Rapport final - Site public du CRAAQ

Transcription

Amélioration des qualités nutritionnelles du milieu de culture utilisé pour produire
Trichoderma, afin d’en maximiser le potentiel antagoniste
(Projet # 202-T)
Rapport final de recherche
Présenté au
CRAAQ
(Centre de référence en agriculture et agroalimentaire du Québec)
Présenté par
Mmes Johanne Caron et Lucie Laverdière
Horti-Protection inc.
février 2003
Table des matières
1.
AVANT-PROPOS__________________________________________________________7
2.
INTRODUCTION _________________________________________________________8
3.
MATÉRIEL ET MÉTHODES________________________________________________9
3.1 Production de la biomasse de Trichoderma___________________________________9
3.2 Tests de confrontation en Pétri ____________________________________________9
3.3 Tests en serre expérimentale _____________________________________________10
4.
RÉSULTATS ET DISCUSSION _____________________________________________12
4.1 Production de la biomasse de Trichoderma__________________________________12
4.1.1 Expérience #1 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu V-8
conventionnel ____________________________________________________________12
4.1.2 Expérience #2 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu
conventionnel mais solide ___________________________________________________12
4.1.3 Expérience #3 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu à base de
pomme de terre (PDA) _____________________________________________________13
solide - sans carbonate de calcium ____________________________________________14
4.1.5 Expérience #5 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu eau et
agar __________________________________________________________________15
4.1.6 Expérience #6 – Effets d’une plus grande concentration de cellulose au milieu V-8
solide - sans carbonate de calcium ____________________________________________16
4.1.7 Expérience #7 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu PDA +
jus V-8 __________________________________________________________________16
semi-solide – sans CaCO3 ___________________________________________________18
4.1.9 Expérience #9 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu ½ PDA
+ jus V-8 ________________________________________________________________18
4.1.10 Expérience #10 – Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu V-8 semi-solide et au
milieu ½ PDA + jus V-8 ____________________________________________________20
4.1.11 Expérience #11 – Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu V-8 solide_________21
4.1.12 Expérience #12 – Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu PDA + jus V-8 alimenté
d’une source de cellulose ___________________________________________________21
d’une source de cellulose ___________________________________________________23
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de la cellulose raffinée (#2) ou à fibres moyennes (#3) ____________________________24
4.2 Test de confrontation en Pétri ____________________________________________25
4.2.1 Expérience #1 - Tests de confrontation entre Trichoderma et les agents pathogènes
sur deux milieux de culture __________________________________________________25
4.3 Tests en serre expérimentale _____________________________________________27
5.
4.3.1
Concombre ________________________________________________________27
4.3.2
Tomate____________________________________________________________32
4.3.3
Muflier____________________________________________________________35
CONCLUSIONS__________________________________________________________40
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Liste des figures
Figure 1. Effet du type et de la concentration de cellulose sur la croissance journalière de
Trichoderma - milieu V-8 semi-solide. ________________________________________12
Trichoderma - milieu V-8 solide._____________________________________________13
Trichoderma - milieu PDA. _________________________________________________14
Trichoderma - milieu V-8 solide sans CaCO3. __________________________________15
Trichoderma - milieu eau et agar. ____________________________________________16
Figure 6. Effet d’une plus grande concentration de cellulose sur la croissance journalière de
Trichoderma - milieu V-8 solide sans CaCO3. __________________________________17
Trichoderma - milieu PDA + jus V-8. _________________________________________17
Trichoderma - milieu V-8 semi-solide sans CaCO3. _____________________________18
Trichoderma - milieu ½ PDA + jus V-8. _______________________________________19
Figure 10. Effet du type, de la concentration de cellulose et de la source d’hydrate de carbone
sur la croissance journalière de Trichoderma – milieu PDA + 200 ml jus V-8. _________22
sur la croissance journalière de Trichoderma – milieu PDA + 200 ml jus V-8. _________24
Figure 12. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de concombre en absence d’agents
pathogènes_______________________________________________________________28
Figure 13. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de concombre en présence de
Rhizoctonia solani _________________________________________________________29
Verticillium dahliae________________________________________________________30
Pythium aphanidermatum ___________________________________________________30
Figure 16. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de tomate en absence d’agents
pathogènes_______________________________________________________________33
Figure 17. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de tomate en présence de
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Figure 19. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de tomate en présence de Pythium
ultimum _________________________________________________________________35
Figure 20. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de muflier en absence d’agents
pathogènes_______________________________________________________________36
Figure 21. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de muflier en présence de
Figure 23. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de muflier en présence de Pythium
ultimum _________________________________________________________________38
Liste des tableaux
Tableau 1. Synthèse des observations effectuées lors des différentes expérimentations réalisées
afin d’améliorer le milieu nutritionnel traditionnel employé pour multiplier Trichoderma. .20
Tableau 2. Comparaison des pH obtenus après ajustement ou non et l’ajout d’une source de
glucose ou de sucrose - milieux de culture V-8 semi-solide et ½ PDA + jus V-8..............21
Tableau 3. Effet d’une source d’hydrate de carbone sur la croissance de Trichoderma – milieu
V-8 solide...............................................................................................................................21
afin d’améliorer le milieu nutritionnel traditionnel employé pour multiplier Trichoderma. .23
Tableau 5. Effet d’une source d’hydrate de carbone et de cellulose sur la croissance de
Trichoderma – milieu PDA + jus V-8. .................................................................................25
Tableau 6. Taux de croissance moyen journalier (mm) des champignons pathogènes et de
l’agent de lutte biologique Trichoderma ................................................................................25
Tableau 7. Identification et pondération des critères de décision sélectionnés pour évaluer la
performance de Trichoderma à la confrontation en Pétri contre différents agents pathogènes
................................................................................................................................................26
Tableau 8. Évaluation, in vitro, de l’activité antagoniste de Trichoderma vis-à-vis les agents
pathogènes ..............................................................................................................................27
Tableau 9. Isolement des agents pathogènes et de Trichoderma à partir des systèmes racinaires
présentant ou non des symptômes visuels de la maladie .......................................................31
Tableau 10. Isolement de Trichoderma et des agents pathogènes à partir d’échantillons de sol. .32
Tableau 11. Synthèse des résultats obtenus en serre expérimentale selon la plante, la formulation
du milieu de culture, la concentration de Trichoderma lorsque comparé au témoin négatif. 38
du milieu de culture, la concentration de Trichoderma lorsque comparé au «témoin plante»
................................................................................................................................................39
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Liste des annexes
Annexe 1. Barème de pondération employé lors de l'évaluation de Trichoderma suite au test de
confrontation en Pétri ______________________________________________________41
Annexe 2. Dispositif expérimental utilisé dans la serre expérimentale ____________________43
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1.
AVANT-PROPOS
Le projet comportait trois volets soit 1) amélioration de la qualité nutritionnelle du milieu de
culture employé pour produire Trichoderma, 2) tests de confrontation en Pétri pour comparer
l’agressivité de Trichoderma envers des agents pathogènes lorsque cultivé sur l’ancienne et
nouvelle formulation et 3) visualiser, en serre expérimentale, le comportement de Trichoderma
produit à partir du nouveau milieu de culture, lorsque comparé à l’ancienne formulation et en
présence d’agents pathogènes seuls ou en combinaison.
Ce projet a été réalisé dans le cadre du Programme pour le Fonds végétal géré par le Centre de
Référence en Agriculture et Agroalimentaire du Québec (CRAAQ) et ses partenaires (HortiProtection inc. et l’IRDA).
Le personnel impliqué
Johanne Caron, M.Sc.
Lucie Laverdière, tech.
11, rue des Peupliers
Sainte-Hélène de Breakeyville (Québec)
G0S 1E1
Tél. : (418) 832-0546
Fax : (418) 832-0546
[email protected]
M. Pierre O. Thibodeau, agr., M.Sc.
Institut de recherche et de développement en agroenvironnement (IRDA)
2700, rue Einstein
Sainte-Foy (Québec) G1P 3W8
Tél. : (418) 644-7226
Fax : (418) 644-6855
[email protected]
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2.
INTRODUCTION
Le genre Trichoderma regroupe un ensemble de champignons imparfaits saprophytes qui se
retrouvent couramment dans le sol, sur le bois mort et les débris végétaux. Trichoderma est un
champignon qui décompose naturellement la cellulose et à un degré moindre, la lignine. C’est
également un des agents de lutte biologique le plus connu dans le monde et de nombreux travaux
de recherche sont en cours afin de fournir aux producteurs l’accès à son potentiel antagoniste.
Trichoderma trouverait des applications dans différents secteurs d’activités comme le domaine
des petits fruits et dans le secteur serricole (productions horticoles, plantes ornementales et
pépinières forestières).
La cellulose est le composé organique le plus synthétisé sur la terre. On évalue à plus de 60 à 90
milliards de tonnes par an la quantité produite par les végétaux. C’est également le polymère le
plus utilisé (bois de construction, pâte à papier, fibres textiles, etc….). Au niveau de la
biosphère, les milliards de tonnes de cellulose synthétisée chaque année sont, malgré sa très
grande résistance aux enzymes, dégradés, sinon la biomasse s’accumulerait dangereusement.
Dans les forêts, les champignons, souvent associés à des bactéries, assurent une cellulolyse
considérable et efficace. La cellulose est composée de monomères de glucose, qui, lorsqu’elle est
dégradée, fournit une source de nourriture facilement assimilable par les agents dégradeurs. De
plus, c’est une ressource naturelle importante au Québec à cause de notre économie forestière.
Cette ressource est à la portée de la main, disponible et à bon marché.
Des travaux de recherches portant sur Trichoderma ont été entamés depuis quelques temps et ils
ont permis de démontrer que des souches indigènes de Trichoderma avaient un potentiel de lutte
intéressant contre les agents pathogènes (Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia
solani, Verticillium dahliae, etc…) dans les cultures serricoles (productions légumières et plantes
ornementales) et dans les petits fruits. Afin d’évaluer les aptitudes antagonistes de Trichoderma,
il a fallu mettre au point un mode de production de spores de Trichoderma puisqu’il est
impossible de le multiplier à l’aide d’un fermenteur. Notre façon de produire la biomasse de
Trichoderma est efficace, simple et facilement réalisable. Par contre, dans le but d’améliorer et
de stimuler davantage l’activité antagoniste de Trichoderma et lui permettre d’occuper
prioritairement les niches écologiques avant l’arrivée des agents pathogènes, qui se doit d’être le
créneau de tout agent de lutte biologique, nous désirons raffiner la qualité nutritionnelle de ce
milieu de culture en y amendant une source de cellulose.
L’objectif général du projet était d’améliorer les qualités nutritionnelles du milieu de culture
utilisé pour multiplier Trichoderma, agent de lutte biologique potentiel dans les productions
serricoles et dans les petits fruits, afin de maximiser son potentiel antagoniste. Les objectifs
spécifiques étaient : 1) Déterminer si l’ajout d’une source de cellulose améliore les qualités
nutritionnelles du milieu de culture actuellement utilisé. 2) Déterminer l’effet de la source de
cellulose sur le comportement de Trichoderma lorsqu’il est introduit seul dans un substrat en
présence uniquement de plantes. 3) Déterminer l’effet du nouveau milieu de culture sur le
comportement de Trichoderma lorsqu’il est introduit dans un substrat, en présence d’un agent
pathogène et de plantes sensibles.
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3.
3.1
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Production de la biomasse de Trichoderma
En laboratoire, différentes formes de cellulose (grossières, moyennes et raffinées) ont été
amendées au milieu de culture actuellement utilisé pour multiplier Trichoderma et comparé à
celui-ci. Le champignon a été produit en Pétri. La technique est simple : il suffit de préparer son
milieu de culture et de le stériliser. Par la suite, le milieu est versé dans les Pétri et refroidi. Une
rondelle de spores de Trichoderma est ensuite déposée au centre de la gélose. Avec ce milieu, la
confluence du Pétri est atteinte après six jours.
Le milieu conventionnel était composé des ingrédients suivants (/litre) : 200 ml de V-8 nonmodifié, 3 g de carbonate de calcium (CaCO3), 8 g d’agar et 800 ml d’eau, autoclavé pendant 20
min à 121°C, 15 PSI. Ce milieu est semi-solide et doit être manipulé avec soin. À partir de ce
milieu, différents tests ont été réalisés en laboratoire afin d’améliorer la rapidité de croissance de
Trichoderma soit en ajoutant un ou des ingrédients et/ou en enlevant des ingrédients au milieu
conventionnel. Les différentes celluloses testées étaient : 1) cellulose avec des fibres longues et
grossières (Sigma), 2) cellulose raffinée (microcristalline de 20 mm, Lab Mat) et 3) cellulose
avec des fibres moyennes (Sigma).
Pour tous les tests réalisés, 3 répétitions par type de cellulose et pour chaque concentration ont été
faites. Les Pétri ont été incubés à la noirceur, à la température de la pièce (22 ± 2°C) et deux
mesures de la croissance radiale ont été faites à chaque jour à partir de la deuxième journée
d’ensemencement. La confluence du Pétri est atteinte lorsque la croissance radiale mesurée est
de 85 mm.
3.2
Tests de confrontation en Pétri
Des tests de confrontation entre Trichoderma et les agents pathogènes suivants : Rhizoctonia
solani, Pythium ultimum, P. aphanidermatum et Verticillium dahliae ont été faits in vitro sur
deux milieux de culture : 1) PDA + jus V-8 alimenté de 1.5 % de cellulose raffinée, de 0.1% de
sucrose et d’eau et 2) PDA + jus V-8 alimenté de 1% de cellulose raffinée, de 0.1% de glucose et
d’eau. Le champignon Pyrenochaeta lycopersicis, responsable de la racine liégeuse chez la
tomate, n’a pas fait l’objet de cette étude puisqu’il a été impossible d’obtenir une souche du
champignon.
Le test de confrontation consistait à placer de façon diamétralement opposée sur les milieux
retenus, une souche de Trichoderma et une souche de l’agent pathogène à tester. La présence
d'une zone d'inhibition au point de contact entre les deux champignons a été notée. L'action de
compétition et en particulier l'effet "prédateur" de Trichoderma sur l'agent pathogène, en
présence ou en l'absence d'une zone d'inhibition, a également été considéré lors de ce test.
L’annexe 1 présente les critères de décision utilisés lors de l’étude. Les tests ont été réalisés à la
température de la pièce (22 ±2°C, à la noirceur) et les Pétri ont été répartis aléatoirement. Cinq
répétitions par souche ont été faites. Le résultat espéré était que le nouveau milieu de culture
favorisait la croissance de Trichoderma au détriment des agents pathogènes.
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3.3
Tests en serre expérimentale
En serre expérimentale, la nouvelle formulation pour produire Trichoderma a été comparée à
l’ancienne méthode. Les aptitudes antagonistes de Trichoderma ont également été vérifiées
lorsque confronté à différents agents pathogènes, toujours en comparant la nouvelle et l’ancienne
méthode de production de Trichoderma. Nous avions déterminé, lors d’expériences précédentes,
que Trichoderma devait être introduit au substrat avant l’arrivée des agents pathogènes. Dans
cette expérience, Trichoderma a mélangé au substrat PRO-MIX BX deux semaines avant
l’inoculation des agents pathogènes. Ce délai permet à Trichoderma de se multiplier et de
coloniser les niches écologiques avant les agents pathogènes. Seul un arrosage adéquat a été
maintenu et une fertilisation (20-20-20) aux deux semaines a été faite.
Pour ces expériences, un terreau de culture PRO-MIX BX a été employé et le muflier
(Antirrhinum majus), la tomate (Lycopersicon esculentum) et le concombre (Cucumis sativus),
ont servi de plantes sensibles, cultivées dans des caissettes de fibres biodégradables. Une
caissette de fibres (17 cm x 13 cm) contient environ 1 litre de terreau. Six graines ont été semées
par caissette, pour chaque plante. Trois répétitions ont été réalisées. L'expérience s’est déroulée
en serre (22 ± 2°C (jour) et 18 ± 2°C (nuit); 16:8 L:N). Les plantes ont observées après 60 jours
de croissance. Le dispositif expérimental était un split-plot. Les différents paramètres étudiés
pour chaque système étaient : 1) l’apparence des plantules saines ou malades (jaunissement,
flétrissement, etc...), 2) la croissance de la partie aérienne (hauteur et poids frais), 3) le
pourcentage de germination, 4) le développement du système racinaire, 5) l’observation des
symptômes à la surface du système racinaire (nécrose, déformation, etc....), 6) le ré-isolement de
Trichoderma du substrat et 7) le ré-isolement de Trichoderma et des agents pathogènes des
racines. Les résultats espérés étaient : 1) une efficacité optimale de Trichoderma à la plus faible
concentration et 2) toutes les plantes sensibles réagissent de la même façon. Pour réaliser cette
expérience, les traitements étaient :
J
J
J
J
Nouvelle formulation de Trichoderma à une concentration de 106 spores/ml
Ancienne formulation de Trichoderma à une concentration de 106 spores/ml
Nouvelle formulation de Trichoderma à une concentration de 107 spores/ml
Ancienne formulation de Trichoderma à une concentration de 107 spores/ml
Pour les confrontations entre Trichoderma et les agents pathogènes, les agents pathogènes
suivants ont été retenus selon la culture visée :
Tomate : Pythium ultimum
Rhizoctonia solani
Verticillium dahliae
Concombre : Pythium aphanidermatum
Rhizoctonia solani
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Muflier : Pythium ultimum
Rhizoctonia solani
Les racines présentant ou non des symptômes ont été conservées et déposées sur un milieu de
culture SNA++ (Solution Nutrient Agar avec antibiotiques) ou PYT (P5ARP) pour les Pythium
pour détecter si les agents pathogènes avaient effectivement infecté les plantes. Les Pétri ont été
incubés pendant 5 j à 24 ± 2°C, à la noirceur.
Les échantillons de sol ont été préparés pour obtenir une dilution 1:10 (10 g de terreau dans 100
ml d’eau) et 100 ml ont été étalés sur un milieu de culture SNA++. Les Pétri ont été incubées 3 à
5 j à 24 ± 2°C, à la noirceur. La présence de Trichoderma sur le milieu de culture a alors été
évaluée.
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4.
RÉSULTATS ET DISCUSSION
4.1
4.1.1
Production de la biomasse de Trichoderma
Expérience #1 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu V-8
conventionnel
Dans la littérature, il est mentionné que l’ajout d’une source de cellulose au milieu devrait se
situer entre 1.5 et 2%. Dans un premier temps, des concentrations de cellulose de 0 – 0.5 – 1.0 –
1.35 et 1.5% ont été amendées au milieu V-8 conventionnel (milieu semi-solide). La figure 1
montre les résultats et aucune différence n’a été observée entre les différentes concentrations et
types de cellulose. La croissance maximale a été obtenue après 5 jours. Sur Pétri, la croissance
de Trichoderma a semblé être affectée par la présence de cellulose puisqu’une alternance de
zones concentriques claires et de zones mycéliennes était visible sur la gélose.
#1 - 0
#1 - .5
#1 - 1
#1 - 1.35
#1 - 1.5
#2 - 0
#2 - .5
#2 - 1
#2 - 1.35
#2 - 1.5
#3 - 0
#3 - .5
#3 - 1
#3 - 1.35
#3 - 1.5
Taux de croissance
journalière (mm)
100
80
60
40
20
0
2
3
4
5
Temps (jour)
Trichoderma - milieu V-8 semi-solide.
4.1.2
Expérience #2 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu
conventionnel mais solide
Des concentrations de cellulose de 0 – 0.5 – 1.0 – 1.5 et 2.0% ont été amendées au milieu V-8
conventionnel mais solide (15 g d’agar ont été ajoutés au lieu de 8). Après la stérilisation du
milieu, le pH du témoin était de 7.05 et variait entre 7.01 et 7.17 pour les différentes formes de
cellulose et concentrations. La figure 2 indique les résultats et aucune différence n’a été observée
entre les différentes concentrations et types de cellulose. Par contre, après 4 jours, la croissance
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radiale maximale était atteinte dans les Pétri alimentés de 0.5% de cellulose à fibres moyennes
(#3) et presque atteinte avec 0.5% de la cellulose grossière (#1 - 81 mm). La quantité d’agar
supplémentaire n’a pas permis une meilleure croissance de Trichoderma sauf qu’il est plus facile
de faire les lectures de la croissance radiale.
#1 - 0
#1 - .5
#1 - 1
#1 - 1.5
#1 - 2
#2 - 0
#2 - .5
#2 - 1.5
#2 - 2
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#3 - .5
#3 - 1
#3 - 1.5
#3 - 2
#2 - 1
Taux de croissance
journalière (mm)
100
80
60
40
20
0
2
3
Temps (jour)
4
5
Trichoderma - milieu V-8 solide.
4.1.3
Expérience #3 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu à base de
pomme de terre (PDA)
Des concentrations de cellulose de 0 – 0.5 – 1.0 – 1.5 et 2.0% ont été amendées au milieu PDA
(milieu solide avec 15 g d’agar / litre). Après la stérilisation du milieu, le pH du témoin était de
5.70 et variait entre 5.69 et 5.76 pour les différentes formes de cellulose et concentrations. Ce
milieu est largement utilisé en laboratoire pour la croissance de divers champignons. La figure 3
indique les résultats et aucune différence n’a été observée entre les différentes concentrations et
types de cellulose. Par contre, Trichoderma a atteint la confluence du Pétri après seulement 4
jours. Est-ce que le pH du milieu influencerait le développement du champignon?
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Taux de croissance
journalière (mm)
100
80
60
40
20
0
1
2
3
4
Temps (jour)
Trichoderma - milieu PDA.
4.1.4
Expérience #4 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu V-8 solide sans carbonate de calcium
solide et en absence de carbonate de calcium. Après la stérilisation du milieu, le pH du témoin
était de 4.50 comparativement à 4.44 à 4.65 pour les différentes formes de cellulose et
concentrations. La figure 4 montre les résultats et aucune différence n’a été observée entre les
différentes concentrations et types de cellulose. Par contre, Trichoderma a atteint la confluence
du Pétri après seulement 3 jours. Un milieu acide favorise donc le développement de
Trichoderma. Suite à ces deux tests, le carbonate de calcium (CaCO3), qui avait comme fonction
de rendre le milieu plus basique, a été banni de la recette de base.
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Taux de croissance
journalière (mm)
100
80
60
40
20
0
2
Temps (jour)
3
Trichoderma - milieu V-8 solide sans CaCO3.
4.1.5
Expérience #5 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu eau et agar
Des concentrations de cellulose de 0 – 0.5 – 1.0 – 1.5 et 2.0% ont été amendées au milieu eau et
agar. Il est connu que les milieux pauvres en éléments nutritifs favorisent la reproduction des
spores des champignons afin d’assurer leur survie. C’est ce que nous voulions vérifier avec cette
expérience. Après la stérilisation du milieu, le pH du témoin était de 6.05 comparativement à
6.04 à 6.11 pour les différentes formes de cellulose et concentrations. La figure 5 montre les
résultats et aucune différence n’a été observée entre les différentes concentrations et types de
cellulose. De plus, Trichoderma a atteint la confluence du Pétri après 5 jours et aucune
sporulation n’était encore visible sur le milieu. Dans ce cas, la faible valeur nutritive du milieu
de culture n’a pas favorisé la croissance et la reproduction de Trichoderma.
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Taux de croissance
journalière (mm)
100
80
60
40
20
0
2
3
4
5
Temps (jour)
Trichoderma - milieu eau et agar.
4.1.6
Expérience #6 – Effets d’une plus grande concentration de cellulose au milieu V-8
solide - sans carbonate de calcium
Différentes concentrations de cellulose (0 – 2.0 – 2.5 – 4.0 et 5.0%) ont été amendées au milieu
V-8 solide - sans CaCO3. Après la stérilisation du milieu, le pH du témoin était de 4.44. La
figure 6 montre les résultats et aucune différence n’a été observée entre les différentes
concentrations et types de cellulose. Trichoderma a atteint la confluence du Pétri après
seulement 3 jours. Une plus forte concentration de cellulose n’accélère donc pas la production de
spores de Trichoderma puisque le même résultat avait été obtenu avec des quantités plus faibles
de cellulose (réf. point 4.1.4). Par contre, avec les celluloses grossière (#1) et fine (#2), la
sporulation a été plus intense.
4.1.7
Expérience #7 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu PDA + jus
V-8
Des concentrations de cellulose de 0 – 0.5 – 1.0 – 1.5 et 2.0% ont été amendées au milieu PDA
fait en remplaçant 200 des 1 000 ml d’eau requis par du jus V-8. Après la stérilisation du
milieu, le pH du témoin était de 4.76. La figure 7 montre les résultats et aucune différence n’a
été observée entre les différentes concentrations et types de cellulose. Trichoderma a atteint la
confluence du Pétri après seulement 3 jours. L’apport de fibres par l’ajout de jus V-8
n’influencerait pas le développement de Trichoderma.
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#1 - 5,0
#2 - 0
#2 - 2,0
#2 - 4,0
#2 - 5,0
#3 - 0
#3 - 2,0
#3 - 2,5
#3 - 4,0
#3 - 5,0
#2 - 2,5
Taux de croissance
journalière (mm)
100
90
80
70
60
50
40
2
3
Temps (jour)
Figure 6. Effet d’une plus grande concentration de cellulose sur la croissance journalière de
Trichoderma - milieu V-8 solide sans CaCO3.
Concentration
#1 - 0
#1 - .5
#1 - 1
#1 - 1.5
#1 - 2
#2 - 0
#2 - .5
#2 - 1
#2 - 1.5
#2 - 2
#3 - 0
#3 - .5
#3 - 1
#3 - 1.5
Taux de croissance
journalière (mm)
100
90
80
70
60
50
2
Temps (jour)
3
Trichoderma - milieu PDA + jus V-8.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ
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4.1.8
Expérience #8 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu V-8 semisolide – sans CaCO3
conventionnel semi-solide mais en absence de CaCO3. Après la stérilisation du milieu, le pH
du témoin était de 4.38. La figure 8 montre les résultats et aucune différence n’a été observée
entre les différentes concentrations et types de cellulose.
#1 - 0
#1 - .5
#1 - 1
#1 - 1.5
#1 - 2
#2 - 0
#2 - .5
#2 - 1.5
#2 - 2
#3 - 0
#3 - .5
#3 - 1
#3 - 1.5
#3 - 2
#2 - 1
Taux de croissance
journalière (mm)
100
90
80
70
60
50
2
Temps (jour)
3
Trichoderma - milieu V-8 semi-solide sans CaCO3.
4.1.9
Expérience #9 – Ajouts de différentes concentrations de cellulose au milieu ½ PDA +
jus V-8
Des concentrations de cellulose de 0 – 0.5 – 1.0 – 1.5 et 2.0% ont été amendées au milieu ½
PDA fabriqué avec 200 ml de jus V-8. Après la stérilisation du milieu, le pH du témoin était de
4.63. La figure 9 montre les résultats et aucune différence n’a été observée entre les différentes
concentrations et types de cellulose.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ
Page 18 sur 44
#1 - 0
#1 - .5
#1 - 1
#1 - 1.5
#1 - 2
#2 - 0
#2 - .5
#2 - 1.5
#2 - 2
#3 - 0
#3 - .5
#3 - 1
#3 - 1.5
#3 - 2
#2 - 1
Taux de croissance
journalière (mm)
100
90
80
70
60
50
2
Temps (jour)
3
Trichoderma - milieu ½ PDA + jus V-8.
Suite à ces différents tests, il est clairement apparu que le carbonate de calcium devait être
éliminé du milieu, que des concentrations plus élevées de cellulose n’étaient pas plus
avantageuses et qu’un milieu solide permettait une meilleure croissance que le milieu semiliquide. De tous ces tests, le temps de croissance a pu être raccourci de 2 jours, ce qui est nonnégligeable. Par contre, les essais réalisés ne permettaient pas encore de déterminer quel type de
cellulose était la plus efficace, ni à quelle concentration. Le tableau 1 schématise les résultats
obtenus lors des différentes expériences. Dans la littérature, il est également recommandé
d’ajouter des substances telles du glucose, sucrose, glycérol, des peptones, etc… afin de stimuler
le développement de Trichoderma. Par contre, ces substances ne doivent pas dépasser 10% de la
concentration de cellulose présente et idéalement, le pH doit être maintenu entre 3 et 3.5. Les
tests qui ont le mieux réussi (en gras dans le tableau 1) ont été repris en ajoutant une dose de
sucrose ou de glucose puisque ce sont deux ingrédients peu coûteux.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ
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afin d’améliorer le milieu nutritionnel traditionnel employé pour multiplier Trichoderma.
Milieu de culture avec
présence de cellulose
Nombre de jours pour
atteindre la croissance
radiale maximale en Pétri
V-8 semi-solide avec CaCO3
5
V-8 solide avec CaCO3
5
Eau + agar
5
PDA
4
V-8 solide sans CaCO3 et
concentration +++ de cellulose
V-8 semi-solide sans CaCO3
3
V-8 solide sans CaCO3
3
PDA + jus V-8 sans CaCO3
3
½ PDA + jus V-8 sans CaCO3
3
3
croissance radiale moyenne
après 2 jours (mm)
rep 1
rep 2
rep 3
--------50
52
51
54
54
55
54
54
54
58
59
58
50
47
48
Légende :
--- : n / a car vérifié seulement avec ceux qui ont atteint la croissance radiale maximale après 3 jours
4.1.10 Expérience #10 – Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu V-8 semi-solide et au
milieu ½ PDA + jus V-8
Du glucose (0.1%) ou du sucrose (0.1%) a été amendé seul au milieu V-8 semi-solide et au
milieu ½ PDA + 200 ml de jus V-8 afin de vérifier leur action sur la croissance de Trichoderma.
Après la stérilisation, le pH a été ajusté entre 3 et 3.5 pour la moitié des Pétri de chaque système.
Le tableau 2 résume les résultats obtenus pour les pH et indique la croissance radiale obtenue
après 2 j; le champignon ayant atteint la confluence du Pétri au troisième jour. Trichoderma a eu
une meilleure croissance sur le milieu où le pH n’était pas ajusté et la croissance a été légèrement
supérieure avec la source de sucrose. Sur milieu V-8 semi-solide, la croissance était plus diffuse
que sur le milieu ½ PDA + jus V-8.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ
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Tableau 2. Comparaison des pH obtenus après ajustement ou non et l’ajout d’une source de
glucose ou de sucrose - milieux de culture V-8 semi-solide et ½ PDA + jus V-8.
Milieu de culture SANS
cellulose
V-8 semi-solide + glucose
V-8 semi-solide + sucrose
½ PDA + jus V-8 + glucose
½ PDA + jus V-8 + sucrose
pH normal / croissance
radiale moyenne après 2 j
pH ajusté / croissance
radiale moyenne après 2 j
écart de
pH
4.45
47
3.29
41
1.16
4.44
47
3.41
40
1.03
4.68
48
3.48
40
1.20
4.66
52
3.41
40
1.25
4.1.11 Expérience #11 – Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu V-8 solide
Du glucose (0.1%) ou du sucrose (0.1%) a été amendé seul au milieu V-8 solide afin de vérifier
leur action sur la croissance de Trichoderma. Le pH n’a pas été ajusté. Même s’il n’y a pas de
différence significative entre les deux sources de sucres, les résultats obtenus avec le sucrose sont
encore légèrement supérieurs à ceux obtenus avec le glucose (tab. 3). La vitesse de croissance est
un paramètre important dans le choix d’un agent de lutte biologique afin de favoriser son
installation et en ce sens, le sucrose permettrait une installation plus rapide de Trichoderma que
le glucose.
Tableau 3. Effet d’une source d’hydrate de carbone sur la croissance de Trichoderma – milieu
V-8 solide.
Milieu de culture
SANS cellulose
V-8 solide + glucose
V-8 solide + sucrose
croissance radiale
après 1 j
croissance radiale
après 2 j
croissance radiale
après 3 j
20
49
85
23
52
85
d’une source de cellulose
Du glucose (0.1%) ou du sucrose (0.1%) et différentes sources et concentrations de cellulose ont
été amendés au milieu PDA + 200 ml de jus V-8 afin de vérifier leur action sur la croissance de
Trichoderma. Le pH n’a pas été ajusté. La figure 10 montre les résultats obtenus. Même s’il n’y
a pas de différence significative entre les deux sources de sucres, les résultats obtenus avec le
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ
Page 21 sur 44
sucrose sont encore légèrement supérieur à ceux obtenus avec le glucose (fig. 10). La cellulose
grossière (#1) a toujours donné des résultats inférieurs à ceux obtenus avec les celluloses
raffinées (#2) et de fibres moyennes (#3). Pour les tests subséquents, elle a été abandonnée.
Le tableau 4 résume le comportement de Trichoderma, sur différents milieux, lorsqu’il croît en
présence d’une source de glucose ou de sucrose. Suite à ces tests, le milieu PDA + Jus V-8 offre
les meilleures conditions de croissance pour Trichoderma. C’est ce milieu qui a été retenu et il a,
par la suite, été testé à avec différentes concentrations des celluloses #2 (raffinée) et #3
(moyennes).
Taux de croissance
journalière (mm)
2 j-g
3 j-g
2 j-s
3 j-s
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
#1 - #1 - #1 - #1 - #1 - #2 - #2 - #2 - #2 - #2 - #3 - #3 - #3 - #3 - #3 0 .5
1 1.5 2
0 .5
1 1.5 2
0 .5
1 1.5 2
Concentration (%) et type de cellulose
sur la croissance journalière de Trichoderma – milieu PDA + 200 ml jus V-8.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ
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afin d’améliorer le milieu nutritionnel traditionnel employé pour multiplier Trichoderma.
Milieu de culture SANS
cellulose
V-8 semi-solide + glucose
Nombre de jours pour
atteindre la croissance
radiale maximale en Pétri
3
V-8 semi-solide + sucrose
3
½ PDA + Jus V-8 + glucose
3
½ PDA + Jus V-8 + sucrose
3
PDA + Jus V-8 + glucose
3
PDA + Jus V-8 + sucrose
3
V-8 solide + glucose
3
V-8 solide + sucrose
3
croissance radiale moyenne
après 2 jours (mm)
48
45
48
46
46
48
47
50
46
53
51
52
56
57
57
61
60
63
50
48
48
52
51
53
d’une source de cellulose
Du glucose (0.1%) ou du sucrose (0.1%) et deux sources et différentes concentrations de
cellulose ont été amendées au milieu PDA + 200 ml de jus V-8 afin de vérifier leur action sur la
croissance de Trichoderma. Six répétitions par traitement ont été faites. Le pH n’a pas été
ajusté. La figure 11 montre les résultats obtenus. Même s’il n’y a pas de différence significative
entre les deux sources de sucres, les résultats obtenus avec le glucose sont encore légèrement
supérieur à ceux obtenus avec le sucrose (fig. 11). L’ajout d’une source de sucre au milieu ne
stimule pas toujours Trichoderma comme en fait foi la figure 11. Lorsque du glucose ou du
sucrose est ajouté en absence de cellulose, la croissance de Trichoderma est moindre dans
certains cas. Avec la cellulose #2, le sucrose donne de meilleurs résultats que le glucose sauf
avec 1 et 2% tandis qu’avec la cellulose #3, c’est le glucose qui donne de meilleurs résultats sauf
à 1.5%. Visuellement sur les Pétri, le témoin sucrose (#3-0) avait une sporulation dense tout
comme les traitements #2g - 1% et #2s – 1.5%. Suite à ce test, les trois traitements suivants ont
été retenus : cellulose #2 à 1% + 0.1% glucose; cellulose #2 à 1.5% + 0.1% sucrose et
cellulose #3 à 1.5% + 0.1% sucrose. Ils ont fait l’objet d’un autre test.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ
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Taux de croissance
journalière (mm)
2 j-g
3 j-g
2 j-s
3 j-s
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
#2 - 0 #2 - .5 #2 - 1 #2 - #2 - 2 #3 - 0 #3 - .5 #3 - 1 #3 - #3 - 2 Tem
1.5
1.5
PDAV8
Concentration (%) et type de cellulose
sur la croissance journalière de Trichoderma – milieu PDA + 200 ml jus V-8.
4.1.14 Expérience #14 – Ajouts de glucose ou de sucrose au milieu PDA + jus V-8 alimenté de
la cellulose raffinée (#2) ou à fibres moyennes (#3)
Les traitements 1) cellulose #2 à 1% + 0.1% glucose, 2) cellulose #2 à 1.5% + 0.1% sucrose et 3)
cellulose #3 à 1.5% + 0.1% sucrose ont été étudiés plus attentivement sur un milieu PDA + 200
ml de jus V-8. Six répétitions par traitement ont été faites. Le pH n’a pas été ajusté. Le tableau
5 montre les résultats obtenus. Visuellement sur les Pétri, la sporulation était moindre dans le
traitement #3 (1.5%) – sucrose que dans le témoin sucrose et le traitement #2 (1.5%) + sucrose.
Pour les tests de confrontation en Pétri, les traitements cellulose raffinée (#2 - 1.5%) + sucrose et
cellulose raffinée (#2 - 1%) + glucose ont été conservés.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ
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Tableau 5. Effet d’une source d’hydrate de carbone et de cellulose sur la croissance de
Trichoderma – milieu PDA + jus V-8.
Milieu de culture et
type de cellulose
croissance radiale croissance radiale croissance radiale croissance radiale
après 2 j
après 3 j
après 2 j
après 3 j
glucose
glucose
sucrose
sucrose
Témoin PDA + jus V8
47
85
47
85
46
85
47
85
47
85
---
---
cellulose #2 – 1.5% - s
---
---
50
85
cellulose #3 – 1.5% - s
---
---
44
85
Tem
cellulose #2 – 1% - g
4.2
4.2.1
Test de confrontation en Pétri
Expérience #1 - Tests de confrontation entre Trichoderma et les agents pathogènes sur
deux milieux de culture
Dans un premier temps, la vitesse de croissance des agents pathogènes et de Trichoderma a été
déterminée et elle est présentée au tableau 6. Trichoderma atteint la confluence du Pétri 3 jours
après son ensemencement et son taux de croissance moyen journalier est de 14,2 mm. Pythium
croit au même rythme que Trichoderma. Rhizoctonia solani doit être déposé sur le milieu de
culture 1 journée avant Trichoderma tandis que Verticillium dahliae le sera 18 jours avant
Trichoderma. Cet agent pathogène pousse très lentement in vitro ce qui pourrait favoriser l’agent
de lutte biologique Trichoderma dans le contrôle de ces maladies. Par contre, dans le cas de
Pythium et R. solani, la lutte devrait être plus intense puisqu’ils ont un taux de croissance
similaire. Dans ces cas, la colonisation rapide des niches écologiques sera déterminante.
Tableau 6. Taux de croissance moyen journalier (mm) des champignons pathogènes et de
l’agent de lutte biologique Trichoderma.
Champignon
Trichoderma
Pythium ultimum
Pythium aphanidermatum
Rhizoctonia solani
Croissance radiale
moyenne journalière
(mm)
14.2
14.2
14.2
10.7
2.0
Dépôt de l’agent pathogène (# jour)
sur le milieu de culture AVANT
Trichoderma
0
0
0
1
18
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ
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Suite aux confrontations, Trichoderma a fait l'objet d'une "analyse multicritère simple". Au total,
sept critères de décision qualitatifs et quantitatifs ont été déterminés et ces critères ont permis
d'évaluer la performance de Trichoderma à la confrontation. Le tableau 7 présente les critères de
décision retenus pour l'analyse.
Tableau 7. Identification et pondération des critères de décision sélectionnés pour évaluer la
performance de Trichoderma à la confrontation en Pétri contre différents agents pathogènes.
Intervalle des poids
0 à 20
0à9
0à5
0à2
0à1
0à4
0à3
Critères de décision*
Temps (jour) requis pour obtenir la zone de contact entre les deux
champignons
La croissance radiale mesurée (mm) à partir du centre de la
pastille de gélose de Trichoderma jusqu'à la zone de contact
Zone d'inhibition entre les deux champignons (intensité de la
coloration)
Sporulation différente et/ou dense au contact entre les deux
champignons
Zone claire au contact entre les deux champignons
Envahissement de Trichoderma sur l'agent phytopathogène ou
vice et versa
Intensité de la sporulation de Trichoderma sur l'agent
phytopathogène ou vice et versa
Remarques :
* Consulter l'annexe 1 pour connaître le barème de pondération employé lors de l'évaluation.
Cette pondération a été faite de façon à favoriser l’action de Trichoderma sur les agents
pathogènes. Le poids le plus grand étant celui du meilleur lors de la confrontation. La
confrontation a eu lieu en tenant compte de la vitesse de croissance des champignons, vitesse
déterminée lors du test précédent. Lors de ces tests in vitro, il apparaît que Trichoderma a une
bonne activité antagoniste contre les champignons étudiés (tab. 8). Le milieu cellulose #2 – 1.5%
+ sucrose favorise le plus Trichoderma. C’est le milieu qui a été retenu pour les tests en serre
expérimentale. La source de sucre seule n’influence pas réellement le comportement et la
croissance des champignons étudiés.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ
Page 26 sur 44
Tableau 8. Évaluation, in vitro, de l’activité antagoniste de Trichoderma vis-à-vis les agents
pathogènes.
Confrontation
PDA(V-8)
T20 vs P. ultimum
T20 vs
P. aphanidermatum
T20 vs R. solani
T20 vs V. dahliae
4.3
+22
+22
+23
+20
Milieu de culture
PDA(V-8)
PDA(V-8)
cellulose #2 cellulose #2
+g
+s
– 1% + g
– 1.5% + s
+22
+22
+21
+23
+22
+22
+19
+22
+23
+20
+24
+20
+22
+25
+25
+25
Tests en serre expérimentale
Trichoderma titrait soit pour 106 ou 107 spores/ml tandis que pour les agents pathogènes, les
concentrations étaient de 3 x 104 (R. solani), 1,6 x 105 (V. dahliae), 2 x 105 (P. aphanidermatum)
et 5 x 105 spores/ml (P. ultimum). Le dispositif expérimental est présenté à l’annexe 2.
Les remarques suivantes doivent être considérées : 1) La hauteur minimale et maximale ont été
déterminées lors de l’évaluation des plants mais afin de mieux visualiser l’influence des
traitements sur ce paramètre de croissance, une hauteur moyenne est considérée. 2) Le poids sec
de la masse aérienne des plants n’a pas été évaluée, tel que prévu au projet, considérant que dans
la grande majorité des cas, le poids sec représente 10% de la masse foliaire humide et ne permet
pas de déterminer de différence significative par rapport à cette dernière. De plus, au moment de
la récolte, le séchoir était hors d’usages.
Le tableau 9 présente les agents pathogènes et Trichoderma isolés à partir des racines
échantillonnées tandis que le tableau 10 indique si Trichoderma a été isolé à partir du sol ramassé
lors de l’évaluation des plantes. Des racines ont été échantillonnées même si aucun symptôme
n’était visible sur le système racinaire. En général, hormis les symptômes attribués à la fonte des
semis, peu de symptômes ont été observés sur les racines des plantes, la plupart de ces cas, un
jaunissement des racines était noté (qui peut également être attribué à l’asphyxie racinaire).
Trichoderma a été observé dans tous les échantillons de sol mis sur milieu de culture (tab. 10).
4.3.1
Concombre
Concombre vs Trichoderma
Lorsque Trichoderma est amendé au substrat en l’absence d’agents pathogènes, il permet une
meilleure croissance que le témoin dans tous les traitements et pour tous les paramètres de
croissance. Ce fait est particulièrement important dans les traitements où Trichoderma a été
cultivé sur le nouveau milieu de culture à base de cellulose (sur la figure = N) et à une dose de
106 ou 107 cfu/ml (fig. 12). De ce fait, nous pouvons supposer que des résultats intéressants
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ
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puissent être obtenus à une concentration de Trichoderma de 106 cfu/ml, ce qui confirme des
résultats obtenus antérieurement dans un autre projet.
Hauteur moy (mm)
200
% germination
162
155
143
Poids frais (g)
169
149
150
100
94
100
43
39
50
100
100
46
100
43
48
0
Concombre
T20-106-A
T20-106-N
T20-107-A
T20-107-N
Traitements
Figure 12. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de concombre en absence
d’agents pathogènes. T20 = Trichoderma MAUL-20; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 =
concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture à base
de cellulose.
Concombre vs R. solani
Le témoin négatif R. solani a donné des résultats légèrement inférieurs au «témoin plante».
Pourtant à l’isolement des racines, R. solani a été détecté en grande quantité sur les milieux de
culture, tout comme Trichoderma (tab. 9). La souche de R. solani n’a peut-être pas eu le temps
de démontrer pleinement son agressivité sur les racines des plants de concombre. De ce fait, tous
les traitements ont donné des résultats supérieurs lorsque comparé au témoin R. solani. Si R.
solani a été actif dans le substrat, nous pouvons supposer que Trichoderma a permis d’avoir une
croissance normale des plants puisque des résultats égaux ou légèrement supérieurs à ceux
obtenus avec la plante seule ont été enregistrés. Lorsque Trichoderma est amendé au substrat
contaminé par R. solani à une concentration de 107 cfu/ml, les résultats sont légèrement
supérieurs à tous les traitements. Le traitement «Rs-107-N» ayant un faible avantage sur
l’ancienne formulation du milieu de culture «Rs-107-A» (fig. 13).
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ
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Hauteur moy (mm)
175
143
147
150
125
100
75
50
% germination
39
100
100
94
150
143
129
94
Poids frais (g)
100
100
41
42
42
37
153
44
25
0
Concombre
Rs
Rs-106-A
Rs-106-N
Rs-107-A
Rs-107-N
Traitements
Rhizoctonia solani. Rs = Rhizoctonia solani; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 =
de cellulose.
Concombre vs V. dahliae
Le témoin négatif V. dahliae a donné des résultats inférieurs au «témoin plante» malgré le fait
qu’à l’isolement des racines, V. dahliae avait été détecté dans seulement 3 des 5 traitements (tab.
9). Tous les traitements ont donné des résultats supérieurs lorsque comparé au témoin V. dahliae
et au «témoin plante» sauf dans le cas des traitements impliquant la concentration 107 cfu/ml.
Les résultats sont alors égaux au «témoin plante» (fig. 14). La présence de Trichoderma a été
notée dans tous les traitements lors de l’isolement (sauf dans le traitement témoin). Le traitement
«Vd-106-N» semble assuré un bon contrôle de V. dahliae sur les racines des plants de
concombre.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ
Page 29 sur 44
Hauteur moy (mm)
% germination
250
209
200
143
152
150
141
119
94
94
100
94
39
50
0
Poids frais (g)
Concombre
Vd
Vd-106-A
100
100
83
47
43
37
142
Vd-106-N
44
Vd-107-A
39
Vd-107-N
Traitements
Verticillium dahliae. Vd = Verticillium dahliae; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 =
de cellulose.
Concombre vs P. aphanidermatum
Le témoin négatif P. aphanidermatum a donné des résultats légèrement inférieurs au «témoin
plante», ce qui peut s’expliquer par l’absence ou la faible agressivité de P. aphanidermatum dans
le sol puisque lors de l’isolement des racines, Pythium a été détecté dans seulement 1 des 5
traitements (tab. 9). De ce fait, tous les traitements ont donné des résultats supérieurs aux
témoins V. dahliae et au «témoin plante» (fig. 15). La concentration «Pa-106-N» semble assurer
un meilleur contrôle du champignon que les trois autres traitements.
Hauteur moy (mm)
% germination
200
143
100
50
94
168
153
139
150
100
78
39
Poids frais (g)
94
47
34
154
151
94
45
83
47
35
0
Concombre
Pa
Pa-106-A
Pa-106-N
Pa-107-A
Pa-107-N
Traitements
Pythium aphanidermatum. P.a. = Pythium aphanidermatum; 106 = concentration de 106 cfu/ml;
107 = concentration de 107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture
à base de cellulose.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ
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Tableau 9. Isolement des agents pathogènes et de Trichoderma à partir des systèmes racinaires
présentant ou non des symptômes visuels de la maladie.
Traitements
Témoin
Trichoderma
Trichoderma -106-A
Trichoderma -106-N
Trichoderma -107-A
Trichoderma -107-N
R. solani
R. solani -106-A
R. solani -106-N
R. solani -107-A
R. solani 107-N
V. dahliae
V. dahliae -106-A
V. dahliae -106-N
V. dahliae -107-A
V. dahliae -107-N
P. ultimum
P. ultimum -106-A
P. ultimum -106-N
P. ultimum 107-A
P. ultimum -107-N
P. aphanidermatum
P. aphanidermatum -106-A
P. aphanidermatum -106-N
P. aphanidermatum 107-A
Concombre
--T20
T20
T20
T20
T20
R.s. + F
T20 + R.s. + F
T20 + R.s. + F
T20 + R.s. + F
T20 + R.s. + F
V.d.
T20 + V.d.
T20 + V.d.
T20 + F
T20
n/a
n/a
n/a
n/a
n/a
F
--F
P.a. + F
F
Plantes
Tomate
--T20
T20
T20
T20
T20
R.s.
T20 + R.s.
T20 + R.s.
T20 + R.s.
T20 + R.s.
V.d.
------T20
P.u.
--P.u.
--P.u.
n/a
n/a
n/a
n/a
n/a
Muflier
--T20
T20
T20
T20
T20
R.s.
T20 + R.s.
T20 + R.s.
T20 + R.s.
T20 + R.s.
V.d.
--------P.u.
--P.u.
--P.u.
n/a
n/a
n/a
n/a
n/a
Légende
n / a = ne s’applique pas
--- = aucune détection du champignon recherché
R.s. = Rhizoctonia solani
V.d. = Verticillium dahliae
P.u. = Pythium ultimum
P.a. = Pythium aphanidermatum
F = Fusarium spp.
T20 = Trichoderma MAUL-20
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ
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Tableau 10. Isolement de Trichoderma et des agents pathogènes à partir d’échantillons de sol.
Traitements
Témoin
Trichoderma
Trichoderma -106-A
Trichoderma -106-N
Trichoderma -107-A
Trichoderma -107-N
R. solani
R. solani -106-A
R. solani -106-N
R. solani -107-A
R. solani 107-N
V. dahliae
V. dahliae -106-A
V. dahliae -106-N
V. dahliae -107-A
V. dahliae -107-N
P. ultimum
P. ultimum -106-A
P. ultimum -106-N
P. ultimum 107-A
P. ultimum -107-N
P. aphanidermatum
P. aphanidermatum -106-A
P. aphanidermatum 107-A
Concombre
--T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
n/a
n/a
n/a
n/a
n/a
T20
T20
T20
T20
T20
Plantes
Tomate
--T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
n/a
n/a
n/a
n/a
n/a
Muflier
--T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
T20
n/a
n/a
n/a
n/a
n/a
Légende
n / a = ne s’applique pas
--- = aucune détection du champignon recherché
P. aphanidermatum = Pythium aphanidermatum
T20 = Trichoderma MAUL-20
4.3.2
P. ultimum = Pythium ultimum
R. solani = Rhizoctonia solani
V. dahliae = Verticillium dahliae
Tomate
Tomate vs Trichoderma
Lorsque Trichoderma est amendé au substrat en l’absence d’agents pathogènes, il permet une
bien meilleure croissance des plants que la plante seule et particulièrement dans le traitement où
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Trichoderma a été cultivé sur le nouveau milieu de culture à base de cellulose (sur la figure =
N) et appliqué à une concentration de 106 cfu/ml (fig. 16). Par contre, le pourcentage de
germination des plantes est inférieur au «témoin plante» dans tous les traitements et
particulièrement dans le traitement «T20-107-A».
Hauteur moy (mm)
200
150
100
160
% germination
161
50
89
78
19
19
151
146
132
94
Poids frais (g)
83
72
25
25
22
0
Tomate
T20-106-A
T20-106-N
T20-107-A
T20-107-N
Traitements
Figure 16. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de tomate en absence d’agents
pathogènes. T20 = Trichoderma MAUL-20; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 =
de cellulose.
Tomate vs R. solani
Dans le témoin négatif R. solani, le champignon a été très actif, affectant grandement le
développement des plants lorsque comparé au «témoin plante». Tous les traitements ont donné
des résultats supérieurs au témoin R. solani mais inférieurs au «témoin plante». La souche de R.
solani a été particulièrement active sur les plants de tomate causant 11 cas de fontes de semis,
particulièrement dans l’ancienne formulation du milieu de culture (sur la figure = A) et dans le
témoin. Trichoderma a eu à combattre activement cet agent pathogène mais aucune perte de
plants attribuables à Rhizoctonia n’a été enregistrée dans le traitement «Nouvelle formulation du
milieu de culture (cellulose)», ce qui est de bon augure (fig. 17). Par contre, le pourcentage de
germination a été assez faible dans tous les traitements lorsque comparé au «témoin plante».
Lors de l’isolement des racines, Trichoderma et R. solani ont été observés abondamment sauf que
Trichoderma semble avoir de la difficulté à lutter efficacement contre cet agent pathogène.
Cas de fontes de semis observés sur les plants de tomate
Tomate de serre :
L 3 cas dans le traitement R. solani - ancienne formulation @ 106 spores/ml
L 4 cas dans le traitement R. solani - ancienne formulation @ 107 spores/ml
L 4 cas dans le traitement témoin R. solani
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Hauteur moy (mm)
150
% germination
132
120
Poids frais (g)
125
94
96
93
90
73
54
60
0
22
19
30
44
1
Tomate
RS
39
28
22
9
1
Rs-106-A
Rs-106-N
5
2
Rs-107-A
Rs-107-N
Traitements
de cellulose.
Tomate vs V. dahliae
Tous les résultats sont similaires au témoin V. dahliae et légèrement supérieurs au «témoin
plante», la souche de V. dahliae n’ayant sûrement pas été très active dans le sol puisque aucune
différence n’a été enregistrée entre les traitements. Selon le tableau 9, Verticillium a été observé
uniquement dans le témoin V. dahliae et même Trichoderma n’a pas ou peu été observé.
Hauteur moy (mm)
160
120
144
132
94
% germination
149
141
89
Poids frais (g)
89
146
94
83
80
56
40
0
150
19
Tomate
Vd
27
21
19
Vd-106-A
Vd-106-N
16
Vd-107-A
21
Vd-107-N
Traitements
de cellulose.
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Tomate vs P. ultimum
Pythium ultimum a été isolé des racines du témoin P. ultimum et des traitements «Pu-106-N» et
«Pu-107-N». Hors, lorsqu’on consulte la figure 19, ce sont les 3 traitements qui ont le mieux
fonctionné. Pythium aurait-il eu un effet de stimulateur de croissance dans ces cas? Est-ce l’effet
de la nouvelle formulation du milieu de culture? Ou un effet de Trichoderma sur la plante
puisque ces valeurs se rapprochent de celles observées lorsque seul Trichoderma est ajouté au
substrat (fig. 16). Par contre, tous les traitements ont été supérieurs au «témoin plante».
Hauteur moy (mm)
200
150
% germination
170
94
100
162
149
132
50
154
147
94
78
72
20
19
Poids frais (g)
89
61
17
18
24
28
0
Tomate
Pu
Pu-106-A
Pu-106-N
Pu-107-A
Pu-107-N
Traitements
Pythium ultimum. Pu = Pythium ultimum; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 =
de cellulose.
4.3.3
Muflier
Muflier vs Trichoderma
Trichoderma ne semble pas autant stimuler la croissance du muflier lorsque comparé au
concombre (fig. 12) et à la tomate (fig. 16), et même à la concentration de 106 cfu/ml, les
résultats sont inférieurs ou égaux au témoin plante. Pourtant, lorsqu’on consulte le tableau 9,
Trichoderma était présent au niveau racinaire. Le traitement «T20-107-A» semble le plus
efficace.
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Hauteur moy (mm)
% germination
Poids frais (g)
120
99
84 89
100
74
80
85 83
72
97
89
78
60
40
5
20
0
Muflier
9
5
T20-106-A
T20-106-N
9
8
T20-107-A
T20-107-N
Traitements
Figure 20. Effet de Trichoderma sur la croissance des plants de muflier en absence d’agents
pathogènes. T20 = Trichoderma MAUL-20; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 =
de cellulose.
Muflier vs R. solani
Sur le muflier, R. solani semble actif tandis que le pouvoir de compétition de Trichoderma envers
Rhizoctonia semble amenuisé car dans tous les traitements, les résultats sont inférieurs au témoin
R. solani et au «témoin plante», laissant présager une forte agressivité de R. solani sur les racines
des plants. Pourtant, le tableau 9 spécifie une présence importante de R. solani et de
Trichoderma lors de l’isolement racinaire. Peut-être que Trichoderma a lutté activement contre
Rhizoctonia, au détriment de protéger les racines?
Hauteur moy (mm)
100
84 89
76
80
% germination
Poids frais (g)
83
70
67
63
61
61
72
72
62
60
40
20
5
2
4
5
3
4
0
Muflier
RS
Rs-106-A Rs-106-N
Rs-107-A Rs-107-N
Traitements
de cellulose.
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Muflier vs V. dahliae
Verticillium a semblé agir seulement dans le témoin V. dahliae car dans les autres traitements, les
résultats sont supérieurs au témoin V. dahliae et égaux ou supérieurs au «témoin plante». De
plus, la présence de V. dahliae a été observée uniquement dans le témoin lors des isolements
racinaires (tab. 9). Dans ces cas, on peut supposer une action de Trichoderma au niveau des
racines pour combattre l’agent pathogène. Par contre, peu de différences ont été obtenues entre
les traitements mais le traitement «Vd-106-N» semble un peu plus efficace que les autres.
Hauteur moy (mm)
120
94
84 89
90
81
73
% germination
96
94
Poids frais (g)
100
89
86
82
89
60
30
0
6
5
Muflier
Vd
10
6
Vd-106-A
Vd-106-N
8
Vd-107-A
5
Vd-107-N
Traitements
de cellulose.Rs = Rhizoctonia solani; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de
107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture à base de cellulose.
Muflier vs P. ultimum
Tous les traitements ont démontré des rendements supérieurs au témoin Pythium. Par contre,
lorsque comparé au «témoin plante», les résultats sont soit inférieurs. Il y a sûrement une lutte
entre les deux antagonistes car les résultats sont quand même supérieurs à ceux obtenus avec le
témoin Pythium sauf que le développement du muflier semble affecté. Des cas de fontes de
semis ont d’ailleurs été notés dans le témoin Pythium et dans la formulation «Pu-106-A».
Cas de fontes de semis observés sur les plants de muflier
Muflier :
L 2 cas dans le traitement témoin Pythium ultimum
L 1 cas dans le traitement P. ultimum - ancienne formulation @ 106 spores/ml
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Hauteur moy (mm)
% germination
Poids frais (g)
120
84 89
83
90
83
77 78
67
81 78
72
72
83
60
30
0
5
Muflier
Pu
Pu-106-A
Pu-106-N
5
6
6
5
4
Pu-107-A
Pu-107-N
Traitements
Pythium ultimum. Pu = Pythium ultimum; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 =
de cellulose.Rs = Rhizoctonia solani; 106 = concentration de 106 cfu/ml; 107 = concentration de
107 cfu/ml; A = ancien milieu de culture et N = nouveau milieu de culture à base de cellulose.
Les tableaux 11 et 12 résument les résultats obtenus lorsqu’on compare les traitements effectués
au témoin négatif ou au «témoin plante». Trichoderma devrait être produit sur un milieu de
culture contenant de la cellulose (milieu de culture sous la Nouvelle formulation) et la
concentration 106 cfu/ml devrait être privilégiée. Dans le cas des tandems «Tomate – R. solani»
et «Muflier – Pythium», les résultats négatifs obtenus lorsque comparé au témoin plante suggère
que Trichoderma a de la difficulté à lutter contre l’agent pathogène et que la lutte s’effectue au
détriment de la plante puisque que son développement est ralenti.
du milieu de culture, la concentration de Trichoderma lorsque comparé au témoin négatif.
Agent biologique
ou pathogène
Trichoderma
R. solani
V. dahliae
P. ultimum ou
aphanidermatum
Légende
Concombre
Tomate
Muflier
+++ 106 N
+++ 107 N
+++ 106 N
+++ 106 N
+++ 106 N
+++ 106 N
-----
+++ 107 A
--+++ 106 N
+++ 106 N
+++ = Les traitements ont donné des résultats supérieurs au témoin négatif
--- = Les traitements ont donné des résultats inférieurs au témoin négatif
106 = centration de Trichoderma
N = Nouveau milieu de culture à base de cellulose
A = Ancienne formulation du milieu de culture
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ
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du milieu de culture, la concentration de Trichoderma lorsque comparé au «témoin plante».
Agent biologique
ou pathogène
Trichoderma
Concombre
Tomate
Muflier
+++
+++
+++
R. solani
+++
---
---
V. dahliae
+++
---
+++
P. ultimum ou
aphanidermatum
+++
+++
---
Légende
+++ = Les traitements ont donné des résultats supérieurs au «témoin plante»
--- = Les traitements ont donné des résultats inférieurs au «témoin plante»
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5.
CONCLUSIONS
La composition d’un milieu de culture pour cultiver les champignons est un facteur important
puisqu’elle influence et la quantité et la qualité des spores. Pour Trichoderma, il était donc
primordial d’améliorer la qualité nutritionnelle du milieu de base employé pour sa multiplication.
Suite à ce projet, il apparaît que Trichoderma peut être cultivé en ajoutant au milieu de culture
une source de cellulose. En se dégradant, celle-ci libère du glucose qui est facilement assimilable
pour l’agent dégradeur, dans ce cas-ci, Trichoderma. La cellulose raffinée (microcristalline; 22
microns) a fourni de meilleures conditions de croissance que les celluloses de type grossière ou
moyenne. En incorporant également une source de sucre au milieu de base, Trichoderma semble
bénéficier d’une source nutritive supplémentaire, le rendant encore plus performant. La
modification du milieu de culture de base a également permis de supprimer la source de
carbonate de calcium qui se trouvait à élever le pH et à ralentir le développement de
Trichoderma. Ainsi, le nouveau milieu nutritif pour cultiver Trichoderma se compose de :
PDA (15 g / l), 200 ml de jus V8 non-modifié, 1,5% de cellulose de type raffinée, 0,1% de
sucrose et de 800 ml d’eau distillée par litre de milieu.
Selon la plante, Trichoderma est efficace contre la majorité des agents pathogènes testés in vitro
et en serre expérimentale. Trichoderma croît également très rapidement sur un milieu de culture,
ce qui devrait l’avantager lors des confrontations in situ et pour la colonisation rapide des niches
écologiques. Trichoderma devra être ajouté au substrat à une concentration de 106 cfu/g de sol.
Trichoderma, lorsqu’il est ajouté au substrat, n’est pas pathogène pour les plante; il peut même
stimuler le développement de celles-ci lorsqu’il est appliqué à une concentration supérieure à 106
cfu/g de sol.
Pour le producteur, il est plus avantageux de permettre à l’agent de lutte biologique de s’établir à
priori dans les substrats avant l’arrivée des agents pathogènes. En permettant à Trichoderma de
coloniser la rhizosphère en premier lieu, celui-ci pourra créer plus facilement son manchon
protecteur autour du système racinaire empêchant ainsi, aux différents agents pathogènes
potentiels, l’accès aux sites recherchés. Par le fait même, la répression de l’ennemi à combattre
est facilitée. Par contre, dans le cas de Pythium chez le muflier et de Rhizoctonia chez la tomate,
la lutte avec Trichoderma semble plus ardue puisque les traitements ont donné des résultats
inférieurs au «témoin plante» même s’ils avaient été supérieurs lorsque comparé au témoin
négatif. Chez la tomate, la lutte semble également inefficace lorsque Verticillium est présent
tandis que chez le muflier, la même situation est observée avec Rhizoctonia. Dans ces deux cas,
la croissance des plantes est ralentie.
La présence d’un agent de lutte biologique dans un terreau :
§
§
§
§
§
Favorise le développement de la plante;
Assure une protection accrue du système racinaire;
Prévient des pertes de rendement pour le producteur;
Diminue l’utilisation de pesticides chimiques de synthèse utilisés pour combattre les agents
pathogènes;
Réduit la pollution de l’environnement.
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Annexe 1. Barème de pondération employé lors de l'évaluation de Trichoderma suite au test de
confrontation en Pétri.
Critères de décision
1. Temps requis pour obtenir la zone de contact
Temps (jours) 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Poids associé 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9
8
7
6
5
4
3
2
1
2. Mesure (mm) de la zone de contact *
Mesure (mm)
0-10
Poids associé
9
11-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90
8
7
6
5
4
3
2
1
* La croissance radiale mesurée (mm) à partir du centre de la pastille de gélose du Trichoderma
jusqu’à la zone de contact entre les deux champignons (Trichoderma et l'agent pathogène). Le
diamètre d'une boîte de Pétri étant de 85 mm.
3. Zone d’inhibition (intensité de la coloration)**
Coloration
Poids
aucune
0
jaune très pâle - pâle
1
+
2
++
3
+++
4
++++
5
** La présence de la zone d’inhibition entre les deux champignons (Trichoderma et l'agent
pathogène) à l’étude est notée par l’intensité de la coloration à la zone de contact (aucune
coloration à orange en passant par différentes intensités de jaune)
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ
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4. Sporulation dense et/ou
5. Présence ou absence de
différente au contact ***
zone claire au contact
Sporulation
Poids
Zone claire
Poids
aucune
0
aucune
0
sporulation dense ou différente
1
présence
1
sporulation dense et différente
2
*** La sporulation différente au contact se
manifeste par un aspect floconneux des
hyphes de Trichoderma.
6. Envahissement du Trichoderma
7. Intensité de sporulation
sur l'agent pathogène ou vice et versa
Envahissement
Poids
du Trichoderma sur l'agent
pathogène ****
Intensité
Poids
aucun
0
aucune
0
par les côtés
1
faible
1
direct mais limité
2
moyen
2
direct mais intense
3
fort
3
direct mais total
4
**** Le poids associé est négatif quand c’est l'agent pathogène qui envahit Trichoderma.
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Annexe 2. Dispositif expérimental utilisé dans la serre expérimentale
Table 1
Tomate : (1-107 A) (3-106 A) (2-107 N) (T20-106 A) (T20-106 N) (3-106 N) (3-107 A) (1-106
A) (VD) (PU) (2-107 A) (T20-107 A) (T20-107 N) (1-107 N) (2-106 A) (1-106 N) (3-107 N) (1106 N) (RS) (TO)
Muflier : (1-107 A) (3-107 A) (2-107 N) (T20-106 A) (PU) (1-107 N) (3-106 A) (T20-106 N)
(3-107 N) (T20-107 A) (2-107 A) (RS) (3-106 N) (1-106 A) (VD) (MU) (2-106 A) (1-106 N)
(T20-107 N) (1-106 N)
Concombre : (PA) (3-106 N) (CO) (T20-106 N) (T20-107 A) (T20-107 N) (3-106 A) (1-106 A)
(1-107 A) (1-106 N) (3-107 N) (T20-106 A) (2-107 A) (1-106 N) (VD) (2-106 A) (3-107 A) (2107 N) (1-107 N) (RS)
Table 2
Concombre : (2-107 A) (3-106 A) (1-107 N) (2-107 N) (1-106 N) (T20-107 A) (T20-107 N) (3107 A) (T20-106 N) (CO) (T20-106 A) (3-107 N) (2-106 A) (3-106 N) (1-106 A) (RS) (1-106 N)
(1-107 A) (PA) (VD)
Tomate : (T20-107 A) (TO) (1-106 N) (1-107 N) (3-106 N) (PU) (T20-106 A) (T20-107 N) (1107 A) (RS) (2-106 A) (2-107 N) (3-107 N) (1-106 N) (1-106 A) (3-106 A) (VD) (2-107 A) (3107 A) (T20-106 N)
Muflier : (PU) (2-106 A) (1-106 A) (2-107 A) (2-107 N) (1-107 N) (3-107 N) (3-106 N) (RS)
(T20-106 A) (3-107 A) (T20-107 A) (1-106 N) (1-107 N) (T20-107 N) (T20-106 N) (VD) (1-107
A) (MU) (3-106 A)
Table 3
Muflier : (PU) (RS) (1-106 N) (T20-107 A) (3-106 N) (2-106 A) (3-107 N) (T20-106 N) (1-106
A) (T20-106 A) (1-107 N) (3-106 A) (1-107 A) (VD) (1-107 A) (MU) (2-107 N) (T20-107 N) (2107 A) (3-107 A)
Concombre : (2-107 N) (3-107 N) (RS) (T20-106 N) (PA) (1-107 N) (1-106 A) (VD) (2-106 A)
(1-106 N) (2-107 A) (3-106 N) (CO) (3-106 A) (T20-106 A) (T20-107 N) (1-106 N) (1-107 A)
(3-107 A) (T20-107 A)
Tomate : (2-106 A) (RS) (2-107 N) (PU) (1-107 N) (3-106 A) (T20-107 N) (T20-106 N) (1-106
N) (2-107 A) (T20-106 A) (1-106 N) (VD) (1-106 A) (3-107 N) (3-106 N) (T20-107 A) (TO) (1107 A) (3-107 A)
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ
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Légende :
Plantes
Co = concombre
Mu = muflier
To = Tomate
Agents pathogènes
R. s. = Rhizoctonia solani
V. d. = Verticillium dahliae
P. u. = Pythium ultimum
P. a. – Pythium aphanidermatum
système à l’étude
1 = Trichoderma + R. solani
2 = Trichoderma + V. dahliae
3 = Trichoderma + P. ultimum ou P. aphanidermatum
Concentration
106 = 106 spores / ml
107 = 107 spores / ml
A = ancienne formulation
N = nouvelle formulation
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Rapport #202-T - CRAAQ
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Rapport final - Site public du CRAAQ

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