SWS v2.3 - Immuno Concepts

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RELISA® ENA
Single Well Screening Test
For Antibodies to
Extractable Nuclear Antigens
For Professional Use
Pour l’Usage Professionnel
Per Uso Professionale
Para El Uso Profesional
Für Professionellen Gebrauch
För yrkesmässigt bruk
English
2
Français
7
Italiano
12
Español
17
Deutsch
22
Svensk
27
Bibliography
32
Bibliographie/Riferimenti
Bibliografici/Bibliographie/Bibliografi
RELISA® ENA SINGLE WELL SCREENING TEST
FOR ANTIBODIES TO EXTRACTABLE NUCLEAR
ANTIGENS
proteins, the wells are incubated with goat anti-human
antibodies that are labeled with horseradish peroxidase. The horseradish peroxidase-conjugated antibody
preparation that is included in the test system is specific
for human IgG heavy and light chains.
FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE
SUMMARY AND EXPLANATION OF THE TEST
After incubation with horseradish peroxidase conjugate,
a stable three part complex is formed if results are positive. This complex consists of horseradish peroxidaseconjugated anti-human antibody bound to human
anti-ENA antibody, which is bound to the antigen
stabilized on the plastic surface.
Intended Use: This is an enzyme immunoassay (EIA) test
system for the detection of antibodies to the extractable nuclear antigens Sm (Smith), RNP, SSA/Ro, SSB/La,
Scl-70, and Jo-1 in human serum. The results from this
assay can be used as an aid in the diagnosis of autoimmune diseases.
After another washing step, this complex is detected
by adding a solution of tetramethylbenzidine (TMB)
and H2O2 as a chromogenic substrate. The degree of
color development in each well is proportional to the
concentration of anti-ENA antibodies in each serum
sample. Each microwell is read using a spectrophotometer at 450 nm.
Antibodies to extractable nuclear antigens (ENA) have
been associated with several autoimmune syndromes,
and appear to be of diagnostic and/or prognostic
significance in systemic sclerosis (1, 2), mixed connective tissue disease (3-5), Sjögren’s syndrome (6, 7),
polymyositis (8), dermatomyositis (9), systemic lupus
erythematosus (5), and rheumatoid arthritis (10). The
antinuclear antibody (ANA) test has been used as
a screen for these antibodies, but the ANA does not
indicate the specificity of the antibody, and antibodies
to some ENA do not show a positive ANA test (11, 12).
Thus, secondary confirmatory testing for antibodies to
ENA is highly recommended (13).
SYSTEM COMPONENTS (MATERIALS PROVIDED)
Storage: All components should be stored under refrigeration between 2-10°C. Do not freeze.
Stability: All components remain stable at least 12
months from date of manufacture. Do not use any
component beyond its expiration date.
The Sm (Smith) antigen was identified in 1966 by Tan
and Kunkel as a saline soluble, non-histone glycoprotein, which is not dependent on DNA or RNA for its
antigenicity (14). Antibodies to the Sm antigen are
considered a specific serologic marker due to their high
degree of specificity for systemic lupus erythematosus
(SLE). These antibodies are seen in up to 30% of SLE
patients, and have been associated with active renal
disease and cerebritis (15-17).
REACTIVE REAGENTS
Extractable nuclear antigen coated microwell strips:
Catalog No. 7008-10. Eight well strips coated with
a blend of six stabilized affinity purified extractable
nuclear antigens (Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70, and
Jo-1). These strips are color coded brown. One eight
well strip is sealed in each individual foil pouch.
Antibodies to Sm antigen are frequently found in
conjunction with antibodies to U1-RNP in the sera of
patients with SLE (18, 19). In contrast to antibodies to
Sm antigen, antibodies to RNP are not considered a
specific serologic marker because they are found in
patients with a variety of rheumatic diseases including
SLE, scleroderma, Sjögren’s syndrome, and rheumatoid
arthritis. However, high levels of antibody to RNP are
highly associated with an overlap syndrome called
mixed connective tissue disease (MCTD). Patients with
MCTD are characterized by a combination of clinical
features seen in SLE, scleroderma, and polymyositis.
These patients frequently demonstrate a good response
to corticosteroid treatment and have a lower incidence
of renal disease when compared to patients with SLE
(20, 21).
SSA and SSB were originally described as nuclear RNAprotein antigens in patients with Sjögren’s syndrome
(6, 7). Ro and La were described as cytoplasmic RNAprotein antigens in patients with SLE (22, 23). It is now
widely accepted that SSA and Ro are analogous, SSB
and La are analogous, and these antigens are found in
both the nucleus and cytoplasm. Antibodies to SSA/Ro
alone or SSA/Ro and SSB/La are found in up to 62% of
patients with subacute cutaneous lupus (24), and in 85%
of patients with Sjögren’s syndrome who develop vasculitis (25). Antibodies to SSA/Ro alone occur in patients
who have a homozygous deficiency of the C2 complement fraction (26), in primary biliary cirrhosis patients
who develop Sjögren’s syndrome (27), and in up to two
thirds of patients with “ANA negative SLE” (28).
The Scl-70 antigen has been identified as a cellular
enzyme, DNA topoisomerase I (29). Antibodies to
Scl-70 have been reported in up to 56% of patients with
progressive systemic sclerosis, particularly the subset of
patients with diffuse scleroderma (30). These autoantibodies are considered a marker for PSS, since they are
not seen in other connective tissue diseases. Antibodies
to Jo-1, which is the cellular enzyme histidyl tRNA synthetase, are found in 25-30% of patients with polymyositis or dermatomyositis, but not in other myopathies (11,
31). Anti Jo-1 antibodies have also been shown to have
a high association with interstitial lung disease seen in
conjunction with myositis (31).
PRINCIPLE OF THE TEST
This test is a qualitative indirect EIA. A blend of stabilized affinity-purified extractable nuclear antigens has
been coated onto the surface of the microwells to
serve as an antigenic substrate in this system. Dilutions
of the patient samples are placed in the microwells and
incubated, allowing specific antibodies in the sample
to react with the antigen on the solid phase. After
washing to remove unbound antibody and other serum
2
Sample Diluent: Catalog No. 7100 (100 ml). Proprietary
buffered sample diluent used to dilute patient samples.
Enzyme Antibody Reagent - Human IgG heavy and light
chain specific: Catalog No. 7009-10 (6 ml). Goat antihuman IgG (H&L) conjugated to horseradish peroxidase
(HRP). Reagent is ready to use.
Substrate Solution: Catalog No. 7035 (6 ml). HRP-specific enzyme substrate solution, containing stabilized
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) and hydrogen
peroxide (H2O2). Reagent is ready to use.
Stopping Reagent: Catalog No. 7033 (6 ml). Proprietary stopping reagent for Immuno Concepts EIA test
systems. Reagent is ready to use. CAUTION: Corrosive.
This reagent contains hydrochloric and sulfuric acids
(less than 3% each, by volume), and should be handled
with care. Keep out of the reach of children. In case
of contact with eyes, flush immediately and thoroughly
with water and consult a physician. Never add water
to this reagent.
ENA Calibrator Serum: Catalog No. 7026-10 (1 ml).
Human serum that contains antibodies to one or more
of the extractable nuclear antigens Sm, RNP, SSA/Ro,
SSB/La, Scl-70, and/or Jo-1. The assay value for this
serum is stated on the vial label. This serum is at working
dilution and is ready to use. This reagent contains 0.1%
sodium azide as a preservative.
ENA Positive Control: Catalog No. 7021-10 (1 ml). Human positive control serum that contains antibodies to
one or more of the extractable nuclear antigens Sm,
RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70, and/or Jo-1. This serum is
at working dilution and is ready to use. This reagent
contains 0.1% sodium azide as a preservative.
ENA Negative Control: Catalog No. 7031 (1 ml). Human
negative control serum that does not contain antibodies to Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70, or Jo-1 antigens.
This serum is at working dilution and is ready to use. This
reagent contains 0.1% sodium azide as a preservative.
Optional ENA Undiluted Assayed Positive Control:
Catalog No. 7022-10 (0.25 ml). Human positive control
serum that contains antibodies to one or more of the
extractable nuclear antigens Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La,
Scl-70, and/or Jo-1. Treat this positive control as an
undiluted serum. The assay value for this serum is stated
on the vial label. This reagent contains 0.1% sodium
azide as a preservative.
NON-REACTIVE COMPONENTS
HOLDER FOR MICROWELL STRIPS
Wash Buffer Solution:
PBS Buffer: Catalog No. 1011. Phosphate-buffered
saline powder (0.01 M, pH 7.4 ± 0.2). Each pouch
contains sufficient buffer powder to make one liter.
(Two pouches of buffer powder are supplied for each
96-microwell plate in complete test kits).
may give false results.
16. The stopping reagent is corrosive, and may cause
burns. This reagent contains hydrochloric and
sulfuric acids (less than 3% each, by volume), and
should be handled with care. Keep out of the
reach of children. In case of contact with eyes,
flush immediately and thoroughly with water and
consult a physician. Never add water to this
reagent.
Wash Buffer Concentrate: Catalog No. 1031 (10 ml). 5%
Tween 20 solution to be used in the wash buffer. (Two
vials of buffer concentrate are supplied for each 96microwell plate in complete test kits).
SPECIMEN COLLECTION
Preparation: Dissolve one pouch of buffer powder in
one liter of deionized or distilled water. Add the entire
contents of one bottle of Wash Buffer Concentrate
to the dissolved PBS. Mix well and store refrigerated
between 2-10°C for up to 4 weeks or until signs of
contamination or other visible changes occur. Wash
buffer solution must be at room temperature (19-23°C)
before use.
Collection: Serum is the preferred specimen. Approximately 5 ml of whole blood should be collected aseptically by venipuncture using a sterile vacuum collection
tube or other suitable collection system. Allow blood to
clot at room temperature (19-23°C). Serum should be
separated from the clot by centrifugation as soon as
possible to minimize hemolysis.
CAUTION: Do not heat inactivate serum samples to be
used for RELISA® ENA screen testing. Heat inactivation
can cause elevated values.
ADDITIONAL MATERIALS REQUIRED (BUT NOT
PROVIDED)
Interfering Substances: Sera exhibiting a high degree
of hemolysis, icterus, lipemia, or microbial growth
should not be used because these conditions may
cause aberrant results. Specimens containing visible
particulate matter should be clarified by centrifugation
before testing.
Volumetric precision pipettors to deliver 25-1000 µl
volumes
Squeeze bottle for delivering wash buffer solution to
microwells, or an automated or semi-automated
wash system for microwells
One liter container for PBS wash buffer solution
Deionized or distilled water
Plate reading spectrophotometer capable of reading absorbance at 450 nm
Test tubes to prepare serum dilutions
Bibulous paper or paper towels
Multichannel pipettor capable of delivering to 8 wells
Disposable latex gloves
Lab timer
Storage: Sera may be stored at 2-10°C up to one week.
If testing is further delayed, sera should be stored frozen
at -20°C or lower. Sera should not be stored in a selfdefrosting refrigerator or freezer.
CAUTION: Repeated freeze/thawing of patient samples
may yield false positive or false negative results.
GENERAL PROCEDURAL NOTES
PRECAUTIONS
1. It is extremely important to have all kit components
and serum samples at room temperature (19-23°C)
before use. A full liter of wash buffer may require
several hours to warm to 20°C after removal from
the refrigerator. Incubation temperatures above
or below the stated range may cause inaccurate
results. Return unused samples and reagents to
refrigerated storage after use.
2. Mix reagents well before use by gentle inversion.
Do not vortex or shake reagents. Avoid foaming.
3. When preparing sample dilutions, pipette tips
should be wiped prior to dispensing serum into
specimen diluent. Excess sample adhering to the
outside of the pipette tip will affect results.
4. The use of a multichannel pipettor is recommended
because it provides more uniform reagent dispensing, incubation times, and reaction times.
5. Adequate washing of wells is extremely important.
Inadequately washed wells will exhibit high background values, and may show false positive values.
For manual washing, aspirate the contents of the
wells, then fill each well with wash buffer solution.
Avoid cross-contamination of the wells, particularly
in the first wash after aspiration. Drain all of the
wash buffer from the wells by inverting, then shaking residual wash buffer from the wells with a sharp
“snapping” motion of the wrist. Repeat the filling
and draining steps for a total of 3 to 5 washes. The
wells should then be rapped vigorously on a paper
towel or other absorbent material to remove all
traces of residual wash buffer. The use of an automated microwell washing system will assure consistent washing of the wells, and is recommended.
NOTE: Due to the various types of wash techniques
and automated systems, the number of washes
may be adjusted to obtain optimal results. Each
laboratory should determine the most efficient
number of washes for its washing system.
6. Inadequate removal of residual wash buffer can
cause inconsistent color development. Microwell
strips should be blotted on absorbent paper or
towels to minimize residual wash buffer.
7. Timing of all steps is critical. All serum samples
should be diluted before beginning the procedure,
and they must be dispensed into the microwells
in as short a period of time as possible (not more
than five minutes). Batch sizes should be set so that
specimen handling can be accomplished comfortably within this time period. The use of a multichannel pipettor facilitates the handling of samples and
reagents, and is recommended.
8. With the exception of the last incubation (substrate
solution), the start of each incubation period begins
with completion of sample or reagent dispensing.
The substrate solution incubation must be exactly
five minutes for each well. All samples and re-
1. All human source materials used for this product
have been tested and found negative (not repeatedly reactive) for antibodies to Human Immunodeficiency Virus-1 (HIV-1), Human Immunodeficiency
Virus-2
(HIV-2), hepatitis C virus (HCV), and for hepatitis B
surface antigen (HBsAg) by FDA approved methods. However, no test method can offer complete
assurance that HIV-1, HIV-2, hepatitis C, hepatitis B,
or other infectious agents are absent. Thus, all kit
materials should be handled in the same manner as
potentially infectious materials.
2. All control sera, calibrator sera and patient samples
should be handled at the Biosafety Level 2 as
recommended for any potentially infectious human
serum or blood specimen in the Centers for Disease
Control/National Institutes of Health Manual:
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 1984 Edition.
3. Sodium azide (0.1%) is used as a preservative in
the control and calibrator sera. Sodium azide
may react with lead or copper plumbing and form
highly explosive metal azides. When disposing of
reagents, flush with ample volumes of tap water
to prevent potential residues in plumbing. Sodium
azide is a poison and may be toxic if ingested.
4. Dilution of the components or substitution of components other than those provided in this system
may yield inconsistent results.
5. Do not heat inactivate serum samples to be used
for RELISA® ENA screen testing. Heat inactivation
can cause elevated values.
6. This kit is for in vitro diagnostic use.
7. Never pipette by mouth and avoid contact of
reagents and specimens with skin and mucous
membranes. If contact occurs, wash with a germicidal soap and copious amounts of water.
8. Do not smoke, eat, or drink in areas where specimens or kit reagents are handled.
9. Avoid splashing or generation of aerosols at all
times.
10. Incubation times and temperatures other than
those specified may give erroneous results.
11. Cross contamination of reagents or samples may
give false results. Samples must remain confined to
microwells during testing.
12. Reusable glassware must be washed and thoroughly rinsed free of detergents prior to use. All
glassware must be clean and dry before use.
13. Bring all reagents, microwells, and specimens to
room temperature (19-23°C) prior to use.
14. Wear disposable latex gloves when handling specimens and reagents, and wash hands thoroughly
afterwards.
15. Microbial contamination of reagents or samples
3
agents should be dispensed in the same sequence
and at a constant rate.
9. If any control value is out of range, the assay is
invalid and must be repeated.
INTERPRETATION OF RESULTS
INTERPRETATION OF PATIENT RESULTS
CALCULATIONS
1. This is a qualitative assay. The levels of antibody
detected have no known clinical significance, and
the Unit values obtained in this assay are designed
merely to separate patients into the following three
broad groups. Patient sample wells that have
calculated values greater than or equal to 25 ENA
Units are considered to be positive, and should
be tested for individual ENA specificities. Patient
sample wells that have calculated values less than
20 ENA Units are considered to be negative. Values
between 20 Units and 25 Units are considered to
be borderline positive and should be repeated,
or should be tested for individual ENA specificities.
Each laboratory must establish its own reference
range and cut-off values based on the population
of patients that are being tested. Unit values are
affected by patient factors, mechanical considerations (such as pipetting precision and accuracy),
and assay conditions (such as temperature and
timing of steps).
2. Since the RELISA® ENA Single Well Screening Test
contains a blend of antigens, the results represent
a composite of the reactions of antibodies to
each of the six antigens. If low levels of multiple
autoantibodies are present, the RELISA® ENA Single
Well Screening Test may show a positive result, but
the individual specificities may be below the cutoff
values for each.
1. Subtract the absorbance value for the reagent
blank well from the absorbance values obtained in
calibrator, control, and patient sample wells. Calculate the mean absorbance values for duplicate
wells.
2. Divide the specific antibody concentration of the
calibrator serum (stated on the label) by the mean
absorbance value of the calibrator wells to obtain
the Conversion Factor.
3. Multiply the absorbance values of each of the
samples by the Conversion Factor to obtain the
specific antibody concentration in units.
4. The simplified form of these calculations can be
expressed as:
��
��
�
��
�
��
��
��
��
��
REPORTING OF RESULTS
Results should be reported as positive or negative for
antibodies to extractable nuclear antigens. The levels
of antibodies have no known
clinical
��
��significance.
��
*If calibrators and samples are run in duplicate, use the
average absorbance of the duplicate wells.
��
QUALITY CONTROL�
��
��
�
��
LIMITATIONS OF THE TEST
1. The mean absorbance value of the calibrator wells
must be at least 0.400. Absorbance values less than
��
��
0.400 indicate
inadequate
color development, and
an invalid
Inadequate
development
�� run.
��
��color
��
�
is usually due to use of cold reagents or incorrect
�
� � ��
timing of one or more steps of the assay. Allow
�� to
� ��
��
��
reagents
warm to
room temperature
(19-23°C),
and repeat the run with particular attention paid to
the timing of all steps.
2. The blank control well should have an absorbance
value of less than 0.150. Blank absorbance values
greater than 0.150 indicate inadequate washing, or
contamination of reagents.
3. Samples with specific antibody values greater than
the upper limit of the calibrator can be further
diluted in sample diluent and reassayed to obtain
� ��estimate
��
a more��
accurate
of the��
specific antibody
value. �To� �
obtain
the final
antibody
��
��specific
��
� value
for these samples, determine the unit value for the
�
�
�
��
��
��
�
absorbance of the diluted sample (as above),
��
��
and multiply
by the��
dilution��
factor.
For example, if
a specimen at 1:40 shows an absorbance greater
than the calibrator, the specimen can be further
diluted to 1:80 by mixing 100 µl of the 1:40 dilution
with 100 µl of sample diluent. The 1:80 dilution is
then assayed, and the result that is obtained is
multiplied by two (the dilution factor) to get the
final unit value.
4. The Conversion Factor must be calculated for each
run. Using a Conversion Factor from another run will
invalidate the results.
5. Each laboratory should establish and maintain its
own reference (normal) range values, based on
the patient population and other local factors.
6. The positive
control
is a human
serum that
��
��serum
��
��
contains antibodies to one or more of the extract��
able nuclear antigens Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl�� Jo-1.
��
��
� which
70, and/or
This is a qualitative
control
should ��
give
a value
20 ENA Units.
� ��
��of
�� greater
��than
��
7. The negative control serum is a pool of human
serum that does not contain antibodies to any of
the six autoantigens in this test. This is a qualitative
control which should give values of less than 20 ENA
Units.
8. The undiluted assayed positive control serum is
a human serum that contains antibodies to one
or more of the extractable nuclear antigens Sm,
RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70, and/or Jo-1. The assay
value of this control, in ENA Units, is stated on the
��
label. This range was established to encompass
� �values
��
��
�
99% of �
the
expected
due to statistically
normal�variation.
Occasional small
� � ��
� deviations
outside these ranges are expected. Each labora��
tory should establish its own accept/reject criteria
��
based on its experience with this assay.
��
��
��
��
��
��
�
�
�
��
��
��
�
�
�
��
��
��
4
��
��
1. Diagnosis cannot be made on the basis of antibodies to extractable nuclear antigens alone. The
physician must interpret these results in conjunction
with the patient’s history and symptoms, the physical findings, and other diagnostic procedures.
2. Treatment should not be initiated on the sole basis
of a positive test for antibodies to extractable
nuclear antigens. Clinical
indications,
other
labora��
��
��
� ��
tory findings, and the physician’s clinical impression
��
��
��
must be considered before any treatment is initi��
ated.
3. Some patients with autoimmune diseases may have
undetectable or insignificant levels of antibodies to
extractable nuclear antigens, and some individuals
may have high levels of antibodies to extractable
nuclear antigens, but little or no evidence of clinical
disease. The physician must interpret the results of
tests for antibodies to extractable nuclear antigens
in conjunction with the patient’s history and symptoms, the physical findings, and other diagnostic
procedures.
4. The levels of antibody detected with this test system
do not necessarily indicate severity or duration of
disease.
EXPECTED VALUES
The incidence of autoantibodies to various nuclear
antigens varies depending upon
the patient population, and the incidence of clinical
��
rheumatic diseases in that population. The association
��
��
��
of the antibodies with��
specific
rheumatic
diseases
is
summarized in table 1. ��
REFERENCE RANGE
The reference range was established by testing sera
from 403 healthy blood donors, 205 females and
198 males, none of whom had any known history of
rheumatic diseases. Based on these data, the normal
cut-off values were established as less than 20 ENA
Units. Good laboratory practice dictates that each
laboratory must establish its own normal ranges based
on its patient population and other local factors.
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
The Immuno Concepts RELISA® Single Well ENA Screen��
��
ing Test was compared to Immuno
Concepts
RELISA® � ��
Multiparameter ENA Screening
Test. The ��
patient
popu��
��
lation studied consisted of 50 patients who
met the��
��
criteria for a diagnosis of Systemic Lupus Erythematosus,
25 patients with autoimmune myositis or myositis overlap
syndromes, 23 patients with a diagnosis of Sclero-
REPRODUCIBILITY
derma or Progressive Systemic Sclerosis, 21 patients
with Sjögren’s Syndrome, 3 patients with a diagnosis of
Rheumatoid Arthritis, 18 patients with undifferentiated
connective tissue disease and 403 individuals without
known autoimmune disease. Based on this comparison,
the following data were obtained. Table 2.
Six positive samples and five negative samples were
run on three different lot numbers of antigen strips, on
three different occasions. In no case did a negative
sample show positive results, and the positive samples
consistently gave clearly positive results.
Borderline results were considered positive. These data
yield the following statistics: relative sensitivity, 97.9%;
relative specificity, 97.8%; and overall agreement, 97.8%
TABLE 1
��
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TABLE 2 ��
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RELISA® SINGLE WELL SCREEN
TEST PROCEDURE
All samples, reagents (including the wash buffer solution), and
microwells must be at room temperature before use.
1.
2.
PREPARE WORKSHEET
Label the worksheet that is enclosed in the
kit to indicate the location of the samples
in the microwells. Assay the calibrator in
duplicate. One well is used for a reagent blank. We recommend that each
control and patient sample be assayed
in duplicate until you have established an
acceptable precision for the assay in your
laboratory.
PREPARE WASH BUFFER SOLUTION (PBSTween)
Dissolve contents of one PBS buffer pouch
in one liter of deionized or distilled water.
Add the entire contents of one bottle of
Wash Buffer Concentrate to the one liter
container of dissolved PBS. Mix well. The
wash buffer solution may be covered and
stored at 2-10° C up to four weeks.
3.
DILUTE PATIENT SAMPLES
Dilute patient samples 1:40 by adding 25
µl of serum to 975 µl of Sample Diluent. If
you are using the optional ENA undiluted
assayed positive control, dilute it in the
same manner as the patient samples. Mix
well. The calibrator, positive control, and
negative control are provided at the working dilution and do not require any further
dilution.
4.
PREPARE MICROWELLS
Remove the required number of microwells
from their pouches, and place them in the
frame holder. The microwells must be firmly
seated in the frame holder. Press down
firmly on both ends of the strips so that
they securely snap into the frame holder. If
using individual wells or less than a full strip
of wells, be sure each well is firmly seated.
Wells that are properly seated in the frame
holder will not fall out when the frame
holder is inverted. If fewer than eight wells
are needed for testing, the wells can be
separated by snapping them apart. The
unused wells can be returned to the foil
pouch, sealed with cellophane tape, and
refrigerated for up to 14 days.
5.
DISPENSE SERUM DILUTIONS
Dispense 50 µl of the calibrators, controls,
and diluted patient samples into the appropriate wells as outlined on the worksheet.
Dispense 50 µl of Sample Diluent into the
reagent blank well.
6.
INCUBATE STRIPS(30 minutes at room temperature, i.e. 19-23°C)
Incubate at room temperature for 30
minutes. The strips should be protected
from drafts or shifts in temperature during
incubation. If desired, the strips can be
covered with transparent tape or a paper
towel to protect them from dust or other
foreign bodies.
7.
WASH STRIPS (See General Procedural
Notes 5 and 6)
Wash the wells 3 to 5 times with PBS-Tween
Wash Buffer Solution. For manual washing,
aspirate the contents of the wells, then fill
each well with wash buffer solution. Avoid
cross-contamination of the wells, particularly in the first wash after aspiration. Drain all
of the wash buffer from the wells by inverting, then shaking residual wash buffer from
the wells with a sharp “snapping” motion
of the wrist. Repeat the filling and draining
steps for a total of 3 to 5 washes. The wells
should then be rapped vigorously on a
paper towel or other absorbent material to
remove all traces of residual wash buffer.
8.
DISPENSE ENZYME ANTIBODY REAGENT
Dispense 50 µl of Enzyme Antibody Reagent
to each of the wells.
9.
INCUBATE STRIPS (30 minutes at room temperature, i.e., 19-23°C)
Incubate at room temperature for 30
minutes. The strips should be protected
incubation. If desired, the strips can be
covered with transparent tape or a paper
towel to protect them from dust or other
foreign bodies.
10.
WASH STRIPS
Wash the wells 3 to 5 times with PBS-Tween
Wash Buffer Solution. For manual washing,
aspirate the contents of the wells, then fill
each well with wash buffer solution. Avoid
cross-contamination of the wells, particularly in the first wash after aspiration. Drain all
of the wash buffer from the wells by inverting, then shaking residual wash buffer from
the wells with a sharp “snapping” motion
of the wrist. Repeat the filling and draining
steps for a total of 3 to 5 washes. The wells
should then be rapped vigorously on a
paper towel or other absorbent material to
remove all traces of residual wash buffer.
11.
DISPENSE SUBSTRATE SOLUTION
Using a timer to assure consistent intervals,
dispense 50 µl of Substrate Solution to each
of the wells. The Substrate Solution must be
added to the wells at a steady rate, so that
each well is incubated for exactly the same
length of time (five minutes). The substrate
solution in wells incubated with positive
samples will turn blue, and the solution in
wells incubated with negative samples will
be colorless to very pale blue.
12.
INCUBATE STRIPS (Exactly 5 minutes at room
temperature, i.e., 19-23°C)
Incubate at room temperature for exactly
five minutes. The strips should be protected
incubation.
13.
DISPENSE STOPPING REAGENT
After the first well has incubated for exactly
five minutes, add 50 µl of Stopping Reagent
to each well, in the same order and at the
same rate that the Substrate Solution was
added to the wells. Upon addition of stopping reagent, blue substrate solution will
turn yellow and colorless solution will remain
colorless.
14.
READ ABSORBANCE OF WELLS
Within 30 minutes after addition of the
stopping reagent, the wells must be read
in a plate reading spectrophotometer. The
wells are read at 450 nm against the blank
control well. If a dual wavelength spectrophotometer is available, the wavelength
for the reference filter should be set at
600-650 nm.
For Technical Assistance:
1-800-251-5115 (Toll Free)
or e-mail:
[email protected]
6
TEST DE DÉPISTAGE ENA À PUITS UNIQUE RELISA®
DES ANTICORPS ANTI-ANTIGÈNES NUCLÉAIRES
SOLUBLES
des micropuits pour servir de substrat antigénique dans
ce système. Les dilutions des échantillons de patient
sont placées dans les micropuits et mises à incuber, ce
qui permet aux anticorps spécifiques de l’échantillon
de réagir par rapport à l’antigène pendant la phase
solide. Après le lavage visant à éliminer les anticorps
non liés et les autres protéines sériques, les puits sont mis
à incuber avec des anticorps anti-humains de chèvre
marqués par de la peroxydase de raifort. La préparation d’anticorps conjugué à de la peroxydase de raifort
incluse dans le système est spécifique aux chaînes
lourdes et légères de l’IgG humaine.
POUR UTILISATION DIAGNOSTIQUE IN VITRO
RÉSUMÉ ET EXPLICATION DU TEST
Utilisation prévue: Il s’agit d’un système de test par
immunodosage enzymatique (EIA) pour la détection
des anticorps dirigés contre les antigènes nucléaires
solubles Sm (Smith), RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 et Jo-1
dans le sérum humain. Les résultats de ce dosage
peuvent être utilisés comme aide au diagnostic des
maladies auto-immunes.
Après incubation avec le conjugué de peroxydase
de raifort, on observe la formation d’un complexe
tripartite stable si les résultats sont positifs. Ce complexe
se compose d’un anticorps anti-humain conjugué à
de la peroxydase de raifort lié à un anticorps anti-ENA
humain, lui-même lié à l’antigène stabilisé sur la surface
en plastique.
Les anticorps anti-antigènes nucléaires solubles (ENA)
ont été associés à plusieurs syndromes auto-immuns
et semblent avoir une valeur diagnostique et/ou
pronostique dans la sclérodermie (1, 2), la connectivité
mixte (3-5), le syndrome de Sjögren (6, 7), la polymyosite (8), la dermatomyosite (9), le lupus érythémateux
disséminé (5) et la polyarthrite rhumatoïde (10). Le
test ANA (anticorps anti-nucléaires) a été utilisé pour
dépister ces anticorps mais il n’indique pas la spécificité
de l’anticorps, et les anticorps dirigés contre certains
antigènes nucléaires solubles ne sont pas positifs au
test ANA (11, 12). Par conséquent, un second test de
confirmation de la présence d’anticorps anti-antigènes
nucléaires solubles est fortement recommandé (13).
Après un deuxième lavage, ce complexe est détecté
par ajout d’une solution de tétraméthylbenzidine (TMB)
et de H2O2 servant de substrat chromogène. Le degré
de développement de la couleur dans chaque puits
est proportionnel à la concentration en anticorps
anti-ENA dans chaque échantillon de sérum. Chaque
micropuits est lu à l’aide d’un spectrophotomètre à
450 nm.
COMPOSITION DES SYSTÈMES (MATÉRIELS FOURNIS)
L’antigène Sm (Smith) a été identifié en 1966 par Tan et
Kunkel. Il s’agit d’une glycoprotéine non histone soluble
saline, non dépendante de l’ADN ou de l’ARN quant à
son antigénicité (14). Les anticorps anti-Sm sont considérés comme un marqueur très spécifique en raison de
leur degré élevé de spécificité au lupus érythémateux
disséminé (LED). Ils sont présents chez plus de 30 %
des patients atteints d’un LED et ont été associés à la
néphropathie évolutive et à la cérébrite (15-17).
Conservation : Tous les composants doivent être
conservés au réfrigérateur entre 2 et 10 °C. Ne pas
congeler.
Stabilité : Tous les composants sont stables pendant
12 mois à partir de la date de fabrication. Ne pas utiliser
les composants au-delà de leur date de péremption.
L’anticorps Sm est souvent associé à l’anticorps U1-RNP
dans les sérums de patients atteints d’un LED (18, 19).
À l’inverse de l’anticorps Sm, l’anticorps RNP n’est pas
considéré comme un marqueur sérologique spécifique
car on observe sa présence chez les patients atteints
de diverses maladies rhumatismales, notamment d’un
LED, du syndrome de Sjögren et de polyarthrite rhumatoïde. Un taux élevé d’anticorps anti-RNP est toutefois
souvent associé à un syndrome de chevauchement
appelé connectivité mixte (MCTD). Les patients atteints
d’une MCTD présentent la plupart du temps une association de signes cliniques observés dans le LED, la
sclérodermie et la polymyosite. Ces patients réagissent
souvent bien à un traitement corticostéroïde et présentent une incidence de néphropathie plus faible que les
patients atteints de LED (20, 21).
RÉACTIFS
Bandelettes de micropuits recouvertes d’antigènes
nucléaires solubles : Référence catalogue 7008-10.
Bandelettes à huit puits recouvertes d’un mélange de
six antigènes nucléaires solubles purifiés par affinité et
stabilisés (Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 et Jo-1). Le
code couleur de ces bandelettes est marron. Chaque
sachet métallisé contient une bandelette de huit puits
emballée hermétiquement.
Diluant pour échantillon : Référence catalogue 7100
(100 ml). Diluant tamponné propriétaire, utilisé pour
diluer les échantillons de patient.
Réactif immuno-enzymatique – Spécifique aux
chaînes lourdes et légères d’IgG humaine : Référence
catalogue 7009-10 (6 ml). Globuline de chèvre anti-IgG
humaine (chaînes lourdes et légères) couplée à de
la peroxydase de raifort (HRP). Le réactif est prêt à
l’emploi.
Les SSA et SSB ont initialement été décrits comme des
antigènes nucléaires protéine-ARN chez les patients
atteints du syndrome de Sjögren (6, 7). Les Ro et La
ont été décrits comme des antigènes cytoplasmiques
protéine-ARN chez les patients atteints de LED (22, 23).
Il est maintenant largement reconnu que, d’une part,
le SSA et le Ro et, d’autre part, le SSB et le La sont analogues et que ces antigènes se trouvent à la fois dans
le noyau et le cytoplasme. Les anticorps anti-SSA/Ro
seuls ou anti- SSA/Ro et SSB/La sont observés chez 62 %
des patients souffrant de lupus cutané subaigu (24) et
chez 85 % des patients atteints du syndrome de Sjögren
qui développent une vascularite (25). Les anticorps
anti-SSA/Ro seuls apparaissent chez les patients ayant
une déficit homozygote de la fraction C2 (26), chez les
patients souffrant de cirrhose biliaire primitive qui développent le syndrome de Sjögren (27) et chez deux tiers
des patients atteints de « SLE négatif aux ANA » (28).
Solution de substrat : Référence catalogue 7035 (6 ml).
Solution de substrat enzymatique spécifique à la HRP,
contenant de la 3,3’,5,5’-tétraméthylbenzidine (TMB) et
du peroxyde d’hydrogène (H2O2) stabilisés. Le réactif
est prêt à l’emploi.
Réactif d’arrêt :Référence catalogue 7033 (6 ml).Réactif
d’arrêt propriétaire pour les systèmes de test EIA
d’Immuno Concepts.Le réactif est prêt à l’emploi
ATTENTION : Corrosif..Ce réactif contient des acides
chlorhydrique et sulfurique (moins de 3 % chacun par
volume) et doit être manipulé avec précaution. Conserver hors de portée des enfants. En cas de contact
avec les yeux, laver immédiatement et abondamment
avec de l’eau et consulter un spécialiste. Ne jamais
ajouter d’eau à ce réactif.
L’antigène Scl-70 a été identifié comme une enzyme
cellulaire, l’ADN topoisomérase de type I (29). Les anticorps anti-Scl-70 ont été observés chez 56 % de patients
souffrant de sclérodermie généralisée, particulièrement
le sous-groupe de patients atteints de sclérodermie
diffuse (30). Ces auto-anticorps sont considérés comme
un marqueur de la sclérodermie car ils ne sont pas
observés dans d’autres collagénoses. Les anticorps antiJo-1, qui est l’enzyme cellulaire histidyl-ARNt-synthétase,
sont observés chez 25 à 30 % des patients atteints de
polymyosite ou de dermatomyosite et non dans les autres myopathies (11, 31). Il a également été démontré
que les anticorps anti-Jo-1 sont fortement corrélés à la
pneumopathie interstitielle associée à la myosite (31).
Sérum étalon ENA : Référence catalogue 7026-10
(1 ml).Sérum humain qui contient des anticorps dirigés
contre un ou plusieurs des antigènes nucléaires solubles
Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 et/ou Jo-1. La valeur de
dosage pour ce sérum est indiquée sur l’étiquette du
flacon.Ce sérum est prédilué et prêt à l’emploi.Ce réactif contient 0,1 % d’azide de sodium (conservateur).
Contrôle positif ENA : Référence catalogue 7021-10
(1 ml). Sérum de contrôle positif humain qui contient des anticorps dirigés contre un ou plusieurs des
antigènes nucléaires solubles Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La,
Scl-70 et/ou Jo-1. Ce sérum est prédilué et prêt à
l’emploi. Ce réactif contient 0,1 % d’azide de sodium
(conservateur).
PRINCIPE DU TEST
Ce test est un immunodosage enzymatique indirect
qualitatif. Un mélange d’antigènes nucléaires solubles
purifiés par affinité stabilisés a été déposé à la surface
7
Contrôle négatif ENA : Référence catalogue 7031 (1 ml).
Sérum de contrôle négatif humain qui ne contient pas
d’anticorps anti-antigènes Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl70 ou Jo-1. Ce sérum est prédilué et prêt à l’emploi. Ce
réactif contient 0,1 % d’azide de sodium (conservateur).
Contrôle positif dosé non dilué ENA optionnel : Référence catalogue 7022-10 (0,25 ml). Sérum de contrôle
positif humain qui contient des anticorps dirigés contre
un ou plusieurs des antigènes nucléaires solubles
Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 et/ou Jo-1. Traiter ce
contrôle positif comme un sérum non dilué. La valeur
de dosage de ce sérum est indiquée sur l’étiquette du
flacon. Ce réactif contient 0,1 % d’azide de sodium
(conservateur).
COMPOSANTS NON RÉACTIFS
Support pour bandelettes de micropuits
Solution tampon de lavage :
Tampon PBS : Référence catalogue 1011. Solution saline
tamponnée au phosphate en poudre (0,01 M, pH 7,4
± 0,2). Chaque sachet contient une quantité suffisante
de poudre tampon pour préparer un litre de tampon.
Chaque système complet contient deux sachets de
poudre tampon pour chaque plateau de 96 micropuits.
Concentré tampon de lavage : Référence catalogue
1031 (10 ml). Solution Tween 20 à 5 % à utiliser dans le
tampon de lavage. Chaque système complet contient
deux flacons de concentré tampon pour chaque
plateau de 96 micropuits.
Préparation : Dissoudre un sachet de poudre tampon
dans un litre d’eau désionisée ou distillée. Ajouter tout
le contenu d’une bouteille de concentré tampon de
lavage au PBS dissous. Bien mélanger et conserver au
réfrigérateur entre 2 et 10 °C pendant 4 semaines maximum ou jusqu’à ce que des signes de contamination
ou de modifications visibles apparaissent. La solution
tampon de lavage doit être à température ambiante
(19-23 °C) avant utilisation.
MATÉRIEL SUPPLÉMENTAIRE REQUIS (MAIS NON
FOURNI)
accumulation de résidus. L’azide de sodium est un
poison et peut être toxique en cas d’ingestion.
4. La dilution des composants ou l’utilisation de composants autres que ceux fournis dans ce système
peut produire des résultats incohérents.
5. Ne pas procéder à une inactivation à la chaleur
des échantillons de sérum utilisés pour le test de
dépistage ENA RELISA®, car cela peut entraîner des
valeurs élevées.
6. Ce kit est destiné à une utilisation diagnostique in
vitro.
7. Ne pas pipeter avec la bouche et éviter tout
contact de la peau et des muqueuses avec les
réactifs et les échantillons. En cas de contact, laver
abondamment avec un savon germicide et de
l’eau.
8. Ne pas fumer, manger ni boire dans les zones où les
échantillons ou les réactifs du kit sont manipulés.
9. Éviter toute éclaboussure ou pulvérisation
d’aérosols à tout moment.
10. Les durées et températures d’incubation autres
que celles spécifiées peuvent donner des résultats
erronés.
11. La contamination croisée des réactifs ou des
échantillons peut donner de faux résultats. Pendant
le test, les échantillons doivent rester confinés dans
les micropuits.
12. Avant utilisation, la verrerie réutilisable doit être
lavée et rincée soigneusement afin d’éliminer tout
détergent. Toute la verrerie doit être propre et
sèche avant utilisation.
13. Avant utilisation, porter les réactifs, micropuits et
échantillons à température ambiante (19-23 °C).
14. Porter des gants en latex jetables pour manipuler
les échantillons et réactifs puis se laver soigneusement les mains par la suite.
15. La contamination microbienne des réactifs ou des
échantillons peut donner de faux résultats.
16. Le réactif d’arrêt est corrosif et peut provoquer
des brûlures. Ce réactif contient des acides
chlorhydrique et sulfurique (moins de 3 % chacun
par volume) et doit être manipulé avec précaution. Conserver hors de portée des enfants. En cas
de contact avec les yeux, laver immédiatement
et abondamment avec de l’eau et consulter un
spécialiste. Ne jamais ajouter d’eau à ce réactif.
PRÉLÈVEMENT D’ÉCHANTILLONS
Pipeteurs volumétriques de précision permettant de
prélever 25 à 1 000 µl
Pissette en plastique pour distribuer la solution tampon de lavage dans les micropuits ou système de
lavage des micropuits automatisé ou semi-automatisé
Récipient d’un litre pour la solution tampon de
lavage PBS
Eau désionisée ou distillée
Spectrophotomètre lecteur de microplaques capable de lire la densité optique à 450 nm
Tubes à essai pour préparer les dilutions de sérum
Papier absorbant ou serviettes en papier
Pipeteur multicanaux capable de remplir 8 puits à
la fois
Gants en latex jetables
Chronomètre de laboratoire.
Prélèvement : Le sérum est l’échantillon préférentiel.
Environ 5 ml de sang entier doivent être prélevés de
manière aseptique par ponction veineuse à l’aide d’un
tube à prélèvement sous vide stérile ou tout autre système de prélèvement adapté. Laisser le sang coaguler
à température ambiante (19-23°C). Le sérum doit être
séparé du caillot par centrifugation aussi rapidement
que possible, de façon à limiter l’hémolyse.
ATTENTION : Ne pas procéder à une inactivation à la
chaleur des échantillons de sérum utilisés pour le test
de dépistage ENA RELISA®, car cela peut entraîner des
valeurs élevées.
Substances interférentes : Les sérums présentant un
degré élevé d’hémolyse, d’ictère, de lipémie ou de
prolifération microbienne doivent être écartés car ces
anomalies peuvent engendrer des résultats aberrants.
Les échantillons contenant des particules visibles doivent être clarifiés par centrifugation avant de procéder
au test.
PRÉCAUTIONS
1. Tous les matériels d’origine humaine utilisés dans la
composition de ce produit ont été testés et se sont
révélés négatifs (non-réactivité répétée) vis-à-vis
des anticorps des virus de l’immunodéficience humaine 1 et 2 (vih 1 et 2), de l’anticorps du virus de
l’hépatite C (hcv) et de l’antigène de surface de
l’hépatite B (hbsag), selon les méthodes approuvées par la fda. Néanmoins, aucune méthode de
test ne peut assurer totalement l’absence de vih-1,
vih-2, hcv, hbv ou d’autres agents infectieux. Par
conséquent, tous les matériels du kit doivent être
manipulés de la même manière que des matériels
considérés comme potentiellement infectieux.
2. Tous les sérums de contrôle, sérums étalons et
échantillons de patient doivent être manipulés
conformément aux recommandations du niveau
de biosécurité 2, comme pour tout échantillon
de sérum ou de sang humain potentiellement
infectieux, telles qu’indiquées dans le manuel du
Centers for Disease Control/National Institutes of
Health : Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 1984 Edition.
3. L’azide de sodium (0,1 %) est utilisé comme conservateur dans les sérums de contrôle et étalons. Il est
possible que l’azide de sodium réagisse au contact
des canalisations en plomb ou en cuivre et forme
des azides métalliques extrêmement explosifs. Lors
de l’élimination des réactifs, rincer abondamment
les canalisations avec de l’eau afin d’éviter toute
Conservation : Les sérums peuvent être conservés entre
2 et 10 °C pendant une semaine maximum. Si le test est
reporté, ils doivent être congelés à -20 °C minimum. Le
sérum ne doit pas être conservé dans un réfrigérateur
ou un congélateur à dégivrage automatique.
ATTENTION : Les congélations et décongélations successives des échantillons de patient peuvent induire des
résultats faussement positifs ou faussement négatifs.
REMARQUES GÉNÉRALES RELATIVES À LA
PROCÉDURE
1. Il est extrêmement important que tous les composants du kit et les échantillons de sérum soient à
température ambiante (19-23 °C) avant utilisation. Il
faut à un litre entier de tampon de lavage plusieurs
heures pour atteindre 20 °C à sa sortie du réfrigérateur. Les températures d’incubation au-dessus ou
en dessous de la plage indiquée peuvent donner
des résultats inexacts. Remettre les échantillons et
les réactifs non utilisés au réfrigérateur après utilisation.
2. Avant utilisation, bien mélanger les réactifs en les
retournant doucement de haut en bas. Ne pas
créer de tourbillon dans les réactifs ou les secouer.
8
Éviter la formation de mousse.
3. Lors de la préparation des dilutions d’échantillon,
essuyer les embouts des pipettes avant de distribuer
le sérum dans le diluant pour échantillon. Si un excès d’échantillon adhère à l’embout de la pipette,
les résultats s’en trouveront affectés.
4. L’utilisation d’un pipeteur multicanaux est recommandée car il permet d’uniformiser la distribution
du réactif ainsi que les durées d’incubation et de
réaction.
5. Un lavage adéquat des puits est extrêmement
important. Des puits mal lavés afficheront des
valeurs de bruit de fond élevées ainsi que des
valeurs faussement positives. Pour le lavage
manuel, aspirer le contenu des puits puis remplir
ceux-ci de solution tampon de lavage. Éviter la
contamination croisée des puits, en particulier
lors du premier lavage suivant l’aspiration. Vider
toute la solution tampon de lavage des puits en
les renversant puis en les secouant d’un geste sec
du poignet afin d’éliminer tout résidu. Répéter ces
étapes (remplissage/élimination) jusqu’à effectuer
3 à 5 lavages au total. Frapper ensuite vigoureusement les puits sur une serviette en papier ou une
autre matière absorbante pour éliminer toute trace
résiduelle de tampon de lavage. Pour un lavage
homogène des puits, il est recommandé d’utiliser
un système automatisé.
REMARQUE : En raison des divers types de techniques de lavage et de systèmes automatisés, le
nombre de lavages peut être adapté pour obtenir
des résultats optimums. Chaque laboratoire doit
déterminer le nombre de lavages le plus efficace
pour son système de lavage.
6. Une élimination inadaptée des résidus de tampon
de lavage peut conduire à un développement
inadapté de la couleur. Sécher les bandelettes de
micropuits sur du papier ou des serviettes absorbants afin d’éliminer au maximum les résidus de
tampon de lavage.
7. Le respect du minutage de toutes les étapes est essentiel. Tous les échantillons de sérum doivent être
dilués avant le début de la procédure et déposés
dans les micropuits aussi rapidement que possible
(moins de cinq minutes). La taille des lots doit être
définie de manière à ce que la manipulation des
échantillons puisse être accomplie sans précipitation dans ce laps de temps. Il est recommandé
d’utiliser un pipeteur multicanaux qui facilite la
manipulation des échantillons et des réactifs.
8. À l’exception de la dernière incubation (solution
de substrat), chaque période d’incubation commence dès la fin de la distribution de l’échantillon
ou du réactif. L’incubation de la solution de substrat
doit durer exactement cinq minutes pour chaque
puits. Tous les échantillons et réactifs doivent être
déposés dans le même ordre et à un rythme constant.
CONTRÔLE QUALITÉ
1. La valeur de densité optique moyenne des puits
étalons doit être d’au moins 0,400. Les valeurs de
densité optique inférieures à 0,400 indiquent un
développement de la couleur inadéquat et une
analyse non valide. Un développement inadéquat
de la couleur est généralement dû à l’utilisation
de réactifs froids ou au non respect du minutage
d’une ou plusieurs étapes du dosage. Laisser tous
les réactifs atteindre la température ambiante (1923 °C) et répéter l’analyse en veillant à respecter le
minutage de toutes les étapes.
2. Le puits de contrôle à blanc doit avoir une valeur
de densité optique inférieure à 0,150. Les valeurs
de densité optique à blanc supérieures à 0,150
indiquent un lavage inadéquat ou une contamination des réactifs.
3. Les échantillons dont les valeurs d’anticorps
spécifiques sont supérieures à la limite maximale
de l’étalon peuvent être dilués de nouveau
dans le diluant pour échantillon et redosés afin
d’obtenir une estimation plus précise de la valeur
d’anticorps spécifiques. Afin d’obtenir la valeur
d’anticorps spécifique finale de ces échantillons,
déterminer la valeur unitaire pour la densité
optique de l’échantillon dilué (comme indiqué
ci-dessus) puis multiplier par le facteur de dilution.
Par exemple, si un échantillon à 1:40 présente une
densité optique supérieure à l’étalon, l’échantillon
peut être dilué de nouveau à 1:80 en mélangeant
100 µl de la dilution à 1:40 à 100 µl de diluant pour
échantillon. La dilution à 1:80 est alors dosée et le
résultat obtenu est multiplié par deux (facteur de
dilution) pour obtenir la valeur unitaire finale.
4. Le facteur de conversion doit être calculé pour
chaque analyse. L’utilisation d’un facteur de conversion d’une analyse invalidera les résultats.
5. Chaque laboratoire doit établir et conserver ses
propres valeurs de plage (normale) de référence,
en fonction de la population de patients étudiée et
d’autres facteurs locaux.
6. Le sérum de contrôle positif est un sérum humain
qui contient des anticorps dirigés contre un ou
plusieurs des antigènes nucléaires solubles Sm, RNP,
SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 et/ou Jo-1. Il s’agit d’un contrôle qualitatif qui doit donner une valeur supérieure
à 20 unités ENA.
7. Le sérum de contrôle négatif est un pool de sérum
humain qui ne contient pas d’anticorps dirigés
l’un des six auto-antigènes de ce test. Il s’agit d’un
contrôle qualitatif qui doit donner des valeurs
inférieures à 20 unités ENA.
8. Le sérum de contrôle positif dosé non dilué est un
sérum humain qui contient des anticorps dirigés
contre un ou plusieurs des antigènes nucléaires
solubles Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 et/ou Jo-1.
La valeur de dosage de ce contrôle est indiquée
en unités ENA sur l’étiquette du flacon. Cette plage
a été établie pour englober 99 % des valeurs escomptées dues à une variation statistiquement normale. De faibles écarts peuvent occasionnellement
être observés hors des plages. Chaque laboratoire
doit établir ses propres critères d’acceptation/de
rejet en se fondant sur son expérience de ce dosage.
9. Si une valeur de contrôle est hors de la plage, le
dosage n’est pas valable et doit être recommencé.
INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
CALCULS
1. Soustraire la valeur de densité optique du blanc
de réactif des valeurs de densité optique obtenues
dans les puits d’échantillonnage, de contrôle et
d’échantillon du patient. Calculer les valeurs de
densité optique moyennes pour les doubles de
puits.
2. Diviser la concentration en anticorps spécifique
du sérum étalon (indiquée sur l’étiquette) par
la valeur de densité optique moyenne des puits
��
�� le facteur de cond’échantillonnage
pour obtenir
version.
��
3. Multiplier les valeurs de densité optique de chacun
��
des échantillons par le facteur de conversion afin
��
��
d’obtenir
la concentration
en anticorps spécifique
en unités.
4. La forme simplifiée de ces calculs peut être exprimée comme suit :
��
��
��
��
�
�
��
��
�
�
��
INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS DU PATIENT
��
��
��
��
��
* Si les étalons et les échantillons sont analysés en
double, utiliser la densité optique moyenne des doubles
de puits.
��
�
��
�
��
9
1. Il s’agit d’un dosage qualitatif. Les niveaux
d’anticorps détectés n’ont pas de signification
clinique connue et les valeurs unitaires obtenues
lors de ce dosage sont simplement destinées à
répartir les patients dans les trois grands groupes
suivants. Les puits d’échantillon de patient dont
les valeurs sont supérieures ou égales à 25 unités
ENA sont considérés comme positifs et doivent être
testés pour les spécificités individuelles en ENA. Les
puits d’échantillon de patient dont les valeurs sont
��
��
inférieures à 20 unités
ENA��
sont considérés
comme��
négatifs. Les valeurs comprises entre
et 25 unités
��20��
��
sont considérées comme étant limites positives ;
��
les dosages doivent être répétés ou testés pour
les spécificités individuelles en ENA. Chaque laboratoire doit établir ses propres valeurs de référence
(limite et plage) en fonction de la population de
patients testés. Les valeurs unitaires sont affectées
par des facteurs liés aux patients, des considérations mécaniques (précision et exactitude du
pipetage, etc.) et les conditions de dosage (ex. :
��
��
température et synchronisation
des étapes.)
2. Étant donné que ��
le test de
dépistage
��
��à puits
unique ENA RELISA® contient un mélange
��
d’antigènes, les résultats représentent une combinaison des réactions des anticorps à chacun des
six antigènes. Si de faibles niveaux d’auto-anticorps
multiples sont présents, le test de dépistage à puits
unique ENA RELISA® peut présenter un résultat
positif mais les spécificités individuelles peuvent être
inférieures aux valeurs limites de chacun.
COMMUNICATION DES RÉSULTATS
Les résultats doivent être notés positifs ou négatifs aux
anticorps anti-antigènes nucléaires solubles. Les niveaux
d’anticorps n’ont pas de signification clinique connue.
PLAGE DE RÉFÉRENCE
La plage de référence a été établie en testant les
sérums de 403 donneurs de sang sains, 205 femmes
et 198 hommes, dont aucun n’avait d’antécédents
connus de maladies rhumatismales. Sur la base de ces
données, les valeurs limites normales ont été établies
comme étant inférieures à 20 unités ENA. Les bonnes
pratiques de laboratoire imposent que chaque laboratoire établisse ses propres plages normales en fonction
de sa population de patients et d’autres facteurs
locaux.
PERFORMANCES
LIMITES DU TEST
Le test de dépistage ENA à puits unique RELISA®
1. Le diagnostic ne peut pas être réalisé sur la base
d’Immuno Concepts a été comparé au test de
des anticorps anti-antigènes nucléaires solubles
dépistage ENA à paramètres multiples RELISA®
seuls. Le médecin doit interpréter ces résultats au
d’Immuno Concepts. La population de patients
regard des antécédents et des symptômes du
étudiée comprenait 50 patients correspondant aux
patient, des observations physiques et d’autres
critères de diagnostic de lupus érythémateux disséminé,
procédures de diagnostic.
25 patients souffrant du syndrome de myosite auto-im2. Le traitement ne doit pas débuter sur la seule base
mune ou de chevauchement de myosite, 23 sujets chez
d’un test positif aux anticorps anti-antigènes nucléqui une sclérodermie a été diagnostiquée, 21 patients
aires solubles. Les indications cliniques, les autres
souffrant du syndrome de Sjögren, 3 patients chez qui
analyses de laboratoire et le diagnostic clinique
une arthrite rhumatoïde a été diagnostiquée, 18 padu médecin doivent être pris en compte avant de
tients atteints de collagénose indéterminée et 403 sujets
commencer tout traitement.
ne présentant aucune maladie auto-immune connue.
3. Certains patients souffrant de maladies auto-imSur la base de cette comparaison, les données dans le
munes peuvent avoir des niveaux indétectables ou
tableau 2 on été obtenues.
insignifiants d’anticorps anti-antigènes nucléaires
solubles et d’autres peuvent avoir des niveaux
Les résultats limites sont considérés comme positifs. Ces
élevés mais présenter peu ou pas de signe de
données induisent les statistiques suivantes : sensibilité
maladie clinique. Le médecin doit interpréter les
relative, 97,9 % ; spécificité relative, 97,8 % et agrément
résultats des tests des anticorps anti-antigènes nutotal, 97,8 %.
cléaires solubles au regard des antécédents et des
symptômes du patient, des observations physiques
REPRODUCTIBILITÉ
et d’autres procédures de diagnostic.
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4. ��
Les niveaux d’anticorps
détectés
avec ce système
Six échantillons positifs et cinq négatifs ont été traités
n’indiquent pas nécessairement la gravité ou la
sur trois numéros de lot différents de bandelettes
durée de la��
maladie.
d’antigènes
à trois occasions
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�� différentes.
�� En aucun cas
un échantillon négatif n’a donné de résultats positifs
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VALEURS ESCOMPTÉES
et les échantillons positifs ont uniformément donné des
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clairement
positifs.
L’incidence des auto-anticorps dirigés contre divers
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antigènes nucléaires varie en fonction de la population
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de patients��
et de l’incidence
des maladies
rhumatismales cliniques dans cette population. L’association
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anticorps/maladies rhumatismales spécifiques est
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récapitulée dans
le tableau
1. ��
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TABLEAU 1
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TABLEAU 2
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PROCÉDURE DE TEST DE DÉPISTAGE ENA À
PUITS UNIQUE RELISA®
Tous les échantillons, réactifs (y compris solution tampon de lavage)
et micropuits doivent être à température ambiante avant utilisation.
1.
2.
PRÉPARATION DU FORMULAIRE
Étiqueter le formulaire inclus dans le kit afin
d’indiquer l’emplacement des échantillons
dans les micropuits. Procéder au dosage
de l’étalon en double. Un puits est utilisé
pour un blanc de réactif. Nous recommandons que chaque contrôle et échantillon
de patient soit dosé en double jusqu’à ce
que vous ayez établi une précision acceptable pour le dosage dans votre laboratoire.
PRÉPARATION DE LA SOLUTION TAMPON DE
LAVAGE (PBS-Tween)
Dissoudre le contenu d’un sachet de
tampon PBS dans un litre d’eau désionisée
ou distillée. Ajouter tout le contenu d’une
bouteille de concentré tampon de lavage
au récipient d’un litre de PBS dissous. Bien
mélanger. La solution tampon de lavage
peut être couverte et conservée à 2-10 °C
pendant quatre semaines.
3.
DILUTION DES ÉCHANTILLONS DES PATIENTS
Diluer les échantillons des patients à 1:40 en
ajoutant 25 µl de sérum à 975 µl de diluant
pour échantillon. Si vous utilisez le contrôle
positif dosé non dilué ENA optionnel, le
diluer de la même manière que les échantillons des patients. Bien mélanger. L’étalon,
le contrôle positif et le contrôle négatif sont
prédilués et ne doivent pas être dilués de
nouveau.
4.
PRÉPARATION DES MICROPUITS
Sortir le nombre requis de micropuits de
leurs sachets et les placer dans le support.
Les micropuits doivent être correctement
placés dans le support. Appuyer fermement sur les deux extrémités des bandelettes pour les enclencher correctement
dans le support Si vous utilisez des puits
individuels ou si vous n’utilisez pas une bandelette de puits complète, veiller à ce que
chaque puits soit correctement placé afin
qu’il ne tombe pas lors du retournement
du support. Si le test requiert moins de huit
puits, vous pouvez détacher les puits dont
vous n’avez pas besoin. Les puits non utilisés
peuvent être remis dans le sachet métallisé
fermé avec un ruban de Cellophane®, et
réfrigérés pendant 14 jours maximum.
5.
6.
7.
DISTRIBUTION DES DILUTIONS SÉRIQUES
Déposer 50 µl d’étalons, de contrôles et
d’échantillons de patient dilués dans les
puits appropriés comme décrit sur le formulaire. Déposer 50 µl de diluant pour échantillon dans le puits du blanc de réactif.
INCUBATION DES BANDELETTES (30 minutes à
température ambiante, soit 19-23 °C)
Mettre à incuber à température ambiante
pendant 30 minutes. Les bandelettes
doivent être protégées des courants d’air
ou des variations de température pendant
l’incubation. Recouvrir, le cas échéant, les
bandelettes d’un film transparent ou d’une
serviette en papier pour les protéger de la
poussière ou d’autres corps étrangers.
8.
DISTRIBUTION DU RÉACTIF IMMUNO-ENZYMATIQUE
Déposer 50 µl de réactif immuno-enzymatique dans chacun des puits.
9.
INCUBATION DES BANDELETTES (30 minutes à
température ambiante, soit 19-23 °C)
Mettre à incuber à température ambiante
pendant 30 minutes. Les bandelettes
doivent être protégées des courants d’air
ou des variations de température pendant
l’incubation. Recouvrir, le cas échéant, les
bandelettes d’un film transparent ou d’une
serviette en papier pour les protéger de la
poussière ou d’autres corps étrangers.
10.
LAVAGE DES BANDELETTES
Laver les puits 3 à 5 fois avec la solution
tampon de lavage PBS-Tween. Pour le
lavage manuel, aspirer le contenu des puits
puis remplir ceux-ci de solution tampon de
lavage. Éviter la contamination croisée des
puits, en particulier lors du premier lavage
suivant l’aspiration. Vider toute la solution
tampon de lavage des puits en les renversant puis en les secouant d’un geste sec du
poignet afin d’éliminer tout résidu. Répéter
ces étapes (remplissage/élimination)
jusqu’à effectuer 3 à 5 lavages au total.
Frapper ensuite vigoureusement les puits
sur une serviette en papier ou une autre
matière absorbante pour éliminer toute
trace résiduelle de tampon de lavage.
11.
DISTRIBUTION DE LA SOLUTION DE SUBSTRAT
Utiliser un chronomètre pour respecter le
minutage et déposer 50 µl de solution de
substrat dans chacun des puits. La solution
de substrat doit être ajoutée aux puits
à un rythme constant, de manière à ce
que l’incubation de chaque puits ait la
même durée (cinq minutes). La solution de
substrat mise à incuber avec des échantillons positifs se colore en bleu et celle mise
à incuber avec des échantillons négatifs
variera d’incolore à bleu très pale.
12.
INCUBATION DES BANDELETTES (exactement
5 minutes à température ambiante, soit
19-23 °C)
Mettre à incuber à température ambiante pendant exactement 5 minutes. Les
bandelettes doivent être protégées des
courants d’air ou des variations de température pendant l’incubation.
13.
DISTRIBUTION DU RÉACTIF D’ARRÊT
Après incubation du premier puits pendant
exactement 5 minutes, ajouter 50 µl de
réactif d’arrêt dans chaque puits, dans le
même ordre et au même rythme que pour
l’ajout de solution de substrat dans les puits.
Dès l’ajout de réactif d’arrêt, la solution de
substrat bleue devient jaune et la solution
incolore demeure incolore.
14.
LECTURE DE LA DENSITÉ OPTIQUE DES PUITS
Dans les 30 minutes suivant l’ajout de
réactif d’arrêt, les puits doivent être lus à
l’aide d’un spectrophotomètre lecteur de
microplaques. Les puits sont lus à 450 nm
par rapport au puits de contrôle à blanc. Si
un spectrophotomètre à double longueur
d’onde est disponible, la longueur d’onde
pour le filtre de référence doit être réglée
sur 600-650 nm.
LAVAGE DES BANDELETTES (voir Remarques
générales relatives à la procédure 5 et 6)
Laver les puits 3 à 5 fois avec la solution
tampon de lavage PBS-Tween. Pour le
lavage manuel, aspirer le contenu des puits
puis remplir ceux-ci de solution tampon de
lavage. Éviter la contamination croisée des
puits, en particulier lors du premier lavage
suivant l’aspiration. Vider toute la solution
tampon de lavage des puits en les renversant puis en les secouant d’un geste sec du
poignet afin d’éliminer tout résidu. Répéter
ces étapes (remplissage/élimination)
jusqu’à effectuer 3 à 5 lavages au total.
Frapper ensuite vigoureusement les puits
sur une serviette en papier ou une autre
matière absorbante pour éliminer toute
trace résiduelle de tampon de lavage.
POUR L’Assistance technique : +1 916-363-2649
ou messagerie électronique :
[email protected]
11
SCREENING DEGLI ENA CON POZZETTO
SINGOLO RELISA®
PER ANTICORPI DIRETTI CONTRO GLI ANTIGENI
NUCLEARI ESTRAIBILI
immunoenzimatico) qualitativo indiretto. In questo sistema, la superficie dei micropozzetti è stata rivestita con
una miscela stabilizzata di antigeni nucleari estraibili
purificati per affinità che funge da substrato antigenico.
Le diluizioni dei campioni del paziente sono messe nei
micropozzetti ed incubate lasciando reagire gli specifici
anticorpi presenti nel campione con l’antigene in fase
solida. Dopo il lavaggio per rimuovere l’anticorpo
non legato e le altre proteine del siero, i pozzetti sono
incubati con anticorpi anti-umani di capra etichettati
con perossidasi di rafano. Il preparato di anticorpo
coniugato con perossidasi di rafano incluso in questo
sistema di analisi è specifico per catene umane IgG
pesanti e leggere.
PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO
RIEPILOGO E INFORMAZIONI DI BASE
Uso previsto: sistema di analisi a dosaggio immunoenzimatico (EIA) per la determinazione nel siero umano di
anticorpi diretti contro gli antigeni nucleari estraibili Sm
(Smith), RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70, e Jo-1. I risultati di
questa analisi possono essere usati come aiuto nella
diagnosi delle autoimmunopatie.
Gli anticorpi contro gli ENA (Extractable nuclear
antigens, antigeni nucleari estraibili) sono stati associati
a parecchie sindromi autoimmuni e sembrano avere
un significato diagnostico e/o prognostico nella sclerosi
sistemica progressiva,(1, 2) nella malattia mista del
tessuto connettivo, (3-5) nella sindrome di Sjögren,(6, 7)
nella polimiosite,(8) nella dermatomiosite,(9) nel lupus
eritematoso sistemico(5) e nell’artrite reumatoide.(10) Il
test ANA (Antinuclear antibody, anticorpi antinucleari)
è stato usato come screening per questi anticorpi,
ma l’ANA non indica la specificità dell’anticorpo e gli
anticorpi contro alcuni ENA non mostrano test ANA
positivi.(11, 12) Quindi è altamente raccomandata
un’analisi secondaria di conferma per gli anticorpi
contro gli ENA.(13)
L’antigene Sm (Smith) fu identificato nel 1966 da Tan e
Kunkel come soluzione fisiologica solubile, glicoproteina
non istone non dipendente da DNA o RNA per la sua
antigenicità.(14) Gli anticorpi anti-antigeni Sm sono
considerati come uno specifico marcatore sierologico
grazie al loro elevato grado di specificità per l’SLE
(Systemic Lupus Erythematosus, lupus eritematoso
sistemico). I livelli osservati di questi anticorpi che sono
stati associati a malattia renale attiva e ad encefalite
raggiungono fino al 30% dei pazienti.(15-17)
Gli anticorpi anti-Sm si trovano di frequente in connessione con gli anticorpi diretti contro il complesso U1-RNP
nel siero di pazienti affetti da SLE.(18, 19) A differenza
degli anticorpi anti-antigene Sm, gli anticorpi anti-RNP
non sono considerati un marcatore sierologico specifico
in quanto si trovano in pazienti con una serie di malattie
reumatiche compresi SLE, sclerodermia, sindrome di
Sjögren e artrite reumatoide. Comunque, elevati livelli
di anticorpi diretti contro l’RNP sono altamente associati
ad una sindrome coincidente denominata MCTD
(Mixed Connective Tissue Disease, malattia mista del
tessuto connettivo). I pazienti con MCTD tipicamente
mostrano un insieme di caratteristiche cliniche osservabili nell’SLE, nella sclerodermia e nella polimiosite.
Questi pazienti spesso mostrano una buona risposta
al trattamento corticosteroide ed hanno una minore
incidenza di malattia renale in confronto ai pazienti
affetti da SLE.(20, 21)
SSA e SSB furono originariamente descritti come antigeni nucleari RNA-proteina nei pazienti con sindrome
di Sjögren.(6, 7) Ro e La furono descritti come antigeni
citoplasmatici RNA-proteina nei pazienti con SLE.(22,
23) È ora comunemente accettato che SSA e Ro siano
analoghi, SSB e La siano analoghi e che questi antigeni
si trovino nel nucleo e nel citoplasma. Anticorpi diretti
verso l’SSA/Ro soltanto o l’SSA/Ro e l’SSB/La sono stati
rilevati nel 62% di pazienti con lupus cutaneo subacuto,(24) e nell’85% di pazienti con sindrome di Sjögren
che sviluppano vasculite.(25) Anticorpi diretti solamente
verso l’SSA/Ro si presentano nei pazienti che hanno
una deficienza a livello omozigotico della frazione del
complemento C2,(26) nei pazienti con cirrosi biliare
primaria che sviluppano la sindrome di Sjögren(27) e nei
due terzi di pazienti con “SLE ANA negativo”.(28)
L’antigene Scl-70 è stato identificato come enzima cellulare, topoisomerasi I del DNA.(29) Anticorpi anti-Scl-70
sono stati segnalati nel 56% dei pazienti con sclerosi progressiva sistemica, ed in particolare nel sottogruppo di
pazienti con sclerodermia diffusa.(30). Questi anticorpi
sono considerati come un marcatore per PSS, poiché
non sono osservati in altre patologie del tessuto connettivo. Anticorpi anti-Jo-1, che è l’istidil tRNA sintetasi
dell’enzima cellulare, sono presenti nel 25-30% dei
pazienti con polimiosite o dermatomiosite, ma non con
altre miopatie.(11, 31) È stato anche dimostrato che gli
anticorpi diretti contro Jo-1 sono fortemente associati
all’enfisema interstiziale osservato in connessione con
la miosite.(31)
PRINCIPIO DEL TEST
Questa analisi è un EIA (Enzime Immunoassay, dosaggio
12
Se i risultati sono positivi, dopo l’incubazione col coniugato di perossidasi di rafano si forma un complesso
stabile in tre parti. Questo complesso consiste di anticorpo antiumano coniugato con perossidasi di rafano
legante l’anticorpo anti-ENA umano che è legato
all’antigene stabilizzato sulla superficie di plastica.
Dopo un’altra fase di lavaggio, questo complesso viene
rilevato aggiungendo una soluzione di tetrametilbenzidina (TMB) e H2O2 come substrato cromogenico.
Il grado di viraggio del colore in ciascun pozzetto è
proporzionale alla concentrazione di anticorpi anti-ENA
in ciascun campione di siero. Ciascun micropozzetto
viene letto usando uno spettrofotometro a 450 nm.
COMPONENTI DEL SISTEMA (MATERIALI FORNITI)
Conservazione: tutti i componenti vanno conservati alla
temperatura di 2-10°C. Non congelare.
Stabilità: tutti i componenti restano stabili per almeno 12
mesi dalla data di produzione. Non usare alcun componente oltre la data di scadenza.
REAGENTI REATTIVI
Strisce di micropozzetti rivestiti di antigene nucleare
estraibile: numero di catalogo 7008-10. Otto strisce
con pozzetti rivestiti con una miscela di sei antigeni
nucleari estraibili, stabilizzati e purificati per affinità (Sm,
RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 e Jo-1). Queste strisce sono
di colore marrone codificato. In ciascun sacchetto di
alluminio è sigillata una striscia con otto pozzetti.
Diluente del campione: numero di catalogo 7100 (100
ml). Esclusivo diluente tamponato per campioni utilizzato per la diluizione dei campioni dei pazienti.
Reagente enzimatico degli anticorpi (specifico per
catene anti-IgG umane pesante e leggera): numero di
catalogo 7009-10 (6 ml). Anti-IgG umane di capra (H&L)
coniugate con perossidasi di rafano (HRP). Il reagente è
pronto per l’uso.
Soluzione di substrato: numero di catalogo 7035 (6 ml).
Soluzione di substrato enzimatica HRP-specifica, contenente 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) stabilizzata e
perossido di idrogeno (H2O2). Il reagente è pronto per
l’uso.
Reagente bloccante: numero di catalogo 7033 (6 ml).
Esclusivo reagente bloccante per sistemi di analisi EIA
della Immuno Concepts. Il reagente è pronto per l’uso.
ATTENZIONE: corrosivo. Questo reagente contiene acidi
cloridrico e solforico (meno del 3% ciascuno in volume),
e deve essere maneggiato con cura. Tenere fuori della
portata dei bambini. In caso di contatto con gli occhi,
lavare immediatamente con acqua abbondante e
consultare un medico. Non aggiungere mai acqua a
questo reagente.
Siero di calibrazione ENA: numero di catalogo 7026-10
(1 ml). Siero umano contenente anticorpi diretti contro
uno o più degli antigeni nucleari estraibili Sm, RNP,
SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 e/o Jo-1. Il valore del dosaggio
per questo siero è indicato sull’etichetta della fiala.
Questo siero è alla diluizione operativa ed è pronto per
l’uso. Questo reagente contiene sodio azide allo 0,1%
come conservante.
Controllo positivo ENA: numero di catalogo 7021-10
(1 ml). Siero di controllo positivo umano contenente
anticorpi diretti contro uno o più degli antigeni nucleari
estraibili Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 e/o Jo-1.
Questo siero è alla diluizione operativa ed è pronto per
l’uso. Questo reagente contiene sodio azide allo 0,1%
come conservante.
Controllo negativo ENA: numero di catalogo 7031
(1 ml). Siero di controllo umano negativo che non
contiene anticorpi diretti contro gli antigeni Sm, RNP,
SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 o Jo-1. Questo siero è alla diluizione operativa ed è pronto per l’uso. Questo reagente
contiene sodio azide allo 0,1% come conservante.
sodio azide è un veleno e può essere tossico se
ingerito.
4. La diluizione di componenti o la sostituzione di componenti diversi da quelli forniti in questo sistema può
dare risultati non coerenti.
5. Non inattivare a caldo i campioni di siero da usare
il test di screening degli ENA RELISA®. L’inattivazione
a caldo può causare l’aumento dei valori.
6. Questo kit è per uso diagnostico in vitro.
7. Non pipettare mai con la bocca ed evitare il
contatto dei reagenti e dei campioni con la cute e
le mucose. In caso di contatto, lavare abbondantemente con un sapone germicida e acqua.
8. Non fumare, non mangiare o non bere nelle aree in
cui sono maneggiati i campioni o i reagenti del kit.
9. Evitare sempre gli spruzzi e la formazione di aerosol.
10. Tempi e temperature di incubazione diversi da
quelli specificati possono dare risultati errati.
11. La contaminazione incrociata dei reagenti o dei
campioni può dare origine a risultati falsi. Durante
l’analisi i campioni devono rimanere confinati nei
micropozzetti.
12. Prima dell’uso, la vetreria di laboratorio riutilizzabile
deve essere lavata e sciacquata a fondo e completamente liberata da ogni residuo di detergente.
Prima dell’uso, tutta la vetreria di laboratorio deve
essere pulita e asciutta.
13. Prima dell’uso, portare tutti i reagenti, i pozzetti e i
campioni a temperatura ambiente (19-23°C).
14. Indossare guanti a perdere in lattice quando si
maneggiano campioni e reagenti e dopo lavare
accuratamente le mani.
15. La contaminazione microbica dei reagenti o dei
campioni può dare origine a risultati falsi.
16. Il reagente bloccante è corrosivo e può causare
ustioni. Questo reagente contiene acidi cloridrico e
solforico (meno del 3% ciascuno in volume), e deve
essere maneggiato con cura. Tenere fuori della
portata dei bambini. In caso di contatto con gli
occhi, lavare immediatamente con acqua abbondante e consultare un medico. Non aggiungere
mai acqua a questo reagente.
Controllo positivo dosato non diluito ENA (opzionale):
numero di catalogo 7022-10 (0,25 ml). Siero di controllo
positivo umano contenente anticorpi diretti contro uno
o più degli antigeni nucleari estraibili Sm, RNP, SSA/Ro,
SSB/La, Scl-70 e/o Jo-1. Trattare questo controllo positivo
come un siero non diluito. Il valore del dosaggio per
questo siero è indicato sull’etichetta della fiala. Questo
reagente contiene sodio azide allo 0,1% come conservante.
COMPONENTI NON REATTIVI
Supporto per strisce di micropozzetti
Soluzione tampone di lavaggio:
Tampone PBS: numero di catalogo 1011. Polvere salina
tamponata al fosfato (0,01 M, pH 7,4 ± 0,2). Ciascuna
busta contiene polvere tamponata sufficiente a fare 1
litro. (Nei kit per analisi completi, per ogni piastra con
96 micropozzetti sono forniti due sacchetti di polvere
tamponata).
Concentrato tampone di lavaggio: numero di catalogo
1031 (10 ml). Soluzione al 5% di Tween 20 da usare nel
tampone di lavaggio. (Nei kit per analisi completi, per
ogni piastra con 96 micropozzetti sono fornite due fiale
di concentrato tamponato).
Preparazione: sciogliere il contenuto di una busta di
tampone in un litro di acqua deionizzata o distillata. Aggiungere l’intero contenuto di un flacone di
concentrato di tampone di lavaggio al PBS sciolto.
Mescolare bene e tenere alla temperatura di 2-10°C
fino a 4 settimane o fino a che non si presentino segni
di contaminazione o altri cambiamenti visibili. Prima
dell’uso, la soluzione tampone di lavaggio deve essere
a temperatura ambiente (19-23°C).
ALTRI MATERIALI NECESSARI (MA NON FORNITI)
Pipette volumetriche di precisione per l’erogazione di
volumi da 25-1000 µl.
Flacone morbido per erogare la soluzione tampone
di lavaggio nei
micropozzetti o un sistema di lavaggio automatico o semiautomatico per micropozzetti.
Contenitore da un litro per soluzione tampone di
lavaggio PBS.
Acqua deionizzata o distillata.
Spettrofotometro per la lettura della piastra, capace
di rilevare la misurazione dell’assorbanza a 450
nm.
Provette per preparare le diluizioni dei sieri.
Carta bibula o assorbente.
Pipettatrice multicanale in grado di erogare i volumi
necessari in 8 pozzetti.
Guanti a perdere in lattice.
Timer da laboratorio.
PRECAUZIONI
1. Tutti i materiali di origine umana usati per questo
prodotto sono stati analizzati e trovati negativi (non
ripetutamente reattivi)
per gli anticorpi del virus dell’immunodeficienza
umana tipo 1 (HIV-1), del virus della immunodeficienza umana tipo 2 (HIV-2), del virus dell’epatite
C (HCV) e per l’antigene di superficie dell’epatite
B (HBsAg) con metodi approvati dalla FDA. Nessun
metodo di analisi può garantire con completa
sicurezza che siano assenti HIV-1, HIV-2, epatite
C, epatite B o altri agenti infettivi. Quindi, tutti i
componenti del kit vanno maneggiati secondo le
stesse modalità utilizzate per i materiali potenzialmente infettivi.
2. Tutti i sieri di controllo, i seri di calibrazione e i campioni dei pazienti devono essere maneggiati osservando le precauzioni di sicurezza biologica di livello
2, come raccomandato per ogni siero umano
potenzialmente infettivo o per campioni di sangue
nel manuale pubblicato per i CDC/NIHM (Centers
for Disease Control/National Institutes of Health
Manual, Centri per il Controllo delle Infezioni/Istituti
Nazionali per la Sanità): Biosafety in Microbiological
and Biomedical Laboratories, Edizione 1984.
3. Il sodio azide (0,1%) viene usato come conservante
nei sieri di controllo e di calibrazione. Il sodio azide
può reagire con le tubature in piombo o rame
formando azoturi metallici altamente esplosivi.
Quando si eliminano i reagenti, far scorrere grandi
quantità di acqua del rubinetto per evitare la
formazione di potenziali residui nelle tubature. Il
RACCOLTA DI CAMPIONI
Raccolta: il siero è il campione preferito. Devono
essere prelevati con tecnica asettica circa 5 ml di
sangue intero per venopuntura usando una provetta
di raccolta sterile a vuoto o un altro sistema di raccolta
adatto. Lasciare che il sangue si coaguli a temperatura
ambiente (19-23°C). Non appena possibile, il siero deve
essere separato dal coagulo per centrifugazione in
modo da minimizzare l’emolisi.
ATTENZIONE: non inattivare a caldo i campioni di
siero da usare il test di screening degli ENA RELISA®.
L’inattivazione a caldo può causare l’aumento dei
valori.
Sostanze interferenti: non vanno usati sieri che mostrano
un alto grado di emolisi, ittero, lipemia o crescita microbica, perché queste condizioni possono provocare
risultati atipici. Campioni contenenti sostanze particellari visibili vanno chiariti per centrifugazione prima
dell’analisi.
Conservazione: i sieri possono essere conservati a
2-10°C fino ad una settimana. Se l’analisi viene ulteriormente rimandata, i sieri devono essere conservati
congelati a -20°C o a una temperatura inferiore. I sieri
non devono essere conservati in frigoriferi autosbrinanti
o in freezer.
ATTENZIONE: il ripetuto congelamento e scongelamento dei campioni dei pazienti può dare origine a falsi
risultati positivi o a falsi risultati negativi.
NOTE PROCEDURALI GENERALI
1. Prima dell’uso è estremamente importante avere
tutti i componenti del kit e i campioni di siero a
temperatura ambiente (19-23°C). Per portare alla
temperatura di 20°C un intero litro di tampone
di lavaggio dopo averlo tolto dal frigo, possono
essere necessarie parecchie ore. Temperature di
incubazione superiori o inferiori al range stabilito
possono essere causa di risultati non accurati. Dopo
l’uso conservare al freddo campioni e reagenti non
usati.
2. Mescolare bene i reagenti prima dell’uso capovolgendoli con delicatezza. Non far vorticare i
reagenti e non scuoterli. Evitare la formazione di
schiuma.
3. Quando si preparano le diluizioni dei campioni,
le punte delle pipette devono essere asciugate
prima di erogare il siero nel diluente per campioni.
13
4.
5.
6.
7.
8.
L’eccesso di campione adeso alla parte esterna
della punta della pipetta influenza i risultati.
Si consiglia l’uso di una pipettatrice multicanale
perché garantisce erogazione, tempi di incubazione e tempi di reazione più uniformi.
Un adeguato lavaggio dei pozzetti è estremamente
importante. Pozzetti non lavati adeguatamente
mostreranno valori di fondo alti e possono dare falsi
valori positivi. Per il lavaggio manuale, aspirare il
contenuto dei pozzetti, poi riempirne ciascuno con
soluzione tampone di lavaggio. Evitare la contaminazione incrociata dei pozzetti, particolarmente
nel primo lavaggio dopo l’aspirazione. Drenare
tutto il tampone di lavaggio dai pozzetti capovolgendoli, poi eliminare i residui con un brusco
movimento “secco” del polso. Ripetere le fasi di
riempimento e di drenaggio per 3-5 lavaggi in tutto.
I pozzetti devono poi essere passati con forza su
carta assorbente o altro materiale assorbente in
modo da eliminare ogni traccia di residuo di tampone di lavaggio. L’uso di un sistema di lavaggio
automatico dei micropozzetti ne assicurerà il giusto
lavaggio ed è consigliato.
NOTA: a causa dei vari tipi di tecniche di lavaggio
e di sistemi automatici, il numero dei lavaggi può
essere adeguato in modo da ottenere risultati ottimali. Ciascun laboratorio deve decidere il numero
di lavaggi più efficace per il proprio sistema di
lavaggio.
Una inadeguata rimozione dei residui del tampone
di lavaggio può causare un viraggio incoerente del
colore. Per ridurre al minimo i residui di tampone di
lavaggio, le strisce di micropozzetti devono essere
tamponate su carta assorbente.
I tempi di tutte le fasi sono cruciali. Tutti i campioni
di siero devono essere diluiti prima di iniziare la
procedura e devono essere distribuiti nei micropozzetti nel minor tempo possibile (non più di cinque
minuti). Le dimensioni dei lotti vanno fissate in modo
che la manipolazione del campione possa essere
realizzata comodamente entro questo lasso di
tempo. L’uso di una pipetta multicanale agevola il
maneggiamento dei campioni e dei reagenti ed è
consigliato.
Con la sola eccezione dell’ultima incubazione
(soluzione di substrato), ogni periodo di incubazione inizia con il completamento dell’erogazione
del campione o del reagente. L’incubazione della
soluzione di substrato deve durare esattamente
��
��
��
cinque
minuti
per ciascun
pozzetto. Tutti i campioni
e i reagenti
devono essere
distribuiti
��
��
� con la stessa
sequenza e a tasso costante.
��
��
��
�
��
�
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
��
��
��
INTERPRETAZIONE
DEI ��
RISULTATI
9.
reagenti a temperatura ambiente (19-23°C), e
ripetere la fase prestando particolare attenzione al
tempo di tutte le fasi.
Il pozzetto di controllo del bianco deve avere un
valore di assorbanza inferiore a 0,150. Valori di
assorbanza del bianco superiori a 0,150 indicano
un lavaggio inadeguato o contaminazione dei
reagenti.
Per ottenere una stima più accurata degli specifici
valori di anticorpi, i campioni con specifici valori di
anticorpi maggiori del limite superiore del calibratore possono essere ulteriormente diluiti. Per ottenere lo specifico valore finale di anticorpi per questi
campioni, stabilirne il valore per l’assorbanza del
campione diluito (come sopra) e moltiplicarlo per
il fattore di diluizione. Ad esempio, se un campione
a 1:40 mostra un’assorbanza superiore a quella del
calibratore, il campione può essere ulteriormente
diluito a 1:80 mescolando 100 µl della diluizione a
1:40 con 100 µl di diluente per campioni. Viene poi
saggiata la diluizione a 1:80 e il risultato ottenuto
si moltiplica per due (il fattore di diluizione) per ottenere il valore unitario finale.
Il fattore di conversione deve essere calcolato per
ogni sequenza. L’uso di un fattore di conversione di
un’altra sequenza invalida i risultati.
Ciascun laboratorio deve stabilire e conservare i
propri valori del range di riferimento (normali) sulla
base del gruppo di pazienti e di altri fattori locali.
Il siero di controllo positivo è un siero umano contenente anticorpi diretti contro uno o più antigeni
nucleari estraibili Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70,
e/or Jo-1. Questo è un controllo qualitativo che
deve dare un valore superiore alle 20 unità ENA.
Il siero di controllo negativo è un pool di siero
umano che non contiene gli anticorpi diretti contro
uno dei sei autoantigeni di questa analisi. Questo
è un controllo qualitativo che deve dare un valore
inferiore alle 20 unità ENA.
Il siero di controllo positivo dosato non diluito è un
siero umano contenente anticorpi diretti contro
uno o più degli antigeni nucleari estraibili Sm, RNP,
SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 e/o Jo-1. Il valore del dosaggio di questo controllo, in unità ENA, è indicato
sull’etichetta della fiala. Questo range è stato
fissato per comprendere il 99% dei valori previsti per
la variazione statisticamente normale. Sono previste
piccole deviazioni occasionali al di fuori di questi
range. Ciascun laboratorio deve stabilire i propri
criteri di accettazione/rifiuto sulla base della propria
esperienza con questa analisi.
Se un valore di controllo è fuori range, l’analisi non
è valida e deve essere ripetuta.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI DEL PAZIENTE
CALCOLI
* Se i calibratori e i campioni sono elaborati in duplicato, usare l’assorbanza media dei pozzetti in duplicato.
1. Questa è un’analisi qualitativa. I livelli di anticorpi
rilevati non hanno alcun significato clinico noto e i
valori delle unità ottenuti in questa analisi tendono
��
��
� ��
semplicemente a dividere
i pazienti
nei tre
ampi ��
gruppi che seguono. I pozzetti di��
campione
del��
��
paziente che hanno valori calcolati superiori o
��
uguali a 25 unità ENA sono considerati positivi, e
devono essere testati per singole specificità ENA.
I pozzetti di campioni di pazienti che hanno valori
calcolati inferiori a 20 unità ENA sono considerati
negativi. Valori tra 20 e 25 unità sono considerati
al limite della positività e devono essere ripetuti
oppure testati per singole specificità ENA. Ciascun
laboratorio deve fissare il propria range di riferimen��
��
� ��
to e i propri valori ��
di cut-off
sulla base dei
gruppi
di
pazienti oggetto del
test. I��
valori
delle unità sono
��
��
influenzati da fattori inerenti ai pazienti, da situazioni
��
meccaniche (come ad esempio, la precisione e
l’accuratezza della pipettatura) e dalle condizioni
di analisi (come ad esempio, la temperatura e il
tempo delle fasi).
2. Dal momento che il test di screening con provetta
singola ENA RELISA® contiene una miscela di
antigeni, i risultati rappresentano un insieme di
reazioni di anticorpi a ciascuno dei sei antigeni. Se
sono presenti bassi livelli di autoanticorpi multipli il
test di screening con provetta singola ENA RELISA®
può mostrare un risultato positivo, ma le singole
specificità possono essere al di sotto del valore di
cut-off per ciascuno.
CONTROLLO DELLA QUALITÀ
RIPORTO DEI RISULTATI
1. Il valore di assorbanza medio dei pozzetti di
calibrazione deve essere almeno di 0,400. Valori di
assorbanza inferiori a 0,400 indicano un viraggio
inadeguato del colore ed una sequenza non
valida. Il viraggio inadeguato del colore in genere
è dovuto all’uso di reagenti freddi o ad un tempo
non esatto di una o più fasi dell’analisi. Portare i
��
14
I risultati devono essere riportati come positivi o negativi
per anticorpi contro gli antigeni nucleari estraibili. I
valori degli anticorpi non hanno alcun significato clinico
noto.
��
��
��
1. Sottrarre il valore di assorbanza per il pozzetto bianco del reagente dai valori di assorbanza ottenuti
nei pozzetti di calibrazione, di controllo e dei campioni del paziente. Calcolare i valori di assorbanza
medi per i pozzetti in duplicato.
2. Per ottenere il fattore di conversione, la specifica
concentrazione di anticorpi del siero di calibrazione
�� sull’etichetta)
��
(indicata
si divide per il valore medio
di assorbanza
dei pozzetti
��
��di
��calibrazione.
��
3. Per ottenere la specifica concentrazione di anti�
� � ��
corpi in unità, moltiplicare i valori di assorbanza di
��
��per
��
��
ciascuno
dei campioni
il fattore
di conversione.
4. La forma semplificata di questi calcoli può essere
espressa come:
��
��
��
��
�
��
�
��
�
��
�
��
��
��
��
��
��
��
�
��
�
��
��
LIMITI DEL TEST
nessuno dei quali aveva alcuna storia nota di patologie
reumatiche. Sulla base di questi dati, i normali valori di
cut-off furono fissati a meno di 20 unità ENA. La buona
pratica di laboratorio vuole che ciascuno fissi i range
normali sulla base dei propri gruppi di pazienti e di altri
fattori locali.
1. La diagnosi non può essere fatta solo sulla base di
anticorpi diretti contro gli antigeni nucleari estraibili.
Il medico deve interpretare questi risultati confrontandoli con l’anamnesi e i sintomi del paziente, i
��diagnostiche.
��
��
�� procedure
dati fisici e altre
CARATTERISTICHE PRESTAZIONALI
2. La cura non va iniziata sulla sola base di un test
positivo per��
gli anticorpi
anti-ENA.
Prima
di iniziare
��
��
��
��
Il test di screening con provetta singola ENA RELISA®
qualunque trattamento devono essere consider��
��
��
��
��
della��
Immuno
Concepts
fu confrontato
col��
test di
ate indicazioni cliniche, altri risultati di laboratorio e
multiparametro
l’impressione clinica del
medico.
��
�� screening
��ENA
��
�� RELISA® della Immuno
Concepts. Il gruppo di pazienti studiato consisteva di
3. Alcuni pazienti con immunopatie hanno livelli di
��
�� 50
��pazienti
�� che soddisfacevano i criteri per la diagnosi
anticorpi contro gli antigeni nucleari estraibili non
di lupus
��
��
��eritematoso sistemico, 25 pazienti con miosite
rilevabili��
o insignificanti
e alcuni��
soggetti possono
autoimmune o sindrome di miosite coincidente, 23
avere livelli alti di anticorpi diretti contro gli antigeni
��
��
pazienti con una diagnosi di sclerodermia o sclerosi pronucleari estraibili ma poca o nessuna evidenza
��
��
��
��sistemica,
��
��
��
gressiva
21 ��
pazienti
con sindrome
di Sjögren,
di patologia
clinica.��
Il medico
deve interpretare
3 pazienti con una diagnosi di artrite reumatoide, 18
i risultati delle analisi degli
anticorpi
anti-antigeni
��
pazienti con malattia del tessuto connettivo indiffernucleari estraibili confrontandoli con l’anamnesi e
enziata e 403 soggetti con immunopatia sconosciuta.
i sintomi del paziente, i dati fisici e altre procedure
Sulla base di questo confronto, furono ottenuti i dati
diagnostiche.
che seguono. Tabella 2.
4. I livelli di anticorpi rilevati con questo sistema di
��
analisi
non indicano necessariamente la gravità o
��
��
��
I risultati borderline vennero considerati positivi. Questi
la durata
della patologia.
dati danno origine alla seguente statistica: sensibilità
relativa,
97,9%; specificità
relativa,
VALORI ATTESI��
��
��
��
��97,8%;
�� e��accordo
�
complessivo 97,8%
��
��
��
L’incidenza degli autoanticorpi
contro diversi
antigeni
RIPRODUCIBILITÀ
nucleari varia
a seconda��
del gruppo di pazienti
�� e ��
��
��
dell’incidenza clinica delle patologie reumatiche
��
��
��
��
��
��
cliniche in quel gruppo. L’associazione degli anticorpi a Vennero elaborati, in tre diverse occasioni, sei campioni
positivi
e
cinque
pecifiche patologie
è riassunta
in tabella
1. ��
��
��
��
� negativi su tre diversi numeri di lotto di
�� reumatiche
strisce di antigene. In nessun caso un campione nega��
��
��
tivo mostrò risultati positivi e campioni positivi dettero
RANGE DI RIFERIMENTO
coerentemente
risultati
chiaramente
positivi.
��
��
��
��
� ��
��
Il range di riferimento fu fissato analizzando i sieri di 403
��
��
��
��
donatori di sangue sani, 205 femmine e 198 maschi,
��
��
��
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TABELLA 1
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TABELLA��
2
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15
��
PROCEDURA DI ANALISI SCREENING
DEGLI ENA CON POZZETTO
SINGOLO RELISA®
Prima dell’uso tutti i campioni, i reagenti (compresa la soluzione tampone di
lavaggio) e i micropozzetti devono essere a temperatura ambiente.
1.
2.
PREPARAZIONE DEL MODULO DI PROTOCOLLO
Indicare nel modulo di protocollo accluso nel kit la posizione dei campioni nei
micropozzetti. Analizzare il calibratore in
duplicato. Un pozzetto viene usato per il
bianco del reagente. Raccomandiamo di
analizzare in duplicato ciascun controllo e
campione del paziente, fino a che non si
sia stabilita una precisione accettabile per
l’analisi nel proprio laboratorio.
in tutto. I pozzetti devono poi essere passati
con forza su carta assorbente o altro materiale assorbente in modo da eliminare ogni
traccia di residuo di tampone di lavaggio.
PREPARAZIONE DELLA SOLUZIONE DI LAVAGGIO TAMPONE (PBS-Tween)
Sciogliere il contenuto di una busta di tampone PBS in un litro di acqua deionizzata
o distillata. Aggiungere l’intero contenuto
di un flacone di concentrato di tampone
di lavaggio al contenitore di PBS sciolto.
Mescolare bene. La soluzione tampone di
lavaggio può essere coperta e conservata
a 2-10° fino a quattro settimane.
3.
DILUIZIONE DEI CAMPIONI DEI PAZIENTI
Diluire i campioni del paziente a 1:40 aggiungendo 25 µl di siero a 975 µl di diluente
per campioni. Se si usa il controllo positivo
ENA non diluito opzionale, diluirlo allo stesso
modo dei campioni dei pazienti. Mescolare
bene. Il calibratore, il controllo positivo e il
controllo negativo sono forniti alla diluizione
di lavoro e non ne richiedono una ulteriore.
4.
PREPARAZIONE DEI MICROPOZZETTI
Rimuovere i micropozzetti necessari dalle
rispettive buste e metterli nel supporto. I
micropozzetti devono essere saldamente
sistemati nel supporto. Premere con forza
su entrambe le estremità delle strisce in
modo che si blocchino correttamente
nel supporto. Se si usano pozzetti singoli o
meno di una striscia completa di pozzetti,
assicurarsi che ogni pozzetto sia ben fermo.
I pozzetti ben sistemati nel supporto non
cadranno quando il supporto si capovolge.
Se per l’analisi sono necessari meno di otto
pozzetti, questi possono essere separati
staccandoli. I pozzetti inutilizzati possono
essere rimessi nel sacchetto, sigillati con
nastro adesivo e refrigerati per 14 giorni al
massimo.
5.
EROGAZIONE DELLE DILUIZIONI DEL SIERO
Erogare 50 µl dei calibratori, dei controlli e
dei campioni diluiti dei pazienti nei pozzetti
appropriati come descritto nel modulo
di protocollo. Erogare 50 µl di diluente
per campioni nel pozzetto bianco del
reagente.
6.
INCUBAZIONE DELLE STRISCE
(30 minuti a temperatura ambiente, ovvero
19-23°C)
Incubare a temperatura ambiente per 30
minuti. Durante l’incubazione, le strisce
devono essere protette da correnti d’aria
o variazioni di temperatura. Le strisce possono essere eventualmente coperte con
nastro trasparente o con carta assorbente
per proteggerle dalla polvere o da altri
corpi estranei.
7.
LAVAGGIO DELLE STRISCE (consultare le
note procedurali generali 5 e 6)
Lavare i pozzetti da 3 a 5 volte con soluzione di lavaggio tampone PBS-Tween. Per
il lavaggio manuale, aspirare il contenuto
dei pozzetti, poi riempirne ciascuno con
soluzione tampone di lavaggio. Evitare la
contaminazione incrociata dei pozzetti,
particolarmente nel primo lavaggio dopo
l’aspirazione. Far scorrere tutto il tampone
di lavaggio dai pozzetti capovolgendoli,
poi eliminare i residui con un brusco movimento “secco” del polso. Ripetere le fasi di
riempimento e di drenaggio per 3-5 lavaggi
16
8.
EROGAZIONE DEL REAGENTE ANTICORPO
ENZIMATICO
Erogare 50 µl di reagente anticorpo enzimatico in ciascun pozzetto.
9.
INCUBAZIONE DELLE STRISCE (30 minuti a
temperatura ambiente, ovvero 19-23°C)
Incubare a temperatura ambiente per 30
minuti. Durante l’incubazione, le strisce
devono essere protette da correnti d’aria
o variazioni di temperatura. Le strisce possono essere eventualmente coperte con
nastro trasparente o con carta assorbente
per proteggerle dalla polvere o da altri
corpi estranei.
10.
LAVAGGIO DELLE STRISCE
Lavare i pozzetti da 3 a 5 volte con soluzione di lavaggio tampone PBS-Tween. Per
il lavaggio manuale, aspirare il contenuto
dei pozzetti, poi riempirne ciascuno con
soluzione tampone di lavaggio. Evitare la
contaminazione incrociata dei pozzetti,
particolarmente nel primo lavaggio dopo
l’aspirazione. Drenare tutto il tampone di
lavaggio dai pozzetti capovolgendoli, poi
eliminare i residui con un brusco movimento “secco” del polso. Ripetere le fasi di
riempimento e di drenaggio per 3-5 lavaggi
in tutto. I pozzetti devono poi essere passati
con forza su carta assorbente o altro materiale assorbente in modo da eliminare ogni
traccia di residuo di tampone di lavaggio.
11.
EROGAZIONE DELLA SOLUZIONE SUBSTRATO
Usando un timer per assicurare intervalli coerenti, erogare 50 µl di soluzione substrato
in ciascun pozzetto. La soluzione substrato
deve essere aggiunta a tasso regolare in
modo che ciascun pozzetto sia incubato
esattamente per lo stesso tempo (cinque
minuti). La soluzione substrato nei pozzetti
incubati con campioni positivi virerà al
blu e la soluzione nei pozzetti incubati con
campioni negativi sarà da incolore a blu
molto chiaro.
12.
INCUBAZIONE DELLE STRISCE (5 minuti esatti
a temperatura ambiente, ovvero 19-23°C)
Incubare a temperatura ambiente per
cinque minuti. Durante l’incubazione, le
strisce devono essere protette da correnti
d’aria o variazioni di temperatura.
13.
EROGAZIONE DEL REAGENTE BLOCCANTE
Dopo che il primo pozzetto è stato incubato per cinque minuti esatti, aggiungere
50 µ di reagente bloccante nello stesso
ordine e allo stesso tasso con cui era stato
aggiunto ai pozzetti la soluzione substrato.
Al momento dell’aggiunta del reagente
bloccante, la soluzione di substrato blu vira
al giallo e quella incolore resta incolore.
14.
LETTURA DELL’ASSORBANZA DEI POZZETTI
Entro 30 minuti dall’aggiunta del reagente
bloccante, i pozzetti devono essere letti in
uno spettrofotometro per la lettura della
piastra. I pozzetti vengono letti a 450 nm
rispetto al pozzetto di controllo del bianco.
Se è disponibile uno spettrofotometro a
lunghezza d’onda doppia, la lunghezza
d’onda per il filtro di riferimento deve essere
600-650 nm.
PER ASSISTENZA TECNICA: +1 916-363-2649
oppure a mezzo e-mail:
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DETECCIÓN SELECTIVA DE ENA EN POCILLO
ÚNICO CON RELISA® PARA ANTICUERPOS
CONTRA ANTÍGENOS NUCLEARES EXTRAÍBLES
PARA USO DIAGNÓSTICO IN VITRO
RESUMEN Y EXPLICACIÓN DE LA PRUEBA
Uso previsto: Se trata de un sistema de análisis inmunoenzimático (EIA) para la detección de anticuerpos
contra los antígenos nucleares extraíbles Sm (Smith),
RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 y and Jo-1 en suero humano. Los resultados de esta prueba se pueden utilizar
como complemento del diagnóstico de enfermedades
autoinmunitarias.
Los anticuerpos anti-ENA se han asociado a diversos síndromes autoinmunitarios, y parecen tener un
significado diagnóstico y/o pronóstico en la esclerosis
sistémica (1, 2), las enfermedades mixtas del tejido
conjuntivo (3-5), el síndrome de Sjögren (6, 7), la polimiositis (8), la dermatomiositis (9), el lupus eritematoso
sistémico (5) y la artritis reumatoide (10). Se ha utilizado
el análisis de anticuerpos antinucleares (ANA) para
hacer una detección selectiva de estos anticuerpos,
pero en dicho análisis no se especifica el anticuerpo, y
algunos anticuerpos contra determinados ENA no dan
positivo en el análisis de ANA (11, 12). Por eso es muy
recomendable realizar una evaluación secundaria de
confirmación de los anticuerpos anti-ENA (13).
El antígeno Sm (Smith) fue identificado en 1966 por Tan
y Kunkel como una glucoproteína no histona soluble
en suero salino, que no depende del ADN ni del ARN
para su poder antigénico (14). Se considera que los
anticuerpos contra el antígeno Sm son marcadores
serológicos específicos, debido a su elevado grado de
especificidad por el lupus eritematoso sistémico (LES).
Estos anticuerpos se observan en hasta el 30% de los
pacientes con LES, y se han asociado a nefropatías
activas y a cerebritis (15-17).
En el suero de pacientes con LES es frecuente
encontrar anticuerpos anti-Sm junto con anticuerpos
anti-U1-RNP (18, 19). Al contrario que los anticuerpos
anti-Sm, los anticuerpos anti-RNP no se consideran marcadores serológicos específicos, pues se encuentran
en pacientes con diversas enfermedades reumáticas
como LES, esclerodermia, síndrome de Sjögren y artritis
reumatoide. No obstante, los niveles elevados de anticuerpos anti-RNP presentan una elevada asociación
a un síndrome intermedio denominado enfermedad
mixta del tejido conjuntivo (EMTC). Los pacientes con
EMTC se caracterizan por una combinación de datos
clínicos que se observan en el LES, la esclerodermia y la
polimiositis. A menudo, estos pacientes demuestran una
buena respuesta al tratamiento con corticosteroides,
y presentan una incidencia menor de enfermedades
renales que los pacientes con LES (20, 21).
Originalmente, SSA y SSB fueron descritos como antígenos nucleares de proteínas del ARN en pacientes
con síndrome de Sjögren (6, 7). Ro y La fueron descritos
como antígenos citoplásmicos de proteínas del ARN
en pacientes con LES (22, 23). En la actualidad se suele
aceptar que SSA y Ro son análogos, que SSB y La también lo son, y que estos antígenos se encuentran tanto
en el núcleo como en el citoplasma. Se encuentran anticuerpos contra SSA/Ro solo o contra SSA/Ro y SSB/La
en hasta el 62% de los pacientes con lupus cutáneo
subagudo (24), y en el 85% de los pacientes con
síndrome de Sjögren que presentan vasculitis (25). Se
observan anticuerpos contra SSA/Ro solo en pacientes
con déficit homozigótico de la fracción C2 del complemento (26), en pacientes con cirrosis biliar primaria que
desarrollan síndrome de Sjögren (27) y en hasta dos
tercios de los pacientes con “LES sin ANA” (28).
Se ha identificado que el antígeno Scl-70 es una
enzima celular, la ADN topoisomerasa I (29). Se han
observado anticuerpos anti-Scl-70 en hasta el 56%
de los pacientes con esclerosis sistémica progresiva,
sobre todo en el subgrupo que presenta esclerodermia
difusa (30). Se considera que estos autoanticuerpos son
marcadores de la ESP, pues no se observan en otras
enfermedades del tejido conjuntivo. Los anticuerpos
anti-Jo-1, que es la enzima celular histidil ARNt sintetasa,
se encuentran en el 25-30% de los pacientes con polimiositis o dermatomiositis, pero no en otras miopatías
(11, 31). También se ha demostrado que los anticuerpos
anti-Jo-1 presentan una elevada asociación con las
neumopatías intersticiales que se observan en asociación a las miositis (31).
PRINCIPIO DE LA PRUEBA
de los micropocillos ha sido recubierta con una mezcla
de antígenos nucleares extraíbles purificados en
función de su afinidad y estabilizados, que actúa como
antígeno en este sistema. Se disponen muestras diluidas
de los pacientes en los micropocillos, y se incuban permitiendo que los anticuerpos específicos de la muestra
reaccionen con el antígeno de la fase sólida. Tras lavar
para retirar el anticuerpo no ligado y otras proteínas del
suero, se incuban los pocillos con anticuerpos humanos
de cabra, marcados con peroxidasa de rábano. El
preparado de anticuerpos conjugados con peroxidasa
de rábano que se incluye en sistema de evaluación es
específico de las cadenas ligeras y pesadas de la IgG
humana.
Tras la incubación con los conjugados de peroxidasa
de rábano, y si los resultados son positivos, se forma un
complejo estable con tres partes. Este complejo esta
compuesto por anticuerpo antihumano conjugado
con peroxidasa de rábano unido al anticuerpo antiENA humano, unido a su vez al antígeno estabilizado
en la superficie de plástico.
Tras otro paso de lavado se detecta el complejo añadiendo una solución de tetrametilbenzidina (TMB) y H2O2
como sustrato cromógeno. El grado de aparición del
color en cada pocillo es proporcional a la concentración de anticuerpos anti-ENA en cada muestra de
suero. Cada micropocillo es analizado en un espectrofotómetro a 450 nm.
COMPONENTES DEL SISTEMA (MATERIALES SUMINISTRADOS)
Conservación: Todos los componentes deben conservarse en refrigerador a 2-10 ºC. No congelar.
Estabilidad: Todos los componentes son estables al
menos durante 12 meses a partir de la fecha de fabricación. No utilice los componentes pasada la fecha
de caducidad.
REACTIVOS
Tiras de micropocillos recubiertas con antígeno nuclear
extraíble: Nº de catálogo 7008-10. Tiras de ocho
pocillos con una mezcla de seis antígenos nucleares
extraíbles purificados en función de su afinidad y estabilizados (Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 y Jo-1). Estas
tiras son de color pardo. Cada tira de ocho pocillos va
en una bolsa de aluminio individual sellada.
Disolvente de muestras: Número de catálogo 7100 (100
ml). Disolvente para muestras tamponado patentado,
para disolver las muestras de los pacientes.
Reactivo enzimático para anticuerpos – específico
de las cadenas ligeras y pesadas de la IgG humana:
Número de catálogo 7009-10 (6 ml). IgG antihumana
de cabra (L y P), conjugada con peroxidasa de rábano
(HRP). Listo para usar.
Solución de sustrato: Número de catálogo 7035 (6 ml).
Solución de sustrato enzimático específica de HRP, que
contiene 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) estabilizada
y peróxido de hidrógeno (H2O2). Listo para usar.
Reactivo de parada: Número de catálogo 7033 (6 ml).
Reactivo de parada patentado para los sistemas de
análisis EIA de Immuno Concepts. Listo para usar. PRECAUCIÓN: Corrosivo. Este reactivo contiene ácido clorhídrico y ácido sulfúrico (menos del 3% de cada uno,
por volumen) y debe ser manipulado con precaución.
Manténgase fuera del alcance de los niños. En caso de
contacto con los ojos, lavar inmediatamente con agua
abundante y acudir al médico. No añadir agua a este
reactivo en ningún caso.
Suero calibrador de ENA: Número de catálogo 7026-10
(1 ml). Suero humano que contiene anticuerpos contra
uno o más de los antígenos nucleares extraíbles Sm,
RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 y/o Jo-1. El valor de la
prueba para este suero figura en la etiqueta del vial.
Este suero se presenta en dilución de trabajo, listo para
usar. Este reactivo contiene azida sódica al 0,1% como
conservante.
Control positivo de ENA: Número de catálogo 7021-10
(1 ml). Suero humano positivo que contiene anticuerpos contra uno o más de los antígenos nucleares
extraíbles Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 y/o Jo-1. Este
suero se presenta en dilución de trabajo, listo para
usar. Este reactivo contiene azida sódica al 0,1% como
conservante.
Se trata de un EIA cualitativo indirecto. La superficie
17
Control negativo para ENA: Número de catálogo 7031
(1 ml). Suero de control negativo humano que no contiene anticuerpos contra los antígenos Sm, RNP, SSA/Ro,
SSB/La, Scl-70 y Jo-1. Este suero se presenta en dilución
de trabajo, listo para usar. Este reactivo contiene azida
sódica al 0,1% como conservante.
Control positivo analizado no diluido de ENA opcional:
Número de catálogo 7022-10 (0,25 ml). Suero de
control positivo humano que contiene anticuerpos
contra uno o más de los antígenos nucleares extraíbles
Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 y/o Jo-1. Este control
positivo debe ser tratado con suero no diluido. El valor
del análisis de este suero figura en la etiqueta del vial.
Este reactivo contiene azida sódica al 0,1% como
conservante.
ELEMENTOS NO REACTIVOS
Soporte para las tiras de micropocillos
Solución tampón de lavado:
Tampón PBS: Nº de catálogo 1011. Polvo tampón salino
con fosfato (0,01 M, pH 7,4 ± 0,2). Cada bolsa contiene
polvo tampón suficiente para formar 1 litro. (Se suministran dos bolsas de polvo tampón con cada placa de
96 micropocillos, en kits de análisis completos).
Concentrado de tampón de lavado: Número de catálogo 1031 (10 ml). Solución de Tween 20 al 5%, para
utilizar en el tampón de lavado. (Se suministran dos
viales de concentrado de tampón con cada lámina
de 96 micropocillos, en kits de análisis completos).
Preparación: Disuelva el contenido de una bolsa de
polvo tampón en un litro de agua desionizada o destilada. Añada todo el contenido de un frasco de concentrado de tampón de lavado al PBS disuelto. Mezcle
bien y conserve en refrigerador a 2-10 ºC durante 4
semanas como máximo, o hasta que aparezcan signos
de contaminación u otras alteraciones visibles. La
solución tampón de lavado debe estar a temperatura
ambiente (19-23 ºC) antes de su empleo.
OTROS MATERIALES NECESARIOS (PERO QUE NO SE
SUMINISTRAN)
Pipetas volumétricas de precisión para dispensar
volúmenes de 25-1000 µl
Frasco flexible para añadir solución de tampón
de lavado a los micropocillos, o un sistema de
lavado automático o semiautomático para
micropocillos.
Envase de un litro para la solución tampón de
lavado PBS
Agua desionizada o destilada
Espectrofotómetro de lectura de placas capaz de
interpretar absorbancia a 450 nm
Probetas para preparar las diluciones de suero
Papel secante o toallas de papel
Pipeta multicanal capaz de dispensar a 8 pocillos
Guantes de látex desechables
Cronómetro
ingestión.
4. La disolución de los componentes o su sustitución
por otros distintos de los suministrados con el
sistema puede arrojar resultados incoherentes.
5. No inactive por calor las muestras de suero utilizadas para la detección selectiva de ENA RELISA®.
La inactivación por calor puede hacer que
aumenten los valores.
6. Este kit es para uso diagnóstico in vitro.
7. No pipetee nunca con la boca y evite el contacto
de los reactivos y las muestras con la piel y las mucosas. En caso de contacto, lávese con un jabón
germicida y agua abundante.
8. Esta prohibido fumar, comer o beber en las zonas
de manipulación de las muestras o los reactivos del
kit.
9. Evite salpicaduras y la generación de aerosoles en
todo momento.
10. Si los tiempos de incubación y las temperaturas
no son los especificados, los resultados pueden ser
erróneos.
11. La contaminación cruzada de los reactivos o de las
muestras puede dar resultados falsos. Las muestras
deben permanecer en los micropocillos durante el
análisis.
12. Los elementos de vidrio reutilizables deben ser
lavados y enjuagados a fondo para eliminar los
detergentes antes de su uso. Todos los elementos
de vidrio deben estar limpios y secos antes de su
uso.
13. Todos los reactivos, micropocillos y muestras deben
estar a temperatura ambiente (19-23 ºC) antes de
su uso.
14. Para manipular las muestras y los reactivos debe
utilizar guantes de látex desechables, y cuando
acabe deberá lavarse bien las manos.
15. La contaminación microbiana de los reactivos o de
las muestras puede dar resultados falsos.
16. El reactivo de parada es corrosivo y puede producir quemaduras. Este reactivo contiene ácido
clorhídrico y ácido sulfúrico (menos del 3% de cada
uno, por volumen) y debe ser manipulado con
precaución. Manténgase fuera del alcance de
los niños. En caso de contacto con los ojos, lavar
inmediatamente con agua abundante y acudir al
médico. No añadir agua a este reactivo en ningún
caso.
OBTENCIÓN DE MUESTRAS
Obtención: La muestra ideal es suero. Se obtendrán
aproximadamente 5 ml de sangre por venipunción
aséptica, con un tubo de vacío estéril u otro sistema de
obtención adecuado. Deje que la sangre coagule a
temperatura ambiente (19-23 ºC). Se separará el suero
del coágulo por centrifugado cuanto antes, para que
la hemólisis sea mínima.
PRECAUCIÓN: No inactive por calor las muestras de
suero utilizadas para la detección selectiva de ENA
RELISA®. La inactivación por calor puede hacer que
aumenten los valores.
PRECAUCIONES
1. Todos los materiales de procedencia humana
utilizados en este producto han sido analizados en
busca de anticuerpos con el virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1), el virus de la inmunodeficiencia humana-2 (VIH-2), el virus de la hepatitis
C (VHC) y el antígeno de superficie de la hepatitis
B (HBsAG) con métodos homologados por la FDA,
obteniendo resultados negativos (no reactivos en
varias ocasiones) en todos los casos. Pero no existe
ningún método de análisis que pueda garantizar
por completo la ausencia de VIH-1, VIH-2, hepatitis
C, hepatitis B u otros agentes infecciosos. Por eso,
todos los materiales del kit deben ser manipulados
como si fueran infecciosos.
2. Todos los sueros de control, los sueros de calibración y las muestras de pacientes deben ser
manipuladas según el nivel 2 de bioseguridad,
según recomienda en el manual de los Centers for
Disease Control/National Institutes of Health para
toda muestra de suero o sangre humana potencialmente infecciosa: Biosafety in Microbiological
and Biomedical Laboratories, 1984 Edition.
3. En los sueros de control y calibración se emplea
azida sódica (0,1%) como conservante. La azida
sódica puede reaccionar con las conducciones de
plomo o cobre y formar sales de azidas metálicas
muy explosivas. Al eliminar los reactivos, lavar con
grandes volúmenes de agua del grifo para evitar
que queden residuos en las tuberías. La azida
sódica es venenosa y puede ser tóxica en caso de
18
Sustancias que interfieren: No se utilizarán sueros que
muestren grados elevados de hemólisis, ictericia, lipemia o crecimiento microbiano, pues en todas esas circunstancias se pueden producir resultados aberrantes.
Si la muestra presenta partículas visibles, éstas deben
ser eliminadas por centrifugado antes de la prueba.
Conservación: Los sueros se pueden conservar a 2-10
ºC durante una semana como máximo. Si el análisis se
posterga, los sueros deben conservarse congelados a
una temperatura de –20 ºC o inferior. No se utilizarán
refrigeradores ni congeladores con sistema “auto-frost”
(eliminación automática de la escarcha).
PRECAUCIÓN: Si las muestras son sucesivamente
congeladas y descongeladas, se pueden obtener
resultados falsos positivos y negativos.
OBSERVACIONES GENERALES SOBRE EL
PROCEDIMIENTO
1. Es muy importante que todos los componentes
del kit y las muestras de suero estén a temperatura
ambiente (19-23 ºC) antes de utilizarlos. Para que
un litro entero de tampón de lavado sacado del
refrigerador alcance los 20 ºC, puede ser necesario
calentar durante varias horas. Si las temperaturas
de incubación son superiores o inferiores a las
recomendadas puede que los resultados no sean
precisos. Las muestras y reactivos no utilizados
deben ser devueltos al refrigerador.
2. Mezcle bien los reactivos antes de utilizarlos, dando
la vuelta al envase con suavidad. No agite ni
remueva los reactivos. Evite que se forme espuma.
3. Para preparar las diluciones de muestras, limpie la
punta de las pipetas antes de utilizarlas para poner
suero en el disolvente. Si queda muestra adherida
al exterior de la punta de la pipeta, los resultados
pueden variar.
4. Se recomienda utilizar una pipeta multicanal
porque con ella la dispensación del reactivo y
los tiempos de incubación y reacción son más
uniformes.
5. Es extremadamente importante lavar bien los
pocillos. Si no es así, los valores de fondo serán muy
elevados, lo que se puede traducir en resultados
falsos positivos. Para el lavado manual, aspire el
contenido de los pocillos y a continuación lave
cada uno con solución tampón de lavado. Evite
la contaminación cruzada de los pocillos, sobre
todo en el lavado siguiente a la aspiración. Elimine
todo el tampón de los pocillos dándoles la vuelta;
los residuos de tampón de lavado se quitan con
un movimiento brusco de la muñeca. Repita estos
pasos hasta un total de 3 a 5 lavados. A continuación, se pasará con fuerza una toalla de papel u
otro material absorbente por los pocillos para retirar
todo vestigio de tampón de lavado. Se recomienda utilizar un sistema de lavado automático
de los micropocillos, ya que así su limpieza queda
garantizada.
NOTA: Como existen diversas técnicas de lavado
y de sistemas automáticos, hay que ajustar el
número de lavados para que los resultados sea
óptimos. Cada laboratorio determinará el número
de lavados más eficaz para su sistema de lavado.
6. Si no se elimina todo el tampón puede que la aparición de color no sea homogénea. Para ello, hay
��limpiar
� ��
��las
��
que
con fuerza
tiras de micropocillos,
secándolas
con papel
secante o
��
��
� toallas absorbentes.
��
7. El tiempo de cada paso es fundamental. Antes de
�� el��
��
iniciar
procedimiento
se disolverán las muestras
de suero, que deben ser dispuestas en los micropocillos en el menor tiempo posible (no más de cinco
minutos). Los tamaños de lote deben determinarse
de forma que se puedan manipular las muestras en
este período de tiempo con comodidad. Se recomienda utilizar pipetas multicanal, pues facilitan la
manipulación de las muestras y los reactivos.
8. A excepción de la última incubación (solución de
sustrato), cada período de incubación empieza al
finalizar la dispensación de la muestra o el reactivo.
� ��
��de sustrato debe duLa ��
incubación
de la solución
rar�
exactamente
cinco minutos
para
� � ��
��
� cada pocillo.
Todas las muestras y reactivos deben dispensarse
�
� � ��
con la misma secuencia y a velocidad constante.
��
��
��
��
��
�
�
��
��
�
�
2.
3.
4.
��
5.
6.
7.
��
8.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
CÁLCULOS
��
��
��
1. Reste el valor de la absorbancia del pocillo sin
reactivo, de los valores de absorbancia obtenidos
en los pocillos de calibración, control y muestra del
paciente. Calcule los valores medios de la absorbancia en pocillos duplicados.
�� obtener
� ��el
��factor
��
�� se divide
2. Para
de conversión,
la concentración
�� de��anticuerpos
��específicos del
suero de calibración (que figura en la etiqueta) por
��
el valor medio de la absorbancia medida en los
�� de
��
��
pocillos
calibración.
3. Para obtener la concentración de anticuerpo
específico en unidades, se multiplican los valores
de la absorbancia de cada muestra por el factor
de conversión.
4. Este cálculo se puede expresar de forma simplificada como:
��
��
��
�
�
��
�
�
9.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS DEL
PACIENTE
1. Se trata de un análisis cualitativo. Los niveles de
anticuerpos detectados carecen de significado
clínico, y las cifras obtenidas en unidades sólo
sirven para separar a los pacientes en los siguientes
tres grandes grupos. Se consideran positivos los pocillos con muestra de paciente cuyos valores calculados sean =25 unidades ENA; serán sometidos a
un análisis de especificidades ENA individuales. Los
pocillos con muestras de pacientes que presentan
valores calculados inferiores a 20 unidades ENA
se consideran negativos. Los valores entre 20 y 25
unidades ENA se consideran positivos en el límite
y deben repetirse o ser sometidos a la detección
individual
de ENA.��
Cada laboratorio
deberá��
esta��
��
� ��
��
blecer sus propios
de referencia
y valores
�� límites
��
��
de corte, en función
de la población
de pacientes
��
��
evaluada. Los valores resultan afectados por factores de los pacientes, consideraciones mecánicas
(como la exactitud y precisión del pipeteado) y las
condiciones del análisis (como la temperatura y la
cronología de los pasos).
2. Como quiera que el análisis de detección selectiva
en pocillo único de ENA RELISA® contiene una
mezcla de antígenos, los resultados representan
una combinación de las reacciones de los anticuerpos contra los seis antígenos. Si los niveles de los
diversos anticuerpos son bajos, el análisis de detección selectiva en pocillo único de ENA RELISA®
puede dar resultado positivo, pero puede que la
presencia de los antígenos individuales sea inferior
al punto de corte de cada uno de ellos.
��
��
��
��
��
*Si se analizan los calibradores y las muestras por duplicado, utilice la absorbancia promedio de los pocillos
duplicados.
��
�
��
CONTROL DE CALIDAD
��
�
��
1. El valor medio de la absorbancia de los pocillos de
calibración debe ser de 0,400 como mínimo. Si es
��
inferior, la aparición del color no es adecuada y
el ciclo no es válido. Si la aparición del color no es
adecuada suele deberse a que los reactivos están
fríos o a que la duración de uno o más pasos de la
prueba no ha sido correcta. Deje que los reactivos
alcancen la temperatura ambiente (19-23 ºC) y
repita el ciclo prestando especial atención a la
duración de todos los pasos.
El pocillo de control vacío debe presentar un valor
de absorbancia inferior a 0,150. Si los valores de absorbancia en el pocillo vacío son superiores a 0,150,
ello indica que el lavado no ha sido adecuado o
que se han contaminado los reactivos.
Las muestras que presentan valores de anticuerpos específicos por encima del límite superior del
calibrador, pueden ser diluidas de nuevo con el
disolvente de muestras, volviendo a analizarlas
para obtener una estimación más precisa del valor
de los anticuerpos específicos. Para obtener el
valor final de estas muestras, mida la absorbancia
que corresponde a la muestra diluida (como se ha
indicado) y multiplíquela por el factor de dilución.
Por ejemplo, si una muestra diluida a 1:40 muestra
una absorbancia superior a la del calibrador, se
puede volver a diluir a 1:80 mezclando 100 µl de la
dilución 1:40 con 100 µl del disolvente de muestras.
A continuación se analiza la dilución 1:80, y el
resultado obtenido se multiplica por dos (el factor
de dilución) para obtener el valor final.
Es necesario calcular el factor de conversión en
cada ciclo. Si se emplea el factor de conversión de
otro ciclo, los resultados no serán válidos.
Cada laboratorio deberá establecer y mantener
sus propios rangos de referencia (normal), en
función de la población de pacientes y de otros
factores locales.
El suero de control positivo es un suero humano que
contiene anticuerpos contra uno o más de los antígenos nucleares extraíbles Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La,
Scl-70 y/o Jo-1. Se trata de un control cualitativo
que debe dar un valor superior a 20 unidades ENA.
El suero de control negativo es una mezcla de sueros humanos que no contiene anticuerpos contra
ninguno de los seis autoantígenos de este análisis.
Se trata de un control cualitativo que debe dar un
��
��
valor inferior a 20��
unidades
ENA.
El suero de control positivo analizado
no diluido
es��
��
��
un suero humano que contiene anticuerpos contra
��
uno o más de los antígenos nucleares extraíbles
Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 y/o Jo-1. El valor de
la prueba para este control figura en la etiqueta,
en unidades ENA. Estos límites han sido establecidos de forma que engloben el 99% de los valores
previstos, según la variación estadísticamente
normal. Cabe esperar que se produzcan pequeñas
desviaciones ocasionales con respecto a estos
��
� ��
límites. Cada laboratorio
establecerá��
sus propios
criterios para aceptarlas
o rechazarlas,
��
�� en función
de su experiencia con esta prueba.
��
Si alguno de los valores de control se sale del
rango, la prueba no es válida y debe repetirse.
19
��
��
��
�� LÍMITES
��
DE REFERENCIA
NOTIFICACIÓN
DE RESULTADOS
��
��
Los límites de referencia se han establecido a partir de
��
��
��
Se indicará si el resultado es positivo o negativo para
sueros de 403 donantes de sangre sanos, 205 mujeres
los anticuerpos��
correspondientes
a los antígenos
y 198
varones,
ninguno��de
los cuales��
presentaba ante��
��nucle��
��
��
��
ares extraíbles. Los niveles de anticuerpos carecen de
cedentes de enfermedades reumáticas. Basándose en
��
significado clínico conocido.
estos datos, se establecieron los valores de corte normales en <20 unidades ENA. La buena práctica exige
LIMITACIONES DE LA PRUEBA
que cada laboratorio establezca sus propios límites de
normalidad en función de su población de pacientes y
��
1. No es
posible hacer un diagnóstico basándose sólo de otros factores locales.
��
��
��
�� de anticuerpos
en la detección
contra
antígenos
nucleares extraíbles. El médico debe interpretar
CARACTERÍSTICAS DEL RENDIMIENTO
estos resultados en el contexto de la historia y los
��
��
��
��
��
síntomas del paciente, los hallazgos físicos y otros
Se comparó el sistema de detección selectiva de ENA
�� en pocillo único RELISA® de Immuno Concepts
procedimientos diagnósticos.
2. No se��
debe iniciar un��
tratamiento basándose
con��el��
sistema de detección
selectiva
��
��
�� de
��ENA
exclusivamente en un resultado positivo del análisis
con múltiples parámetros RELISA® de Immuno
��
��
��
de anticuerpos con antígenos
nucleares��
extraíbles.
Concepts.
La población estudiada consistió en
Antes ��
de iniciar un tratamiento
hay
que
tener
en
50
pacientes
�� que cumplían los criterios para el
cuenta las indicaciones clínicas, otros hallazgos de
diagnóstico de lupus eritematoso sistémico, 25
��
�� médico.
��
�� con miositis inmunitaria o síndrome
��
laboratorio
y la impresión
clínica del
pacientes
3. Algunos��
pacientes con
enfermedades
autoinmude ��
superposición
de miositis,
23 pacientes
��
��
��
��
��
�� con
nitarias pueden presentar niveles indetectables o
diagnóstico de esclerodermia o esclerosis sistémica
��
��
��
insignificantes de anticuerpos
contra ��
los antígenos
progresiva,
21 pacientes con síndrome de Sjögren,
nucleares��
extraíbles, ��
y algunos individuos
pueden
3 pacientes
con��
diagnóstico
de ��
artritis
reuma��
��
��
��
� ��
�
presentar niveles elevados con escasos o nulos
toide, 18 pacientes con enfermedades del tejido
��
��
��
��
��
��
��
��
datos de enfermedad. El médico debe interpretar
conjuntivo indiferenciadas y 403 individuos sin
estos resultados en el contexto de la historia y los
enfermedades autoinmunitarias conocidas. Según
síntomas del paciente, los hallazgos físicos y otros
estas comparación, se obtuvieron los siguientes
�� diagnósticos.
procedimientos
datos. Tabla 2.
��
��
��
��
4. El nivel de anticuerpos detectado con este sistema
��
��
��
��
de análisis no indica necesariamente la intensidad
Los resultados
en el
límite se consideraron
positivos.
��
��
��la��
��
��
��de la enfermedad.
o la duración
Estos
datos arrojan
siguiente
estadística:
sensibilidad
�� relativa, 97,9%;
��
��
especificidad relativa,
97,8%; y concor��
VALORES ESPERADOS
dancia general, 97,8%.
��
��
��
��
��
��
� ��
� ��
La incidencia
de autoanticuerpos
contra
los diversos
Reproductibilidad
��
��
��
� ��
��
antígenos nucleares varían en��
función de la población
Se analizaron seis
�
� muestras positivas �y cinco negativas
��
��
��
��
��
��
de pacientes
y de la incidencia
de enfermedades
en tres
números de lote diferentes de tiras de antíge��
��en esa población. En tabla 1 se
reumáticas
clínicas
nos, en
tres ocasiones diferentes. En ningún caso hubo
��
��
��
resume��
la asociación
de los anticuerpos
una muestra negativa
que diera positivo,
��
��a las enferme�
�
�� y las positivas
��
��
��claramente.
��
��concretas.
dades reumáticas
lo siguieron
siendo
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
TABLA 1
��
��
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�
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TABLA 2
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��
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��
�
�
��
��
��
��
��
20
��
�
�
��
��
PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS DE
DETECCIÓN SELECTIVA DE ENA EN
POCILLO ÚNICO CON RELISA®
Todas las muestras (incluida la solución tampón de lavado) y los micropocillos deben estar a temperatura ambiente antes de su empleo.
1.
2.
PREPARACIÓN DE LA HOJA DE TRABAJO
Marque la hoja de trabajo que se adjunta
con el kit, para indicar la localización de
las muestras en los micropocillos. Analice el
calibrador por duplicado. Un pocillo debe
quedar libre de reactivo. Recomendamos
que todas las muestras de pacientes y de
control se analicen por duplicado hasta
que se alcance una precisión aceptable
en su laboratorio.
PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN TAMPÓN DE
LAVADO (PBS-Tween)
Disuelva el contenido de una bolsa de
tampón PBS en un litro de agua desionizada o destilada. Añada todo el contenido
de un frasco de concentrado de tampón
de lavado al envase de un litro de PBS disuelto. Mezcle bien. La solución tampón de
lavado se puede tapar y conservar a 2-10
ºC durante cuatro semanas como máximo.
3.
DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS DE LOS
PACIENTES
Disuelva las muestras de pacientes a 1:40
añadiendo 25 µl de suero a 975 µl de disolvente de muestras. Si utiliza el control positivo analizado no diluido de ENA opcional,
deberá disolverlo igual que las muestras de
los pacientes. Mezcle bien. Los controles
positivos y negativos y el calibrador se entregan a la dilución de trabajo, por lo que
no es necesario disolverlos.
4.
PREPARACIÓN DE LOS MICROPOCILLOS
Saque de sus bolsas los micropocillos
necesarios y colóquelos en el soporte.
Deben quedar firmemente sujetos en él.
Apriete suavemente ambos lados de la
tira, de forma que quede bien sujeta en el
soporte. Si se emplean pocillos individuales
o menos de una tira completa de pocillos,
asegúrese de que quedan bien colocados. Si las tiras están bien colocadas en el
soporte, no se caen al darle la vuelta. Si se
necesitan menos de ocho pocillos se pueden separar los que sean necesarios. Los
pocillos no utilizados se pueden devolver
a la bolsa de aluminio; se cierra con cinta
adhesiva y se conserva refrigerada durante
14 días como máximo.
toalla de papel u otro material absorbente
por los pocillos para retirar todo vestigio de
tampón de lavado.
8.
DISPENSACIÓN DEL REACTIVO CON ANTICUERPOS ENZIMÁTICOS
Dispense 50 µl de reactivo con anticuerpos
enzimáticos en cada pocillo.
9.
INCUBACIÓN DE LAS TIRAS (30 minutos a
temperatura ambiente, es decir, entre 19 y
23°C)
Incube a temperatura ambiente durante
30 minutos. Durante la incubación, la temperatura no podrá sufrir cambios bruscos.
Si se desea se pueden tapar las tiras con
cinta transparente o con toallas de papel,
para protegerlas del polvo u otros cuerpos
extraños.
10.
LAVADO DE LAS TIRAS
Lave los pocillos de 3 a 5 veces con solución tampón de lavado PBS-Tween. Para
el lavado manual, aspire el contenido de
los pocillos y a continuación lave cada
uno con solución tampón de lavado. Evite
la contaminación cruzada de los pocillos, sobre todo en el lavado siguiente a
la aspiración. Elimine todo el tampón de
los pocillos dándoles la vuelta; los residuos
de tampón de lavado se quitan con un
movimiento brusco de la muñeca. Repita
estos pasos hasta un total de 3 a 5 lavados.
A continuación, se pasará con fuerza una
toalla de papel u otro material absorbente
por los pocillos para retirar todo vestigio de
tampón de lavado.
11.
DISPENSACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE
SUSTRATO
Utilizando un cronómetro para que los
intervalos sean homogéneos, dispense 50
µl de solución de sustrato en cada pocillo.
La solución de sustrato se incorporará a los
pocillos a velocidad constante, de forma
que todos se sometan al mismo tiempo de
incubación (cinco minutos). La solución
de sustrato incubada en los pocillos con
muestras positivas se volverá de color azul,
y si son muestras negativas, serán incoloras
o de azul muy claro.
5.
DISPENSATION DE LAS DILUCIONES DE SUERO
Dispense 50 µl de los calibradores, los controles y las muestras de pacientes diluidas
en los pocillos correspondientes, como se
describe en la hoja de trabajo. Ponga 50
ml de disolvente de muestras en el pocillo
que no lleva reactivo.
12.
INCUBACIÓN DE LAS TIRAS (exactamente 5
minutos a temperatura ambiente, es decir,
entre 19 y 23 °C)
Incube a temperatura ambiente durante 5 minutos exactamente. Durante la
incubación, la temperatura no podrá sufrir
cambios bruscos.
6.
INCUBACIÓN DE LAS TIRAS (30 minutos a
temperatura ambiente, es decir, entre 19 y
23 °C)
Incube a temperatura ambiente durante
30 minutos. Durante la incubación, la temperatura no podrá sufrir cambios bruscos.
Si se desea se pueden tapar las tiras con
cinta transparente o con toallas de papel,
para protegerlas del polvo u otros cuerpos
extraños.
13.
DISPENSACIÓN DEL REACTIVO DE PARADA
Cuando el primer pocillo haya sido
incubado durante cinco minutos exactos,
añada 50 µl de reactivo de parada a cada
pocillo, en el mismo orden y a la misma
velocidad en que se añadió la solución de
sustrato a los pocillos. Tras añadir el reactivo
de parada, la solución de sustrato azul se
volverá amarilla y la incolora permanecerá
tal cual.
7.
LAVADO DE LAS TIRAS (Véanse las notas 5 y
6 del procedimiento general)
Lave los pocillos 3 a 5 veces en la solución
de tampón de lavado PBS-Tween. Para el
lavado manual, aspire el contenido de los
pocillos y a continuación lave cada uno
con solución tampón de lavado. Evite la
contaminación cruzada de los pocillos,
sobre todo en el lavado siguiente a la
aspiración. Elimine todo el tampón de los
pocillos dándoles la vuelta; los residuos
de tampón de lavado se quitan con un
movimiento brusco de la muñeca. Repita
estos pasos hasta un total de 3 a 5 lavados.
A continuación, se pasará con fuerza una
14.
INTERPRETACIÓN DE LA ABSORBANCIA DE
LOS POCILLOS.
En los treinta minutos siguientes a la adición
del reactivo de parada, los pocillos deben
ser medidos en un espectrofotómetro de
lectura de placas. Los pocillos se medirán
a 450 nm, frente al pocillo sin reactivo. Si
se dispone de un espectrofotómetro con
doble longitud de onda, la del filtro de
referencia debe ser de 600-650 nm.
ASISTENCIA TÉCNICA: 916-363-2649
o correo electrónico: techservice@immunocon
cepts.com
21
RELISA® ENA EINZEL-SCREENING
FÜR ANTIKÖRPER GEGEN EXTRAHIERBARE
NUKLEÄRE ANTIGENE
NUR ZUR IN VITRO-DIAGNOSTIK
ZUSAMMENFASSENDE ERKLÄRUNG DES TESTS
Verwendungszweck: Dies ist ein Enzymimmuntest (EIA)
für den Nachweis von Antikörpern gegen extrahierbare
nukleäre Antigene vom Typ Sm (Smith), RNP, SSA/Ro,
SSB/La, Scl-70 und Jo-1 in Humanserum. Der Test dient
als Hilfestellung bei der Diagnose von Autoimmunerkrankungen.
ENA-Antikörper (extrahierbare nukleäre Antigene)
werden mit mehreren Autoimmunsyndromen in Verbindung gebracht und haben offenbar einen diagnostischen und/oder prognostischen Wert bei systemischer
Sklerose (1, 2), gemischter Bindegewebskrankheit (3-5),
Sjögren-Syndrom (6, 7), Polymyositis (8), Dermatomyositis (9), systemischem Lupus erythematosus (5) und
rheumatoider Arthritis (10). Der antinukleäre Antikörpertest (ANA) wird als Screening-Test für diese Antikörper
verwendet, gibt jedoch keinen Hinweis auf die Spezifität
der Antikörper, und Antikörper gegen einige ENA
weisen keine positiven ANA-Testwerte auf (11, 12). Es
wird deshalb dringend ein zweiter Bestätigungstest für
Antikörper gegen ENA empfohlen (13).
Antigen-Substrat dienen. Verdünnte Patientenproben
werden in die Vertiefungen gegeben und inkubiert, so
dass in der Probe vorhandene spezifische Antikörper mit
dem gebundenen Antigen in der Festphase reagieren
können. Nicht gebundene Antikörper und andere Serumproteine werden abgewaschen und anschließend
werden die Vertiefungen mit antihumanen Antikörpern
(Ziege) inkubiert, die mit Meerrettich-Peroxidase markiert sind. Das im Testsystem enthaltene an MeerrettichPeroxidase konjugierte Antikörper-Präparat ist spezifisch
für schwere und leichte Ketten von humanem IgG.
Nach der Inkubation mit dem Meerrettich-PeroxidaseKonjugat wird in positiven Proben ein stabiler dreiteiliger
Komplex gebildet. Dieser Komplex besteht aus einem
an Meerrettich-Peroxidase konjugierten anti-HumanAntikörper, gebunden an einen Human-Anti-ENA-Antikörper, der wiederum an das auf der Plastikoberfläche
stabilisierte Antigen gebunden ist.
Nach einem weiteren Waschvorgang wird dieser
Komplex durch Addition einer Lösung aus Tetramethylbenzidin (TMB) und H2O2 als chromogenes Substrat
nachgewiesen. Der Grad der Farbentwicklung in
den Vertiefungen ist proportional zur Konzentration
von anti-ENA-Antikörpern in den Serumproben. Jede
Vertiefung wird in einem Spektrophotometer bei 450 nm
ausgewertet.
Das Sm (Smith) Antigen wurde 1966 von Tan und Kunkel
als kochsalzlösliches, nicht-histonisches Glykoprotein
identifiziert, das für seine Antigenizität nicht DNA- oder
RNA-abhängig ist (14). Antikörper gegen Sm gelten
wegen ihrer ausgeprägten Spezifität für systemischen
Lupus erythematosus (SLE) als spezifischer serologischer
Marker. Diese Antikörper treten bei bis zu 30 % der SLEPatienten auf und werden mit aktiver Nierenkrankheit
und Zerebritis (15-17) in Verbindung gebracht.
SYSTEMKOMPONENTEN (IM LIEFERUMFANG ENTHALTEN)
Antikörper gegen Sm werden häufig zusammen
mit U1-RNP-Antikörpern im Serum von SLE-Patienten
nachgewiesen (18, 19). Anders als Antikörper gegen
Sm sind Antikörper gegen RNP nicht als spezifische
serologische Marker anzusehen, da sie bei Patienten
mit den verschiedensten rheumatischen Erkrankungen,
einschließlich SLE, Sklerodermie, Sjögren-Syndrom und
rheumatoider Arthritis, auftreten. Hochtitrierte RNPAntikörper allein werden jedoch überwiegend mit gemischter Bindegewebskrankheit (MCTD) in Verbindung
gebracht. Bei Patienten mit MCTD tritt typischerweise
eine Kombination der klinischen Merkmale auf, wie sie
für SLE, Sklerodermie und Polymyositis charakteristisch
sind. Diese Patienten zeigen häufig auch ein gutes
Ansprechen auf die Behandlung mit Kortikosteroiden
und im Vergleich zu SLE-Patienten eine geringere Häufigkeit von Nierenerkrankungen (20, 21).
REAKTIVE REAGENZIEN
Aufbewahrung: Sämtliche Komponenten sollten bei 2-10
°C im Kühlschrank aufbewahrt werden. Nicht einfrieren.
Stabilität: Alle Komponenten sind bis mindestens
12 Monate nach Herstellungsdatum stabil. Keine
Komponenten nach Überschreiten des Verfallsdatums
verwenden.
Mit extrahierbarem nukleärem Antigen beschichtete
Mikrotiterplattenstreifen: Katalognummer 7008-10. Streifen mit acht Vertiefungen, mit einer Mischung aus sechs
stabilisierten affinitätsbereinigten extrahierbaren nukleären Antigenen beschichtet (Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La,
Scl-70 und Jo-1). Diese Streifen sind braun farbcodiert.
Jeder Streifen ist einzeln in Folie verpackt.
Probenverdünner: Katalognummer 7100 (100 ml). Spezieller gepufferter Probenverdünner zur Verdünnung der
Patientenproben.
SSA und SSB wurden ursprünglich als nukleäre RNAProteinantigene bei Patienten mit Sjögren-Syndrom
beschrieben (6,7). Ro und La wurden als zytoplasmische
RNA-Proteinantigene bei Patienten mit SLE beschrieben
(22, 23). Inzwischen wird allgemein akzeptiert, dass
SSA und Ro analog sind, dass SSB und La analog sind,
und dass diese Antigene sowohl im Nukleus als auch
im Zytoplasma vorkommen. Antikörper gegen SSA(Ro)
allein oder SSA(Ro) und SSB/La treten bei bis zu 62 %
der Patienten mit subakutem kutanem Lupus auf (24)
sowie bei 85 % der Patienten mit Sjögren-Syndrom, die
eine Vaskulitis entwickeln (25). Antikörper gegen SSA/Ro
allein treten bei Patienten mit homozygotem Defekt der
C2-Komplementärfraktion auf (26) sowie bei Patienten
mit primärer biliärer Leberzirrhose, die Sjögren-Syndrom
(27) entwickeln, und bei bis zu zwei Dritteln der Patienten mit „ANA-negativem SLE“ (28).
Das Scl-70 Antigen wurde als zelluläres Enzym, DNA
Topoisomerase I, identifiziert (29). Über Antikörper gegen
Scl-70 in bis zu 56 % der Patienten mit progressiver
systemischer Sklerose, insbesondere in der Untergruppe
von Patienten mit diffuser Sklerodermie, wurde berichtet
(30). Diese Autoantikörper gelten als Marker für PSS, da
sie in anderen Bindegewebskrankheiten nicht festzustellen sind. Antikörper gegen Jo-1, bei dem es sich um das
Zellular-Enzym Histidyl tRNA Synthetase handelt, sind in
25-30 % der Patienten mit Polymyositis oder Dermatomyositis zu finden, jedoch nicht in anderen Myopathien
(11, 31). Es hat sich gezeigt, dass Anti Jo-1 Antikörper in
engem Zusammenhang mit der interstitiellen Lungenkrankheit stehen, die zusammen mit Myositis (31) auftritt.
TESTPRINZIP
Dieser Test ist ein qualitativer, indirekter Enzym-Immuntest. Die Oberfläche der Mikrotiterplatten wurde mit
stabilisierten Präparaten affinitätsbereinigter extrahierbarer nukleärer Antigene beschichtet, die im System als
22
Enzym-Antikörper-Reagens – spezifisch für schwere
und leichte Ketten aus Human-IgG: Katalognummer
7009-10 (6 ml). Ziegen-Anti-Human-IgG (H&L), an Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiert. Gebrauchsfertiges
Reagens.
Substratlösung: Katalognummer 7035 (6 ml). HRPspezifische Enzymsubstratlösung, enthält stabilisiertes
3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin (TMB) und Wasserstoffperoxid (H2O2). Gebrauchsfertiges Reagens.
Stopplösung: Katalognummer 7033 (6 ml). Spezielle
Stopplösung für EIA-Testsysteme von Immuno Concepts.
Gebrauchsfertiges Reagens. ACHTUNG: Korrosiv. Dieses
Reagens enthält Chlorwasserstoff- und Schwefelsäure
(jeweils weniger als 3 % Volumenanteil) und sollte mit
Vorsicht gehandhabt werden. Für Kinder unzugänglich aufbewahren. Bei Kontakt mit Augen, sofort und
gründlich mit Wasser ausspülen und einen Arzt konsultieren. Dieses Reagens niemals mit Wasser verdünnen.
ENA Kalibratorserum: Katalognummer 7026-10 (1 ml).
Menschliches Serum, das Antikörper gegen ein oder
mehrere extrahierbare nukleäre Antigene vom Typ Sm,
RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 und/oder Jo-1 enthält. Der
Testwert für dieses Serum ist auf dem Flaschenetikett
eingetragen. Das Serum ist gebrauchsfertig verdünnt.
Dieses Reagens enthält 0,1 % Natriumazid als Konservierungsmittel.
ENA-Positivkontrolle: Katalognummer 7021-10 (1 ml).
Human-Positivkontrollserum, das Antikörper gegen ein
oder mehrere extrahierbare nukleäre Antigene vom Typ
Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 und/oder Jo-1 enthält.
Das Serum ist gebrauchsfertig verdünnt. Dieses Reagens
enthält 0,1 % Natriumazid als Konservierungsmittel.
ENA-Negativkontrolle: Katalognummer 7031 (1 ml).
Human-Negativkontrollserum, das keine Antikörper
gegen Antigene vom Typ Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La,
Scl-70 und Jo-1 enthält. Das Serum ist gebrauchsfertig
verdünnt. Dieses Reagens enthält 0,1 % Natriumazid als
Konservierungsmittel.
häuten vermeiden. Bei Kontakt mit viel Wasser und
desinfizierender Seife waschen.
8. In Bereichen, in denen mit Patientenproben oder
Kitreagenzien gearbeitet wird, nicht rauchen, essen
oder trinken.
9. Verspritzen von Reagenzien und Erzeugung von
Aerosolen vermeiden.
10. Die angegebenen Inkubationszeiten und Temperaturwerte genau einhalten, andernfalls könnten die
Ergebnisse verfälscht werden.
11. Eine Kreuzkontamination der Reagenzien oder
Proben kann ebenfalls zu falschen Ergebnissen
führen. Während der Tests müssen die Proben in
den Vertiefungen der Mikrotiterplatten verbleiben.
12. Wiederverwendbare Glasartikel müssen vor
Gebrauch gewaschen und gründlich ausgespült
werden, um sämtliche Waschmittelrückstände zu
entfernen. Die Glasartikel müssen vor Gebrauch
sauber und trocken sein.
13. Vor der Testdurchführung müssen alle Reagenzien,
Mikrotiterstreifen und Proben auf Zimmertemperatur
(19-23 °C) gebracht werden.
14. Beim Arbeiten mit Proben und Reagenzien sind
grundsätzlich Einmal-Latexhandschuhe zu tragen.
Danach gründlich Hände waschen.
15. Eine mikrobielle Kontamination der Reagenzien
oder Proben kann das Ergebnis verfälschen.
16. Das Stoppreagens ist korrosiv und kann Verbrennungen verursachen. Dieses Reagens enthält Chlorwasserstoff- und Schwefelsäure (jeweils weniger als 3 %
Volumenanteil) und sollte mit Vorsicht gehandhabt
werden. Für Kinder unzugänglich aufbewahren. Bei
Kontakt mit Augen, sofort und gründlich mit Wasser
ausspülen und einen Arzt konsultieren. Dieses Reagens niemals mit Wasser verdünnen.
Optionale unverdünnte Getestete ENA-Positivkontrolle:
Katalognummer 7022-10 (0,25 ML). Human Positivcontrollserum, das Antikörper gegen ein oder mehrere
extrahierbare nukleäre Antigene vom typ Sm, RNP,
SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 und/oder Jo-1 enthält. Die Positivkontrolle ist als unverdünntes Serum zu verweden. Der
Test wert für dieses Serum ist auf dem Flaschenetikett
einge-tragen. Dieses Reagens enthält 0,1 % Natriumazid
als Konservierungsmittel.
NICHT-REAKTIVE KOMPONENTEN
Streifenhalter
Waschpufferlösung:
PBS-Puffer: Katalognummer 1011. Phosphat-gepuffertes
Kochsalzpulver (0,01 M, pH 7,4 ± 0,2). Jeder Beutelinhalt
reicht für 1 Liter gebrauchsfertigen Puffer. Zwei Beutel
je 96er-Mikrotiterplatte sind im Lieferumfang des Testkits
enthalten.
Waschpufferkonzentrat: Katalognummer 1031 (10
ml). 5 % Tween 20-Lösung zur Verwendung mit dem
Waschpuffer. (Zwei Fläschchen Pufferkonzentrat je
96er-Mikrotiterplatte sind im Lieferumfang des Testkits
enthalten.)
Herstellung: Inhalt eines Beutels mit Pufferpulver in
einem Liter deionisiertem oder destilliertem Wasser
auflösen. Den Inhalt einer ganzen Flasche Waschpufferkonzentrat in den aufgelösten PBS-Puffer hinzugeben.
Gut durchmischen und bei 2-10 °C bis zu vier Wochen
aufbewahren, oder bis Anzeichen von Kontamination
oder andere sichtbare Veränderungen zu erkennen
sind. Waschpufferlösung muss vor Gebrauch auf Raumtemperatur (19-23 °C) gebracht werden.
ZUSÄTZLICH ERFORDERLICHE MATERIALIEN (NICHT
IM LIEFERUMFANG ENTHALTEN)
Präzisionspipetten für Volumina von 25-1000 µl.
Spritzflasche für die Zugabe von Waschpufferlösung
in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten, oder
(halb)automatisches Waschsystem für Mikrotiterplatten.
1-Liter-Behälter für die PBS-Waschpufferlösung.
Deionisiertes oder destilliertes Wasser.
Spektrophotometer für Mikrotiterplatten für Absorptionsmessungen bei 450 nm.
Teströhrchen zur Herstellung von Serumverdünnungen.
Saugpapier oder Papierhandtücher.
Mehrkanal-Pipette für bis zu 8 Vertiefungen.
Einmal-Latexhandschuhe.
Laborstoppuhr.
SICHERHEITSHINWEISE
1. Sämtliche für dieses Produkt verwendeten Materialien menschlichen Ursprungs wurden nach von
der FDA anerkannten Methoden negativ (nicht wiederholt reaktiv) auf Antikörper gegen HIV-1, HIV-2,
Hepatitis-C (HCV) und Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAG) getestet. Keine Testmethode kann
jedoch mit absoluter Sicherheit nachweisen, dass
keine HIV-1, HIV-2, Hepatitis-C oder Hepatitis-B-Viren
oder andere infektiöse Agenten vorhanden sind.
Daher sollten alle Kitbestandteile wie potenziell
infektiöse Materialien gehandhabt werden.
2. Alle Kontrollseren, Kalibratorseren und Patientenproben sollten nach den Anforderungen für Biosafety
Level 2 behandelt werden, wie für potentiell infektiöses humanes Serum und andere Blutbestandteile
empfohlen in: Centers for Disease Control / National
Institutes of Health Manual: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, Ausgabe 1984.
3. Die Kontroll- und Kalibratorseren enthalten als Konservierungsmittel Natriumazid (0,1 %). Natriumazid
kann mit Blei- oder Kupferinstallationen reagieren
und hochexplosive Metallazide bilden. Beim Entsorgen der Reagenzien mit reichlich Leitungswasser
nachspülen, damit im Abfluss keine Rückstände
verbleiben. Natriumazid ist giftig und kann bei
Verschlucken toxisch wirken.
4. Ein Verdünnen der Bestandteile oder eine Zugabe
von nicht zum Kit gehörenden Reagenzien kann die
Qualität der Ergebnisse beeinträchtigen.
5. Die für RELISA® ENA Screening-Tests vorgesehenen
Serumproben nicht durch Hitzeeinwirkung deaktivieren. Inaktivierung durch Hitze kann erhöhte Werte
zur Folge haben.
6. Der Kit ist ausschließlich zur In vitro-Diagnostik
bestimmt.
7. Niemals mit dem Mund pipettieren und Kontakt der
Reagenzien und Proben mit Haut und Schleim-
PROBENGEWINNUNG
Probenentnahme: Nach Möglichkeit sollten Serumproben hergestellt werden. Dazu durch Venenpunktion in
ein steriles Vakuumröhrchen oder durch ein anderes
geeignetes Blutentnahmesystem aseptisch ca. 5 ml
Vollblut entnehmen. Das Blut bei Zimmertemperatur (1923 °C) gerinnen lassen. Danach muss das Serum so bald
wie möglich durch Zentrifugation abgetrennt werden,
um Hämolyse zu vermeiden.
ACHTUNG: Die für RELISA® ENA Screening-Tests vorgesehenen Serumproben nicht durch Hitzeeinwirkung
deaktivieren. Inaktivierung durch Hitze kann erhöhte
Werte zur Folge haben.
Störsubstanzen: Stark hämolytische, lipämische oder
durch Mikrobenwachstum verunreinigte Seren sowie
Seren von Ikteruspatienten dürfen nicht verwendet
werden, weil diese Zustände zu falschen Ergebnissen
führen können. Proben mit sichtbaren Verunreinigungen
müssen vor Verwendung zentrifugiert werden.
Aufbewahrung: Serumproben können bei einer Temperatur von 2-10 °C maximal eine Woche lang aufbewahrt
werden. Sollen die Proben länger aufbewahrt werden,
müssen sie bei mindestens –20 °C eingefroren werden.
Seren dürfen nicht in einem Kühlschrank oder Gefrierschrank mit Abtauautomatik gelagert werden.
ACHTUNG: Wiederholtes Einfrieren / Auftauen von
Patientenproben ist zu vermeiden. Andernfalls können falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse
auftreten.
ALLGEMEINE HINWEISE ZUM VERFAHREN
1. Vor Verwendung müssen unbedingt alle Serumproben und Kitbestandteile auf Zimmertemperatur
(19-23 °C) gebracht werden. Ein Liter Waschpuffer
benötigt mehrere Stunden, um nach Entnahme aus
dem Kühlschrank auf 20 °C zu kommen. Bei Inkubationstemperaturen außerhalb des hier angegebenen Bereichs können die Ergebnisse verfälscht
werden. Unverbrauchte Proben und Kitmaterialien
müssen nach Verwendung wieder gekühlt werden.
2. Reagenzien vor dem Test durch vorsichtiges Umdrehen der Flasche gut durchmischen. Auf keinen Fall
schütteln oder auf einen Mischer stellen. Schaumbildung vermeiden.
3. Beim Herstellen der Probenverdünnungen müssen
die Pipettenspitzen vor der Zugabe von Serum in
den Probenverdünner abgewischt werden. Außen
an der Pipette anhaftendes überschüssiges Probenmaterial kann die Ergebnisse beeinträchtigen.
4. Das Arbeiten mit einer Mehrkanalpipette wird empfohlen, weil dadurch die Zugabe, die Inkubationszeit und die Reaktionszeit gleichmäßiger ausfallen.
5. Sorgfältiges Waschen der Vertiefungen ist von entscheidender Bedeutung. Unzureichendes Waschen
23
der Vertiefungen führt zu hohen Hintergrundwerten
und unter Umständen zu falsch-positiven Ergebnissen. Beim Auswaschen von Hand den Inhalt der
Vertiefungen aspirieren, anschließend die Vertiefungen mit Waschpuffer füllen. Kreuzkontamination
zwischen den Vertiefungen vermeiden, vor allem
beim ersten Waschgang nach dem Absaugen. Die
Platten umdrehen und in der Luft kräftig ausschlagen, um alle Waschlösung aus den Vertiefungen
zu entfernen. Der Waschvorgang mit Füllen und
Entfernen muss drei bis fünf Mal wiederholt werden.
Danach
die Platten
auf ��
einem Papierhandtuch
��
��
oder vergleichbarem Material ausklopfen, so dass
� � ��
��
� wird. Die
der�Waschpuffer
vollständig
entfernt
��
�� Waschgeräts
Verwendung
eines automatischen
für ��
Mikrotiterplatten
empfohlen, weil dies zu
� �� wird
��
gleichmäßigeren Waschergebnissen führt.
HINWEIS: Auf Grund der verschiedenen Waschtechniken und Automatiksysteme muss die Anzahl der
Waschgänge evtl. angepasst werden, um optimale
Ergebnisse zu erzielen. Jedes Labor muss für sein
Waschsystem die Anzahl von Waschgängen mit der
höchsten Effizienz selbst bestimmen.
6. Unzureichende Entfernung von Waschpufferrückständen kann zu inkonsistenter Farbentwicklung
führen. Die Mikrotiterstreifen sollten in der Luft kräftig
ausgeschlagen
und auf
Papierhandtuch ausgelegt
��
��
werden, um Waschpufferrückstände zu minimieren.
�
�
�
��
��
��
�
7. Die bei den Inkubationsschritten
angegebene
�
�
�
��
��
��
��
�
Zeitdauer muss unbedingt eingehalten werden.
Alle
Serumproben
Versuchsbeginn
�� müssen
��vor
��
�� verdünnt
und möglichst schnell hintereinander (in maximal fünf Minuten) in die Vertiefungen dispensiert
werden. Die Testserien dürfen nur so groß sein, dass
diese Zeit bequem eingehalten werden kann. Die
Verwendung einer mehrkanaligen Pipette zur leichteren Handhabung von Proben und Reagenzien ist
zu empfehlen.
8. Mit Ausnahme des letzten Inkubationsschritts (Substratlösung) beginnt jede Inkubationsperiode nach
beendigter Proben- oder Reagenzienzugabe. Die
��
Inkubation mit Substratlösung muss für jede Verti�� genau
��
��
efung
fünf Minuten
dauern.�Daher müssen
Proben
Reagenzien
in derselben
�� und
��
��
� Reihenfolge
und im selben zeitlichen Abstand zugegeben
��
werden.
��
��
��
��
��
��
�
��
�
��
�
��
�
��
�
��
�
��
INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
BERECHNUNGEN
1. Den Absorptionswert der Leervertiefung von den
Absorptionswerten des Kalibrators, der Kontrollseren
und Patientenproben abziehen. Den mittleren Absorptionswert von Doppelbestimmungen ermitteln.
2. Die spezifische Antikörperkonzentration des Kalibratorserums (auf dem Etikett vermerkt) wird durch
den mittleren Absorptionswert der Kalibratorvertiefungen dividiert, um den Konvertierungsfaktor zu
��
ermitteln.
� � �� jeder
��
�
3. Die�Absorptionswerte
Probe werden
mit dem
Konvertierungsfaktor
um� die spezifische
�� multipliziert,
��
Antikörperkonzentration zu ermitteln.
��
4. Die Formel für diese Berechnung lässt sich vereinfacht wie folgt ausdrücken:
��
��
��
��
�
�
��
��
�
�
��
��
��
��
��
��
��
*Wenn Kalibratoren und Proben doppelt ermittelt
werden, ist die durchschnittliche Absorption beider
Vertiefungen zu verwenden.
��
��
�
��
QUALITÄTSSICHERUNG
�
��
1. Der mittlere Absorptionswert der Kalibratorvertiefungen��muss
bei mindestens��
0,400 liegen. Absorption� ��
swerte kleiner als 0,400 lassen auf unzureichende
��
Farbentwicklung schließen und sollten nicht gewer� � ��
� Farbentwicklung ist in
tet �
werden.
Unzureichende
der��
Regel
auf die��
Verwendung kalter Reagenzien
� ��
oder falsches Timing bei einem oder mehreren
Schritten des Assays zurückzuführen. Reagenzien
auf Zimmertemperatur (19-23 °C) erwärmen lassen
und den Lauf wiederholen, wobei besonderes
24
Augenmerk auf den zeitlichen Ablauf der einzelnen
Schritte zu legen ist.
2. Die leere Kontrollvertiefung muss einen Absorptionswert von unter 0,150 haben. Höhere
Absorptionsleerwerte als 0,150 sind als Hinweis auf
unzureichendes Waschen oder Kontamination der
Reagenzien zu interpretieren.
3. Proben mit höheren spezifischen Antikörperwerten als die Obergrenze des Kalibrators können
mit Probenverdünner weiter verdünnt und neu
bestimmt werden, um einen genaueren Schätzwert
für den spezifischen Antikörperwert zu erhalten. Um
für diese Proben einen endgültigen spezifischen
Antikörperwert zu ermitteln, den Antikörperwert für
die Absorption der verdünnten Probe (siehe oben)
bestimmen und anschließend mit dem Verdünnungsfaktor multiplizieren. Wenn beispielsweise
eine Probe bei 1:40 eine höhere Absorptionsrate
als der Kalibrator aufweist, kann die Probe auf 1:
80 verdünnt werden, indem 100 µl der 1:40-Verdünnung mit 100 µl Probenverdünner verdünnt werden.
Anschließend wird��
die 1:80-Verdünnung
�� getestet
��
und das Ergebnis mit zwei (dem Verdünnungsfaktor)
��
multipliziert, um den endgültigen Antikörperwert zu
��
ermitteln.
4. Der Konvertierungsfaktor muss für jeden Durchlauf
separat berechnet werden. Wenn ein Konvertierungsfaktor aus einem anderen Durchlauf verwendet wird, werden die Ergebnisse unbrauchbar.
5. Jedes Labor muss seine eigenen (normalen) Referenzwerte auf der Basis der Patientenpopulation und
anderer lokaler Faktoren festlegen.
6. Human-Positivkontrollserum,
das Antikörper
��
��gegen
� ��
ein oder mehrere extrahierbare nukleäre Antigene
��
��
��
vom Typ Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 und/oder
��
Jo-1 enthält. Dies��
ist eine qualitative
Kontrolle, die
einen Wert von mehr als 20 ENA-Einheiten liefern
sollte.
7. Das Negativkontrollserum ist ein Pool von Humanserum, das keine Antikörper gegen eines der sechs
Autoantigene in diesem Test enthält. Dies ist eine
qualitative Kontrolle, die kleinere Werte als 20 ENAEinheiten ergeben sollte.
8. Das unverdünnte getestete Positivkontrollserum
ist ein menschliches Serum, das Antikörper gegen
ein oder mehrere extrahierbare nukleäre Antigene
vom Typ Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 und/oder
Jo-1 enthält. Der Testwert für dieses Serum ist auf
dem Flaschenetikett in ENA-Einheiten eingetragen.
Dieser Bereich wurde so festgelegt, dass 99 % der
innerhalb der statistisch normalen Variation zu
erwartenden Werte abgedeckt werden. Gelegentliche kleinere Abweichungen von diesen Bereichen
sind nicht ungewöhnlich. Jedes Labor muss eigene
Akzeptanzkriterien auf Basis der Erfahrungen mit
��
diesem Test festlegen.
��
��
9. Wenn der Kontrollwert
außerhalb
des��
zulässigen Be��
��und
��
reichs liegt, ist der
Test ungültig
muss wiederholt
werden.
INTERPRETATION DER PATIENTENERGEBNISSE
1. Dies ist ein qualitatives Assay. Die Anzahl der
nachgewiesenen Antikörper besitzt keinerlei
bekannte klinische Relevanz und die mit diesem
Assay erzielten Einheitsgrößen dienen lediglich
der Aufteilung der Patienten in die folgenden drei
Hauptgruppen. Die Patientenprobevertiefungen,
deren errechnete Werte höher als oder gleich 25
ENA-Einheiten sind, sind als positiv zu werten und
sollten auf ihre ENA-Spezifität getestet werden. Die
Patientenprobevertiefungen, deren errechnete
Werte niedriger als 20 ENA-Einheiten sind, sind als
��
� ��
negativ zu werten. Werte
zwischen��
20 und 25 Einheiten liegen im positiven
Grenzbereich
und sollten
��
��
��
wiederholt oder einzeln auf ihre��
ENA-Spezifität
��
getestet werden. Jedes Labor muss seinen eigenen
Referenzbereich und eigene Cutoff-Werte auf Basis
der getesteten Patientenpopulation ermitteln. Die
Einheitswerte sind abhängig von Patientenfaktoren,
mechanischen Gegebenheiten (wie Präzision der
Pipetten), und Testumständen (wie Temperatur und
zeitliche Abfolge der Schritte.)
2. Da der RELISA® ENA Einzel-Screening-Test verschiedene Antigene enthält, stellen die Ergebnisse
eine Zusammenfassung der Antikörperreaktionen
��
��
� ��
auf jedes der sechs
Antigene dar.
Wenn verschiedene Autoantikörper in niedriger Zahl��
vorhanden
sind, kann der RELISA® ENA Einzel-Screening-Test
��
zu einem positiven Ergebnis führen, die Spezifität
einzelner Autoantikörper kann jedoch unter dem
jeweiligen Cutoff-Wert liegen.
AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE
Das Testergebnis ist als positiv oder negativ für
��
��
� ��
��
Antikörper��
gegen extrahierbare
nukleäre��
Antigene
REFERENZBEREICH
anzugeben. Die Zahl der Antikörper hat keine bekannte
��
klinische Bedeutung.
Der Referenzbereich wurde durch Tests an Seren von
��
��
�� Blutspendern, 205 Frauen und 198
��
403
gesunden
EINSCHRÄNKUNGEN
DES
TESTS ��
Männer, ermittelt. Bei keinem der Spender war eine
��
��
��
rheumatische Erkrankung bekannt. Auf Basis dieser
��
�� Cutoff-Werte,
�� weniger
�
��
1. Es ist nicht
möglich, lediglich
auf��
der Basis des��
Daten��
wurden die normalen
Nachweises von Antikörpern
gegen extrahierbare
als 20 ENA-Einheiten,
berechnet. Die gute Laborpraxis
��
��
��
nukleäre Antigene eine Diagnose zu stellen. Der
schreibt vor, dass jedes Labor seine eigenen normalen
��
�� mit
��
��
�� und
Arzt muss��
die Ergebnisse
im Zusammenhang
Wertebereiche
auf ��
Basis der Patientenpopulation
Krankengeschichte und
des Patienten,
anderer lokaler
ermitteln muss.
��Symptomen
��
��
�� Faktoren
��
den Ergebnissen der körperlichen Untersuchung
und anderen diagnostischen Methoden interpretieLEISTUNGSFÄHIGKEIT DES TESTS
ren.��
�� Der RELISA® Einzel-ENA-Screening-Test von Immuno
2. ��
Lediglich
auf Grund��
eines positiven��
Testergebnisses
��
für Antikörper gegen extrahierbare nukleäre AntiConcepts wurde mit dem Immuno Concepts RELISA®
gene sollte keine Behandlung initiiert werden. Für
Multiparameter-ENA-Screening-Test verglichen. Die
��
��
eine Behandlung müssen auch klinische Symptome, studierte Patientenpopulation bestand aus 50 Patient��
��
��
��
andere Laborergebnisse
und der Gesamteinen, welche
die Kriterien
für eine Diagnose von systemdruck des Patienten auf den behandelnden Arzt ��
ischem Lupus��
erythematosus
25 Patienten mit
��
��
�� erfüllten,
��
��
��
herangezogen werden.
Autoimmun-Myositis oder Myositis-überlappenden Syn��
��
��
�
��
��
��
��
��
3. Bei einigen Patienten mit Autoimmunerkrankungen
Patienten mit diagnostizierter
�� dromen, 23
��
��Sklerodermie
können
nicht nachweisbare
oder
oder��
progressiver systemischer Sklerose, 21 Patienten
��
�� unbedeutende
��
��
Mengen
Antikörper gegen extrahierbare
nukleäre
mit Sjögren-Syndrom,
3 Patienten mit�diagnostizierter
��
��
��
�
��
��
��
��
��
Antigene
vorhanden
sein; bei anderen
Patienten
rheumatoider
Arthritis, 18 Patienten mit undifferenzierter
��
mit großen
Mengen��
an Antikörpern
gegen extrahiBindegewebskrankheit
403 Personen,
bei denen
��
��
�� und
��
��
��
�
��
��
erbare
nukleäre
Antigene ��
sind u.U. nur geringfügige
keine bekannte�Autoimmunerkrankung
vorlag. Auf
��
��
oder keine
einer
klinischen Erkrankung
Basis dieses Vergleichs wurden die folgenden Daten
�� Anzeichen
��
festzustellen.
Arzt
muss die Ergebnisse
des��
Tests
aufgestellt.
2.
��
��
��Tabelle
��
��
��Der
��
��
��
�
� ��
auf Antikörper gegen extrahierbare nukleäre An��
�
��
tigene im Zusammenhang mit Krankengeschichte
Ergebnisse im Grenzbereich wurden als positiv gewertet.
und Symptomen des Patienten, den Ergebnissen�� Aus
diesen Daten
sich die folgenden statist��
��ergeben
� ��
der körperlichen Untersuchung und anderen diagischen Werte: relative Sensitivität, 97,9 %; relative Spezi��
��
��
��
��
nostischen Methoden interpretieren.
�� fität, 97,8 % sowie Gesamtübereinstimmung, 97,8 %.
�� Testsystem
4. Die mit��
diesem
nachgewiesenen Antikör��
��
��
��
perwerte lassen nicht unbedingt auf die Schwere
REPRODUZIERBARKEIT
��
oder Dauer
einer
Erkrankung
schließen.
��
��
��
��
��
��
��
� Proben
��
Sechs positive Proben und fünf negative
��
��
��
ZU ERWARTENDE
wurden auf drei verschiedenen Chargennummern von
��WERTE
Antigen-Streifen
��
�
� bei drei verschiedenen
� Gelegenheiten
��
��
Die Häufigkeit von Autoantikörpern gegenüber
getestet. In keinem Fall wies eine negative Probe
��
��
��
� ��
��
��
��
verschiedenen
nukleären
Antigenen variiert
je nach
positive
Ergebnisse auf,
die positiven
Proben ��
lieferten
�
�
��
Patientenpopulation
nach��
der
durchwegs
positive Ergebnisse.
��
��Häufigkeit
��
��
�� deutlich
��
�� sowie
klinischer Rheumaerkrankungen in dieser Population.
��
��
Der Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein von
Antikörpern
und spezifischen
Rheumaerkrankungen
ist ��
��
��
��
��
��
��
��
in der Tabelle 1 zusammengefasst.
��
��
��
��
��
��
��
��
��
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��
��
�
�
TABELLE��
1
��
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�
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TABELLE
2
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��
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��
��
��
�
25
��
�
�
�
�
RELISA® ENA EINZEL-SCREENING
TESTVERFAHREN
Vor der Testdurchführung müssen alle Proben, Reagenzien (auch der Waschpuffer)
und Mikrotiterstreifen auf Zimmertemperatur gebracht werden.
1.
2.
ARBEITSBLATT AUSFÜLLEN
In das mit dem Kit gelieferte Arbeitsblatt
die Lage der Proben in den Mikrotiterplatten eintragen. Der Kalibrator sollte doppelt
getestet werden. Eine Vertiefung dient als
Leerwert. Es wird empfohlen, jede Patientenprobe und jedes Kontrollserum doppelt
zu testen, bis eine für das Labor akzeptable
Bestimmungsgenauigkeit erzielt wird.
vergleichbarem Material ausklopfen, so
dass der Waschpuffer vollständig entfernt
wird.
WASCHPUFFERLÖSUNG VORBEREITEN (PBSTween)
Inhalt eines Beutels mit PBS-Pufferpulver in
einem Liter deionisiertem oder destilliertem
Wasser auflösen. Den Inhalt einer ganzen
Flasche Waschpufferkonzentrat in den aufgelösten PBS-Puffer (1 Liter) hinzugeben und
gut durchmischen. Die Waschpufferlösung
kann verschlossen und gekühlt bei 2-10 °C
bis zu vier Wochen aufbewahrt werden.
3.
PATIENTENPROBEN VERDÜNNEN
Patientenproben durch Zugabe von 25
µl Serum zu 975 µl Probenverdünner 1:
40 verdünnen Wenn die optionale unverdünnte ENA-getestete Positivkontrolle
verwendet wird, genauso wie die Patientenproben verdünnen und gut durchmischen. Kalibrator, Positivkontrolle und
Negativkontrolle sind gebrauchsfertig und
müssen nicht verdünnt werden.
4.
MIKROTITERPLATTEN VORBEREITEN
Benötigte Streifenzahl aus den Beuteln
entnehmen und in den Halter einsetzen. Die
Streifen müssen fest im Halter sitzen. Kräftig
auf beide Enden drücken, so dass die
Streifen fest im Halter einrasten. Wenn nur
einzelne Vertiefungen oder kein voller Streifen verwendet wird, sicherstellen, dass jede
Vertiefung fest sitzt. Streifen, die korrekt im
Halter sitzen, können beim Umdrehen des
Halters nicht herausfallen. Wenn weniger als
acht Vertiefungen für Testzwecke benötigt
werden, können einzelne Vertiefungen
abgetrennt werden. Die unbenutzten Vertiefungen können wieder in den Folienbeutel
verpackt und mit Klebestreifen versiegelt
bis zu 14 Tage im Kühlschrank aufbewahrt
werden.
5.
SERUMVERDÜNNUNGEN AUFTRAGEN
Je 50 µl Kalibrator, Kontrollseren und
verdünnte Patientenproben in die entsprechenden Vertiefungen pipettieren, wie
im Arbeitsblatt eingetragen. 50 µl Probenverdünner in die für den Leerwert vorgesehene Vertiefung pipettieren.
6.
STREIFEN INKUBIEREN (30 Minuten bei Zimmertemperatur, 19-23 °C)
Streifen bei Zimmertemperatur 30 Minuten lang inkubieren. Während dieser
Zeit müssen die Streifen vor Luftzug oder
Temperaturschwankungen geschützt sein.
Gegebenenfalls die Streifen mit Klebeband
oder einem Papierhandtuch abdecken,
um sie vor Staub und anderen Fremdkörpern zu schützen.
7.
STREIFEN WASCHEN (siehe allgemeine Verfahrenshinweise 5 und 6)
Vertiefungen drei bis fünf Mal mit PBSTween-Waschpufferlösung auswaschen.
Beim Auswaschen von Hand den Inhalt
der Vertiefungen aspirieren, anschließend
die Vertiefungen mit Waschpuffer füllen. Kreuzkontamination zwischen den
Vertiefungen vermeiden, vor allem beim
ersten Waschgang nach dem Absaugen.
Die Platten umdrehen und in der Luft kräftig
ausschlagen, um alle Waschlösung aus den
Vertiefungen zu entfernen. Der Waschvorgang mit Füllen und Entfernen muss drei bis
fünf Mal wiederholt werden. Danach die
Platten auf einem Papierhandtuch oder
26
8.
ENZYM-ANTIKÖRPER-REAGENS DISPENSIEREN
50 µl Enzym-Antikörper-Reagens in jede
Vertiefung pipettieren.
9.
STREIFEN INKUBIEREN (30 Minuten bei Zimmertemperatur, 19-23 °C)
Streifen bei Zimmertemperatur 30 Minuten lang inkubieren. Während dieser
Gegebenenfalls die Streifen mit Klebeband
oder einem Papierhandtuch abdecken,
um sie vor Staub und anderen Fremdkörpern zu schützen.
10.
STREIFEN WASCHEN
Vertiefungen drei bis fünf Mal mit PBSTween-Waschpufferlösung auswaschen.
Beim Auswaschen von Hand den Inhalt
der Vertiefungen aspirieren, anschließend
die Vertiefungen mit Waschpuffer füllen. Kreuzkontamination zwischen den
Vertiefungen vermeiden, vor allem beim
ersten Waschgang nach dem Absaugen.
Die Platten umdrehen und in der Luft kräftig
ausschlagen, um alle Waschlösung aus den
Vertiefungen zu entfernen. Der Waschvorgang mit Füllen und Entfernen muss drei bis
fünf Mal wiederholt werden. Danach die
Platten auf einem Papierhandtuch oder
vergleichbarem Material ausklopfen, so
dass der Waschpuffer vollständig entfernt
wird.
11.
SUBSTRATLÖSUNG DISPENSIEREN
Eine Laborstoppuhr verwenden, um
sicherzustellen, dass die Zeiten genau
eingehalten werden. 50 µl Substratlösung in
jede Vertiefung pipettieren. Die Substratlösung muss in gleichmäßigen Zeitabständen
zugegeben werden, damit sichergestellt
ist, dass jede Vertiefung exakt fünf Minuten
inkubiert wird. In Vertiefungen, die positive
Proben enthalten, verfärbt sich die Substratlösung blau. In den anderen Vertiefungen bleibt die Lösung farblos oder wird nur
schwach blau.
12.
STREIFEN INKUBIEREN (genau fünf Minuten
bei Zimmertemperatur, 19-23 °C)
Streifen bei Zimmertemperatur genau fünf
Minuten lang inkubieren. Während dieser
13.
STOPPREAGENS HINZUGEBEN
Nachdem die erste Vertiefung genau
5 Minuten inkubiert wurde, mit dieser
anfangen und im selben Rhythmus wie bei
der Substratlösung in jede Vertiefung 50
µl Stopplösung zugeben. Bei Zugabe der
Stopplösung verfärbt sich blaue Substratlösung gelb, während farblose Lösung farblos
bleibt.
14.
ABSORPTIONSRATE IN DEN VERTIEFUNGEN
MESSEN
Die Absorption der Vertiefungen muss
innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe
des Stoppreagens mit einem Spektrophotometer gemessen werden. Die Vertiefungen werden bei 450 nm um den Leerwert
bereinigt gemessen. Wenn die Möglichkeit
besteht, bei einer zweiten Wellenlänge zu
messen, auch bei 600-650 nm als Referenzwellenlänge messen.
TECHNISCHE UNTERSTÜTZUNG: + 916-363-264
oder via E-Mail:
[email protected]
RELISA® ENA ENKELBRUNNS SCREENING
AV ANTIKROPPAR MOT EXTRAHERBARA NUKLEÄRA
ANTIGENER
FÖR DIAGNOSTISK ANVÄNDNING IN VITRO
SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING AV TESTET
AVSEDD ANVÄNDNING: Detta är enzymimmunanalyssystem(EIA) för detektion av antikroppar mot de extraherbara nukleära antigenerna Sm (Smith), RNP, SSA/Ro,
SSB/La, Scl-70 och Jo-1 i humanserum. Resultaten av
denna analys kan användas som ett hjälpmedel vid
diagnostisering av autoimmuna sjukdomar.
Antikroppar mot extraherbara nukleära antigener (ENA)
har associerats med flera autoimmuna syndrom och
verkar vara av diagnostisk och/eller prognostisk betydelse vid systemisk skleros (1, 2), blandad bindvävssjukdom (3-5), Sjögrens syndrom (6, 7), polymyosit (8),
dermatomyosit (9), systemisk lupus erytematosus (5) och
reumatoid artrit (10). Det antinukleära antikropptestet
(ANA) har använts som ett filter för dessa antikroppar,
men ANA anger inte antikroppens specificitet, och
antikroppar mot vissa ENA ger inte positivt ANA-svar
(11, 12). Därför rekommenderas bestämt denna andra
bekräftande analys av antikroppar mot ENA (13).
Sm-antigenen (Smith) identifierades 1966 av Tan och
Kunkel som ett i saltlösning lösligt icke-histonglykoprotein
som inte är beroende av DNA eller RNA för sin antigena
potential (14). Antikroppar mot Sm-antigenen betraktas
som en specifik serologisk markör på grund av sin höga
specificitet för systemisk lupus erytematosus (SLE). Dessa
antikroppar har noterats hos upp till 30 procent av SLEpatienterna och associerats med aktiv njursjukdom och
cerebrit (15-17).
Antikroppar mot Sm-antigen påträffas ofta tillsammans
med U1-RNP-antikroppar i sera hos patienter med SLE
(18, 19). Till skillnad från antikroppar mot Sm-antigen
betraktas antikroppar mot RNP inte som en specifik
serologisk markör, eftersom de påträffas hos patienter
med olika reumatiska sjukdomar, t ex SLE, sklerodermia, Sjögrens syndrom och reumatoid artrit. Emellertid
associeras höga antikroppnivåer av RNP med ett
överlappande syndrom som kallas blandad bindvävssjukdom (MCTD). Patienter med MCTD karaktäriseras av
en kombination av sjukdomssymptom liknande de som
påträffas vid SLE, sklerodermia och polymyosit. Sådana
patienter reagerar ofta väl på kortikosteroidbehandling
och har färre njursjukdomar jämfört med patienter med
SLE (20, 21).
SSA och SSB beskrevs ursprungligen som nukleära
RNA-proteinantigener hos patienter med Sjögrens
syndrom (6, 7). Ro och La beskrevs som cytoplasmiska
RNA-proteinantigener hos patienter med SLE (22, 23).
Det är i dag vida accepterat att såväl SSA och Ro som
SSB och La är analoga, och att dessa antigener påträffas i både kärnan och cytoplasman. Antikroppar mot
enbart SSA/Ro, eller SSA/Ro och SSB/La påträffas hos 62
procent av patienterna med subakut kutan lupus (24)
och hos 85 procent av patienter med Sjögrens syndrom
som utvecklar vaskulit (25). Antikroppar mot enbart
SSA/Ro påträffas hos patienter som har homozygot brist
på C2-komplementfragment (26), patienter med primär
biliär cirros som utvecklar Sjögrens syndrom (27) samt
hos maximalt två tredjedelar av patienter med ”ANAnegativ SLE” (28).
Scl-70-antigen har identifierats som ett cellformigt
enzym, DNA topoisomeras I (29). Antikroppar mot Scl-70
har rapporterats hos upp till 56 procent av patienter
med progressiv systemisk skleros, framför allt den
delmängd patienter som har diffus sklerodermia (30).
Dessa autoantikroppar betraktas som en markör för
PSS, eftersom de inte påträffas vid andra bindvävssjukdomar. Antikroppar mot Jo-1, vilket är den cellformiga
enzymhistidyl-TRNA-syntestasen, påträffas hos 25-30 procent av patienterna med polymyosit eller dermatomyosit, men inte vid andra myopatier (11, 31). Anti-Jo1-antikroppar har också visat sig vara högt associerade med
interstitiell lungsjukdom i samband med myosit (31).
TESTPRINCIP
Detta test är en kvalitativ indirekt EIA. Mikrobrunnarna
har belagts med en blandning av stabiliserade affinitetsrenade extraherbara nukleära antigener som
fungerar som antigensubstrat i detta system. Utspädda
patientprover placeras i mikrobrunnarna och odlas
så att de specifika antikropparna i provet reagerar
med antigenen i den fasta fasen. Efter tvättning för att
avlägsna obunden antikropp och annat seraprotein
odlas brunnarna med getantihumana antikroppar som
är märkta med pepparrotperoxidas. Det pepparrotper-
oxidaskonjugerade antikroppreparat som ingår i detta
testsystem är specifikt för humana IgG-tunga och -lätta
kedjor.
Om resultaten är positiva efter inkubation med konjugat
av pepparrotperoxidas bildas ett stabilt komplex i tre
delar. Detta komplex består av antihuman antikropp
konjugerad med pepparrotperoxidas bunden till human
anti-ENA-antikropp, vilken i sin tur är bunden till den
antigen som stabiliserats på plastytan.
Efter ännu ett tvättsteg upptäcks detta komplex genom
att tillsättning av en lösning av tetrametylbensidin (TMB)
och H2O2 som kromogent substrat. Graden av färgutveckling i varje brunn står i relation till koncentrationen
av anti-ENA-antikroppar i respektive serumprov. Varje
mikrobrunn avläses med hjälp av en spektrometer vid
450 nm.
SYSTEMKOMPONENTER (MATERIAL SOM MEDFÖLJER)
Förvaring: Alla komponenter skall kylförvaras i 2-10 °C.
Får ej frysas.
Stabilitet: Alla komponenter förblir stabila i minst tolv
månader från tillverkningsdatum. Använd inte komponenterna efter utgångsdatum.
REAKTIVA REAGENSER
Extraherbara nukleära antigenbelagda mikrofördjupningsremsor: Katalognr 7008-10. Åtta brunnas remsor
belagda med en blandning av sex stabiliserade affinitetsrenade extraherbara nukleära antigener (Sm, RNP,
SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 och Jo-1). Dessa remsor har brun
kodfärg. En åttabrunnarsremsa finns i varje försluten
foliepåse.
Provspädningsvätska: Katalognummer 7100 (100 ml).
Patentskyddad buffrad provspädningsvätska som
används för spädning av patientprover.
Enzymantikroppreagens - human IgG tung- och
lättkedjespecifik: Katalognummer 7009-10 (6 ml).
Getantihuman IgG (H och L) konjugerad med pepparrotperoxidas (HRP). Reagensen är bruksfärdig.
Substratlösning: Katalognummer 7035 (6 ml). HRPspecifik enzymsubstratlösning som innehåller stabiliserad
3,3’,5,5’-tetrametylbensidin (TMB) och väteperoxid
(H2O2). Reagensen är bruksfärdig.
Stoppreagens: Katalognummer 7033 (6 ml). Patentskyddad stoppreagens för Immuno Concepts EIA-testsystem. Reagensen är bruksfärdig. VARNING: Frätande.
Denna reagens innehåller hydrokloriska och svavelhaltiga syror (mindre än 3 % vardera, per volym) och
skall hanteras med varsamhet. Förvaras utom räckhåll
för barn. Om du råkar röra vid ögonen i samband med
hantering skall du omedelbart spola med vatten och
kontakta läkare. Tillsätt aldrig vatten i denna reagens.
ENA kalibratorserum: Katalognummer 7026-10 (1 ml).
Humanserum innehållande antikroppar mot en eller
fler< av de extraherbara nukleära antigenerna Sm, RNP,
SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 och/eller Jo-1. Analysvärdet för
detta serum står angivet på ampulletiketten. Detta serum är färdigspätt och kan användas direkt. Reagensen
innehåller 0,1 % natriumazid som konserveringsmedel.
ENA positiv kontroll: Katalognummer 7021-10 (1 ml).
Humant positivt kontrollserum innehållande antikroppar
mot en eller flera av de extraherbara nukleära antigenerna Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 och/eller Jo-1.
Detta serum är färdigspätt och bruksfärdigt. Denna
reagens innehåller 0,1 % natriumazid som konserveringsmedel.
ENA negativ kontroll: Katalognummer 7031 (1 ml).
Humant negativt kontrollserum som inte innehåller
antikroppar mot Sm-, RNP-, SSA/Ro-, SSB/La-, Scl-70eller Jo-1-antigener. Detta serum är färdigspätt och
kan användas direkt. Denna reagens innehåller 0,1 %
natriumazid som konserveringsmedel.
Tillhörande ENA outspädd och analyserad positiv kontroll: Katalognummer 7022-10 (0,25 ml). Humant positivt
kontrollserum innehållande antikroppar mot en eller
flera av de extraherbara nukleära antigenerna Sm, RNP,
SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 och/eller Jo-1. Behandla denna
positiva kontroll som outspätt serum. Analysvärdet för
detta serum anges på ampulletiketten. Denna reagens
innehåller 0,1 % natriumazid som konserveringsmedel.
27
ICKE-REAKTIVA KOMPONENTER
13. Placera alla reagenser, mikrofördjupningar och
prov i rumstemperatur (19-23 °C) före användning.
14. Använd engångshandskar av latex vid hantering
av prover och reagenser, och tvätta händerna
noggrant efteråt.
15. Mikrobiell kontamination av reagenser eller prov
kan ge felaktiga resultat.
16. Stoppreagensen är frätande och kan orsaka brännskador. Denna reagens innehåller hydrokloriska
och svavelhaltiga syror (mindre än 3 % vardera,
per volym) och skall hanteras med varsamhet.
Förvaras utom räckhåll för barn. Om du råkar röra
vid ögonen i samband med hantering skall du
omedelbart spola med vatten och kontakta läkare.
Tillsätt aldrig vatten till denna reagens.
Hållare för mikrofördjupningsremsor
Tvättbuffertlösning:
PBS-buffert: Katalognummer 1011. Fosfatbuffrat saltlösningspulver (0,01 M, pH 7,4 ± 0.2). Varje påse innehåller
tillräckligt med buffertpulver för att ge en liter. (Två
påsar med buffertpulver levereras för varje 96-mikrofördjupningsplatta i kompletta testsatser).
Tvättbuffertkoncentrat: Katalognummer 1031 (10 ml). 5
% Tween-20-lösning att användas i tvättbufferten. (Två
ampuller med buffertkoncentrat levereras för varje 96mikrofördjupningsplatta i kompletta testsatser).
PROVTAGNING
Framställning: Lös upp en påse buffertpulver i en liter
avjoniserat eller destillerat vatten. Tillsätt hela innehållet
i en flaska med tvättbuffertkoncentrat i den upplösta
fosfatbuffrade saltlösningen. Blanda väl och förvara i
kylskåp i 2-10 °C i upp till fyra veckor eller tills det syns
tecken på kontamination eller andra synliga förändringar. Tvättbuffertlösning måste stå i rumstemperatur
(19-23 °C) före användning.
Provtagning: Serum rekommenderas som prov. Cirka 5
ml helblod skall tas aseptiskt genom venpunktion med
hjälp av ett sterilt vakuumblodtagningsrör eller annat
lämpligt blodtagningssystem. Låt blodet koagulera i
rumstemperatur (19-23 °C). Serum skall så snart som
möjligt separeras från koagler genom centrifugering för
att minimera hemolys.
VARNING: Värm inte upp inaktiva serumprover som skall
användas för RELISA® ENA screentester. Värmeinaktivering kan ge förhöjda värden.
ÖVRIGT MATERIAL SOM BEHÖVS (MEDFÖLJER EJ)
Volymetriska precisionspipetter för pipettering av
25-1000 µl volymer
Klämflaska för pipettering av tvättbuffertlösning till
mikrobrunnarna eller till automatiserat eller halvautomatiserat tvättsystem för mikrobrunnar.
Enlitersbehållare för PBS-tvättbuffertlösning
Avjoniserat eller destillerat vatten
Plattläsningsspektrometer som kan avläsa absorption
vid 450 nm
Provrör för beredning av serumspädningar
Läskpapper eller pappershanddukar
Multikanalspipett som kan pipettera maximalt 8
brunnar.
Engångshandskar av latex
Laboratorietidur
Störande substanser: Sera som uppvisar en hög grad av
hemolys, ikterus, lipemi eller mikrobiell tillväxt skall inte
användas, eftersom dessa förhållanden kan leda till avvikande resultat. Prover som innehåller synliga partiklar
bör klargöras genom centrifugering före testning.
Förvaring: Sera kan förvaras i 2-10 °C under högst en
vecka. Om analysen fördröjs ytterligare, skall sera frysas
i –20 °C eller lägre. Sera bör inte förvaras i självavfrostande kylskåp eller fryslagerrum.
VARNING: Upprepad frysning/upptining av patientprover kan ge falskt positiva eller negativa resultat.
FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER
ALLMÄNNA PROCEDURANVISNINGAR
1. Allt material av humant ursprung som använts i
den här produkten har testats med FDA-godkända
metoder och visat sig reagera negativt (inte
upprepat reaktivt) på antikroppar mot humant
immunbristvirus-1 (HIV-1), humant immunbristvirus-2 (HIV-2), hepatit C-virus (HCV) och hepatit B
ytantigen (HBsAg). Ingen testmetod kan emellertid
helt garantera att det inte förekommer HIV-1, HIV-2,
hepatit-C, hepatit-B, eller andra smittämnen. Därför
skall allt satsmaterial hanteras som potentiellt smittsamt.
2. Alla kontrollsera, kalibratorsera och patientprov på
biosäkerhetsnivå 2 skall hanteras enligt rekommendationerna för potentiellt smittsamt humanserum
eller blodprov i Centrum för Sjukdomskontroll/
Nationella hälsoinstitutets manual: Biosäkerhet i
mikrobiologiska och biomedicinska laboratorier,
1984 års upplaga.
3. Natriumazid (0,1 %) används som konserveringsmedel i kontrollen och kalibratorserat. Natriumazid
kan reagera med ledningsrör av bly eller koppar
och bilda högexplosiva metallazider. När reagenser
kasseras, skall man spola med rikliga mängder
kranvatten för att skölja bort eventuella rester i
avloppsledningarna. Natriumazid är ett gift och kan
vara toxiskt vid förtäring.
4. Spädning av komponenter eller byte till andra komponenter än de som medföljer detta system kan ge
motsägande resultat.
5. Värm inte upp inaktiva serumprov som skall användas för RELISA® ENA filtertestning. Värmeinaktivering
kan ge förhöjda värden.
6. Denna sats är avsedd för diagnostisk användning in
vitro.
7. Pipettera aldrig med munnen och undvik att
komma i kontakt med reagenser och prover med
hud eller slemhinnor. Tvätta med bakteriedödande
tvål och rikligt med vatten om sådan kontakt inträffat.
8. Undvik att röka, äta eller dricka i områden där prov
eller satsreagenser hanteras.
9. Undvik alltid stänk och alstring av aerosoler.
10. Andra inkubationstider och temperaturer än de
angivna kan ge felaktiga resultat.
11. Korskontamination mellan reagenser och prover
kan ge felaktiga resultat. Proverna måste hållas
instängda i mikrobrunnarna under hela analysen.
12. Återanvändningsbart glas måste tvättas och
noggrant sköljas från rengöringsmedel innan det
används. Allt glas måste rengöras och torkas före
användning.
1. Det är ytterst viktigt att alla satskomponenter och
serumprov står i rumstemperatur (19-23 °C) före
användning. En hel liter tvättbuffert kan ta flera timmar att värma till 20 °C sedan den har tagits ur kylskåpet. Inkubationstemperaturer som ligger högre
eller lägre än det angivna intervallet kan leda till
inexakta resultat. Sätt tillbaka oanvända prover och
reagenser i kylförvaring efter användning.
2. Blanda reagenserna väl före användning genom
försiktig inversion. Snurra eller rotera inte reagenserna. Undvik skumning.
3. Vid framställning av provspädningar skall pipettspetsarna torkas av innan serum dispenseras i
provspädningen. Överflödigt prov som sitter fast på
utsidan av pipettspetsen påverkar resultaten.
4. Vi rekommenderar att en multikanalspipett används eftersom detta ger mer enhetliga reagensdispenseringar, inkubationstider och reaktionstider.
5. Det är ytterst viktigt att brunnarna tvättas ordentligt.
Otillräckligt tvättade brunnar leder till höga bakgrundsvärden och kan ge falskt positiva resultat.
Manuell tvätt: Aspirera brunnarnas innehåll och fyll
därefter varje brunn med tvättbuffertlösning. Undvik
korskontamination mellan brunnarna, särskilt i första
tvätten efter aspirationen. Töm all tvättlösning från
brunnarna genom att vända dem upp och ned
och skaka därefter resterande tvättbuffert från
brunnarna med en bestämd ”knyck” med handleden. Upprepa fyll- och torkstegen för totalt tre till
fem tvättar. Brunnarna skall sedan knackas bstämt
mot en pappershandduk eller annat absorberande
material för att avlägsna alla spår av resterande
tvättbuffert. Användning av det automatiserade
tvättsystemet för mikrobrunnar ger konsekvent tvätt
av brunnarna, varför detta rekommenderas.
OBSERVERA: Då det finns många olika tvättekniktyper och automatiserade program kan antalet tvättar behöva justeras för optimala resultat.
Varje laboratorium bör fastställa det mest effektiva
antalet tvättar för sitt tvättsystem.
6. Om den resterande tvättbufferten inte avlägsnas
ordentligt kan detta leda till ojämn färgutveckling.
Mikrobrunnsremsorna skall läskas mot absorberande
papper eller handdukar för att minimera mängden
kvarvarande tvättbuffert.
7. Det är av yttersta vikt att alla steg utförs i rätt tid.
Alla serumprover skall spädas innan proceduren
påbörjas och de måste dispenseras till mikrobrunnarna på så kort tid som möjligt (inte mer än
fem minuter). Batchstorlekarna skall väljas så att
provhanteringen går så smidigt som möjligt under
28
denna tidsperiod. Prov- och reagenshanteringen
underlättas med hjälp av en multikanalspipett,
varför detta rekommenderas.
8. Med undantag för den sista inkubationen (substratlösning) börjar varje inkubationstid med att
prover eller reagenser dispenseras. Inkubationen
av substratlösningen måste vara exakt fem minuter
för varje
Alla��
prover och
reagenser skall
�� brunn.
��
��
dispenseras i samma ordningsföljd och med en
��
konstant hastighet.
��
nukleära antigenerna Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl70 och/eller Jo-1. Analysvärdet för denna kontroll
anges på etiketten. Detta intervall upprättades för
att omfatta
99 procent
av förväntade
värden��
på��
��
��
��
� ��
grund av statistisk
normal
variation.��Ibland
kan små
��
��
��
avvikelser förväntas uppstå utanför dessa områden.
��
Varje laboratorium bör upprätta sina egna kriterier
för acceptabla respektive ej acceptabla intervall
grundade på hur förtrogna de är med denna
analys.
9. Om något kontrollvärde ligger utanför området är
analysen ogiltig och måste göras om.
BERÄKNINGAR
1. Subtrahera absorptionsvärdet för reagensämnesbrunnen från de absorptionsvärden som erhållits
i kalibrator-, kontroll- och patientprovbrunnarna.
Beräkna de genomsnittliga absorptionsvärdena för
dubbla brunnar.
2. Dela den specifika antikroppkoncentrationen i
kalibratorserat (står angivet på etiketten) med
medelabsorptionsvärdet för kalibratorbrunnarna för
��
att få fram konverteringsfaktorn.
��
��
� och ett
3. Multiplicera
absorptionsvärdena
för vart
av proven
med denna konverteringsfaktor
för att
��
�
erhålla den specifika antikroppkoncentrationen i
��
enheter.
��
4. Den förenklade formeln för dessa beräkningar kan
uttryckas på följande sätt:
TOLKNING AV TESTRESULTATET
��
��
�
��
�
��
TOLKNING
RESULTAT
�� AV
��
��
��
��
��
��
�
��
�
��
�
��
�
��
1. Detta är en kvalitativ analys. Nivåerna av detekterade antikroppar har ingen känd klinisk betydelse,
och de enhetsvärden som erhållits i denna analys
har endast beräknats för att dela in patienter i
följande tre breda grupper. Patientprovbrunnar
som har beräknade värden större än eller lika
med 25 ENA-enheter betraktas som positiva och
��
skall analyseras med avseende på individuella
��
��
ENA-specificiteter. Patientprovbrunnar
som har
beräknade värden som är mindre
än 20 ENA-enhet��
��
er betraktas som negativa. Värden mellan 20 och
25 enheter betraktas ligga på gränsen till att vara
positiva och skall göras om, eller analyseras med
avseende på individuella ENA-specificiteter. Varje
laboratorium måste fastställa sina egna referensområden och frånslagsvärden baserat på analyserad
patientpopulation . Enhetsvärdena påverkas av patientfaktorer, mekaniska överväganden (t ex pipetteringsprecision och exakthet) och analysvillkor (t ex
temperatur och val av rätt tidpunkt för ett visststeg).
��
��
� ��
2. Eftersom RELISA®
ENA enkelbrunn
screeningtestet
består av en blandning av antigener,��
består resul��
taten av en sammansättning antikroppreaktioner
mot var och en av de sex antigenerna. Om flera
autoantikroppar har låga nivåer, kan RELISA® ENA
enkelbrunn screeningtestet uppvisa ett positivt
resultat, medan enskilda specificiteter kan ligga
under respektive frånslagsvärden.
��
��
��
��
* Använd duplikatbrunnarnas medelabsorption, om
kalibratorer och prover körs i duplikat.
KVALITETSKONTROLL
1. Kalibratorbrunnarnas genomsnittliga absorptionsvärde måste vara minst 0,400. Absorptionsvärden
som är lägre än 0,400 innebär att färgutvecklingen
är otillräcklig och serien ogiltig. Otillräcklig färgutveckling beror vanligtvis på att kalla reagenser har
använts eller att tidpunkten för ett eller flera steg
i analysen varit felaktigt vald. Låt reagenserna
värmas till rumstemperatur (19-23 °C) och upprepa
serien med särskilt beaktande av valet av tidpunkt
för alla steg.
2. Den färglösa kontrollbrunnen skall ha ett absorptionsvärde på mindre än 0,150. Färglösa absorptionsvärden större än 0,150 tyder på otillräcklig
tvättning eller kontamination av reagenser.
3. Prover med specifika antikroppvärden större än
det övre gränsvärdet för kalibratorn kan spädas
ytterligare i provspädningsvätska och analyseras
på nytt för att erhålla en mer exakt beräkning
av det specifika antikroppvärdet. För att erhålla
det slutliga specifika antikroppvärdet för dessa
prover skall enhetsvärdet fastställas för det spädda
provets absorption (se ovan) och multipliceras med
spädningsfaktorn. Om till exempel ett prov vid 1:40
visar en högre absorption än kalibratorn, kan provet
spädas ytterligare till 1:80 genom att blanda 100 µl
av spädningen 1:40 med 100 µl av provspädningsvätskan. Därefter analyseras spädningen 1:80 , och
erhållna resultat multipliceras med två (spädningsfaktorn) för att få fram det slutliga enhetsvärdet.
4. Konverteringsfaktorn måste beräknas för varje serie.
Resultaten blir ogiltiga om en konverteringsfaktor
från en annan serie används.
5. Varje laboratorium bör upprätta och underhålla
sina egna referensintervall (normalvärden) baserat
på patientpopulation och andra lokala faktorer.
6. Det positiva kontrollserat är ett humanserum som
innehåller antikroppar mot en eller flera av de extraherbara nukleära antigenerna Sm, RNP, SSA/Ro,
SSB/La, Scl-70 och/eller Jo-1. Detta är en kvalitativ
kontroll som bör ge ett värde som är större än 20
ENA-enheter.
7. Det negativa kontrollserumet är en samling humanserum som inte innehåller antikroppar mot någon
av de sex autoantigenerna i detta test. Detta är en
kvalitativ kontroll som bör ge värden på mindre än
20 ENA-enheter.
8. Det ospädda och analyserade positiva kontrollhumanserumet är ett humanserum som innehåller
antikroppar mot en eller flera av de extraherbara
RAPPORTERING AV RESULTAET
Resultatet skall rapporteras som positivt eller negativt
för antikroppar mot extraherbara nukleära antigener.
Antikroppnivåerna har ingen känd klinisk signifikans.
TESTETS BEGRÄNSNINGAR
1. Diagnos kan inte ställas enbart på grundval av
antikroppar mot extraherbara nukleära antigener.
Läkaren måste tolka dessa resultat med hänsyn
till patientens tidigare sjukdomar och symptom,
de fysiska upptäckterna och andra diagnostiska
metoder.
2. Behandling bör inte påbörjas enbart på grundval
av ett positivt test för antikroppar mot extraherbara
nukleära antigener. Kliniska indikationer, andra
laboratorieupptäckter och läkarens kliniska intryck
måste beaktas innan behandling påbörjas.
3. Vissa patienter med autoimmuna sjukdomar kan ha
obetydliga nivåer av antikroppar eller nivåer som är
omöjliga att upptäcka medan andra personer kan
ha höga nivåer av antikroppar mot extraherbara
nukleära antigener, men litet eller inget tecken på
klinisk sjukdom. Läkaren måste tolka testresultaten
för antikroppar mot extraherbara nukleära antigener med hänsyn till patientens tidigare sjukdomar
och symptom, de fysiska upptäckterna och andra
diagnostiska metoder.
4. De antikroppnivåer som detekteras med detta
testsystem indikerar inte nödvändigtvis sjukdomens
svårighetsgrad eller varaktighet.
FÖRVÄNTADE VÄRDEN
Förekomsten av autoantikroppar mot olika nukleära
antigener varierar beroende på patientpopulation och
förekomsten av kliniska reumatiska sjukdomar i denna.
Sambandet mellan antikroppar och specifika reumatiska sjukdomar sammanfattas i nedanstående tabell 1.
REFERENSINTERVALL
Referensintervallet upprättades genom analys av sera
från 403 friska blodgivare, 205 kvinnor och 198 män, av
vilka ingen veterligt hade haft någon reumatisk sjukdom
tidigare. Baserat på dessa data upprättades de normala frånslagsvärdena som mindre än 20 ENA-enheter.
God laboratoriepraxis föreskriver att varje laboratorium
måste upprätta sina egna normala spridningsområden
baserade på patientpopulation och andra lokala
faktorer.
29
��
PRESTANDA
��
��
Gränsfallresultaten betraktades som positiva. Dessa
��
��
��
data gav följande
statistik:
relativ sensitivitet 97,9 %, rela-
tiv specificitet 97,8 % och total överensstämmelse 97,8 %
��
��
��
��
Immuno Concepts RELISA® enkelbrunns ENA screen��
��
��
�� med Immuno
��
ingtest jämfördes
Concepts RELISA®
REPRODUCERBARHET
multiparameter
ENA screeningtest.
Den
patientpopu��
��
�
�
��
��
��
lation som studerades bestod av 50 patienter som
Sex positiva prover och fem negativa kördes vid tre
��
��
motsvarade kriterierna för diagnosen systemisk lupus
olika tillfällen på antigenremsor med tre olika lotnum��
�
�
�
��
��
erytematosus,
25 patienter
med autoimmun
mer. Inte
i något fall gav��
ett negativt
prov positiva
��myosit
��
��
��
eller myositöverlappande
syndrom, 23 patienter med
resultat. De positiva proverna gav genomgående
��
��
��
diagnosen sklerodermia eller progressiv
systemisk
positiva resultat. �
��
�
��
��
��
��
��
skleros, 21
patienter med
Sjögrens syndrom, 3��
patienter
med diagnosen reumatoid artrit, 18 patienter med
��
��
odifferentierad bindvävssjukdom och 403 personer utan
��
��
��
känd autoimmun sjukdom.
Följande data
erhölls vid
��
denna jämförelse. Tabell 2.
��
��
��
��
��
��
��
��
��
�
�
TABELL 1 ��
��
��
��
�
�
�
��
��
��
��
�
�
��
��
��
��
��
��
��
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� ��
�
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��
��
�
�
�
��
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��
��
�
��
��
��
TABELL 2
��
��
��
��
��
��
�
��
��
��
��
��
�
�
��
�
�
�
��
�
�
��
30
RELISA® ENA ENKELBRUNNS SCREENING
TESTPROCEDUR
Alla prover, reagenser (inklusive tvättbuffertlösningen) och mikrobrunnar
måste stå i rumstemperatur före användning.
1.
2.
IORDNINGSTÄLLANDE AV ARBETSBLAD
Märk det arbetsblad som medföljer satsen
för att ange var proverna skall stå i mikrobrunnarna. Analysera kalibratorn två gånger.
En brunn används för ett reagensämne.
Vi rekommenderar att varje kontroll- och
patientprov analyseras två gånger tills
godtagbar precision för laboratorieprovet
har upprättats.
FRAMSTÄLLNING AV TVÄTTBUFFERTLÖSNING
(PBS-Tween)
Lös upp innehållet i en PBS-buffertpåse i en
liter avjoniserat eller destillerat vatten. Tillsätt
hela innehållet i en flaska med tvättbuffertkoncentrat i den upplösta fosfatbuffrade
saltlösningen i en enlitersbehållare. Blanda
väl. Tvättbuffertlösningen kan täckas och
förvaras i 2-10 °C i högst fyra veckor.
3.
SPÄDNING AV PATIENTPROVER
Späd patientprov till 1:40 genom tillsättande av 25 µl serum till 975 µl provspädningsvätska. Om den tillhörande ENAoutspädda och analyserade positiva
kontrollen används, skall denna spädas på
samma sätt som patientproven. Blanda väl.
Kalibratorn, den positiva kontrollen och den
negativa kontrollen levereras färdigspädda
och kräver ingen ytterligare spädning.
4.
IORDNINGSTÄLLANDE AV MIKROBRUNNARNA
Avlägsna nödvändigt antal mikrobrunnar
från sina påsar och placera dem i ramhållaren. Mikrobrunnarna måste sitta ordentligt
fast i ramhållaren. Tryck ned remsans båda
ändar ordentligt så att de sitter säkert fast
i ramhållaren. Om du använder enstaka
brunnar eller mindre än en hel brunnremsa,
måste du kontrollera att varje brunn sitter
ordentligt fast. Brunnar som sitter ordentligt
fast i ramhållaren faller inte ut om ramhållaren vänds upp och ned. Om det behövs
färre än åtta brunnar för analysen kan
brunnarna avskiljas genom att de dras isär.
De oanvända brunnarna kan återföras till
foliepåsen som försluts med cellofantejp
och kylförvaras i högst 14 dagar.
5.
6.
7.
DISPENSERING AV SPÄDNINGAR
Dispensera 50 µl av kalibratorerna,
kontrollerna och de spädda patientproverna i lämpliga brunnar (se arbetsblad).
Dispensera 50 µl provspädningsvätska i
reagensämnesbrunnen.
ODLING AV REMSOR (30 minuter i rumstemperatur, det vill säga 19-23 °C)
Odla i rumstemperatur i 30 minuter. Remsorna skall skyddas mot drag och temperaturväxlingar under inkubationstiden.
Remsorna kan om så önskas täckas med
genomskinlig tejp eller pappershandduk
för att skydda dem mot damm och andra
främmande ämnen.
8.
DISPENSERING AV ENZYMANTIKROPPREAGENS
Dispensera 50 µl enzymantikroppreagens i
varje brunn.
9.
ODLING AV REMSOR (30 minuter i rumstemperatur, det vill säga 19-23 °C)
Odla i rumstemperatur under trettio minuter.
Remsorna skall skyddas mot drag och temperaturväxlingar under inkubationstiden.
Remsorna kan om så önskas täckas med
genomskinlig tejp eller pappershandduk
för att skydda dem mot damm och andra
främmande ämnen.
10.
TVÄTTNING AV REMSOR
Tvätta brunnarna tre till fem gånger med
PBS-Tween tvättbuffertlösning. Manuell
tvätt: Aspirera brunnarnas innehåll och
fyll därefter varje brunn med tvättbuffertlösning. Undvik korskontamination mellan
brunnarna, särskilt i första tvätten efter
aspirationen. Töm all tvättlösning från
brunnarna genom att vända dem upp och
ned och skaka därefter resterande tvättbuffert från brunnarna med en bestämd
”knyck” med handleden. Upprepa fyll- och
torkstegen för totalt tre till fem tvättar. Brunnarna skall sedan knackas bestämt mot en
pappershandduk eller annat absorberande
material för att avlägsna alla spår av
11.
DISPENSERING AV SUBSTRATLÖSNING
Förvissa dig om jämna tidsintervall med
hjälp av ett tidur och dispensera 50 µl
substratlösning i varje brunn. Substratlösningen måste tillsättas i brunnarna med jämn
hastighet så att varje brunn inkuberas exakt
lika länge (fem minuter). Substratlösningen i
brunnar som inkuberas med positiva prover
blir blå, medan lösningen i brunnar som
inkuberas med negativa prover blir färglösa
till mycket svagt blå.
12.
ODLA REMSORNA (exakt 5 minuter i rumstemperatur, det vill säga 19-23 °C)
Odla i rumstemperatur under exakt fem
minuter. Remsorna skall skyddas mot drag
och temperaturväxlingar under inkubationstiden.
13.
DISPENSERING AV STOPPREAGENS
När den första brunnen har inkuberats exakt
fem minuter skall 50 µl stoppreagens tillsättas i varje brunn, i samma ordningsföljd och
med samma hastighet som substratlösningen tillsattes i brunnarna. När stoppreagens
tillsätts skiftar den blå substratlösningen till
gult, medan den färglösa lösningen förblir
färglös.
14.
AVLÄSNING AV BRUNNARNAS ABSORPTION
Brunnarna måste avläsas i en plattläsande
spektrofotometer inom 30 minuter efter
tillsättandet av stoppreagensen. Brunnarna avläses vid 450 nm mot den färglösa
kontrollbrunnen. Om spektrofotometer med
dubbla våglängder används skall referensfiltrets våglängd ställas in på 600-650 nm.
TVÄTT AV REMSORNA (Se Allmänna proceduranvisningar 5 och 6)
Tvätta brunnarna tre till fem gånger med
PBS-Tween tvättbuffertlösning. Manuell
tvätt: Aspirera brunnarnas innehåll och
fyll därefter varje brunn med tvättbuffertlösning. Undvik korskontamination mellan
brunnarna, särskilt i första tvätten efter
aspirationen. Töm all tvättlösning från
brunnarna genom att vända dem upp och
ned och skaka därefter resterande tvättbuffert från brunnarna med en bestämd
”knyck” med handleden. Upprepa fyll- och
torkstegen för totalt tre till fem tvättar. Brunnarna skall sedan knackas bestämt mot en
pappershandduk eller annat absorberande
material för att avlägsna alla spår av
TEKNISK SUPPORT: +1-916- 363-2649
eller e-mail: [email protected]
31
BIBLIOGRAPHY
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
Douvas, A.S., Achten, M., and Tan, E.M. Identification of a Nuclear Protein (Scl-70) as a Unique Target of Human Antinuclear
Antibodies in Scleroderma. J. Biol. Chem. 254:10514-10522, 1979.
Moroi, Y., Peebles, C., Fritzler, M.J., et al. Autoantibodies to Centromere (Kinetochore) in Scleroderma Sera. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 77:1627-1631, 1980.
Cohen, M.L., Dawkins, B., Dawkins, R.L., et al. Clinical Significance of Antibodies to Ribonucleoprotein. Ann. Rheum. Dis. 38:74-78,
1979.
Sharp, G.C., Irwin, W.S., Tan, E.M., et al. Mixed Connective Tissue Disease-An Apparently Distinct Rheumatic Disease Syndrome
Associated with a Specific Antibody to Extractable Nuclear Antigen (ENA). 52:148-159, 1972.
Sharp, G.C., Irwin, May, L.M., et al. Association of Antibodies to Ribonucleoprotein and Sm Antigens with mixed Connective Tissue
Disease, Systemic Lupus Erythematosus, and Other Rheumatic Diseases. N. Engl. J. Med. 295:1149-1154, 1976.
Alspaugh, M.A., and Tan, E.M. Antibodies to Cellular Antigens in Sjögren’s Syndrome. J. Clin. Invest. 55:1067-1078, 1975.
Alspaugh, M.A., Talal, N., and Tan, E.M. Differentiation and Characterization of Autoantibodies and Their Antigens in Sjögren’s
Syndrome. Arthritis Rheum. 19:216-222, 1976.
Wolfe, J.F., Adelstein, J.F., and Sharp, G.C. Antinuclear Antibody with Distinct Specificity for Polymyositis. J. Clin. Invest. 59:176178, 1977.
Nishikai, M. and Reichlin, M. Purification and Characterization of a Nuclear Non-histone Basic Protein (Mi-1) which reacts with
Anti-immunoglobulin Sera and the Sera of Patients with Dermatomyositis. Mol. Immunol. 17: 1129-1141, 1980.
Alspaugh, M.A., and Tan, E.M. Serum Antibody in Rheumatoid Arthritis Reactive with a Cell-Associated Antigen. Demonstration
by Precipitation and Immunofluorescence. Arthritis Rheum. 19:711-719, 1976.
Holden, D.J., Brownell, A.K.W., and Fritzler, M.J. Clinical and Serologic Features of Patients with Polymyositis or Dermatomyositis.
Can. Med. Assoc. J. 132:649-653, 1985.
Hoy, E.S. Detection of Autoantibodies to the SSA/Ro Antigen: Comment on the Article by Boire et al (letter). Arthritis Rheum. 35:
1109-1112, 1992.
Fritzler, M.J. and Tan, E.M. Antinuclear Antibodies and the Connective Tissue Diseases, p. 207-247. In Cohen, A.S. (ed.), Laboratory
Diagnostic Procedures in the Rheumatic Diseases (Third Edition). Grune and Stratton, Orlando, FL, 1985.
Tan, E.M. and Kunkel, H.G. Characteristics of a Soluble Nuclear Antigen Precipitating with Sera of Patients with Systemic Lupus
Erythematosus. J. Immunol. 96:464-471, 1966.
Winfield, J.B., Brunner, C.M., and Koffler, D. Serological Studies in Patients with Systemic Lupus Erythematosus and Central Nervous
System Dysfunction. Arthritis Rheum. 21:289-294, 1978.
Nakamura, R.M. and Tan, E.M. Autoantibodies to Nonhistone Nuclear Antigens and Their Clinical Significance. Hum. Pathol. 14:
392-400, 1983.
Hamburger, M., Hodes, S., and Barland, P. The Incidence and Clinical Significance of Antibodies to Extractable Nuclear Antigens.
Am. J. Med. Sci. 273:21-28, 1977.
Lerner, M.R. and Steitz, J.A. Antibodies to Small Nuclear RNAs Complexed with Proteins are Produced by Patients with Systemic
Lupus Erythematosus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5495-5499, 1979.
Conner, G.E., Nelson, D., Wisniewolski, R., et al. Protein Antigens of the RNA-protein Complexes Detected by Anti-Sm and Anti-RNP
Antibodies Found in Serum of Patients with Systemic Lupus Erythematosus and Related Disorders. J. Exp. Med. 156:1475-1485,
1982.
Notman, D.D., Kurata, N., and Tan, E.M. Profiles of Antinuclear Antibodies in Systemic Rheumatic Diseases. Ann. Intern. Med. 83:
464-469, 1975.
Tan, E.M. Antinuclear Antibodies in Diagnosis and Management. Hosp. Pract. 18:78-84, 1983.
Clark, G., Reichlin, M., and Tomasi, T.B. Characterization of a Soluble Cytoplasmic Antigen Reactive with Sera from Patients with
Systemic Lupus Erythematosus. J. Immunol. 102:117-122, 1969.
Mattioli, M. and Reichlin, M. Heterogeneity of RNA Protein Antigens Reactive with Sera of Patients with Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis Rheum. 17:421-429, 1974.
Sontheimer, R.D., Maddison, P.J., Reichlin, M., et al. Serologic and HLA Associations in Subacute Cutaneous Lupus Erythematosus,
a Clinical Subset of Lupus Erythematosus. Ann. Intern. Med. 97:664-671, 1982.
Alexander, E.L., Arnett, F.C., Provost, T.T., et al. Sjögren’s Syndrome: Association of Anti-Ro (SSA) Antibodies with Vasculitis, Hematologic Abnormalities, and Serologic Hyperreactivity. Ann. Intern. Med. 98:155-159, 1983.
Provost, T.T., Arnett, F.C., and Reichlin, M. Homozygous C2 Deficiency, Lupus Erythematosus, and Anti-Ro (SSA) Antibodies. Arthritis
Rheum. 26:1279-1282, 1983.
Wasicek, C.A. and Reichlin, M. Clinical and Serological Differences Between Systemic Lupus Erythematosus Patients with Antibodies to Ro versus Patients with Antibodies to Ro and La. J. Clin. Invest. 69:835-843, 1982.
Maddison, P.J., Provost, T.T., and Reichlin, M. Serological Findings in Patients with “ANA Negative” Systemic Lupus Erythematosus.
Medicine 60:87-94, 1981.
Guldner, H.H., Szostecki, C., Vosberg, H.P., et al. Scl 70 Autoantibodies from Scleroderma Patients Recognize a 95 kDa Protein
Identified as DNA Topoisomerase I. Chromosoma 94:132-138, 1986.
Jarzabek-Chorzelska, M., Blaszczyk, M., Jablonska, S., et al. Scl 70 Antibody-A Specific Marker of Systemic Sclerosis. Brit. J. Dermatol. 115:393-401, 1986.
Bernstein, R.M., Morgan, S.H., Chapman, J., et al. Anti-Jo-1 Antibody: A marker for Myositis with Interstitial Lung Disease. Brit. Med.
J. 289:151-152, 1984.
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Manufacturer
Constructeur
Fornitore
Fabricante
Hersteller
Fabrikant
Authorized Representative in the European Community
Représentant autorisé dans le Communauté européen
Rappresentante autorizzato nella Comunità Europea
Representante autorizado en la Comunidad Europea
Autorisierter Repräsentant in der Europäischen Gemeinschaft
Auktoriserad Representant europeiska unionen
Temperature Limitation
Limitation de la Température
Limitazione Di Temperatura
Limitación De la Temperatura
Temperatur-Beschränkung
Temperatur begränsning
Contains Sufficient for <n> tests
Contient suffisamment pour <n> essais
Contiene sufficiente per <n> test
Contiene suficiente para <n> pruebas
Enthält genügendes für <n> Tests
Innehåller tillräckligt för <n> test
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