Exercice de biochimie et biologie moléculaire
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Exercice de biochimie et biologie moléculaire
1 Master – Pr Chap Université Paul Sabatier - Faculté de Médecine de Toulouse-Purpan Master 1ère année – Domaine Sciences de la Vie et de la Santé Option Physiopathologie Cellulaire Intégrée et Physiopathologie U.E. : « Biologie et Physiopathologie Moléculaires de la Cellule » (Pr. Hugues Chap) RAPPELS DE BIOCHIMIE ET BIOLOGIE MOLECULAIRE EXERCICE D’APPLICATION Cet exercice est inspiré de la publication suivante : Zheng, B., Chen, D., and Farquhar, G. (2000) MIR16, a putative membrane glycerophosphodiester phosphodiesterase, interacts with RGS16. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3999-4004. Les auteurs de ce travail s’intéressent à des protéines, parmi lesquelles RGS16, qui modulent la transduction du signal par une famille de récepteurs membranaires couplés aux protéines G. A l’aide d’une technique de clonage que nous décrirons plus loin dans le cours sur la transcription (double hybride pour two-hybrid), ils ont isolé un ADNc qui code pour une protéine interagissant avec RGS16 et appelée MIR16, pour Membrane Interacting protein for RGS16. Les résultats sélectionnés de cette publication illustrent la caractérisation de cet ADNc et de son produit MIR16. 1) Soit la Fig. 1 ci-dessous et sa légende : Le commentaire suivant est proposé par les auteurs : «…The full length cDNA isolated from a rat lung cDNA library encodes an ORF (open reading frame) of 331 aa with a calculated molecular mass of 37 kDa and was later named MIR16 (Fig. 1). Kyte-Doolittle analysis predicted that MIR16 contains two hydrophobic regions, one at the N terminus (amino acids 8-45) and the other close to the C terminus (amino acids 243276 ; Fig. 1). The N-terminal hydrophobic region is a putative signal peptide (based on a signal peptide prediction program), and the second hydrophobic region is a strong candidate for a membrane-spanning region (based on MACVECTOR von Heijne helix transmembrane prediction). Two putative N-glycosylation sites (-N-X-S/T-) were also found (Fig. 1) ». 2 Master – Pr Chap a) Qu’est-ce qu’un « full length cDNA » ? b) Qu’est-ce qu’un « open reading frame » ? c) Qu’est-ce qu’un « signal peptide » ? d) Quest-ce qu’un « strong candidate for a membrane-spanning region » ? e) Qu’est-ce qu’un site de N-glycosylation ? f) L’adjectif « putatif » est utilisé 2 fois par les auteurs. Pourquoi ? g) Quelles informations essentielles tirez-vous de ces résultats et de ces commentaires ? 2) Soit la Fig. 2 et sa légende : 3 Master – Pr Chap Les commentaires des auteurs sont les suivants : « Human and mouse orthologs of rMIR16, including an unknown gene from human chromosome 16, and several mouse and human expressed sequence tags were identified from data-bases. Two expressed sequence tag clones containing human and mouse orthologs of MIR16 were obtained from the American Type Culture Collection and sequenced. The deduced human and mMIR16 amino acid sequences showed 94 % and 99 %, respectively, overall similarity with rMIR16. A BLAST search with the amino acid sequence of MIR16 indicated that MIR16 has significant homology with GP-PDEs from E. coli and Haemophilus influenzae, suggesting that MIR16 may have GPE-PDE enzymatic activity. Up to now, no mammalian GP-PDE has been cloned. From the alignment shown in Fig .2, it can be seen that the N-terminal region of MIR16 (amino acids 70-150) immediately after the putative signal peptide (amino acids 8-45) is highly conserved (40-61 % similarity), suggesting that it may contain residues critical for enzymatic activity, i.e. the catalytic cycle ». L’abréviation GP-PDE signifie glycerophosphodiester phosphodiesterase, c’est-àdire une enzyme agissant sur des composés dérivés de la dégradation des phospholipides tels que la glycérophosphorylcholine, selon la réaction suivante : HO—CH2 HO—CH O || CH3 + CH2—O — P—O—CH2—CH2—N —CH3 − O CH3 + H2 O Glycérophosphocholine HO—CH2 HO—CH O || CH2—O — P—O—H O− + Glycérol-3-phosphate CH3 + HO—CH2—CH2—N —CH3 CH3 Choline Cette enzyme est connue depuis longtemps dans des bactéries, telles qu’Escherichia coli, où son gène a été cloné. Elle permet à la bactérie de récupérer des substrats énergétiques tels que le glycérol (après déphosphorylation du glycérol-3-phosphate). Une activité de ce type a été caractérisée chez les mammifères, y compris l’homme, en particulier dans le cerveau et le rein. Chez les mammifères, il a été proposé qu’elle puisse également servir à récupérer la choline. a) Qu’est-ce qu’un gène orthologue ? b) Qu’est-ce qu’un EST (expressed sequence tag) ? c) Qu’est-ce qu’une recherche de type BLAST ? 4 Master – Pr Chap d) Quelle est la conclusion essentielle tirée par les auteurs de la Fig. 2 et des données contenues dans les commentaires correspondants ? e) Sur la base des résultats présentés, les auteurs n’ont manifestement pas la preuve formelle que la protéine MIR16 possède une activité GP-PDE ? Quelle expérience suggérez-vous pour le démontrer ? f) Supposons que la réponse à la question (e) soit positive. Pouvez-vous commenter comment un ADNc peut être isolé de manière fortuite ? Quelle démarche aurait dû être entreprise pour cloner l’ADNc codant pour une GP-PDE par un chercheur, par exemple un neurobiologiste, s’intéressant à la GP-PDE du cerveau ? Pourquoi un neurobiologiste s’intéresserait-il à une GP-PDE ? 3) Soit la Fig. 3 et sa légende : Commentez les résultats présentés en donnant les grands principes des opérations effectuées. 4) Les expériences suivantes ont été réalisées à l’aide de deux anticorps dont la description est donnée ci-dessous. Antibodies : « MIR16 cDNA fragment (amino acids 46-331) was subcloned into the pET28 vector (Novagen), and the resulting plasmid was transformed into E. coli. Recombinant 6xHis-tagged fusion protein was purified on Ni-NTA agarose beads (Qiagen) according to the manufacturer’s instructions and used to immunize New Zealand White rabbits. IgG was purified from antiserum by Affi-Gel Protein A agarose beads (Bio-Rad) according to the manufacturer’s instructions. Monoclonal antibody 16B12 against the hemagglutinin (HA) epitope was purchased from Babco. Remarques : le vecteur pET28 est adapté à la préparation de protéines recombinantes en fusion avec une étiquette de 6 résidus consécutifs d’Histidine placés en N- ou C-terminal. 5 Master – Pr Chap Cette courte séquence de 6 His a une bonne affinité pour certains complexes de Nickel (NiNTA), permettant une purification facile de la protéine par chromatographie d’affinité. L’épitope HA est une courte séquence d’hémagglutinine introduite dans des protéines recombinantes sous forme d’étiquette à l’aide de vecteurs plasmidiques appropriés. Définissez les deux anticorps décrits ci-dessus en décrivant éventuellement les grandes lignes de leur préparation. 5) Soit la Fig. 4 ci-dessous obtenue à l’issue du protocole suivant : « HEK293 cells were transiently transfected with a pCDNA3 construct containing MIR16 with a C-terminal HA tag. At 48 h after transfection, cells were lysed by sonication and centrifuged at 1000 x g for 10 min to eliminate nuclei. The postnuclear supernatant (PNS) was then centrifuged at 100 000 x g for 30 min in order to separate a P100 pellet from the supernatant (S100). Proteins associated with each fraction were separated by SDS/PAGE and immunoblotted with anti-HA IgG ». PNS S100 P100 HA-MIR16 Quelle est votre conclusion ? Avec quelle donnée de la question 1 est-elle compatible ? Proposez un schéma illustrant les orientations possibles de la protéine dans la membrane. Comment pourriez-vous vérifier vos hypothèses ? 6) Dans la Fig. 5 ci-dessous, des cellules GC (lignée immortalisée de cellules hypophysaires de rat couramment utilisée par les auteurs et exprimant MIR16) ont été mises en culture et récupérées. La fraction P100 préparée comme nous l’avons décrit ci-dessus est ensuite incubée 30 min à 37°C en absence ou en présence d’endoglycosidase H (Endo H), une enzyme qui clive spécifiquement les liaisons entre les chaînes glucidiques et les résidus d’asparagine (Asn ou N) impliqués dans la N-glycosylation des protéines. La Figure cidessous montre les résultats d’un « Western blot » obtenu avec l’anticorps polyclonal décrit plus haut. − + Endo H 43 kDa 37 kDa Commentez ces résultats et donnez votre conclusion. Avec quelle donnée de la question 1 est-elle compatible ? 7) En supposant que la lecture de cet article vous ait convaincu de l’intérêt d’approfondir l’étude de MIR16, quel programme de recherche proposez-vous de développer ?