PROCEDURE UTILISATEUR BECKMAN COULTER 5C

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Procédure Workshop HPN NAVIOS
Procédure utilisateur Beckman-Coulter 6C NAVIOS: 3 lasers
Prélèvement de sang sur EDTA :
Sang normal
Myélémie
SMD
HPN
Préparation des réactifs :
1) Tampon de lavage : PBS 1X + SVF 1% = 500µl SVF pour 50 ml volume final
2) Réactif de lyse à température ambiante : Versalyse®
3) Anticorps :
CD16 PC7 : A diluer au 1/5 dans tampon de lavage
SOP HPN WORKSHOP Beckman Coulter 6C NAVIOS 3 lasers
FLUORO
VOLUMES Ac
CLONE
CHROME 5C
(microL)
CTRL iso
FITC
20
FLAER
AF488
5
CD11b
BEAR1
PE
10
CD55
JS11KSC2
FITC
10
CD59
P282
FITC
10
CD24
ALB9
PE
20
CD33
D3HL-60
PC5.5
2
CD16
3G8
PC7
5 (dil 1/5e)
CD45
J33
PC7
10
CD14
RMO52
APC
10
CD15
80H5
PB
10
Préparation de l’échantillon :
Numération formule : PNN = _____, ____ G/L
Vous utilisez les panels 6 couleurs, vous avez 5 tubes.
Volume de sang à traiter :
vol = 6 / _____, ____ G/L = ________ mL
- Si vol < 1 ml utiliser un tube 15 mL fond conique
- Si 1 ml < vol < 2 mL fractionner le sang pour faire la lyse en 2 tubes etc…
Lyse à ajouter : ________ ml x 10 = ________ mL
Homogénéiser le mélange, incuber à température ambiante, 10 min minimum et 20 min
maximum si lyse incomplète
Remplir avec tampon de lavage, mélanger par inversion
Centrifuger à 200 g pendant 5 min
Aspirer le surnageant, ne pas vortexer mais fractionner le culot cellulaire par percussion du
fond du tube, et ajouter 10 ml de tampon de lavage
A ce stade, si la lyse a été faite en plusieurs tubes, regrouper toutes les cellules dans un tube 15mL
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Procédure Workshop HPN NAVIOS
Centrifuger à 200 g pendant 5 min
Aspirer le surnageant et remettre en suspension avec le même procédé
Homogénéiser par pipetage, dans un volume final de 180µl
Ainsi 45µl de suspension cellulaire contiennent environ 106 PNN
TRES IMPORTANT : SUSPENSION HOMOGENE +++++
Marquage :
Préparer le mix d’anticorps dans le tube avant de déposer les cellules.
T
PB
0
-
1 test
-
2 ctrl
-
3
CD15
10µl
4
CD15
10µl
FITC
AF488
PE
PerCPCy5.5
PE-Cy7
APC
APCH7
-
-
-
-
-
-
CD55-59
10µl-10µl
CRTL
ISO 20µl
FLAER
5µl
CD11b
10µl
CD11b
10µl
CD24
20µl
-
-
-
-
-
-
-
CD45
10µl
CD16
5µl DIL !
CD14
10µl
CD14
10µl
-
CD33 2µl
Ajuster
le volume
+25µl
tampon
+25µl
tampon
CD33 2µl
CD24
20µl
DIL : pour CD16 il faut préparer une dilution = 2µl Ac+ 8µl tampon de lavage (1/5°)
CD55
10µl
-
NB : il est préférable de passer le tube « Nakao test » avant le tube « Nakao contrôle » car
sinon il y a risque de « pollution » entre tube.
Vortexer le mix d’anticorps puis ajouter dans chaque tube 45µl de suspension cellulaire,
vortexer, incuber à température ambiante et à l’abri de la lumière pendant 30 min
Préparer le Tube 0 avec le reste de suspension cellulaire
Lavage avec 3 ml de tampon de lavage par tube, centrifugation 200 g pendant 5 minutes.
Aspirer le surnageant, ne pas vortexer, fractionner le culot cellulaire par percussion du fond du
tube afin de le remettre en suspension, ajouter 500µl de tampon de lavage, agiter
La suspension cellulaire sera vortexée avant acquisition
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Procédure Workshop HPN NAVIOS
Paramètres à enregistrer :
Exemple pour tubes 3 ou 4
FSC-INT
FSC-Peak
SSC- INT
Tube 0 :
Tube 1 : FL-1-LOG FL-2-LOG
Tube 2 : FL-1-LOG FL-2-LOG
Tube 3 : FL-1-LOG FL-2-LOG
Tube 4 : FL-1-LOG FL-2-LOG
Time
FL-4-LOG
FL-4-LOG
FL-5-LOG
FL-5-LOG
FL-6-LOG
FL-6-LOG
FL-9-LOG
FL-9-LOG
Ajuster le DISCRIMANT sur le FSC, il doit être le même pour tous les tubes
S’assurer que la sauvegarde est faite en FCS 3.0
Laver le cytomètre avant de débuter l’acquisition : 1 tube de CLENZ 1 mn, 1 tube d’eau tiède du
robinet 1 mn et 1 tube d’eau distillée 1 mn
Storage Gate :
ALL EVENTS
Stopping Gate :
5x105 granulocytes
500 sec (attention aux bulles d’air)
NB : vérifier que des bulles d’air ne soient pas aspirées en fin de tube
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Procédure Workshop HPN NAVIOS
Ne pas oublier le tube 0 : acquisition de 20 000 événements sur le tube des cellules non
marquées = référence pour la répartition des populations leucocytaires, veiller à obtenir le même
% de PNN dans les tubes suivants
Vortexer le tube avant de débuter l’acquisition sans dépasser 3000 events/sec
(correspondant à un « % d’abort théorique » de moins de 5%).
Le paramètre « TIME » permet de déceler une sédimentation de l’échantillon (le nombre
d’events analysées/min décroit : en général au-delà de 300 sec).
Utiliser alors la fonction « pause rotate », vortexer la suspension cellulaire et poursuivre
l’acquisition.
Ces opérations permettent d’acquérir le maximum d’évents (500 000 granuleux sont attendus) en évitant
une possible sédimentation et agrégation cellulaire
Stratégie de gating : cf feuille d’analyse (flow page) jointe
Code couleur des populations analysées (GTLLF/GEIL) :
Granulocytes :
Monocytes :
Lymphocytes :
Clone HPN :
rouge
Vert
Fushia
noir
FS/SS : fenêtre de conditionnement « A » excluant les débris
Tube 0 :
Noter le % de granuleux qui doit être le même dans tous les tubes
suivants
Tube 1 Nakao TEST :
FS INT / FS PIC fenêtre de conditionnement des singulets
SS / CD11b fenêtre de conditionnement des Monos et neutros
CD 55+ CD59 / CD11b fenêtre de conditionnement des clones HPN
Tube 2 Nakao CTRL:
identique
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Procédure Workshop HPN NAVIOS
Tube 3 Guidelines : * FS INT / FS PIC Fenêtre de conditionnement des singulets
* FS / SS Fenêtre sur les cellules « vivantes »
* SS/CD45 : large « granulocytes» en et excluant les éosinos, et les cellules
« CD45 faible »
*CD33/ CD15 pour définir précisément « polys » et « monos »
Exemple cellules normales
CD45
CD15
*Expression du Flaer / CD24 et FLAER / CD14, sur deux dot-plots
Faire fenêtre « poly HPN » et «mono HPN »
Exemple cellules normales
CD14
CD24
CD14
FLAER
FLAER
Exemple cellules HPN
CD24
CD14
FLAER
FLAE
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Procédure Workshop HPN NAVIOS
Tube 4 Beckman : *fenêtre de conditionnement des singulets
* FS / SS Fenêtre sur les cellules « vivantes »
* SS/CD33 : large « granulocytes» en et excluant les éosinos, et les cellules
« CD45 faible »
*CD33/ CD15 pour définir précisément « polys » et « monos »
Exemple cellules normales
CD15
FS
CD33
CD33
*Expression CD55 CD24 CD16 sur trois dot-plots
Fenêtre clone HPN: “CD55neg AND CD24neg AND CD16low”
Exemple cellules normales
CD16
CD16
CD24
CD55
CD14
CD5
Exemple cellules HPN
CD16
CD16
CD24
CD14
CD55
CD55
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Procédure Workshop HPN NAVIOS
Réglage du cytomètre et matrice de compensation
Objectif :
Obtenir des « images comparables» entre machines de même type et plus
si possible
Rainbow beads :
Vortexer avant préparation, diluer selon les recommandations, vortexer la
dilution avant acquisition +++++
Feuille d’analyse : Positionner respectivement le 8ème pic (dernier pic) de FL1, FL2,
FL5, FL6 et FL9 et le 7ème pic (avant-dernier pic) de FL4 au plus près de la
valeur cible indiquée ci-dessous
NAVIOS
MFI
FL1 (8ème pic) FL2 (8ème pic) FL4 (7ème pic) FL5 (8ème pic) FL6 (8ème pic) FL9 (8ème pic)
179
353
210
18
721
768
Valeurs cibles correspondant à la moyenne de 4 passages
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Procédure Workshop HPN NAVIOS
Matrice de compensation : A établir en suivant les recommandations Beckman-Coulter avec
du CD45 Beckman Coulter ou des Ac autres Beckman-Coulter (ou ceux du workshop mais
Attention à ne pas « manger » inutilement des Ac). Utilisation
A titre d’exemple ci-dessous : la matrice de compensation obtenue à
la Pitié qui devrait être proche de la votre (nous avons toujours des différences minimes entre
les centres qui ont testés la stratégie) :
NB : Vous pouvez faire appel à l’ingénieur d’application Beckman-Coulter de votre région
tube BC
Guidelines
FL1
FL1
FL2
FL4
FL5
FL6
FL9
tube BC Société
17,1
0
0,1
0
0
FL1
FL1
FL2
FL4
FL5
FL6
FL9
17,1
0,1
0,1
0
0
FL2
1,1
30,6
0,1
0
0
FL2
1,1
30,4
0,1
0
0
FL4
0,1
0,1
2,8
0,2
0
FL4
0,1
0,2
2,5
0,3
0
FL5
1,6
5,4
10,1
0,4
0
FL5
1,5
6
5,8
0
0
FL6
1,2
0,1
0
0
FL9
0
0
0
0
0
0
FL6
0,2
0,1
2,2
0
0
Feuille de résultat
Cf un tableau Excel regroupant les données patients et les données cytométrie
FL9
0
0
0
0
0