Etude d`un vaccin contre la rage animale, à virus inactivé

Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 1982, 1 (3), 799-809
Etude d'un vaccin contre la rage animale,
à virus inactivé, préparé à partir
d'encéphale ovin
J. BLANCOU*, M.F.A. AUBERT*, L. ANDRAL* et J. GODENIR**
Résumé : Parmi les modes possibles de production de vaccins antirabiques (à virus inactivé), celui de l'utilisation d'encéphales ovins paraît un
des plus économiques et des plus pratiques lors des campagnes de vaccination du chien en particulier dans les pays de la zone tropicale.
Les conditions pratiques de production de ce type de vaccin, les titres
en virus obtenus selon l'âge des ovins, les valeurs antigéniques des lots
fabriqués, les titres en anticorps et/ou la résistance à l'épreuve observés
après leur administration au chien (ou au renard) sont rapportés et discutés.
L'étude de ces données indique que les vaccins de ce type répondent aux
recommandations de l'Organisation Mondiale de la Santé. Cependant,
s'ils sont conservés à l'état liquide, ils doivent être utilisés dans les six mois
qui suivent leur fabrication dans les conditions décrites.
Plusieurs explications de l'extension actuelle de la rage dans le m o n d e sont
possibles.
L ' u n e d'entre elles est la résurgence des grandes épizooties de rage selvatique, particulièrement en E u r o p e et en Amérique du N o r d , contre lesquelles les
mesures de prophylaxie s'avèrent d'application très difficile.
L ' a u t r e est la difficulté que rencontrent u n grand n o m b r e de pays d'Afrique, d'Asie ou d'Amérique du Sud à venir à bout des épi-enzooties de rage
canine — les plus redoutables pour l ' h o m m e — par les méthodes de prophylaxie sanitaire ou médicale classiques.
L'efficacité de cette dernière, qui consiste en une vaccination de masse de
la population canine, n'est plus à démontrer. Elle reste donc toujours vive* Ministère de l'Agriculture, Direction de la Qualité, Services Vétérinaires, Centre National
d'Etudes sur la Rage, BP 9, 54220 Malzéville (France).
** En stage au Centre National d'Etudes sur la Rage.
— 800 —
ment recommandée, par l'Organisation Mondiale de la Santé, c o m m e « l'une
des armes les plus importantes en matière de contrôle de la rage » (7). Mais
elle se heurte en pratique à la difficulté d'approvisionnement de certains pays
en vaccin antirabique, ou au coût de cet approvisionnement. C'est p o u r q u o i ,
après avoir envisagé les diverses solutions pratiques à cette difficulté, une des
propositions les plus concrètes retenues en commission des experts de
l ' O . M . S . est celle de favoriser la fabrication, par chacun des pays concernés,
des réserves de vaccins antirabiques nécessaires à leurs campagnes de vaccination de masse. Une telle proposition n'est concevable, et acceptable, que si les
vaccins ainsi produits sont de prix inférieur à ceux existant sur le marché international, et d'innocuité et efficacité correspondantes aux normes de l ' O . M . S .
(4).
Les types de vaccins qui, techniquement, répondent le mieux à ces exigences du moins dans une première étape sont les vaccins à virus inactivé (plus
sûrs) produits sur encéphales d ' a n i m a u x (moins chers) : souris, rats, lapins,
petits ou grands ruminants.
Nous avons choisi, dans la présente communication, de rapporter les résultats obtenus avec u n vaccin produit sur encéphale d'agneau. C'est cette espèce
qui, après d'autres auteurs (2, 3, 5), nous a p a r u en effet la plus répandue et la
moins onéreuse, d'achat ou d'élevage, dans la plupart des pays concernés par
la rage canine.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
MATÉRIEL
Animaux
• Ovins : les ovins utilisés étaient de race croisée Ile-de-France, adultes
(mères), jeunes n o n sevrés (1 mois) ou juste sevrés (2 mois).
• Chiens : les chiens utilisés pour le titrage d'anticorps post-vaccinaux
étaient des chiens croisés Beagles ou anglo-normands âgés de plus de trois
mois.
• Souris : les souris Swiss, E . O . P . S . utilisées p o u r le titrage des virus et des
sérums, ou le contrôle des vaccins, étaient de souche OF1 âgées de 3 à 4 semaines achetées aux Etablissements I F F A - C R E D O (69210 Saint-Germain-surPArbresle, France).
Souche de virus
Nous avons employé la souche fixe Challenge Virus Standard (C.V.S.) ellemême dérivée de la souche Pasteur isolée d ' u n bovin français en 1882.
Matériel de laboratoire
Outre le matériel usuel nécessaire aux manipulations ou titrages des virus,
sérums et vaccins, nous avons utilisé, pour le broyage des encéphales, un
— 801 —
broyeur Ultra-Turrax J a n k e et Kunkel KG 170 w, type T P 18-10 à tige 18 K de
220 m m . P o u r les injections intradermiques de contrôle d'activité du vaccin a
été utilisé p o u r u n groupe de chiens, le « Dermojet » A K R A (23 bis, rue
L. Berthou, 64000 P a u , France).
Produits chimiques
L'agent d'inactivation du virus était la Bêta Propiolactone (« B . P . L . »)
pure ( O C H 2 C H 2 CO) Fluka A G Buchs SG (commercialisée par les Etablissements O.S.I., 141, rue de Javel, 75015 Paris).
• Le phénol rajouté p o u r éviter les contaminations bactériennes ultérieures
du virus inactivé était du phénol p u r , cristallisé, Rhône-Poulenc.
• L'hydroxyde
d'alumine,
agent adsorbant du virus et adjuvant de
l'immunité, contenant 2,46 m g / m l d ' A l
, nous a été aimablement fourni
par les Laboratoires R. Bellon (Usine de la Croisette, Villaines-les-Rochers,
37190 Azay-le-Rideau).
+ + +
MÉTHODES
Nous ne décrirons ici que la méthode de fabrication des vaccins étudiés, les
méthodes de contrôle du vaccin, par le test des National Institutes of Health
( N . I . H . ) ou des sérums par le test de séro-neutralisation sur souris, étant parfaitement décrites et standardisées par l ' O . M . S . (4).
La fabrication du vaccin étudié peut être résumée en trois étapes successives :
Première étape : Inoculation des ovins
Les ovins sont inoculés par trépanation à l'aide d ' u n e chignolle ordinaire,
munie d'une mèche à bois de 2 m m de diamètre. La trépanation se fait, après
incision et réclinaison et désinfection de la peau et des muscles peauciers sousjacents, en u n point défini comme le milieu d'une ligne imaginaire joignant la
base de l'oreille au centre d ' u n e autre ligne joignant le sommet des deux arcades osseuses des orbites (Figure 1).
L'inoculum est déposé, à travers l'effraction osseuse ainsi réalisée à l'aide
d'une aiguille de 16 m m (5/10), dans le cortex cérébral. Cet inoculum est constitué par 0,5 ml de suspension de cerveaux de souris infectées par la souche
C . V . S . , et titrant au moins 10 Doses létales souris par voie cérébrale. Les
lésions ainsi créées cicatrisent spontanément dans les jours suivants, où les
ovins sont observés quotidiennement.
5
Seconde étape : Récolte du virus rabique
Les ovins présentent les premiers symptômes de rage 4 à 7 j o u r s après l'inoculation, et meurent du 5 au 9 j o u r après cette inoculation, selon leur âge. Ils
sont sacrifiés en phase agonique (paralysie, dyspnée) par saignée totale et la
e
e
— 802 —
totalité de leur encéphale est aussitôt extraite selon les méthodes classiques (4)
puis soit traitée immédiatement, soit conservée à - 30 °C durant les quelques
jours qui précèdent le traitement.
Troisième étape : Inactivation du virus, préparation finale du vaccin
Les encéphales*, frais ou congelés, prédécoupés en petits fragments de
quelques grammes, sont pré-broyés dans un volume de soluté t a m p o n n é stérile
frais (4 °C) égal à trois fois leur poids. Ce pré-broyage s'effectue à l'UltraTurrax dans un récipient de la hauteur de la tige, à la vitesse maxima (20 000
t o u r s / m i n u t e ) et durant trois minutes.
La sécurité de ce broyage, générateur d'aérosols de virus, est assurée par
une double enveloppe plastique (Figure 2). A l'issue de ce pré-broyage, u n
titrage est effectué par inoculation intracérébrale à la souris et exprimé en dose
létale p o u r 50 p . 100 des souris par voie intracérébrale ( D L / i . c . / souris).
50
Le pré-broyat est alors additionné d'une quantité de soluté t a m p o n n é * *
préchauffé à 37° telle que la suspension finale contienne 5 parties d'encéphale
p o u r 95 de soluté. Cette suspension est filtrée aseptiquement sur gaze stérile et
inactivée aussitôt par addition d ' u n e partie p o u r cent d'une solution de B . P . L .
à 1/40 réalisée extemporanément. L'inactivation se poursuit alors durant une
heure à 37 °C puis 12 heures à + 4 ° C , sous agitation constante, le p H étant
rectifié à 7 si nécessaire en fin d'inactivation. Le vaccin est alors complété par
addition de 2,5 p . 1000 de phénol et d ' u n e partie d'hydroxyde d'alumine pour
trois parties de vaccin inactivé phénolé.
RÉSULTATS
Les résultats des essais faits sur divers lots de vaccins expérimentaux peuvent être résumés par l'étude des trois critères les plus importants pour u n vaccin antirabique destiné au chien :
— le titre de la suspension virale avant inactivation,
— la valeur antigénique de la suspension après inactivation (test N . I . H . ) ,
— le titre d'anticorps élaborés par les chiens vaccinés.
TITRE DE LA SUSPENSION VIRALE
AVANT INACTIVATION
Ce titre apparaît comme très différent selon que le virus provient du
broyage de l'encéphale d ' u n ovin adulte (poids moyen d'environ 90 grammes,
après « toilette » des méninges, tissus conjonctifs, vaisseaux, etc.) ou de celui
d ' u n agneau de 1 à 2 mois (poids moyen de 75 grammes).
* L'encéphale est constitué, dans nos essais, du cerveau, du cervelet et du bulbe rachidien.
** La formule de ce soluté est celle décrite par P. Lépine et coll. (5).
803
Figure 1
Inoculation intracérébrale de l'agneau (souche C.V.S.)
Figure 2
Broyage de la récolte de virus à l'Ultra-Turrax
— 804 —
Les valeurs respectives moyennes des titres déterminés sur six sujets sont
présentées dans le Tableau I.
Tableau I. — TITRE DE VIRUS PAR GRAMME D'ENCÉPHALE
SELON LES CATÉGORIES D'OVINS
Catégorie de sujets
Brebis adulte
Agneau non sevré
Agneau juste sevré
Titre en virus par
gramme d'encéphale
Intervalle de confiance
au niveau P < 0,05
10-4.13
± 0,73
± 0,39
± 0,48
10-7.22
10-7.2
On constate que s'il n'existe pas de différence significative entre le titre
viral des agneaux n o n sevrés ou juste sevrés, ce titre est environ 1 200 fois plus
élevé que chez la brebis adulte.
Le gain apparent qui pourrait être escompté d ' u n poids plus important (90
grammes) de l'encéphale de l'adulte par r a p p o r t à celui du jeune (75 grammes)
est évidemment complètement annulé, si l'on considère la quantité de virus
rabique qu'il contient.
VALEUR ANTIGÉNIQUE
DE LA SUSPENSION VIRALE INACTIVÉE
Après vérification de la complète innocuité de la suspension virale inactivée
(par inoculation intracérébrale à des lots de dix souris) sa valeur est appréciée
par le test des N . I . H . utilisant la Préparation nationale de Référence (lot 009)
française comme étalon.
Elle est déterminée en faisant varier trois paramètres :
— la suspension antigénique : liquide ou lyophilisée*,
— la température de conservation de cette suspension : + 4 ° C , + 20 ° C ,
ou + 37 ° C ,
— la durée de conservation de cette suspension aussitôt après fabrication,
3 ou 6 mois plus tard.
L'ensemble des résultats de ces différents titrages en Dose protectrice pour
50 p . 100 des souris (ou en Unités Internationales par ml) est rassemblé dans le
Tableau II.
* La lyophilisation (9) de la suspension a été assurée après mélange dans le substrat saccharosé
recommandé par P. Lépine et coll. (5) en flacon type pénicilline, sur appareil Sérail type CS 3.
— 805 —
Tableau II. — DOSE PROTECTRICE 50 % ET VALEURS ANTIGÉNIQUES
DES SUSPENSIONS VIRALES INACTIVÉES LIQUIDE OU LYOPHILISÉE
IMMÉDIATEMENT APRÈS FABRICATION ET APRÈS CONSERVATION A 4°,
20° OU 37 °C PENDANT 3 ET 6 MOIS
Température de conservation
Délais
du titrage
(après fabrication)
De la suspension liquide
+ 4 °C
Aussitôt
après fabrication
+ 20 °C
+ 37 °C
2,24 ± 0,16
1,38<3,18<7,38
3 mois
1,92 ± 0,16
1,6<2,7<4,6
6 mois
1,42 ± 0,22
0,20<0,36<0,70
1,56 ± 0,19
0,3 ± 1,9
0,65<1,16<2,08 0,14<0,36<0,9
De la suspension
lyophilisée
+ 4 °C
2,21 ± 0,23
1<4,01<8
1,84 ± 0,17
0,6<1,92<3,84
1,08 ± 0,38
0,97 ± 0,45
1,42 ± 0,13
0,10<0,2<0,44 0,08<0,16<0,36 0,51<1,00<1,93
Chiffres en italiques = Dose protectrice pour 50 % des souris vaccinées éprouvées par 30 à 70
D L / i . c . : exposant logarithmique décimal ± intervalle de confiance à P < 0,05.
Chiffres romains = Valeur antigénique en Unités Internationales par ml, encadrée par les valeurs
extrêmes à P < 0,05.
50
De l'examen de ce tableau il est possible de conclure que :
1. Aussitôt après sa fabrication, le vaccin a une très b o n n e valeur antigénique qu'il soit liquide (3,18 U . I . / m l ) ou lyophilisé (4,01 U . I . / m l ) .
Ces valeurs ne sont guère différentes de celles obtenues avec les vaccins préparés sur encéphales de souriceaux ou sur cellules.
2. Après 3 mois de conservation, les vaccins liquide ou lyophilisé n ' o n t
perdu q u ' u n e partie de leur valeur antigénique (respectivement 2,7 et 1,92
U . I . / m l ) lorsqu'ils ont été conservés à 4 ° C , mais ont été plus dégradés si la
conservation a eu lieu à 20° (1,16 U . I . / m l ) ou 37° (0,36 U . I . / m l ) pour le vaccin liquide.
3 . Après 6 mois de conservation, les pertes relatives de valeur antigénique
sont très importantes surtout pour les vaccins conservés à + 4 °C : le vaccin
liquide est 7,5 fois moins puissant que 3 mois plus tôt, et le vaccin lyophilisé
1,9 fois moins. Dans les deux cas les vaccins répondent encore aux normes de
l'Organisation Mondiale de la Santé, mais le vaccin liquide se situe à la limite
de ces normes s'il est employé à la dose de 1 ml.
TITRE D'ANTICORPS NEUTRALISANTS ÉLABORÉS
CHEZ LE CHIEN
Afin d'apprécier les différentes modalités d'injection possibles du vaccin,
et les économies que pourrait éventuellement permettre le choix de la voie
— 806 —
intradermique recommandée anciennement chez le chien (8) et redécouverte
récemment chez l ' h o m m e (6) nous avons utilisé 36 chiens divisés en quatre
groupes* qui ont reçu respectivement, d ' u n lot de vaccin préparé trois mois
plus tôt et titrant 1,7 U . I . / m l :
• groupe 1 : 0,2 ml administrés par voie intradermique avec une aiguille ;
• groupe 2 : 0,2 ml administrés par voie intradermique « sans aiguille »
(appareil Dermojet) à titre de contrôle de l'effet « technique d'injection intradermique » du groupe 1 ;
• groupe 3 : 0,2 ml administrés par voie sous-cutanée à titre de contrôle de
l'effet « voie d'injection » des groupes 1 et 2 ;
• groupe 4 : 1 ml administré par voie sous-cutanée, à titre de contrôle de
l'effet « dose d'antigène » du groupe 3.
Le titre d'anticorps élaboré 25 à 40 jours après cette injection dans les quatre groupes a été déterminé par la technique de séro-neutralisation sur souris
(4). Ils sont rassemblés dans le Tableau III et exprimés soit en Dose protectrice
pour 50 % des souris, soit en Unités Internationales par ml. Ce tableau n'indique que la moyenne des titres par groupe, le détail des chiffres étant d o n n é par
ailleurs dans la publication de T o m a et coll. (« Vaccination antirabique du
chien par la voie intradermique » : à paraître).
De l'étude de ce tableau et de son analyse statistique il apparaît que
l'influence de la voie d'injection du vaccin est significative l o r s q u ' o n considère la réponse sérologique 25 jours après la vaccination (F = 20,7). P a r
contre, l o r s q u ' o n considère cette réponse 40 jours après la vaccination, la voie
d'injection n ' a plus d'influence significative sur le titre d'anticorps élaborés,
bien que la voie intradermique paraisse la plus favorable à l'immunisation.
DISCUSSION - CONCLUSION
La fabrication d ' u n vaccin à virus inactivé à partir d'encéphales d'agneau
doit permettre d'obtenir u n produit répondant à la fois aux exigences internationales concernant la valeur antigénique des vaccins antirabiques à usage animal et aux contraintes financières concernant ce type de production, dans les
pays envisageant une prophylaxie de masse de la rage canine.
7,2
Le titre du virus obtenu avant inactivation ( 1 0 - / g ) n'est pas, en effet,
significativement inférieur à ceux que l'on peut obtenir sur souriceau (4 et 10)
ou sur cellules (4) actuellement considérés comme les meilleurs substrats de
réplication du virus rabique. Mais u n tel titre ne peut être espéré que si l'ani-
* Cet essai a été fait à l'Ecole Nationale Vétérinaire d'Alfort, Chaire des Maladies Contagieuses
(Professeur Toma) que nous remercions vivement.
— 807 —
Tableau III. — TITRES D'ANTICORPS NEUTRALISANTS DÉTERMINÉS SUR SOURIS,
SUR DES SÉRUMS DE CHIEN SOUMIS A DIVERSES MODALITÉS
DE VACCINATION ANTIRABIQUE
Titre d'anticorps neutralisants
Groupe de chiens
25 jours après l'injection
DP *
50
Voie dermique
0,2 ml de vaccin
(Dermojet)
Voie dermique
0,2 ml de vaccin
(aiguille)
Voie sous-cutanée
0,2 ml de vaccin
Voie sous-cutanée
1 ml de vaccin
1,65
2,1
2,2
2,2
2,3
2,3
2,3
2,45
2,55
1,5
1,7
1,7
1,8
2,05
2,05
2,05
2,1
2,1
U.I./ml**
DP *
U.I./ml*
0,8 ± 0,36
1,7
1,7
1,7
1,75
1,75
1,95
1,95
1,95
2,1
0,3 ± 0,1
0,35 ± 0,15
1,5
1,6
1,6
1,7
1,7
1,75
1,75
2,05
0,2 ± 0,03
1
1,35
1,35
1,5
1,7
1,7
U
1,75
2,2
40 jours après l'injection
0,21 ± 0,18
50
1,25
1,4
1,5
1,75
1,75
1,95
2,15
2,2
0,3 ± 0,2
0,95
1,4
1,45
1,55
1,6
1,7
1,7
0,13 ± 0,07
1
1,3
1,4
1,5
1,5
1,7
1,7
2,2
0,2 ± 0,2
* DP50 = Doses protectrices de chacun des sérums pour 50 % des souris (exposant du logarithme
décimal de la dilution finale neutralisante).
** U.I./ml = Unités Internationales par ml : moyenne pour le groupe. La D P du sérum de référence étant très élevée dans ces titrages (10~ ) les titres des sérums testés paraissent relativement
faibles.
5 0
4,2
— 808 —
mal utilisé est très jeune (agneau non sevré, ou juste sevré). L'emploi de sujets
adultes fournirait, au contraire, une récolte de valeur très médiocre, dont
l'inactivation totale produirait u n vaccin de valeur immunogène inacceptable.
La valeur antigénique du virus après inactivation mesurée par le test des
N . I . H . (3,18 à 4,4 U . I . / m l ) est également comparable à celle obtenue à partir
de virus répliqué sur souriceaux ou cellules. Mais, contrairement à ces derniers, cette valeur antigénique a tendance à baisser assez rapidement pour des
raisons encore inexpliquées. Ceci doit inciter à ne pas réaliser de réserves trop
importantes de vaccins, et à les utiliser rapidement (dans les trois mois après
fabrication) sous peine d'être obligés d'augmenter la posologie vaccinale pour
compenser cette perte de valeur antigénique.
La voie d'administration du vaccin pourrait être, très avantageusement, la
voie intradermique. Cette dernière déjà étudiée chez l'animal et l ' h o m m e (8)
(1-6) semble bien entraîner, 25 jours après vaccination, une réaction humorale
supérieure à la voie sous-cutanée avec une dose de vaccin cinq fois m o i n d r e .
Le titre moyen d'anticorps (0,8 U . I . / m l ) obtenu par cette voie répond aux
normes internationales. Si, 40 jours plus tard, cette différence n'est pas significative, elle reste tout de même en faveur de la voie intradermique. L'emploi
de cette voie devrait donc pouvoir être recommandé pour les vaccinations de
masse sous réserve d'une étude complémentaire en cours, qui vérifiera sur plusieurs années la cinétique de l'immunité humorale comparée selon les voies
d'injection.
REMERCIEMENTS
Nous remercions vivement le Docteur K. Bögel, du Service de la Santé
Publique Vétérinaire de l'Organisation Mondiale de la Santé, pour ses encouragements et son aide matérielle dans ces essais, ainsi que le Professeur
B. T o m a pour sa précieuse collaboration aux essais sur chiens.
STUDY OF A VACCINE AGAINST ANIMAL RABIES,
USING AN INACTIVATED VIRUS PREPARED FROM SHEEP BRAIN
J. Blancou, M.F.A. Aubert, L. Andral and J. Godenir
Summary : Among the possible ways of manufacturing rabies vaccines
(inactivated virus), the use of sheep brain appears to be one of the most
economical and practical methods in vaccination campaigns of dogs, particularly in tropical countries.
The practicalities of manufacturing this type of vaccine, the virus titres
obtained depending on the age of the sheep, the antigenic values of manufactured vaccine batches, the antibody titres and/or resistance to challenge observed after vaccination of dogs (or foxes) are reported and discussed.
— 809 —
A study of these data indicates that vaccines of this type meet the
recommendations of the World Health Organization. However, if the
vaccines are kept in a liquid state, they must be used under described
conditions within six months after the date of manufacture.
ESTUDIO DE UNA VACUNA CONTRA LA RABIA ANIMAL,
DE VIRUS INACTIVADO, PREPARADA A PARTIR DE ENCÉFALO OVINO
J. Blancou, M.F.A. Aubert, L. Andral y J. Godenir
Resumen : Entre las posibles formas de producción de vacunas antirrábicas (de virus inactivado), la del empleo de encéfalos ovinos parece que es
una de las más económicas y más prácticas en las campañas de vacunación
de perros, especialmente en países de zona tropical.
Se reseñan y discuten las condiciones prácticas de producción de este
tipo de vacuna, los títulos de virus obtenidos según la edad de los ovinos,
los valores antigénicos de los lotes fabricados, los títulos de anticuerpos
y/o la resistencia a la prueba observados después de administrarlos al
perro (o al zorro).
Al estudiar estos datos se ve que las vacunas de este tipo corresponden a
las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud. Sin
embargo, de conservarse en estado líquido, se las ha de emplear en los seis
meses que siguen a su fabricación en las condiciones descritas.
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