Extraction d`ADN - McGill University and Génome Québec

06 DECEMBRE 2016
SERVICES D’EXTRACTION D’ADN
Centre d’innovation Génome Québec et Université McGill
Extraction d’ADN
Guide de l’utilisateur
Version 1.0
© Copyright 2016 Centre d’innovation Génome Québec et Université McGill
Tous droits réservés.
Table des matières
TABLE DES MATIÈRES ................................................................................................................ 2
DEMANDE DE SERVICE ............................................................................................................... 3
DEMANDE DE SERVICE .......................................................................................................................... 3
CONSIDERATIONS GENERALES .............................................................................................................. 3
EXIGENCES DE SOUMISSION ET D’ENVOI .................................................................................. 4
FICHIER DE SOUMISSION DES ECHANTILLONS ............................................................................................ 4
ÉCHANTILLONS DE SANG ET DE COUCHE LEUCOCYTAIRE ................................................................................ 6
ÉCHANTILLONS DE SALIVE ET FROTTIS BUCCAUX ......................................................................................... 6
ÉCHANTILLONS DE CELLULES................................................................................................................ 7
AUTRES TYPES D’ECHANTILLONS ........................................................................................................... 7
ÉCHELLE MINIMALE DE TRAITEMENT ........................................................................................................ 8
EXIGENCES D’ORGANISATION DES ECHANTILLONS ....................................................................................... 8
PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS POUR ENVOI ................................................................................................ 9
PRÉPARATION ET ANALYSE DES ÉCHANTILLONS ..................................................................... 10
FORMATS DES CONTENANTS DISPONIBLES POUR LES ÉCHANTILLONS D'ADN ...................................................... 10
ANALYSE DE LA QUANTITÉ D’ADN ....................................................................................................... 10
ANALYSE DE LA QUALITÉ DE L’ADN ...................................................................................................... 10
FICHIERS DE RÉSULTATS ET IDENTIFICATION DES ÉCHANTILLONS ................................................................... 11
POUR PLUS D’INFORMATION ................................................................................................... 11
BUREAU DE GESTION DES CLIENTS ....................................................................................................... 11
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Demande de service
Demande de service
Nous offrons un service d’extraction d’ADN pour plusieurs types d’échantillons différents, soit le sang, la
salive, les frottis buccaux, la couche leucocytaire et les échantillons de cellules. Nous travaillons
continuellement à développer divers services d’extraction pour plusieurs autres types d’échantillons qui ne
sont pas présentés dans ce document. Pour toute demande de service ou pour recevoir de l’information
concernant le service d’extraction d’ADN veuillez communiquer directement avec le Bureau de gestion
des clients.
Considérations générales
Tous les échantillons soumis pour extraction d’ADN doivent être reconnus comme exempts de pathogènes
humains. Dans le cas où des échantillons pourraient contenir des pathogènes, le client doit
impérativement avertir la plateforme et mentionner quels sont les pathogènes possibles.
Les échantillons pouvant contenir, ou constitués de virus, bactéries ou moisissures/champignons de
niveau de biosécurité 2 et plus, ne sont pas acceptés par le service d’extraction d’ADN. Les échantillons de
moisissures et de champignons qui produisent beaucoup de spores sont aussi refusés en raison du risque
de contaminer les équipements et les locaux.
Généralement, nous n’acceptons pas les échantillons de prélèvements biomédicaux tels que l’urine, les
fèces et le sperme. En tout temps, nous nous réservons le droit de modifier nos Politiques, pour accepter
ou refuser certains types d’échantillons.
Afin d'éviter tout délai dans le traitement de votre demande, prenez soin de suivre attentivement les
instructions de préparation et de soumission des échantillons mentionnées dans le présent document.
Notez que les échantillons sont traités sur une base «premier arrivé, premier servi», et que les délais
d'exécution peuvent varier selon l'ampleur du projet. Il est donc recommandé de vous informer auprès du
Bureau de gestion des clients concernant les délais de traitement lorsque vous soumettez des
échantillons.
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Exigences de soumission et d’envoi
Fichier de soumission des échantillons
Pour soumettre vos échantillons pour extraction vous devez remplir le document (fichier Excel) nommé
Modèle pour échantillons individuels. Ce document est disponible sur Nanuq, dans la section LIMS,
« Réception d’échantillons », Template Excel, Fichier modèle à télécharger, Puce et Validation, Modèle
pour échantillons individuels. Il est important de sauvegarder le fichier en format Excel 1997-2003 (.xls).
Le fichier Excel n’accepte que les caractères suivants : a-z, A-Z, 0-9, point (.), tiret (-), tiret bas (_) et @.
Veuillez n’utiliser aucun autre caractère car le fichier sera rejeté par notre base de données informatique.
De plus, il est important de limiter le nom d’échantillon (Sample name), l’Individual ID et le Pedigree à un
maximum de 25 caractères. Les champs obligatoires sont indiqués par un astérisque (*) ou un signe plus
(+). Chaque individu doit avoir un nom d’identification d'individu (Individual_ID) unique.
Veuillez compléter les cases suivantes selon les instructions données ci-dessous:
Type : Indiquer le type de vos échantillons selon les choix disponibles dans le menu déroulant: Blood
(Sang), Buffy coat (Couche leucocytaire), Cells (Cellules), Spit (Saliva), Pellet (Culot de
bactéries/cellules), Serum (Sérum), Swab (Écouvillon), Tissu animal (Animal Tissue), Tissu végétal (Plant
tissue). Un seul type d’échantillon par fichier est accepté. Si vous soumettez plusieurs types
d’échantillons, vous devez soumettre un nombre égal de fichiers de soumission.
Cohorte: À indiquer selon vos besoins, sinon laisser vide.
Taxon: Indiquer le taxon relatif à l’espèce dont proviennent les échantillons à extraire.
Individual name prefix: Pour usage interne seulement, ne rien indiquer dans cette case.
Pedigree prefix: Pour usage interne seulement, ne rien indiquer dans cette case.
Volume units: Indiquer l’unité de volume utilisée pour les échantillons liquides tels que le sang, la salive,
la couche leucocytaire (buffy coat), etc...
Concentration units: Ne rien indiquer, non pertinent pour les échantillons à extraire.
Individual container kind: Choisir ¨Tube¨ dans tous les cas.
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Container barcode: Veuillez indiquer le code à barre inscrit sur chaque tube individuel s’il y en a un, en
cas contraire ne rien indiquer.
Sample name: Inscrire le nom de l’échantillon en utilisant le nom le plus simple possible et en
respectant les caractères autorisés seulement. Si plusieurs de vos échantillons ont le même nom, il
convient ici d’ajouter un élément de texte à la fin du nom pour les différencier, par exemple _2, ou b,
etc…
Location barcode: Pour usage interne seulement, ne rien indiquer dans cette case.
Location coord: Pour usage interne seulement, ne rien indiquer dans cette case.
Individual name: Inscrire le nom de l’échantillon en utilisant le nom le plus simple possible et en
respectant les caractères autorisés seulement. Si plusieurs de vos échantillons proviennent du même
individu, il convient d’indiquer le même « individual name » pour tous les échantillons du même individu.
Gender: Indiquer le genre en sélectionnant dans le menu déroulant.
Pedigree: Indiquer le pedigree de votre échantillon (famille, groupe, mère ou père) si l’information est
connue et pertinente, autrement, copier seulement le nom de l’échantillon.
Mother ID: Identité de la mère (Individual name de la mère) si connu et pertinent, sinon laisser vide.
Father ID: Identité du père (Individual name du père) si connu et pertinent, sinon laisser vide.
Vol: Indiquer le volume des échantillons liquides selon l’unité choisie préalablement. Seulement les
chiffres sont acceptés dans cette colonne, ne pas indiquer d’unité après le chiffre. Idéalement, vous devez
inscrire le volume réel contenu dans le tube et non pas une estimation théorique approximative. Indiquer
un volume inexact risque de nuire à la pureté de l’ADN obtenue.
Conc.: Ne rien indiquer, non pertinent pour les échantillons à extraire.
Contact ID: Indiquer l’identifiant Nanuq du chercheur principal, ou du contact, qui soumet les
échantillons.
Alias: Si possible veuillez numéroter vos échantillons à partir du nombre 1, selon leur ordre de
présentation dans la boite/contenant. Ce numéro sera utilisé pour identifier les tubes lors de l’extraction
de vos échantillons.
Site of origin: Indiquer l’origine de l’échantillon, si pertinent.
Tissue source: Indiquer la source du tissu, si pertinent.
Sample blank: Ne rien indiquer, non pertinent pour les échantillons à extraire.
Default control: Ne rien indiquer, non pertinent pour les échantillons à extraire.
Comment: Indiquer tout commentaire relatif à l’échantillon. L’équipe d’extraction ajoute souvent des
notes sur l’échantillon à cet endroit.
Experimental group: Indiquer le groupe expérimental de l’échantillon si pertinent. Si inutilisé, l’équipe
d’extraction note le lot (batch) d’extraction à cet endroit, si pertinent.
Le fichier doit être sauvegardé en le renommant de la manière suivante : Nom_de_Projet_PI-box00X
(e.g.ChildBC_YR-box001).
Lorsque le document est dûment complété selon les instructions données, veuillez le soumettre
directement dans votre projet dans Nanuq, ou l’envoyer par courriel à la personne en charge de votre
projet au bureau de gestion clients et/ou au technicien en extraction d’ADN.
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Échantillons de sang et de couche leucocytaire
Nous acceptons tous les échantillons de sang et de couche leucocytaire provenant d’animaux et de
donneurs sains. Le client doit avertir Génome Québec si les échantillons proviennent de patients malades,
ou pouvant être infectés par des virus pathogènes tels que le virus du VIH ou de l’hépatite C.
Types de contenants acceptés et anticoagulant
Les échantillons de sang et de couche leucocytaire doivent contenir un anticoagulant tel que l’héparine ou
l’EDTA. Les échantillons qui contiennent du sang coagulé donneront un échantillon d’ADN qui sera
contaminé en plus grande proportion par des protéines sanguines. Les clients doivent éviter d’envoyer du
sang qui contient de caillots ou du sang séché.
Les échantillons de sang peuvent être envoyés directement dans leur tube de collecte de type médical
Vacutainer ou être transférés dans un autre type de contenant qui se visse hermétiquement. Les
échantillons de couche leucocytaire doivent être transférés dans un microtube ou cryotube approprié, qui
se visse hermétiquement.
Quantité de matériel de départ
Le volume de sang accepté varie entre 0,5 et 10mL. Le volume minimal suggéré est de 1mL. Il est
important de comprendre que nous devons utiliser le même volume initial de sang pour tous les
échantillons d’un même lot. Le client doit donc regrouper ses échantillons selon le volume réel de sang
dans le contenant. Nous utilisons le volume maximal disponible pour tous les échantillons. Sauf indication
contraire, le sang résiduel (volume excédentaire par rapport aux autres échantillons) sera jeté suite à
l’extraction. Comme les volumes résiduels sont minimes et tous différents, il n’est pas possible de les
réutiliser pour faire une autre extraction.
Le volume de couche leucocytaire accepté varie entre 0,1 et 2mL. Le volume minimal suggéré est de
0,5mL. Nous utilisons tout le volume de l’échantillon.
Échantillons de salive et frottis buccaux
Nous acceptons tous les échantillons de salive provenant de donneurs sains. Le client doit nous avertir si
les échantillons proviennent de patients malades ou pouvant être infectés par des virus pathogènes tels
que le virus du VIH ou de l’hépatite C.
Type de contenants de collecte acceptés
Nous acceptons les échantillons de salive ainsi que les frottis buccaux collectés avec les produits de la
compagnie DNA Genotek. Les clients doivent utiliser les kits de collecte Oragene ou ORAcollect de DNA
Genotek, car ils doivent être compatibles avec le protocole d’extraction que nous utilisons associé au kit
Prep-It L2P de la même compagnie. Le kit GeneFix Saliva DNA Collection de Isohelix devrait fonctionner
aussi. Pour les frottis buccaux nous recommandons le kit OCR-100. Nous ne pouvons pas garantir le
résultat de l’extraction d’ADN si les échantillons de salive sont collectés avec des produits autres que ceux
de DNA Genotek ou de façon différente que celle spécifiée par le fabricant DNA Genotek. Le kit DNA
Buccal Swabs de Isohelix devrait fonctionner aussi.
Quantité de matériel de départ
Selon le kit de collecte utilisé, le volume de salive récolté varie de 0,5 à 3mL. Le volume minimal suggéré
pour un obtenir une quantité d’ADN suffisante est de 1mL, un volume inférieur donnera une faible
quantité d’ADN. Idéalement, toutes les consignes de collectes spécifiées par le fabricant doivent être
suivies à la lettre. Une collecte supervisée et de qualité donne généralement des échantillons avec un
volume similaire de salive claire et non colorée qui ne contient pas ou peu de particules.
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Il est important de comprendre que nous devons utiliser le même volume initial de salive pour tous les
échantillons d’un même lot. Le client doit donc regrouper ses échantillons en lots, selon le volume réel de
salive dans le contenant. Nous utilisons le volume maximal disponible pour tous les échantillons. Sauf
indication contraire, la salive résiduelle (volume excédentaire par rapport aux autres échantillons) sera
jetée suite à l’extraction. Comme les volumes résiduels sont minimes et tous différents, il n’est pas
possible de les réutiliser pour faire une autre extraction. Le volume de salive maximal extrait est de 3 mL.
Échantillons de cellules
Nous acceptons tous type de culture cellulaire qui n’a pas servi à la multiplication virale et toute culture
primaire provenant de tissu non-infecté.
Type de contenants acceptés
Tous les échantillons de cellules doivent être envoyés sous forme de culot dans un microtube de 1,5 à
fond conique. Seul le culot doit être présent dans le fond du tube, le surnageant doit être préalablement
retiré. Dans certains cas, les culots de cellules peuvent être envoyés dans une plaque PCR de 96 puits
régulière avec demi-jupe.
Quantité de matériel de départ
La quantité de cellules acceptée varie entre 1 à 2 millions de cellules. Nous suggérons une quantité
minimale de 1 million de cellules et de ne pas dépasser 2 millions de cellules pour un résultat optimal.
L’échantillon est entièrement extrait.
Autres types d’échantillons
Nous sommes disposés à recevoir d’autres types d’échantillons selon la disponibilité d’une méthode
d’extraction validée. Nous élaborons continuellement de nouveaux protocoles d’extraction pour répondre
aux différents besoins de nos clients. Nous espérons pouvoir bientôt offrir un service d’extraction qui
couvrira l’ensemble des échantillons de tissus animaux et végétaux. Veuillez communiquer avec nous
pour connaitre les nouveaux types d’échantillons acceptés.
Important!
N'envoyez pas les échantillons en microtubes de moins de 1,5mL ou en bandes de tubes (strip-tubes)!
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Échelle minimale de traitement
Veuillez noter qu’un minimum de 12 échantillons est nécessaire pour l’extraction des échantillons
individuels en tube (sang, salive, couche leucocytaire, frottis bucaux), dans le cas contraire un minimum
de 12 échantillons sera facturé pour le lot.
Pour les projets d’extraction d’ADN de cellules en plaque (digestion seulement) ceux-ci seront facturés par
tranche de 96 échantillons (peu importe le nombre d'échantillons dans la plaque).
Exigences d’organisation des échantillons
Soyez attentifs aux recommandations pour l'organisation des échantillons en boite/contenant ou en
plaques pour les projets d’extraction.
Tubes individuels
Tous les échantillons en tube individuel doivent être organisés en ordre logique dans une boite ou tout
autre contenant qui permet de présenter les échantillons dans le même ordre que celui présenté dans le
fichier Excel de soumission des échantillons.
Les échantillons sont présentés dans le contenant dans l’ordre logique de lecture, soit en commençant en
haut à gauche, vers en bas à droite.
Les tubes individuels ne doivent pas être envoyés emballés de façon individuelle et non classés. Nous
nous réservons le droit d’ajouter des frais pour tout lot d’échantillons envoyés emballés individuellement
ou non classés pour le travail supplémentaire associé au déballage et au tri de vos échantillons.
Plaques
Les échantillons sont présentés dans la plaque dans l’ordre logique de lecture, soit en rangée
commençant en haut à gauche dans le puit A1 vers A12, B1 vers B12, etc… jusqu’à H12 en bas à droite.
Évitez de remplir complètement les puits car cela augmente le risque de contamination des échantillons
de puits voisins. Centrifugez vos plaques et enlever le surnageant pour n’envoyer que les culots de
cellules. Utilisez seulement des plaques PCR à demi-embase (half-skirt). Les plaques doivent être
correctement scellées. Utilisez un film adhésif de bonne qualité tel que Adhesive PCR Films de la
compagnie Thermo Fisher Scientific (Cat# AB-0558).
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Préparation des échantillons pour envoi
Afin d’assurer la préservation de l’intégrité des divers échantillons lors du transport et de l’entreposage,
veuillez suivre les instructions suivantes.
Les échantillons de sang, de couche leucocytaire, ou de cellules doivent être envoyés congelés sur glace
sèche, classés dans leurs contenants respectifs dûment identifiés.
Les échantillons de salive et le frottis buccaux sont généralement envoyés à température ambiante,
classés dans leurs contenants respectifs dûment identifiés.
Chaque boite ou contenant doit être emballé dans un sac de plastique à fermeture glissière à pression (de
type Ziploc).
Le Nom du Project (Project Name), le nom du Destinataire (Recipient) ainsi que le nom de la Plateforme
(BioPuce-Extraction d’ADN) doivent être indiqués clairement à l’extérieur de la boîte/sac d’envoi.
Si les échantillons sont envoyés par la poste ou tout autre service de livraison, veuillez utiliser l’adresse
postale suivante :
Attn: Plateforme de BioPuce-Extraction d’ADN – Daniel Vincent ou Rosalie Fréchette
Centre d’innovation Génome Québec et Université McGill, bureau 7500
740, avenue Dr-Penfield
Montréal (Québec), Canada
H3A 0G1
Un courriel doit être envoyé au destinataire lorsque les échantillons sont expédiés.
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Préparation et analyse des échantillons
Formats des contenants disponibles pour les échantillons d'ADN
Suite à l’extraction, vos échantillons seront transférés dans le type de contenant approprié.
Pour les projets d’extraction de faible envergure (moins de 96 échantillons), à faible rendement d’ADN
(frottis, écouvillons) et pour les projets d’analyse génomique ponctuelle, nous transférons habituellement
l’ADN dans une plaque PCR de 96 puits à demi-jupe régulière. La plaque est scellée avec un film plastique
autocollant.
Pour les projets qui nécessitent la création d’une banque d’ADN et pour les projets à haut rendement
d’ADN (volume recommandé de sang, de couche leucocytaire, de salive, ou quantité recommandée de
cellules), nous transférons vos échantillons dans des microtubes individuels avec bouchon vissable de
1mL, organisés dans un contenant de format plaque de 96 puits. Chaque tube est identifié avec un code à
barres linéaire sur le côté du tube, et un code à barres 2D sous le tube. Prenez-note qu’un lecteur
spécialisé est nécessaire pour lire les codes à barres 2D sous le tube, mais que le code à barres et inscrit
sous forme de chiffres lisible sur le côté de chaque tube. Pour plus d’information sur ce produit veuillez
consulter le site Internet du fabricant Thermo Fisher Scientific pour le produit Matrix™ 2D Barcoded Tubes
and Rack
Seuls les deux types de contenants spécifiés sont considérés. Toute demande de transférer les
échantillons dans un autre type de contenant risque d’entraîner des frais additionnels et l’impossibilité de
quantifier l’ADN et d’en déterminer sa qualité. Pour des raisons techniques, seuls les échantillons d’ADN
disposés sous format de plaque peuvent être analysés. Les échantillons transférés dans des tubes
individuels ne seront pas analysés (quantification de l’ADN et qualité de l’ADN).
Analyse de la quantité d’ADN
L’extraction d’ADN inclus une quantification par spectrophotométrie UV à 260nm pour tous les
échantillons. Cette méthode donne une valeur approximative de la concentration en ADN de vos
échantillons. Il est important de comprendre que cette méthode surestime parfois la concentration de
l’ADN, car toute molécule libre contenant un cycle aromatique va créer une certaine absorbance à 260nm.
Nous recommandons d’ajouter un dosage de l’ADN par méthode PicoGreen (optionnel). Cette méthode de
quantification ne tient compte que de l’ADN double brin de vos échantillons et n’est pas affectée par la
présence de molécules contaminantes. Notez que le dosage PicoGreen est souvent inclus par défaut
comme étape préliminaire de la majorité des projets de séquençage ou de génotypage soumis à Génome
Québec.
Analyse de la qualité de l’ADN
Nous évaluons la qualité de l’ADN génomique extrait par spectrophotométrie à 260 et 280nm. Le ratio
260/280 donne une bonne idée de la qualité de l’ADN extrait et s’il est contaminé par de l’ARN ou des
protéines. Un échantillon avec un ratio près de 1,8 est généralement considéré comme de l’ADN «pur».
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Fichiers de résultats et identification des échantillons
Une fois le projet d’extraction complété, un courriel sera envoyé à la personne contact, via l’adresse
électronique inscrite dans la requête, lorsque les résultats seront disponibles sur son compte Nanuq. Vous
pourrez alors accéder à tous les renseignements relatifs à vos échantillons et aux divers processus
d’extraction directement dans le projet associé sur votre compte Nanuq.
Suite au projet d’extraction, nous vous ferons parvenir par courriel les fichiers informatisés qui
contiennent toutes les informations relatives à l’identification de vos échantillons, l’identification des
contenants et l’emplacement de vos échantillons dans leur contenant respectif (plaque de 96 puits ou
Matrix 2D Tube Rack). Les fichiers relatifs aux analyses de la quantité et de qualité de l’ADN vous seront
également fournis.
Pour plus d’information
Bureau de gestion des clients
Frédérick Robidoux, B.Sc.
Sharen Roland, B.Sc.
Philippe Daoust, M.Sc.
Centre d'innovation Génome Québec et Université McGill
740, avenue du Docteur Penfield, bureau 7104
Montréal (Québec) Canada
H3A 0G1
Téléphone : 514-398-7211
Télécopieur : 514-398-1790
Courriel : [email protected]
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