MBI 2ème année PRO - DSIMB

Université Paris Diderot - Paris 7
Master « Sciences et Applications »
Mention « Biologie-Informatique »
MBI 2ème année PRO
PROPOSITION DE STAGE
Année Universitaire 2010 – 2011
Titre du stage : mise au point d’un protocole de Northern virtuel adapté aux données de
séquencage haut débit des petits ARNs et validation expérimentale
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Nom du Responsable du Laboratoire 1 : Dr. Bruno Villoutreix
Affiliation administrative (CNRS, INSERM,…) et Numéro d’affiliation de l'unité :
INSERM U973, MTI - Univ. Paris Diderot
Adresse précise du Laboratoire :
35 rue Hélène Brion, Bâtiment Larmarck, 75205 Paris Cedex 13, France
Nom du Responsable de l'équipe d'accueil (EA) : Pr Anne-Claude Camproux
E-mail : Anne-Claude.Camproux@univ-paris-diderot
Nom du Responsable du Laboratoire 2 : DR H. Barbier-Brygoo
Affiliation administrative (CNRS, INSERM,…) et Numéro d’affiliation de l'unité :
Institut des sciences du végétal, CNRS UPR 2355
Adresse précise du Laboratoire :
1 av de la terrasse, CNRS GIF/Yvette, 91198 Gif/Yvette cedex
Nom du Responsable de l'équipe d'accueil (EA) : DR M. Crespi
E-mail : [email protected]
Noms des Responsables du stage : Christelle Reynès1, Christine Lelandais2
Numéro de Téléphone : 0157278394
E-mail : christelle.reynes@univ-paris-diderot, [email protected],
Description du sujet :
Contexte
Les microARNs (miR) sont des petits ARN non codants, impliqués dans la régulation négative de l’expression
génique, qui jouent un rôle majeur dans le développement et la différenciation cellulaire (1). Récemment, plusieurs
études ont révélé leur implication dans les réponses adaptatives des plantes aux contraintes environnementales (2,3).
Les enjeux applicatifs sont donc très importants. L’équipe « Architecture racinaire et ARN riborégulateurs » de
l’Institut des Sciences Végétales (UPR2355, CNRS Gif/Yvette) s’intéresse aux rôles des miR dans l’adaptation de
Medicago truncatula (Mt) à la salinité des sols. Cette plante modèle de la famille des Légumineuses est proche de la
luzerne cultivée, dont la productivité est fortement limitée par ce stress avec de fortes conséquences pour
l'alimentation animale.
Depuis l’émergence des technologies de séquençage haut débit, le nombre de miR recensés croît à une vitesse
vertigineuse. Chez Mt, l’an passé, une centaine de nouveaux miR ont été identifiés grâce à la technologie 454 (4).
De plus, un programme national (Génoscope 2008-2010), coordonné par l’équipe « Architecture racinaire et ARN
riborégulateurs », a permis l’obtention de 200 autres miRs (non publié) à l’aide de la technologie Solexa, qui permet
un séquencage plus profond.
Le stage offre l'opportunité très rare et enrichissante de combiner les aspects d'analyse et la validation
expérimentale.
1ère partie du stage : Analyse de données
Les séquençages haut-débit permettent, outre l’identification de miR, de comparer de façon globale leurs profils
d’accumulation. Cependant, ces analyses, de type Northern virtuel, se révèlent particulièrement complexes,
notamment du point de vue de l'analyse statistique. Le protocole d'analyse, développé au cours du stage, devra ainsi
tenir compte d'un nombre important de caractéristiques qui représentent un réel challenge. En effet, la diversité des
petits ARN cellulaires (miR et petits ARN interférents) est très importante et se traduit par une forte variabilité entre
banques (5) qui nécessite le recours à des réplicats pour pouvoir attester de la significativité des observations. De
plus, la majorité des petits ARN ont un niveau d’accumulation très bas. Ces particularités impliquent la nécessité de
la mise au point d'analyses statistiques nouvelles des données et posent en particulier la question du nombre de
réplicats biologiques, de la profondeur du séquençage et des techniques de normalisation.
Cette partie du stage sera effectuée au sein de l'Equipe Inserm MTi (Molécules Thérapeutiques in silico). Elle
fera appel à des techniques d'analyse de données et d'apprentissage statistique permettant l'analyse des données de
séquençage haut-débit dans le cas des miR, dans un contexte pluridisciplinaire.
2ème partie du stage : validation expérimentale
Le deuxième partie du stage sera réalisée avec l’équipe « Architecture racinaire et ARN riborégulateurs » au
cours de cette période, l’étudiant pourra effectuer une validation expérimentale des résultats qu’il aura pu mettre en
évidence durant la partie « statistique » de son stage. Cette partie du travail sera réalisée à l’Institut des Sciences du
Végétal au CNRS de Gif/Yvette dans l’équipe « Architecture racinaire et ARN régulateurs ». Une dizaine de petits
ARN identifiés comme « régulés par le stress salin » dans les analyses statistiques seront sélectionnés d’après selon
différents critères (abondance dans les banques, activation ou répression en réponse au traitement salin, importance
du ratio de régulation). Cinq candidats « non-régulés » d’après les analyses seront aussi choisis en guise de contrôle.
L’accumulation de ces 15 petits ARNs dans des racines traitées ou non par du NaCl 100 mM (trois expériences
indépendantes) sera analysée simultanément par Northern et par RT-PCR en temps réel. Pour cette dernière
stratégie, plusieurs méthodes dédiées à l’analyse de l’accumulation des petits ARNs seront utilisées et comparées.
Références bibliographiques :
1- Chuck G, O'Connor D. Small RNAs going the distance during plant development.Curr Opin Plant
Biol. 2010, 13 : 40-5.
2- Ruiz-Ferrer V, Voinnet O., Roles of plant small RNAs in biotic stress responses. Annu Rev Plant
Biol. 2009, 60 : 485-510.
3- Sunkar R, Chinnusamy V, Zhu J, Zhu JK.Small RNAs as big players in plant abiotic stress
responses and nutrient deprivation. Trends Plant Sci. 2007, 12 : 301-9.
4- Lelandais-Brière C, Naya L, Sallet E, Calenge F, Frugier F, Hartmann C, Gouzy J and Crespi M,
Genome-wide Medicago truncatula small RNA analysis revealed novel miRNAs and isoforms
differentially regulated in roots and nodules, Plant Cell 2009, 21 : 2780-96
5- Nobuta K, McCormick K, Nakano M, Meyers BC. Bioinformatics analysis of small RNAs in plants
using next generation sequencing technologies. Methods Mol Biol. 2010, 592 : 89-106.
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