Light Cycler Data Analysis

Light Cycler Data Analysis
Fonctionnement d’Analysis
Deux méthodes sont possibles pour l’analyse des profils (et l’obtention des Cp) sur le Light
Cycler : la méthode des « fit points » influencée fortement par l’utilisateur et la méthode
automatique du maximum de la seconde dérivée :
La méthode des « fit points » :
La méthode des fit points va permettre a l’utilisateur de placer une ligne horizontale de bruit
de fond qui va éliminer le bruit de fond et le plateau. Un certain nombre de points linéaire
(appelés « fit point ») sur l’échelle log vont permettre de tracer une droite dans la portion
exponentielle de la courbe. L’intersection de cette droite avec la ligne de bruit de fond
horizontale va identifier le Cp.
1°/ Ajustement de la ligne de base
La fluorescence de base peut varier d’un échantillon a un autre (différences dans le contenu en
ADN, dans le pipetage,…).La méthode des fit points nécessite une remise à niveau de toutes
les lignes de base a un même niveau. Plusieurs types d’ajustement de cette ligne de base sont
possibles :
- ajustement arithmétique : la valeur moyenne des 5 plus faibles fluorescence mesurée
pour chaque échantillon est calculée puis soustraite a tous les points de fluorescence.
Cette ajustement est recommandé pour toutes les applications présentant de fortes
variations de bruit de fond d’échantillon à échantillon (SyBr Green )
- ajustement proportionnel : lorsque les différences de quantité d’ADN n’interviennent
pas, cette méthode permet d’éliminer toutes variations tube a tube dues au pipetage.
- normalisation : toutes les courbes de fluorescence sont présentées en % de
fluorescence. Toutes les fluorescences sont amenées a la même valeur maximale.
2°/ Positionnement de la ligne de bruit de fond (ligne rouge)
La méthode des « fit point » place par défaut la ligne de bruit de fond à une valeur située à 3
fois l’écart type des 5 valeurs de fluorescence les plus faibles d’un run. Un ajustage manuel
est nécessaire : la ligne de bruit de fond est placée à une position ou elle croise tous les
échantillons dans la partie basse de la phase linéaire. L’échelle log utilisée permet à l’œil de
distinguer ou la linéarité disparaît. Le positionnement de la ligne de bruit de fond peut être
variable sur la partie linéaire et son influence négligeable par rapport aux autres sources de
variance dans ces expériences de PCR quantitative.
3°/ Croisement de la ligne de seuil (ligne verte)
Un certain nombre de points (2 par défaut) établis sur la partie linéaire permettent de tracer
une droite tangente. Le croisement de cette droite avec la ligne de seuil définit les Ct. Par
défaut, la ligne de seuil est confondue avec la ligne de bruit de fond. La ligne de seuil peut
être placée à n’importe quelle position de la partie linéaire. Par contre, il est nécessaire de
conserver cette position pour toutes les expériences d’un même projet.
La méthode de la seconde dérivée :
La méthode de la seconde dérivée est une méthode automatique. Pas besoin pour l’utilisateur
de définir une ligne de bruit de fond. Après ajustage de la ligne de base, le logiciel va
examiner le profil de la courbe PCR et identifier le Ct.
1°/ Ajustement de la ligne de base
La fluorescence de base peut varier d’un échantillon a un autre (différences dans le contenu en
ADN, dans le pipetage,…).La méthode des fit points nécessite une remise à niveau de toutes
les lignes de base a un même niveau. Plusieurs types d’ajustement de cette ligne de base sont
possibles :
- ajustement arithmétique : la valeur moyenne des 5 plus faibles fluorescence mesurée
pour chaque échantillon est calculée puis soustraite a tous les points de fluorescence.
Cette ajustement est recommandé pour toutes les applications présentant de fortes
variations de bruit de fond d’échantillon à échantillon (SyBr Green )
- ajustement proportionnel : lorsque les différences de quantité d’ADN n’interviennent
pas, cette méthode permet d’éliminer toutes variations tube a tube dues au pipetage.
- normalisation : toutes les courbes de fluorescence sont présentées en % de
fluorescence. Toutes les fluorescences sont amenées à la même valeur maximale.
2°/ Détermination du Ct
Le logiciel va calculer la seconde dérivée de la courbe de PCR. La position du point
maximum de cette seconde dérivée permet d’identifier le Ct (en valeur décimale). C’est la
forme de la courbe PCR qui détermine la position du Ct.
Les 2 méthodes génèrent le plus souvent des résultats strictement identiques. Cependant, il est
indispensable de conserver la même méthode d’analyse tout au long de vos expériences.