Application de la spectrométrie de masse au laboratoire de

Applications de la
Spectrométrie de Masse
au Laboratoire de Microbiologie
Pharm Biol Delphine Martiny
Departement de Microbiologie
CHU Saint-Pierre & Institut Jules Bordet
Bruxelles, Belgique
Seng CID 2009
Performances
Bizzini CMI 2010
BD Phoenix
Bruker
Genre Espèce Genre Espèce
308 95%
93%
96%
93%
132 52%
34%
85%
56%
n
Espèces courantes
Espèces moins fréquentes
Saffert JCM 2011
Accuracy of API Campy System, Vitek 2 Neisseria-Haemophilus (NH) Card
and Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-flight mass
spectrometry (MALDI-TOF MS) for Identification of Campylobacter and
related organisms.
Identification correcte à l’espèce
N=234
API Campy
Vitek NH
Maldi-TOF MS
C. jejuni ssp jejuni
94.4%
89.6%
100%
C. coli
73.8%
87.7%
100%
Other species
47.7%
0%
90.9%
All strains
79.9%
72.2%
98.3%
Mauvaise identification
API Campy
Vitek NH
Maldi-TOF MS
0%
10.4%
0%
C. coli
4.6%
7.7%
0%
Other species
22.7%
69.5%
0%
All strains
5.6%
20.1%
0%
C. jejuni ssp jejuni
Martiny CMI 2010
Systèmes
disponibles
Réflectron ?
IVD versus RUO ?
Etude en cours
Préparation de l’échantillon
Matériel biologique
Fraction d’une colonie isolée
Différents milieux
Dépôt direct ou extraction
Matrice
HCCA
Réservées à la recherche:
DHB
Acide sinapinique
Point déterminant: quantité de matériel biologique déposé
Contrôles
Principe
Acceleration
a
Drift
b
+
+ ++
Electrodes
+
+
Detector
Laser Desorption/Ionization
Time-of-Flight
Intensity
m/z
Base de données
Bruker
Nom
Comparaison
Origine des spectres
Entrées
Base de données
complémentaire
Biotyper
Spectres de référence
Souches de référence et
clinique
~ 4000
« bioterrorisme »
~ 100
Resultats
Cut-off adaptés ?
Result Overview
Analyte
Organism
Score
Organism
Score
Name
(best match)
Value
(second best match)
Value
Campylobacter coli 11167_03 NVU
2,484
Campylobacter coli CCUG 11283 NVU
2,446
Arcobacter butzleri DSM 7301 DSM
2,414
Arcobacter butzleri 347_98 NVU
2,383
Arcobacter butzleri 460_98 NVU
2,341
Arcobacter butzleri 347_98 NVU
2,337
Arcobacter butzleri 460_98 NVU
2,527
Arcobacter butzleri 347_98 NVU
2,488
Campylobacter coli 11167_03 NVU
2,407
Campylobacter coli CCUG 11283 NVU
2,281
1
( +++ )
11516
( +++ )
13140
( +++ )
13220
( +++ )
1366
( +++ )
Meaning of Score Values
Range
Description
Symbols
Color
2.300 ... 3.000
highly probable species identification
( +++ )
green
2.000 ... 2.299
secure genus identification, probable species
identification
( ++ )
green
1.700 ... 1.999
probable genus identification
(+)
yellow
0.000 ... 1.699
no reliable identification
(-)
red
Validation
RUO versus IVD
Reproductibilité
Influence de l’âge de la culture
Comparaison avec les techniques
classiques et adaptation des algorithmes
Reproductibilité
ATCC
S. aureus
30 analyses
-> ID ok
-> Scores entre 2.18 et 2.36
Mellmann JCM 2009
Age
Culture
J3
J4
S. pneumoniae
S. agalactiae
Manuel 2.02
2.299
Manuel 2.1
2.313
S. anginosus
NPF
/
E. faecalis
2.318
2.302
K. pneumoniae
2.236
2.38
P. aeruginosa
2.331
2.338
E. coli
2.253
2.356
S. sonnei
E. coli 2.04
E. coli 2.072
C. jejuni
NPF
/
Comparaison avec les
techniques classiques:
origine des isolats (n=992)
Double dépôt
300
Bacilles Gram négatif
Nombre d’isolats
250
Rouge = erreur au genre
Jaune = erreur à l’espèce
Bleu = ID correcte au genre et à l’espèce
200
150
100
50
Genre
0
CIT
ENT
ESC
MOR
PRO
PSE
SAL
SHI
SER
A CH
A CI
EIK
HA E
STE
KLE
Coques Gram positif
200
Nombre d’isolats
180
160
Seulement Biotyper = 4%
140
120
100
80
60
40
20
0
ENC
STA AUR
SCN
STR HEM
STR
Genre
1er algorithme: Décembre 2010
Colonie isolée
Score <2 -> contamination?
Score >2
E. coli, K. pneumoniae and K. oxytoca, E.
cloacae et E. aerogenes, P. aeruginosa, C.
freundii et C. koseri, S. aureus, SCN -> ok
Autres: identification classique
Pratiquement
65% identifiées par MT
32% non validées
3% NRI / NPF / <2
Algorithme évolutif
Dernier algorithme: Mai 2011
41 espèces de 16 genres bactériens
Acinetobacter
Enterobacter
Streptococcus
baumanii
genomospecies
cloacae
asburiae
kobei
ludwigii
hormaechei
cloacae complexe
anginosus
constellatus
répondre A. baumanii complexe
répondre E. cloacae complexe
répondre S. anginosus groupe
Validation au genre:
Acinetobacter, Enterococcus, Staphylococcus, Salmonella,
Corynebacterium, Micrococcus
Follow-up: 16 au 29 mai 2011
URI: 144 / 145 ID → 99.3% par MT
1 Achromobacter xylosoxydans
VRS: 86 / 97 ID → 88.6% par MT
9 Haemophilus / Pneumo
1 Hafnia alvei, 1 Klebsiella ozaenae
PUS: 216 / 228 ID → 94,7% par MT
7 Haemophilus / Pneumo
4 Streptos hémolytiques
1 Providencia rettgeri et 1 Enterococcus casseiflavus
HC et dépistages: 76 / 82 ID → 92,7% par MT
5 Pneumo / Strepto
1 Salmonella
Follow-up: approximation
Biais: flores salivaires,…
Anaérobies et levures
3% NPF / NRI
Total: (552-29)/552= 94.6%
Toujours en évolution
Avantages
Rapidité du diagnostic
Préparation de la matrice ~ 5 min
Extraction, si nécessaire ~ 30 min
Préparation de la cible ~ 15 min
Liste de travail ~ 5 min
Acquisition des spectres ~ 1 min
Comparaison à la base de données ~ 1 min
Résultats (1 cible complète) ~ 2h
Coût
Seng CID 2009
Pratiquement
Facile à utiliser
Peu de matériel biologique nécessaire
Large panel d’espèces incluses dans la BD
Coprocultures
Outil diagnostique
Désavantages
Identification
Shigella versus E. coli
C. africana versus C. albicans
S. pneumoniae versus S. mitis/oralis
B. pertussis versus bronchiseptica
K. oxytoca versus R. ornitholytica
S. maltophilia versus Pseudomonas species
Achromobacter species
Pseudomonas fluorescens group
Burkholderia cepacia complex
Bacteroides species
Listeria species
Enterobacter cloacae complex
Aeromonas species
Pseudomonas putida group
Acinetobacter species
Pratiquement
Pas d’information sur la résistance aux AB
Contaminations
(Connexion au LIS)
(Nettoyage des plaques)
(Préparation de la matrice)
Conclusions
Rapide, économique, peu de matériel (bio ou tech)
> 90% des souches identifiées sans test compl.
Pas de temps épargné au début
Workflow à revoir
Plus d’ID réalisées
Découverte de pathogènes potentiels
Perspectives dans notre
laboratoire
Identification directe sur échantillons (HC)
Centrifugations
Tampon de lyse
Sepsityper kit
Yan, JCM 2011
Prod’hom JCM 2010
Stevenson, JCM 2010
Ferroni, JCM 2010
Ferreira, CMI 2010
Moussaoui, CMI 2010
Travail de David Fage
Levures
Travail de Ann Packeu (ISSP)
Extraction courte + cut-offs adaptés
Milieux chromogènes
Aspergillus, dermatophytes
Erhard, Exp Derm 2007
Alliano, CMI 2010
Santos, J Appl Microbiol 2010
Putignani, Mol Biosyst 2011
Bader CMI 2010
Dhiman, JCM 2011
Anaerobies
Aurélien Simon – validation en cours
Expansion de la base de données
nécessaire
n
Bacteroides fragilis group
CGP anas
Total
Bruker
Shimadzu
Bruker
Shimadzu
Bruker
Shimadzu
15
24
79
Sans pré-traitement
espèce
genre
87
[100]
53
93.3
12.5
37.5
83
92
35.4
51.9
60.8
70.9
Avec pré-traitement
espèce
genre
87
100
NA
NA
37.5
50
NA
NA
50.6
60.8
NA
NA
Après upgrade
espèce
genre
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
63.3
72.2
NA
NA
Veloo CMI 2011
Veloo Syst Appl Microbiol 2011
Mycobacteries
Procédure d’inactivation
Consortium
NTBC
Expansion de la base de données
nécessaire
Milieu solide
Inactivation à la chaleur
Upgrade dB
Procédure d’extraction
Saleeb, JCM 2011
Demain ?
Typage?
Resistance?
Toxicité?
Virologie?
Génomique?
MERCI DE VOTRE ATTENTION
Contact : Pharm Biol Delphine Martiny, Dpt of Microbiology
Saint-Pierre Univ Hospital & Jules Bordet Institute
Brussels, Belgium
E. mail: [email protected]