Etude de la présence de Kystes de Giardia - GIP Seine-Aval
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Etude de la présence de Kystes de Giardia - GIP Seine-Aval
Etat d’avancement des travaux du programme coordonnée de recherche sur l’estuaire de Seine (Thème I) Avril 2002 Etude de la présence de kystes de Giardia duodenalis dans l'estuaire de la Seine. Responsable : P. Brasseur Université de Rouen Introduction L'infection par Giardia duodenalis est la première cause de gastro-entérite parasitaire dans le monde (le nombre de nouveaux cas est estimé à 200 millions par an dans le monde avec 2 millions aux Etats Unis) (Furness BW, 2000). D'un point de vue clinique, la giardiose s'exprime surtout chez les enfants chez qui elle peut déterminer un ou plusieurs des symptômes suivants: diarrhée, flatulence, cassure de la courbe de poids, nausée, malabsorption, fatigue, anorexie. Bien que considérée générallement comme bénigne, cette pathologie peut être grave. Ainsi, Berkman et coll. viennent de montrer dans une étude effectuée au Pérou que l'existence d'antécédents de malnutrition due à des infections répétées par Giardia dans la petite enfance étaient associés chez des enfants péruviens âgés de 9 ans à une diminution de leurs capacités cognitives. Chez les adultes en revanche, l'infection est plus souvent asymptomatique mais elle peut être aussi responsable de troubles fonctionnels digestifs. Cette parasitose présente également un intérêt en médecine vétérinaire. Ainsi, chez certains animaux, en particulier les veaux, Giardia détermine une diarrhée de malnutrition grave qui peut mettre en jeu le pronostic vital. D'un point de vue épidémiologique, la présence de porteurs asymptomatiques méconnus qui élimine des kystes durant quelques semaines à quelques mois augmente la dissémination du parasite. En outre, l'importance relative des différents réservoirs de parasite reste méconnue. Si on a longtemps pensé que Giardia duodenalis était strictement inféodé à l'homme, il est maintenant bien démontré que ce parasite infecte également d'autres mammifères, que ce soient des rongeurs (rat, castors) ou des animaux domestiques, bovins en particulier (Slifko, 2000). De plus, plusieurs génotypes de ces parasites ont été caractérisés. Certains sont strictement inféodés à l'homme, d'autres responsables d'anthropozoonoses, d'autres encore spécifiquement animaux. En France, très peu d'études concernant l'épidémiologie de cette maladie ont été réalisées. Une étude récente que nous avons effectué en Haute Normandie retrouve une prévalence de 4% de cette protozoose chez l'homme (Maillot, 2000). Concernant le réservoir animal, nous effectuons actuellement une étude en collaboration avec le laboratoire Franck Duncombe de Caen pour déterminer la prévalence de la giardiose bovine en Basse Normandie. Les résultats préliminaires nous montre des taux de prévalence de la giardiose bovine de l'ordre de 1%, avec une maladie beaucoup plus fréquente chez les veaux âgés de moins de un mois. Le réservoir animal semble donc pouvoir jouer un rôle dans l'épidémiologie de la giardiose humaine. En effet, nous avons pu par ailleurs étudier le génotype de 16 isolats humains provenant de différentes régions françaises et montrer que la majorité des infections étaient dues à des génotypes pouvant infecter à la fois l'animal et l'homme (Lemée V, 2001) L'homme se contamine par ingestion de kyste à la suite de contacts interhumains (directs par les mains sales ou indirects via la manipulation d'objet contaminés) ou par ingestion de nourriture ou d'eau souillée. Giardia est ainsi l'agent étiologique qui a été le plus souvent associé à des épidémies de gastro-entérite liée à l'eau de boisson aux Etats Unis entre 1976 et 1994. Le risque pour l'homme est d'autant plus important que la dose infectieuse pour un individu sain est relativement faible (1 à 100 kystes)(Rendtorff, 1954). En outre, la dose infectante est probablement plus faible chez les sujets immunodéprimés, chez qui d'ailleurs la maladie est plus symptomatique (Abboud, 2001). Les formes parasitaires responsables de la contamination, les kystes de G. duodenalis, sont très résistantes dans un milieu hydrique ce qui explique que la contamination est liée à l'eau (eau de boisson ou récréative) et à la consommation de coquillages. Ainsi, Deregnier et coll. ont estimé la viabilité des kystes en rivière entre 56 et 84 jours suivant la saison (Deregnier DP, 1989). Dans ce contexte, le but de ce travail a été de rechercher les kystes de Giardia présents dans l'estuaire de Seine. - Page 1 - Etat d’avancement des travaux du programme coordonnée de recherche sur l’estuaire de Seine (Thème I) Avril 2002 1. Prélèvements et méthodes d'étude 1.1 Prélèvements Les prélèvement analysés ont été recueillis lors des campagnes suivantes: - Prélèvement du bouchon vaseux et étude des vasières (Mission DYVA, mai 2001) - Profil longitudinal (Campagne SNS, Mai 2001) - Prélèvement au niveau du gradient de salinité en période de crue (Mission Vastedeba, 29/4/2001) - Etude du gradient de salinité en période d'étiage (Août 2001) - Etude du panache de sortie de la station émeraude (Campagne STEP du 30/04/2001) - Etude d'un cycle semi diurne de marée au niveau du bouchon vaseux (Août 2001) 1.2 Méthode d’étude Les kystes de parasite ont été recherchés et dénombrés selon la technique recommandée par l'agence américaine de l'environnement pour la recherche et le dénombrement des kystes de Giardia dans les prélèvements d'eau (Méthode USEPA 1623, Avril 1999). Les prélèvements d'eaux ont ainsi été filtrés sur des cartouches Envirochek® (Pall Gelmann Laboratory, Ann Arbor, MI , USA). Après filtration, les parasites ont été élués selon la technique proposée par le fabricant: brièvement, les cartouches ont été vidées puis agitées deux fois consécutivement pendant 10 minutes en présence de 100 ml de tampon d'élution (Tampon Tris/EDTA (0.01M/0.001M) contenant 1g/l de lauryl-sulfate de sodium). L'eau restant dans la cartouche et les 200 ml de tampon d'élution sont ensuite mélangés et centrifugés (1500g, 10 min) et le culot obtenu est resuspendu dans 10 ml d'eau distillée. En ce qui concerne les prélèvements des vasières, ceux ci sont directement dilués dans l'eau distillée pour obtenir un volume total de 10ml. Les kystes de Giardia présents dans le prélèvement sont ensuite purifiés en utilisant le système Dynabeads® (Dynal France SA, Compiègne, France). Le principe de cette purification est d'utiliser des billes magnétiques recouvertes d'anticorps monoclonaux dirigés contre Giardia. Brièvement, les billes magnétiques recouvertes d'anticorps sont mélangées dans des tubes en verre avec l'échantillon en milieu tamponné. Après fixation des billes sur la paroi du tube par utilisation de portoirs aimantés, les parasites fixées sur les billes sont lavés puis séparés des billes par rupture de la liaison antigèneanticorps en milieu acide (HCl 0,1N). L'ensemble de l'échantillon susceptible de contenir des parasites est ensuite analysé en microscopie à fluorescence après utilisation d'anticorps monoclonaux fluorescents (Aqua-glo®, New Orleans, LA, USA). 2. Résultats 2.1 Etude de la vasière intertidale Nord: Aucun parasite n'a été retrouvé au niveau des prélèvements effectués (Tableau 1). - Page 2 - Etat d’avancement des travaux du programme coordonnée de recherche sur l’estuaire de Seine (Thème I) Avril 2002 2.2 Etude de la contamination des eaux de l'estuaire de la Seine: Lors de l'étude du profil longitudinal effectué en mai 2001 en période de crue, aucun parasite n'a été retrouvé (Tableau 2). Les résultats de l'analyse de différents prélèvements d'eau de surface effectués au niveau du gradient de salinité sont exposés dans les figures 1 et 2. Le tableau 3 résume les résultats de la recherche de kyste de Giardia à la sortie de la station émeraude et l'évolution en fonction de la distance avec le rejet. Enfin, l'évolution de la présence de parasite au cours d'un cycle semi diurne de marée au niveau du bouchon vaseux est résumée dans le tableau 4. 3. Discussion Aucun parasite n'a été retrouvé au niveau de la vasière intertidale Nord. Il n'existe malheureusement aucune donnée de la littérature à ce sujet. Toutefois, la durée de vie relativement limitée du parasite dans l'eau (56 à 84 jours) peut partiellement expliquer ces résultats. En outre, la difficulté de la recherche du parasite dans un milieu solide ou semi solide comme de la vase limite à la fois la prise d'échantillon possible et le rendement de la recherche (Nieminski EC, 1995). Au cours de la campagne SNS de profil longitudinal (Mai 2001), aucun parasite n'a été retrouvé. Cette campagne a été effectuée en période de grande crue et le phénomène de dilution liée à la crue peut en partie expliquer ces résultats. Concernant l'étude du gradient de salinité, il apparaît que l'on retrouve des parasites surtout dans les eaux de salinité faible (comprise entre 0 et 5g/l). Là aussi, aucune étude comparable n'a été rapportée dans la littérature. Il est toutefois intéressant de constater que lorsque les parasites sont présents, les concentrations sont comparables à celles retrouvées lors d'études effectuées dans d'autres rivières en Asie (Japon, Taiwan) ou au Canada (généralement de l'ordre de 0.1 à 1 kyste par litre)(Hashimoto A., 2002; Hsu BM, 2001; Ono K, 2001; Robertson LJ, 2001). L'étude du panache de sortie de la station d'épuration émeraude montre la présence de parasite à ce niveau malgré le faible volume de l'échantillon. Lors de cette étude, le seul prélèvement retrouvé négatif est celui dans lequel les flores indicatrices sont en très faible quantité. Il nous paraît donc important de recommencer cette étude sur de plus gros volume d'échantillons afin de pouvoir quantifier le parasite et d'analyser les résultats avec ceux des flores indicatrices. - Page 3 - Etat d’avancement des travaux du programme coordonnée de recherche sur l’estuaire de Seine (Thème I) Avril 2002 En conclusion, le but de cette étude était de rechercher la présence de kystes de Giardia au niveau des vasières, le long du gradient de salinité et au niveau du panache de sortie d'une station d'épuration. Ces résultats, bien que provenant de l'étude de faibles volumes d'eaux semble très intéressants et méritent d'être confirmer par des études complémentaires portants sur des échantillons de plus gros volume qui permettront de mieux préciser les concentrations en parasites présents dans les environnements considérés. - Page 4 - Etat d’avancement des travaux du programme coordonnée de recherche sur l’estuaire de Seine (Thème I) Avril 2002 Bibliographie Abboud P, Lemee V, Gargala G, Brasseur P, Ballet JJ, Borsa-Lebas F, Caron F, Favennec L Successful treatment of metronidazole- and albendazole-resistant giardiasis with nitazoxanide in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. Clin Infect Dis 2001;32(12):1792-4 Berkman DS, Lescano AG, Gilman RH, Lopez SL, Black MM. Effects of stunting, diarrhoeal disease, and parasitic infection during infancy on cognition in late childhood: a follow-up study. Lancet. 2002 ;359(9306):542. deRegnier DP, Cole L, Schupp DG, Erlandsen SL. Viability of Giardia cysts suspended in lake, river, and tap water. Appl Environ Microbiol 1989 May;55(5):1223-9 Furness BW, Beach MJ, Roberts JM. Giardiasis surveillance--United States, 19921997. Mor Mortal Wkly Rep CDC Surveill Summ 2000;49(7):1-13 Hashimoto A, Kunikane S, Hirata T. Prevalence of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts in the drinking water supply in Japan. Water Res 2002 Feb;36(3):51926 Hsu BM, Huang C, Hsu CL Analysis for Giardia cysts and Cryptosporidium oocysts in water samples from small water systems in Taiwan. Parasitol Res 2001 Feb;87(2):163-8 Lemée V. Etude génotypique de 16 isolats humains de Giardia duodenalis. DEA Relation Hôte parasite, 2001, Université Paris VII. Maillot C, Favennec L, Lalaude O, Savoye G, Riachi G, Zalar A, Hochain P, Brasseur P, Ducrotte P. Prospective study of the prevalence of protozoan gastroduodenal infection in a cohort of dyspepsia patients. Gastroenterol Clin Biol 2000;24(6-7):683-4 Nieminski EC, Schaefer FW 3rd, Ongerth JE. 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Profondeur (cm) Quantité analysée Giardia duodenalis -1 10g absence -3 10g absence -15 10g absence -29 10g absence Les recherches de kyste de Giardia ont été réalisée selon le protocole décrit dans le chapitre: " prélèvement et méthodes". Elles ont été faites sur les échantillons obtenus à partir de la carotte de sédiment (campagne DYVA). Tableau 2: Recherche de kystes de Giardia duodenalis le long de l'estuaire de la seine. Giardia duodenalis 202 absence 247 absence Point Kilométrique 260 337 absence absence 356 absence 357 absence Les recherches de kyste de Giardia ont été réalisée à partir de différents échantillons d'eau prélevés ( Campagne SNS) et selon le protocole décrit dans le chapitre: " prélèvement et méthodes". Les points kilométriques sont mesurés le long de l'estuaire de la Seine en prenant pour point 0 le Pont marie à Paris. Les points kilométriques 202, 247, 260, 337, 356 et 357 sont respectivement Poses amont, La Bouille, Le Croisset, Tancarville, Honfleur basse mer et Honfleur haute mer. - Page 6 - Etat d’avancement des travaux du programme coordonnée de recherche sur l’estuaire de Seine (Thème I) Gradient de Avril 2002 0 5.5 14.5 22.2 30.2 +* +** - - - salinité (g/l) Giardia duodenalis Figure 1: Recherche de kystes de Giardia le long du gradient salinité (mai 2001) Les recherches de kystes de Giardia ont été réalisée à partir de différents échantillons d'eau de surface le long du gradient de salinité (mission Vastedeba) et selon le protocole décrit dans le chapitre: " prélèvement et méthodes" (+ : présence et -: absence dans 250 ml). * 4 kystes par litre. ** 8 kystes par litre. Gradient de 0.35 5 15 20.2 32.8 - + + - - (0.2/l) (0.2/l) salinité (g/l) Giardia duodenalis Figure 2: Recherche de kystes de Giardia le long du gradient salinité (août 2001) Les recherches de kystes de Giardia ont été réalisée à partir de différents échantillons d'eau de surface le long du gradient de salinité (mission août 2001) et selon le protocole décrit dans le chapitre: " prélèvement et méthodes" (+ : présence et -: absence dans 5 l). - Page 7 - Etat d’avancement des travaux du programme coordonnée de recherche sur l’estuaire de Seine (Thème I) Avril 2002 Tableau 3: Recherche de Giardia duodenalis à la sortie de la station d'épuration émeraude et évolution en fonction de la distance avec le rejet. 0 Matières en 21 suspension (mg/l) Giardia +* duodenalis 1.5 20 - Point kilométrique à partir de la STEP 3.5 6.5 9.5 35 32 30 +** + 13.5 23 + + Les recherches de kystes de Giardia ont été effectuées dans les eaux de la Seine après le rejet de la station d'épuration émeraude selon le protocole décrit dans le chapitre: " prélèvement et méthodes" (+ : présence et -: absence dans 250 ml). * 4 kystes par litre. ** 8 kystes par litre. Tableau 4: Recherche des kystes de Giardia au cours d'un cycle semi diurne de marée au niveau du bouchon vaseux. Minutes après la basse mer -100 0 100 200 300 400 surface +** +** - fond +* +* +* - Les recherches de kystes de Giardia ont été réalisée à partir de différents échantillons d'eau d'un cycle semi diurne de marée au niveau du bouchon vaseux (mission Thalia, août 2001) et selon le protocole décrit dans le chapitre: " prélèvement et méthodes" (+ : présence et -: absence dans 5 l). * 0.2 kystes par litre. ** 0.4 kystes par litre. - Page 8 -