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L’efflux actif comme mécanisme
potentiel d’interactions
médicamenteuses:
Compétition entre Fluoroquinolones et
Antiviraux dans un modèle de
macrophages J774
Laetitia Garcia
L’efflux actif
L’efflux actif est un processus ubiquitaire
de protection des cellules vis-à-vis de substances
étrangères amphiphiles
Ì Concentration cellulaire
Ì Activité pharmacologique
La Ciprofloxacine, une Fluoroquinolone
O
F
O
C
OH
N
N
HN
Antibiotique amphiphile
et diffusible
% initial conc.
Concentration
Initiale (%)
La Ciprofloxacine, une Fluoroquinolone
substrat d’une pompe à efflux
Contrôle
control
++ Gemfibrozil
gemfibrozil
100
80
control
Contrôle
60
40
20
0
0
10
20
30
Temps
Time(Minutes)
(min)
Antibiotique amphiphile
et diffusible,
substrat d’une pompe à efflux
Marquez et al. 2008, soumis pour publication
Les transporteurs MRPs
(Multidrug Resistance Proteins)
8
Phylogénie et structure
MRPs longues
MRP1
MRP3
MRP
2
MRP6
MRP7
MRP5
MRPs courtes
MRP8
MRP9
MRP
2
Tammur et al. ,Gene (2001) 273: 89‐96 Deeley et al., Physiol. Rev. (2006) 86 : 849‐899
Identification du transporteur de la
Ciprofloxacine
Cellules sauvages
(WT)
Exposition
chronique
à la Ciprofloxacine
cellular concentration
Concentration
Cellulaire
(ng/mg
prot)
(ng/mg de protéines)
1000
WT
RS
750
500
250
0
CT
Contrôle
+ Gem
+ Gemfibrozil
Cellules résistantes
(RS)
Michot et al. AAC (2006) 50:1689‐1695
Identification du transporteur de la
Ciprofloxacine
ARNm des Mrps (RS versus WT)
30
Types
cellcellulaires
type
25
20
15
10
Mrp1
Mrp3
Mrp5
Mrp2
Mrp4
Mrp6
Mrp7
WT
RS
0
5
20
40
60
80
100
gene distribution
Distribution
des gènes
7
M
rp
6
M
rp
5
M
rp
4
M
rp
3
M
rp
2
M
rp
1
0
M
rp
Facteur d’augmentation
versus
fold(RS
increase
(RSWT)
versus WT)
8
Les cellules résistantes
surexpriment Mrp2 et Mrp4,
mais Mrp4 prédomine
Marquez et al. 2008, soumis pour publication
Les transporteurs MRPs
(Multidrug Resistance Proteins)
8
Multiplicité de substrats: Compétition pour le transport?
Deeley et al., Physiol. Rev. (2006) 86 : 849‐899
But du travail
8
•
•
Etude de la compétition potentielle entre
La Ciprofloxacine
Différents substrats préférentiels de MRP2 ou de MRP4
8
•
•
Afin de :
Mieux caractériser le transporteur de Ciprofloxacine;
Mettre
en
évidence
des
«
interactions
médicamenteuses » potentielles par compétition pour un
même transporteur.
Ciprofloxacine
O
F
O
C
O-
N
N
HN
PMEA et MRP4
Saquinavir et MRP2
PMEA [Adéfovir]
Saquinavir
9-(2-PhosphonylMethoxyEthyl)Adenine
Reid et aL; Mol Pharmacol. 2003 63:1094-103
Imaoka et al. Mol Pharmacol. 2007 71:619-27.
Hydrolyse du Bis(POM)PMEA
Bis(POM)PMEA
9-[2-(BisPivaloyolOxyMethyl)PhosphoMEthoxy]Adenine
[Bis(POM)PMEA ou Adefovir Dipivoxil]
H
Mono(POM)PMEA
PMEA
Résultats : Bis(POM)PMEA
9-[2-(BisPivaloyolOxyMethyl)PhosphoMEthoxy]Adenine
[Bis(POM)PMEA ou Adefovir Dipivoxil]
Accumulation de Bis(POM)PMEA,
Mono(POM)PMEA et PMEA
Cellules sauvages
Bis(POM)PMEA
0-200 µM pdt 2 heures
Dosage des contenus cellulaires en
Bis(POM)PMEA, Mono(POM)PMEA et PMEA
HPLC: 4°C, flux de 1 mL/min, volume d’injection 25 µL.
Phase stationnaire: colonne Agilent C8 (4,6x250mm)
Phase mobile A : Acétonitrile
Phase mobile B : 900 mL de tampon [10 mM KH2PO4 et 2 mM (But)4N+ HSO4-] et 50 mL Acétonitrile.
Accumulation de Bis(POM)PMEA,
Mono(POM)PMEA et PMEA
Le profil de dégradation du Bis(POM)PMEA est caractérisé par :
• Une dégradation quasi complète du Bis(POM)PMEA ;
• Une importante formation de Mono(POM)PMEA ;
• Une production faible et saturable de PMEA.
Compétition entre CIPRO et Bis(POM)PMEA
Cellules sauvages
Cellules résistantes
CIPRO 50 µM
Bis(POM)PMEA
10-1000 µM
Dosage du contenu cellulaire en CIPRO
Fluorimétrie: λexcitation = 275 nm; λémission = 450 nm
Compétition entre CIPRO et Bis(POM)PMEA
Concentration Cellulaire de CIPRO
(% par rapport au contrôle ds les WT)
Accumulation de Ciprofloxacine
Cellules sauvages
Cellules résistantes
Cellules sauvages
Cellules résistantes
2 heures
4 heures
300
2 heures
4 heures
300
200
200
100
100
0
0
0 0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Bis(POM)PMEA
3.0 2.7
GEM
Log Concentration Extracellulaire (µM)
0 0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Bis(POM)PMEA
3.0 2.7
GEM
Log Concentration Extracellulaire (µM)
L’accumulation de CIPRO est augmentée en présence de Gemfibrozil
ou de Bis(POM)PMEA dans les deux types cellulaires
Compétition entre Bis(POM)PMEA et CIPRO
Cellules sauvages
Cellules résistantes
CIPRO 500 µM
Bis(POM)PMEA
50 µM
Dosage du contenu cellulaire en Mono(POM)PMEA et PMEA
HPLC: 4°C, flux de 1 mL/min, volume d’injection 25 µL.
Phase stationnaire: colonne Agilent C8 (4,6x250mm)
Phase mobile A : Acétonitrile
Phase mobile B : 900 mL de tampon [10 mM KH2PO4 et 2 mM (But)4N+ HSO4-] et 50 mL Acétonitrile.
Compétition entre Bis(POM)PMEA et CIPRO
Accumulation de Mono(POM)PMEA
Concentration Cellulaire de
Mono(POM)PMEA
(% par rapport au contrôle ds les WT)
Cellules sauvages
sauvages
Cellules
Contrôle
+ CIPRO
+ GEM
250
B
200
B
150
100
Cellules résistantes
résistantes
Cellules
Contrôle
+ CIPRO
+ GEM
250
b*
200
c*
150
A A
A A
50
100
50
0
a* a*
a* a*
0
120
240
Temps (Minutes)
120
240
Temps (Minutes)
L’accumulation de Mono(POM)PMEA n’est pas affectée par la CIPRO
mais l’est par le Gemfibrozil dans les cellules sauvages et résistantes
Compétition entre Bis(POM)PMEA et CIPRO
Accumulation de PMEA
Concentration Cellulaire de PMEA
(% par rapport au contrôle ds les WT)
Cellules sauvages
Cellules
sauvages
Cellules résistantes
Cellules
résistantes
Contrôle
+ CIPRO
+ GEM
300
B B
200
A
A
Contrôle
+ CIPRO
+ GEM
300
b
b
200
A
b
A
100
c
100
a*
0
a*
0
120
240
Temps (Minutes)
120
240
Temps (Minutes)
L’accumulation de PMEA est augmentée en présence de Gemfibrozil ou
de CIPRO et ce, surtout dans les cellules résistantes
CIPRO versus Bis(POM)PMEA/PMEA :
Conclusion de ces compétitions
Accumulation
Paramètre
Cellules
CIPRO
PMEA <
BIS(POM)PMEA
RS vs WT
Ì
Ì
Effet du Gemfibrozil
WT
Ê
(Ê)
Effet du médicament compétiteur
WT
Ê
(Ê)
Effet du Gemfibrozil
RS
Ê
Ê
Effet du médicament compétiteur
RS
Ê
Ê
Accumulation
Le Bis(POM)PMEA a un effet similaire à celui du Gemfibrozil…
Mais y a-t-il compétition pour l’efflux?
Cinétique d’efflux de la Ciprofloxacine
Cellules sauvages
Cellules résistantes
Incubation en présence
de 50 µM de CIPRO
Incubation en présence
de 50 µM de CIPRO
+ 300 µM de
Bis(POM)PMEA
Lavages
Réincubation en présence
ou non de 1000 µM de
Bis(POM)PMEA
Dosage du contenu cellulaire en CIPRO
Fluorimétrie: λexcitation = 275 nm; λémission = 450 nm
Cinétique d’efflux de la Ciprofloxacine
Cellules résistantes
Cellules sauvages
Cellules résistantes
CIPRO
125
CIPRO + BIS(POM)PMEA
100
t ½ : 1,30 min
t ½ : 2,94 min
75
50
25
0
0
10
20
Temps (Minutes)
30
Concentration Extracellulaire de
CIPRO
(% par rapport au contrôle ds les WT)
Concentration cellulaire en CIPRO
(% par rapport au contrôle ds les WT)
Cellules sauvages
CIPRO
125
CIPRO + BIS(POM)PMEA
t ½ : 0,12 min
t ½ : 2,14 min
100
75
50
25
0
0
10
20
30
Temps (Minutes)
Le PMEA inhibe l’efflux de la CIPRO dans les 2 types cellulaires
Compétition entre Ciprofloxacine et PMEA
Cellules sauvages
Cellules résistantes
CIPRO 50 µM
PMEA
10-1000 µM
Dosage du contenu cellulaire en CIPRO
Fluorimétrie: λexcitation = 275 nm; λémission = 450 nm
Compétition entre Ciprofloxacine et PMEA
Accumulation de Ciprofloxacine
Concentration Cellulaire de CIPRO
(% par rapport au contrôle ds les WT)
Cellules sauvages
Cellules résistantes
Cellules sauvages
Cellules résistantes
2 heures
4 heures
300
2 heures
4 heures
300
200
200
100
100
0
0
0 1.0
1.5
2.0
PMEA
2.5
3.0 2.7
GEM
Log Concentration Extracellulaire (µM)
0 1.0
1.5
2.0
PMEA
2.5
3.0 2.7
GEM
Log Concentration Extracellulaire (µM)
L’accumulation de CIPRO n’est pas (ou peu) affectée par le PMEA dans
les cellules sauvages et résistantes
CIPRO versus Bis(POM)PMEA/PMEA:
Conclusions générales
8
8
8
Le PMEA n’a quasi effet sur l'accumulation de CIPRO
dans les cellules sauvages et résistantes
Le Bis(POM)PMEA
Ê l’accumulation de CIPRO
Ì l’efflux de CIPRO
La CIPRO Ê l’accumulation de PMEA
Conclusions générales
Bis(POM)PMEA
PMEA
O
F
O
C
CIPRO
OH
N
O
N
F
HN
O
C
OH
N
N
HN
Le PMEA est substrat du transporteur MRP de la CIPRO et
inhibe également son efflux
Ciprofloxacine
O
F
O
C
O-
N
N
HN
PMEA et MRP4
Saquinavir et MRP2
PMEA [Adéfovir]
Saquinavir
9-(2-PhosphonylMethoxyEthyl)Adenine
Huisman et al. AIDS. 2002 16:2295-301.
Williams et al . AAC. 2002 46:3456-62.
Compétition entre Ciprofloxacine et SQV
Cellules sauvages
Cellules résistantes
CIPRO 50 µM
SQV
10-300 µM
Dosage du contenu cellulaire en CIPRO
Fluorimétrie: λexcitation = 275 nm; λémission = 450 nm
Compétition entre Ciprofloxacine et SQV
Concentration Cellulaire de CIPRO
(% par rapport au contrôle ds les WT)
Accumulation de Ciprofloxacine
Cellules sauvages
Cellules résistantes
Cellules sauvages
Cellules résistantes
500
500
2 heures
4 heures
400
2 heures
4 heures
400
300
300
200
200
100
100
0
0
0 0.0
0.5
1.0
1.5
SQV
2.0
2.5 2.7
GEM
Log Concentration Extracellulaire (µM)
0 0.0
0.5
1.0
1.5
SQV
2.0
2.5 2.7
GEM
Log Concentration Extracellulaire (µM)
L’accumulation de CIPRO est augmentée en présence de Gemfibrozil
ou de SQV dans les deux types cellulaires
Compétition entre SQV et Ciprofloxacine
Cellules sauvages
Cellules résistantes
CIPRO 500 µM
SQV 50 µM
Dosage du contenu cellulaire en SQV
HPLC: 25°C, gradient isocratique, flux de 1 mL/min.
Phase stationnaire : colonne Agilent C8 (4,6x250mm)
Phase mobile : 45% Acétonitrile / 55% de tampon [3,042 g KH2PO4 et 0,6 mL Triethylamine /L, ajusté à pH 3,1]
Compétition entre SQV et Ciprofloxacine
Accumulation de Saquinavir
Concentration Cellulaire de SQV
(% par rapport au contrôle ds les WT)
Cellules sauvages
Cellules
sauvages
Cellules résistantes
Cellules
résistantes
Contrôle
+ CIPRO
+ GEM
150
A
150
A
a
A
100
Contrôle
+ CIPRO
+ GEM
A
B
100
a
a
a
b
b
B
50
50
0
120
240
Temps (Minutes)
0
120
240
Temps (Minutes)
L’accumulation de SQV n’est augmentée ni par la CIPRO ni par le
Gemfibrozil dans les cellules sauvages et résistantes
CIPRO versus SQV :
Conclusion de ces compétitions
Accumulation
Paramètre
Cellules
CIPRO
SQV
RS vs WT
Ì
-
Effet du Gemfibrozil
WT
Ê
-
Effet du médicament compétiteur
WT
Ê
-
Effet du Gemfibrozil
RS
Ê
-
Effet du médicament compétiteur
RS
Ê
-
Accumulation
Le SQV a un effet similaire à celui du Gemfibrozil…
Mais y a-t-il compétition pour l’efflux?
Cinétique d’efflux de la Ciprofloxacine
Cellules sauvages
Cellules résistantes
Incubation en présence
de 50 µM de CIPRO
Incubation en présence
de 50 µM de CIPRO
+ 30 µM de SQV
Lavages
Réincubation en présence
ou non de 300 µM de SQV
Dosage du contenu cellulaire en CIPRO
Fluorimétrie: λexcitation = 275 nm; λémission = 450 nm
Cinétique d’efflux de la Ciprofloxacine
Cellules sauvages
Cellules résistantes
CIPRO
CIPRO
CIPRO
SQV
CIPRO
+ +SQV
100
t ½ : 2,19 min
t ½ : 3,50 min
75
50
25
0
Cellules résistantes
Concentration Extracellulaire de
CIPRO
(% par rapport au contrôle des RS)
Concentration cellulaire de CIPRO
(% par rapport au contrôle des WT)
Cellules sauvages
CIPRO
CIPRO
CIPRO
+ SQV
CIPRO
+ SQV
100
t ½ : 1,25 min
t ½ : 2,27 min
75
50
25
0
0
10
20
Temps (Minutes)
30
0
10
20
Temps (Minutes)
Le SQV inhibe l’efflux de la CIPRO dans les deux types
cellulaires
30
CIPRO versus SQV:
Conclusions générales
8
Le Saquinavir
Ê l’accumulation de CIPRO
8
Ì l’efflux de CIPRO
La CIPRO n’a aucun effet sur le Saquinavir
Conclusions générales
SQV
O
F
O
C
OH
N
CIPRO
N
HN
O
F
O
C
OH
N
N
HN
Le Saquinavir est un puissant inhibiteur du transport de la
CIPRO
Perspectives
8
Etudes à court terme :
•
Mécanisme d’inhibition par le Saquinavir : Compétitif ou non ?
→ Etudes pharmacocinétiques:
-
•
Accumulation de SQV à de plus faibles concentrations;
Etudes de la capture et de l’efflux du SQV.
Interaction du Saquinavir : MRP2 ou MRP4 ?
-
Compétition entre le Bis(POM)PMEA et le SQV;
Etude de l’accumulation des antiviraux et de leur pouvoir
inhibiteur sur le transport de la Ciprofloxacine dans des
cellules surexprimant spécifiquement MRP2 ou MRP4.
8
Etudes à long terme :
•
•
Implications pharmacocinétiques;
Conséquences toxicologiques et pharmacologiques.