAT KO.
Chez la souris sauvage, on observe que les transcrits de la synucléine 1 sont
fortement exprimés au niveau du cortex cérébral, de l’hippocampe, de la substance noire
compacte, de l’aire tegmentale ventrale (figure 23), et plus faiblement au niveau du striatum,
comme précédemment décrit dans la littérature (Maroteaux and Scheller, 1991; Abeliovich et
al., 2000). Chez les souris mutantes, la répartition des ARNm est similaire à celle des
sauvages et aucune différence significative de densité du marquage n‘a été décelée au
niveau des régions dopaminergiques (figure 24), ainsi qu’au niveau de l’aire hippocampique
CA3, structure témoin faiblement dopaminergique.
77
marqueur
ARNm
structure
SN
DAT KO
147,1±5
139,9±6
57,3±6
60,2±5
CA3
474,9±14
437,1±37
SN
123,0±6
125,8±4
Striatum
69,6±7
63,0±2
Cortex
47,4±2
43,8±2
Striatum
protéine
WT
Figure 24 : Quantification des ARNm (par hybridation in situ) et de la protéine (par
immuno-autoradiographie) synucléine 1 chez des souris sauvages (WT) et DAT KO.
Les valeurs représentent la moyenne + SEM des densités (unité arbitraire) de 4-6
animaux par génotype dans trois expériences indépendantes.
2/ Expression de la protéine
La protéine a été détectée par immuno-autoradiographie, à l’aide d’un anticorps antisynucléine 1, dirigé contre la protéine de souris (α90 ; Totterdell et al., 2004). La synucléine
1 est largement distribuée au niveau de la substance grise du cerveau, avec une expression
plus marquée au niveau de l’hippocampe (CA3, gyrus dentelé) et de la substance noire
réticulée (figure 25 ; Kingsbury et al., 2004; Totterdell et al., 2004). Aucune différence
significative de densité de la protéine n’a été mise en évidence au niveau des régions
dopaminergiques striatum et substance noire des animaux DAT KO, ainsi que dans le
cortex, région contrôle peu dopaminergique (figure 24).
78
Figure 25 : Expression de la protéine synucléine 1 au niveau du striatum et de la
substance noire (SN) de coupes de cerveau de souris sauvages (WT) et DAT KO.
Immuno-autoradiographie réalisée à l’aide de l’anticorps α90 (Totterdell et al., 2004) ;
1/15000).
3/ Discussion
La synucléine 1 est l’homologue murin de l’alpha-synucléine humaine. Cette
abondante protéine a été impliquée dans la maladie de Parkinson, puisque des mutants de
l’alpha-synucléine ont été retrouvés dans des formes autosomales dominantes de la maladie
de Parkinson et que l’alpha-synucléine est un composant majeur des corps de Lewy,
caractéristiques de cette pathologie. L’alpha-synucléine est aussi abondamment présente
dans les plaques amyloïdes de la maladie d’Alzheimer et dans d’autres maladies
neurodégénératives (synucléopathies). Toutefois, son rôle physiologique reste à ce jour mal
défini. Des expériences menées in vitro ont suggéré que l’alpha-synucléine avait un effet
cytoprotecteur contre le stress oxydatif et l’apoptose induits par la dopamine (Wersinger et
al., 2003). Cet effet pourrait être dû, en partie, à l’action inhibitrice de l’alpha-synucléine sur
la recapture de dopamine libérée, via la réduction du nombre de molécules de DAT à la
surface cellulaire.
L’invalidation de cette protéine chez la souris (α-syn KO), réalisée par différentes
équipes, a permis d’apporter de nouvelles informations sur le rôle de l’alpha-synucléine in
vivo. Ainsi, ces souris présentent une réduction du pool de réserve de vésicules synaptiques
79
dans l’hippocampe, ainsi que des anormalités électrophysiologiques, suggérant que l’alphasynucléine pourrait réguler le degré de libération de neurotransmetteur en contrôlant le stock
de vésicules (Cabin et al., 2002). L’analyse de la densité du DAT par immuno-fluorescence
et autoradiographie a montré une densité normale du transporteur au niveau du striatum de
souris α syn KO. De même, aucun changement des paramètres fonctionnels du DAT n’a été
détecté par capture de [3H]-dopamine sur des cultures primaires de neurones
dopaminergiques ni sur synaptosomes striataux issus de souris α syn KO (Vmax et Km
similaires entre les deux génotypes ; Dauer et al., 2002; Schluter et al., 2003). Il a été
suggéré que la ß-synucléine, très souvent co-localisée avec l’isoforme α, pourrait compenser
l’absence de celle-ci (Kahle et al., 2000).
Chez les souris DAT KO, aucune différence de densité des ARNm et de la protéine
synucléine 1 n’a été mise en évidence au niveau des régions dopaminergiques (substance
noire et striatum). L’ensemble des données sur les souris invalidées pour la synucléine 1 et
le DAT suggère que l’interaction DAT-synucléine 1 n’est pas essentielle pour l’expression et
la fonction de chacun des deux partenaires.
80
CONCLUSION
81
Partie 1 - Conclusion
A/ Etude de l’interaction DAT-partenaire
Nous avons rencontré des difficultés techniques avec l’approche du double-hybride
en levure que nous n’avons pas toutes résolues : ainsi, je n’ai pas retrouvé l’interaction DATACIII, proie identifiée lors du crible initial réalisé par la société Hybrigenics et DAT-synucléine
1, interaction publiée dans la littérature. En revanche, l’interaction DAT-Sh2bp1, identifiée
lors du premier crible, a été retrouvée lors de mes expériences de double-hybride. Dans tous
les cas, il me paraît nécessaire de recourir à d’autres méthodes permettant de vérifier une
interaction directe entre deux protéines. Deux techniques sont couramment utilisées : le
« GST pull down » et la co-immunoprécipitation.
Dans la première, l’extrémité C-terminale du DAT est fusionnée (par son extrémité Nterminale) à une protéine glutathion-S-transferase (GST) et accrochée sur une colonne
d’affinité de billes glutathion agarose, permettant de retenir le complexe DAT-partenaire, à
partir d’homogénats de striata de souris sauvages et DAT KO, ces dernières servant de
témoin négatif. Après élution par compétition avec du glutathion libre, la présence d’une
protéine partenaire est détectée par western-blot. Lorsque l’on ne possède pas d’anticorps
spécifiques des protéines partenaires, on exprime la protéine d’intérêt en fusion avec la GST
et on élue le DAT, que l’on détecte par western-blot. La construction de ces vecteurs est en
cours au laboratoire.
Dans la seconde technique, un anticorps dirigé contre la partie N-terminale du DAT
(disponible au laboratoire) permettra d’immuno-précipiter le complexe DAT-partenaire, dont
la nature sera révélée après élution par western-blot à l’aide d’anticorps spécifique de
chaque protéine. Lorsque l’anticorps n’est pas disponible, il est nécessaire d’étiqueter la
protéine à l’aide d’épitopes myc ou 6-His, et d’utiliser une résine d’affinité de cet épitope,
permettant donc l’élution du DAT.
N’ayant pas retrouvé l’interaction DAT-synucléine dans deux systèmes de levure
différents, nous pouvons émettre des réserves quant à la robustesse de cette interaction
directe. L’interaction DAT-alpha-synucléine n’a été montrée qu’une seule fois par doublehybride (Lee et al., 2001a), à l’aide d’un kit utilisant le système GAL4 (Clontech). Les auteurs
ont co-transformé les levures, cette méthode étant plus sensible que la conjugaison de
levures de signes sexuels opposés. De plus, ils n’ont utilisé que le test β-gal pour démontrer
leur interaction. Il y avait donc un risque de faux-positif. L’interaction a été vérifiée par coimmunoprécipitation à partir de cellules transfectées ou d’extraits de striatum (Lee et al.,
82
1996; Wersinger and Sidhu, 2003), mais, selon les conditions expérimentales, cette
technique peut co-immunoprécipiter des complexes multi-protéiques. Nous pouvons émettre
l’hypothèse que l’interaction DAT-synucléine nécessite la présence d’une protéine
adaptatrice, présente dans les cellules et les extraits striataux, qui rapproche la synucléine
du DAT sans qu’il y ait interaction physique entre les deux protéines.
La fonction endogène de Sh2bp1 n’a pas été démontrée à ce jour, mais il est
possible que cette protéine intervienne dans ce type d’interaction, grâce à ses domaines
TPR et SH2, connus pour médier des interactions entre protéines. Des protéines à domaines
TPR jouent le rôle de co-chaperonnes, liant des protéines chaperonnes telles que hsp70, qui
permettent le repliement, l’assemblage ou le désassemblage de complexes protéiques ou le
transport de protéines vers des organelles (Liu et al., 1999). D’autres sont impliquées dans la
libération de neurotransmetteurs, comme la rapsyne qui contient 8 domaines TPR et joue un
rôle essentiel dans l’agrégation des récepteurs nicotiniques à la jonction neuromusculaire
(Ponting and Phillips, 1996).
L’interaction DAT-Sh2bp1 ayant été confirmée par notre protocole de double hybride,
nous nous sommes aussitôt intéressés à déterminer le domaine d’interaction du DAT avec
ce partenaire. Par des expériences de troncations croissantes de l’extrémité C-terminale du
DAT et des expériences de mutagenèse dirigée réalisées et testées en double-hybride au
laboratoire, Patrick Slama a pu identifier un triple mutant du DAT (YKF577AAS) ayant perdu
sa capacité d’interaction avec Sh2bp1 (Slama et al., en préparation). Plusieurs constructions
portant une seule mutation, visant notamment les résidus conservés entre DAT et NET, ont
été fabriquées et vont être testées en double-hybride.
B/ Etude du rôle fonctionnel de l’interaction DAT-partenaire
J’ai rencontré des problèmes de reproductibilité lors des expériences de capture de
3
[ H]-dopamine sur cellules HEK293 co-exprimant le DAT et la protéine d’intérêt, qui ne m’ont
pas permis de conclure quant à l’effet des protéines synucléine 1 et Sh2bp1 sur l’activité
fonctionnelle du DAT. Ceci pourrait provenir d’un problème de protocole, concernant le mode
de transfection transitoire utilisé. Il sera donc nécessaire de mettre au point les
manipulations de transport en utilisant la technique de transfection par puits (in situ). Il me
paraît également important d’effectuer ces manipulations sur protéine entière, puisque
83
jusqu’à présent nous avons travaillé sur la séquence interactante des protéines ACIII et
Sh2bp1 ressortie en double-hybride. Ainsi, il manque plusieurs domaines TPR et le domaine
SH2 de la protéine Sh2bp1, qui jouent très probablement un rôle important dans la régulation
de l’interaction DAT-Sh2bp1. Comme contrôle négatif, nous pourrons utiliser les mutants du
DAT identifiés en double-hybride, tel que le mutant DAT YKF577AAS pour l’interaction DATSh2bp1. Enfin, en vue de se rapprocher des conditions physiologiques, nous envisageons
d’effectuer ces expériences sur des cultures primaires de neurones mésencéphaliques.
De manière intéressante, Patrick Slama a construit au laboratoire des mutants de
l’extrémité C-terminale du DAT et a démontré que Sh2bp1 interagissait avec la partie
centrale de l’extrémité du transporteur, contenant la séquence FREKLAYAIA (Slama et al.,
en préparation). L’ablation de ce motif abolit l’interaction DAT-Sh2bp1. Récemment, l’équipe
de Melikian (Holton et al., 2005) a montré que cette séquence, spécifique des transporteurs
dépendant de Na/Cl, était nécessaire et suffisante à l’internalisation constitutive des
transporteurs DAT et NET. Le mécanisme et la régulation de ce processus ne sont pas
encore connus, mais pourraient mettre en jeu une ou plusieurs protéines adaptatrices,
comme Sh2bp1. D’après nos résultats préliminaires, la présence de Sh2bp1 a tendance à
augmenter la capacité de transport maximale du DAT. Ceci est souvent corrélé à une
augmentation des molécules du transporteur à la membrane, donc à une internalisation
moins forte. On peut donc émettre l’hypothèse que Sh2bp1, se liant au DAT via la séquence
FREKLAYAIA, empêcherait une endocytose constitutive. Ceci aurait pour conséquence une
plus forte densité de transporteurs membranaires et donc une plus grande activité de
transport.
C/ Etude de l’expression de la synucléine 1 chez les souris DAT KO
Par des expériences d’hybridation in situ des ARNm et d’immuno-autoradiographie
de la protéine synucléine 1, j’ai montré que la délétion constitutive du DAT n’entraînait pas
de modification d’expression et de densité de la synucléine 1 au niveau des régions à corps
cellulaires et terminaisons dopaminergiques. Ces données devront être complétées par des
quantifications de la synucléine 1 par western-blot dans différentes structures cérébrales et
par des expériences d’immuno-fluorescence, permettant de localiser précisément la protéine
au niveau neuronal. Toutefois, il paraît peu probable que l’expression de la synucléine 1 soit
84
altérée chez les souris DAT KO. Les résultats présentés ici sont en accord avec ceux décrits
dans la littérature concernant les souris dépourvues de synucléine 1, chez lesquelles
l’expression et l’activité du DAT n’est pas modifiée.
85
PARTIE 2
86
INTRODUCTION
87
A/ La schizophrénie
1/ Définition et évolution
•
Définition de la maladie
Identifiée en 1904 par Kraeplin puis caractérisée en 1911 par Bleuler, la
schizophrénie est une maladie psychiatrique qui se manifeste par trois catégories de
symptômes cliniques : 1/ des symptômes productifs regroupant pensées délirantes
(convictions erronées), hallucinations (perceptions sensorielles sans objets) et une
désorganisation de la pensée et du discours; 2/ des symptômes déficitaires se traduisant par
un comportement catatonique, une perte de volonté, un émoussement affectif et un retrait
social et 3/ des déficits cognitifs touchant l’attention, la capacité d’abstraction, les fonctions
exécutives et certaines formes de mémoire, notamment la mémoire de travail. L’absence de
marqueurs biologiques implique que le diagnostic de cette pathologie est établi cliniquement,
sur un ensemble de critères basés sur des observations du comportement du sujet et sur le
rapport d'expériences "anormales". Ainsi, les symptômes ne doivent pas être liés à une autre
maladie (dépression ou prise de drogues) et doivent affecter le fonctionnement personnel et
social. Ces symptômes peuvent se succéder dans le temps ou co-exister simultanément.
Cette maladie touche actuellement 1% de la population mondiale, sans préférence
concernant les pays, cultures et sexes, bien que les symptômes apparaissent plus
précocement chez les hommes (18-25 ans) que chez les femmes (25-35 ans).
•
Evolution de la maladie
Selon les individus, la progression de la schizophrénie apparaît très variable dans
son évolution et son issue. Le premier épisode de la maladie est souvent précédé d’une
phase prodromale (figure 26), caractérisée, entre autres, par des symptômes productifs
atténués (illusions, superstition, pensées magiques), des troubles de l’humeur (anxiété,
irritabilité), des symptômes cognitifs (difficultés de concentration, distraction) et un retrait
social (Lewis and Lieberman, 2000; Frankle et al., 2003). Cependant, ces comportements
sont aussi fréquemment retrouvés chez des adolescents sains qui ne développeront pas la
maladie ; ces critères ne peuvent donc pas servir de diagnostic. Ensuite, des épisodes
d’exacerbation de la maladie, caractérisés par l’émergence ou l’aggravation de pensées
désorganisées et de symptômes psychotiques, alternent avec des périodes de rémission,
88
pendant lesquelles les symptômes sont moins apparents. Contrairement aux symptômes
productifs, les symptômes déficitaires tendent à être stables au cours du temps et, si la
schizophrénie est traitée de façon correcte et suffisamment tôt, certains patients peuvent
espérer une réduction, voire une rémission de leurs troubles psychotiques après un premier
épisode. D’autres patients ne répondent pas aussi bien au traitement et, dans ce cas, une
détérioration clinique est généralement observée d’épisode en épisode. La maladie est plus
active pendant la deuxième et troisième décennie de vie et tend à se stabiliser après dans
un état résiduel.
Figure 26 : Evolution clinique et pathophysiologique de la schizophrénie.
Les différentes étapes de la maladie décrivent les phases pré-morbides et morbides. La
sévérité des symptômes, représentée en ordonnée, est inversement proportionnelle à
l’axe des y. Les mécanismes pathogénique et pathophysiologique hypothétiques sont
indiqués en dessous de l’axe des abscisses. D’après Frankle et al., 2003.
2/ Etiologie : deux composantes
La schizophrénie apparaît comme une maladie polygénique, associée à des facteurs
de vulnérabilité environnementaux et développementaux.
89
a/ Aspects génétiques
La vulnérabilité à la schizophrénie est reliée à des facteurs génétiques (Tsuang,
2000). Des études d’agrégation familiale ont montré que le risque de développer la maladie
passait de 1 à 6-17% chez des apparentés de premier degré (parents, enfants ou fratrie) de
schizophrènes. Parmi les jumeaux, l’incidence de la maladie est de 17% chez les jumeaux
dizygotes (du même ordre que les apparentés de 1er degré) et atteint presque 50% chez les
jumeaux monozygotes (Gottesman, 1994). Enfin, des études d’adoption ont révélé que le
risque de schizophrénie était lié à la présence de la maladie chez les parents biologiques et
non chez les parents adoptifs.
De nombreuses études de liaison ont été entreprises afin d’associer dans des
familles informatives différents marqueurs de régions chromosomiques (satellites ou gènes
candidats) avec la maladie. De fait, diverses régions de chromosomes ont été proposées
comme sites potentiels de vulnérabilité, comme la région 22q11 (pour revue, voir
Karayiorgou and Gogos, 2004). Il est admis que la prédisposition à la schizophrénie soit la
résultante de mutations de plusieurs gènes ayant chacun des effets modestes. Citons les
gènes COMT (catéchol-O-méthyltranférase), dysbindine 1, neuréguline 1, calcineurine,
RGS4 (regulator of G-protein signalling 4) et DISC1 (disrupted in schizophrenia 1) qui
constituent quelques uns des gènes de susceptibilité pour la schizophrénie (pour revue, voir
Harrison and Weinberger, 2005; Norton et al., 2006).
Un autre axe d’étude est la recherche d’endophénotypes, traits infracliniques,
marqueurs de la vulnérabilité génétique à la maladie chez les apparentés non atteints.
Les
endophénotypes
neurophysiologiques,
peuvent
être
des
neuroanatomiques,
mesures
cognitives
biochimiques,
ou
endocriniennes,
neuropsychologiques.
Un
endophénotype doit répondre aux critères suivants : il doit être présent avant
le début de la maladie et doit être héritable. En outre, les sujets atteints et
non
atteints
d'une
même
famille
doivent
partager
ces
caractéristiques
endophénotypiques plus souvent que des témoins apparentés entre eux, et plus
souvent que des apparentés non atteints ne les partagent avec des témoins. Ainsi, on
retrouve fréquemment chez les schizophrènes et leurs apparentés des déficits neurologiques
(absence d’inhibition du réflexe de sursaut (pre-pulse inhibition ou PPI), défaut d’amplitude
des ondes p50, p300,...) et anomalies anatomiques (augmentation de la taille des ventricules
cérébraux, asymétrie cérébrale,…)
Une piste supplémentaire consiste à analyser les symptômes communs à diverses
maladies psychiatriques (déficits cognitifs, hallucinations,...) afin de tenter d’établir une
origine commune.
90
En conclusion, on estime que la composante génétique interviendrait de façon
majoritaire dans l’étiologie de la schizophrénie (Cannon et al., 2000).
b/ Aspects environnementaux
Chez les jumeaux monozygotes, possédant un génome identique, le risque d’être
schizophrène est bien inférieur à 100%, ce qui signifie que l’origine de la schizophrénie n’est
pas entièrement génétique et qu’interviennent des facteurs extérieurs et non liés au
patrimoine génétique de l’individu. La plupart surviennent au cours de la grossesse, en
période pré- ou péri-natale, affectant le processus de développement neuronal. Il peut s’agir
d’exposition à des agents infectieux, toxiques, une maladie auto-immune ou bien des
traumatismes ou des situations stressantes (McDonald and Murray, 2000). Par exemple,
l’infection par le virus de la grippe (Influenza) au milieu de la grossesse semble être un
facteur de risque, qui pourrait expliquer l’augmentation du nombre de naissances des
schizophrènes en hiver ou au printemps.
3/ Etiologie : les différentes hypothèses
a/ L’hypothèse dopaminergique
La dopamine est considérée depuis longtemps comme jouant un rôle crucial dans la
schizophrénie. La première hypothèse avancée est que les symptômes productifs résultent
d’une hyperactivité dopaminergique des régions sous-corticales. Cette théorie provient de
l’observation que des agonistes dopaminergiques, directs et indirects, comme l’amphétamine
ou la cocaïne, sont capables de provoquer des réactions psychotiques chez des sujets sains
et d’exacerber, à faibles doses, certains symptômes chez les schizophrènes. D’autre part, il
existe une corrélation positive entre l’effet clinique des antipsychotiques et leur affinité à
bloquer les récepteurs dopaminergiques D2 (Seeman, 1977; Carlsson, 1988).
La plupart des résultats qui étayent cette hypothèse ont été obtenus par des
techniques d’imagerie, SPECT (tomographie d’émission mono-photonique) et TEP
(tomographie par émission de positons), mesurant la liaison d’un traceur radioactif,
spécifique d’un sous-type de récepteur dopaminergique donné (voir Abi-Dargham, 2004).
Plusieurs études ont démontré une augmentation de l’accumulation de DOPA, précurseur de
la dopamine, dans le striatum de patients schizophrènes, qui serait encore plus forte chez
des patients psychotiques (Reith et al., 1994; Lindstrom et al., 1999). Ceci serait compatible
91
avec une activité de synthèse de dopamine accrue chez ces derniers. De même, une
augmentation de la libération de dopamine après administration aiguë d’amphétamine a été
montrée chez les schizophrènes, comparés aux sujets sains (Abi-Dargham et al., 1998;
Laruelle et al., 1999). Ainsi, chez les patients schizophrènes le déplacement de liaison du
[123-I]-IBZM (spécifique des récepteurs D2) induit par l’amphétamine est 2,5 fois plus élevé
que chez les contrôles. Ce résultat est corrélé avec une probabilité accrue (40%) chez ces
patients de développer des symptômes productifs, contre 0% chez les sujets sains (Laruelle
et al., 1999).
Etant donnée l’implication des récepteurs D2 dans le traitement de la maladie, de
nombreuses études ont déterminé la densité de ces récepteurs. Une augmentation des
récepteurs striataux a été trouvée et reproduite sur des cerveaux post-mortem de
schizophrènes (Zakzanis and Hansen, 1998). Cependant, ces patients ayant été traités par
des antipsychotiques, il ne peut être exclu que la hausse de récepteurs D2 observée ne soit
pas due au traitement lui-même. Afin d’effectuer cette mesure chez des patients non traités,
divers ligands spécifiques du récepteur D2 ont été utilisés en imagerie in vivo. Les études
réalisées avec le [11C]-méthylspipérone ont conclu à une augmentation des sites tandis que
celles menées avec le [11C]-raclopride n’ont pas révélé de variation significative. Cette
différence serait due aux propriétés intrinsèques des ligands (voir Seeman and Kapur, 2000).
Le méthylspipérone ne se lie qu’aux récepteurs D2 monomériques, forme supposée
prépondérante chez les schizophrènes, tandis que le raclopride reconnaît également les
récepteurs oligomériques. Ainsi, chez les patients contrôles, qui possèdent des récepteurs
D2 monomériques et oligomériques, la liaison au [11C]-méthylspipérone serait sous-estimée,
ce qui conduirait à une apparente augmentation des sites chez les schizophrènes.
Une solution à ce problème est de mesurer l’occupation basale des récepteurs D2
par SPECT, en comparant la liaison d’un ligand D2 avant et après déplétion de dopamine
par l’α-méthyl-para-tyrosine (Abi-Dargham et al., 2000). Ce composé inhibe la synthèse de
dopamine, déplétant la synapse en dopamine et laissant plus de récepteurs accessibles au
traceur. La différence entre les deux images reflète la proportion de récepteurs occupés à
l’état de base. Il en résulte que les schizophrènes ont un taux d’occupation basal des
récepteurs D2 significativement supérieur à celui des contrôles. D’autre part, on retrouve une
meilleure efficacité d’un traitement aux antipsychotiques chez les schizophrènes ayant un
niveau synaptique de dopamine plus élevé comparés aux schizophrènes ayant un niveau de
dopamine plus bas. Ceci est en faveur de la notion selon laquelle l’hyperstimulation des
récepteurs D2 est en grande partie responsable des psychoses des schizophrènes. Ainsi, il
92
est peu probable qu’il y ait une augmentation de la densité des recepteurs D2 mais plutot
une plus grande occupation de ces récepteurs par la dopamine chez les schizophrènes.
Quant aux récepteurs D1, une seule équipe a montré une augmentation significative
de leur densité au niveau du cortex préfrontal (Abi-Dargham et al., 2002).
Une hypothèse complémentaire serait qu’une hypodopaminergie préfrontale serait
responsable des déficits de mémoire de travail, associée au cortex préfrontal (Davis et al.,
1991). Cette notion découle de travaux d’imagerie cérébrale décrivant une activité
métabolique réduite au niveau de cette région lors d’une activation cognitive (Andreasen et
al., 1992; Volz et al., 1999). Cependant, ce résultat n’a pas toujours été confirmé et semble
dépendre des tâches cognitives effectuées (pour revue et références, voir Wong and Van
Tol, 2003).
b/ L’hypothèse glutamatergique
La deuxième hypothèse émise quant à la pathophysiologie de la schizophrénie
concerne le glutamate : une transmission glutamatergique réduite serait à l’origine des
symptômes productifs et déficitaires de la maladie (Olney and Farber, 1995; Jentsch and
Roth, 1999). La transmission glutamatergique représente le système excitateur majeur du
cerveau, contrôlant de nombreuses fonctions physiologiques. Ce neurotransmetteur agit sur
trois types de récepteurs ionotropiques (NMDA, AMPA, kainate) et sur des récepteurs
métabotropiques (mGluR). Cette hypothèse est basée sur la capacité d’antagonistes des
récepteurs NMDA (phencyclidine, kétamine) à provoquer, chez des sujets sains, des
symptômes productifs, déficitaires ainsi que des altérations des capacités cognitives (Coyle,
1996). De plus, ces substances exacerbent les symptômes des patients schizophrènes et un
traitement complémentaire avec des agonistes des récepteurs NMDA (glycine, sérine)
améliore les symptômes de la maladie (Tsai et al., 1998; Javitt et al., 2005).
Dès lors, beaucoup d’études ont été entreprises sur des cerveaux post-mortem
puisqu’une difficulté majeure est qu’il n’existe pas à l’heure actuelle de radioligand spécifique
des composants glutamatergiques, limitant ainsi les études in vivo de neuro-imagerie. La
quantité des récepteurs AMPA, NMDA et des transcrits de leurs différentes sous-unités a été
analysée chez des cerveaux de schizophrènes, mais les résultats de différentes équipes ne
sont pas concordants (voir Ohnuma et al., 2005). Ohnuma et collaborateurs proposent que
ce manque de reproductibilité soit dû à des changements fonctionnels de faible amplitude
qui ne pourraient pas être détectés de manière robuste par l’étude d’un seul marqueur. Ce
groupe a quantifié les transcrits des sous-unités mGLuR3 et mGluR5 ainsi que ceux du
93
transporteur glutamatergique astrocytaire EAAT2 au niveau du cortex préfrontal de sujets
schizophrènes et n’ont noté aucune différence significative de densité comparés aux sujets
témoins. En revanche, les rapports des transcrits de chaque sous-unité par rapport au
récepteur apparaissent significativement différents, suggérant que ce mode de comparaison
pourrait être utile pour détecter des variations minimales.
Récemment, un nouveau concept est né, réunissant les deux hypothèses précitées
en reliant les systèmes dopaminergique et glutamatergique (voir Laruelle et al., 2005). Ainsi,
une injection d’antagoniste NMDA ne modifie pas l’activité dopaminergique de patients
contrôles. En revanche, le blocage des récepteurs NMDA chez des sujets sains ayant reçu
de l’amphétamine provoque un excès de libération de dopamine, dont l’amplitude est
comparable à la réponse des schizophrènes à une injection d’amphétamine seule. Ces
données suggèrent qu’un déficit de la transmission glutamatergique serait impliqué dans les
altérations de la régulation dopaminergique observées chez les schizophrènes.
Réciproquement, la dopamine a des effets modulateurs sur la transmission
glutamatergique.
Les
afférences
corticales
glutamatergiques
et
les
projections
dopaminergiques convergent sur les neurones inhibiteurs GABA de type « medium spiny »
du striatum (figure 27). La stimulation des récepteurs D2 inhibe la libération de glutamate et
réduit l’excitabilité des neurones GABA.
Figure 27 : Modulations opposées de la transmission glutamatergique NMDA par les
récepteurs dopaminergiques D1 et D2 sur les neurones GABA « medium spiny » du
striatum.
D’après Laruelle et al., 2005.
94
Au contraire, la stimulation des récepteurs D1 favorise la transmission NMDA et
l’excitabilité des neurones GABA (West and Grace, 2002). Ainsi, une stimulation excessive
des récepteurs D2 dans la schizophrénie inhiberait une transmission corticale et limbique via
les récepteurs NMDA déjà déficiente. En bloquant les récepteurs D2, les antipsychotiques
restaureraient la transmission glutamatergique striatale (Laruelle et al., 2005).
c/ La théorie neuro-développementale
Comme mentionné plus haut, plusieurs études suggèrent que le développement
anormal du cerveau pendant la période pré- ou post-natale soit un des facteurs de risque
pour la manifestation de la pathologie chez les jeunes adultes. Plus précisément, l’hypothèse
neuro-développementale
propose
développement
du
normal
qu’un
cerveau,
évènement
engendrant
adverse
une
in
utero
vulnérabilité
altère
cérébrale,
le
qui
prédisposerait un individu à risque génétique à développer la maladie au cours de sa vie
(figure 28).
Prédisposition génétique
Facteurs environnementaux précoces
(complications obstétriques, infection virale,…)
Anomalies neuro-développementales
Facteurs environnementaux tardifs (maturation
cérébrale, synaptogenèse,..)
Dysfonctions cérébrales et schizophrénie
Figure 28 : Etapes
schizophrénie.
de
l’hypothèse
neuro-développementale
conduisant
à
la
Adapté de Tsuang, 2000.
•
Facteurs de risques
Les sujets ayant souffert de complications obstétriques ont deux fois plus de risques
de développer la schizophrénie que des sujets n’ayant pas subi de complications (pour revue
et références, voir Rehn and Rees, 2005). De plus, la précocité de la première manifestation
de la maladie est hautement associée aux complications obstétriques. Une petite
circonférence crânienne à la naissance est associée à une plus grande incidence de
95
schizophrénie. Il en est de même pour des infections virales maternelles survenant au cours
des premier et deuxième trimestres de gestation, ainsi qu’une malnutrition maternelle.
•
Anomalies morphologiques
Des études d’imagerie ou des analyses de cerveaux post-mortem ont permis de
décrire quelques anomalies morphologiques (pour revue, voir Harrison, 1999). Ainsi, une
dilatation des ventricules latéraux et du troisième ventricule a été observée de manière
robuste chez les schizophrènes (McCarley et al., 1999). Une perte de tissu cérébral au
niveau du cortex et de structures associées a également été trouvée : ceci concernerait
certains cortex associatifs, dont ceux du lobe temporal, le cortex préfrontal dorsal et des
aires limbiques telles que l’hippocampe et le cortex cingulaire antérieur (Goldstein et al.,
1999; McCarley et al., 1999). Au niveau de l’hippocampe et du cortex préfrontal dorsal, ces
diminutions ne proviendraient pas d’une réduction du nombre total de neurones, mais plutôt
d’une réduction de la taille des corps cellulaires ou du nombre de terminaisons, de dendrites
et d’épines dendritiques. Beaucoup de ces anomalies ont été montrées chez des sujets non
traités, lors de leur premier épisode de schizophrénie (apparition des symptômes
précédemment cités), suggérant que ces anomalies pourraient refléter le processus primaire
de la maladie et ne sont pas secondaires à la pathologie ou au traitement. D’autre part, une
étude d’imagerie a montré qu’il n’y avait pas de progression de la baisse de volume de
l’hippocampe chez des schizophrènes au cours d’un suivi de deux ans, suggérant que ces
altérations, analysées lors du premier épisode de la pathologie, sont stables au cours du
temps et pourraient résulter d’un développement anormal pendant la grossesse ou l’enfance
(Wood et al., 2001). En outre, la majorité des études n’a pas décelé d‘astrogliose, signe de
neurodégénerescence, suggérant qu’il n’y aurait pas de processus neurodégénératif en
cause dans la schizophrénie.
d/ Une maladie de la synapse ?
Les anomalies morphologiques, particulièrement au niveau du cortex préfrontal
(réduction du volume de matière grise, augmentation de la densité de cellules sans
changement du nombre total de neurones), contribuent probablement aux déficits cognitifs
caractérisant la schizophrénie. Les données laissent à penser qu’il pourrait y avoir une
diminution du nombre des terminaisons axonales, des dendrites distales et de leur principale
cible synaptique, les épines dendritiques (Selemon and Goldman-Rakic, 1999). Une
diminution de la densité d’épines dendritiques a en effet été trouvée au niveau du cortex
préfrontal de schizophrènes (Glantz and Lewis, 2000) ainsi qu’une baisse de la
96
synaptophysine, protéine présynaptique (Karson et al., 1999). D’autre part, l’âge de début
typique de la maladie coïncide avec la période de fin de réduction de la densité des
synapses (« synaptic pruning ») et des épines dendritiques au niveau du cortex préfrontal du
primate (Bourgeois et al., 1994). En outre, des gènes codant pour des protéines
responsables du processus de myélinisation ou associées au cytosquelette ont également
été mis en cause dans la schizophrénie (Cotter et al., 1997; Davis et al., 2003). La reeline,
qui régule la migration neuronale pendant la phase embryonnaire et module l’activité des
récepteurs NMDA, est diminuée de 50% dans le cortex des schizophrènes (Guidotti et al.,
2000; Chen et al., 2005b).
Récemment, la technologie des puces à ADN a permis d’étudier les changements
d’expression de gènes à grande échelle, très utile pour l’analyse des maladies complexes
telles que les maladies psychiatriques. Ainsi, Mirnics et collaborateurs (2000) ont trouvé une
diminution reproductible d’expression des transcrits codant pour des protéines régulant la
fonction présynaptique, notamment les mécanismes de libération du neurotransmetteur. Bien
que les gènes les plus affectés varient selon les individus schizophrènes, soulignant
l’hétérogénéité moléculaire de la maladie, cette étude a identifié un gène dont l’expression
était presque systématiquement réduite chez le groupe de patients étudié, par rapport au
groupe contrôle. Cette observation a également été confirmée par hybridation in situ sur
d’autres sujets. Il s’agit du gène RGS4 (regulator of G protein signaling 4) qui a pour fonction
de restreindre la durée de la réponse post-synaptique après libération du neurotransmetteur
et son action sur ses récepteurs métabotropiques, glutamatergiques, sérotoninergique (5HT2) et dopaminergique (D2) (Mirnics et al., 2001). De façon intéressante, RGS4 est localisé
sur la région chromosomique 1q21-22, identifiée comme étant un locus significatif de
susceptibilité à la schizophrénie (Brzustowicz et al., 2000). Une diminution d’expression a
également été notée pour les gènes NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor), synapsine II
(SYN2) et ATPase (Mirnics et al., 2000). Physiologiquement, une expression moindre de
gènes présynaptiques provoquerait une diminution de la libération de neurotransmetteur par
les vésicules synaptiques des terminaisons neuronales, qui ne serait pas forcément
significative dans des conditions de faible activité synaptique mais qui pourrait avoir des
conséquences fonctionnelles lorsqu’une activité plus soutenue est requise. Ainsi, ceci
pourrait expliquer que les sujets atteints de schizophrénie montrent une moindre activation
du cortex préfrontal pendant les tâches qui nécessitent une activité soutenue, comme celles
impliquant la mémoire de travail. D’autres travaux sont nécessaires pour valider les résultats
de cette première grande étude. Notons que d’autres expériences utilisant des puces à ADN
97
ont identifié différents gènes dérégulés, impliqués dans des fonctions autres que synaptiques
(voir Konradi, 2005).
4/ Le traitement de la schizophrénie
Bien que l’étiologie et la pathophysiologie de la schizophrénie ne soient pas encore
élucidées, l’efficacité des traitements pharmacologiques a clairement été démontrée depuis
une cinquantaine d’années. Les différents types de neuroleptiques utilisés ont en commun la
propriété de réduire la transmission dopaminergique en bloquant efficacement le récepteur
dopaminergique D2. Les traitements pharmacologiques actuels montrent cependant une
efficacité parfois limitée et sont souvent associés à des effets secondaires indésirables:
tremblements et dyskinésies (syndromes extra-pyramidaux), dus au blocage du récepteur
D2 au niveau de la voie nigro-striée ; aggravation de symptômes négatifs et troubles
cognitifs dus au blocage de la voie méso-corticale ; stimulation de la production de
prolactine, par blocage des récepteurs du système hypothalamo-hypophysaire. Toutefois,
ces molécules permettent de réduire considérablement les symptômes psychotiques et de
limiter leur récurrence, grâce au blocage du récepteur D2 au niveau de la voie mésolimbique.
Depuis une quinzaine d’années, une nouvelle classe d’antipsychotiques, dits
« atypiques » est apparue sur le marché. Certaines de ces molécules (clozapine,
rispéridone, olanzapine,…) sont moins spécifiques du récepteur D2 que les neuroleptiques
conventionnels (halopéridol) et ciblent également les récepteurs sérotoninergiques (5HT-1,
5HT-2) ou ont une affinité pour une combinaison de récepteurs multiples et de transporteurs
plasmiques, incluant les récepteurs dopaminergiques, noradrénergiques, muscariniques,
histaminergiques, le DAT, le NET... Ces molécules présentent l’avantage d’engendrer peu
ou pas d’effets extrapyramidaux. Toutefois, certaines d’entre elles présentent le gros
désavantage d’induire des désordres endocriniens, tels que surpoids et diabète.
Ajoutons qu’une thérapie cognitive peut complémenter de façon bénéfique le
traitement pharmacologique des patients schizophrènes (Kane, 1996).
5/ Les modèles animaux pour la schizophrénie
Bien que les modèles animaux puissent seulement approcher la complexité clinique
du phénotype de la schizophrénie, ils représentent un outil essentiel pour comprendre les
mécanismes
moléculaires
et
cellulaires
qui
sous-tendent
la
pathogenèse
et
la
98
pathophysiologie de la maladie. Selon Lipska (2004), plusieurs critères comportementaux
sont requis chez le rongeur pour valider la pertinence d’un modèle animal pour la
schizophrénie, dont :
1/ des changements cellulaires, moléculaires et morphologiques du cerveau
2/ une réponse accrue au stress, aux antagonistes NMDA et aux agonistes
dopaminergiques
3/ un déficit de filtrage sensori-moteur (PPI) et d’inhibition latente
4/ une altération de la mémoire de travail
5/ une vulnérabilité aux drogues addictives
6/ un déficit dans le comportement social
7/ une amélioration des déficits par des neuroleptiques
a/ Modèles pharmacologiques
Plusieurs modèles animaux ont été réalisés afin d’étudier la pertinence des
hypothèses classiques dopaminergique et glutamatergique. Ainsi, les rongeurs traités par les
amphétamines montrent une hyperactivité et des stéréotypies, mimant les symptômes
psychotiques des schizophrènes. Ils montrent également un déficit du PPI et d’inhibition
latente, c’est-à-dire une moindre performance dans une tâche d’apprentissage impliquant un
stimulus non renforçant pré-exposé (Segal et al., 1981; Swerdlow and Geyer, 1998). Ces
comportements peuvent être améliorés par l’administration de neuroleptiques conventionnels
et atypiques. Cependant, ce modèle ne reproduit pas la symptomatologie déficitaire de la
schizophrénie.
Les animaux recevant des antagonistes des récepteurs NMDA (PCP, kétamine, MK801, mémantine) montrent une locomotion et des stéréotypies accrues, des déficits
d’interaction sociale ainsi que des déficits de PPI et une altération des fonctions cognitives
(Sams-Dodd, 1998; Krystal et al., 1999), suggérant que ce modèle est plus pertinent que le
précédent. On peut noter que, dans ce modèle, les antipsychotiques atypiques se révèlent
plus efficaces que les neuroleptiques typiques.
b/ Modèles neuro-développementaux
De nombreux modèles animaux ont été développés afin d’étayer l’hypothèse neurodéveloppementale (Rehn and Rees, 2005; Robertson et al., 2006). Citons notamment les
modèles de complications obstétriques (privation nutritionnelle ou stress durant la gestation,
hypoxie/ ischémie pendant la mise bas) provoquant des dommages structurels au niveau du
cerveau et des déficits comportementaux, limités cependant aux symptômes productifs;
99
l’altération de la prolifération cellulaire par méthylation des acides nucléiques, engendrant
des anomalies structurelles et l’insuffisance placentaire chronique, également à l’origine de
défauts structurels et comportementaux.
L’hypothèse de l’infection virale a également été testée: l’inoculation de rattes
gestantes par le cytomégalovirus, l’Herpes simplex ou l’Influenza conduit à un déficit du PPI,
un retrait social et des altérations de la morphologie temporo-limbique. Des études récentes
suggèrent que ces altérations seraient probablement le résultat de la réponse immunitaire
maternelle à l’infection plutôt que dues au virus lui-même. Ainsi, Zuckerman et collaborateurs
(2003) ont démontré que des rattes gestantes, injectées avec un ARN double brin
synthétique mimant l’exposition virale, donnaient naissance à des petits, apparemment
normaux à la naissance et pendant l’adolescence, mais qui développaient des troubles
comportementaux à l’âge adulte. Ces animaux montrent notamment des déficits du PPI, une
sensibilité accrue à l’amphétamine et au MK-801 et une altération de l’inhibition latente
(Zuckerman and Weiner, 2005). Beaucoup de comportements sont améliorés par un
traitement aux antipsychotiques, en accord avec les critères validant un modèle animal pour
la schizophrénie. Il semblerait donc qu’une accumulation de cytokines inflammatoires, à la
suite d’une infection virale au cours du développement du cerveau, augmente le risque de
désordres neuro-développementaux, en altérant la survie et la connectivité des neurones
(Nawa et al., 2000).
Plusieurs équipes ont injecté une toxine anti-mitotique, le méthylazoxyméthanol
(MAM ; Talamini et al., 1998) à des rattes gestantes, entre les jours embryonnaires E09 et
E17 et ont étudié l’anatomie et le comportement de la progéniture. Selon le moment de
l’injection, les animaux présentent des défauts anatomiques et comportementaux plus ou
moins sévères. Chez les rats injectés de E09 à E12, le poids du cerveau est plus faible et le
volume du striatum et des cortex enthorinal et préfrontal sont plus ou moins réduits selon le
jour de l’injection (Jongen-Relo et al., 2004). Toutefois, les rats adultes ne semblent pas
présenter d’hyperactivité et de défaut de PPI ou d’inhibition latente (Jongen-Relo et al.,
2004). Les rats traités à E15 présentent de grosses anomalies anatomiques et un fort déficit
de mémoire spatiale, tandis que ceux injectés à E17, qui ont une migration cellulaire
anormale dans l’hippocampe et une désorganisation laminaire corticale, semblent avoir une
mémoire de travail altérée (Gourevitch et al., 2004). D’autres études s’avèrent nécessaires
pour valider ce modèle.
Citons enfin le modèle de lésion bilatérale de l’hippocampe ventral chez les rats
nouveaux nés (Lipska et al., 1993), qui a fait l’objet de nombreux travaux (voir Lipska, 2004).
Ce modèle est intéressant car l’hippocampe est une structure altérée chez les
100
schizophrènes, qui projette directement sur le cortex préfrontal, également atteint chez ces
sujets. Les jeunes rats lésés (jour postnatal 35) paraissent moins sociables que leurs
contrôles mais se comportent normalement dans des tests moteurs impliquant un stress et
des agonistes dopaminergiques. A l’adolescence et à l’âge adulte (jour postnatal 56), les
animaux lésés montrent des changements de comportements liés à une transmission
dopaminergique accrue (hyperlocomotion en réponse au stress et aux stimulants,
augmentation des stéréotypies). Ils présentent également une hypersensibilité aux
antagonistes glutamatergiques (MK-801, PCP), des déficits du PPI et d’inhibition latente, un
comportement social altéré et des problèmes de mémoire de travail. Certains de ces
comportements,
excepté
le
retrait
social,
sont
améliorés
après
traitement
aux
neuroleptiques. Ce modèle paraît donc pertinent et répond aux principales exigences d’un
modèle animal pour la schizophrénie. Cependant, la sévérité de l’intervention, détruisant
totalement l’hippocampe ventral, contraste avec les changements neuropathologiques
modestes décrits sur les cerveaux post-mortem de patients schizophrènes. Un modèle
moins lourd d’inactivation transitoire de l’hippocampe ventral par injection de tétrodotoxine,
bloquant les canaux sodiques voltage-dépendants de façon réversible, a alors été développé
(Lipska et al., 2002). Les comportements des rats lésés sont similaires au modèle de lésion
permanente, avec toutefois une amplitude moindre et une absence d’altération du
comportement social.
c/ Modèles génétiques
Les études génétiques d’association et de liaison suggèrent que plusieurs régions
chromosomiques contiennent des gènes de susceptibilité à la schizophrénie, impliqués dans
la neurotransmission, le neuro-développement et la fonction synaptique. Des modèles
animaux invalidés pour différentes protéines impliquées dans ces processus ont donc été
générés (voir Robertson et al., 2006).
Selon l’hypothèse dopaminergique, plusieurs composants de ce système (récepteurs
D1-D5, COMT, MAO ; voir Gainetdinov et al., 2001a) ont ainsi été inactivés de façon
constitutive chez la souris. Par exemple, les souris invalidées pour le DAT (Giros et al., 1996;
voir partie I, Introduction, paragraphe 8) montrent une hyperlocomotion spontanée, des
stéréotypies et des déficits sensori-moteurs et cognitifs améliorés par des neuroleptiques.
Par contre, ces souris ne présentent pas d’altération de leur comportement social (comme le
modèle pharmacologique d’animaux traités à l’amphétamine), ni de réponse accrue aux
psychostimulants. En revanche, les souris exprimant 5 à 10% de la sous-unité NR1 du
récepteur glutamatergique NMDA montrent une hyperlocomotion, des stéréotypies en
101
réponse à un nouvel environnement ainsi que des déficits sociaux, normalisés par la
clozapine (Mohn et al., 1999). Cependant, le déficit de PPI de ces souris n’est pas amélioré
par cet antipsychotique (Fradley et al., 2005).
La calcineurine est une protéine dépendante du calcium et de la calmoduline,
impliquée dans la croissance neuritique, la plasticité synaptique et les fonctions
d’apprentissage et de mémoire. Une expression diminuée de cette protéine a été notée au
niveau de l’hippocampe de patients schizophrènes, potentiellement à l’origine d’une plasticité
réduite dans cette région (Gerber et al., 2003). Les souris invalidées pour cette protéine
spécifiquement au niveau du cerveau antérieur (Zeng et al., 2001) montrent des déficits de
plasticité synaptique, de certaines formes de mémoire, ainsi qu’une hyperlocomotion, une
altération du PPI, du comportement social et d’inhibition latente (Zeng et al., 2001; Miyakawa
et al., 2003).
La neuréguline 1 est aussi une protéine jouant un rôle dans la plasticité synaptique et
la neurogenèse, ainsi que la migration et la survie neuronales. Un polymorphisme situé dans
la partie non codante du gène a été positivement corrélé à la schizophrénie. Cette mutation
serait probablement impliquée dans la régulation de l’expression de la protéine (voir Tosato
et al., 2005). Les souris ne portant qu’une copie du gène montrent également des
comportements altérés : hyperlocomotion, déficit de PPI, d’inhibition latente,… (Gerlai et al.,
2000; Stefansson et al., 2002; Rimer et al., 2005).
Citons enfin les souris STOP KO (Andrieux et al., 2002), qui feront l’objet d’un
chapitre à part entière (voir chapitre C).
B/ Nicotine et schizophrénie
1/ Le système cholinergique
a/ Voies cholinergiques centrales
Dans le système nerveux central, les neurones cholinergiques sont localisés en amas
dans des noyaux mais aussi de façon diffuse dans certaines structures, en tant
qu’interneurones. Les noyaux cholinergiques sont regroupés dans deux zones cérébrales : le
prosencéphale, contenant la majorité des neurones et le tronc cérébral.
102
Le prosencéphale contient les structures anatomiques telles que la bande diagonale de
Broca, le noyau préoptique, la substance innominée, le noyau basal de Meynert et les
noyaux du septum.
Les neurones issus du septum et de la bande de Broca innervent
principalement l’hippocampe (voie septo-hippocampique), le cortex cingulaire et l’amygdale
(figure 29). Cette voie serait impliquée dans les processus d’apprentissage, de
mémorisation. Les projections issues des autres noyaux sont diffuses dans le cortex. Le
tronc cérébral comprend deux noyaux cholinergiques : le noyau pédonculaire et le noyau
tegmental latéral. Ces neurones innervent, entre autres, les noyaux thalamiques, l’habenula,
les colliculi supérieurs, la substance noire, l’aire tegmentale ventrale et le septum. Par
ailleurs, des interneurones cholinergiques sont notamment présents dans le noyau
accumbens et le striatum, où ils participent au processus de motricité extrapyramidale.
Raphe
Locus
nuclei
coeruleus
Figure 29 : Schéma illustrant les principaux noyaux cholinergiques et leurs projections
dans le cerveau de rat.
b/ Métabolisme de l’acétylcholine
L’acétylcholine (ACh) est synthétisée à partir de la choline et de l’acétyl coenzyme A,
par l’enzyme cytoplasmique choline acétyltransférase (ChAT):
Choline + Acétyl coenzyme A
Acétylcholine + Coenzyme A
ChAT
Les deux précurseurs ne sont pas disponibles en permanence dans le cytoplasme.
La choline provient à la fois de la dégradation d’un lipide circulant, la phosphatidylcholine et
103
de la dégradation de l’acétylcholine et l’acétyl coenzyme A est synthétisé et stocké dans les
mitochondries.
La choline est transportée à l’intérieur du neurone par deux mécanismes spécifiques :
-
un mécanisme lent, à faible affinité ;
-
un mécanisme actif à haute affinité, co-transportant la choline avec le
sodium extracellulaire, via le transporteur HACU (high affinity choline uptake),
également nommé CHT1 (choline transporter 1).
Après synthèse, l’acétylcholine est transportée activement dans les vésicules
synaptiques par le transporteur vésiculaire VAChT (vesicular acetylcholine transporter). Lors
de l’arrivée d’un potentiel d’action, les vésicules fusionnent à la membrane et leur contenu
est libéré dans l’espace synaptique : l’acétylcholine peut alors agir sur ses récepteurs
spécifiques. Contrairement aux monoamines classiques, mais comme l’histamine,
l’acétylcholine ne possède pas de transporteur plasmique spécifique. L’acétylcholine se lie à
deux types de récepteurs : des récepteurs ionotropiques, appelés également nicotiniques,
liant la nicotine et métabotropiques, dits muscariniques, liant la muscarine. Néanmoins,
environ la moitié de la quantité d’acétylcholine libérée est aussitôt métabolisée en choline et
en acétate dès son entrée dans l’espace synaptique. Cette dégradation est effectuée par
l’enzyme acétylcholine estérase; le temps d’inactivation d’une molécule d’acétylcholine est
estimé à 100 msec.
2/ La transmission cholinergique
L’acétylcholine agit sur deux types de récepteurs : les récepteurs muscariniques,
activés par la muscarine et les récepteurs nicotiniques, stimulés par la nicotine.
a/ Les récepteurs muscariniques
Les récepteurs muscariniques peuvent être classés en deux types : les récepteurs
activateurs (M1, M2, M5) et les récepteurs inhibiteurs (M2 et M4 ; figure 30). Les premiers
sont couplés à des protéines Gq, dont la stimulation entraîne l’activation du métabolisme des
phosphoinositides, via la phospholipase C et une libération de calcium intracellulaire,
aboutissant à une dépolarisation membranaire. Les récepteurs M2 et M4 sont quant à eux
couplés à une protéine Gi et inhibent l’adénylate cyclase, donc la production d’AMPc.
104
Figure 30 : Représentation schématique des voies de signalisation médiées par les deux
types de récepteurs muscariniques.
AC : adénylate cyclase ; Ins(1, 4, 5)P3 : inositol (1,4,5) triphosphate
D’après Eglen et al., 2001.
b/ Les récepteurs nicotiniques neuronaux
•
Structure et diversité des sous-unités
Les récepteurs nicotiniques (nAChRs) appartiennent à la superfamille des canaux
ioniques activés par des ligands, tout comme les récepteurs ionotropiques du GABA, de la
glycine et de la sérotonine (Karlin and Akabas, 1995). Ils ont une structure pentamérique,
constituée de cinq sous-unités transmembranaires assemblées autour d’un canal ionique
central (figure 31). Les sous-unités du système nerveux central se répartissent en deux
classes : les sous-unités α (α2-α10), se différenciant par la présence de deux résidus
cystéine adjacents, formant le site de liaison au ligand et les sous-unités β (β2-β4).
L’assemblage de sous-unités α et β donne lieu à de multiples combinaisons possibles.
105
ACh ou nicotine
Figure 31 : Représentation schématique d’un récepteur nicotinique ancré
dans la membrane plasmique.
D’un point de vue évolutif, l’ensemble de ces sous-unités peut être classé en deux
familles, définies sur la base de séquences protéiques et de la structure des gènes (voir
Arias, 2000). Les récepteurs homopentamériques sont constitués de cinq sous-unités α
appartenant à la famille I (α7-α10). Les hétéropentamères sont formés de deux sous-unités
α de la famille II (α2-α6) et trois sous-unités β de la famille II (β2-β4). L’association des
différentes sous-unités entre elles confère à chaque type de récepteur des propriétés
pharmacologiques et fonctionnelles distinctes (affinité pour les ligands, perméabilité calcique,
vitesse de désensibilisation, durée de re-sensibilisation…).
•
Classification et propriétés des récepteurs
Parmi les différentes classifications proposées, on peut retenir celle de Zoli et
collaborateurs (1998), qui différencie quatre types de récepteurs (le sigle * indique une
associations avec d’autres sous-unités) :
Type I (α7*) : caractérisés par leur sensibilité à l’antagoniste α-bungarotoxine et leur faible
affinité pour la nicotine, ces récepteurs sont des homopentamères composés de la sousunité α7. Leur vitesse de désensibilisation, donc d’inactivation, est très rapide.
Type II (α4α6β2*) : composés de la sous-unité β2, ils lient l’épibatidine avec une affinité
nanomolaire, meilleure que la nicotine. Cette classe contient essentiellement les récepteurs
α4β2, constituant 90% des récepteurs nicotiniques et également les récepteurs α*α6β2β*.
Type 3 (α3β4*) : ces récepteurs ne contiennent pas la sous-unité β2, lient l’épibatidine avec
une bonne affinité et se désensibilisent assez lentement.
106
Type 4 (α2α4β4* ; α3α5β4*): ces récepteurs ne contiennent pas non plus la sous-unité β2,
lient l’épibatidine et la cytisine avec une bonne affinité et ne lient pas la nicotine. Ils montrent
une désensibilisation rapide.
Régulation
Les nAChRs peuvent exister sous différents états conformationnels, régis par des lois
allostériques (Lena and Changeux, 1993). De manière simplifiée, en absence d’agoniste, le
récepteur est dans un état de repos. Lorsqu’un agoniste se lie au nAChR, ce dernier s’ouvre
pendant plusieurs millisecondes, laissant passer un flux de cations. Puis, il se referme de
façon plus ou moins rapide selon le type de récepteur et se retrouve dans un état
désensibilisé, qui évolue vers un état d’inactivation où le récepteur est réfractaire à
l’agoniste. Divers ligands ou processus peuvent modifier la fonctionnalité des nAChRs
(figure 32).
toxines α
agonistes et
antagonistes compétitifs
glycosylation
modulateurs et inhibiteurs
non compétitifs
agents non compétitifs
bloquant le canal
cytosquelette
Figure 32 : Représentation des sites allostériques d’un récepteur nicotinique.
D’après Dani, 2001.
De façon non conventionnelle, une exposition prolongée à l’agoniste engendre une
augmentation du nombre de nAChRs (Peng et al., 1994). Dans les cerveaux de fumeurs
post mortem, il a été trouvé un nombre de sites liant la nicotine significativement plus élevé
comparé aux cerveaux de non fumeurs (Breese et al., 1997). Ce processus serait la
conséquence de la désensibilisation rapide et de l’inactivation des récepteurs, provoquant
potentiellement un déficit de transmission cholinergique, pallié par un accroissement du
nombre de récepteurs.
107
Par ailleurs, il a récemment été montré que la consommation journalière de cigarettes
conduisait à une occupation quasi-complète des sites α4β2* (Brody et al., 2006).
Perméabilité calcique
Les nAChRs sont des canaux cationiques, permettant une entrée d’ions Na+ et Ca2+ et
une sortie d’ions K+. Comparés aux autres récepteurs canaux, les récepteurs nicotiniques
présentent la caractéristique d’être particulièrement perméables au calcium (voir Fucile,
2004). Le rapport de perméabilité entre le calcium et le sodium (PCa/PNa) se situe autour de
1,5 pour les hétéropentamères et peut atteindre une valeur dix fois plus élevée pour les
homopentamères α7. Ces derniers sont donc plus perméables au calcium que le récepteur
glutamatergique de type NMDA (PCa/PNa=7). Au potentiel de repos de la cellule, lorsque les
récepteurs NMDA sont bloqués par les ions Mg2+, les nAChRs constituent une voie majeure
d’entrée du calcium.
•
Localisations cérébrale et neuronale
Localisation cérébrale
Des expériences d’hybridation in situ chez le rongeur ont permis de montrer une
répartition assez diffuse et variée des ARNm codant pour les différentes sous-unités des
récepteurs nicotiniques (figure 33). Les ARNm des sous-unités α4, α7, β2 sont assez
largement exprimées dans tout le cerveau tandis que ceux de la sous-unité α6 sont
sélectivement
concentrés
au
niveau
des
corps
cellulaires
catécholaminergiques :
dopaminergiques (substance noire, aire tegmentale ventrale) et noradrénergiques (locus
coeruleus).
108
Télencéphale
bulbe olfactif
cortex
couche I-III
couche IV
couche V
coucheVI
hippocampe
striatum
septum
hypothalamus
NSO
Diencéphale
hypophyse
habenula
thalamus
α2
α3
α4
α5
α6
α7
β2
β3
β4
+
++
+
++
-
++
++
-
+
(+)
-
+
(+)
-
+
+
++
++
+
+
+
+
+
+
+
+
++
+
-
+
-
+
+
++
++
+++
+
+
+++
++
++
++
++
++
+
+
+
+
-
-
-
+++
+++
+
++
+++
+
+
-
(+)
+
(+)
-
+
++
+++
++
+
++
+
++
(+)
-
++
+
++
++
+++
+
(+)
(+)
++
++
+++
+
+++
+
-
+
(+)
+
++
++
+
+
(+)
++
+
+
+
+
+
+++
-
++
-
+
+
++
++
++
++
+
+++
-
+
+++
-
Mésencéphale
SN+ATV
IPN
Rhombencéphale
noyaux
cervelet
locus coeruleus
noyaux moteurs
NTS
area postrema
Figure 33 : Distribution différentielle des ARNm de différentes sous-unités des
récepteurs nicotiniques dans le cerveau de rat.
ATV: aire tegmentale ventrale ; IPN : noyau interpédonculaire ; NTS : noyau du tractus
solitaire ; NSO : noyau supraoptique ; SN : substance noire
Tableau adapté de Lena and Changeux, 1998, d’après Le Novere et al., 1996; Lena and
Changeux, 1997; Pidoplichko et al., 1997; Winzer-Serhan and Leslie, 1997; Zoli et al.,
1998.
D’autre part, des études de radioliaison, utilisant des radioligands plus ou moins
sélectifs des différents récepteurs ont permis de localiser les récepteurs nicotiniques. Ainsi,
par liaison de [3H]-nicotine, [125I]-épibatidine et de [3H]-cytisine sur coupes, il a été montré
que les sous-unités α4 et β2 sont les plus largement exprimées dans le cerveau de rongeur
(Flores et al., 1992; Hill et al., 1993; Zoli et al., 1998). Leur présence a été décrite au niveau
du cortex cérébral
(Clarke et al., 1985; Zilles et al., 1989), du striatum, du noyau
accumbens, des noyaux thalamiques, des colliculi supérieurs, de l’habénula médiane, de
109
l’aire tegmentale ventrale, de la substance noire pars compacta et du noyau
interpédonculaire (Clarke et al., 1985; Zoli et al., 1998).
Les récepteurs nicotiniques contenant la sous-unité α6, liant l’125I-α-conotoxine MII,
sont exprimés dans la rétine, les noyaux catécholaminergiques (substance noire, aire
tegmentale ventrale, locus coeruleus), le striatum, le noyau interpédonculaire et l’habénula
médiane (Zoli et al., 1998; Champtiaux et al., 2002). Ces régions correspondent aux
neurones exprimant les ARNm de la sous-unité α6 (Le Novere et al., 1996).
Les sites de liaison à l’[125I]-α-bungarotoxine, composés de la sous-unité α7, sont
distribués de manière diffuse dans l’ensemble du cerveau et plus fortement au niveau du
cortex, de l’hippocampe (gyrus denté et région CA1), du striatum et de l’amygdale (Clarke et
al., 1985; Orr-Urtreger et al., 1997).
Localisation neuronale
La fonction des récepteurs nicotiniques la plus fréquemment observée est la
stimulation de la libération de neurotransmetteurs (pour revue, voir Wonnacott, 1997). Pour
cela, ils sont situés stratégiquement au niveau présynaptique : terminal ou pré-terminal
(figure 34). Ces récepteurs présynaptiques terminaux (A) et pré-terminaux (B) permettent de
stimuler la libération de la quasi-totalité des neurotransmetteurs étudiés : une application
exogène
d’un
agoniste
ou
d’un
antagoniste
nicotinique
augmente
ou
diminue,
respectivement, la libération d’acétylcholine elle-même, de dopamine, de noradrénaline, de
sérotonine, de glutamate et de GABA (voir Dani, 2001 et références associées). La
stimulation des récepteurs nicotiniques provoque l’entrée d’un flux d’ions Na+, dépolarisant la
membrane et capable d’activer les canaux calciques voltage-dépendants, engendrant une
libération accrue de neurotransmetteur calcium-dépendante.
A
B
Figure 34 : Représentation schématique de la localisation des récepteurs nicotiniques
(nAChRs) au niveau terminal du neurone (A) ou préterminal (B).
110
Les récepteurs homomériques α7, particulièrement perméables au calcium, pourraient
aussi provoquer un influx calcique suffisamment important pour conduire à une exocytose
indépendante des canaux voltage-dépendants. Ainsi, dans des tranches et cultures
d’hippocampe de rat, la stimulation des récepteurs présynaptiques de type α7 initie un flux
de calcium qui augmente la libération de glutamate des terminaisons présynaptiques
(Albuquerque et al., 1997). Le calcium intracellulaire joue également le rôle de second
messager, activant plusieurs voies de régulation, notamment des protéines kinases et
phosphatases. Au niveau pré-terminal (B), la stimulation ou l’inhibition des récepteurs
nicotiniques joue sur l’activité des canaux sodium voltage-dépendants, favorisant ou
inhibant, respectivement la régénération d’un potentiel d’action.
Les récepteurs nicotiniques sont également localisés, quoique plus rarement, sur les
soma et dendrites de neurones post-synaptiques (figure 35).
Figure 35 : Représentation schématique de récepteurs nicotiniques postsynaptiques.
Ce type de transmission direct et rapide a notamment été détecté au niveau
d’interneurones GABA pendant le développement du cortex visuel (Roerig et al., 1997).
Cependant, d’une manière générale, la transmission nicotinique rapide ne représente qu’un
très faible pourcentage du signal excitateur qui est très majoritairement glutamatergique.
3/ Relation entre nicotine et schizophrénie
a/ Etudes épidémiologiques
De nombreuses études épidémiologiques ont montré que la consommation de tabac
était beaucoup plus forte chez les populations d’individus atteints de maladies mentales,
111
particulièrement les schizophrènes, comparées à des populations contrôles (Glassman,
1993). Ainsi, on estime à 70-80% le pourcentage de fumeurs parmi les sujets atteints de
schizophrénie, contre 20-30% dans la population générale (de Leon et al., 2002). De plus,
les fumeurs schizophrènes semblent avoir une plus forte consommation de cigarettes (Ucok
et al., 2004), apprécier les cigarettes plus chargées en nicotine (Olincy et al., 1997) et
extraire plus de nicotine de leurs cigarettes que les fumeurs sains (Strand and Nyback,
2005). Une étude prospective a également montré que la consommation régulière de tabac
chez les adolescents était significativement prédictive de l’apparition ultérieure de
schizophrénie, avec un effet-dose par rapport à la consommation quotidienne de cigarettes
(Weiser et al., 2004). Toutes ces données ont suggéré un éventuel dysfonctionnement de la
transmission nicotinique chez les schizophrènes.
b/ Expression des récepteurs nicotiniques chez les schizophrènes
Des expériences de liaison de l’α-bungarotoxine ou d’immunochimie sur des
cerveaux post-mortem de schizophrènes ont décelé une réduction du nombre de récepteurs
nicotiniques de type α7 au niveau de l’hippocampe (Freedman et al., 1995; Leonard et al.,
1996) et du cortex préfrontal (Guan et al., 1999; Martin-Ruiz et al., 2003). Dans cette
dernière région, aucune différence significative d’ARNm de la sous-unité α7, ou d’immunoréactivité des sous-unités α4, α3 ou β2 n’a été observée chez les schizophrènes comparés
aux témoins (Martin-Ruiz et al., 2003). Par contre, la liaison de l’épibatidine semble
augmentée dans le cortex préfrontal des schizophrènes, révélant une augmentation des
récepteurs de type α4β2 (Durany et al., 2000; Martin-Ruiz et al., 2003). D’autres études ont
trouvé une diminution des récepteurs à haute affinité pour la nicotine dans l’hippocampe et le
striatum (Freedman et al., 1995; Durany et al., 2000). Cependant, un autre groupe n’a pas
décelé de changement significatif de liaison de la nicotine au niveau de l’hippocampe, du
thalamus, du cortex et du striatum, mais plutôt un dysfonctionnement dans la régulation des
récepteurs α4β2 des patients schizophrènes en réponse à la nicotine (Breese et al., 2000).
Remarquons que la grande difficulté de ces études provient des critères d’inclusion des
patients, qui ne sont pas toujours identiques entre les différentes études. Il est d’autant plus
difficile d’avoir accés à un grand nombre de sujets schizophrènes à la fois non traités par des
antipsychotiques et non fumeurs.
112
4/ La nicotine comme forme d’auto-médication
L’ensemble des données épidémiologiques et biochimiques suggèrent que la nicotine
serait utilisée dans un processus d’auto-médication, afin de réduire les déficits cognitifs
associés à la schizophrénie, d’augmenter l’effet thérapeutique et/ou de réduire les effets
secondaires dus au traitement par les antipsychotiques (pour revue, voir Kumari and
Postma, 2005)
a/ Amélioration des symptômes et des effets secondaires
Selon Smith et collaborateurs (2002), la nicotine, via la cigarette, serait capable de
réduire les symptômes déficitaires de la schizophrénie, sans effet sur les symptômes
productifs. Ceci proviendrait de la capacité qu’à la nicotine, comme les autres drogues
d’abus, d’augmenter la libération de dopamine au niveau de la voie méso-limbique (noyau
accumbens et cortex préfrontal), réduisant ainsi l’hypofrontalité avancée dans l’hypothèse
dopaminergique, qui serait responsable des symptômes déficitaires (Weinberger and
Berman, 1988; Dalack et al., 1998).
De façon intéressante, les antipsychotiques atypiques, comme la clozapine, qui ont
une bonne affinité pour divers récepteurs de plusieurs neuromédiateurs, sont plus efficaces
que les neuroleptiques conventionnels pour améliorer cette classe de symptômes. Une
étude a montré que la clozapine, en bloquant les récepteurs sérotoninergiques 5HT-3,
favorisait la libération de plusieurs neurotransmetteurs, dont l’acétylcholine, ce qui stimulerait
l’activité des récepteurs nicotiniques et la libération de dopamine (Imperato et al., 1993; Arnt
and Skarsfeldt, 1998). En outre, les patients schizophrènes passant d’un traitement à
l’halopéridol à un traitement à la clozapine réduisent leur consommation de cigarettes
(McEvoy et al., 1995).
Les
antipsychotiques
ont
une
forte
capacité
de
blocage
des
récepteurs
dopaminergiques D2, conduisant à l’apparition de symptômes moteurs extra-pyramidaux de
type Parkinsonien. L’administration de nicotine sous forme de patchs réduirait les
dyskinésies induites par les neuroleptiques (Yang et al., 2002), en stimulant la libération de
dopamine. De la même manière, la nicotine améliorerait le ralentissement cognitif, les
déficits de mémoire spatiale et d’attention chez les sujets schizophrènes (Levin et al., 1996).
b/ Amélioration des déficits sensoriels
Chez les patients schizophrènes et leurs apparentés non atteints, de nombreuses
études ont mis en évidence des déficits de filtrage sensoriel. L’individu atteint de
113
schizophrénie intègre malgré lui une multitude d’informations sensorielles extérieures
(visuelles, auditives), lui rendant très difficile de se focaliser sur une tâche précise (une
conversation, par exemple) et le conduisant à une fragmentation cognitive et une pensée
désorganisée (voir Light and Braff, 2003). Notons que ces anomalies de filtrage sensoriel ne
sont pas spécifiques de la schizophrénie et sont retrouvées dans d’autres troubles
psychiatriques, comme les troubles bipolaire et dépressif. Ces altérations de la perception
sensorielle peuvent être appréhendées chez l’homme par deux tests, communément
employés, mesurant le PPI (prepulse inhibition ou inhibition du réflexe de sursaut) et la
suppression de l’onde P50.
•
Amélioration du PPI
Chez les mammifères, le réflexe de sursaut se traduit par la contraction réflexe des
muscles faciaux et squelettiques en réponse à un stimulus intense. Si celui-ci est précédé de
30 à 500 msec d’un stimulus de faible intensité (prepulse), la réponse au deuxième stimulus
est significativement diminuée (figure 36). Cette réponse se mesure par électromyographie
du muscle oculaire chez l’homme ou par une réduction du sursaut du corps de l’animal.
stimulus
pulse
sursaut
réponse normale
prepulse
réponse inhibée
Figure 36 : Représentation du paradigme de l’inhibition du réflexe de sursaut (PPI).
D’après Light and Braff, 2003.
Les schizophrènes montrent un défaut d’inhibition de leur réflexe de sursaut (Braff et al.,
2001) qui peut être amélioré de façon transitoire par la nicotine (Kumari et al., 2001). Il en est
de même chez les rongeurs (Acri et al., 1991; Curzon et al., 1994), bien que ce résultat
semble dépendre des souches étudiées (Faraday et al., 1999).
114
•
Amélioration du filtrage de l’onde P50
L’onde P50 est une onde de potentiel évoqué, produite environ 50 millisecondes après
un stimulus auditif. La suppression de l’onde P50 correspond à la réduction de l’amplitude
d’une seconde onde suivant un stimulus, quand un stimulus identique est présenté 75 à
2000 msec après le premier (figure 37).
Cette réponse, qui se mesure par électroencéphalographie, est anormale chez 80% des
schizophrènes (Adler et al., 1982; Waldo et al., 1991) et 50% de leurs apparentés de premier
degré (Waldo et al., 1991). Il a été montré que la nicotine, administrée sous forme de
cigarettes ou de gommes, était capable de normaliser transitoirement ce déficit de filtrage
sensoriel chez ces deux populations (Adler et al., 1982; Adler et al., 1992; Adler et al., 1993).
D’autre part, la schizophrénie et ce déficit de filtrage de l’onde P50 ont été liés
génétiquement au locus du gène codant la sous-unité α7 du récepteur nicotinique
(Freedman et al., 1997; Freedman et al., 2001). Cette liaison concernerait un polymorphisme
qui se trouverait dans la région promotrice du gène α7, suggérant un défaut de régulation de
son expression (Leonard et al., 2002).
ST1
ST2
50 ms
50 ms
500 ms
Stimulus auditif
Réponse P50
Suppression P50 normale
filtrage
Suppression P50 déficiente
défaut de filtrage
Figure 37 : Représentation du paradigme de la suppression de l’onde P50.
ST1 : premier stimulus ; ST2: deuxième stimulus. D’après Light and Braff, 2003.
De manière intéressante, les souris de la lignée DBA/2Ibg montrent une densité de
liaison de l’α-bungarotoxine moins grande que celles de la lignée C3H (Marks et al., 1989) et
présentent un déficit de filtrage auditif (Stevens et al., 1996). La nicotine normalise ce déficit,
115
de même qu’un agoniste des récepteurs nicotiniques α7, le GTS-21 (Stevens et al., 1998),
démontrant que ce récepteur joue un rôle important dans ce phénotype.
Ces comportements de filtrage sensoriel font intervenir, sur le plan neurologique,
l’activation de circuits inhibiteurs. Le GABA est vraisemblablement impliqué puisque les
interneurones GABA portent des récepteurs nicotiniques et que la nicotine induit la libération
de GABA chez l’homme et l’animal (Freedman et al., 1993; Alkondon et al., 1997a). Il a été
proposé que la baisse des récepteurs α7 nicotiniques chez les schizophrènes provoquerait
une diminution de l’activation cholinergique d’interneurones GABAergiques, engendrant une
moindre inhibition (Leonard et al., 1998; Martin et al., 2004). La nicotine augmenterait la
libération de glutamate, facilitant la libération de GABA par les interneurones, à l’origine de
l’inhibition des neurones pyramidaux localisés dans l’hippocampe (aires CA3 et CA4). Ceci
expliquerait l’inhibition de la réponse au second stimulus (Alkondon et al., 1997a).
Ajoutons enfin deux tâches de mouvements oculaires, la poursuite lente et la tâche
d’anti-saccade, qui sont testées chez l’homme uniquement. Ces deux comportements sont
altérés chez les schizophrènes (Ettinger et al., 2003) et améliorés après administration de
nicotine (Olincy et al., 2003).
c/ Amélioration des déficits cognitifs
De nombreux travaux réalisés chez l’homme et l’animal ont démontré que la nicotine
et les agonistes nicotiniques étaient capables d’améliorer diverses fonctions cognitives alors
que des antagonistes nicotiniques les altéraient (Levin and Simon, 1998; Levin et al., 2002).
En traitement aigu ou chronique, la nicotine et ses agonistes, comme l’épibatidine, peuvent
augmenter l’attention et la mémoire de travail chez les individus sains. Chez les
schizophrènes, la nicotine améliore l’attention soutenue et réverse les déficits de mémoire de
travail spatiale induits par l’abstinence de cigarettes (George et al., 2002). Sous forme de
patch, la nicotine améliorerait les performances lors d’une tâche d’attention (Depatie et al.,
2002), alors que dans une autre étude, sous forme de spray nasal, elle n’aurait pas d’effet
bénéfique sur cette même tâche (Sherr et al., 2002). Récemment, un agoniste partiel des
récepteurs nicotiniques α7, le DMXB-A, a permis d’améliorer les performances de
schizophrènes dans une batterie de tests neurocognitifs (Martin et al., 2004; Olincy et al.,
2006).
116
C/ La protéine STOP
1/ Microtubules et protéines associées
a/ Les microtubules
Les cellules eucaryotes contiennent un réseau de fibres cytoplasmiques qui constitue
leur cytosquelette, au contraire des cellules procaryotes, qui en sont dépourvues. Ce
cytosquelette, responsable de la structure et de la motilité cellulaire, est composé de trois
grandes familles de protéines, très conservées dans l’évolution : les microtubules, les
microfilaments d’actine et les filaments intermédiaires.
Les microtubules sont des tubes creux de 25 nm de diamètre de longueur variable,
constitués de 13 protofilaments de tubuline (figure 38). Chaque protofilament est lui-même
constitué de dimères de tubuline : tubulines α et β. Cet assemblage polymérique est, dans la
plupart des cellules, extrêmement labile : les extrémités des microtubules se polymérisent,
utilisant l’énergie provenant de l’hydrolyse du GTP et se dépolymérisent en permanence. Les
deux extrémités des microtubules ont des propriétés différentes : il existe une extrémité
"plus" où les dimères s'ajoutent et une extrémité "moins" qui, au contraire, perd
progressivement ses dimères.
Figure 38 : Représentation schématique d’un microtubule, composé de protofilaments,
eux-mêmes formés par l’assemblage de monomères de tubuline α et β.
Les microtubules interviennent dans plusieurs fonctions vitales pour la cellule, telles
que la division cellulaire et le trafic des vésicules. Ils forment le fuseau mitotique qui permet
de ségréguer équitablement les deux jeux de chromosomes dans les cellules filles. Ils
117
servent également de rails directeurs pour le transport d’organites et sont impliqués dans la
polarisation et la morphogenèse des cellules.
La tubuline est abondamment présente dans le système nerveux central où elle
représente environ un cinquième des protéines cérébrales. Les microtubules sont donc très
nombreux dans les neurones, en particulier dans les dendrites et les axones. Ils permettent
d'acheminer divers composants, comme les vésicules synaptiques et les mitochondries, vers
les extrémités neuronales, servant de véritables rails sur lesquels des moteurs moléculaires
(par exemple la kynésine), liant les composants à transporter, se déplacent.
Les neurones, contrairement aux autres types cellulaires, contiennent une grande
proportion de microtubules stables, résistants aux substances dépolymérisantes et aux
basses températures. La pertinence physiologique de la résistance au froid reste incomprise.
Ces microtubules seraient importants pour la génération et la maintenance de la
morphologie et des fonctions neuronales (Baas and Heidemann, 1986). Ces propriétés de
stabilité leur sont conférées par certaines protéines, appartenant à la famille des protéines
associées aux microtubules, les MAPs (microtubule associated proteins).
b/ Les protéines associées aux microtubules
Par définition, les MAPs sont des protéines associées aux microtubules par des
interactions très fortes puisqu’elles co-immunoprécipitent avec la tubuline. Elles ont un rôle
de médiateur, étant placées entre les microtubules et les composants de la cellule en
interaction avec ces microtubules. Elles influent sur la structure et la dynamique des
microtubules, ainsi que sur les processus de transport axonal et de motilité cellulaire.
On peut distinguer deux sous-ensembles : les MAPs moteurs (dynéine, kynésine) qui
ont une activité enzymatique et participent au transport et à la motilité cellulaire et les MAPs
structurales, qui régulent la dynamique des microtubules, en influant sur la stabilité et
l’organisation des microtubules. Parmi ces dernières, les mieux caractérisées sont MAP2,
tau, anormalement phosphorylée dans la maladie d’Alzheimer, et STOP.
2/ La protéine STOP
La protéine STOP (stable tubule only polypeptide), comme la BPAG1 et la
doublecortine, confère aux microtubules neuronaux la capacité de résister au froid.
Initialement isolée de préparations de cerveaux de rat de microtubules résistants au froid,
cette protéine lie la calmoduline et joue un rôle essentiel dans la stabilisation des
118
microtubules in vitro (Job et al., 1981; Job et al., 1982). L’inhibition de sa fonction par
addition d’anticorps à des cultures de cellules neuronales abolit la stabilité des microtubules
au froid et aux agents dépolymérisants dans les neurites (Guillaud et al., 1998). De même,
des cellules injectées pendant la phase de différentiation, avec des anticorps dirigés contre
la protéine STOP ou des oligonucléotides antisens, ont une croissance neuritique altérée
(Guillaud et al., 1998).
Le gène codant la protéine STOP, nommé Mtap6 chez la souris (situé sur le
chromosome 1q32) ou Map6 chez l’homme (situé sur le chromosome 11q14), a été cloné il y
a une dizaine d’années (Bosc et al., 1996; Denarier et al., 1998b). Ce gène est composé de
quatre exons, codant différentes isoformes issues de l’épissage du transcrit et de l’utilisation
de promoteurs alternatifs (figure 39, voir Bosc et al., 2003). Selon le type cellulaire, on
trouve ainsi N-STOP (100 kDa) et E-STOP (84 kDa) dans les neurones, F-STOP (42 kDa)
dans les fibroblastes ainsi que A-STOP (60 kDa) et O-STOP (89 kDa) dans les astrocytes et
les oligodendrocytes, respectivement (Bosc et al., 1996; Denarier et al., 1998a; Guillaud et
al., 1998; Galiano et al., 2004). La séquence du gène contient quatre sites consensus de
phosphorylation par la CaM kinase II et deux sites putatifs riches en proline liant les
domaines SH3. N-STOP est la forme majoritairement exprimée dans le cerveau adulte.
Notons que le gène STOP n’est apparemment présent que chez les vertébrés : mammifères,
poissons et oiseaux (Bosc et al., 2003).
119
Figure 39 : Structure du gène et protéines STOP :
A/ Représentation schématique montrant les domaines structuraux de la protéine NSTOP. B/ Organisation du gène STOP de souris (Mtap6), montrant les différents exons
et représentation schématique de 3 variants de STOP.
KR : domaine riche en lysine et arginine ; P : domaine riche en proline. Les barres
rouges représentent les sites putatifs de phosphorylation par la CaMKII.
D’après Bosc et al., 2003.
Au niveau du cerveau de souris, les transcrits sont fortement exprimés dans
l’hippocampe, un peu plus faiblement au niveau du cervelet et des cortex occipital, frontopariétal et cingulaire, avec une moindre expression dans le striatum (Eastwood et al., sous
presse). La protéine, très ubiquitaire, est trouvée un peu plus concentrée au niveau des
bulbes olfactifs, de l’hippocampe et du cervelet (Andrieux et al., 2002). Au sein des
neurones, la protéine STOP est cytoplasmique, abondante au niveau des épines
dendritiques, à proximité des densités postsynaptiques et se trouve également dans les
axones (Andrieux et al., 2002). Récemment, il a été montré que la phosphorylation de STOP
par la CaM kinase II était responsable de la translocation de la protéine des microtubules
vers les compartiments synaptiques où elle pourrait interagir avec l’actine (Baratier et al.,
2006).
Afin de mieux évaluer le rôle de cette protéine in vivo, Andrieux et collaborateurs
(2002) ont créé des souris invalidées pour la protéine STOP (STOP KO).
120
3/ Les souris STOP KO
Par recombinaison homologue, l’exon 1 du gène Mtap6 a été remplacé par une
cassette contenant le gène codant la néomycine, permettant une sélection positive et le
gène rapporteur LacZ (Andrieux et al., 2002). Le croisement de souris hétérozygotes donne
naissance à des souris STOP KO viables, dans des proportions mendéliennes.
a/ Caractérisation anatomique et physiologique
Les souris STOP KO sont dépourvues de microtubules neuronaux stables à basse
température (figure 40).
WT
STOP KO
37°C
0°C
Figure 40 : Analyse de la stabilité au froid de microtubules dans des cultures primaires
neuronales de souris sauvages (WT) et invalidées pour la protéine STOP (STOP KO).
Les cellules sont exposées à 37°C ou à 0°C pendant 45 mn. Les microtubules sont
marqués avec un anticorps anti β-tubuline (vert) et les noyaux avec l’agent Hoescht
33258 (bleu). D’après Andrieux et al., 2002.
De façon surprenante, compte tenu du rôle des microtubules dans la croissance
neuronale, l’anatomie du cerveau des souris mutées, analysée en microscopie, ne présente
pas d’anomalies structurelles ou de dégénérescences neuronales évidentes. L’organisation
des bulbes olfactifs ainsi que la structure en « champs de tonneaux » du cortex
somatosensoriel sont normales. Au niveau de l’hippocampe, l’organisation des fibres
moussues de la zone CA3, la configuration somato-dendritique des cellules pyramidales de
121
la région CA1 ainsi que l’arborisation dendritique des cellules de Purkinje cérebelleuses sont
préservées chez les souris STOP KO (Andrieux et al., 2002).
L’examen de synapses hippocampiques par microscopie électronique a montré une
densité deux fois moins élevée de vésicules synaptiques au sein des collatérales de Schaffer
glutamatergiques, très précisément au niveau de la couche stratum radiatum de la région
CA1 (Andrieux et al., 2002). L’analyse de la quantité de différentes protéines synaptiques
dans des synaptosomes n’a pas permis de déceler de différence chez les animaux mutés,
suggérant un import normal des protéines synaptiques vers la zone active de la synapse. En
revanche, par hybridation in situ, une baisse significative des transcrits des gènes
présynaptiques codant pour la synaptophysine, VGLUT1 (transporteur vésiculaire du
glutamate 1), GAP43 (growth associated protein 43), ainsi que du gène postsynaptique de la
spinophiline a été trouvée dans plusieurs régions, dont l’hippocampe (Eastwood et al., sous
presse).
Des études électrophysiologiques au niveau de cette même région ont révélé une
plasticité synaptique à court et long terme altérée chez les animaux STOP KO. Tandis que la
transmission synaptique basale est normale, la potentialisation à long terme (LTP) au niveau
des collatérales de Schaffer et de l’aire CA1 est diminuée d’un facteur trois. La dépression à
long terme (LTD) est également plus faible dans cette région, de même que la
potentialisation post-tétanique (PTP), probablement à cause de la taille réduite du pool
vésiculaire glutamatergique (Andrieux et al., 2002). Dans la région CA3, au niveau des
synapses fibres moussues-cellules pyramidales, la LTP n’est pas modifée, mais un déficit de
plasticité synaptique à court terme a été retrouvé.
b/ Caractérisation biochimique
Les concentrations de dopamine extracellulaire mesurées par microdialyse
quantitative au niveau du striatum et du noyau accumbens sont normales chez les animaux
STOP KO, comparés aux contrôles (Brun et al., 2005). Des expériences d’électrochimie,
mesurant l’efflux dopaminergique après stimulation électrique des fibres dopaminergiques
issues du mésencéphale, ont également été menées chez ces souris. A faible fréquence, il
n’y a pas de différence significative de l’efflux évoqué entre les deux génotypes. En
revanche, pour des fréquences de 15 à 50 Hz, on observe une forte potentialisation de
l’efflux dopaminergique au niveau du noyau accumbens des souris mutées (Brun et al.,
2005). Par contre, au niveau du striatum de ces mêmes animaux, cet efflux a tendance à
être diminué par rapport aux contrôles, bien que non significativement. Les souris STOP KO
présentent donc une réponse normale à une stimulation tonique et une hyper-réactivité au
122
signal phasique, spécifiquement au niveau du noyau accumbens. D’après l’analyse des
courbes de cinétique de clairance de dopamine, cette réponse excessive serait due à un
excès de libération de dopamine et non à la diminution de recapture du neurotransmetteur
par son transporteur plasmique ou une inhibition déficiente médiée par les auto-récepteurs
D2/D3 (Brun et al., 2005).
c/ Caractérisation comportementale
Les souris STOP KO présentent des troubles multiples et sévères de leur
comportement. Elles alternent entre des crises d’hyperactivité ou au contraire de prostration,
avec
apparition
d’activité
sans
but
apparent
et
désorganisation
des
séquences
comportementales normales (Andrieux et al., 2002). Elles ont une locomotion accrue en
réponse à un nouvel environnement, à un léger stress et également pendant la phase
nocturne du cycle circadien (Brun et al., 2005). Ces animaux montrent des signes d’anxiété
importante dans le test de la boîte claire-obscure puisqu’ils passent significativement plus de
temps dans le compartiment sombre. Ils sont également incapables de réussir les tests de
reconnaissance d’objet, probablement par manque d’intérêt pour leur environnement
physique. En outre, les souris mutantes ont un comportement social fortement altéré :
l’investigation sociale ainsi que le comportement agressif envers des congénères sont
nettement diminués (Andrieux et al., 2002).
D’autre part, les femelles STOP KO sont incapables d’élever leur progéniture : elles
ne manifestent que très peu d’intérêt pour leurs petits et ne sont pas capables de les
ramener au nid pour les allaiter. Plusieurs tests ont montré que ce défaut de soins maternels
était indépendant de l’état hormonal des souris (présence de lait dans les mamelles) ou de
perturbations sensorielles (odorat, vue ; Andrieux et al., 2002).
Les souris STOP KO sont hypersensibles à l’effet stimulant locomoteur de
l’amphétamine (Brun et al., 2005) et, de façon intéressante, plusieurs de leurs
comportements peuvent être améliorés par l’administration de neuroleptiques. Une dose
aiguë de clozapine, inefficace chez les sauvages, est ainsi capable de réverser
l’hyperlocomotion de ces souris (Fradley et al., 2005). Néanmoins, seul un traitement
chronique de quatre mois par des neuroleptiques (chlorpromazine+halopéridol) est capable
d’améliorer le déficit de maternage des femelles mutées (Andrieux et al., 2002). Ce
traitement n’a aucun effet sur la transmission synaptique de base mais améliore la LTP et la
PTP, initialement déficientes chez les mutants. De même, ce traitement réduit partiellement
le déficit en vésicules synaptiques dans la région CA1 de l’hippocampe (A. Andrieux,
123
communication personnelle). Enfin, les animaux STOP KO présentent un déficit de PPI, qui
n’est pas amélioré par l’injection d’une dose aiguë de clozapine (Fradley et al., 2005).
d/ Un modèle pour la schizophrénie ?
Les souris STOP KO ont été proposées pour étudier l’efficacité des neuroleptiques
dans la schizophrénie et les troubles schizoïdes (Andrieux et al., 2002). En effet, ces souris
présentent divers troubles comportementaux qui sont sensibles à ces molécules. Ces
animaux ne montrent pas de défaut anatomique évident, mais présentent des altérations
synaptiques dans l’hippocampe (pool vésiculaire diminué, défauts de plasticité synaptique),
qui est une structure atteinte chez les schizophrènes. Comme d’autres modèles animaux
proposés pour la schizophrénie, ces souris sont hypersensibles au stress et à l’amphétamine
et manifestent un déficit de PPI ainsi qu’un retrait social. De plus, ce modèle, issu de
l’inactivation d’une protéine associée au cytosquelette, semble présenter des troubles de la
transmission dopaminergique (hyperdopaminergie dans le noyau accumbens), sans
modification de la transmission basale ainsi que des altérations du système glutamatergique
(hypoglutamatergie dans l’hippocampe), comme ce qui est suspecté dans la schizophrénie.
Des changements d’expression de protéines synaptiques ont également été trouvés, en
accord avec ce qui a été décrit chez des patients schizophrènes (Mirnics et al., 2001).
Enfin, le gène STOP humain (Map6), situé sur le chromosome 11q14, se trouve
proche d’une région associée aux désordres mentaux, dont les troubles schizoïdes (St Clair
et al., 1990). De fait, très récemment, une association génétique a été découverte entre un
polymorphisme de ce gène et une population de schizophrènes japonais (Shimizu et al.,
2006). Une hausse significative d’expression d’une des deux isoformes de Map6 a
également été décelée au niveau du cortex préfrontal de cerveaux post-mortem de
schizophrènes (Shimizu et al., 2006).
L’ensemble de ces éléments, décrivant le récent modèle des souris STOP KO,
suggère que ces animaux pourraient reproduire certains traits étiologiques et/ou
symptomatiques de la schizophrénie, constituant potentiellement un modèle pertinent pour
l’étude de cette maladie.
124
RESULTATS
125
ARTICLE I : Augmentation de la densité des récepteurs
nicotiniques alpha7 chez les souris STOP KO et amélioration par la
choline d’un déficit d’apprentissage de type associatif
Caroline Bouvrais-Veret1+, Stéphanie Weiss1+, Annie Andrieux2, Annie Schweitzer2, J.
Michael McIntosh3, Didier Job2, Bruno Giros1 and Marie-Pascale Martres1#
+
contribution équivalente
(article soumis pour publication au journal Neuropharmacology)
126
Contexte de l’étude
Les souris invalidées pour la protéine STOP associée aux microtubules (Andrieux et
al., 2002) montrent une hyper-réactivité dopaminergique au niveau du système limbique,
probablement associée à une hypoglutamatergie dans l’hippocampe. Elles présentent
également
de
nombreux
troubles
comportementaux,
dont
une
hypersensibilité
à
l’amphétamine, un déficit de filtrage sensori-moteur et un comportement social altéré
(Andrieux et al., 2002; Brun et al., 2005; Fradley et al., 2005). Différents éléments de ce
phénotype sont en partie améliorés par un traitement aigu ou chronique par des
neuroleptiques. Ces traits physiologiques et comportementaux sont généralement associés à
la schizophrénie et suggèrent que ces souris pourraient constituer un modèle pertinent pour
cette pathologie mentale.
De nombreuses études épidémiologiques ont montré une forte prévalence de
fumeurs parmi les individus atteints de schizophrénie : 80 à 90% des schizophrènes fument
contre 25-30% de la population générale (Glassman, 1993; de Leon et al., 1995). Il a été
suggéré que la nicotine, qui agit via ses récepteurs canaux principalement en modulant la
libération de nombreux neurotransmetteurs, constituait une forme d’auto-médication chez les
patients (Kumari and Postma, 2005). Par exemple, la nicotine améliore le déficit de filtrage
sensoriel de l’onde P50 retrouvés chez les schizophrènes, probablement via la stimulation
des récepteurs nicotiniques α7 (Freedman et al., 1997; Adler et al., 1998; Siegel et al., 2005)
Le but de ces travaux a été de caractériser le phénotype nicotinique des souris STOP
KO et d’éventuelles altérations des composants et/ou fonctions de ce système. Pour cela,
nous avons quantifié les densités protéiques de certains composants du système
cholinergique et récepteurs nicotiniques. Puis, nous avons analysé l’activité locomotrice des
souris en réponse à l’injection de nicotine et testé la mémoire associative de nos animaux et
l’effet sur celle-ci d’un agoniste des récepteurs α7.
Principaux résultats
•
Les densités de certains récepteurs nicotiniques et composants cholinergiques
sont modifiées dans le cerveau des souris STOP KO (figure 1, tableaux 1 et 2)
La densité relative de l’acétylcholine estérase (AChE) n’est pas modifiée dans les
régions cérébrales analysées des souris mutées, contrairement celle du transporteur
127
vésiculaire de l’acétylcholine (VAChT) qui est diminuée de manière significative (-17 à -33%)
dans l’hippocampe (figure 1, tableau 1).
Aucune différence de densité du récepteur de type β2* n’a été décelée dans les
diverses structures cérébrales analysées. Par contre, la densité du récepteur nicotinique de
type α6* est significativement diminuée dans le striatum et le noyau accumbens (20-40%)
des animaux mutés et celle du récepteur nicotinique α7 est significativement augmentée
dans le striatum (25%) et dans les différentes couches de l’hippocampe dorsal (25-70%).
•
La nicotine provoque un effet locomoteur biphasique chez les souris STOP KO
(figure 2)
Chez les souris sauvages, la nicotine administrée à des doses croissantes a
globalement un effet hypolocomoteur, qui devient significatif à partir de 1 mg/kg (figure 2).
Chez les souris STOP KO, la nicotine provoque un net effet locomoteur biphasique,
constitué d’une composante hyperlocomotrice jusqu’à 1 mg/kg, maximale à 0,5 mg/kg, suivie
d’une composante hypolocomotrice pour les doses supérieures.
La dose inhibitrice de nicotine efficace à 50% (DI50) est identique chez les souris des
deux génotypes. L’activité locomotrice verticale des souris montre un profil similaire à celui
de l’activité horizontale.
•
La choline n’a pas d’effet locomoteur global chez les deux génotypes de souris
(figure 3)
Afin de tester l’effet de la choline, agoniste sélectif des récepteurs nicotiniques α7,
sur les performances des souris dans la version associative du labyrinthe aquatique de
Morris, nous avons tout d’abord analysé l’effet locomoteur de cet agent.
Chez les souris sauvages, la choline aux trois doses testées n’induit pas d’effet
locomoteur significatif sur l’activité horizontale et verticale des animaux (figure 3). Chez les
souris mutantes, la choline augmente l’activité horizontale de manière dose-dépendante et
significative, jusqu’à 165% à 30 mg/kg. A l’inverse, la choline inhibe l’activité verticale des
souris mutées de façon dose-dépendante, jusqu’à 80% à 30 mg/kg.
•
Les souris STOP KO ont des performances déficitaires dans une tâche de
mémoire associative, qui sont améliorées par l’administration de choline (figure 4)
Nous avons testé les performances des souris STOP KO dans la version associative
du labyrinthe aquatique de Morris. Les souris STOP KO ont de mauvaises performances
128
comparées aux souris sauvages : la latence pour trouver la plate-forme et la distance
parcourue pour l’atteindre sont significativement plus grandes (figure 4) et la proportion
d’essais réussis est significativement plus faible.
Nous avons alors testé les effets de la choline sur les capacités mnésiques des
souris dans cette même tâche. Quinze minutes avant chaque essai, les animaux des deux
génotypes ont reçu du sérum physiologique ou la choline à une dose de 0,3 mg/kg. A cette
dose, la choline n’a pas d’effet sur la vitesse de nage des souris des deux génotypes (non
montré). Chez les souris sauvages, le traitement à la choline n’a pas d’effet significatif sur la
latence et la distance parcourue mais augmente significativement la proportion d’essais
réussis. Chez les animaux mutés, la choline diminue la latence et la distance parcourue de
façon significative. De plus, la choline améliore la proportion d’essais réussis, de sorte que
les performances des souris STOP KO traitées à la choline ne sont plus significativement
différentes de celles des souris sauvages.
Conclusions de l’étude
L’ensemble des résultats de cette étude montre que l’inactivation constitutive de la
protéine STOP, plutôt ubiquitaire, provoque d’importantes modifications de composants
cholinergiques et de récepteurs nicotiniques, de façon région- et protéine-dépendante. Ces
modifications ont vraisemblablement pour effet d’altérer certaines fonctions nicotiniques. Les
animaux mutants sont hypersensibles à l’effet hyperlocomoteur de la nicotine, en accord
avec leur hypersensibilité à l’amphétamine (Brun et al., 2005). Malgré l’importante
augmentation de récepteurs α7 dans des structures impliquées dans l’apprentissage, les
souris mutantes présentent un défaut important de mémoire associative. Ce déficit est
quasiment restauré par l’administration d’un agoniste des récepteurs nicotiniques α7, la
choline. Ce résultat, associé à la diminution de densité de VAChT, suggère que la
neurotransmission nicotinique est probablement déficiente chez ces animaux mutants.
129
Sustained increase of alpha7 nicotinic receptors and cholineinduced improvement of learning deficit of STOP knock-out mice.
C. Bouvrais-Veret,a+ S. Weiss,a+ A. Andrieux,b A. Schweitzer,b J. M. McIntosh,c D. Job,b B.
Girosa and M.-P. Martresa#
+
equal contribution
a
Inserm, U513, Laboratoire de Neurobiologie et Psychiatrie, Créteil, F-94000 France; Univ
Paris 12, Créteil, F-94000 France
b
Inserm, U366, Laboratoire du Cytosquelette, CEA, Grenoble, F-38000 France cDepartment
of Psychiatry, University of Utah, Salt Lake City, UT 84112
Running title: Nicotinic transmission in STOP KO mice
Key words: cytoskeleton, dopamine, locomotion, cued version of the Morris watermaze,
schizophrenia, vesicular acetylcholine transporter/nicotinic receptors
Footnote : For nAChRs, * indicates the association with other subunits
#Corresponding author. Inserm U513, Laboratoire de Neurobiologie et Psychiatrie, Créteil, F94010 France. Tel: (33) 139 813 635; fax: (33) 139 813 658; E-mail address: [email protected]
Acknowledgements: The authors thank Drs M. Nosten-Bertrand (Inserm U513) and V. Setola
(Inserm U616) for helpful discussion and D. Proietto (Inserm U366) for mouse genotyping.
This work was supported by Inserm (AA, AS, DJ, BG, MPM) and by NIH MH 53631 and
DA12242 (JMM). CBV and SW were the recipients of a fellowship from MILDT and the
"Société de Tabacologie", respectively.
130
ABSTRACT
Mice deficient for the microtubule stabilizing protein STOP (Stable Tubule Only
Polypeptide) show synaptic plasticity anomalies and dopamine hyper-reactivity in the limbic
system, in spite of the absence of anatomical and neurological defects. These mice exhibit
severe behavioural deficits, some being alleviated by long-term antipsychotic treatment.
Therefore, this mouse line represents a pertinent model for some aspects of schizophrenic
symptomatology.
Numerous data support dysfunction of nicotinic transmission in schizophrenia and
epidemiological studies show increased tobacco intake in schizophrenic patients, in whom
nicotine has been reported to improve deficits in sensory gating and cognitive dysfunctions.
In this study, we examined potential alterations in cholinergic (ACh) and nicotinic
components and functions in STOP mutant mice. STOP KO mice displayed no variation of
the density of ACh esterase and β2* nicotinic receptors (nAChRs), decreased density of
vesicular ACh transporter and α6* nAChRs and highly increased density of α7 nAChRs, in a
subtype- and area-dependent manner. STOP KO mice were hypersensitive to the stimulating
locomotor effect of nicotine and, interestingly, the impaired performance of mutant mice in
learning a place task (cued version of the Morris watermaze) were improved by
administration of the α7 nAChR agonist choline.
Altogether, our data suggest that nicotinic neurotransmission can be deficient in
STOP KO mice and that mutant mice can represent a meaningful model for the study of
some nicotinic adaptations and/or dysfunctions related to schizophrenia.
Key words: cytoskeleton, dopamine, locomotion, Morris water-maze, schizophrenia, vesicular
acetylcholine transporter/nicotinic receptors
131
INTRODUCTION
Neuronal microtubules play a key structural role in morphogenesis and protein
transports in dendrites and axons. Recently, microtubules and their effectors such as
microtubule-associated proteins (MAP 1B, STOP) or sequestering proteins, have been
implicated in synaptic plasticity events (Andrieux et al., 2002; Shumyatsky et al., 2005; van
Rossum et al., 1999; Zervas et al., 2005). Mice deficient for the protein STOP exhibit
characteristics reminiscent of schizophrenia, including impaired behaviours, cognitive deficits
and
neurotransmission
disorders
combining
potential
hypoglutamatergia
and
hyperdopaminergia, some of which improved by antipsychotic treatment (Andrieux et al.,
2002).
Surprisingly, STOP knock-out (KO) mice do not display any obvious disturbance of
neuronal cell morphology, but exhibit synaptic abnormalities in the hippocampus. This
includes depleted glutamatergic vesicle pools and highly decreased long-term potentiation
and depression in the CA1 field. These mice show severe behavioural deficits, such as
purposeless and disorganized activity, impaired social interactions and maternal behaviour,
deficits in prepulse inhibition (PPI) of the startle reflex, hypersensitivity to mild stress and to
the stimulant locomotor effect of amphetamine. STOP KO mice also display a dopamine
(DA) hyper-reactivity in the limbic system (Brun et al., 2005). Whereas basal extracellular DA
levels are not modified in the striatum and the nucleus accumbens of mutant mice, evoked
stimulated DA release is selectively increased in the nucleus accumbens of STOP KO mice,
suggesting a hyperDAergia in the meso-limbic system. Importantly, some of these
dysfunctions can be alleviated by acute or chronic antipsychotic drug treatment (Andrieux et
al., 2002; Brun et al., 2005). Therefore, STOP KO mice may represent a pertinent
experimental model for various symptoms present in schizophrenia, in agreement with recent
models in which schizophrenia arises from synaptic disorders (Frankle et al., 2003; Mirnics et
al., 2001; Owen et al., 2005). Finally, a recent study shows decreased mRNA transcript
levels of synaptic protein in the hippocampus of STOP KO mice, such as synaptophysin,
GAP-43 and spinophilin (Eastwood et al., 2006).
Numerous data support dysfunction of nicotinic neurotransmission in several
psychiatric disorders, including schizophrenia. In particular, post-mortem studies show
decreased number of nicotinic receptors in various brain areas of schizophrenic patients
(Breese at al., 2000; Freedman et al., 1995, 1997; Leonard et al., 2002; Martin-Ruiz et al.,
2003; Milhailescu et al., 2000). Moreover, linkage studies strongly suggest that the P50
auditory sensory deficit in schizophrenia is genetically linked to the locus of the α7 nicotinic
receptor gene (Freedman et al., 1997; Leonard et al., 2002). In addition, epidemiological
studies show an increased tobacco intake in schizophrenic patients: 80-90% versus 25-30%
in the general population (de Leon et al., 1995, 2002; Glassman et al., 1993). It is suggested
that nicotine could serve as a self-medication to improve a number of cognitive deficits
associated with schizophrenia, to enhance the therapeutic effect of antipsychotics, to
alleviate negative symptoms and/or to reduce the side-effects of antipsychotic drugs (Kumari
and Postma, 2005). Thus, deficits in sensorimotor gating, often encountered in schizophrenic
patients and their first-degree relatives, is alleviated by nicotine, probably via its action
through hippocampal α7 nicotinic receptors (Adler et al., 1998; Freedman et al., 1997; Siegel
et al., 2005).
Nicotinic neurotransmission facilitates the activity of a wide diversity of transmitter
pathways, including the mesocorticolimbic and nigrostriatal DAergic and the glutamatergic
transmission (Jones et al., 1999). Nicotine acts via stimulation of its multiple nicotinic
acetylcholine receptor (nAChR) subtypes, widely distributed in the CNS. Beta2 nicotinic
132
subunits, associated with α4 or α6 subunits, are the most prominent nAChRs located on
DAergic neurons (Champtiaux et al., 2003; Zhou et al., 2002) and on many GABA neurons in
the areas containing DA cell bodies and terminals (Klink et al., 2001; Picciotto et al., 1998;
Zhou et al., 2002). Other nAChRs, mostly α7 nAChRs, are mainly expressed on
glutamatergic terminals (Mansvelder et al., 2000; Nomikos et al., 2000).
Thus, STOP KO mice, which represent a pertinent experimental model for some
schizophrenic related symptoms, offer us the opportunity to characterize key-components of
the cholinergic/nicotinic neurotransmission. We first determined the density of acetylcholine
esterase (AChE), of vesicular ACh transporter (VAChT) and of β2*, α6* and α7 nAChRs in
various brain areas of wild-type (WT) and STOP KO mice. Then, in order to evaluate the
potential consequences of the modified expression of cholinergic/nicotinic markers, we chose
to characterize two behaviours that involved nicotinic neurotransmission, namely nicotineinduced locomotor activity and pro-cognitive effect of the α7 nAChR agonist choline.
133
MATERIALS AND METHODS
ANIMALS
Homozygous STOP KO mice and their WT littermates were obtained from the intercross (F2)
of heterozygous 50:50 BALBc/129 SvPas-F1 mice (Andrieux et al., 2002). The genotype of
the mice was determined from tail biopsies as previously described (Andrieux et al., 2002).
Animals were housed 4-6 per cage by gender and litter, with sawdust bedding and under
standard conditions, i.e. laboratory chow and water available ad libitum, temperature and
humidity maintained at 23±2°C and 55±10%, respectively, and a light cycle of a 12 h light:12
h dark (lights on at 7:30 a.m.). Experiments were carried out in accordance with the
European Communities Council Directive (86/809/EEC) and approved by the local ethical
committee. Mice were allowed to habituate to the animal holding room for at least one week
prior to use. All experiments were conducted on naive WT and KO mice (about 60%/40%
females/males), 3-4 month old and of the same litters.
DRUGS
Nicotine bitartrate and choline hydrochloride were purchased from Sigma-Aldrich (St Louis,
MO). All drugs were dissolved in physiological serum as free bases and were administered
by s.c route under a volume of 100 µl per 20 g weight. [125I]-Epibatidine (74 TBq/mmol) and
3-[125I]-iodotyrosyl-α-bungarotoxin (74 TBq/mmol) were from GE healthcare. [125I]-αConotoxin-MII was synthetized as previously described (Whiteaker et al., 2000). Before use,
rabbit [125I]-Ig F(ab’)2 fragment antibodies (28-111 TBq/mmol, GE healthcare, Orsay, France)
were purified by gel filtration onto a PD10 column (Sephadex G25 M, Pharmacia) in PBS (50
mM NaH2PO4/Na2HPO4, 154 mM NaCl) containing 0.1% gelatin. The first 0.25 ml eluate
was discarded and the following 3.5 ml eluate was put into 400 ml PBS supplemented with
3% bovine serum albumin (BSA), 1% goat serum, 1 mM NaI and 0.02% sodium azide. This
solution was kept at 4°C, for 4-6 weeks.
QUANTITATIVE AUTORADIOGRAPHY
Mice were killed by cervical dislocation (between 10:00 a.m. and 4:00 p.m.) and their brains
rapidly removed and frozen in isopentane at –30°C. Serial 10 µm coronal sections were cut
at –20°C, thaw-mounted on Superfrost Plus® slides and then stored at –80°C until use.
Immunoautoradiography of acetylcholine esterase (AChE) and vesicular acetylcholine
transporter (VAChT)
Brain sections were fixed with 4% paraformaldehyde for 15 min at room temperature (RT),
extensively washed with PBS and then incubated for 1 h at RT in PBS containing 3% BSA,
1% goat serum and 1 mM NaI. Sections were incubated for 2 h at RT (or overnight at 4°C) in
the presence of AChE antiserum (1:1,000 dilution, polyclonal AChE antibody characterized
by (Marsh et al., 1984) or VAChT antiserum (1:8,000 dilution; polyclonal antibody directed
against mouse VAChT Ser478-Ser530 peptide). After washes, slides were incubated for 2 h
at RT with purified anti-rabbit [125I]-IgG (370-740 MBq/100 ml). Sections were extensively
washed with PBS, dried and exposed to Biomax MR films for 1-4 days.
Autoradiographic determination of β2*, α6* and α7 nicotinic receptor densities
To rule out possible binding of endogenous acetylcholine to nicotinic receptors, sections
were pre-incubated in buffer before addition of radioactive ligands.
134
The labelling of β2* subunits was performed according to(Plenge and Mellerup, 1998). The
slides were pre-incubated three times for 5 min at RT in 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4
containing 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2 and 1 mM MgCl2 (Tris-ions buffer).
Sections were then incubated for 40 min at RT in the same fresh buffer, in the presence of
0.4 nM [125I]-epibatidine with or without 300 µM nicotine to determine non specific binding.
Slides were then washed twice for 5 min in Tris-ions buffer at 4°C, dipped in ice-cold water,
dried and exposed to Biomax MR films for 2-3 days.
Labelling of α6* subunits was performed according to Whiteaker et al. (2000). Slides were
pre-incubated for 15 min at RT in 20 mM HEPES (4-[2-hydroxyethyl]-1-piperazine
ethanesulfonic acid) buffer, pH 7.5, containing 144 mM NaCl, 1.5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1
mM MgSO4 (standard binding buffer), supplemented with 0.1% BSA and 1 mM
phenylmethylsulfonyl fluoride. They were then incubated in the presence of 0.8 nM [125I]-αconotoxin-MII for 2 h at RT in standard binding buffer supplemented with 0.1% BSA, 5 mM
EDTA, 5 mM EGTA and 1 mg/100 ml of aprotinin, leupeptin and pepstatin A (protease
inhibitors). Non specific binding was determined in the presence of 1 µM epibatidine. Slides
were washed for 30 sec at RT and then at 4°C in standard binding buffer plus 0.1 % BSA.
Afterwards, sections were washed twice for 5 sec at 4°C in standard binding buffer with
0.01% BSA and, finally, twice for 5 sec at 4°C in 5 mM HEPES buffer pH 7.5. After dipping in
ice-cold water and drying, they were exposed to Biomax MR films for 24-72 h.
Labelling of α7 nicotinic receptors was performed according to Spurden et al. (1997). The
slides were pre-incubated for 30 min at RT in 50 mM Tris–HCl buffer, pH 7.4, containing
0.1% BSA. Sections were next incubated for 2 h at RT in the same buffer in the presence of
0.5 nM [125I]-α-bungarotoxin, with or without 1 mM nicotine to determine non specific
binding. Slides were then washed four times for 10 min in ice-cold Tris-HCl buffer, dipped in
ice-cold water, dried and exposed to Biomax MR films for 1 week.
Quantification of autoradiographic labelling
Standard radioactive-microscales (GE healthcare) were exposed on each autoradiographic
film to ensure that labelling densities were in the linear range. The autoradiograms were
scanned and densitometry was performed with MCIDTM Analysis software. Labelling
densities (mean grey values) of four sections per area were averaged for each mouse.
BEHAVIOURAL STUDIES
Locomotor activity
The horizontal (locomotion) and vertical (rearing) activities were individually assessed in
transparent activity cages (20x15x25 cm), with automatic monitoring of photocell beam
breaks, located at 1.5 cm (horizontal activity) and 6.5 cm (vertical activity) above the floor
(Imetronic, Bordeaux, France). For the dose-response analysis of nicotine and choline,
locomotor activities of mice were recorded for 60 min immediately after s.c. drug
administration, between 9:00 a.m. and 2:00 p.m..
Cued version of the Morris water-maze
The water-maze consists of a circular stainless steel pool (150 cm diameter, 29 cm height),
filled to a depth of 16 cm with 20-22 °C water made opaque using a white aqueous emulsion
(Acusol® OP 301 opacifier, Rohm Ihaas, France). The escape platform (9 cm diameter),
made of rough stainless steel, was submerged one cm below the water surface. The pool
135
was located in a sound-attenuated and brightly illuminated room. A video tracking system,
including an overhead camera connected to an image analyzer and a computer (View Point,
France), was used to monitor activity. Saline or choline (0.30 mg/kg, free base, s.c.) was
injected and mice were tested 15 min later.
In the cued version (or place task), mice were trained to find and escape onto a platform,
made visible by a small contrasted ball (4.5 cm diameter) fixed 11 cm above the platform.
The pool was surrounded by curtains to hide distal cues. Animals were trained with two trials
per day for 5 consecutive days. The maximal latency to find the plateform is 90 sec. The first
trials were conducted from 10:00 a.m., mice were left undisturbed in their home cage for the
2 hours intertrial and the second trials were from 2:00 p.m. Both the platform location and the
animal's starting position were pseudo-randomized for each trial. The mean latency (sec), the
mean distance travelled (m), the swimming speed (m/min) and the number of successful
trials were calculated for each mouse.
STATISTICAL ANALYSIS
Data from autoradiographic experiments were subjected to factorial one-way analysis of
variance (ANOVA), with genotype as between-group. Significant main effects were further
analyzed by comparisons of means using the Fisher’s exact test. Behavioural data were
subjected to factorial two-, three- or four-way ANOVA, with genotype, sex, treatment as
between-group and time as within-group factors. Significant main effects were further
analyzed by post-hoc comparison of means using the Fisher’s test. The numbers of
successful trials in the Morris water-maze tests were compared by the Kolmogorov-Smirnov
non-parametric test.
136
RESULTS
Quantification of acetylcholine/nicotinic components
Relative densities of cholinergic markers and nicotinic receptors were determined in
various brain areas of WT and STOP KO mice.
No significant variation of ACh esterase (AChE) density was found in the various areas
tested in STOP KO mice, compared to WT mice (Fig. 1, Table 1). The results from
immunoautoradiographic labelling of vesicular ACh transporter (VAChT) showed a near
significant effect of genotype in the hippocampus and the CA1 and CA3 fields (genotype x
area: F(2,24)=2.68, p=0.089). The density of VAChT was significantly decreased by 17% in
the entire dorsal hippocampus (F(1,8)=8.92, p=0.0174) and by 33% in the CA1 field
(F(1,8)=27.50, p=0.0008) in STOP KO compared to WT mice, whereas it was not modified in
the other areas tested (Fig. 1, Table 1).
In all areas tested, [125I]-epibatidine at low concentration is a specific ligand of β2*
subunits (Marks et al., 2006). Its autoradiographic labelling is entirely suppressed in mice
lacking the β2 subunit gene (Zoli et al., 1998) and recovered by its re-expression in the
ventral tegmental area (Maskos et al., 2005). No variation of β2* nAChR subunit density was
found between WT and STOP KO mice (Fig. 1, Table 2). Analysis of the relative density of
α6* subunits showed a significant effect of genotype (genotype x area: F(5,54)=8.49,
p<0.0001). The density of α6* subunits was significantly decreased in the striatum (-19%,
F(1,10)=24.56, p=0.001), in the shell (-33%, F(1,10)=48.55, p<0.0001) and in the cone part
of the nucleus accumbens (-39%, F(1,10)=65.16, p<0.0001) of STOP KO (Fig. 1, Table 2).
Analysis of the α7 nAChR density showed a significant effect of genotype (genotype x area:
F(10,80)=2.10, p=0.034). The density of α7 nAChR in STOP KO mice was significantly
increased in the dorsolateral striatum (+24%, F(1,7)=7.16, p=0.032), in the dorsal
hippocampus (+24%; F(1,9)=5.22, p=0.048), the CA1 (+51%, F(1,8)=13.22, p=0.007) and
the CA3 fields (+67%, F(1,9)=7.92, p=0.020) and the lacunosum moleculare layer of
hippocampus (+34%, F(1,8)=7.36, p=0.027). Density of α7 nAChRs was nearly significantly
increased in the shell of the nucleus accumbens (+16%, F(1,4)=5.89, p=0.072).
Effects of nicotine on the locomotor activity
In order to evaluate the potential consequences of the altered VAChT and nAChR
densities, we first studied the locomotor effects of nicotine. Since male and female mice of
each genotype did not show any significant difference in locomotor activity (not shown), their
data were pooled. In both genotypes, acute administration of nicotine at increasing doses
elicited a multi-phasic dose-dependent response on the horizontal and vertical locomotor
activities (Fig. 2).
In WT mice, nicotine at 0.1 mg/kg induced a nearly significant inhibition of the
horizontal activity by 32% over the first 30 min, compared to saline treatment (treatment x
time: F(5,100)=2.26, p=0.0540, Fig. 2A, C). The dose of 0.5 mg/kg had no effect compared
to saline treatment, but induced a significant 38% increased horizontal locomotion during the
first 30 min, compared to 0.1 mg/kg (treatment x time: F(5,60)=2.38, p=0.0494). At doses
greater than 0.5 mg/kg, nicotine elicited a dose-dependent hypolocomotor effect (treatment:
F(3,32)=10.79, p<0.0001; treatment x time: F(33,352)=3.20, p<0.0001), with an ID50%=1.6
mg/kg and a maximal inhibition (Imax)=100%. The effects of nicotine on vertical locomotor
activity were similar to those observed on the horizontal activity in WT mice (Fig. 2D). At
dose higher than 0.5 mg/kg, nicotine exerted a pronounced dose-dependent hypolocomotion
137
(treatment: F(3,30)=6.98, p=0.001; treatment x time: F(33,330)=3.12, p<0.0001; Fig. 2D),
with an ID50%=1 mg/kg and a maximal inhibition of 100%.
In STOP KO mice, nicotine at 0.1 mg/kg had no effect on the horizontal activity (Fig. 2B, C).
The dose of 0.25 mg/kg significantly increased the locomotion by 50% over the time course,
compared to saline treatment (treatment x time: F(11,198)=2.21, p=0.0152; not shown and
Fig. 2C). Nicotine at 0.5 mg/kg stimulated the horizontal activity of STOP KO mice (Fig. 2B,
C) by 130% over the time course, compared to saline (treatment: F(1,18)=6.91, p=0.0170).
For doses higher than 0.5 mg/kg, nicotine depressed the locomotor activity in a dosedependent manner (treatment: F(3,30)=4.91, p=0.007; treatment x time: F(33,330)=1.48,
p=0.0476), with an ID50%=1.6 mg/kg and an Imax=100%. The effects of nicotine on vertical
locomotor activity were similar to those observed on the horizontal activity in STOP KO mice
(Fig. 2D). Nicotine at 0.5 mg/kg significantly increased by 54% the vertical activity of mutant
mice over the time course (treatment x time: F(11,132)=2;59, p=0.005). At doses greater
than 0.5 mg/kg, nicotine elicited a dose-dependent hypolocomotion (treatment: F(3,25)=8.29,
p=0.0005; treatment x time: F(33,275)=3.29, p<0.0001), with an ID50%=1.1 mg/kg and an
Imax=100%. This demonstrated that the increased horizontal locomotion induced by nicotine
at the doses of 0.25 and 0.5 mg/kg was not due to an inhibition of vertical activity.
Effects of choline on the locomotor activity
Choline at the three doses tested had no effect on the horizontal (Fig. 3A, C) or the
vertical (Fig. 3D) activity of WT mice. In STOP KO mice, choline significantly increased the
horizontal activity in a dose-dependent manner, over the time course (treatment:
F(3,26)=5.98, p=0.003; treatment x time: F(33,286)=2.51, p<0.0001; Fig. 3B, C), by 78% at
0.3 mg/kg (treatment: F(1,12), p=0.0651), by 116% at 3.0 mg/kg (treatment: F(1,13)=9.87,
p=0.008, treatment x time: F(11,143)=1.798, p=0.0605) and by 166% at 30 mg/kg (treatment:
F(1,13)=19.09, p=0.0008, treatment x time: F(11,143)=6.52, p<0.0001).
In contrast, choline significantly inhibited the vertical activity of STOP KO mice, in a dosedependent manner (treatment: F(3,18)=3.71; treatment x time: F(33,198)=2.27, p=0.0003;
Fig. 3D), by 69% at 3.0 mg/kg (treatment x time: F(11,110)=2.91, p=0.002) and by 88% at 30
mg/kg (treatment: F(1,10)=6.70, p=0.027; treatment x time: F(11,110)=4.64, p<0.0001).
Effect of choline on performance of WT and STOP KO mice in the cued version of the Morris
water-maze
Animals of both genotypes received saline or 0.30 mg/kg choline, 15 min before each
trial. At these time and dose, choline had no effect on the swimming speed of both WT and
STOP KO mice (not shown).
WT mice learned correctly the task, since the latency time and the swum distance to find the
platform was decreased by 59% (F(1,16)=15.60, p=0.001) and 61% (F(1,16)=14.07,
p=0.002) between day 1 and day 5, respectively (Fig. 4). In constrast, STOP KO mice did not
learn correctly, as their performance were not significantly improved between day 1 and day
5. The latency time of STOP KO mice was higher than WT mice by 20% for the 5-day
session (genotype x time: F(4,68)=2.39, p=0.0595) and by 42% between day 3-5 (genotype:
F(1,34)=5.04, p=0.0384). Mutant mice travelled more distance to reach the platform
(genotype x time: F(4,68)=2.33, p=0.0643, between day 1-5) and the number of successful
trials was significantly lower (Chi2=3.200, p=0.0375, Fig. 4).
Choline treatment had no effect on the performance of WT mice, since their latency and
distance were not significantly modified by choline during trials. However, the number of
138
successful trials of WT mice was significantly increased by choline treatment (Chi2=4.350,
p=0.025). In contrast, choline treatment improved the performance of STOP KO mice.
Choline-treated STOP KO mice learned correctly the task, since their latency time was
decreased by 54% (F(1,18)=13.25, p=0.002) and their distance by 62% (F(1,18)=32.24,
p<0.0001), between day 1 and day 5. Compared to saline-treatment, choline decreased the
latency time of STOP KO mice between day 1-5 (treatment x time: F(4,72)=2.30, p=0.067)
and the distance (treatment x time: F(4,72)=3.35, p=0.0143). Moreover, choline treatment
significantly increased the number of successful trials of STOP KO mice (Chi2=3.760,
p=0.025).
Finally, performance of choline-treated STOP KO mice and saline-treated WT mice
were no longer different (genotype x treatment: latency F(4,68)=0.32, distance F(4,68)=0.08,
number of successful trials Chi2=0.200).
139
DISCUSSION
STOP KO mice have been proposed as a model for some symptoms exhibited in
schizophrenia (Andrieux et al., 2002; Brun et al., 2005). The pertinence of this experimental
mouse line is strengthened by recent studies showing an association between schizophrenia
and polymorphism markers of the MAP6 gene, the human homologous of STOP gene
(Shimizu et al., 2006). Since dysfunctions of ACh/nicotinic neurotransmission are suspected
in schizophrenia and since schizophrenic patients abuse tobacco (probably as a selfmedication), we decided to characterize the nicotinic phenotype of STOP KO mice. Our data
demonstrate that STOP KO mice displayed important modifications in the cholinergic
components, nicotinic receptors and functions. The constitutive inactivation of the ubiquitous
protein STOP elicited modified VAChT and nicotinic receptor densities, in an area- and subtype dependent-manner. Mutant mice were hypersensitive to nicotine-induced locomotor
hyperactivity and, interestingly, their impaired performance in the cued version of the Morris
watermaze were improved by the α7 receptor agonist, choline.
In STOP KO mice, whereas the density of AChE, the ACh inactivating enzyme, was
not modified in any brain areas, the density of VAChT, the vesicular ACh transporter, was
selectively decreased in the granular layer of the hippocampal CA1 field, but not modified in
the CA3 field and in the median septum containing somas of cholinergic neurons. This
suggests that modulation of VAChT expression depends on a specific regional/neuronal
environment. Importantly, a two-fold decrease in glutamatergic synaptic vesicles has been
found in CA1 field and correlated with altered synaptic transmission in this structure
(Andrieux et al., 2002). No synaptic defect has been observed in CA3 field, suggesting areadependent alterations. The decreased density of VAChT could result from a drop in the
amount of cholinergic terminals and/or of vesicular transporters per vesicle and/or a global
reduction in vesicle number per terminal. In any event, reduction in VAChT density might
result in decreased ACh release. Interestingly, modified VAChT was located in terminals of
septo-hippocampal cholinergic neurons thought to be involved in learning and memory
(Leanza et al., 1995).
The relative density of β2* nAChRs was not modified in any tested area of STOP null
mice. In contrast, α6 nAChR subunit density was highly decreased in the striatum and the
shell and cone parts of the nucleus accumbens and α7 nAChR density was highly increased
in the dorsolateral striatum and, particularly, in many layers of the dorsal hippocampus, but
not in the median septum. Such opposite effects on α6* and α7 nAChR density were also
found in DA transporter (DAT) KO mice, another experimental model pertinent for
schizophrenia (Gainetdinov et al., 2001; Giros et al., 1996; Weiss et al., in preparation). In
these mice, modifications of nAChR density are thought to originate from constitutive
hyperdopaminergia.
In order to evaluate the potential consequences of the modified expression of
cholinergic/nicotinic markers, we chose to characterize two behaviours that involved nicotinic
neurotransmission, namely nicotine-induced locomotor activity and choline-effect on learning
performance.
In WT mice, nicotine elicited a multiphasic locomotor effect, since it first depressed
locomotor activity at low doses, had no effect at 0.5 mg/kg and, finally, strongly inhibited the
locomotor activity for higher doses. In STOP KO mice, nicotine 0.5 mg/kg induced a two-fold
increase in locomotor activity. The hypersensitivity of mutant mice to the stimulating
locomotor effect of nicotine was in agreement with previous results on amphetamine (Brun et
140
al., 2005). In rodents, nicotine can increase locomotion in a familiar environment probably via
activation of DAergic pathways through distinct nAChRs (Menzaghi et al., 1997; Picciotto et
al., 2001). In our case, habituation of STOP KO mice to actimeter cages was not different
from their WT counterparts (compare the time course of basal activities after saline
administration, Fig. 1 A and B). On the other hand, the hypersensitivity of STOP KO mice to
the stimulating locomotor effect of nicotine could be due to an enhanced DA release effect.
Recent studies in STOP KO mice showed that the DA efflux evoked by electrical stimulations
mimicking physiological stimulation is highly increased in the nucleus accumbens (Brun et
al., 2005). Studies on various nAChR subunit KO mice indicate that nicotine exerts its DA
releasing effect mainly via β2* nAChRs (Maskos et al., 2005; Picciotto et al., 1998). The
relative density of nicotinic β2 subunits was not modified in STOP KO mice but their
sensitization state has not been determined. Increased striatal α7 nAChRs, if they were
functional, could also participate to the nicotine-induced DA release, taking into account the
strategic localization of α7 nAChRs on glutamatergic terminals in DAergic areas (Kaiser and
Wonnacott, 2000). Finally, other non-AChRs could mediate the hypersensitivity of STOP KO
mice to the stimulant effect of nicotine.
In contrast, STOP KO mice were not hypersensitive to the depressant locomotor
effect of nicotine at higher doses, unlike the hyperactive DAT KO mice (Weiss et al., in
preparation). As the neuronal substrates responsible for acute nicotine hypolocomotor effects
have not been fully elucidated, it is difficult to relate this data to nicotinic or non nicotinic
components.
Since the density of α7 nAChRs was highly increased in the hippocampus of STOP
KO mice, we first assessed spatial learning of mice in the Morris watermaze. In this version,
WT mice did not learn to find the hidden platform up to an 8-day training (not shown). The
bad performance of mice can be attributed to the strain (50:50 Balbc/129ScPas), since both
parental strains were poor performers (van Dam et al., 2006). Accordingly, we have chosen
another easier task, i.e. the cued platform version of the watermaze, in which mice were
trained to swim to a platform mounted with a visible cue and placed in a different location on
each trial. Such a learning is thought to be mediated by the basal ganglia, in particular the
dorsal striatum (Packard and Knowlton, 2002), where α7 nAChR density was also increased
in STOP KO mice. In this place task, STOP KO mice show impaired performances compared
to WT littermates. Contrary to WT mice whose performance were improved during the
successive trials, mutant mice did not learn correctly to find the platform during the 5-day
training, as their mean latency and distance travelled were not significantly decreased
between day 1 and day 5.
Numerous studies in humans and rodents demonstrate the pro-cognitive effect of
nicotine, via α7 nAChR stimulation (Adler et al., 1998; Levin et al., 2002; Siegel et al., 2005;
Young et al., 2004). The highly increased α7 nAChR density in the hippocampus and the
dorsolateral striatum of STOP KO mice has prompted us to test the cognitive performance of
mice in the Morris watermaze and the potential effect of choline, a selective α7 nAChR
agonist at low doses (Matsuyama et al., 2003; Papke et al., 1996). In a first set of
experiments, we assessed choline effect on the locomotor activities of mice. Whereas
choline had no effect on both the horizontal and vertical activities of WT mice, choline
increased the horizontal and decreased the vertical activity of STOP KO mice at doses
greater than 0.3 mg/kg. These opposite and paradoxical effects were elicited by choline at
relatively high doses, for which it can stimulate non-α7 nAChRs and/or can serve as
substrate for the synthesis of ACh. Nevertheless, we have chosen the lowest dose of choline
141
(0.3 mg/kg) to test its potential effect on learning of WT and STOP KO mice. At this dose,
choline had no effect on the swimming speed of mice.
Choline, administered 15 minutes before trials, had no effect on the mean latency and
distance travelled by WT mice, but significantly increased the number of successful trials. In
contrast, choline treatment significantly improved performance of STOP KO mice, by
decreasing their latency and distance travelled and increasing their number of successful
trials. Altogether, the performances of choline-treated STOP KO mice were no longer
different from saline-treated WT mice.
A recent report demonstrates that stimulation of both α4β2 and α7 nAChRs, by
epibatidine and choline respectively, are essential for full-development of long-term
potentiation in the mouse dentate gyrus (Matsuyama and Matsumoto, 2003). Literature data
indicate that working memory performance of rats are improved by stimulation or costimulation of (α4)β2 and α7 nAChRs in the hippocampus and/or amygdala (Levin et al.,
2002a, 2002b). Various studies also indicate participation of cholinergic neurotransmission of
the dorsal striatum in learning in which stimulus and response are associated (Packard and
Knowlton, 2002). Absence of training acquisition during the 5-day session of STOP KO mice
cannot be explained by the increased α7 nAChR density in the dorsolateral striatum. This
suggests that up-regulated α7 nAChRs may not be functionnal, undergoing a desensitization
state or may be associated with a basal decreased ACh release. This latter hypothesis
seems to be more pertinent: first, the α7 nAChR agonist choline at low dose improved the
impaired performance of STOP KO mice. Second, in hippocampus, another area implicated
in cognitive behaviour, up-regulated α7 nAChRs were associated with decreased density of
VAChT, suggesting a reduced ACh release in this particular structure. Nevertheless, we
have not measured the activity of VAChT, nor the extracellular ACh level, in both dorsolateral
striatum and hippocampus of mutant mice. Another non exclusive hypothesis to explain
impaired performance of STOP KO mice would be an imbalance between β2* (not modified)
and α7 (increased) nAChR densities in some brain areas, in agreement with previous reports
(Levin et al., 2002a). The slight effect of choline on performance of WT mice and its
beneficial effect in STOP KO mice can be due to a hypersensitive response of mutant mice
to the pro-cognitive effect of choline. It is also reminiscent of studies on cognitive
performances in humans. Although the pro-cognitive effect of nicotine is debated in healthy
human subjects, there are stronger evidences of nicotinic modulation of cognitive
dysfunctions in several neuropsychiatric disorders, including Alzheimer's and Parkinson's
diseases, ADHD and schizophrenia (Sacco et al., 2004). Finally, the improvement of
performance of STOP KO mice by choline, probably via α7 nAChR stimulation, is reinforced
by recent data of our lab showing that impaired performance of DAT KO mice in the cued
version of the watermaze was improved by DMXB-A, another α7 nAChR agonist (Moutsimilli
et al., in preparation).
In conclusion, our present study shows that the deletion of the widespread regulatedmicrotubule STOP can induce significant adaptation of the cholinergic/nicotinic
neurotransmission. Altogether, our data suggest that nicotinic neurotransmission can
probably be deficient in STOP mutant mice and that these mice may provide an useful
experimental model to study dysfunctions related to some psychiatric symptoms, particularly
schizophrenia. Such a mouse line can also be useful to test the potential benefits of various
therapeutic treatments, such as nicotine or nicotinic agonists.
142
REFERENCES
Adler, L. E., Olincy, A., Waldo, M., Harris, J.G., Griffith, J., Stevens, K., Flach, K., Nagamoto, H.,
Bickford, P., Leonard, S., Freedman, R., 1998. Schizophrenia, sensory gating, and nicotinic
receptors. Schizophrenia Bulletin 24, 189-202.
Andrieux, A., Salin, P. A., Vernet, M., Kujala, P., Baratier, J., Gory-Faure, S., Bosc, C., Pointu, H.,
Proietto, D., Schweitzer, A., Denarier, E., Klumperman, J., Job, D., 2002. The suppression of
brain cold-stable microtubules in mice induces synaptic defects associated with neurolepticsensitive behavioral disorders. Genes Development 16, 2350-2364.
Bosc C., Cronk J.D., Pirollet F., Watterson D.M., Haiech J., Job D. and Margolis R.L. (1996) Cloning,
expression, and properties of the microtubule-stabilizing protein STOP. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 93, 2125-2130.
Breese, C. R., Lee, M. J., Adams, C. E., Sullivan ,B., Logel, J., Gillen, K. M., Marks, M. J., Collins, A.
C., Leonard, S., 2000. Abnormal regulation of high affinity nicotinic receptors in subjects with
schizophrenia. Neuropsychopharmacology 23, 351-364.
Brun, P., Begou, M., Andrieux, A., Mouly-Badina, L., Clerget, M., Schweitzer, A., Scarna, H., Renaud,
B., Job, D., Suaud-Chagny, M. F., 2005. Dopaminergic transmission in STOP null mice. Journal
of Neurochemistry 94, 63-73.
Buccafusco, J. J., Letchworth, S. R., Bencheri,f M., Lippiello, P. M., 2005. Long-lasting cognitive
improvement with nicotinic receptor agonists: mechanisms of pharmacokineticpharmacodynamic discordance. Trends in Pharmacological Sciences 26, 352-360.
Champtiaux, N., Gotti, C., Cordero-Erausquin, M., David, D.J., Przybylski, C., Lena, C., Clementi, F.,
Moretti, M., Rossi, F.M., Le Novere, N., McIntosh, J.M., Gardier, A.M., Changeux, JP., 2003.
Subunit Composition of Functional Nicotinic Receptors in Dopaminergic Neurons Investigated
with Knock-Out Mice. Journal of Neuroscience 23, 7820-7829.
de Leon, J., Dadvand, M., Canuso, C., White, A. O., Stanilla, J. K., Simpson, G. M., 1995.
Schizophrenia and smoking: an epidemiological survey in a state hospital. American Journal of
Psychiatry 152, 453-455.
de Leon, J., Tracy, J., McCann, E., McGrory, A., Diaz, F.J., 2002. Schizophrenia and tobacco
smoking: a replication study in another US psychiatric hospital. Schizophr Res 56,55-65
Eastwood, S.L., Lyon, L., George, L., Andrieux, A., Job, D., Harrison, P.J., 2006. Altered expression of
synaptic protein mRNAs in STOP (MAP-6) mutant mice. Journal of Psychopharmacology, in
press.
Fradley, R. L., O'Meara ,G. F., Newman, R. J., Andrieux, A., Job, D., Reynolds, D. S., 2005. STOP
knockout and NMDA NR1 hypomorphic mice exhibit deficits in sensorimotor gating. Behavioral
Brain Research 163, 257-264.
Frankle, W. G., Lerma, J., Laruelle, M., 2003. The synaptic hypothesis of schizophrenia. Neuron 39,
205-216.
Freedman, R., Hall, M., Adler, L. E., Leonard, S., 1995. Evidence in postmortem brain tissue for
decreased numbers of hippocampal nicotinic receptors in schizophrenia. Biological Psychiatry
38, 22-33.
Freedman, R., Coon, H., Myles-Worsley, M., et al., 1997. Linkage of a neurophysiological deficit in
schizophrenia to a chromosome 15 locus. Proceeding of National Academy of Sciences U S A
94, 587-592.
Gainetdinov, R. R., Jones, S. R., Caron, M. G., 1999. Functional hyperdopaminergia in dopamine
transporter knock-out mice. Biological Psychiatry 46, 303-311.
Gainetdinov, R. R., Mohn, A. R., Caron, M. G., 2001. Genetic animal models: focus on schizophrenia.
Trends in Neurosciences 24, 527-533.
Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G., 1996. Hyperlocomotion and
indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature 379,
606-612.
Glassman, A. H. 1993. Cigarette smoking: implications for psychiatric illness. American Journal of
Psychiatry 150, 546-553.
143
Guillaud L., Bosc C., Fourest-Lieuvin A., Denarier E., Pirollet F., Lafanechere L. and Job D. (1998)
STOP proteins are responsible for the high degree of microtubule stabilization observed in
neuronal cells. Journal of Cell Biology 142, 167-179.
Jones, S. R., Gainetdinov, R. R., Jaber, M., Giros, B., Wightman, R. M., Caron, M. G., 1998. Profound
neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proceeding of
National Academy of Sciences USA 95, 4029-4034.
Jones, S., Sudweeks, S., Yakel, J.L., 1999. Nicotinic receptors in the brain: correlating physiology with
function. Trends in Neurosciences 22, 555-561.
Kaiser, S., Wonnacott, S., 2000. Alpha-bungarotoxin-sensitive nicotinic receptors indirectly modulate
[(3)H]dopamine release in rat striatal slices via glutamate release. Molecular Pharmacology 58,
312-318.
Klink, R., de Kerchove d'Exaerde, A., Zoli, M., Changeux, J. P., 2001. Molecular and physiological
diversity of nicotinic acetylcholine receptors in the midbrain dopaminergic nuclei. Journal of
Neuroscience 21, 1452-1463.
Kumari, V., Postma, P., 2005. Nicotine use in schizophrenia: the self medication hypotheses.
Neuroscience Biobehavioral Review 29, 1021-1034.
Leanza, G., Nilsson, O.G., Wiley, R.G., Bjorklund, A., 1995. Selective lesioning of the basal forebrain
cholinergic system by intraventricular 192 IgG-saporin: behavioural, biochemical and
stereological studies in the rat. European Journal of Neuroscience 7, 329-343.
Leonard, S., Gault, J., Hopkins, J., Logel, J., Vianzon, R., Short, M., Drebing, C., Berger, R., Venn, D.,
Sirota, P., Zerbe, G., Olincy, A., Ross, R.G., Adler, L.E., Freedman, R., 2002. Association of
promoter variants in the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit gene with an inhibitory
deficit found in schizophrenia. Archives of General Psychiatry 59, 1085-1096.
Levin, E. D., 2002. Nicotinic receptor subtypes and cognitive function. Journal of Neurobiology 53,
633-640.
Levin, E. D., Bradley, A., Addy, N., Sigurani, N., 2002. Hippocampal alpha 7 and alpha 4 beta 2
nicotinic receptors and working memory. Neuroscience 109, 757-765.
Mansvelder, H. D., McGehee, D. S. 2000. Long-term potentiation of excitatory inputs to brain reward
areas by nicotine. Neuron 27, 349-357.
Marks, M.J;, Whiteaker, P., Collins, A.C., 2006. Deletion of the {alpha}7, {beta}2 or {beta}4 Nicotinic
Receptor Subunit Genes Identifies Diverse, Highly Expressed Binding Sites with Relatively Low
Affinity for [3H]Epibatidine. Molecular Pharmacology, in press.
Marsh, D., Grassi, J., Vigny, M., Massoulie, J., 1984. An immunological study of rat
acetylcholinesterase: comparison with acetylcholinesterases from other vertebrates. Journal of
Neurochemistry 43, 204-213.
Martin-Ruiz, C. M., Haroutunian, V. H., Long, P., Young, A. H., Davis, K. L., Perry, E. K., Court, J. A.,
2003. Dementia rating and nicotinic receptor expression in the prefrontal cortex in
schizophrenia. Biological Psychiatry 54, 1222-1233.
Marubio, L. M., Gardier, A. M., Durier, S., David, D., Klink, R., Arroyo-Jimenez, M.M., McIntosh, J.M.,
Rossi, F., Champtiaux, N., Zoli, M., Changeux, J.P., 2003. Effects of nicotine in the
dopaminergic system of mice lacking the alpha4 subunit of neuronal nicotinic acetylcholine
receptors. European Journal of Neuroscience 17, 1329-1337.
Maskos, U., Molles, B. E., Pons, S., Besson, M., Guiard, B.P., Guilloux, J.P., Evrard, A., Cazala, P.,
Cormier, A., Mameli-Engvall, M., Dufour, N., Cloez-Tayarani, I., Bemelmans, A.P., Mallet, J.,
Gardier, A.M., David, V., Faure, P., Granon, S., Changeux, J.P., 2005. Nicotine reinforcement
and cognition restored by targeted expression of nicotinic receptors. Nature 436, 103-107.
Matsuyama, S., and Matsumoto A., 2003. Epibatidine induces long-term potentiation (LTP) via
activation of alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) in vivo in the intact mouse
dentate gyrus: both alpha7 and alpha4beta2 nAChRs essential to nicotinic LTP. Journal of
Pharmacological Sciences 93, 180-187.
Menzaghi, F., Whelan, K. T., Risbrough, V. B., Rao, T. S., Lloyd, G. K., 1997. Effects of a novel
cholinergic ion channel agonist SIB-1765F on locomotor activity in rats. Journal of
Pharmacology and Experimental Therapeutics 280, 384-392.
144
Mihailescu, S., Drucker-Colin, R., 2000. Nicotine, brain nicotinic receptors, and neuropsychiatric
disorders. Archives of Medical Research 31, 131-144.
Mirnics, K., Middleton, F. A., Lewis, D. A., Levitt, P., 2001. Analysis of complex brain disorders with
gene expression microarrays: schizophrenia as a disease of the synapse. Trends in
Neurosciences 24, 479-486.
Nomikos, G.G, Gruber, S., Svensson, T.H, Mathe, A.A, 2000. Effects of acute and chronic
electroconvulsive stimuli on cAMP and cGMP efflux in the rat striatum and hippocampus. Eur
Neuropsychopharmacol 10, 495-500
Owen, M.J., O'Donovan, M.C., Harrison,P.J., 2005. Schizophrenia: a genetic disorder of the synapse?
Bmj 330, 158-9
Packard, M. G., Knowlton, B. J., 2002. Learning and memory functions of the Basal Ganglia. Annual
Review of Neurosciences 25, 563-593.
Papke, R.L., Bencherif, M., Lippiello, P., 1996. An evaluation of neuronal nicotinic acetylcholine
receptor activation by quaternary nitrogen compounds indicates that choline is selective for the
alpha 7 subtype. Neuroscience Letters 213, 201-204.
Perry, D.C., Kellar, K.J., 1995. [3H]epibatidine labels nicotinic receptors in rat brain: an
autoradiographic study. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 275, 10301034.
Picciotto, M. R., Caldarone, B. J., Brunzell, D. H., Zachariou, V., Stevens, T. R., King ,S. L., 2001.
Neuronal nicotinic acetylcholine receptor subunit knockout mice: physiological and behavioral
phenotypes and possible clinical implications. Pharmacology & Therapeutics 92, 89-108.
Picciotto, M. R., Zoli, M., Rimondini, R., Lena, C., Marubio, L. M., Pich, E. M., Fuxe, K., Changeux, J.P., 1998. Acetylcholine receptors containing the [beta]2 subunit are involved in the reinforcing
properties of nicotine. Nature 391, 173-177.
Plenge, P., Mellerup, E., 1998. Non-acetylcholine displaceable 3[H]epibatidine binding in the rat brain.
Neuroscience Letters 248, 65-67.
Ross, S. A., Wong, J. Y., Clifford, J. J., Kinsella, A., Massalas, J.S., Horne, M.K., Scheffer, I.E., Kola,
I., Waddington, J.L., Berkovic, S.F., Drago, J., 2000. Phenotypic characterization of an alpha 4
neuronal nicotinic acetylcholine receptor subunit knock-out mouse. Jounal of Neuroscience 20,
6431-6441.
Sacco, K.A., Bannon, K.L., George, T.P., 2004. Nicotinic receptor mechanisms and cognition in
normal states and neuropsychiatric disorders. Journal of Psychopharmacology 18, 457-474.
Shimizu, H., Iwayama, Y., Yamada, K., Toyota, T., Minabe, Y., Nakamura, K., Nakajima, M., Hattori,
E., Mori, N., Osumi, N., Yoshikawa, T., 2006. Genetic and expression analyses of the STOP
(MAP6) gene in schizophrenia. Schizophrenia Research, in press.
Shumyatsky,G.P., Malleret, G., Shin, R.M et al., 2005. stathmin, a gene enriched in the amygdala,
controls both learned and innate fear Cell 123, 697-709.
Siegel, S.J., Maxwell, C.R., Majumdar, S. et al., 2005. Monoamine reuptake inhibition and nicotine
receptor antagonism reduce amplitude and gating of auditory evoked potentials. Neuroscience
133, 729-38
Spurden, D. P., Court, J. A., Lloyd, S., Oakley, A., Perry, R., Pearson, C., Pullen, R. G., Perry, E. K.,
1997. Nicotinic receptor distribution in the human thalamus: autoradiographical localization of
[3H]nicotine and [125I] alpha-bungarotoxin binding. Journal of Chemical Neuroanatomy 13,
105-113.
van Dam, D., Lenders, G., De Deyn, P.P., 2006. Effect of Morris water maze diameter on visualspatial learning in different mouse strains. Neurobiology of Learning & Memory 85,164-172.
van Rossum, D., Hanisch, U. K., 1999. Cytoskeletal dynamics in dendritic spines: direct modulation by
glutamate receptors? Trends in Neurosciences 22, 290-295.
Whiteaker, P., McIntosh, J. M., Luo, S., Collins, A. C., Marks, M. J., 2000. 125I-alpha-conotoxin MII
identifies a novel nicotinic acetylcholine receptor population in mouse brain. Molecular
Pharmacology 57, 913-925.
Young, J. W., Finlayson, K., Spratt, C., Marston, H. M., Crawford, N., Kelly, J. S., Sharkey, J., 2004.
Nicotine improves sustained attention in mice : evidence for involvement of the alpha7 nicotinic
acetylcholine receptor. Neuropsychopharmacology 29, 891-900.
145
Zervas, M., Opitz, T., Edelmann, W. et al., 2005. Impaired hippocampal long-term potentiation in
microtubule-associated protein 1B-deficient mice. J Neurosci Res 82, 83-92
Zhou, F. M., Wilson, C. J., Dani, J. A., 2002. Cholinergic interneuron characteristics and nicotinic
properties in the striatum. Journal of Neurobiology 53, 590-605.
Zoli, M., Lena, C., Picciotto, M. R., Changeux, J. P., 1998. Identification of four classes of brain
nicotinic receptors using beta2 mutant mice. Journal of Neuroscience 18, 4461-4472.
146
Table 1: Relative density of cholinergic markers in WT and STOP KO mice
Marker
AChE
Area
SNC
SNR
VTA
Striatum
Acc Shell
Acc Core
Acc Cone
Dorsal Hipp
CA1
CA3
WT
(4) 235±7
(5) 167±9
(3) 269±13
(6) 335±12
(4) 352±23
(3) 295±15
(4) 405±16
(6) 57±1
(5) 90±3
(6) 71±4
KO
(4) 263±14
(5) 177±10
(6) 290±11
(5) 331±12
(4) 356±16
(4) 294±22
(5) 364±18
(5) 60±3
(5) 88±4
(6) 73±5
% KO/WT
+12% ns
+6% ns
+8% ns
-1% ns
+1% ns
0%
-10% ns
+5% ns
-2% ns
+3% ns
VAChT
SN
VTA
Striatum
Acc Shell
Acc Core
Acc Cone
Dorsal Hipp
CA1
CA3
Septum
ND
ND
(6) 182±10
(6) 224±18
(6) 156±9
(6) 259±13
(5) 39.5±1.6
(5) 30.6±1.3
(5) 46.8±2.9
(6) 180±13
ND
ND
(6) 181±7
(6) 233±20
(6) 166±8
(6) 261±11
(5) 32.8±1.6
(5) 20.6±1.4
(5) 48.7±5.1
(6) 154±15
-1% ns
+4% ns
+6% ns
+1% ns
-17% *
-33% ***
+4% ns
-14% ns
Densities are the means ± SEM of immunolabelling in arbitrary units. The number of mice is
indicated in parentheses. ND, not detectable; Acc, nucleus accumbens; AChE, acetylcholine
esterase; CA1, CA1 field of hippocampus; CA3, CA3 field of hippocampus; Dorsal Hipp,
dorsal hippocampus; SN, substantia nigra; SNC substantia nigra, pars compacta; SNR,
substantia nigra, pars reticulata; VAChT, vesicular acetylcholine transporter; VTA, ventral
tegmental area; ns: non significant.
Fisher's test: *p<0.05; ***p<0.001.
147
Table 2: Relative density of nicotinic receptors in WT and STOP KO mice
Receptor
β2*
Area
SN
VTA
Striatum
Acc Shell
Acc Core
Dorsal Hipp
Cing Cx
WT
(5) 126±5
(5) 333±16
(6) 242±12
(6) 193±11
(5) 166±9
(6) 133±10
(5) 225±5
KO
(4) 119±11
(4) 313±13
(6) 215±18
(6) 211±2
(5) 180±11
(6) 126±6
(4) 216±10
% KO/WT
-6% ns
-6% ns
-11% ns
+9% ns
+8% ns
-5% ns
-4% ns
α6*
SNC
VTA
Striatum
Acc Shell
Acc Core
Acc Cone
(5) 155±9
(4) 225±27
(6) 179±6
(6) 225±7
(6) 192±5
(6) 303±10
(4) 156±9
(5) 210±21
(6) 145±4
(6) 151±8
(6) 173±10
(6) 183±11
0%
-7% ns
-19% ***
-33% ***
-10% ns
-40% ***
α7
SN
VTA
Str DL
Acc Shell
Acc Core
Dorsal Hipp
CA1
CA3
L Mol
Septum
Cing Cx
(5) 50.0±4.9
(6) 143±11
(5) 65.0±4.7
(3) 15.5±0.8
(4) 16.1±1.4
(6) 74.2±3.3
(6) 44.1±4.2
(6) 58.3±3.6
(6) 92.8±7.1
(4) 34.2±4.0
(5) 35.2±2.4
(5) 48.0±8.3
(4) 132±20
(4) 80.4±2.4
(3) 18.0±0.7
(4) 17.0±2.3
(5) 92.2±10.3
(4) 66.8±4.2
(5) 97.5±14.8
(4) 124.0±10.0
(3) 43.0±4.2
(4) 32.5±2.8
-4% ns
-8% ns
+24% *
+16% #
+6% ns
+24% *
+51% **
+67% *
+34% *
+26% ns
-8% ns
Densities are the means ± SEM of specific radioligand binding in arbitrary units. The number
of mice is indicated in parentheses. Acc, nucleus accumbens; CA1, CA1 field of
hippocampus; CA3, CA3 field of hippocampus; Cing Cx, cingulate cortex; Dorsal Hipp, dorsal
hippocampus; L Mol, lacunosum moleculare layer of hippocampus; SN, substantia nigra;
SNC substantia nigra, pars compacta; Str DL, dorsolateral striatum; VTA, ventral tegmental
area. ns: non significant.
Fisher's test: # p<0.08; *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001.
148
LEGENDS TO FIGURES
Fig.1: Autoradiographic representation of acetylcholine esterase (AChE), vesicular
acetylcholine transporter (VAChT), β2*, α6* and α7 nicotinic receptors in WT and STOP KO
mice.
Acb C: nucleus accumbens, core; Acb S: nucleus accumbens, shell; CA1 or CA3: CA1 or
CA3 layer; Hip: hippocampus; L Mol: Lacunosum Moleculare layer; Str: striatum.
Fig. 2: Effects of nicotine administration on the locomotor activity of WT and STOP KO mice.
Time course of the horizontal activity of WT (A) and STOP KO (B) mice after s.c.
administration of nicotine (Nic) at increasing doses. Means ± SEM of photocell counts over a
5 min period. Dose-response effects of nicotine administration on the horizontal (C) and
vertical (D) locomotor activities of WT and STOP KO mice. Data represent means ± SEM of
photocell counts over a 60 min period, expressed as percentages of respective basal
activities (65.5±9.0 and 63.3±7.0 counts/60 min for horizontal activity of WT and STOP KO,
respectively; 299±60 and 246±55 counts/60 min for vertical activity of WT and STOP KO
mice, respectively). Number of mice in parentheses, Sal (15 WT, 13 KO), Nic (7 WT or KO
per dose).
Fisher's test: ∗ p<0.05, ∗∗ p<0.01, ∗∗∗ p<0.0001 compared to the saline group of the same
genotype; # p<0.05, ## p<0.005, ### p<0.0001, comparison between genotypes.
Fig. 3: Effects of choline administration on the locomotor activity of WT and STOP KO mice.
Time course of the horizontal activity of WT (A) and STOP KO (B) mice after s.c. choline
administration at various doses. Means ± SEM of photocell counts over a 5 min period for 78 mice per dose. Dose-response effects of choline administration on the horizontal (C) and
vertical (D) locomotor activities in WT and STOP KO mice. Data represent means ± SEM of
photocell counts over a 60 min period, expressed as percentages of respective basal activity
(61.6±6.0 and 35.7±8.0 counts/60 min for horizontal activity of WT and STOP KO,
respectively; 101±36 and 151±51 counts/60 min for vertical activity of WT and STOP KO
mice, respectively).
Fisher’s test: ∗∗ p<0.01, ∗∗∗ p<0.0001 compared to the saline group of the same genotype; #
p<0.05, ## p<0.005, ### p<0.0001, comparison between genotypes.
Fig. 4: Effect of choline treatment on performance of WT and STOP KO mice in the cued
version of watermaze.
15 Min before each trial, mice received s.c. administration of saline (Sal) or choline 0.3 mg/kg
(Chol). Performance of mice are expressed as latency (seconds, s) and mean distance
travelled (meters, m) to find the platform and proportion of successful trials. Values are
means ± SEM for 9 (WT Sal), 10 (KO Sal and KO Chol) and 11 (WT Chol) mice.
149
150
151
152
153
ARTICLE II : Altérations préférentielles du système dopaminergique
limbique des souris STOP KO
Caroline Bouvrais-Veret, Stéphanie Weiss, Naima Hanoun, Annie Andrieux, Annie
Schweitzer, Didier Job, Michel Hamon, Bruno Giros et Marie-Pascale Martres
Manuscrit en préparation
154
Contexte de l’étude
Au sein des neurones, les microtubules et les protéines associées jouent un rôle
dans la stabilisation et la plasticité synaptique (van Rossum and Hanisch, 1999). Les souris
invalidées pour la protéine STOP n’ont pas de défaut anatomique évident mais montrent des
anomalies de plasticité synaptique dans l’hippocampe (Andrieux et al., 2002) et une
diminution de l’expression des transcrits de certaines protéines synaptiques (Eastwood, sous
presse). Elles montrent également des déficits comportementaux, comme une activité
désorganisée, des interactions sociales diminuées, un déficit du filtrage sensori-moteur (PPI)
une hypersensibilité au stress et à l’amphétamine (Andrieux et al., 2002; Brun et al., 2005;
Fradley et al., 2005). Récemment, Brun et collaborateurs (2005) ont montré que les souris
mutantes présentaient une altération du système dopaminergique. La transmission de base
est normale mais une stimulation évoquée des fibres dopaminergiques provoque une
augmentation de l’efflux de dopamine, spécifiquement au niveau du noyau accumbens.
Ces données, en accord avec le fait qu’une partie des déficits est améliorée par des
neuroleptiques, suggèrent que ces souris partagent certaines caractéristiques associées à la
schizophrénie d’autant plus que cette maladie psychiatrique semblerait liée à des défauts de
connectivité synaptique (Owen et al., 2005). D’ailleurs, un polymorphisme du gène MAP6,
homologue humain du gène murin STOP, a récemment été associé à une population de
schizophrènes japonais (Shimizu et al., 2006).
Dans cette étude, nous nous proposons d’examiner certains composants clés du
système dopaminergique des souris STOP KO. Nous avons tout d’abord déterminé la
densité de récepteurs D1, D2, D3 ainsi que celles du transporteur DAT et du transporteur
vésiculaire des monoamines VMAT2 dans plusieurs régions cérébrales. Nous avons
également mesuré les taux endogènes de dopamine et l’activité de son enzyme de
synthèse, la tyrosine hydroxylase. Ensuite, nous avons déterminé les paramètres cinétiques
du DAT. Enfin, nous avons examiné la réponse locomotrice de ces animaux à la cocaïne,
ainsi que la sensibilisation comportementale induite par cette drogue.
155
Principaux résultats
•
Les densités relatives de certains marqueurs dopaminergiques sont modifiées
dans le cerveau des souris STOP KO (figure 1, tableau 1)
Les densités du DAT et de VMAT2 ne sont pas modifiées dans le cerveau des souris
STOP KO. Aucune différence significative de densité n’a été trouvée pour le récepteur D1.
La densité du récepteur D2 est diminuée de manière significative au niveau des terminaisons
dopaminergiques, striatum et accumbens (-20 à -30%) et celle du récepteur D3 est diminuée
dans l’aire tegmentale ventrale (-40%), alors qu’elle n’est pas modifiée dans la substance
noire.
•
Ni le couplage des récepteurs D1 aux protéines G, ni celui des récepteurs
D2/D3, mesurés par liaison de [35S]-GTP, ne sont significativement modifiés chez
les STOP KO (figure 2, tableau 2)
•
Les taux endogènes de dopamine et de ses métabolites sont diminués dans
certaines régions cérébrales des souris STOP KO (tableau 3)
Contrairement aux régions à corps cellulaires dopaminergiques (substance noire +
aire tegmentale ventrale), les taux endogènes de dopamine et de ses principaux métabolites,
HVA
et
DOPAC,
sont
significativement
diminués
au
niveau
des
terminaisons
dopaminergiques des souris STOP KO, avec une amplitude au niveau du noyau accumbens
(-50 à -60%) significativement plus importante que dans le striatum. Dans le cortex
préfrontal, seul le niveau du métabolite DOPAC est diminué de manière significative.
•
L’activité de la tyrosine hydroxylase (TH) est réduite dans les régions
dopaminergiques des souris STOP KO (tableau 4)
L’activité de la TH a été déterminée in vivo, par mesure des taux de L-DOPA
accumulés
après
inhibition
de
la
dopa-décarboxylase.
L’activité
de
la
TH
est
significativement diminuée dans les corps cellulaires et les terminaisons dopaminergiques (20 à -30%), de façon plus importante dans le noyau accumbens par rapport au striatum.
Aucune différence significative d’activité n’est à noter dans le cortex préfrontal.
156
•
La capacité maximale de transport (Vmax) est diminuée dans le noyau
accumbens des souris STOP KO (figure 3)
Les paramètres cinétiques du DAT ont été mesurés par capture de [3H]-dopamine par
des synaptosomes de striatum et de noyau accumbens. Dans le striatum, l’affinité du DAT
pour la dopamine est significativement moins grande chez les souris STOP KO. Dans cette
même région, la capacité maximale de transport (Vmax) du DAT des animaux mutants n’est
pas significativement différente, bien que la vitesse de capture des souris STOP KO soit
systématiquement plus grande que celle des souris sauvages, à toutes les concentrations de
dopamine utilisées. Dans le noyau accumbens, la Vmax des souris STOP KO est
significativement diminuée (-24%). D’autre part, l’affinité du DAT pour la dopamine est
significativement plus faible dans le noyau accumbens que dans le striatum.
•
Les souris STOP KO sont hypersensibles à l’effet hyperlocomoteur de la
cocaïne (figure 4)
L’activité locomotrice horizontale des souris sauvages augmente de manière
significative en réponse à une dose de 25 mg/kg de cocaïne. En revanche, celle des souris
STOP KO est significativement plus forte dès la dose de 10 mg/kg de cocaïne et augmente
de manière dose-dépendante.
•
La constante d’inhibition du DAT pour la cocaïne n’est pas significativement
modifiée chez les souris STOP KO (figure 5)
Nous avons mesuré les paramètres d’inhibition du DAT par la cocaïne par des
expériences de capture de [3H]-dopamine dans des synaptosomes de striatum et de noyau
accumbens, issus de souris sauvages et STOP KO. La concentration de cocaïne qui inhibe
de moitié l’effet maximal de la cocaïne (CI 50) n’est pas significativement différente entre les
deux génotypes de souris pour les deux régions analysées. Par contre, pour les deux
génotypes de souris, la CI 50 est significativement plus forte dans le noyau accumbens que
dans le striatum.
•
Les souris STOP KO développent une sensibilisation comportementale à une
faible dose de cocaïne, contrairement aux souris sauvages (figure 6)
Pendant les cinq jours de la phase d’initiation, les animaux montrent une
sensibilisation comportementale à la cocaïne, qui n‘est significative que pour les souris
sauvages. Après un sevrage de vingt jours, l’hyperactivité locomotrice induite par la cocaïne
n’est pas significativement différente entre les souris sauvages traitées au sérum
157
physiologique versus cocaïne. Au contraire, l’hyperactivité locomotrice des souris STOP KO
induite par la cocaïne est significativement plus forte pour les animaux traités par la cocaïne
versus sérum physiologique.
Conclusions de l’étude
Cette étude révèle des altérations de la densité et/ou de la fonction de certains
composants du système dopaminergique, en accord avec des anomalies déjà observées par
Brun et collaborateurs (2005). L’hyper-réactivité dopaminergique des souris STOP KO dans
le noyau accumbens décrite par cette équipe pourrait être en partie expliquée par la baisse
de la capacité de transport du DAT dans cette région, baisse qui ne devient apparente que
pour les fortes concentrations de dopamine. Par contre, l’hypersensibilité des animaux
mutants à l’effet hyperlocomoteur de la cocaïne, en accord avec leur hypersensibilité à
l’amphétamine (Brun et al., 2005) ne peut être liée à une meilleure affinité du DAT pour cette
drogue. Remarquons enfin que l’inactivation de la protéine ubiquitaire STOP donne lieu à
des altérations sélectives à la fois des composants dopaminergiques et des régions
cérébrales. Ces différents points seront développés dans le chapitre discussion.
158
Preferential alterations of dopaminergic accumbic system in STOP
knock-out mice
Caroline Bouvrais-Veret1, Stéphanie Weiss1, Naima Hanoun2, Annie Andrieux3, Annie
Schweitzer3, Didier Job3, Michel Hamon2, Bruno Giros1 and Marie-Pascale Martres1#
1
Inserm, U513, Créteil, F-94000 France ; Univ Paris 12, Créteil, F-94000 France. 2Inserm,
U677, Paris, F-75000 France ; Univ Paris 6, Paris, F-75000 France. 3Inserm, U366, CEA,
Grenoble, F-38000 France.
Running title: Accumbic DA system in STOP null mice
Key words: cytoskeleton, cocaine, dopaminergic transporters and receptors, synaptosomes,
schizophrenia, tyrosine hydroxylase
#Correspondence should be addressed to Marie-Pascale Martres, Inserm U513, Laboratoire
de Neurobiologie et Psychiatrie, 8 rue du Général Sarrail, Créteil, F-94010 France. e-mail :
[email protected]
Acknowledgements: The authors thank Dr M. Nosten-Bertrand (Inserm U513) for helpful
discussion and D. Proietto (Inserm U366) for mouse genotyping. This work was supported by
grants from Inserm. C. Bouvrais-Veret was the recipient of a grant from the "Mission
Interministérielle de Lutte contre la Drogue et la Toxicomanie" (MILDT, France), S. Weiss
from the "Société de Tabacologie" (France).
159
INTRODUCTION
Microtubules are key cytoskeleton components particularly abundant in neurons,
where they play a role in morphogenesis and protein transport in dentrites and axons.
Previous work has indicated a central role of microtubule associated proteins called STOPs
(Stable Tubule Only Polypeptides or MAP 1B) in neuronal stabilization and in synaptic
plasticity (Bosc et al., 1996; Guillaud et al., 1998; van Rossum and Hanisch, 1999).
Unexpectedly, the recently developed mouse line deficient for the protein STOP do not
display any detectable defects in brain anatomy, but exhibit synaptic defects in hippocampus,
such as depleted glutamatergic vesicle pool and highly decrease in long-term potentiation
and depression (LTP and LDP, respectively; Andrieux et al., 2002). STOP knock-out (KO)
mice show severe behavioural disturbances, such as purposeless and disorganized activity,
impaired social interactions and maternal behaviour, deficit in prepulse inhibition (PPI) of the
startle reflex, hypersensitivity to mild stress and to the stimulant locomotor effect of
amphetamine (Andrieux et al., 2002; Brun et al., 2005; Fradley et al., 2005). STOP KO mice
also display hyperdopaminergia, preferentially in the limbic dopaminergic (DA) system (Brun
et al., 2005). These authors show that, whereas basal extracellular DA level is not modified
in the striatum and the nucleus accumbens, evoked stimulated DA release is selectively
increased in the nucleus accumbens. Some of the behavioural and synaptic deficits of STOP
KO mice can be partly restored by chronic or acute antipsychotic drug treatment (Andrieux et
al., 2002; Brun et al., 2005; Fradley et al., 2005). Finally, a recent study shows decreased
levels of mRNA transcripts of synaptic proteins in STOP KO mice, such as synaptophysin,
GAP-43 and spinophilin (Eastwood et al., 2006). Altogether, the behavioural disturbances,
the hyperDAergia in limbic system, the indirect evidence of a decreased glutamatergic
neurotransmission and the fact that some of these defects are improved by antipsychotics
suggest that STOP KO mice may represent a pertinent experimental model for
schizophrenia.
Various evidence suggest that schizophrenia is associated with alterations of
neuronal architecture, particularly in the synaptic connectivity (Benitez-King et al., 2004;
Frankle et al., 2003; Mirnics et al., 2001; Owen et al., 2005b). Recently, the protein DISC1
(Disrupted-In-Schizophrenia 1) has been demonstrated to bind with microtubules and its
truncation in schizophrenic patients contributes to impair intraneuronal transport, neurite
cytoarchitecture and/or neuronal migration (Morris et al., 2003; Owen et al., 2005a; Ishizuka
et al., 2006). Furthermore, the MAP6 gene, the human homologous of STOP gene, is
localized on chromosome 11q14, a region highly associated with schizotypal personality
disorders (Lewis et al., 2003). Interestingly, recent study shows association between single
nucleotide polymorphism markers of the MAP6 gene (human homologous of STOP gene)
and schizophrenia (Shimizu et al., 2006). The authors equally report an up-regulation of
isoform 2 of MAP6 transcripts in the prefrontal cortex of schizophrenic patients.
Thus, the STOP KO mice, which represent a pertinent experimental model for some
schizophrenic related symptoms, are likely to be informative to precisely characterize keycomponents of the DAergic neurotransmission. We determined in various brain areas of wildtype (WT) and mutant mice the density of the DA transporter (DAT), the vesicular
monoamine transporter (VMAT2) and the D1, D2 and D3 DAergic receptors. We measured
the endogenous DA and metabolite levels and the in vivo DA synthesis activity in various
brain areas containing DAergic cell bodies and terminals. We performed studies of DA
uptake by striatal and accumbic synaptosomes, as well as its inhibition by cocaine. Finally,
we assessed the effect of acute cocaine on the locomotor activity of WT and STOP KO mice,
as well as the cocaine-induced behavioural sensitization.
160
MATERIAL AND METHODS
Animals
Homozygous STOP KO mice and their WT littermates were obtained from the intercross (F2)
of heterozygous 50:50 BALBc/129 SvPas-F1 mice. The genotype of the mice was
determined from tail biopsies as previously described (Andrieux et al., 2002). Animals were
housed 4-6 per cage by gender and litter, with sawdust bedding and under standard
conditions, i.e. laboratory chow and water available ad libitum, temperature and humidity
maintained at 23±2°C and 55±10%, respectively, and a light cycle of a 12 h light:12 h dark
(lights on at 7:30 a.m.). Experiments were carried out in accordance with the European
Communities Council Directive (86/809/EEC) and approved by the local ethical committee.
Mice were allowed to habituate to the animal holding room for at least one week prior to use.
All experiments were conducted on naive WT and KO mice (about 60%/40% females/males),
3-4 month old and of the same litters.
Drugs
(±)-Butaclamol hydrochloride, 1,3-di-o-tolylguanidine, dopamine hydrochloride, SKF38393
hydrochloride, were purchased from Sigma-Aldrich (Saint Quentin, Fallavier). Quinpirole
hydrochloride, sulpiride, SCH23390 were purchased from Tocris Cookson (Bristol, UK).
Nomifensine maleate was purchased from RBI (Natick, USA) and cocaine chlorydrate was
from Cooper (France). All drugs were dissolved in 0.9% NaCl as free bases and were
administered by s.c. or i.p. route under a volume of 100 µl per 20 g weight. [125I]Iodosulpride (74 TBq/mmol), [35S]-GTP-γ-S (37 TBq/mmol), [3H]-dopamine (1.6 TBq/mmol)
and [N-methyl-3H]SCH 23390 (2.2-3.3 TBq/mmol) were from GE Healthcare (Orsay,
France). [125I]-R(+)trans-7-hydroxy-2-[N-(3’-iodo-2’-propenyl)amino] tetralin ([125I]-7-OHPIPAT, 74 TBq/mmol) from Perkin Elmer-NEN (Orsay, France).
Before use, rabbit [125I]-Ig F (ab’)2 fragment antibodies (28-111 TBq/mmol, GE Healthcare,
Orsay, France) were purified by gel filtration onto a PD10 column (Sephadex G25 M,
Pharmacia) in PBS (50mM NaH2PO4/Na2H PO4, 154 mM NaCl) containing 0.1% gelatin.
The first 0.25 ml eluate was discarded and the following 3.5 ml eluate was put into 400 ml
PBS supplemented with 3% bovine serum albumin (BSA), 1% goat serum, 1 mM NaI and
0.02% sodium azide. This corresponds to a concentration of 10-20 µCi/100 ml, for a freshly
synthetized [125I]-IgG batch. This solution was kept at 4°C, for 4-6 weeks.
Quantitative autoradiography
Slices
Mice were killed by cervical dislocation and their brains were then rapidly removed and
frozen in isopentane at -30°C. Serial coronal sections (10 µm, 4 sections per slide) were cut
at -20°C, thaw-mounted on Superfrost Plus® slides and stored at -80°C until use. To rule out
binding of endogenous DA to its receptors, sections were pre-incubated in buffer, before
addition of radioactive ligands.
Immunoautoradiography of dopamine transporter (DAT) and vesicular monoamine
transporter (VMAT2)
Brain sections were fixed with 4% paraformaldehyde for 15 min at room temperature (RT),
washed with PBS (50 mM NaH2PO4/Na2H PO4, 154 mM NaCl) and then incubated for 1h at
RT in PBS containing 3% BSA, 1% goat serum and 1 mM NaI. Sections were incubated for
2h at RT in the presence of DAT antiserum (1:20,000 dilution, according to Martres et al.,
1998) or polyclonal VMAT2 antibody (1:1500 dilution). After extensive washes, slides were
incubated overnight at 4°C with purified anti-rabbit [125I]-IgG (10-20 µCi/100ml). Sections
were washed with PBS, dried and exposed to Biomax MR films for 1-4 days.
161
Autoradiographic determination of DAergic D1, D2 and D3 receptor densities
Labelling of D1 receptors was performed according to Fernagut et al (2003). The slides were
pre-incubated for 20 min at RT in 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4 containing 120 mM NaCl, 5
mM KCl, 2 mM CaCl2 and 1 mM MgCl2 (Tris-ions buffer). The slides were then incubated for
90 min at RT in a fresh Tris-ions buffer containing 3 nM [3H]-SCH23390, with or without 10
µM butaclamol to determine non-specific binding. After 4 washes for 5 min with ice cold Trisions buffer, sections were dipped in ice-cold water and dried. The slides were exposed to
BAS-TR Fuji Imaging screen for 72 h and the screens were scanned with a Fuji Bioimaging
Analyzer BAS-5000.
Labelling of D2 receptors was done as previously described (Martres et al 1985). The slides
were pre-incubated three times for 5 min at RT in Tris-ions buffer supplemented with 0.1%
bovine serum albumin (BSA) and 0.57 mM ascorbic acid and then incubated for 60 min at
RTin the same fresh Tris-ions buffer in the presence of 0.2 nM [125I]-iodosulpride, with or
without 10 µM apomorphine to determine non-specific binding. Sections were washed as
described for D1 receptor labelling and exposed to Biomax MR film (GE Healthcare) for 2472 h.
Labelling of D3 receptors was performed according to Stanwood et al (2000) and modified as
follows: the slides were pre-incubated three times for 5 min at RT in 50 mM HEPES buffer,
pH 7.4, supplemented with 1 mM EDTA, 2.8 mM ascorbic acid, 0.1% BSA, 100 µM GTP (to
dissociate D2 receptors from G proteins) and 25 µM 1,3-di-o-tolylguanidine (to dissociate
ligand from receptors). Then, sections were incubated for 60 min at RT in fresh buffer in the
presence of 0.25 nM [125I]-7-OH-PIPAT, with or without 10 µM dopamine to determine nonspecific binding. Sections were washed four times for 15 min in ice-cold HEPES buffer,
dipped in ice-cold water, dried and exposed to Biomax MR films for 24 h.
Quantitative autoradiography of [35S]GTP-γ-S binding
Autoradiography of agonist-stimulated [35S]GTP-γ-S binding was performed according to
slight modifications of published procedures (He et al., 2000). Briefly, sections were
preincubated at RT for 20 min in 50 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine
ethanesulfonic acid) supplemented with 100 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.2 mM EGTA and 0.2
mM dithiothreitol and then incubated for 15 min in the same buffer with 2 mM guanosine-5'diphosphate. Thereafter, sections were incubated for 1 h at RT in the same buffer with 0.05
nM [35S]GTP-γ-S with 0.3 mM SKF38393 for D1 receptor stimulation and of 0.3 mM
quinpirole for D2/D3 receptor stimulation. Non-specific binding was determined in the
presence of 0.2 mM SCH23390 or 1 mM sulpiride, respectively. Sections were then washed
twice for 5 min in ice-cold 50 mM HEPES buffer, dipped in ice-cold water, dried and exposed
to Biomax MR films for 15-20 h.
Quantification
Standard radioactive-microscales (Amersham) were exposed on each autoradiographic film
to ensure that densities of the labellings were in the linear range. After scanning
autoradiograms, densities were analyzed with Multi Gauge software or MCIDTM Analysis
software for [3H]- or [35S]- and [125I]-radioligand, respectively. The values, in arbitrary units
(mean grey values), of the densities of the labellings of 4 sections per area were averaged to
give one value per animal.
Determination of endogenous DA levels and in vivo tyrosine hydroxylase activity
The levels of endogenous DA, its precursor L-DOPA and its metabolites DOPAC and HVA
were determined as already described (Martres et al., 1998). Briefly, brain areas were
weighted and homogenized in cold 0.1 M HClO4 supplemented with 0.05% EDTA and 0.05%
Na2S2O2 and centrifuged at 450,000 gxmin at 4 °C. 200 µl aliquots were neutralized with 2
162
M KH2PO4/K2HPO4, pH 7.4 containing 0.01 mg/ml ascorbate oxidase and centrifuged at
300,000 gxmin. Aliquots (10µl) of the clear supernatant were injected into a highperformance liquid chromatography (HPLC) column (Ultrasphere IP, Beckman, Gagny,
France; 25x4.6 cm, C18 reversed-phase, particle size 5 µm) protected with a Brownee
precolumn (3 cm, 5 µm). The mobile phase for the elution (flow rate of 1 ml/min) consisted of
70 mM KH2PO4, 2.1 mM triethylamine, 0.1 mM EDTA, 1.25 mM octane sulphonate and 16%
methanol, adjusted to pH 3.02 with solid citric acid. The electrochemical detection system
(ESA 5011, Bedford, USA) comprises an analytical cell with dual coulometric monitoring
electrodes (+50 mV and +350 mV). The generated signal was integrated by a computing
integrator (Millenium32- Waters, Saint Quentin en Yvelines, France). Quantitative
determinations were made using appropriate standards.
For the in vivo measurement of tyrosine hydroxylase activity, animals were i.p. injected with
100 mg/kg NSD 1015, 30 min before sacrifice. Endogenous L-DOPA, DA and its metabolites
were measured as described.
Uptake on synaptosomes
3-4 striata or nucleus accumbens were homogenized in 15-20 volumes (v/w) of 0.32 M
sucrose with a glass-Teflon potter. Homogenates were diluted to 40 volumes with 0.32 M
sucrose, centrifuged at 10,000 gxmin and the resulting supernatants were centrifuged again
at 300,000 gxmin. The pellets were gently resuspended in 50 volumes of 0.32 M sucrose and
25 µl aliquots were incubated in a final volume of 500 µl buffer containing 4 mM Tris-HCl,
6.25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM CaCl2, 1.2 MgSO4, 5.6 mM D-glucose
and 0.5 mM ascorbic acid, pH 7.4. For saturation experiments, synaptosomes were
incubated in the presence of 10 nM [3H]-dopamine and increasing concentrations of DA. For
inhibition cocaine experiments, synaptosomes were incubated in the presence of 10 nM [3H]dopamine with or without cocaine at increasing concentrations. In all cases, non specific
uptake was determined in the presence of 30 µM nomifensine. After 7 min at 37 °C, samples
were diluted with 3 ml of cold buffer and rapidly filtered through Whatman GF/B glass-fibers
presoaked with 0.05% polyethylenimine. After three washes with 3 ml of cold buffer, filters
were dried and the entrapped radioactivity counted by liquid scintillation spectrometry.
Proteins were quantified as described by Lowry et al. (1951).
Behavioural studies
Acute effect of cocaine
The horizontal (locomotion) and vertical (rearing) activities were assessed in transparent
activity cages (20x15x25 cm), with automatic monitoring of 8 photocell beam breaks, located
at 1.5 cm (horizontal activity) and 6.5 cm (vertical activity) above the floor (Imetronic,
Bordeaux, France). Mice were allowed to habituate to actimeter cages, 20 min before i.p.
administration of saline or cocaine at increasing doses. Their locomotor activity was further
recorded for 50 min.
Behavioural sensitization to cocaine
Mice were allowed to habituate to actimeter cages during 20 min before administration of the
drug. Animals of both genotypes received saline or cocaine (10 mg/kg) for 5 consecutive
days (initiation phase) and their locomotor activity was recorded for 60 min. 20 Days after the
last saline or cocaine administration (day 25), all pre-treated mice received saline and their
locomotion was recorded. On day 26 (expression phase), all mice received cocaine (10
mg/kg) and their locomotion was further recorded for 60 min.
163
Statistical analysis
For autoradiographic quantifications, determination of endogenous DA and metabolite levels
and tyrosine hydroxylase activity, data were subjected to factorial two-way analysis of
variance (ANOVA), with genotype as between-group. Significant main effects were further
analyzed by comparison of means using the Fisher’s test.
The kinetic parameters from uptake experiments on synaptosomes, i.e. KM, IC50% and VM
were calculated by non linear regression using PRISM software.
Behavioural data were subjected to factorial two-, three- or four-way ANOVA, with genotype,
sex and treatment as between-group and time as within-group factors. Significant main
effects were further analyzed by post-hoc comparison of means using the Fisher’s exact test.
164
RESULTS
Relative density of dopaminergic transporters and receptors in various areas of WT and
STOP KO mice
The relative density of the DA transporter (DAT), the vesicular monoamine transporter
(VMAT2) and of the three main DA receptors D1, D2 and D3 were determined in various
brain areas of WT and STOP KO mice (Fig. 1 and Table 1). The density of the DAergic
markers varied in a sub-type- and area-dependent manner.
The density of DAT and VMAT2 were not modified in the various areas tested in STOP KO
mice. The relative density of the DAergic D1 receptors was not altered in any of the areas
tested in STOP KO mice, whereas the density of D2 receptors was significantly decreased
by 20%-30% in the striatum and the core and the shell parts of the nucleus accumbens. The
D2 receptor density was not modified in the DAergic cell bodies, substantia nigra and ventral
tegmental area. The density of D3 receptors were significantly decreased by 37% in the
ventral tegmental area, while its density was not modified in the substantia nigra and in the
DAergic terminal areas, striatum and nucleus accumbens.
D1 and D2/D3 receptor-mediated binding of [35S]-GTP-γ-S in various areas of WT and
STOP KO mice
The binding of [35S]-GTP-γ-S mediated by the stimulation of D1 receptors with the
agonist SKF38393, or by the stimulation of D2/D3 receptors with quinpirole, was quantified in
various areas of WT and STOP null mice (Fig. 2 and Table 2).
No variation was found in the amplitude of the [35S]-GTP-γ-S binding, when stimulated by
D1 or D2/D3 agonist, in any area tested in STOP KO mice, compared to WT mice.
Endogenous levels of DA and its metabolites DOPAC and HVA in various areas of WT and
STOP KO mice
The levels of endogenous DA and its two main metabolites DOPAC and HVA were
compared in DAergic areas of WT and STOP KO mice (Table 3).
No variation in DA and metabolite levels was found between mice of the two genotypes, in
the substantia nigra and ventral tegmental area, where the DAergic cell bodies are localized.
In contrast, the level of endogenous DA was significantly decreased in the striatum (39%,
p=0.0063) and in the nucleus accumbens (63%, p=0.0023). The levels of DOPAC and HVA
were also decreased to the same extent as DA, so that the ratio between metabolites and
DA was not modified in the two DAergic terminals of STOP KO mice. Interestingly, the
amplitude of the decrease of DA level was significantly higher in the nucleus accumbens
than in the striatum (p=0.0005). In the prefrontal cortex, only the DOPAC level was
significantly decreased (26%, p=0.0162), suggesting a decreased intracellular metabolism of
endogenous DA.
Determination of the in vivo activity of the tyrosine hydroxylase in various areas of WT and
STOP KO mice
In order to determine the mechanism responsible for the drop in DA and metabolites
concentration, we measured the in vivo synthesis of DA. The in vivo activity of the tyrosine
hydroxylase (TH) was determined by the L-DOPA accumulated after inhibition of the DOPA
decarboxylase activity (Table 4). In all areas, the respective endogenous levels of L-DOPA
were subtracted from L-DOPA accumulated 30 min after NSD 1015 administration. Basal
endogenous L-DOPA levels represented 7% of total L-DOPA in the substantia nigra plus the
ventral tegmental area, in the striatum and in the nucleus accumbens and 15% in the
prefrontal cortex (not shown).
The levels of accumulated L-DOPA were significantly reduced by 20%-30% in the
substantia nigra plus the ventral tegmental area, in the striatum and in the nucleus
165
accumbens of STOP KO mice, suggesting a decreased TH activity in both DAergic cell
bodies and terminals. In contrast, no variation was found in the prefrontal cortex.
DA uptake on synaptosomes from the striatum and the nucleus accumbens of WT and STOP
KO mice
In order to evaluate a potential modulation of the DA transporter (DAT) activity, the
kinetic parameters of the [3H]-DA uptake were determined on synaptosomes from the
striatum and the nucleus accumbens of mice of both genotypes (Fig. 3).
In striatal synaptosomes, the Vmax for STOP KO mice was not significantly different from
WT mice (Vmax= 19.4±2.4 and 24.5±2.1 pmol/mg prot/min for WT and KO mice,
respectively), contrary to the Km, which was higher for KO mice (Km= 50.4±5.7 and 73.4±2.1
nM for WT and KO mice, respectively for three independent experiments). However, uptake
of [3H]-DA, at all concentrations tested in mutant mice, was systematically higher, although
not significantly, reaching a near significantly increase (26%, p=0.083) at 100 nM [3H]-DA.
In contrast, in accumbic synaptosomes, the maximal uptake rate was significantly decreased
in STOP KO mice compared to WT mice, without significant modification of DA affinity, i.e.
Vmax= 18.5±1.3 and 14.1±0.6 pmol/mg prot/min, -22%, p=0.0240, and Km=191.3±5.2 and
185.0±2.5 nM, respectively for 6 independent experiments). Finally, the Km for DA was
significantly increased by 400% (p<0.0001) in the nucleus accumbens compared to the
striatum of WT mice. In our knowledge, the kinetic parameters of the DA uptake by accumbic
synaptosomes from mouse had never been determined.
Effect of cocaine on the locomotor activity WT and STOP KO mice
In order to determine a potential functional consequence of the decreased accumbic
Vmax of [3H]-DA uptake, we assessed the effect of acute cocaine at various doses on the
horizontal and vertical locomotor activities (Fig. 4).
During the habituation phase, the horizontal locomotor activity of STOP KO mice was higher
(26%, p=0.0399) than WT mice, as previously reported for mutant mice in a novel
environment (Brun et al., 2005). In contrast, their vertical activity was decreased (40%,
p=0.0081), compared to WT mice (not shown). STOP KO mice were hypersensitive to the
stimulating effect of cocaine for both their horizontal and vertical activities. Whereas cocaine
at the dose of 10 mg/kg had no significant effect on the horizontal activity of WT mice, it
strongly increased the locomotion of STOP KO mice (850%, p<0.0001, Fig.4, top and
bottom), as recently reported with amphetamine (Brun et al., 2005). The stimulant effect of
10 mg/kg cocaine on the horizontal locomotion of mutant mice was not due to a decreased
vertical activity. Indeed, 10 mg/kg cocaine significantly increased (830%, p=0.0029) the
vertical activity of STOP KO mice (Fig. 4), while cocaine at this dose significantly decreased
the vertical activity of WT mice (99%, p=0.0040).
Cocaine inhibition of DA uptake in synaptosomes from the striatum and the nucleus
accumbens of WT and STOP KO mice
In order to determine if the hypersentivity of mutant mice towards the hyperlocomotor
effect of cocaine was due to modified inhibition of DA uptake, the inhibition parameters of
cocaine were measured after [3H]-DA uptake on synaptosomes from the striatum and the
nucleus accumbens of WT and STOP mice (Fig. 5). The concentration of cocaine which
inhibits by 50% (IC50%) the [3H]-DA uptake was the same, whatever the genotype of mice,
in both the striatum and the nucleus accumbens (IC50%=99±27 nM and 102±33 nM in the
striatum, 193±24 nM and 205±23 nM in the nucleus accumbens of WT and STOP KO mice,
respectively). Finally, the IC50% for cocaine was significantly higher in the nucleus
accumbens compared to the striatum of WT mice (95%, p=0.0240).
166
Behavioural sensitization to cocaine in WT and STOP KO mice
To check the potential dependence of STOP KO mice towards cocaine, we tested the
effect of repeated administration of the lowest active dose of cocaine (10 mg/kg, see Fig. 5).
During the initiation phase, the 5-day administration of cocaine induced a behavioural
sensitization, reaching the same amplitude for mice of both genotypes (Fig. 6). The
comparison of cocaine effects between day 1 and day 5 was only significant for WT mice
(p=0.0375). After a 20-day withdrawal, the challenge cocaine-induced hyperactivity was
similar between saline- and cocaine-pretreated WT mice (compare Sal+Coc and Coc+Coc
on Fig.3, bottom). However, in saline-treated WT mice, the challenge cocaine effect was
significantly higher than day 1 (compare J1 and Sal+Coc, p=0.0111), suggesting a
behavioural (environmental) sensitization. During the expression phase, the challenge
cocaine-induced hyperactivity was significantly higher in cocaine-pretreated than in salinepretreated STOP KO mice, showing a behavioural sensitization STOP KO mice to cocaine
(p=0.0417, compare Sal+Coc and Coc+Coc on Fig.3, bottom).
167
DISCUSSION
The present study demonstrates that the constitutive inactivation of the microtubule
effector STOP elicits important modifications in the DAergic components and functions.
Paradoxically, the suppression of this relatively ubiquitous protein (Andrieux et al., 2002) did
not induce alterations of all DAergic markers, nor in all DAergic areas. Very interestingly, our
data show that the meso-limbic neurotransmission is more altered than the nigro-striatal
pathway.
In STOP KO mice, the relative density of the DA transporter DAT and of the vesicular
monoamine transporter VMAT2 were not altered in the dopaminergic areas tested. On the
contrary, the density of D2 and D3 receptors was decreased by 20%-40%. It can be noted
that the D3 receptor density was only modified in the ventral tegmental area, containing cell
bodies of the meso-limbic DA neurons contrary to the D2 receptor density, which was only
modified in the terminals. The decreased density of D2 receptors may correspond to a
compensatory mechanism to increased DA release, as previously reported in the
constitutively hyperDAergic DAT KO mice (Giros et al., 1996; Jones et al., 1998; Weiss et al.,
in preparation). Surprisingly, the density of D1 receptors was not modified contrasting with
previous results in DAT KO mice, nor the sensitivity state of D1 and D2 receptors, as
revealed by their coupling to proteins G. This could mean that in STOP KO mice, alterations
of DA receptor levels not only depend on the DAergic area, but also on the neuronal
environment. Finally, the unmodified or the decreased density of both autoreceptors D2 and
D3 (Sokoloff et al., 1990) in the ventral tegmental area were in disagreement with the
previous report of Brun et al. (2005). By amperometric measurements, these authors
inbdirectly show an enhanced autoinhibition of evoked DA release in the nucleus accumbens
of STOP KO mice. However, we ignore the ratio between D2 and D3 autoreceptors versus
postsynaptic receptors in the nucleus accumbens of mutant mice, nor their respective
sensitization state and coupling.
A preferential alteration of the meso-limbic DAergic pathway in STOP KO mice was
observed from the alterations of the endogenous DA levels. Indeed, whereas DA and its
metabolite levels were not modified in the substantia nigra and the ventral tegmental area
containing DAergic cell bodies, they were highly decreased in the DAergic terminal areas,
striatum and nucleus accumbens. Furthermore, the amplitude of the drop in endogenous DA
level was significantly two-fold higher in the nucleus accumbens than in the striatum. This
decreased endogenous DA level in STOP KO mice was reminiscent of that in DAT KO mice
(Giros et al., 1996). The selective decrease in DA level was not due to different synthesis
activity between DAergic cell bodies and terminals, as indicated by the similar decreased in
vivo activity of the tyrosine hydroxylase in the three DAergic areas tested. The decreased
endogenous DA level restricted to DA terminals could be due to difference in vesicular
uptake and/or intraneuronal catabolism between cell bodies and terminals. Finally, as it was
the case for the D2 receptor density, the decrease of TH activity was higher in the nucleus
accumbens than in the striatum, although not significantly.
Whereas the relative density of DAT was not modified in any DAergic tissues of
STOP KO mice, its activity in synaptosomes was increased by 25%, although non
significantly, in the striatum, but significantly decreased by 25% in the nucleus accumbens.
Such opposite effects on the DA uptake in the striatum and the nucleus accumbens, not
observed at low DA concentrations, were quite in accordance with data from studies of Brun
et al. (2005). These authors show that, whereas basal extracellular DA level is not modified
in the striatum nor the nucleus accumbens, evoked stimulated DA release (tonic release) is
not significantly decreased in the striatum and significantly increased in the nucleus
accumbens.
168
As previously reported for amphetamine (Brun et al., 2005) and nicotine (BouvraisVeret et al., in preparation), STOP KO mice displayed hypersensitive response to the
stimulating locomotor effect of acute cocaine. Indeed, concerning the mutant mice locomotor
activity, the cocaine dose-response curve showed a 10-fold leftward shift, compared to WT
mice. In a behavioural sensitization protocol, we showed that this hypersensitivity was
maintained 20 days after a semi-chronically treatment, in mutant mice only. This latter data
might result from the hypersensitivity of STOP KO mice to the acute effect of cocaine. This
hypersensitivity might not be due to modified characteristics of inhibition of DA uptake by
cocaine, but rather to a hyper-reactivity of the meso-limbic DAergic system and/or to
decreased DA reuptake in the nucleus accumbens. Another, not exclusive, explanation could
be that cocaine partly mediates its effects via another monoamine transporter, as the
serotonin transporter for which it displays a good affinity (Giros et al., 1992). The serotonin
neurotransmission of STOP KO mice is probably altered, in agreement with previous report
on dramatic signs of anxiety-like behaviour of mutant mice (Andrieux et al., 2002). The higher
sensitivity of STOP KO mice to the stimulant locomotor effect of cocaine, as well to its
behavioural sensitization, is reminiscent of studies showing co-morbidity of schizophrenia
and psychostimulant abuse (Green, 2005; Swartz et al., 2006).
Altogether our results reinforce the pertinence of STOP KO mice as a study model for
some symptoms of schizophrenia. According to previous results (Brun et al., 2005), these
mice displayed hyperDAergy, preferentially in the meso-limbic pathway. These mutants were
hyper-reactive to psychostimulant and exhibited some common feature with the constitutively
hyperDAergic DAT KO mice, another pertinent model for some symptoms of schizophrenia
(Gainetdinov et al., 2001).
169
REFERENCES
Andrieux A., Salin P. A., Vernet M. et al (2002) The suppression of brain cold-stable microtubules in
mice induces synaptic defects associated with neuroleptic-sensitive behavioral disorders. Genes
Dev 16, 2350-2364.
Bahi A., Boyer F., Bussard G; and Dreyer J.L. (2006) Silencing dopamine D3-receptors in the nucleus
accumbens shell in vivo induces changes in cocaine-induced hyperlocomotion. Eur J Neurosci
21, 3415-3426.
Benitez-King G., Ramirez-Rodriguez G., Ortiz L;, Meza I. (2004) The neuronal cytoskeleton as a
potential therapeutical target in neurodegenerative diseases and schizophrenia. Curr. Drug
Targets CNS Neurol. Disord. 3, 515-533.
Bosc C., Cronk J.D., Pirollet F., Watterson D.M., Haiech J., Job D. and Margolis R.L. (1996) Cloning,
expression, and properties of the microtubule-stabilizing protein STOP. Proc. Natl. Acad. Sci. U
S A 93, 2125-2130.
Brun P., Begou M., Andrieux A., Mouly-Badina L., Clerget M., Schweitzer A., Scarna H., Renaud B.,
Job D. and Suaud-Chagny M. F. (2005) Dopaminergic transmission in STOP null mice. J
Neurochem 94, 63-73.
Eastwood S.L., Lyon L., George L., Andrieux A., Job D. and Harrison P.J. (2006) Altered expression of
synaptic protein mRNAs in STOP (MAP-6) mutant mice. J Psychopharmacol, in press.
Fernagut P.O., Chalon S., Diguet E., Guilloteau D., Tison F. and Jaber M. (2003) Motor behavior
deficits and their histopathological and functional correlates in the nigrostriatal system of
dopamine transporter knock-out mice. Neuroscience 116, 1123-1130.
Fradley R. L., O'Meara G. F., Newman R. J., Andrieux A., Job D. and Reynolds D. S. (2005) STOP
knockout and NMDA NR1 hypomorphic mice exhibit deficits in sensorimotor gating. Behav Brain
Res 163, 257-264.
Gainetdinov R. R., Mohn A. R. and Caron M. G. (2001) Genetic animal models: focus on
schizophrenia. Trends Neurosci 24, 527-533.
Giros B. and Caron M. G. (1993) Molecular characterization of the dopamine transporter. Trends
Pharmacol Sci 14, 43-49.
Giros B., el Mestikawy S., Godinot N., Zheng K., Han H., Yang-Feng T. and Caron M.G. (1992)
Cloning, pharmacological characterization, and chromosome assignment of the human
dopamine transporter. Mol Pharmacol 42, 383-390.
Giros B., Jaber M., Jones S. R., Wightman R. M. and Caron M. G. (1996) Hyperlocomotion and
indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature 379,
606-612.
Guillaud L., Bosc C., Fourest-Lieuvin A., Denarier E., Pirollet F., Lafanechere L. and Job D. (1998)
STOP proteins are responsible for the high degree of microtubule stabilization observed in
neuronal cells. J. Cell Biol. 142, 167-179.
Green A. I. (2005) Schizophrenia and comorbid substance use disorder: effects of antipsychotics. J
Clin Psychiatry 66, 21-6
He L, Di Minte D. A., Langston J.W., Quick M. (2000) Autoradiographic analysis of dopamine receptorstimulated [(35)S]GTPgammaS binding in rat striatum. Brain Res 885, 133-6
Ishizuka K., Paek M., Kamiya A. and Sawa A. (2006) A review of Disrupted-In-Schizophrenia-1
(DISC1): neurodevelopment, cognition, and mental conditions. Biol. Psychiatry 59, 1189-1197.
Jones S. R., Gainetdinov R. R., Jaber M., Giros B., Wightman R. M. and Caron M. G. (1998) Profound
neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U
S A 95, 4029-4034.
Lewis C.M., Levinson D.F., Wise L.H. et al. (2003)
Genome scan meta-analysis of schizophrenia
and bipolar disorder, part II: Schizophrenia. Am. J. Hum. Genet. 73, 34-48.
Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. and Randall R.J. (1951) Protein measurement with the Folin
phenol reagent. J Biol Chem 193, 265-275.
Martres M.P., Bouthenet M.L., Salés N., Sokoloff P. and Schwartz J.C. (1985) Widespread distribution
125
of brain dopamine receptors evidenced with [ I]iodosulpride, a highly selective ligand. Science
228, 752-755.
Mirnics K., Middleton F. A., Lewis D. A. and Levitt P. (2001) Analysis of complex brain disorders with
gene expression microarrays: schizophrenia as a disease of the synapse. Trends Neurosci 24,
479-486.
170
Morris J.A., Kandpal G., Ma L., and Austin C.P. (2003) DISC1 (Disrupted-In-Schizophrenia 1) is a
centrosome-associated protein that interacts with MAP1A, MIPT3, ATF4/5 and NUDEL:
regulation and loss of interaction with mutation. Hum. Mol. Genet. 12,1591-1608.
Owen M.J., Craddock N. and O'Donovan M.C. (2005a) Schizophrenia: genes at last? Trends Genet.
21, 518-525.
Owen M. J., O'Donovan M. C. and Harrison P. J. (2005b) Schizophrenia: a genetic disorder of the
synapse? Bmj 330, 158-159.
Shimizu H., Iwayama Y., Yamada K. et al (2006) Genetic and expression analyses of the STOP
(MAP6) gene in schizophrenia. Schizophr Res, in press.
Stanwood G.D., Artymyshyn R.P., Kung, M.P., Kung H.F., Lucki I. and McGonigle P. (2000)
Quantitative autoradiographic mapping of rat brain dopamine D3 binding with [125I]7-OHPIPAT: evidence for the presence of D3 receptors on dopaminergic and nondopaminergic cell
bodies and terminals. J Pharmacol Exp Ther 295, 1223-1231.
Swartz M.S., Wagner H.R., Swanson J.W. et al (2006) Substance use and psychosocial functioning in
schizophrenia among new enrollees in the NIMH CATIE study. Psychiatr Serv 57, 1110-6
van Rossum D. and Hanisch U. K. (1999) Cytoskeletal dynamics in dendritic spines: direct modulation
by glutamate receptors? Trends Neurosci 22, 290-295.
Zervas M., Opitz T., Edelmann W., Wainer B., Kucherlapati R. and Stanton P. K. (2005) Impaired
hippocampal long-term potentiation in microtubule-associated protein 1B-deficient mice. J
Neurosci Res 82, 83-92.
171
Table 1: Relative density of DAergic transporters and receptors in various areas of WT
and STOP KO mice
Marker
Area
WT
KO
% KO/WT
DAT
SNc
VTA
Str
Acc Core
Acc Shell
(6) 353 ± 11
(5) 355 ± 13
(6) 359 ± 8
(5) 350 ± 11
(5) 279 ± 9
(5) 370 ± 19
(5) 387 ± 21
(6) 360 ± 12
(6) 362 ± 13
(6) 291 ± 19
+5% ns
+9% ns
0%
+3% ns
+4% ns
VMAT2
SN
VTA
Str
Acc Core
Acc Shell
(6) 514 ± 58
(4) 265 ± 26
(5) 436± 25
(5) 454 ± 42
(5) 533 ± 32
(4) 581 ± 28
(4) 241 ± 27
(5) 482 ± 44
(5) 499 ± 37
(5) 538 ± 25
+9% ns
-9% ns
+11% ns
+10% ns
+1% ns
D1
SNr
Striatum
Acc Core
Acc Shell
Cing Cx
(6) 131 ± 4
(5) 494 ± 10
(5) 356 ± 7
(5) 324 ± 12
(6) 5.25 ± 0.52
(6) 132 ± 7
(5) 486 ± 21
(5) 332 ± 16
(5) 358 ± 14
(6) 5.92 ± 0.17
0%
-2% ns
-7% ns
+11% ns
+13% ns
D2
SNc
VTA
Striatum
Acc Core
Acc Shell
(5) 264 ± 33
(5) 237 ± 18
(6) 774 ± 58
(5) 257 ± 23
(5) 240 ± 22
(5) 231 ± 11
(4) 211 ± 11
(6) 596 ± 50
(5) 185 ± 14
(5) 175 ± 15
-12% ns
-11% ns
-23% 0.0431
-28% 0.0298
-27% 0.0422
D3
SN
VTA
Str DL
Acc Core
Acc Shell
(6) 25.1 ± 2.4
(6) 14.3 ± 0.8
(5) 12.8 ± 0.7
(6) 87.0 ± 5.2
(7) 111.3 ± 4.8
(5) 21.2 ± 3.3
(4) 8.9 ± 1.9
(6) 12.9 ± 0.3
(5) 74.0 ± 6.1
(6) 99.1 ± 8.1
-16% ns
-38% 0.0182
+1% ns
-15% ns
-11% ns
Relative densities are the means ± SEM of specific autoradiographic labellings in arbitrary
mean grey values. The number of mice is indicated in parentheses. Acc, Nucleus
Accumbens ; SN, Substantia Nigra ; SNc and SNr, Substantia Nigra, pars compacta and
reticulata ; Str, Striatum ; Str DL, Dorso-Lateral part of Striatum ; VTA, Ventral Tegmental
Area. ND, not detectable; ns: non significant. Comparison between genotypes by Fisher’s
test.
172
Table 2: D1 and D2/D3 receptor-mediated binding of [35S]-GTP-γ-S in various areas of WT
and STOP KO mice
Receptor
Area
WT
KO
% KO/WT
D1
SNr
Str
Acc Core
Acc Shell
Cing Cx
(4) 245 ±49
(4) 166 ± 38
(4) 286 ±88
(4) 238 ±92
(5) 112 ± 30
(4) 232 ± 54
(5) 256 ± 87
(3) 344 ± 5
(3) 216 ± 81
(5) 124 ± 30
-5% ns
+54% ns
+20% ns
-9% ns
+11% ns
D2/D3
SN
VTA
Str
Acc Core
Acc Shell
Cing Cx
(5) 328 ± 85
(5) 416 ±32
(4) 1043 ± 50
(5) 1016 ± 150
(5) 994 ± 141
(5) 655 ± 121
(6) 400 ± 22
(6) 333 ± 42
(5) 1174 ± 220
(5) 1006 ± 253
(5) 977 ± 241
(6) 609 ± 139
+22% ns
-20% ns
+13% ns
-1% ns
-2% ns
-7% ns
Relative densities are the means ± SEM of specific autoradiographic labellings in arbitrary
mean grey values. The number of mice is indicated in brackets. Acc, Nucleus Accumbens ;
Cing Cx, Cingulate Cortex; SN, Substantia Nigra, pars compacta and reticulata ; SNr,
Substantia Nigra, pars reticulata ; Str, Striatum; VTA, Ventral Tegmental Area. ns; non
significant. Comparison between genotypes by Fisher’s test.
173
Table 3: Endogenous levels of dopamine and its metabolite in various areas of WT and
STOP KO mice
Area
Mice
DA
DOPAC
HVA
SN + VTA
WT
KO
(6) 0.77±0.04
(5) 0.78±0.13
+2% ns
(6) 0.41±0.04
(6) 0.32±0.05
-23% ns
(6) 0.47±0.02
(5) 0.38±0.05
-19% ns
Str
WT
KO
(5) 11.27±0.97
(6) 7.95±0.31
-39% 0.0063
(5) 1.11±0.16
(6) 0.85±0.04
-23% ns
(5) 1.72±0.12
(6) 1.30±0.07
-24% 0.0075
Acc
WT
KO
(5) 5.45±0.86
(6) 2.01±0.24
-63% 0.0023
(5) 0.88±0.11
(6) 0.42±0.04
-52% 0.0020
(6) 0.87±0.07
(6) 0.43±0.04
-51% 0.0003
PrFr Cx
WT
KO
(4) 0.21±0.02
(5) 0.26±0.06
+25% ns
(6) 0.11±0.01
(5) 0.08±0.004
-26% 0.0162
(6) 0.43±0.04
(3) 0.47±0.02
+8% ns
The levels of endogenous DA and its metabolites HVA and DOPAC of WT and STOP KO
mice are expressed as means ± SEM of values in µg/g tissue. The number of mice is
indicated in parentheses. Acc, Nucleus Accumbens; PrFr Cx, Pre-Frontal Cortex; SN+VTA,
Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area; Str, Striatum. ns: non significant. Values of
KO mice were compared with respective WT mouse values by Fisher's test.
174
Table 4: In vivo activity of tyrosine hydroxylase in various areas of WT and STOP KO mice
Area
SN+VTA
Str
Acc
PrFr Cx
L-DOPA (ng/g)
WT
(12) 861±55
(10) 1405±83
(11) 1188±108
(11) 382±32
KO
(12) 590±38
(11) 1145±63
(11) 846±76
(12) 395±58
% KO/WT
-31% 0.0009
-19% 0.0036
-29% 0.0001
+3% ns
Mice received 100 mg/kg NSD 1015 30 minutes before sacrifice and dissections. Respective
basal endogenous L-DOPA levels were subtracted from L-DOPA accumulated after NSD
administration. The levels of L-DOPA are expressed as means ± SEM of values in ng/g
tissue. The number of mice is indicated in parentheses. Acc, Nucleus Accumbens; PrFr Cx,
Pre-Frontal Cortex; SN+VTA, Substantia Nigra+Ventral Tegmental Area; Str, Striatum.
Values in STOP KO mice were compared with the respective WT mice values by Fisher's
test.
175
LEGENDS TO FIGURES
Fig. 1 : Autoradiographic representation of plasmic DA (DAT) and vesicular monoamine
(VMAT2) transporters and of DAergic D1, D2 and D3 receptors in wild-type (WT) and STOP
KO mice.
Acb C: nucleus accumbens, core; Acb S: nucleus accumbens, shell; SN: substantia nigra;
SNc: substantia nigra, pars compacta; Str: striatum; VTA: ventral tegmental area.
Fig. 2 : Autoradiographic representation of D1 and D2/D3 receptor-mediated binding of [35S]GTP-γ-S in various areas of wild-type (WT) and STOP KO mice.
The binding of [35S]-GTP-γ-S was stimulated by the D1 receptor agonist SKF38393 (0.3
mM) or the D2/D3 receptor agonist quinpirole (0.3 mM).
Acb C: nucleus accumbens, core; Acb S: nucleus accumbens, shell; Cing cx: cingulate
cortex; SN: substantia nigra; Str: striatum; VTA: ventral tegmental area.
Fig. 3 : DA uptake in synaptosomes from the striatum and the nucleus accumbens of wildtype (WT) and STOP KO mice.
Values represent means ± SEM in pmol/mg prot/min of uptaked [3H]-DA from 3 (striatum)
and 6 (nucleus accumbens) independent experiments.
Fig. 4 : Effect of acute administration of cocaine on the locomotor activities of wild-type (WT)
and STOP KO mice.
Top: time course of the horizontal and vertical activities of WT and STOP KO mice after
administration of cocaine at increasing doses. Means ± SEM of photocell counts over a 5 min
period for 7-15 mice per dose. Bottom: dose-response effects of cocaine administration on
the horizontal locomotor activity of WT and STOP KO mice. Data represent means ± SEM of
photocell counts over a 50 min period. ∗ p<0.05, ∗∗ p<0.01, ∗∗∗ p<0.0001 compared to the
saline group of the same genotype (Fisher’s test).
Fig. 5 : Inhibition of DA uptake by cocaine in synaptosomes from the striatum and the
nucleus accumbens of wild-type (WT) and STOP KO mice.
Uptake of 10 nM [3H]-DA in the presence of cocaine at increasing concentrations. Values
represent means ± SEM in % of DA uptake in the absence of cocaine, in 3 independent
experiments.
Fig. 6 : Behavioural sensitization to cocaine of wild-type (WT) and STOP KO mice.
Top: time course of the horizontal locomotor activity of WT and STOP KO mice after
administration of saline (Sal) or 10 mg/kg cocaine (Coc), once daily for 5 days. After 20-day
cessation treatment, all mice received saline at day 25 (25 Sal) and 10 mg/kg cocaine at day
26 (26 Coc). Bottom: cumulated counts over 60 min period, after cocaine administration, at
day 1 (acute administration), day 5 (end of the acquisition period) and at day 26 (expression
period) for saline-pretreated (Sal+Coc) or cocaine-pretreated (Coc+Coc) mice. Means ± SEM
of data for 9-11 mice per condition. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.0001 by Fisher’s test.
176
177
178
179
180
181
182
RESULTATS COMPLEMENTAIRES
183
Taux endogènes de sérotonine (5-HT) et de son métabolite 5-HIAA, mesurés sur cerveaux
de souris sauvages (WT) et STOP KO (KO) (μg/ g tissu).
Régions
SN+AVT
Striatum
Noyau accumbens
Raphé
Hippocampe
Cortex Frontal
Génotype
5-HT
5-HIAA
WT
(6) 1.232±0.087
(6) 0.819±0.075
KO
(6) 1.311±0.125
(6) 0.877±0.071
%
WT
+6% NS
(6) 0.451±0.061
+7% NS
(6) 0.297±0.037
KO
(6) 0.279±0.033
(6) 0.200±0.017
%
WT
-38% 0.0315
(6) 0.382±0.028
-33% 0.0400
(6) 0.260±0.013
KO
(6) 0.198±0.026
(6) 0.159±0.018
%
WT
-48% 0.0007
(6) 0.651±0.072
-39% 0.0011
(6) 0.651±0.056
KO
(6) 0.776±0.060
(6) 0.800±0.075
%
WT
+19% NS
(6) 0.327±0.028
+23% NS
(6) 0.249±0.025
KO
(6) 0.169±0.022
(6) 0.159±0.023
%
WT
-48% 0.0013
(6) 0.416±0.032
-36% 0.0249
(6) 0.177±0.017
KO
(6) 0.202±0.016
(6) 0.082±0.007
%
-51% 0.0001
-54% 0.0005
Le nombre d’animaux est indiqué entre parenthèses.
NS : Non significatif (test de Fischer)
184
Mesure de l’activité in vivo de la tryptophane hydroxylase, dans plusieurs régions cérébrales
de souris sauvages (WT) et STOP KO (KO)
Régions
5-HTp (ng/g tissu)
WT
KO
% KO/WT
Raphé
397 + 15 (6)
514 + 28 (6)
+29%
0,0047
SN+ATV
433 + 14 (12)
525 + 35 (12)
+21%
ns
Striatum
227 + 13 (12)
170 + 16 (12)
-26%
0,010
N. Accumbens
296 + 30 (12)
261 + 22 (12)
-22%
ns
Hippocampe
223 + 13 (12)
121 + 10 (11)
-46%
0,0001
Cx Préfrontal
164 + 9 (12)
108 + 11 (12)
-34%
0,0007
Le nombre d’animaux est indiqué entre parenthèses.
ns : non significatif (test de Fischer)
185
DISCUSSION
186
Partie 2 - Discussion
Notre
travail
de
recherche,
centré
sur
les
transmissions
nicotinique
et
dopaminergique, nous a permis de mieux caractériser les souris invalidées pour la protéine
associée aux microtubules STOP. L’utilisation de diverses techniques biochimiques a mis en
évidence des altérations de la densité et/ou de l’activité de différents marqueurs, des taux
endogènes de dopamine et de métabolites, ainsi que des paramètres cinétiques
caractérisant le transporteur de la dopamine chez ces animaux. Des tests comportementaux,
mesurant l’activité locomotrice en réponse à des psychostimulants et la mémoire associative,
ont également révélé des sensibilités altérées et des déficits cognitifs. Ces résultats nous
amènent à réfléchir sur les effets spécifiques de l’inactivation de la protéine ubiquitaire STOP
et la validité des souris STOP KO comme modèle d’étude pour la schizophrénie.
A/ Altérations biochimiques des souris STOP KO
1/ Marqueurs nicotiniques/cholinergiques et dopaminergiques
Par des techniques de radioliaison sur coupes, nous avons montré une baisse de
densité des nAChRs de type α6* au niveau du striatum et du noyau accumbens des souris
STOP KO, ainsi qu’une augmentation des récepteurs α7 dans le striatum dorso-latéral et
l’hippocampe, structures impliquées dans certaines fonctions cognitives. La liaison à
l’épibatidine, mesurant les sous-unités β2*, probablement associées en majorité à des sousunités α4, n’est pas modifiée, de même que la densité de l’enzyme d’inactivation de
l’acétylcholine, AChE. Par contre, la densité du transporteur vésiculaire de l’acétylcholine,
VAChT, est réduite de manière sélective dans le champ CA1 de l’hippocampe, mais pas au
niveau du champ CA3, ni du septum, contenant les corps cellulaires de ces neurones
cholinergiques. Ce dernier résultat peut être rapproché de la baisse des transcrits du
transporteur vésiculaire glutamatergique VGLUT1 récemment décrite dans l’hippocampe
(Eastwood et al, sous presse). Une baisse de densité des vésicules synaptiques
glutamatergiques a également été trouvée dans CA1 et serait à l’origine du déficit de
plasticité synaptique à court terme dépendant de l’élément pré-synaptique (PTP) et plus
indirectement du déficit de LTP, processus postsynaptique, observé chez ces souris
(Andrieux et al., 2002). La baisse de densité de VAChT peut provenir de différentes causes:
une diminution globale du nombre de terminaisons cholinergiques, une réduction du nombre
de vésicules par terminaison et/ou une réduction de la densité de transporteurs par vésicule.
187
Des études de microscopie électronique seront nécessaires pour valider l’une ou l’autre de
ces hypothèses. Dans tous les cas et si la décroissance de densité de VAChT n’est pas
compensée par une augmentation d’activité, la diminution de ce transporteur vésiculaire
pourrait être responsable d’une baisse de libération d’acétylcholine chez les animaux
mutants.
Les densités des transporteurs plasmique DAT et vésiculaire VMAT2 ne sont pas
modifiées de façon significative dans les différentes régions cérébrales testées. La baisse du
récepteur D2 observée dans diverses régions dopaminergiques pourrait être un effet
compensateur d’une plus grande libération de dopamine à la synapse, comme chez les
souris hyperdopaminergiques DAT KO (Giros et al., 1996; Jones et al., 1998). Cependant, la
densité du récepteur D1 n’est modifiée dans aucune des régions testées et celle du
récepteur D3 n’est diminuée que dans l’aire tegmentale ventrale, région contenant les corps
cellulaires dopaminergiques de la voie méso-cortico-limbique. D’autre part, la fonctionnalité
des récepteurs D1 et D2/D3, reflétée par leur degré de couplage aux protéines G, n’est pas
altérée de manière significative chez les souris STOP KO. Ce résultat, combiné à la baisse
ou l’absence de variation de densité des récepteurs D2 et D3 dans le striatum et le noyau
accumbens, serait en désaccord avec les études d’électrochimie, réalisées par MF SuaudChagny et son équipe, qui suggéraient une auto-inhibition accrue par les auto-récepteurs
D2/D3, suite à une libération évoquée de dopamine dans le noyau accumbens des souris
mutantes (Brun et al., 2005). Toutefois, au niveau des terminaisons dopaminergiques,
notamment du noyau accumbens où le récepteur D3 est préférentiellement exprimé, nous ne
connaissons pas la proportion de récepteurs D2/D3 post-synaptiques versus présynaptiques, de même que le degré de fonctionnalité des récepteurs post-synaptiques
versus pré-synaptiques. Des expériences supplémentaires, mesurant l’activité des autorécepteurs par d’autres techniques s’avèrent nécessaires.
2/ Altérations biochimiques
La synthèse de dopamine se fait tout le long du neurone grâce à l’activité de la
tyrosine hydroxylase, qui est l’enzyme limitante hautement régulée de cette voie de
biosynthèse. Par dosage HPLC, nous avons montré que les taux endogènes de dopamine et
de ses métabolites étaient diminués d’environ 20 à 60% au niveau des régions à
terminaisons dopaminergiques (striatum et noyau accumbens) des souris STOP KO. La
libération de dopamine par exocytose ne constituant qu’1% environ de la concentration
188
endogène, ce résultat n’est pas en désaccord avec une concentration dopaminergique
extracellulaire basale normale (Brun et al., 2005). Aucune variation n’a été décelée au
niveau des régions à corps cellulaires dopaminergiques (aire tegmentale ventrale et
substance noire).
Cette diminution des taux endogènes de dopamine uniquement dans les régions à
terminaisons neuronales pourrait résulter d’un défaut de transport de la tyrosine hydroxylase.
Par conséquent, nous avons analysé l’activité de la tyrosine hydroxylase in vivo, après
inhibition de la DOPA décarboxylase et mesure de l’accumulation de L-DOPA. De manière
intéressante, on ne constate aucune régulation différentielle de la synthèse de dopamine en
fonction des structures cérébrales. L’activité de cette enzyme est diminuée de 20-30%, aussi
bien au niveau des corps cellulaires que des terminaisons neuronales. Ce résultat suggère
que la baisse des taux endogènes de dopamine sélective des terminaisons neuronales n’est
pas due à des variations locales de synthèse. On peut émettre l’hypothèse que dans les
régions des terminaisons, la dopamine est moins protégée de la dégradation intra-cellulaire,
parce que moins internalisée au sein des vésicules synaptiques. Ceci pourrait être la
conséquence d’une diminution du nombre de molécules et/ou de l’activité de VMAT2.
N’ayant pas trouvé de variation significative de la densité de ce transporteur vésiculaire au
niveau des terminaisons neuronales dopaminergiques des souris mutantes, notre hypothèse
pencherait vers une activité de transport décrue et/ou une moindre affinité de VMAT2 pour la
dopamine. Au contraire, dans les corps cellulaires, la dopamine serait moins synthétisée et
mieux stockée. Des expériences de capture de [3H]-dopamine sur des préparations
vésiculaires de souris STOP KO seront nécessaires pour vérifier cette hypothèse.
Concernant le système sérotoninergique (voir résultats complémentaires), les taux
endogènes de sérotonine et des métabolites ne varient pas de façon significative dans les
corps cellulaires (raphé) des souris mutantes, mais diminuent dans presque toutes les
régions de projection étudiées (striatum, accumbens, hippocampe, cortex préfrontal), tout
comme la dopamine. Le tryptophane est hydroxylé par l’enzyme limitante tryptophane
hydroxylase (TpOH), conduisant au 5-hydroxytryptophane (5-HTp), aboutissant à la
sérotonine après décarboxylation. La mesure des taux de 5-HTp chez l’animal vivant, après
inhibition de la décarboxylase, révèle que l’activité de la TpOH est régulée différemment
chez les souris KO, selon les structures cérébrales. Dans le raphé, son activité est
augmentée de façon significative, alors qu’elle est diminuée ou inchangée dans les régions
de terminaisons. Dans ces dernières, la baisse d’activité de la TpOH peut expliquer les
diminutions des taux endogènes de sérotonine. Par contre, au niveau du raphé, on peut
189
supposer que la sérotonine est un peu plus dégradée, contrairement à ce que nous
suggérons pour la dopamine.
Nous avons réalisé des d’expériences de capture de [3H]-dopamine sur des
préparations de synaptosomes de striatum et de noyau accumbens de souris STOP KO, afin
de déterminer les paramètres d’activité du DAT, dont la densité n’est pas modifiée chez les
mutants. De manière surprenante, et ce pour les deux génotypes de souris, on observe une
différence significative d’affinité du DAT entre striatum et noyau accumbens, l’affinité pour la
dopamine étant significativement plus faible dans cette dernière structure que dans le
striatum. Cette différence pourrait être due à des interactions différentes du DAT avec des
protéines chaperons, selon l’environnement neuronal/régional.
La vitesse maximale de capture (Vmax) du DAT augmente de manière non
significative dans le striatum des souris STOP KO et est significativement diminuée de 25%
pour les fortes concentrations de dopamine au niveau du noyau accumbens des souris
mutantes. Ces différences de capture pourraient résulter en une augmentation significative
de concentration de dopamine extracellulaire dans le noyau accumbens et une diminution
non significative dans le striatum des souris mutantes, dans les deux cas après stimulus.
Ces résultats rappellent ceux précédemment publiés (Brun et al., 2005). La stimulation
électrique à haute fréquence des fibres dopaminergiques conduit à un efflux de dopamine
significativement accru au niveau du noyau accumbens et non significativement diminué
dans le striatum. Nos résultats semblent donc a priori en accord avec ceux de cette équipe,
bien qu’elle ait conclu, de façon indirecte, à une absence de variation significative des
paramètres d’activité du DAT chez les souris mutées (Brun et al., 2005).
Cette discordance s’explique peut-être par la différence des techniques employées
permettant une mesure des paramètres biochimiques du DAT directe dans le cas des
synaptosomes et indirecte dans le cas de l’ampérométrie. D’autre part, Brun et
collaborateurs ont mesuré ces constantes pour des concentrations de dopamine allant
jusqu’à 250 nM alors que nous n’observons de différence de Vmax entre les deux génotypes
que pour des concentrations de dopamine supérieures ou égales à 300 nM. Brun et
collaborateurs concluent que la potentialisation de l’efflux dopaminergique n’est due qu’à une
augmentation de libération de dopamine chez les mutants. Cette plus forte libération peut
avoir plusieurs causes, par exemple un plus grand nombre de vésicules synaptiques, un plus
fort remplissage vésiculaire et/ou un cycle d’exocytose des vésicules plus rapide. Il serait
intéressant de compter en microscopie électronique le nombre de vésicules des
terminaisons dopaminergiques du striatum et du noyau accumbens et de mesurer l’activité
de VMAT2 sur des préparations de vésicules synaptiques, comme cela a déjà été proposé
190
précédemment. Chez les souris STOP KO, la potentialisation de l’efflux dopaminergique
évoqué à haute fréquence au niveau du noyau accumbens pourrait donc être due à la fois à
une moindre recapture de dopamine par le DAT et à une libération augmentée de dopamine.
B/ Altérations comportementales des souris STOP KO
1/ Sensibilité aux psychostimulants
Du fait des modifications densitométrique et biochimique de certains marqueurs
cholinergiques, nicotiniques et dopaminergiques, nous avons exploré l’activité locomotrice
des souris STOP KO et leur sensibilité aux psychostimulants, nicotine et cocaïne.
Les effets de la nicotine sur l’activité locomotrice des rongeurs sont variables et
dépendent de l’espèce, de l’arrière-fond génétique, du sexe, de l’environnement et de la
dose administrée (Ksir et al., 1987; Menzaghi et al., 1997; Damaj, 2001). Chez la souris, la
nicotine provoque le plus souvent une diminution de l’activité locomotrice, variable selon la
souche génétique. Selon l’environnement, la nicotine engendre généralement une
hyperlocomotion dans un environnement familier et une hypolocomotion dans un
environnement nouveau. Ces modulations de l’activité locomotrice font intervenir différents
sous-types de nAChRs. Dans nos expériences, l’activité locomotrice des souris a été
enregistrée sans période d’habituation, l’environnement est donc considéré comme nouveau.
Chez les souris sauvages, la nicotine provoque globalement un effet hypolocomoteur,
significatif à partir d’une dose de 1 mg/kg, globalement en accord avec les données de la
littérature. En revanche, l’administration systémique de doses croissantes de nicotine
engendre un effet biphasique chez les souris STOP KO, avec une composante
hyperlocomotrice
pour
des
faibles
doses
de
nicotine
suivie
d’une
composante
hypolocomotrice pour de plus fortes doses. L’hypersensibilité des souris mutantes à l’effet
hyperlocomoteur de la nicotine est en accord avec l’hypersensibilité aux effets locomoteurs
de l’amphétamine décrite chez ces souris (Brun et al., 2005), de même qu’aux effets de la
cocaïne. L’augmentation de la locomotion induite par la nicotine a été reliée à la stimulation
des voies dopaminergiques (Clarke et al., 1988). Or, Brun et collaborateurs ont montré une
libération accrue de dopamine dans le noyau accumbens en réponse à une stimulation
191
électrique mimant un stimulus physiologique. L’hypothèse d’une libération accrue de
dopamine après administration de nicotine, produisant l’effet hyperlocomoteur des souris
STOP KO, semble donc pertinente. Et ceci d’autant plus que la nicotine, comme toutes les
drogues d’abus, provoque une libération de dopamine dans le shell de l’accumbens (Di
Chiara and Imperato, 1988). Des études menées sur tranches de cerveaux ou chez des
souris invalidées pour différentes sous-unités des nAChRs suggèrent que la libération de
dopamine induite par la nicotine impliquerait essentiellement la sous-unité β2 (Picciotto et al.,
1998; Wonnacott et al., 2000; Maskos et al., 2005). Nos résultats de radioliaison n’ont pas
montré d’augmentation significative de cette sous-unité dans les régions dopaminergiques,
toutefois, nous n’avons pas mesuré l’état d’activité de ces récepteurs. Les récepteurs α7
pourraient aussi jouer un rôle indirect dans la libération de dopamine, de par leur localisation
stratégique sur les neurones glutamatergiques projetant dans les régions dopaminergiques
(Kaiser and Wonnacott, 2000). Etant donnée la forte augmentation de leur densité au niveau
striatal, et à la condition d’être fonctionnels, on peut supposer que ces récepteurs pourraient
être impliqués dans l’effet hyperlocomoteur de la nicotine.
Nous avons montré que la choline, agoniste sélectif des récepteurs α7 à faible dose
(Papke et al., 1996; Alkondon et al., 1997b), n’a pas d’effet locomoteur chez les souris
sauvages, mais provoque une forte hyperlocomotion horizontale des souris STOP KO et, à
l’opposé, une forte hypolocomotion verticale. Ce dernier effet de la choline chez les souris
mutantes est difficile à interpréter, d’autant plus que la signification de l’activité verticale est
peu explorée et discutée dans la littérature. Toutefois, l’hypolocomotion verticale n’est
significative que pour de fortes doses de choline, pour lesquelles la spécificité de son action
sur les récepteurs α7 n’est pas démontrée. A ces doses, la choline peut également servir de
substrat dans la synthèse d’acétylcholine et par conséquent agir sur d’autres récepteurs non
α7, nicotiniques et muscariniques. Une participation des récepteurs α7 dans l’effet
hyperlocomoteur de la choline chez les souris mutantes n’est donc pas à exclure, tout
comme d’autres types de nAChRs.
La sensibilité des souris STOP KO à l’effet hypolocomoteur provoqué par la nicotine
à fortes doses est la même que celle des souris sauvages, l’amplitude de l’effet et la dose
efficace inhibitrice (DI50) étant identiques. Des travaux réalisés sur des souris invalidées
pour certaines sous-unités des nAChRs suggèrent que les sous-unités α3 et α4 participent à
l’hypolocomotion induite par la nicotine (Ross et al., 2000; Marubio et al., 2003; Salas et al.,
2004). Cette hypothèse n’a pu être vérifiée, faute de ligands spécifiques pour chacune des
combinaisons de sous-unités nicotiniques.
192
Plusieurs études indiquent que l’effet stimulant produit par la cocaïne sur la
locomotion est associé à une augmentation de la transmission dopaminergique dans les
régions des terminaisons neuronales dopaminergiques (Johanson and Fischman, 1989).
Comme pour l’amphétamine (Brun et al., 2005), les souris STOP KO sont hypersensibles à
l’effet locomoteur de la cocaïne. Ces animaux montrent une hyperlocomotion dosedépendante à partir d’une dose de 10 mg/kg de cocaïne, pour laquelle aucun effet moteur
n’est observé chez les souris sauvages.
Pour tenter de caractériser cette hypersensibilité des souris STOP KO à l’effet
locomoteur de la cocaïne, nous avons mesuré les paramètres d’inhibition du transporteur
DAT par la cocaïne. La concentration de cocaïne nécessaire pour obtenir une inhibition de
50% de la Vmax du DAT (CI50) n’est pas significativement différente entre les deux
génotypes de souris, montrant que l’affinité du transporteur pour la cocaïne n’est pas
modifiée. Par contre, la CI50 est significativement deux fois plus élevée sur la préparation de
synaptosomes du noyau accumbens que sur celle du striatum, quelque soit le génotype des
souris. Nous avons précédemment montré que l’affinité du DAT pour la dopamine est moins
bonne dans le noyau accumbens que dans le striatum. Remarquons que le NET,
transportant la dopamine avec une grande affinité et liant la cocaïne avec une moins bonne
affinité que le DAT, est présent sur des terminaisons noradrénergiques abondantes dans le
noyau accumbens, mais rares dans le striatum. La moins bonne affinité du DAT pour la
dopamine dans le noyau accumbens ne peut pas être expliquée par la présence du NET. En
revanche, la moins bonne affinité du DAT pour la cocaïne pourrait être due à une certaine
participation du NET dans la recapture de la dopamine dans le noyau accumbens et/ou à la
présence de protéines partenaires du DAT, différentes dans les deux régions.
L’hypersensibilité des souris mutantes à la cocaïne ne peut donc pas être expliquée
par un changement des paramètres de son inhibition du DAT. Par contre, une plus grande
libération tonique de dopamine dans le système limbique (Brun et al., 2005), associée à une
recapture déficiente du DAT au niveau du noyau accumbens, suggérée par nos résultats,
pourrait engendrer une concentration de dopamine extracellulaire plus élevée à l’origine de
l’hyperlocomotion. Cette hypothèse pourrait être vérifiée par la mesure comparée chez les
souris sauvages et mutantes des taux de dopamine libérée par la cocaïne (et
l’amphétamine) à différentes doses. D’autres transporteurs plasmiques peuvent être
également mis en jeu, comme le transporteur de la sérotonine, qui a une bonne affinité pour
la
cocaïne.
La
transmission
sérotoninergique
des
souris
STOP
KO
est
très
vraisemblablement altérée. En effet, ces souris présentent des signes sévères d’anxiété
(Andrieux et al., 2002), ont des taux endogènes de sérotonine très diminués dans la plupart
193
des régions de terminaisons sérotoninergiques et une activité de l’enzyme de synthèse
TpOH altérée (voir résultats complémentaires).
L’hypersensibilité des souris mutantes à l’administration aiguë de cocaïne nous a
conduits à tester une éventuelle différence de sensibilisation psychomotrice à cette drogue.
Ce comportement se définit par l’augmentation des effets hyperlocomoteurs en réponse à
l’administration répétée d’un psychostimulant, perdurant après une période de sevrage
(Pierce and Kalivas, 1997). Il est connu que la sensibilisation comportementale induite par
des psychostimulants est associée à une augmentation de libération de dopamine au niveau
du core du noyau accumbens. De nombreuses études ont rapporté que la sensibilisation
comportementale aux psychostimulants est accompagnée de modifications neurobiologiques
au niveau du système limbique, notamment dans le noyau accumbens (Pierce and Kalivas,
1997). Il a été suggéré que les modifications cérébrales induites par la drogue ainsi que
l’induction de la sensibilisation comportementale contribuaient au processus d’addiction. Des
études épidémiologiques ont montré que la cocaïne était une des drogues d’abus
consommées chez les schizophrènes, sans que les causes de cette co-morbidité ne soient
clairement connues (Green, 2005; Swartz et al., 2006). Nous avons choisi de tester ce
comportement de sensibilisation comportementale pour une dose de 10 mg/kg de cocaïne,
bien que les souris sauvages ne répondent pas à cette faible dose, ceci afin de ne pas
masquer un effet potentiel chez les mutants, qui y répondent déjà fortement. Suite à un
protocole d’administration quotidienne pendant cinq jours et une période de sevrage de vingt
jours, l’activité locomotrice des souris STOP KO est significativement plus élevée après
traitement à la cocaïne qu’après administration de sérum physiologique. Cette sensibilisation
comportementale à la drogue n’est pas retrouvée chez les souris sauvages, qui ne
présentent qu’une sensibilisation comportementale à l’environnement, puisqu’après sevrage,
leur activité locomotrice est plus élevée, quelque soit le traitement reçu, cocaïne ou sérum
physiologique. L’absence de la protéine STOP permet donc la sensibilisation psychomotrice
des animaux à une dose relativement faible de cocaïne. Cette réponse comportementale
spécifique des souris STOP KO à l’injection répétée de cocaïne est probablement due en
partie à l’hypersensibilité de ces animaux à l’effet aigu de cette drogue.
194
2/ Performances mnésiques
L’augmentation très importante de densité de récepteurs α7 dans des régions des
souris STOP KO impliquées dans les processus d’apprentissage nous a incités à tester les
performances mnésiques des souris.
Dans un premier temps, nous avons voulu tester la mémoire spatiale des souris
STOP KO, dans un test de labyrinthe aquatique de Morris. Cependant, les souris sauvages
manifestaient de mauvaises performances, commençant tout juste à acquérir une stratégie
spatiale après huit jours d’entraînement (résultats non montrés). Ce fort déficit
d’apprentissage est très probablement lié à leur fond génétique mixte (50%/50% BALBc/129
SvPas). En effet, il a été montré que les performances des souches parentales sont
mauvaises dans certaines conditions expérimentales de ce test, qui sont celles que nous
avons utilisées dans notre laboratoire (Van Dam et al., 2006).
Nous avons donc testé la version indicée (version associative) du labyrinthe
aquatique de Morris, dans laquelle le rongeur doit apprendre à associer la position de la
plateforme, variable mais matérialisée par une petite balle contrastée. Dans cette
expérience, les souris sauvages montrent une certaine capacité à apprendre. Par contre, les
souris STOP KO présentent un fort déficit de performances. Ce genre d’apprentissage et de
mémoire pourrait faire intervenir le striatum dorsal (Packard and Knowlton, 2002). Bien que
l’hippocampe ait été décrit comme interagissant plus clairement dans la mémoire spatiale, sa
participation dans l’apprentissage associatif n’est pas à exclure. Or, les souris STOP KO
présentent des défauts de plasticité synaptique dans cette région, qui pourraient contribuer à
leurs mauvaises performances. Il n’est pas exclu non plus que ces souris présentent aussi
des déficits de plasticité synaptique dans le striatum.
La transmission cholinergique semble jouer un rôle important dans l’apprentissage et
la mémoire. En effet, des injections intra-striatales d’agonistes et d’antagonistes
cholinergiques augmentent et diminuent respectivement les fonctions mnésiques (Packard et
al., 1996; Hefco et al., 2003). Plusieurs études démontrent l’effet pro-cognitif de la nicotine et
des agonistes nicotiniques chez l’homme et le rongeur (Levin and Simon, 1998; Levin and
Rezvani, 2002). Une co-administration d’antagonistes des récepteurs nicotiniques α4β2
(DHβE) et α7 (MLA) à doses sub-actives dans l’hippocampe ventral potentialise les déficits
de mémoire de travail (Levin et al., 2002). En outre, il apparaît que la co-stimulation de ces
deux types de récepteurs chez la souris, par l’épibatidine (α4β2) et la choline (α7), est
essentielle pour le développement complet de la LTP dans le gyrus dentelé. Ce processus
de LTP est généralement considéré comme substrat de la mémoire (Bliss and Collingridge,
195
1993; Malenka and Bear, 2004). Or, on observe un accroissement de la densité des
récepteurs nicotiniques α7 dans le striatum dorsal et l’hippocampe des souris mutantes, qui
n’est pas en accord avec les mauvaises performances de ces animaux. On peut donc
supposer que ces récepteurs ne sont pas fonctionnels, soit parce qu’ils sont désensibilisés,
soit parce qu’ils sont sous-stimulés à l’état basal. L’administration d’un agoniste des nAChRs
α7, la choline (à une dose n’engendrant pas d’effet locomoteur significatif), avant chaque
essai du test, permet d’améliorer les performances (latence, distance parcourue et
proportion d’essais réussis) des souris STOP KO, qui ne sont plus significativement
différentes de celles des animaux sauvages. Nos données montrent un effet pro-cognitif d’un
agoniste α7 chez les souris STOP KO, en désaccord avec une éventuelle désensibilisation
des récepteurs α7. L’hypothèse que nous privilégions serait donc que ces récepteurs sont
sous-stimulés à l’état basal, à cause du déficit de libération d’acétylcholine. Nous pouvons
également proposer que le déséquilibre entre la densité des nAChRs β2* (non modifiée) et
α7 (augmentée) soit aussi à l’origine des déficits de mémoire associative (Levin et al., 2002).
Des expériences complémentaires s’avèrent donc nécessaires pour préciser la cause
des déficits de mémoire associative et le mécanisme d’action de la choline. Dans un premier
temps, il serait intéressant de mesurer la concentration extracellulaire d’acétylcholine par
microdialyse ainsi que la fonctionnalité du transporteur vésiculaire VAChT dans le striatum et
l’hippocampe afin d’obtenir des données biochimiques supplémentaires. Au niveau
comportemental, nous pourrions tester les mémoires spatiale et associative dans d’autres
paradigmes (planche à trou de Barnes, test de préférence de place) et tester l’action de
substances pharmacologiques, comme un agoniste des récepteurs β2* (épibatidine) ou un
inhibiteur d’acétylcholinestérase.
Enfin, notons que chez les souris sauvages, l’effet bénéfique de la choline est mineur
puisque ce traitement n’améliore pas la latence et la distance parcourue, mais améliore la
proportion d’essais réussis. Le parallèle peut être fait
avec l’action pro-cognitive de la
nicotine chez les humains. En effet, si son action pro-cognitive a clairement été démontrée
chez des patients atteints de schizophrénie, d’ADHD ou de la maladie d’Alzheimer, elle reste
controversée chez les patients sains (Newhouse et al., 2004).
196
C/ Effets localisés de l’inactivation de STOP
Les mécanismes moléculaires responsables des altérations neurochimiques
observées chez les animaux STOP KO demeurent inconnus à ce jour. Beaucoup de
processus dépendant des microtubules, comme la morphologie et la connectivité cellulaires,
le transport de protéines, des vésicules et des organelles, la fusion des vésicules
synaptiques avec la membrane pourraient être affectés chez ces souris. Contrairement aux
résultats attendus, aucune anomalie morphologique et structurelle du cerveau n’a été
décelée chez les mutants. Malgré une baisse des vésicules glutamatergiques dans le champ
CA1 de l’hippocampe, A. Andrieux et son équipe (2002) n’ont pas trouvé de différence dans
la quantité de protéines synaptiques chez les souris mutantes, suggérant un import normal
des protéines synaptiques vers la zone active de la synapse. Il n’est cependant pas à
exclure que l’import de protéines puisse être différentiellement régulé selon la protéine en
question, le phénotype neuronal et/ou la structure cérébrale.
La protéine STOP est une protéine très ubiquitaire, présente dans les neurones de
toutes les régions cérébrales, avec cependant une expression plus importante dans les
régions à forte plasticité synaptique, hippocampe, bulbes olfactifs et cervelet (Andrieux et al.,
2002). De façon surprenante, son inactivation donne lieu à des modifications biochimiques
spécifiques, qui affectent certaines régions et pas d’autres, qui altèrent différemment divers
systèmes de neurotransmission ou certains composants d’un même système de
neurotransmission et pas les autres. Ainsi, les systèmes glutamatergique et dopaminergique
semblent être touchés de manière opposée (Andrieux et al., 2002; Brun et al., 2005),
l’ensemble des résultats suggérant une diminution de la transmission glutamatergique et une
augmentation de libération de dopamine, indice d’une hyperdopaminergie. La mesure des
taux endogènes et de l’activité des enzymes de synthèse montre par ailleurs une régulation
différente des systèmes dopaminergique et sérotoninergique. Au sein d’un même système,
on observe également des altérations sélectives. Ainsi, la densité du transporteur vésiculaire
VAChT n’est modifiée que dans le champ CA1 de l’hippocampe, celle des récepteurs
nicotiniques β2* n’est pas modifiée, alors que celle des récepteurs α6 et α7 l’est. La densité
des récepteurs dopaminergiques D1 n’est pas modifiée, celle des récepteurs D2 et D3 l’est.
De plus, le système limbique dopaminergique semble être particulièrement touché : une
augmentation significative de l’efflux dopaminergique évoqué a été montrée dans le noyau
accumbens et une tendance non significative à une diminution dans le striatum (Brun et al.,
2005). Certains de nos résultats corroborent ces données : la densité des récepteurs D2
197
baisse plus fortement (bien que non significativement) dans le noyau accumbens que dans
le striatum, celle des récepteurs D3 n’est modifiée que dans l’ATV, les taux endogènes de
dopamine et l’activité de la tyrosine hydroxylase sont plus fortement diminués dans le noyau
accumbens que dans le striatum. Enfin, nos expériences de capture de dopamine sur
synaptosomes ont montré que la vitesse maximale de recapture de dopamine est
significativement plus faible dans le noyau accumbens des souris STOP KO et qu’elle est
plus élevée dans le striatum, bien que de manière non significative. Ces altérations
sélectives pourraient être dues à un environnement cellulaire différent ou encore à une
expression différentielle de la protéine STOP au cours du développement, qui pourrait
s’exprimer plus ou moins tôt selon les régions cérébrales et les systèmes de
neurotransmission.
Des études complémentaires s’avèrent nécessaires pour comprendre comment la
suppression d’une protéine du cytosquelette, exprimée de façon ubiquitaire, peut conduire à
des altérations spécifiques de certaines régions cérébrales ou voies de neurotransmission.
D/ Validité du modèle d’étude STOP KO pour la schizophrénie
1/ Modélisation animale des maladies psychiatriques
Les premiers modèles animaux de maladie reposaient sur la chirurgie et la
pharmacologie et permettaient d’étudier les conséquences de la perte d’un organe, d’une
structure cérébrale ou de fibres neuronales, ou encore l’effet d’une substance
pharmacologique sur l’animal. Depuis les années 1990, l’avancée des technologies et des
connaissances génomiques a permis l’introduction d’une mutation dans un gène, se
transmettant dans la lignée germinale et donnant naissance à des souris invalidées ou
« knock-out ». Cette technique révolutionnaire, modélisant des maladies et impliquant une
perte de fonction, est très utile pour étudier la fonction d’un gène in vivo mais présente des
limites. L’invalidation du gène d’intérêt est constitutive et totale, ce qui peut affecter le
développement de l’animal ou engendrer des adaptations qui n’existent pas dans la maladie
modélisée. L’évolution de la technique de mutation nulle permet de générer une invalidation
contrôlée dans le temps ou dans l’espace. Il est ainsi possible d’étudier l’effet d’une mutation
à un moment donné du développement ou dans une structure cérébrale précise. Cependant,
198
il faut garder à l’esprit que ces techniques génétiques, dont la réussite est incertaine,
nécessitent encore à l’heure actuelle un investissement lourd et coûteux.
L’utilisation des modèles animaux pour l’étude de maladies complexes telles que les
maladies psychiatriques, comme la schizophrénie, affectant la perception, la pensée et les
émotions, reste controversée. A priori, il peut paraître insensé de vouloir reproduire les
symptômes majeurs de la schizophrénie, hallucinations, délires et désorganisation de la
pensée -comportements tellement humains- chez l’animal, qu’il soit primate non humain ou
rongeur (Lipska and Weinberger, 2000). Cependant, certains comportements animaux
peuvent être reliés à des symptômes de type schizoïde. De plus, le fort degré d’homologie
entre les génomes humain et murin justifie l’utilisation de la souris dans la modélisation des
maladies humaines. Toutefois, vue la complexité des interactions génétiques et
environnementales suspectées dans l’étiologie de la schizophrénie, il est absolument
nécessaire d’étudier différents modèles animaux. Le but ultime de ces études n’est pas de
créer une souris « schizophrène », mais de se rapprocher au maximum des traits de la
maladie modélisables chez l’animal, en vue de concevoir et de tester l’effet de médicaments
potentiels.
2/ Pertinence du modèle STOP KO : un modèle pour la schizophrénie ?
Récemment, il a été proposé que des affections psychiatriques comme la
schizophrénie et l’autisme pouvaient résulter d’anomalies synaptiques impliquant des
protéines structurales (Harrison and Eastwood, 2001; Jamain et al., 2003). Le produit du
gène DISC1 (Disrupted In Schizophrenia 1), lié à la schizophrénie, est associé aux centres
organisateurs des microtubules et aux protéines associées aux microtubules (Morris et al.,
2003). Par ailleurs, l’inactivation de la protéine stathmine, inhibant la formation des
microtubules chez la souris, est à l’origine de certains troubles comportementaux
(Shumyatsky et al., 2005).
L’ensemble des travaux effectués à l’heure actuelle sur les souris STOP KO suggère
que ces souris partagent certaines caractéristiques avec les modèles animaux utilisés pour
l’étude de la schizophrénie et retrouvées dans cette maladie.
Rappelons premièrement que le gène STOP humain (Map6) est localisé au sein
d’une région chromosomique associée aux troubles schizoïdes (St Clair et al., 1990) et
qu’une association génétique a récemment été découverte entre des polymorphismes de ce
199
gène et une population de schizophrènes japonais (Shimizu et al., 2006). Cependant,
contrairement à une diminution attendue de l’expression de ce gène, une augmentation des
transcrits d’une des deux isoformes de Map6 a été observée dans le cortex préfrontal d’un
certain nombre de malades de cette même population (Shimizu et al., 2006). Il faut noter
néanmoins que la fonction de cette isoforme de MAP6 est encore inconnue. D’autres études
génétiques et post-mortem sur des populations différentes de patients seront nécessaires
pour valider ces premiers résultats. Chez les animaux STOP KO, la diminution d’expression
des transcrits de différentes protéines synaptiques (synaptophysine, VGLUT1, GAP43,
spinophiline) est similaire à celle observée dans l’hippocampe de patients schizophrènes
(Eastwood, sous presse). Parallèlement, dans cette même région, les souris mutantes
montrent des anomalies biochimiques affectant le système glutamatergique, associées à des
déficits de plasticité synaptique, pouvant découler de la baisse d’expression des ARNm des
protéines synaptiques. Les souris STOP KO semblent donc présenter une hypotransmission
glutamatergique dans l’hippocampe (Andrieux et al., 2002) ainsi qu’une hyper-réactivité
dopaminergique du système limbique (Brun et al., 2005), rejoignant l’hyperdopaminergie
associée à l’hypoglutamatergie soupçonnées chez les schizophrènes. Sur le plan
biochimique, la densité des récepteurs D2 (et D3) diminue dans certaines régions
cérébrales, indice probable d’une hyperdopaminergie constitutive dans ces régions. Ce
résultat est en désaccord avec l’absence de modification de densité des récepteurs D2
retrouvée dans le caudé-putamen de schizophrènes (Farde et al., 1990). Fait étonnant,
aucune différence significative n’a été retrouvée pour la densité et l’état de couplage du
récepteur D1, dans les régions mêmes où la densité des récepteurs D2 diminue. Une seule
étude a décrit une augmentation de ces récepteurs D1 dans le cortex préfrontal de
schizophrènes (Abi-Dargham et al., 2002). Nous ne trouvons pas non plus de variation
significative des récepteurs nicotiniques β2, en désaccord avec les variations régionsdépendantes observées chez les schizophrènes (Freedman et al., 1995; Durany et al., 2000;
Martin-Ruiz et al., 2003). De plus, les souris invalidées pour la protéine STOP présentent
une forte augmentation du nombre de récepteurs nicotiniques α7 dans l’hippocampe,
contrairement à la diminution de densité décrite chez les malades (Freedman et al., 1995).
Cependant, selon notre hypothèse, ces récepteurs seraient sous-stimulés du fait d’une
libération réduite d’acétylcholine chez les animaux KO. Remarquons qu’il n’est pas
nécessairement judicieux de comparer directement entre eux les différents composants des
neurotransmissions dopaminergique et nicotinique entre souris mutantes et schizophrènes,
mais plutôt de confronter les conséquences résultant de leurs altérations. L’ensemble des
résultats que nous avons obtenus chez les souris STOP KO serait donc en faveur d’une
200
hyperdopaminergie, tout au moins dans des régions limbiques, et d’une hypocholinergie, tout
au moins dans l’hippocampe, comme cela est décrit dans le système nerveux central des
schizophrènes.
Sur le plan comportemental, rappelons que les souris STOP KO présentent des
troubles du comportement maternel et un fort état d’anxiété, une activité désorganisée et des
déficits du PPI, rappelant la symptomatologie productive de la schizophrénie (Andrieux et al.,
2002). De même, elles sont hypersensibles au stress et à des psychostimulants, tels que
l’amphétamine (Brun et al., 2005), la cocaïne et la nicotine, mimant l’aggravation des
symptômes productifs des schizophrènes en réponse aux agonistes dopaminergiques
indirects
et
rappelant
la
co-morbidité
psychostimulants-schizophrénie.
Ces
souris
manifestent un retrait social, en accord avec la symptomatologie déficitaire des
schizophrènes. De façon importante, certains de ces troubles peuvent être restaurés après
administration aiguë ou chronique d’antipsychotiques, démontrant la bonne valeur prédictive
de ce modèle animal (Andrieux et al., 2002). Enfin, au niveau cognitif, nous avons montré
que les animaux mutants avaient une mémoire associative déficiente, qui pourrait être mise
en relation avec les déficits de mémoire de travail des schizophrènes. Des déficits de
plasticité synaptique, notamment de LTP, ont été mis en évidence dans l’hippocampe des
souris STOP KO. Nos travaux démontrent l’effet pro-cognitif de la choline, un agoniste des
nAChRs α7, sur les performances mnésiques des souris mutantes. Ces résultats rappellent
ceux de nombreuses études qui ont démontré l’effet pro-cognitif de la nicotine et du DMXBA, un agoniste partiel des récepteurs α7 chez les individus atteints de schizophrénie (Levin
and Rezvani, 2002; Martin et al., 2004; Olincy et al., 2006).
En résumé, l’ensemble de ces études montre que ce modèle de souris STOP KO
présente
des
similitudes
avec
des
comportements
observés
chez
les
patients
schizophrènes. Malgré les discordances relevées, ainsi qu’une étiologie et une
pathophysiologie probablement différentes, définissant les limites de ce modèle animal, il
m’apparaît important de continuer la caractérisation approfondie de ces souris. Ces animaux
peuvent en effet se révéler utiles pour la compréhension de la pathophysiologie de la
schizophrénie ainsi que l’étude des traitements antipsychotiques et pro-cognitifs.
201
REFERENCES
202
Références
Abeliovich A, Schmitz Y, Farinas I, Choi-Lundberg D, Ho WH, Castillo PE, Shinsky N, Verdugo JM, Armanini M,
Ryan A, Hynes M, Phillips H, Sulzer D, Rosenthal A (2000) Mice lacking alpha-synuclein display
functional deficits in the nigrostriatal dopamine system. Neuron 25:239-252.
Abi-Dargham A (2004) Do we still believe in the dopamine hypothesis? New data bring new evidence. Int J
Neuropsychopharmacol 7 Suppl 1:S1-5.
Abi-Dargham A, Gil R, Krystal J, Baldwin RM, Seibyl JP, Bowers M, van Dyck CH, Charney DS, Innis RB,
Laruelle M (1998) Increased striatal dopamine transmission in schizophrenia: confirmation in a second
cohort. Am J Psychiatry 155:761-767.
Abi-Dargham A, Rodenhiser J, Printz D, Zea-Ponce Y, Gil R, Kegeles LS, Weiss R, Cooper TB, Mann JJ, Van
Heertum RL, Gorman JM, Laruelle M (2000) Increased baseline occupancy of D2 receptors by
dopamine in schizophrenia. Proc Natl Acad Sci U S A 97:8104-8109.
Abi-Dargham A, Mawlawi O, Lombardo I, Gil R, Martinez D, Huang Y, Hwang DR, Keilp J, Kochan L, Van
Heertum R, Gorman JM, Laruelle M (2002) Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in
schizophrenia. J Neurosci 22:3708-3719.
Acri JB, Grunberg NE, Morse DE (1991) Effects of nicotine on the acoustic startle reflex amplitude in rats.
Psychopharmacology (Berl) 104:244-248.
Adler LE, Hoffer LD, Wiser A, Freedman R (1993) Normalization of auditory physiology by cigarette smoking in
schizophrenic patients. Am J Psychiatry 150:1856-1861.
Adler LE, Hoffer LJ, Griffith J, Waldo MC, Freedman R (1992) Normalization by nicotine of deficient auditory
sensory gating in the relatives of schizophrenics. Biol Psychiatry 32:607-616.
Adler LE, Pachtman E, Franks RD, Pecevich M, Waldo MC, Freedman R (1982) Neurophysiological evidence for
a defect in neuronal mechanisms involved in sensory gating in schizophrenia. Biol Psychiatry 17:639654.
Adler LE, Olincy A, Waldo M, Harris JG, Griffith J, Stevens K, Flach K, Nagamoto H, Bickford P, Leonard S,
Freedman R (1998) Schizophrenia, sensory gating, and nicotinic receptors. Schizophr Bull 24:189-202.
Albuquerque EX, Alkondon M, Pereira EF, Castro NG, Schrattenholz A, Barbosa CT, Bonfante-Cabarcas R,
Aracava Y, Eisenberg HM, Maelicke A (1997) Properties of neuronal nicotinic acetylcholine receptors:
pharmacological characterization and modulation of synaptic function. J Pharmacol Exp Ther 280:11171136.
Alkondon M, Pereira EF, Barbosa CT, Albuquerque EX (1997a) Neuronal nicotinic acetylcholine receptor
activation modulates gamma-aminobutyric acid release from CA1 neurons of rat hippocampal slices. J
Pharmacol Exp Ther 283:1396-1411.
Alkondon M, Pereira EF, Cortes WS, Maelicke A, Albuquerque EX (1997b) Choline is a selective agonist of
alpha7 nicotinic acetylcholine receptors in the rat brain neurons. Eur J Neurosci 9:2734-2742.
Amalric M, Koob GF (1993) Functionally selective neurochemical afferents and efferents of the mesocorticolimbic
and nigrostriatal dopamine system. Prog Brain Res 99:209-226.
Amara SG, Sonders MS (1998) Neurotransmitter transporters as molecular targets for addictive drugs. Drug
Alcohol Depend 51:87-96.
Anden NE, Dahlstroem A, Fuxe K, Larsson K (1965) Further Evidence for the Presence of Nigro-Neostriatal
Dopamine Neurons in the Rat. Am J Anat 116:329-333.
Andreasen NC, Rezai K, Alliger R, Swayze VW, 2nd, Flaum M, Kirchner P, Cohen G, O'Leary DS (1992)
Hypofrontality in neuroleptic-naive patients and in patients with chronic schizophrenia. Assessment with
xenon 133 single-photon emission computed tomography and the Tower of London. Arch Gen
Psychiatry 49:943-958.
Andrieux A, Salin PA, Vernet M, Kujala P, Baratier J, Gory-Faure S, Bosc C, Pointu H, Proietto D, Schweitzer A,
Denarier E, Klumperman J, Job D (2002) The suppression of brain cold-stable microtubules in mice
induces synaptic defects associated with neuroleptic-sensitive behavioral disorders. Genes Dev
16:2350-2364.
Arias HR (2000) Localization of agonist and competitive antagonist binding sites on nicotinic acetylcholine
receptors. Neurochem Int 36:595-645.
Arnt J, Skarsfeldt T (1998) Do novel antipsychotics have similar pharmacological characteristics? A review of the
evidence. Neuropsychopharmacology 18:63-101.
Arriza JL, Eliasof S, Kavanaugh MP, Amara SG (1997) Excitatory amino acid transporter 5, a retinal glutamate
transporter coupled to a chloride conductance. Proc Natl Acad Sci U S A 94:4155-4160.
Baas PW, Heidemann SR (1986) Microtubule reassembly from nucleating fragments during the regrowth of
amputated neurites. J Cell Biol 103:917-927.
Bakalyar HA, Reed RR (1990) Identification of a specialized adenylyl cyclase that may mediate odorant detection.
Science 250:1403-1406.
Baratier J, Peris L, Brocard J, Gory-Faure S, Dufour F, Bosc C, Fourest-Lieuvin A, Blanchoin L, Salin P, Job D,
Andrieux A (2006) Phosphorylation of microtubule-associated protein STOP by calmodulin kinase II. J
Biol Chem 281:19561-19569.
Bauman AL, Apparsundaram S, Ramamoorthy S, Wadzinski BE, Vaughan RA, Blakely RD (2000) Cocaine and
antidepressant-sensitive biogenic amine transporters exist in regulated complexes with protein
phosphatase 2A. J Neurosci 20:7571-7578.
203
Références
Biederman J, Faraone SV (2002) Current concepts on the neurobiology of Attention-Deficit/Hyperactivity
Disorder. J Atten Disord 6 Suppl 1:S7-16.
Bjerggaard C, Fog JU, Hastrup H, Madsen K, Loland CJ, Javitch JA, Gether U (2004) Surface targeting of the
dopamine transporter involves discrete epitopes in the distal C terminus but does not require canonical
PDZ domain interactions. J Neurosci 24:7024-7036.
Blakely RD, Berson HE, Fremeau RT, Jr., Caron MG, Peek MM, Prince HK, Bradley CC (1991) Cloning and
expression of a functional serotonin transporter from rat brain. Nature 354:66-70.
Blatch GL, Lassle M (1999) The tetratricopeptide repeat: a structural motif mediating protein-protein interactions.
Bioessays 21:932-939.
Bliss TV, Collingridge GL (1993) A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature
361:31-39.
Bodeau-Pean S, Laurent C, Campion D, Jay M, Thibaut F, Dollfus S, Petit M, Samolyk D, d'Amato T, Martinez M,
et al. (1995) No evidence for linkage or association between the dopamine transporter gene and
schizophrenia in a French population. Psychiatry Res 59:1-6.
Bosc C, Andrieux A, Job D (2003) STOP proteins. Biochemistry 42:12125-12132.
Bosc C, Cronk JD, Pirollet F, Watterson DM, Haiech J, Job D, Margolis RL (1996) Cloning, expression, and
properties of the microtubule-stabilizing protein STOP. Proc Natl Acad Sci U S A 93:2125-2130.
Bosse R, Fumagalli F, Jaber M, Giros B, Gainetdinov RR, Wetsel WC, Missale C, Caron MG (1997) Anterior
pituitary hypoplasia and dwarfism in mice lacking the dopamine transporter. Neuron 19:127-138.
Boulton SJ, Gartner A, Reboul J, Vaglio P, Dyson N, Hill DE, Vidal M (2002) Combined functional genomic maps
of the C. elegans DNA damage response. Science 295:127-131.
Bourgeois JP, Goldman-Rakic PS, Rakic P (1994) Synaptogenesis in the prefrontal cortex of rhesus monkeys.
Cereb Cortex 4:78-96.
Bouthenet ML, Souil E, Martres MP, Sokoloff P, Giros B, Schwartz JC (1991) Localization of dopamine D3
receptor mRNA in the rat brain using in situ hybridization histochemistry: comparison with dopamine D2
receptor mRNA. Brain Res 564:203-219.
Braff DL, Geyer MA, Light GA, Sprock J, Perry W, Cadenhead KS, Swerdlow NR (2001) Impact of prepulse
characteristics on the detection of sensorimotor gating deficits in schizophrenia. Schizophr Res 49:171178.
Breese CR, Marks MJ, Logel J, Adams CE, Sullivan B, Collins AC, Leonard S (1997) Effect of smoking history on
[3H]nicotine binding in human postmortem brain. J Pharmacol Exp Ther 282:7-13.
Breese CR, Lee MJ, Adams CE, Sullivan B, Logel J, Gillen KM, Marks MJ, Collins AC, Leonard S (2000)
Abnormal regulation of high affinity nicotinic receptors in subjects with schizophrenia.
Neuropsychopharmacology 23:351-364.
Brody AL, Mandelkern MA, London ED, Olmstead RE, Farahi J, Scheibal D, Jou J, Allen V, Tiongson E, Chefer
SI, Koren AO, Mukhin AG (2006) Cigarette smoking saturates brain alpha4beta2 nicotinic acetylcholine
receptors. Arch Gen Psychiatry 63:907-914.
Brun P, Begou M, Andrieux A, Mouly-Badina L, Clerget M, Schweitzer A, Scarna H, Renaud B, Job D, SuaudChagny MF (2005) Dopaminergic transmission in STOP null mice. J Neurochem 94:63-73.
Brzustowicz LM, Hodgkinson KA, Chow EW, Honer WG, Bassett AS (2000) Location of a major susceptibility
locus for familial schizophrenia on chromosome 1q21-q22. Science 288:678-682.
Buck KJ, Amara SG (1994) Chimeric dopamine-norepinephrine transporters delineate structural domains
influencing selectivity for catecholamines and 1-methyl-4-phenylpyridinium. Proc Natl Acad Sci U S A
91:12584-12588.
Buck KJ, Amara SG (1995) Structural domains of catecholamine transporter chimeras involved in selective
inhibition by antidepressants and psychomotor stimulants. Mol Pharmacol 48:1030-1037.
Budygin EA, John CE, Mateo Y, Jones SR (2002) Lack of cocaine effect on dopamine clearance in the core and
shell of the nucleus accumbens of dopamine transporter knock-out mice. J Neurosci 22:RC222.
Cabin DE, Shimazu K, Murphy D, Cole NB, Gottschalk W, McIlwain KL, Orrison B, Chen A, Ellis CE, Paylor R, Lu
B, Nussbaum RL (2002) Synaptic vesicle depletion correlates with attenuated synaptic responses to
prolonged repetitive stimulation in mice lacking alpha-synuclein. J Neurosci 22:8797-8807.
Cannon TD, Huttunen MO, Lonnqvist J, Tuulio-Henriksson A, Pirkola T, Glahn D, Finkelstein J, Hietanen M,
Kaprio J, Koskenvuo M (2000) The inheritance of neuropsychological dysfunction in twins discordant for
schizophrenia. Am J Hum Genet 67:369-382.
Carboni E, Spielewoy C, Vacca C, Nosten-Bertrand M, Giros B, Di Chiara G (2001) Cocaine and amphetamine
increase extracellular dopamine in the nucleus accumbens of mice lacking the dopamine transporter
gene. J Neurosci 21:RC141: 141-144.
Carlsson A (1988) The current status of the dopamine hypothesis of schizophrenia. Neuropsychopharmacology
1:179-186.
Carneiro AM, Ingram SL, Beaulieu JM, Sweeney A, Amara SG, Thomas SM, Caron MG, Torres GE (2002) The
multiple LIM domain-containing adaptor protein Hic-5 synaptically colocalizes and interacts with the
dopamine transporter. J Neurosci 22:7045-7054.
204
Références
Caron MG, Beaulieu M, Raymond V, Gagne B, Drouin J, Lefkowitz RJ, Labrie F (1978) Dopaminergic receptors in
the anterior pituitary gland. Correlation of [3H]dihydroergocryptine binding with the dopaminergic control
of prolactin release. J Biol Chem 253:2244-2253.
Carrera MR, Ashley JA, Wirsching P, Koob GF, Janda KD (2001) A second-generation vaccine protects against
the psychoactive effects of cocaine. Proc Natl Acad Sci U S A 98:1988-1992.
Carvelli L, McDonald PW, Blakely RD, Defelice LJ (2004) Dopamine transporters depolarize neurons by a
channel mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A 101:16046-16051.
Carvelli L, Moron JA, Kahlig KM, Ferrer JV, Sen N, Lechleiter JD, Leeb-Lundberg LM, Merrill G, Lafer EM, Ballou
LM, Shippenberg TS, Javitch JA, Lin RZ, Galli A (2002) PI 3-kinase regulation of dopamine uptake. J
Neurochem 81:859-869.
Champtiaux N, Han ZY, Bessis A, Rossi FM, Zoli M, Marubio L, McIntosh JM, Changeux JP (2002) Distribution
and pharmacology of alpha 6-containing nicotinic acetylcholine receptors analyzed with mutant mice. J
Neurosci 22:1208-1217.
Chandra S, Fornai F, Kwon HB, Yazdani U, Atasoy D, Liu X, Hammer RE, Battaglia G, German DC, Castillo PE,
Sudhof TC (2004) Double-knockout mice for alpha- and beta-synucleins: effect on synaptic functions.
Proc Natl Acad Sci U S A 101:14966-14971.
Chang MY, Lee SH, Kim JH, Lee KH, Kim YS, Son H, Lee YS (2001) Protein kinase C-mediated functional
regulation of dopamine transporter is not achieved by direct phosphorylation of the dopamine transporter
protein. J Neurochem 77:754-761.
Chen N, Reith ME (2000) Structure and function of the dopamine transporter. Eur J Pharmacol 405:329-339.
Chen R, Han DD, Gu HH (2005a) A triple mutation in the second transmembrane domain of mouse dopamine
transporter markedly decreases sensitivity to cocaine and methylphenidate. J Neurochem 94:352-359.
Chen Y, Beffert U, Ertunc M, Tang TS, Kavalali ET, Bezprozvanny I, Herz J (2005b) Reelin modulates NMDA
receptor activity in cortical neurons. J Neurosci 25:8209-8216.
Cheon KA, Ryu YH, Kim YK, Namkoong K, Kim CH, Lee JD (2003) Dopamine transporter density in the basal
ganglia assessed with [123I]IPT SPET in children with attention deficit hyperactivity disorder. Eur J Nucl
Med Mol Imaging 30:306-311.
Cho S, Park SG, Lee do H, Park BC (2004) Protein-protein interaction networks: from interactions to networks. J
Biochem Mol Biol 37:45-52.
Ciliax BJ, Heilman C, Demchyshyn LL, Pristupa ZB, Ince E, Hersch SM, Niznik HB, Levey AI (1995) The
dopamine transporter: immunochemical characterization and localization in brain. J Neurosci 15:17141723.
Ciliax BJ, Drash GW, Staley JK, Haber S, Mobley CJ, Miller GW, Mufson EJ, Mash DC, Levey AI (1999)
Immunocytochemical localization of the dopamine transporter in human brain. J Comp Neurol 409:38-56.
Clarke PB, Fu DS, Jakubovic A, Fibiger HC (1988) Evidence that mesolimbic dopaminergic activation underlies
the locomotor stimulant action of nicotine in rats. J Pharmacol Exp Ther 246:701-708.
Clarke PB, Schwartz RD, Paul SM, Pert CB, Pert A (1985) Nicotinic binding in rat brain: autoradiographic
comparison of [3H]acetylcholine, [3H]nicotine, and [125I]-alpha-bungarotoxin. J Neurosci 5:1307-1315.
Cook EH, Jr., Stein MA, Krasowski MD, Cox NJ, Olkon DM, Kieffer JE, Leventhal BL (1995) Association of
attention-deficit disorder and the dopamine transporter gene. Am J Hum Genet 56:993-998.
Cotter D, Kerwin R, Doshi B, Martin CS, Everall IP (1997) Alterations in hippocampal non-phosphorylated MAP2
protein expression in schizophrenia. Brain Res 765:238-246.
Coyle JT (1996) The glutamatergic dysfunction hypothesis for schizophrenia. Harv Rev Psychiatry 3:241-253.
Curzon P, Kim DJ, Decker MW (1994) Effect of nicotine, lobeline, and mecamylamine on sensory gating in the
rat. Pharmacol Biochem Behav 49:877-882.
Dalack GW, Healy DJ, Meador-Woodruff JH (1998) Nicotine dependence in schizophrenia: clinical phenomena
and laboratory findings. Am J Psychiatry 155:1490-1501.
Damaj MI (2001) Influence of gender and sex hormones on nicotine acute pharmacological effects in mice. J
Pharmacol Exp Ther 296:132-140.
Dani JA (2001) Overview of nicotinic receptors and their roles in the central nervous system. Biol Psychiatry
49:166-174.
Daniels GM, Amara SG (1999) Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated
internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters. J Biol Chem 274:35794-35801.
Dauer W, Kholodilov N, Vila M, Trillat AC, Goodchild R, Larsen KE, Staal R, Tieu K, Schmitz Y, Yuan CA, Rocha
M, Jackson-Lewis V, Hersch S, Sulzer D, Przedborski S, Burke R, Hen R (2002) Resistance of alpha synuclein null mice to the parkinsonian neurotoxin MPTP. Proc Natl Acad Sci U S A 99:14524-14529.
Davidson WS, Jonas A, Clayton DF, George JM (1998) Stabilization of alpha-synuclein secondary structure upon
binding to synthetic membranes. J Biol Chem 273:9443-9449.
Davis KL, Kahn RS, Ko G, Davidson M (1991) Dopamine in schizophrenia: a review and reconceptualization. Am
J Psychiatry 148:1474-1486.
Davis KL, Stewart DG, Friedman JI, Buchsbaum M, Harvey PD, Hof PR, Buxbaum J, Haroutunian V (2003) White
matter changes in schizophrenia: evidence for myelin-related dysfunction. Arch Gen Psychiatry 60:443456.
205
Références
Daws LC, Callaghan PD, Moron JA, Kahlig KM, Shippenberg TS, Javitch JA, Galli A (2002) Cocaine increases
dopamine uptake and cell surface expression of dopamine transporters. Biochem Biophys Res Commun
290:1545-1550.
de Leon J, Tracy J, McCann E, McGrory A, Diaz FJ (2002) Schizophrenia and tobacco smoking: a replication
study in another US psychiatric hospital. Schizophr Res 56:55-65.
de Leon J, Dadvand M, Canuso C, White AO, Stanilla JK, Simpson GM (1995) Schizophrenia and smoking: an
epidemiological survey in a state hospital. Am J Psychiatry 152:453-455.
Denarier E, Fourest-Lieuvin A, Bosc C, Pirollet F, Chapel A, Margolis RL, Job D (1998a) Nonneuronal isoforms of
STOP protein are responsible for microtubule cold stability in mammalian fibroblasts. Proc Natl Acad Sci
U S A 95:6055-6060.
Denarier E, Aguezzoul M, Jolly C, Vourc'h C, Roure A, Andrieux A, Bosc C, Job D (1998b) Genomic structure and
chromosomal mapping of the mouse STOP gene (Mtap6). Biochem Biophys Res Commun 243:791-796.
Depatie L, O'Driscoll GA, Holahan AL, Atkinson V, Thavundayil JX, Kin NN, Lal S (2002) Nicotine and behavioral
markers of risk for schizophrenia: a double-blind, placebo-controlled, cross-over study.
Di Chiara G, Imperato A (1988) Drugs abused by humans preferentially increase synaptic dopamine
concentrations in the mesolimbic system of freely moving rats. Proc Natl Acad Sci U S A 85:5274-5278.
Diaz J, Levesque D, Lammers CH, Griffon N, Martres MP, Schwartz JC, Sokoloff P (1995) Phenotypical
characterization of neurons expressing the dopamine D3 receptor in the rat brain. Neuroscience 65:731745.
Dickerson TJ, Janda KD (2005) Recent advances for the treatment of cocaine abuse: central nervous system
immunopharmacotherapy. Aaps J 7:E579-586.
Dickinson SD, Sabeti J, Larson GA, Giardina K, Rubinstein M, Kelly MA, Grandy DK, Low MJ, Gerhardt GA,
Zahniser NR (1999) Dopamine D2 receptor-deficient mice exhibit decreased dopamine transporter
function but no changes in dopamine release in dorsal striatum. J Neurochem 72:148-156.
Donovan DM, Vandenbergh DJ, Perry MP, Bird GS, Ingersoll R, Nanthakumar E, Uhl GR (1995) Human and
mouse dopamine transporter genes: conservation of 5'-flanking sequence elements and gene structures.
Brain Res Mol Brain Res 30:327-335.
Dougherty DD, Bonab AA, Spencer TJ, Rauch SL, Madras BK, Fischman AJ (1999) Dopamine transporter
density in patients with attention deficit hyperactivity disorder. Lancet 354:2132-2133.
Dragovic M, Hammond G (2005) Handedness in schizophrenia: a quantitative review of evidence. Acta Psychiatr
Scand 111:410-419.
Dresel S, Krause J, Krause KH, LaFougere C, Brinkbaumer K, Kung HF, Hahn K, Tatsch K (2000) Attention
deficit hyperactivity disorder: binding of [99mTc]TRODAT-1 to the dopamine transporter before and after
methylphenidate treatment. Eur J Nucl Med 27:1518-1524.
Durany N, Zochling R, Boissl KW, Paulus W, Ransmayr G, Tatschner T, Danielczyk W, Jellinger K, Deckert J,
Riederer P (2000) Human post-mortem striatal alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptor density in
schizophrenia and Parkinson's syndrome. Neurosci Lett 287:109-112.
Durston S (2003) A review of the biological bases of ADHD: what have we learned from imaging studies? Ment
Retard Dev Disabil Res Rev 9:184-195.
Dutta AK, Zhang S, Kolhatkar R, Reith ME (2003) Dopamine transporter as target for drug development of
cocaine dependence medications. Eur J Pharmacol 479:93-106.
Eastwood, S.L., Lyon, L., George, L., Andrieux, A., Job, D., Harrison, P.J., 2006. Altered expression of synaptic
protein mRNAs in STOP (MAP-6) mutant mice. Journal of Psychopharmacology, in press.
Eglen RM, Choppin A, Watson N (2001) Therapeutic opportunities from muscarinic receptor research. Trends
Pharmacol Sci 22:409-414.
Emson PC, Koob GF (1978) The origin and distribution of dopamine-containing afferents to the rat frontal cortex.
Brain Res 142:249-267.
Ettinger U, Kumari V, Crawford TJ, Davis RE, Sharma T, Corr PJ (2003) Reliability of smooth pursuit, fixation, and
saccadic eye movements. Psychophysiology 40:620-628.
Fairman WA, Vandenberg RJ, Arriza JL, Kavanaugh MP, Amara SG (1995) An excitatory amino-acid transporter
with properties of a ligand-gated chloride channel. Nature 375:599-603.
Falkenburger BH, Barstow KL, Mintz IM (2001) Dendrodendritic inhibition through reversal of dopamine transport.
Science 293:2465-2470.
Faraday MM, O'Donoghue VA, Grunberg NE (1999) Effects of nicotine and stress on startle amplitude and
sensory gating depend on rat strain and sex. Pharmacol Biochem Behav 62:273-284.
Faraone SV, Perlis RH, Doyle AE, Smoller JW, Goralnick JJ, Holmgren MA, Sklar P (2005) Molecular genetics of
attention-deficit/hyperactivity disorder. Biol Psychiatry 57:1313-1323.
Farde L, Wiesel FA, Stone-Elander S, Halldin C, Nordstrom AL, Hall H, Sedvall G (1990) D2 dopamine receptors
in neuroleptic-naive schizophrenic patients. A positron emission tomography study with [11C]raclopride.
Arch Gen Psychiatry 47:213-219.
Fauchey V, Jaber M, Caron MG, Bloch B, Le Moine C (2000) Differential regulation of the dopamine D1, D2 and
D3 receptor gene expression and changes in the phenotype of the striatal neurons in mice lacking the
dopamine transporter. Eur J Neurosci 12:19-26.
206
Références
Fields S, Song O (1989) A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature 340:245-246.
Fleckenstein AE, Metzger RR, Wilkins DG, Gibb JW, Hanson GR (1997) Rapid and reversible effects of
methamphetamine on dopamine transporters. J Pharmacol Exp Ther 282:834-838.
Flores CM, Rogers SW, Pabreza LA, Wolfe BB, Kellar KJ (1992) A subtype of nicotinic cholinergic receptor in rat
brain is composed of alpha 4 and beta 2 subunits and is up-regulated by chronic nicotine treatment. Mol
Pharmacol 41:31-37.
Foster JD, Pananusorn B, Vaughan RA (2002) Dopamine transporters are phosphorylated on N-terminal serines
in rat striatum. J Biol Chem 277:25178-25186.
Fradley RL, O'Meara GF, Newman RJ, Andrieux A, Job D, Reynolds DS (2005) STOP knockout and NMDA NR1
hypomorphic mice exhibit deficits in sensorimotor gating. Behav Brain Res 163:257-264.
Frankle WG, Lerma J, Laruelle M (2003) The synaptic hypothesis of schizophrenia. Neuron 39:205-216.
Freedman R, Hall M, Adler LE, Leonard S (1995) Evidence in postmortem brain tissue for decreased numbers of
hippocampal nicotinic receptors in schizophrenia. Biol Psychiatry 38:22-33.
Freedman R, Wetmore C, Stromberg I, Leonard S, Olson L (1993) Alpha-bungarotoxin binding to hippocampal
interneurons: immunocytochemical characterization and effects on growth factor expression. J Neurosci
13:1965-1975.
Freedman R, Leonard S, Gault JM, Hopkins J, Cloninger CR, Kaufmann CA, Tsuang MT, Farone SV, Malaspina
D, Svrakic DM, Sanders A, Gejman P (2001) Linkage disequilibrium for schizophrenia at the
chromosome 15q13-14 locus of the alpha7-nicotinic acetylcholine receptor subunit gene (CHRNA7). Am
J Med Genet 105:20-22.
Freedman R, Coon H, Myles-Worsley M, Orr-Urtreger A, Olincy A, Davis A, Polymeropoulos M, Holik J, Hopkins
J, Hoff M, Rosenthal J, Waldo MC, Reimherr F, Wender P, Yaw J, Young DA, Breese CR, Adams C,
Patterson D, Adler LE, Kruglyak L, Leonard S, Byerley W (1997) Linkage of a neurophysiological deficit
in schizophrenia to a chromosome 15 locus. Proc Natl Acad Sci U S A 94:587-592.
Fucile S (2004) Ca2+ permeability of nicotinic acetylcholine receptors. Cell Calcium 35:1-8.
Gainetdinov RR, Jones SR, Caron MG (1999a) Functional hyperdopaminergia in dopamine transporter knock-out
mice. Biol Psychiatry 46:303-311.
Gainetdinov RR, Mohn AR, Caron MG (2001a) Genetic animal models: focus on schizophrenia. Trends Neurosci
24:527-533.
Gainetdinov RR, Mohn AR, Bohn LM, Caron MG (2001b) Glutamatergic modulation of hyperactivity in mice
lacking the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A 98:11047-11054.
Gainetdinov RR, Wetsel WC, Jones SR, Levin ED, Jaber M, Caron MG (1999b) Role of serotonin in the
paradoxical calming effect of psychostimulants on hyperactivity. Science 283:397-401.
Galiano MR, Bosc C, Schweitzer A, Andrieux A, Job D, Hallak ME (2004) Astrocytes and oligodendrocytes
express different STOP protein isoforms. J Neurosci Res 78:329-337.
Galli A, DeFelice LJ, Duke BJ, Moore KR, Blakely RD (1995) Sodium-dependent norepinephrine-induced currents
in norepinephrine-transporter-transfected HEK-293 cells blocked by cocaine and antidepressants. J Exp
Biol 198:2197-2212.
Gamma F, Faraone SV, Glatt SJ, Yeh YC, Tsuang MT (2005) Meta-analysis shows schizophrenia is not
associated with the 40-base-pair repeat polymorphism of the dopamine transporter gene. Schizophr Res
73:55-58.
Geerlings A, Nunez E, Lopez-Corcuera B, Aragon C (2001) Calcium- and syntaxin 1-mediated trafficking of the
neuronal glycine transporter GLYT2. J Biol Chem 276:17584-17590.
George JM (2002) The synucleins. Genome Biol 3:REVIEWS3002.
George TP, Vessicchio JC, Termine A, Sahady DM, Head CA, Pepper WT, Kosten TR, Wexler BE (2002) Effects
of smoking abstinence on visuospatial working memory function in schizophrenia.
Gerber DJ, Hall D, Miyakawa T, Demars S, Gogos JA, Karayiorgou M, Tonegawa S (2003) Evidence for
association of schizophrenia with genetic variation in the 8p21.3 gene, PPP3CC, encoding the
calcineurin gamma subunit. Proc Natl Acad Sci U S A 100:8993-8998.
Gerlai R, Pisacane P, Erickson S (2000) Heregulin, but not ErbB2 or ErbB3, heterozygous mutant mice exhibit
hyperactivity in multiple behavioral tasks. Behav Brain Res 109:219-227.
Giros B, Caron MG (1993) Molecular characterization of the dopamine transporter. Trends Pharmacol Sci 14:4349.
Giros B, el Mestikawy S, Bertrand L, Caron MG (1991) Cloning and functional characterization of a cocainesensitive dopamine transporter. FEBS Lett 295:149-154.
Giros B, Jaber M, Jones SR, Wightman RM, Caron MG (1996) Hyperlocomotion and indifference to cocaine and
amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature 379:606-612.
Giros B, Sokoloff P, Martres MP, Riou JF, Emorine LJ, Schwartz JC (1989) Alternative splicing directs the
expression of two D2 dopamine receptor isoforms. Nature 342:923-926.
Giros B, Wang YM, Suter S, McLeskey SB, Pifl C, Caron MG (1994) Delineation of discrete domains for
substrate, cocaine, and tricyclic antidepressant interactions using chimeric dopamine-norepinephrine
transporters. J Biol Chem 269:15985-15988.
207
Références
Giros B, el Mestikawy S, Godinot N, Zheng K, Han H, Yang-Feng T, Caron MG (1992) Cloning, pharmacological
characterization, and chromosome assignment of the human dopamine transporter. Mol Pharmacol
42:383-390.
Glantz LA, Lewis DA (2000) Decreased dendritic spine density on prefrontal cortical pyramidal neurons in
schizophrenia. Arch Gen Psychiatry 57:65-73.
Glassman AH (1993) Cigarette smoking: implications for psychiatric illness. Am J Psychiatry 150:546-553.
Gnegy ME (2003) The effect of phosphorylation on amphetamine-mediated outward transport. Eur J Pharmacol
479:83-91.
Gnegy ME, Khoshbouei H, Berg KA, Javitch JA, Clarke WP, Zhang M, Galli A (2004) Intracellular Ca2+ regulates
amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol
Pharmacol 66:137-143.
Goldstein JM, Goodman JM, Seidman LJ, Kennedy DN, Makris N, Lee H, Tourville J, Caviness VS, Jr., Faraone
SV, Tsuang MT (1999) Cortical abnormalities in schizophrenia identified by structural magnetic
resonance imaging. Arch Gen Psychiatry 56:537-547.
Gottesman, II (1994) Complications to the complex inheritance of schizophrenia. Clin Genet 46:116-123.
Gourevitch R, Rocher C, Le Pen G, Krebs MO, Jay TM (2004) Working memory deficits in adult rats after prenatal
disruption of neurogenesis. Behav Pharmacol 15:287-292.
Granas C, Ferrer J, Loland CJ, Javitch JA, Gether U (2003) N-terminal truncation of the dopamine transporter
abolishes phorbol ester- and substance P receptor-stimulated phosphorylation without impairing
transporter internalization. J Biol Chem 278:4990-5000.
Green AI (2005) Schizophrenia and comorbid substance use disorder: effects of antipsychotics. J Clin Psychiatry
66 Suppl 6:21-26.
Gu H, Wall SC, Rudnick G (1994) Stable expression of biogenic amine transporters reveals differences in inhibitor
sensitivity, kinetics, and ion dependence. J Biol Chem 269:7124-7130.
Guan ZZ, Zhang X, Blennow K, Nordberg A (1999) Decreased protein level of nicotinic receptor alpha7 subunit in
the frontal cortex from schizophrenic brain. Neuroreport 10:1779-1782.
Guastella J, Brecha N, Weigmann C, Lester HA, Davidson N (1992) Cloning, expression, and localization of a rat
brain high-affinity glycine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A 89:7189-7193.
Guastella J, Nelson N, Nelson H, Czyzyk L, Keynan S, Miedel MC, Davidson N, Lester HA, Kanner BI (1990)
Cloning and expression of a rat brain GABA transporter. Science 249:1303-1306.
Guidotti A, Auta J, Davis JM, Di-Giorgi-Gerevini V, Dwivedi Y, Grayson DR, Impagnatiello F, Pandey G, Pesold C,
Sharma R, Uzunov D, Costa E (2000) Decrease in reelin and glutamic acid decarboxylase67 (GAD67)
expression in schizophrenia and bipolar disorder: a postmortem brain study. Arch Gen Psychiatry
57:1061-1069.
Guillaud L, Bosc C, Fourest-Lieuvin A, Denarier E, Pirollet F, Lafanechere L, Job D (1998) STOP proteins are
responsible for the high degree of microtubule stabilization observed in neuronal cells. J Cell Biol
142:167-179.
Gulley JM, Zahniser NR (2003) Rapid regulation of dopamine transporter function by substrates, blockers and
presynaptic receptor ligands. Eur J Pharmacol 479:139-152.
Gulley JM, Doolen S, Zahniser NR (2002) Brief, repeated exposure to substrates down-regulates dopamine
transporter function in Xenopus oocytes in vitro and rat dorsal striatum in vivo. J Neurochem 83:400-411.
Hall FS, Li XF, Sora I, Xu F, Caron M, Lesch KP, Murphy DL, Uhl GR (2002) Cocaine mechanisms: enhanced
cocaine, fluoxetine and nisoxetine place preferences following monoamine transporter deletions.
Neuroscience 115:153-161.
Harrison PJ (1999) The neuropathology of schizophrenia. A critical review of the data and their interpretation.
Brain 122 ( Pt 4):593-624.
Harrison PJ, Eastwood SL (2001) Neuropathological studies of synaptic connectivity in the hippocampal formation
in schizophrenia. Hippocampus 11:508-519.
Harrison PJ, Weinberger DR (2005) Schizophrenia genes, gene expression, and neuropathology: on the matter of
their convergence. Mol Psychiatry 10:40-68; image 45.
Hastrup H, Karlin A, Javitch JA (2001) Symmetrical dimer of the human dopamine transporter revealed by crosslinking Cys-306 at the extracellular end of the sixth transmembrane segment. Proc Natl Acad Sci U S A
98:10055-10060.
Hastrup H, Sen N, Javitch JA (2003) The human dopamine transporter forms a tetramer in the plasma
membrane: cross-linking of a cysteine in the fourth transmembrane segment is sensitive to cocaine
analogs. J Biol Chem 278:45045-45048.
Hefco V, Yamada K, Hefco A, Hritcu L, Tiron A, Olariu A, Nabeshima T (2003) Effects of nicotine on memory
impairment induced by blockade of muscarinic, nicotinic and dopamine D2 receptors in rats. Eur J
Hill JA, Jr., Zoli M, Bourgeois JP, Changeux JP (1993) Immunocytochemical localization of a neuronal nicotinic
receptor: the beta 2-subunit. J Neurosci 13:1551-1568.
Hoffman BJ, Palkovits M, Pacak K, Hansson SR, Mezey E (1998) Regulation of dopamine transporter mRNA
levels in the central nervous system. Adv Pharmacol 42:202-206.
208
Références
Holton KL, Loder MK, Melikian HE (2005) Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKCregulated neurotransmitter transporter internalization. Nat Neurosci 8:881-888.
Horn AS (1990) Dopamine uptake: a review of progress in the last decade. Prog Neurobiol 34:387-400.
Hornykiewicz O (1966) Dopamine (3-hydroxytyramine) and brain function. Pharmacol Rev 18:925-964.
Horton N, Quick MW (2001) Syntaxin 1A up-regulates GABA transporter expression by subcellular redistribution.
Mol Membr Biol 18:39-44.
Hsiao MC, Lin KJ, Liu CY, Tzen KY, Yen TC (2003) Dopamine transporter change in drug-naive schizophrenia:
an imaging study with 99mTc-TRODAT-1. Schizophr Res 65:39-46.
Huff RA, Vaughan RA, Kuhar MJ, Uhl GR (1997) Phorbol esters increase dopamine transporter phosphorylation
and decrease transport Vmax. J Neurochem 68:225-232.
Hyman SE (1996) Addiction to cocaine and amphetamine. Neuron 16:901-904.
Imperato A, Obinu MC, Casu MA, Mascia MS, Dazzi L, Gessa GL (1993) Evidence that neuroleptics increase
striatal acetylcholine release through stimulation of dopamine D1 receptors. J Pharmacol Exp Ther
266:557-562.
Ingram SL, Prasad BM, Amara SG (2002) Dopamine transporter-mediated conductances increase excitability of
midbrain dopamine neurons. Nat Neurosci 5:971-978.
Ito T, Chiba T, Ozawa R, Yoshida M, Hattori M, Sakaki Y (2001) A comprehensive two-hybrid analysis to explore
the yeast protein interactome. Proc Natl Acad Sci U S A 98:4569-4574.
Jaber M, Robinson SW, Missale C, Caron MG (1996) Dopamine receptors and brain function.
Neuropharmacology 35:1503-1519.
Jamain S, Quach H, Betancur C, Rastam M, Colineaux C, Gillberg IC, Soderstrom H, Giros B, Leboyer M,
Gillberg C, Bourgeron T (2003) Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and
NLGN4 are associated with autism. Nat Genet 34:27-29.
Javitt DC, Hashim A, Sershen H (2005) Modulation of striatal dopamine release by glycine transport inhibitors.
Jayanthi LD, Apparsundaram S, Malone MD, Ward E, Miller DM, Eppler M, Blakely RD (1998) The
Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine
transporter. Mol Pharmacol 54:601-609.
Jentsch JD, Roth RH (1999) The neuropsychopharmacology of phencyclidine: from NMDA receptor hypofunction
to the dopamine hypothesis of schizophrenia. Neuropsychopharmacology 20:201-225.
Job D, Fischer EH, Margolis RL (1981) Rapid disassembly of cold-stable microtubules by calmodulin. Proc Natl
Acad Sci U S A 78:4679-4682.
Job D, Rauch CT, Fischer EH, Margolis RL (1982) Recycling of cold-stable microtubules: evidence that cold
stability is due to substoichiometric polymer blocks. Biochemistry 21:509-515.
Johanson CE, Fischman MW (1989) The pharmacology of cocaine related to its abuse. Pharmacol Rev 41:3-52.
Johnson LA, Guptaroy B, Lund D, Shamban S, Gnegy ME (2005) Regulation of amphetamine-stimulated
dopamine efflux by protein kinase C beta. J Biol Chem 280:10914-10919.
Jones SR, Gainetdinov RR, Jaber M, Giros B, Wightman RM, Caron MG (1998) Profound neuronal plasticity in
response to inactivation of the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A 95:4029-4034.
Jones SR, Gainetdinov RR, Hu XT, Cooper DC, Wightman RM, White FJ, Caron MG (1999) Loss of autoreceptor
functions in mice lacking the dopamine transporter. Nat Neurosci 2:649-655.
Jongen-Relo AL, Leng A, Luber M, Pothuizen HH, Weber L, Feldon J (2004) The prenatal methylazoxymethanol
acetate treatment: a neurodevelopmental animal model for schizophrenia? Behav Brain Res 149:159181.
Jucaite A, Fernell E, Halldin C, Forssberg H, Farde L (2005) Reduced midbrain dopamine transporter binding in
male adolescents with attention-deficit/hyperactivity disorder: association between striatal dopamine
markers and motor hyperactivity. Biol Psychiatry 57:229-238.
Kahle PJ, Neumann M, Ozmen L, Muller V, Jacobsen H, Schindzielorz A, Okochi M, Leimer U, van Der Putten H,
Probst A, Kremmer E, Kretzschmar HA, Haass C (2000) Subcellular localization of wild-type and
Parkinson's disease-associated mutant alpha -synuclein in human and transgenic mouse brain. J
Neurosci 20:6365-6373.
Kahlig KM, Javitch JA, Galli A (2004) Amphetamine regulation of dopamine transport. Combined measurements
of transporter currents and transporter imaging support the endocytosis of an active carrier. J Biol Chem
279:8966-8975.
Kahlig KM, Lute BJ, Wei Y, Loland CJ, Gether U, Javitch JA, Galli A (2006) Regulation of Dopamine Transporter
Trafficking by Intracellular Amphetamine. Mol Pharmacol.
Kaiser S, Wonnacott S (2000) alpha-bungarotoxin-sensitive nicotinic receptors indirectly modulate
[(3)H]dopamine release in rat striatal slices via glutamate release. Mol Pharmacol 58:312-318.
Kanai Y, Hediger MA (1992) Primary structure and functional characterization of a high-affinity glutamate
transporter. Nature 360:467-471.
Kane JM (1996) Treatment-resistant schizophrenic patients. J Clin Psychiatry 57 Suppl 9:35-40.
Kantak KM, Collins SL, Lipman EG, Bond J, Giovanoni K, Fox BS (2000) Evaluation of anti-cocaine antibodies
and a cocaine vaccine in a rat self-administration model. Psychopharmacology (Berl) 148:251-262.
209
Références
Karayiorgou M, Gogos JA (2004) The molecular genetics of the 22q11-associated schizophrenia. Brain Res Mol
Brain Res 132:95-104.
Karlin A, Akabas MH (1995) Toward a structural basis for the function of nicotinic acetylcholine receptors and
their cousins. Neuron 15:1231-1244.
Karson CN, Mrak RE, Schluterman KO, Sturner WQ, Sheng JG, Griffin WS (1999) Alterations in synaptic proteins
and their encoding mRNAs in prefrontal cortex in schizophrenia: a possible neurochemical basis for
'hypofrontality'. Mol Psychiatry 4:39-45.
Kebabian JW, Calne DB (1979) Multiple receptors for dopamine. Nature 277:93-96.
Khoshbouei H, Wang H, Lechleiter JD, Javitch JA, Galli A (2003) Amphetamine-induced dopamine efflux. A
voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J Biol Chem 278:12070-12077.
Kilic F, Rudnick G (2000) Oligomerization of serotonin transporter and its functional consequences. Proc Natl
Acad Sci U S A 97:3106-3111.
Kilty JE, Lorang D, Amara SG (1991) Cloning and expression of a cocaine-sensitive rat dopamine transporter.
Science 254:578-579.
Kim E, Sheng M (2004) PDZ domain proteins of synapses. Nat Rev Neurosci 5:771-781.
Kingsbury AE, Daniel SE, Sangha H, Eisen S, Lees AJ, Foster OJ (2004) Alteration in alpha-synuclein mRNA
expression in Parkinson's disease. Mov Disord 19:162-170.
Kitayama S, Wang JB, Uhl GR (1993) Dopamine transporter mutants selectively enhance MPP+ transport.
Synapse 15:58-62.
Konradi C (2005) Gene expression microarray studies in polygenic psychiatric disorders: applications and data
analysis. Brain Res Brain Res Rev 50:142-155.
Koob GF (1996) Drug addiction: the yin and yang of hedonic homeostasis. Neuron 16:893-896.
Krause KH, Dresel SH, Krause J, la Fougere C, Ackenheil M (2003) The dopamine transporter and neuroimaging
in attention deficit hyperactivity disorder. Neurosci Biobehav Rev 27:605-613.
Krystal JH, D'Souza DC, Petrakis IL, Belger A, Berman RM, Charney DS, Abi-Saab W, Madonick S (1999) NMDA
agonists and antagonists as probes of glutamatergic dysfunction and pharmacotherapies in
neuropsychiatric disorders. Harv Rev Psychiatry 7:125-143.
Ksir C, Hakan RL, Kellar KJ (1987) Chronic nicotine and locomotor activity: influences of exposure dose and test
dose. Psychopharmacology (Berl) 92:25-29.
Kuhar MJ, McGirr KM, Hunter RG, Lambert PD, Garrett BE, Carroll FI (1999) Studies of selected phenyltropanes
at monoamine transporters. Drug Alcohol Depend 56:9-15.
Kumari V, Postma P (2005) Nicotine use in schizophrenia: the self medication hypotheses. Neurosci Biobehav
Rev 29:1021-1034.
Kumari V, Soni W, Sharma T (2001) Influence of cigarette smoking on prepulse inhibition of the acoustic startle
response in schizophrenia. Hum Psychopharmacol 16:321-326.
Lane-Ladd SB, Pineda J, Boundy VA, Pfeuffer T, Krupinski J, Aghajanian GK, Nestler EJ (1997) CREB (cAMP
response element-binding protein) in the locus coeruleus: biochemical, physiological, and behavioral
evidence for a role in opiate dependence. J Neurosci 17:7890-7901.
Laruelle M, Abi-Dargham A, Gil R, Kegeles L, Innis R (1999) Increased dopamine transmission in schizophrenia:
relationship to illness phases. Biol Psychiatry 46:56-72.
Laruelle M, Frankle WG, Narendran R, Kegeles LS, Abi-Dargham A (2005) Mechanism of action of antipsychotic
drugs: from dopamine D(2) receptor antagonism to glutamate NMDA facilitation. Clin Ther 27 Suppl
A:S16-24.
Le Moine C, Bloch B (1995) D1 and D2 dopamine receptor gene expression in the rat striatum: sensitive cRNA
probes demonstrate prominent segregation of D1 and D2 mRNAs in distinct neuronal populations of the
dorsal and ventral striatum. J Comp Neurol 355:418-426.
Le Novere N, Zoli M, Changeux JP (1996) Neuronal nicotinic receptor alpha 6 subunit mRNA is selectively
concentrated in catecholaminergic nuclei of the rat brain. Eur J Neurosci 8:2428-2439.
Lee FJ, Liu F, Pristupa ZB, Niznik HB (2001a) Direct binding and functional coupling of alpha-synuclein to the
dopamine transporters accelerate dopamine-induced apoptosis. Faseb J 15:916-926.
Lee FJ, Pristupa ZB, Ciliax BJ, Levey AI, Niznik HB (1996) The dopamine transporter carboxyl-terminal tail.
Truncation/substitution mutants selectively confer high affinity dopamine uptake while attenuating
recognition of the ligand binding domain. J Biol Chem 271:20885-20894.
Lee KH, Kim MY, Kim DH, Lee YS (2004) Syntaxin 1A and receptor for activated C kinase interact with the Nterminal region of human dopamine transporter. Neurochem Res 29:1405-1409.
Lee SH, Kang SS, Son H, Lee YS (1998) The region of dopamine transporter encompassing the 3rd
transmembrane domain is crucial for function. Biochem Biophys Res Commun 246:347-352.
Lee TH, Balu R, Davidson C, Ellinwood EH (2001b) Differential time-course profiles of dopamine release and
uptake changes induced by three dopamine uptake inhibitors. Synapse 41:301-310.
Lena C, Changeux JP (1993) Allosteric modulations of the nicotinic acetylcholine receptor. Trends Neurosci
16:181-186.
Lena C, Changeux JP (1997) Pathological mutations of nicotinic receptors and nicotine-based therapies for brain
disorders. Curr Opin Neurobiol 7:674-682.
Lena C, Changeux JP (1998) Allosteric nicotinic receptors, human pathologies. J Physiol Paris 92:63-74.
210
Références
Leonard S, Gault J, Adams C, Breese CR, Rollins Y, Adler LE, Olincy A, Freedman R (1998) Nicotinic receptors,
smoking and schizophrenia. Restor Neurol Neurosci 12:195-201.
Leonard S, Adams C, Breese CR, Adler LE, Bickford P, Byerley W, Coon H, Griffith JM, Miller C, Myles-Worsley
M, Nagamoto HT, Rollins Y, Stevens KE, Waldo M, Freedman R (1996) Nicotinic receptor function in
schizophrenia. Schizophr Bull 22:431-445.
Leonard S, Gault J, Hopkins J, Logel J, Vianzon R, Short M, Drebing C, Berger R, Venn D, Sirota P, Zerbe G,
Olincy A, Ross RG, Adler LE, Freedman R (2002) Association of promoter variants in the alpha7
nicotinic acetylcholine receptor subunit gene with an inhibitory deficit found in schizophrenia. Arch Gen
Levin ED, Simon BB (1998) Nicotinic acetylcholine involvement in cognitive function in animals.
Psychopharmacology (Berl) 138:217-230.
Levin ED, Rezvani AH (2002) Nicotinic treatment for cognitive dysfunction. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord
1:423-431.
Levin ED, Wilson W, Rose JE, McEvoy J (1996) Nicotine-haloperidol interactions and cognitive performance in
schizophrenics. Neuropsychopharmacology 15:429-436.
Levin ED, Bradley A, Addy N, Sigurani N (2002) Hippocampal alpha 7 and alpha 4 beta 2 nicotinic receptors and
working memory. Neuroscience 109:757-765.
Lewis DA, Lieberman JA (2000) Catching up on schizophrenia: natural history and neurobiology. Neuron 28:325334.
Li D, Sham PC, Owen MJ, He L (2006) Meta-analysis shows significant association between dopamine system
genes and attention deficit hyperactivity disorder (ADHD). Hum Mol Genet 15:2276-2284.
Li LB, Chen N, Ramamoorthy S, Chi L, Cui XN, Wang LC, Reith ME (2004) The role of N-glycosylation in function
and surface trafficking of the human dopamine transporter. J Biol Chem 279:21012-21020.
Light GA, Braff DL (2003) Sensory gating deficits in schizophrenia: can we parse the effects of medication,
nicotine use, and changes in clinical status? Clinical Neurosci Res 3:47-54
Lin Z, Zhang PW, Zhu X, Melgari JM, Huff R, Spieldoch RL, Uhl GR (2003) Phosphatidylinositol 3-kinase, protein
kinase C, and MEK1/2 kinase regulation of dopamine transporters (DAT) require N-terminal DAT
phosphoacceptor sites. J Biol Chem 278:20162-20170.
Lindstrom LH, Gefvert O, Hagberg G, Lundberg T, Bergstrom M, Hartvig P, Langstrom B (1999) Increased
dopamine synthesis rate in medial prefrontal cortex and striatum in schizophrenia indicated by L-(beta11C) DOPA and PET. Biol Psychiatry 46:681-688.
Lindvall O, Bjorklund A, Skagerberg G (1984) Selective histochemical demonstration of dopamine terminal
systems in rat di- and telencephalon: new evidence for dopaminergic innervation of hypothalamic
neurosecretory nuclei. Brain Res 306:19-30.
Lipska BK (2004) Using animal models to test a neurodevelopmental hypothesis of schizophrenia. J Psychiatry
Neurosci 29:282-286.
Lipska BK, Weinberger DR (2000) To model a psychiatric disorder in animals: schizophrenia as a reality test.
Lipska BK, Jaskiw GE, Weinberger DR (1993) Postpubertal emergence of hyperresponsiveness to stress and to
amphetamine after neonatal excitotoxic hippocampal damage: a potential animal model of
schizophrenia. Neuropsychopharmacology 9:67-75.
Lipska BK, Halim ND, Segal PN, Weinberger DR (2002) Effects of reversible inactivation of the neonatal ventral
hippocampus on behavior in the adult rat. J Neurosci 22:2835-2842.
Liu FH, Wu SJ, Hu SM, Hsiao CD, Wang C (1999) Specific interaction of the 70-kDa heat shock cognate protein
with the tetratricopeptide repeats. J Biol Chem 274:34425-34432.
Loland CJ, Norregaard L, Gether U (1999) Defining proximity relationships in the tertiary structure of the
dopamine transporter. Identification of a conserved glutamic acid as a third coordinate in the
endogenous Zn(2+)-binding site. J Biol Chem 274:36928-36934.
Lorang D, Amara SG, Simerly RB (1994) Cell-type-specific expression of catecholamine transporters in the rat
brain. J Neurosci 14:4903-4914.
Madine J, Doig AJ, Middleton DA (2006) A study of the regional effects of alpha-synuclein on the organization and
stability of phospholipid bilayers. Biochemistry 45:5783-5792.
Madras BK, Miller GM, Fischman AJ (2005) The dopamine transporter and attention-deficit/hyperactivity disorder.
Biol Psychiatry 57:1397-1409.
Mager S, Min C, Henry DJ, Chavkin C, Hoffman BJ, Davidson N, Lester HA (1994) Conducting states of a
mammalian serotonin transporter. Neuron 12:845-859.
Maiya R, Mayfield RD (2004) Dopamine transporter network and pathways. Int Rev Neurobiol 61:79-96.
Malek SN, Yang CH, Earnshaw WC, Kozak CA, Desiderio S (1996) p150TSP, a conserved nuclear
phosphoprotein that contains multiple tetratricopeptide repeats and binds specifically to SH2 domains. J
Biol Chem 271:6952-6962.
Malenka RC, Bear MF (2004) LTP and LTD: an embarrassment of riches. Neuron 44:5-21.
Marks MJ, Romm E, Campbell SM, Collins AC (1989) Variation of nicotinic binding sites among inbred strains.
Pharmacol Biochem Behav 33:679-689.
211
Références
Maroteaux L, Scheller RH (1991) The rat brain synucleins; family of proteins transiently associated with neuronal
membrane. Brain Res Mol Brain Res 11:335-343.
Marsh D, Grassi J, Vigny M, Massoulie J (1984) An immunological study of rat acetylcholinesterase: comparison
with acetylcholinesterases from other vertebrates. J Neurochem 43:204-213.
Martin LF, Kem WR, Freedman R (2004) Alpha-7 nicotinic receptor agonists: potential new candidates for the
treatment of schizophrenia. Psychopharmacology (Berl) 174:54-64.
Martin-Ruiz CM, Haroutunian VH, Long P, Young AH, Davis KL, Perry EK, Court JA (2003) Dementia rating and
nicotinic receptor expression in the prefrontal cortex in schizophrenia. Biol Psychiatry 54:1222-1233.
Marubio LM, Gardier AM, Durier S, David D, Klink R, Arroyo-Jimenez MM, McIntosh JM, Rossi F, Champtiaux N,
Zoli M, Changeux JP (2003) Effects of nicotine in the dopaminergic system of mice lacking the alpha4
subunit of neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Eur J Neurosci 17:1329-1337.
Mash DC, Pablo J, Ouyang Q, Hearn WL, Izenwasser S (2002) Dopamine transport function is elevated in
cocaine users. J Neurochem 81:292-300.
Maskos U, Molles BE, Pons S, Besson M, Guiard BP, Guilloux JP, Evrard A, Cazala P, Cormier A, MameliEngvall M, Dufour N, Cloez-Tayarani I, Bemelmans AP, Mallet J, Gardier AM, David V, Faure P, Granon
S, Changeux JP (2005) Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of nicotinic
receptors. Nature 436:103-107.
Masson J, Sagne C, Hamon M, El Mestikawy S (1999) Neurotransmitter transporters in the central nervous
system. Pharmacol Rev 51:439-464.
Mayfield RD, Zahniser NR (2001) Dopamine D2 receptor regulation of the dopamine transporter expressed in
Xenopus laevis oocytes is voltage-independent. Mol Pharmacol 59:113-121.
McCahill A, Warwicker J, Bolger GB, Houslay MD, Yarwood SJ (2002) The RACK1 scaffold protein: a dynamic
cog in cell response mechanisms. Mol Pharmacol 62:1261-1273.
McCarley RW, Niznikiewicz MA, Salisbury DF, Nestor PG, O'Donnell BF, Hirayasu Y, Grunze H, Greene RW,
Shenton ME (1999) Cognitive dysfunction in schizophrenia: unifying basic research and clinical aspects.
Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci 249 Suppl 4:69-82.
McCraith S, Holtzman T, Moss B, Fields S (2000) Genome-wide analysis of vaccinia virus protein-protein
interactions. Proc Natl Acad Sci U S A 97:4879-4884.
McDonald C, Murray RM (2000) Early and late environmental risk factors for schizophrenia. Brain Res Brain Res
Rev 31:130-137.
McEvoy J, Freudenreich O, McGee M, VanderZwaag C, Levin E, Rose J (1995) Clozapine decreases smoking in
patients with chronic schizophrenia. Biol Psychiatry 37:550-552.
Meador-Woodruff JH, Mansour A, Healy DJ, Kuehn R, Zhou QY, Bunzow JR, Akil H, Civelli O, Watson SJ, Jr.
(1991) Comparison of the distributions of D1 and D2 dopamine receptor mRNAs in rat brain.
Meijler MM, Matsushita M, Wirsching P, Janda KD (2004) Development of immunopharmacotherapy against
drugs of abuse. Curr Drug Discov Technol 1:77-89.
Melikian HE, Buckley KM (1999) Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter. J
Neurosci 19:7699-7710.
Menzaghi F, Whelan KT, Risbrough VB, Rao TS, Lloyd GK (1997) Effects of a novel cholinergic ion channel
agonist SIB-1765F on locomotor activity in rats. J Pharmacol Exp Ther 280:384-392.
Mirnics K, Middleton FA, Lewis DA, Levitt P (2001) Analysis of complex brain disorders with gene expression
microarrays: schizophrenia as a disease of the synapse. Trends Neurosci 24:479-486.
Mirnics K, Middleton FA, Marquez A, Lewis DA, Levitt P (2000) Molecular characterization of schizophrenia
viewed by microarray analysis of gene expression in prefrontal cortex. Neuron 28:53-67.
Mitsuhata C, Kitayama S, Morita K, Vandenbergh D, Uhl GR, Dohi T (1998) Tyrosine-533 of rat dopamine
transporter: involvement in interactions with 1-methyl-4-phenylpyridinium and cocaine. Brain Res Mol
Brain Res 56:84-88.
Miyakawa T, Leiter LM, Gerber DJ, Gainetdinov RR, Sotnikova TD, Zeng H, Caron MG, Tonegawa S (2003)
Conditional calcineurin knockout mice exhibit multiple abnormal behaviors related to schizophrenia. Proc
Natl Acad Sci U S A 100:8987-8992.
Mohn AR, Gainetdinov RR, Caron MG, Koller BH (1999) Mice with reduced NMDA receptor expression display
behaviors related to schizophrenia. Cell 98:427-436.
Morice E, Denis C, Macario A, Giros B, Nosten-Bertrand M (2005) Constitutive hyperdopaminergia is functionally
associated with reduced behavioral lateralization. Neuropsychopharmacology 30:575-581.
Morris JA, Kandpal G, Ma L, Austin CP (2003) DISC1 (Disrupted-In-Schizophrenia 1) is a centrosome-associated
protein that interacts with MAP1A, MIPT3, ATF4/5 and NUDEL: regulation and loss of interaction with
mutation. Hum Mol Genet 12:1591-1608.
Nawa H, Takahashi M, Patterson PH (2000) Cytokine and growth factor involvement in schizophrenia--support for
the developmental model. Mol Psychiatry 5:594-603.
Newhouse PA, Potter A, Singh A (2004) Effects of nicotinic stimulation on cognitive performance. Curr Opin
Pharmacol 4:36-46.
Nirenberg MJ, Vaughan RA, Uhl GR, Kuhar MJ, Pickel VM (1996) The dopamine transporter is localized to
dendritic and axonal plasma membranes of nigrostriatal dopaminergic neurons. J Neurosci 16:436-447.
212
Références
Nirenberg MJ, Chan J, Vaughan RA, Uhl GR, Kuhar MJ, Pickel VM (1997) Immunogold localization of the
dopamine transporter: an ultrastructural study of the rat ventral tegmental area. J Neurosci 17:52555262.
Norregaard L, Frederiksen D, Nielsen EO, Gether U (1998) Delineation of an endogenous zinc-binding site in the
human dopamine transporter. Embo J 17:4266-4273.
Norton N, Williams HJ, Owen MJ (2006) An update on the genetics of schizophrenia. Curr Opin Psychiatry
19:158-164.
Ohnuma T, Suzuki T, Arai H (2005) Hypothesis: minimal changes in neural transmission in schizophrenia:
decreased glutamatergic and GABAergic functions in the prefrontal cortex. Prog Neuropsychopharmacol
Olincy A, Young DA, Freedman R (1997) Increased levels of the nicotine metabolite cotinine in schizophrenic
smokers compared to other smokers. Biol Psychiatry 42:1-5.
Olincy A, Johnson LL, Ross RG (2003) Differential effects of cigarette smoking on performance of a smooth
pursuit and a saccadic eye movement task in schizophrenia. Psychiatry Res 117:223-236.
Olincy A, Harris JG, Johnson LL, Pender V, Kongs S, Allensworth D, Ellis J, Zerbe GO, Leonard S, Stevens KE,
Stevens JO, Martin L, Adler LE, Soti F, Kem WR, Freedman R (2006) Proof-of-concept trial of an alpha7
nicotinic agonist in schizophrenia. Arch Gen Psychiatry 63:630-638.
Olney JW, Farber NB (1995) Glutamate receptor dysfunction and schizophrenia. Arch Gen Psychiatry 52:9981007.
Orr-Urtreger A, Goldner FM, Saeki M, Lorenzo I, Goldberg L, De Biasi M, Dani JA, Patrick JW, Beaudet AL (1997)
Mice deficient in the alpha7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor lack alpha-bungarotoxin binding
sites and hippocampal fast nicotinic currents. J Neurosci 17:9165-9171.
Owen MJ, O'Donovan MC, Harrison PJ (2005) Schizophrenia: a genetic disorder of the synapse? Bmj 330:158159.
Pacholczyk T, Blakely RD, Amara SG (1991) Expression cloning of a cocaine- and antidepressant-sensitive
human noradrenaline transporter. Nature 350:350-354.
Packard MG, Knowlton BJ (2002) Learning and memory functions of the Basal Ganglia. Annu Rev Neurosci
25:563-593.
Packard MG, Introini-Collison I, McGaugh JL (1996) Stria terminalis lesions attenuate memory enhancement
produced by intracaudate nucleus injections of oxotremorine. Neurobiol Learn Mem 65:278-282.
Papke RL, Bencherif M, Lippiello P (1996) An evaluation of neuronal nicotinic acetylcholine receptor activation by
quaternary nitrogen compounds indicates that choline is selective for the alpha 7 subtype. Neurosci Lett
213:201-204.
Peng X, Gerzanich V, Anand R, Whiting PJ, Lindstrom J (1994) Nicotine-induced increase in neuronal nicotinic
receptors results from a decrease in the rate of receptor turnover. Mol Pharmacol 46:523-530.
Persico AM, Macciardi F (1997) Genotypic association between dopamine transporter gene polymorphisms and
schizophrenia. Am J Med Genet 74:53-57.
Picciotto MR, Zoli M, Rimondini R, Lena C, Marubio LM, Pich EM, Fuxe K, Changeux JP (1998) Acetylcholine
receptors containing the beta2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine. Nature
391:173-177.
Pidoplichko VI, DeBiasi M, Williams JT, Dani JA (1997) Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine
neurons. Nature 390:401-404.
Pierce RC, Kalivas PW (1997) A circuitry model of the expression of behavioral sensitization to amphetamine-like
psychostimulants. Brain Res Brain Res Rev 25:192-216.
Pifl C, Agneter E, Drobny H, Reither H, Singer EA (1997) Induction by low Na+ or Cl- of cocaine sensitive carriermediated efflux of amines from cells transfected with the cloned human catecholamine transporters. Br J
Pines G, Danbolt NC, Bjoras M, Zhang Y, Bendahan A, Eide L, Koepsell H, Storm-Mathisen J, Seeberg E,
Kanner BI (1992) Cloning and expression of a rat brain L-glutamate transporter. Nature 360:464-467.
Plenge P, Mellerup E (1998) Non-acetylcholine displaceable 3[H]epibatidine binding in the rat brain. Neurosci Lett
248:65-67.
Ponting CC, Phillips C (1996) Rapsyn's knobs and holes: eight tetratrico peptide repeats. Biochem J 314 ( Pt
3):1053-1054.
Povlock SL, Amara SG (1998) Vaccinia virus-T7 RNA polymerase expression system for neurotransmitter
transporters. Methods Enzymol 296:436-443.
Pristupa ZB, McConkey F, Liu F, Man HY, Lee FJ, Wang YT, Niznik HB (1998) Protein kinase-mediated
bidirectional trafficking and functional regulation of the human dopamine transporter. Synapse 30:79-87.
Purper-Ouakil D, Wohl M, Mouren MC, Verpillat P, Ades J, Gorwood P (2005) Meta-analysis of family-based
association studies between the dopamine transporter gene and attention deficit hyperactivity disorder.
Psychiatric Genetics 15:1-7.
Quick MW (2003) Regulating the conducting states of a mammalian serotonin transporter. Neuron 40:537-549.
Rain JC, Selig L, De Reuse H, Battaglia V, Reverdy C, Simon S, Lenzen G, Petel F, Wojcik J, Schachter V,
Chemama Y, Labigne A, Legrain P (2001) The protein-protein interaction map of Helicobacter pylori.
Nature 409:211-215.
213
Références
Ralph RJ, Paulus MP, Fumagalli F, Caron MG, Geyer MA (2001) Prepulse inhibition deficits and perseverative
motor patterns in dopamine transporter knock-out mice: differential effects of D1 and D2 receptor
antagonists. J Neurosci 21:305-313.
Rehn AE, Rees SM (2005) Investigating the neurodevelopmental hypothesis of schizophrenia. Clin Exp
Pharmacol Physiol 32:687-696.
Reith J, Benkelfat C, Sherwin A, Yasuhara Y, Kuwabara H, Andermann F, Bachneff S, Cumming P, Diksic M,
Dyve SE, Etienne P, Evans AC, Lal S, Shevell M, Savard G, Wong DF, Chouinard G, Gjedde A (1994)
Elevated dopa decarboxylase activity in living brain of patients with psychosis. Proc Natl Acad Sci U S A
91:11651-11654.
Rimer M, Barrett DW, Maldonado MA, Vock VM, Gonzalez-Lima F (2005) Neuregulin-1 immunoglobulin-like
domain mutant mice: clozapine sensitivity and impaired latent inhibition. Neuroreport 16:271-275.
Ritz MC, Kuhar MJ (1989) Relationship between self-administration of amphetamine and monoamine receptors in
brain: comparison with cocaine. J Pharmacol Exp Ther 248:1010-1017.
Ritz MC, Kuhar MJ (1993) Psychostimulant drugs and a dopamine hypothesis regarding addiction: update on
recent research. Biochem Soc Symp 59:51-64.
Robertson GS, Hori SE, Powell KJ (2006) Schizophrenia: an integrative approach to modelling a complex
disorder. J Psychiatry Neurosci 31:157-167.
Rocha BA, Fumagalli F, Gainetdinov RR, Jones SR, Ator R, Giros B, Miller GW, Caron MG (1998) Cocaine selfadministration in dopamine-transporter knockout mice. Nat Neurosci 1:132-137.
Rodriguiz RM, Chu R, Caron MG, Wetsel WC (2004) Aberrant responses in social interaction of dopamine
transporter knockout mice. Behav Brain Res 148:185-198.
Roerig B, Nelson DA, Katz LC (1997) Fast synaptic signaling by nicotinic acetylcholine and serotonin 5-HT3
receptors in developing visual cortex. J Neurosci 17:8353-8362.
Ron D, Chen CH, Caldwell J, Jamieson L, Orr E, Mochly-Rosen D (1994) Cloning of an intracellular receptor for
protein kinase C: a homolog of the beta subunit of G proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 91:839-843.
Ross SA, Wong JY, Clifford JJ, Kinsella A, Massalas JS, Horne MK, Scheffer IE, Kola I, Waddington JL, Berkovic
SF, Drago J (2000) Phenotypic characterization of an alpha 4 neuronal nicotinic acetylcholine receptor
subunit knock-out mouse. J Neurosci 20:6431-6441.
Rudnick G, Clark J (1993) From synapse to vesicle: the reuptake and storage of biogenic amine
neurotransmitters. Biochim Biophys Acta 1144:249-263.
Ruskin DN, Bergstrom DA, Shenker A, Freeman LE, Baek D, Walters JR (2001) Drugs used in the treatment of
attention-deficit/hyperactivity disorder affect postsynaptic firing rate and oscillation without preferential
dopamine autoreceptor action. Biol Psychiatry 49:340-350.
Salas R, Cook KD, Bassetto L, De Biasi M (2004) The alpha3 and beta4 nicotinic acetylcholine receptor subunits
are necessary for nicotine-induced seizures and hypolocomotion in mice. Neuropharmacology 47:401407.
Sams-Dodd F (1998) Effects of continuous D-amphetamine and phencyclidine administration on social behaviour,
stereotyped behaviour, and locomotor activity in rats. Neuropsychopharmacology 19:18-25.
Sandoval V, Riddle EL, Ugarte YV, Hanson GR, Fleckenstein AE (2001) Methamphetamine-induced rapid and
reversible changes in dopamine transporter function: an in vitro model. J Neurosci 21:1413-1419.
Saunders C, Ferrer JV, Shi L, Chen J, Merrill G, Lamb ME, Leeb-Lundberg LM, Carvelli L, Javitch JA, Galli A
(2000) Amphetamine-induced loss of human dopamine transporter activity: an internalization-dependent
and cocaine-sensitive mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A 97:6850-6855.
Schechtman D, Mochly-Rosen D (2001) Adaptor proteins in protein kinase C-mediated signal transduction.
Oncogene 20:6339-6347.
Schluter OM, Fornai F, Alessandri MG, Takamori S, Geppert M, Jahn R, Sudhof TC (2003) Role of alphasynuclein in 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced parkinsonism in mice. Neuroscience
118:985-1002.
Schmid JA, Scholze P, Kudlacek O, Freissmuth M, Singer EA, Sitte HH (2001) Oligomerization of the human
serotonin transporter and of the rat GABA transporter 1 visualized by fluorescence resonance energy
transfer microscopy in living cells. J Biol Chem 276:3805-3810.
Schomig A, Kurz T, Richardt G, Schomig E (1988) Neuronal sodium homoeostatis and axoplasmic amine
concentration determine calcium-independent noradrenaline release in normoxic and ischemic rat heart.
Circ Res 63:214-226.
Seeman P (1977) Anti-schizophrenic drugs--membrane receptor sites of action. Biochem Pharmacol 26:17411748.
Seeman P, Madras BK (1998) Anti-hyperactivity medication: methylphenidate and amphetamine. Mol Psychiatry
3:386-396.
Seeman P, Kapur S (2000) Schizophrenia: more dopamine, more D2 receptors. Proc Natl Acad Sci U S A
97:7673-7675.
Seeman P, Madras B (2002) Methylphenidate elevates resting dopamine which lowers the impulse-triggered
release of dopamine: a hypothesis. Behav Brain Res 130:79-83.
Segal DS, Geyer MA, Schuckit MA (1981) Stimulant-induced psychosis: an evaluation of animal methods. Essays
Neurochem Neuropharmacol 5:95-129.
214
Références
Selemon LD, Goldman-Rakic PS (1999) The reduced neuropil hypothesis: a circuit based model of schizophrenia.
Sherr JD, Myers C, Avila MT, Elliott A, Blaxton TA, Thaker GK (2002) The effects of nicotine on specific eye
tracking measures in schizophrenia. Biol Psychiatry 52:721-728.
Shimada S, Kitayama S, Lin CL, Patel A, Nanthakumar E, Gregor P, Kuhar M, Uhl G (1991) Cloning and
expression of a cocaine-sensitive dopamine transporter complementary DNA. Science 254:576-578.
Shimizu H, Iwayama Y, Yamada K, Toyota T, Minabe Y, Nakamura K, Nakajima M, Hattori E, Mori N, Osumi N,
Yoshikawa T (2006) Genetic and expression analyses of the STOP (MAP6) gene in schizophrenia.
Schizophr Res 84:244-252.
Shumyatsky GP, Malleret G, Shin RM, Takizawa S, Tully K, Tsvetkov E, Zakharenko SS, Joseph J, Vronskaya S,
Yin D, Schubart UK, Kandel ER, Bolshakov VY (2005) stathmin, a gene enriched in the amygdala,
controls both learned and innate fear. Cell 123:697-709.
Sibley DR, Monsma FJ, Jr. (1992) Molecular biology of dopamine receptors. Trends Pharmacol Sci 13:61-69.
Siegel SJ, Maxwell CR, Majumdar S, Trief DF, Lerman C, Gur RE, Kanes SJ, Liang Y (2005) Monoamine
reuptake inhibition and nicotine receptor antagonism reduce amplitude and gating of auditory evoked
potentials. Neuroscience 133:729-738.
Singh S (2000) Chemistry, design, and structure-activity relationship of cocaine antagonists. Chem Rev 100:9251024.
Smith RC, Singh A, Infante M, Khandat A, Kloos A (2002) Effects of cigarette smoking and nicotine nasal spray
on psychiatric symptoms and cognition in schizophrenia. Neuropsychopharmacology 27:479-497.
Sokoloff P, Giros B, Martres MP, Bouthenet ML, Schwartz JC (1990) Molecular cloning and characterization of a
novel dopamine receptor (D3) as a target for neuroleptics. Nature 347:146-151.
Sokoloff P, Diaz J, Levesque D, Pilon C, Dimitriadou V, Griffon N, Lammers CH, Martres MP, Schwartz JC (1995)
Novel dopamine receptor subtypes as targets for antipsychotic drugs. Ann N Y Acad Sci 757:278-292.
Sonders MS, Zhu SJ, Zahniser NR, Kavanaugh MP, Amara SG (1997) Multiple ionic conductances of the human
dopamine transporter: the actions of dopamine and psychostimulants. J Neurosci 17:960-974.
Sora I, Hall FS, Andrews AM, Itokawa M, Li XF, Wei HB, Wichems C, Lesch KP, Murphy DL, Uhl GR (2001)
Molecular mechanisms of cocaine reward: combined dopamine and serotonin transporter knockouts
eliminate cocaine place preference. Proc Natl Acad Sci U S A 98:5300-5305.
Sorkina T, Doolen S, Galperin E, Zahniser NR, Sorkin A (2003) Oligomerization of dopamine transporters
visualized in living cells by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biol Chem 278:2827428283.
Sowell ER, Thompson PM, Welcome SE, Henkenius AL, Toga AW, Peterson BS (2003) Cortical abnormalities in
children and adolescents with attention-deficit hyperactivity disorder. Lancet 362:1699-1707.
Spencer TJ, Biederman J, Madras BK, Faraone SV, Dougherty DD, Bonab AA, Fischman AJ (2005) In vivo
neuroreceptor imaging in attention-deficit/hyperactivity disorder: a focus on the dopamine transporter.
Spielewoy C, Roubert C, Hamon M, Nosten-Bertrand M, Betancur C, Giros B (2000) Behavioural disturbances
associated with hyperdopaminergia in dopamine-transporter knockout mice. Behav Pharmacol 11:279290.
St Clair D, Blackwood D, Muir W, Carothers A, Walker M, Spowart G, Gosden C, Evans HJ (1990) Association
within a family of a balanced autosomal translocation with major mental illness. Lancet 336:13-16.
Staley JK, Hearn WL, Ruttenber AJ, Wetli CV, Mash DC (1994) High affinity cocaine recognition sites on the
dopamine transporter are elevated in fatal cocaine overdose victims. J Pharmacol Exp Ther 271:16781685.
Stefansson H, Sigurdsson E, Steinthorsdottir V, Bjornsdottir S, Sigmundsson T, Ghosh S, Brynjolfsson J,
Gunnarsdottir S, Ivarsson O, Chou TT, Hjaltason O, Birgisdottir B, Jonsson H, Gudnadottir VG,
Gudmundsdottir E, Bjornsson A, Ingvarsson B, Ingason A, Sigfusson S, Hardardottir H, Harvey RP, Lai
D, Zhou M, Brunner D, Mutel V, Gonzalo A, Lemke G, Sainz J, Johannesson G, Andresson T,
Gudbjartsson D, Manolescu A, Frigge ML, Gurney ME, Kong A, Gulcher JR, Petursson H, Stefansson K
(2002) Neuregulin 1 and susceptibility to schizophrenia. Am J Hum Genet 71:877-892.
Stevens KE, Kem WR, Mahnir VM, Freedman R (1998) Selective alpha7-nicotinic agonists normalize inhibition of
auditory response in DBA mice. Psychopharmacology (Berl) 136:320-327.
Stevens KE, Freedman R, Collins AC, Hall M, Leonard S, Marks MJ, Rose GM (1996) Genetic correlation of
inhibitory gating of hippocampal auditory evoked response and alpha-bungarotoxin-binding nicotinic
cholinergic receptors in inbred mouse strains. Neuropsychopharmacology 15:152-162.
Storck T, Schulte S, Hofmann K, Stoffel W (1992) Structure, expression, and functional analysis of a Na(+)dependent glutamate/aspartate transporter from rat brain. Proc Natl Acad Sci U S A 89:10955-10959.
Strand JE, Nyback H (2005) Tobacco use in schizophrenia: a study of cotinine concentrations in the saliva of
patients and controls. Eur Psychiatry 20:50-54.
Sulzer D, Sonders MS, Poulsen NW, Galli A (2005) Mechanisms of neurotransmitter release by amphetamines: a
review. Prog Neurobiol 75:406-433.
215
Références
Sung U, Apparsundaram S, Galli A, Kahlig KM, Savchenko V, Schroeter S, Quick MW, Blakely RD (2003) A
regulated interaction of syntaxin 1A with the antidepressant-sensitive norepinephrine transporter
establishes catecholamine clearance capacity. J Neurosci 23:1697-1709.
Swanson LW (1982) The projections of the ventral tegmental area and adjacent regions: a combined fluorescent
retrograde tracer and immunofluorescence study in the rat. Brain Res Bull 9:321-353.
Swartz MS, Wagner HR, Swanson JW, Stroup TS, McEvoy JP, McGee M, Miller del D, Reimherr F, Khan A,
Canive JM, Lieberman JA (2006) Substance use and psychosocial functioning in schizophrenia among
new enrollees in the NIMH CATIE study. Psychiatr Serv 57:1110-1116.
Swerdlow NR, Geyer MA (1998) Using an animal model of deficient sensorimotor gating to study the
pathophysiology and new treatments of schizophrenia. Schizophr Bull 24:285-301.
Syringas M, Janin F, Mezghanni S, Giros B, Costentin J, Bonnet JJ (2000) Structural domains of chimeric
dopamine-noradrenaline human transporters involved in the Na(+)- and Cl(-)-dependence of dopamine
transport. Mol Pharmacol 58:1404-1411.
Talamini LM, Koch T, Ter Horst GJ, Korf J (1998) Methylazoxymethanol acetate-induced abnormalities in the
entorhinal cortex of the rat; parallels with morphological findings in schizophrenia. Brain Res 789:293306.
Thomas SM, Hagel M, Turner CE (1999) Characterization of a focal adhesion protein, Hic-5, that shares
extensive homology with paxillin. J Cell Sci 112 ( Pt 2):181-190.
Tiberi M, Jarvie KR, Silvia C, Falardeau P, Gingrich JA, Godinot N, Bertrand L, Yang-Feng TL, Fremeau RT, Jr.,
Caron MG (1991) Cloning, molecular characterization, and chromosomal assignment of a gene encoding
a second D1 dopamine receptor subtype: differential expression pattern in rat brain compared with the
D1A receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 88:7491-7495.
Torres GE (2006) The dopamine transporter proteome. J Neurochem 97 Suppl 1:3-10.
Torres GE, Carneiro A, Seamans K, Fiorentini C, Sweeney A, Yao WD, Caron MG (2003) Oligomerization and
trafficking of the human dopamine transporter. Mutational analysis identifies critical domains important
for the functional expression of the transporter. J Biol Chem 278:2731-2739.
Torres GE, Yao WD, Mohn AR, Quan H, Kim KM, Levey AI, Staudinger J, Caron MG (2001) Functional
interaction between monoamine plasma membrane transporters and the synaptic PDZ domaincontaining protein PICK1. Neuron 30:121-134.
Tosato S, Dazzan P, Collier D (2005) Association between the neuregulin 1 gene and schizophrenia: a systematic
review. Schizophr Bull 31:613-617.
Totterdell S, Meredith GE (2005) Localization of alpha-synuclein to identified fibers and synapses in the normal
mouse brain. Neuroscience 135:907-913.
Totterdell S, Hanger D, Meredith GE (2004) The ultrastructural distribution of alpha-synuclein-like protein in
normal mouse brain. Brain Res 1004:61-72.
Tsai G, Yang P, Chung LC, Lange N, Coyle JT (1998) D-serine added to antipsychotics for the treatment of
schizophrenia. Biol Psychiatry 44:1081-1089.
Tsuang M (2000) Schizophrenia: genes and environment. Biol Psychiatry 47:210-220.
Ucok A, Polat A, Bozkurt O, Meteris H (2004) Cigarette smoking among patients with schizophrenia and bipolar
disorders. Psychiatry Clin Neurosci 58:434-437.
Uetz P, Giot L, Cagney G, Mansfield TA, Judson RS, Knight JR, Lockshon D, Narayan V, Srinivasan M, Pochart
P, Qureshi-Emili A, Li Y, Godwin B, Conover D, Kalbfleisch T, Vijayadamodar G, Yang M, Johnston M,
Fields S, Rothberg JM (2000) A comprehensive analysis of protein-protein interactions in
Saccharomyces cerevisiae. Nature 403:623-627.
Uhl GR, Lin Z (2003) The top 20 dopamine transporter mutants: structure-function relationships and cocaine
actions. Eur J Pharmacol 479:71-82.
Usdin TB, Mezey E, Chen C, Brownstein MJ, Hoffman BJ (1991) Cloning of the cocaine-sensitive bovine
dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A 88:11168-11171.
Vaidya CJ, Austin G, Kirkorian G, Ridlehuber HW, Desmond JE, Glover GH, Gabrieli JD (1998) Selective effects
of methylphenidate in attention deficit hyperactivity disorder: a functional magnetic resonance study.
Proc Natl Acad Sci U S A 95:14494-14499.
Van Dam D, Lenders G, De Deyn PP (2006) Effect of Morris water maze diameter on visual-spatial learning in
different mouse strains. Neurobiol Learn Mem 85:164-172.
van Dyck CH, Quinlan DM, Cretella LM, Staley JK, Malison RT, Baldwin RM, Seibyl JP, Innis RB (2002)
Unaltered dopamine transporter availability in adult attention deficit hyperactivity disorder. Am J
van Rossum D, Hanisch UK (1999) Cytoskeletal dynamics in dendritic spines: direct modulation by glutamate
receptors? Trends Neurosci 22:290-295.
Vandenbergh DJ, Persico AM, Uhl GR (1992) A human dopamine transporter cDNA predicts reduced
glycosylation, displays a novel repetitive element and provides racially-dimorphic TaqI RFLPs. Brain Res
Mol Brain Res 15:161-166.
Vaughan RA, Brown VL, McCoy MT, Kuhar MJ (1996) Species- and brain region-specific dopamine transporters:
immunological and glycosylation characteristics. J Neurochem 66:2146-2152.
216
Références
Vaughan RA, Huff RA, Uhl GR, Kuhar MJ (1997) Protein kinase C-mediated phosphorylation and functional
regulation of dopamine transporters in striatal synaptosomes. J Biol Chem 272:15541-15546.
Venton BJ, Seipel AT, Phillips PE, Wetsel WC, Gitler D, Greengard P, Augustine GJ, Wightman RM (2006)
Cocaine increases dopamine release by mobilization of a synapsin-dependent reserve pool. J Neurosci
26:3206-3209.
Vles JS, Feron FJ, Hendriksen JG, Jolles J, van Kroonenburgh MJ, Weber WE (2003) Methylphenidate downregulates the dopamine receptor and transporter system in children with attention deficit hyperkinetic
disorder (ADHD). Neuropediatrics 34:77-80.
Volkow ND, Fowler JS, Wang G, Ding Y, Gatley SJ (2002a) Mechanism of action of methylphenidate: insights
from PET imaging studies. J Atten Disord 6 Suppl 1:S31-43.
Volkow ND, Gatley SJ, Fowler JS, Logan J, Fischman M, Gifford AN, Pappas N, King P, Vitkun S, Ding YS, Wang
GJ (1996) Cocaine doses equivalent to those abused by humans occupy most of the dopamine
transporters. Synapse 24:399-402.
Volkow ND, Wang GJ, Fowler JS, Logan J, Franceschi D, Maynard L, Ding YS, Gatley SJ, Gifford A, Zhu W,
Swanson JM (2002b) Relationship between blockade of dopamine transporters by oral methylphenidate
and the increases in extracellular dopamine: therapeutic implications. Synapse 43:181-187.
Volz H, Gaser C, Hager F, Rzanny R, Ponisch J, Mentzel H, Kaiser WA, Sauer H (1999) Decreased frontal
activation in schizophrenics during stimulation with the continuous performance test--a functional
magnetic resonance imaging study. Eur Psychiatry 14:17-24.
Waldo MC, Carey G, Myles-Worsley M, Cawthra E, Adler LE, Nagamoto HT, Wender P, Byerley W, Plaetke R,
Freedman R (1991) Codistribution of a sensory gating deficit and schizophrenia in multi-affected
families. Psychiatry Res 39:257-268.
Walhout AJ, Sordella R, Lu X, Hartley JL, Temple GF, Brasch MA, Thierry-Mieg N, Vidal M (2000) Protein
interaction mapping in C. elegans using proteins involved in vulval development. Science 287:116-122.
Wang D, Deken SL, Whitworth TL, Quick MW (2003a) Syntaxin 1A inhibits GABA flux, efflux, and exchange
mediated by the rat brain GABA transporter GAT1. Mol Pharmacol 64:905-913.
Wang W, Sonders MS, Ukairo OT, Scott H, Kloetzel MK, Surratt CK (2003b) Dissociation of high-affinity cocaine
analog binding and dopamine uptake inhibition at the dopamine transporter. Mol Pharmacol 64:430-439.
Weinberger DR, Berman KF (1988) Speculation on the meaning of cerebral metabolic hypofrontality in
schizophrenia. Schizophr Bull 14:157-168.
Weiser M, Reichenberg A, Grotto I, Yasvitsky R, Rabinowitz J, Lubin G, Nahon D, Knobler H, Davidson M (2004)
Higher rates of cigarette smoking in male adolescents before the onset of schizophrenia: a historicalprospective cohort study. Am J Psychiatry 161:1219-1223.
Wersinger C, Sidhu A (2003) Attenuation of dopamine transporter activity by alpha-synuclein. Neurosci Lett
340:189-192.
Wersinger C, Sidhu A (2005) Disruption of the interaction of alpha-synuclein with microtubules enhances cell
surface recruitment of the dopamine transporter. Biochemistry 44:13612-13624.
Wersinger C, Rusnak M, Sidhu A (2006) Modulation of the trafficking of the human serotonin transporter by
human alpha-synuclein. Eur J Neurosci 24:55-64.
Wersinger C, Prou D, Vernier P, Sidhu A (2003) Modulation of dopamine transporter function by alpha-synuclein
is altered by impairment of cell adhesion and by induction of oxidative stress. Faseb J 17:2151-2153.
West AR, Grace AA (2002) Opposite influences of endogenous dopamine D1 and D2 receptor activation on
activity states and electrophysiological properties of striatal neurons: studies combining in vivo
intracellular recordings and reverse microdialysis. J Neurosci 22:294-304.
Wilcox KM, Lindsey KP, Votaw JR, Goodman MM, Martarello L, Carroll FI, Howell LL (2002) Self-administration of
cocaine and the cocaine analog RTI-113: relationship to dopamine transporter occupancy determined by
PET neuroimaging in rhesus monkeys. Synapse 43:78-85.
Winzer-Serhan UH, Leslie FM (1997) Codistribution of nicotinic acetylcholine receptor subunit alpha3 and beta4
mRNAs during rat brain development. J Comp Neurol 386:540-554.
Wong AH, Van Tol HH (2003) Schizophrenia: from phenomenology to neurobiology. Neurosci Biobehav Rev
27:269-306.
Wong ST, Trinh K, Hacker B, Chan GC, Lowe G, Gaggar A, Xia Z, Gold GH, Storm DR (2000) Disruption of the
type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron
27:487-497.
Wonnacott S (1997) Presynaptic nicotinic ACh receptors. Trends Neurosci 20:92-98.
Wonnacott S, Kaiser S, Mogg A, Soliakov L, Jones IW (2000) Presynaptic nicotinic receptors modulating
dopamine release in the rat striatum. Eur J Pharmacol 393:51-58.
Wood SJ, Velakoulis D, Smith DJ, Bond D, Stuart GW, McGorry PD, Brewer WJ, Bridle N, Eritaia J, Desmond P,
Singh B, Copolov D, Pantelis C (2001) A longitudinal study of hippocampal volume in first episode
psychosis and chronic schizophrenia. Schizophr Res 52:37-46.
Wu X, Gu HH (2003) Cocaine affinity decreased by mutations of aromatic residue phenylalanine 105 in the
transmembrane domain 2 of dopamine transporter. Mol Pharmacol 63:653-658.
Xia J, Zhang X, Staudinger J, Huganir RL (1999) Clustering of AMPA receptors by the synaptic PDZ domaincontaining protein PICK1. Neuron 22:179-187.
217
Références
Xie T, Tong L, Barrett T, Yuan J, Hatzidimitriou G, McCann UD, Becker KG, Donovan DM, Ricaurte GA (2002)
Changes in gene expression linked to methamphetamine-induced dopaminergic neurotoxicity. J
Neurosci 22:274-283.
Yamamoto BK, Novotney S (1998) Regulation of extracellular dopamine by the norepinephrine transporter. J
Neurochem 71:274-280.
Yamashita A, Singh SK, Kawate T, Jin Y, Gouaux E (2005) Crystal structure of a bacterial homologue of Na+/Cl-dependent neurotransmitter transporters. Nature 437:215-223.
Yang L, Wang YF, Li J, Faraone SV (2004) Association of norepinephrine transporter gene with methylphenidate
response. J Am Acad Child Adolesc Psychiatry 43:1154-1158.
Yang YK, Nelson L, Kamaraju L, Wilson W, McEvoy JP (2002) Nicotine decreases bradykinesia-rigidity in
haloperidol-treated patients with schizophrenia. Neuropsychopharmacology 27:684-686.
Zahniser NR, Doolen S (2001) Chronic and acute regulation of Na+/Cl- -dependent neurotransmitter transporters:
drugs, substrates, presynaptic receptors, and signaling systems. Pharmacol Ther 92:21-55.
Zahniser NR, Sorkin A (2004) Rapid regulation of the dopamine transporter: role in stimulant addiction?
Neuropharmacology 47 Suppl 1:80-91.
Zakzanis KK, Hansen KT (1998) Dopamine D2 densities and the schizophrenic brain. Schizophr Res 32:201-206.
Zeng H, Chattarji S, Barbarosie M, Rondi-Reig L, Philpot BD, Miyakawa T, Bear MF, Tonegawa S (2001)
Forebrain-specific calcineurin knockout selectively impairs bidirectional synaptic plasticity and
working/episodic-like memory. Cell 107:617-629.
Zhu WH, Conforti L, Millhorn DE (1997) Expression of dopamine D2 receptor in PC-12 cells and regulation of
membrane conductances by dopamine. Am J Physiol 273:C1143-1150.
Zilles K, Schroder H, Schroder U, Horvath E, Werner L, Luiten PG, Maelicke A, Strosberg AD (1989) Distribution
of cholinergic receptors in the rat and human neocortex. Exs 57:212-228.
Zoli M, Lena C, Picciotto MR, Changeux JP (1998) Identification of four classes of brain nicotinic receptors using
beta2 mutant mice. J Neurosci 18:4461-4472.
Zuckerman L, Weiner I (2005) Maternal immune activation leads to behavioral and pharmacological changes in
the adult offspring. J Psychiatr Res 39:311-323.
Zuckerman L, Rehavi M, Nachman R, Weiner I (2003) Immune activation during pregnancy in rats leads to a
postpubertal emergence of disrupted latent inhibition, dopaminergic hyperfunction, and altered limbic
morphology in the offspring: a novel neurodevelopmental model of schizophrenia.
218

THESE DE DOCTORAT DE L`UNIVERSITE PARIS XII Caroline

Transcription

Documents pareils

Brochure PDF

Cartouches de données 4 mm, HEWLETT

Fichier DAT illisible

Partition Le Soldat

1. Copiez le fichier "test_data.dat" à la racine du fichier Historique

Les destinataires reçoivent une pièce jointe winmail.dat Problèmes

LA GOURMANDISE

extrait Recette de chansons

lancement du premier evenement nice à l`échelle du grand paris