masque de mode opératoire

Plate-Forme Métabolisme-Métabolome
IFR 87 La plante et son environnement
Université Paris-Sud, IBP et ESE, 91405 Orsay Cedex
http://www.ifr87.cnrs-gif.fr/platefor/metabol/metabol.html
Mode opératoire
Préparation des échantillons et extraction pour
GC-MS
Réf : MO-PMM-GCMS-01
Version 1
date : 05/10/2005
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Objet et domaine d’application
Préparation des échantillons végétaux pour l’analyse quantitative des métabolites polaires
par GC-MS
1. Documents de référence
Méthode publiée dans : Proteomics 2004, 4 : 78-83
(http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/fulltext/107061044/PDFSTART)
2. Liste de diffusion et si nécessaire niveau de confidentialité
-Institut de Biotechnologie des Plantes (UMR8618)
-Ecologie, Systématique et Evolution (UMR8079)
-Plate-Forme « Métabolisme-Métabolome » de l’IFR 87
Contact :
[email protected]
3. Hygiène et sécurité
Manipulation de produits corrosif, irritant, inflammable, toxique, nocif et d’azote
liquide.
4. Principe de la méthode
Extraire les métabolites, les rendre volatilisables par dérivation et introduire un étalon
interne.
5. Matériels nécessaires
-bombonne d’azote liquide,
-vortex,
-speed-vac,
-mortier et pilon,
-roue à agitation,
-incubateurs à 30 et 37°C.
6. Réactifs (chimiques et biologiques)
-Méthanol,
-Chloroforme,
-Pyridine,
-Méthoxyamine,
-Adonitol.
-balance de précision,
-centrifugeuse,
-Eau milliQ
-MSTFA,
7. Contraintes de la méthode
La préparation de l’échantillon se réalise à cheval sur deux jours puisqu’elle nécessite
une évaporation au speed-vac durant toute une nuit.
8. Contenu du mode opératoire
Etape 1 : Préparation des solutions d’extraction et de l’étalon interne
Etape 2 : Broyage de l’échantillon végétal
Etape 3 : Extraction des métabolites
Etape 4 : Préparation des réactifs de dérivation
Etape 5 : Dérivation de l’échantillon
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Mode opératoire
Préparation des échantillons et extraction pour
GC-MS
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Version 1
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Etape 1 : Préparation des solutions d’extraction
•
Solution d’extraction I (à conserver à –20°C)
1) Utilisation des produits suivants :
CH3OH (Prolabo 20847) MM=32.04
CHCL3 (Prolabo 22711) MM=119.38
H2O Milli Q
Les deux premiers produits sont stockés à –20°C et l’eau au réfrigérateur avant
préparation de la solution d’extraction.
2) Stocker la vaisselle nécessaire au mélange à –20°C à savoir flacons et éprouvettes.
3) Mélanger les trois produits dans les proportions volumiques suivantes :
2.5 CH3OH
1 CHCL3
1 H2O.
•
Solution d’extraction II (à conserver à –20°C)
1) Utilisation des produits suivants :
CH3OH (Prolabo 20847) MM=32.04
CHCL3 (Prolabo 22711) MM=119.38
Les produits sont stockés à –20°C avant préparation de la solution d’extraction.
2) Stocker la vaisselle nécessaire au mélange à –20°C à savoir flacons et éprouvettes.
3) Mélanger les deux produits dans les proportions volumiques suivantes :
1 CH3OH
1 CHCL3.
•
Préparation d’une solution d’étalon interne
1) Utilisation de l’adonitol (Sigma A5502) MM=152.15
2) Solution d’adonitol 2 mM
3) Stocker la solution d’adonitol dans l’azote liquide.
Etape 2 : Broyage de l’échantillon végétal
1) Couper les feuilles en enlevant la nervure centrale, échantillonner par 100 mg de
MF et les congeler, frais dans l’azote liquide.
2) Stocker à –80°C en attendant l’extraction et l’analyse.
3) Broyer dans l’azote liquide au mortier et au pilon jusqu’à obtenir une poudre fine et
homogène.
Etape 3 : Extraction des métabolites
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Ajouter 2 mL de tampon d’extraction I et finaliser le broyage.
Ajouter 10 µL d’étalon interne.
Agiter pendant 30 min à 4°C.
Récupérer le surnageant après centrifugation pendant 2 min à 14000 rpm et 4 °C.
Ajouter 1 mL de tampon d’extraction II, vortexer longuement.
Récupérer le surnageant après centrifugation pendant 2 min à 14000 rpm et 4°C.
Ajouter aux deux surnageants 500 µL d’H2O, vortexer.
Centrifuger pendant 15 min à 4000 rpm et 4°C.
Récupérer deux fois 1 mL de la phase polaire (2 répétitions) et sécher ces deux
fractions toute la nuit au speed-vac.
Etape 4 : Préparation du réactif de méthoxymation
1) Utilisation des produits suivants :
Méthoxyamine (Sigma M1139) MM=83.52
Pyridine (Merck 1.09728) MM=79.10
Les produits sont stockés à l’air ambiant.
2) Solution de méthoxyamine à 20 µM dans la pyridine.
3) Stocker à l’air ambiant
Etape 5 : Dérivation de l’échantillon
1) Ajouter 50 µL de la solution de méthoxyamine, vortexer et incuber avec agitation
constante 90min à 30°C.
2) Ajouter 80 µL de MSTFA (Sigma M7891 MM=199.25), vortexer et incuber avec
agitation constante 30 min à 37°C.
3) Laisser reposer 2 heures minimum avant injection au GC-MS.
4) Vortexer et transférer dans un vial contenant un insert.
5) Après l’analyse GC-MS, stocker le vial au réfrigérateur pour une éventuelle
réinjection dans un délai d’une semaine maximum.